本申請要求于2015年7月1日在韓國知識產(chǎn)權(quán)局提交的韓國專利申請第10-2015-0094302號優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用的方式并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過海藻例如紅藻殘余物的酶促處理來制備半乳糖的方法。具體而言，制備半乳糖的方法包括：制備海藻殘余物，用酶處理海藻殘余物，以及使包含在海藻殘余物中的半乳糖濃縮、沉淀并顆粒化。
背景技術(shù)：
：半乳糖是海洋藻類諸如紅藻中的碳水化合物組分之一，并在應(yīng)用于用于化學(xué)反應(yīng)的原材料和生理活性物質(zhì)的開發(fā)以及用于制藥領(lǐng)域時時具有有用的功能。半乳糖是很少在自然界中見到游離形式但是廣泛地以聚合物形式分布的己醛糖，且具有C6H12O6的分子式和約167℃的熔點。半乳糖可以制成易溶于水的有甜味的白色粉末，且當(dāng)含有結(jié)晶水時可具有約118℃的熔點。半乳糖可以是D-和L-型的光學(xué)異構(gòu)體，而D-半乳糖是普遍存在的半乳糖。當(dāng)前對于作為生物糖的半乳糖制備的研究，集中在使用酸性材料的糖化技術(shù)，但是使用酸性材料的糖化技術(shù)還沒有商業(yè)化。因為使用酸性材料的糖化技術(shù)需要使用酸性化學(xué)品，不利之處在于必須中和酸性化學(xué)品。此外，高濃度的酸材料已使紅藻細(xì)胞壁的降解最大化，其可能回改變所產(chǎn)生的單糖生物糖的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致副產(chǎn)物的產(chǎn)量增加。問題在于，糖化收率降低。此外，通過糖化方法制備的半乳糖是單糖，且半乳糖不能作為顆粒直接從糖化液體獲得，是因為海藻組分的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)以及酸 性化學(xué)品可能在酸性糖化時包含在液體中。然而，當(dāng)前對于通過糖化過程由海藻制備生物糖諸如半乳糖的技術(shù)的研究集中在使用酸性化學(xué)品使海藻糖化、中和酸性化學(xué)品、且然后通過發(fā)酵過程制備燃料材料如生物乙醇的方法。直接地從糖化液體將單糖生物糖例如半乳糖制備為顆粒的技術(shù)還沒有完成。此外，因為通過使用酸性化學(xué)品的糖化技術(shù)獲得的糖化液體包含生物糖類，其利用方法已得以研究。然而，還沒有令人滿意的對于固相的酶促糖化的研究，其中該固相是作為使用酸性化學(xué)品的糖化作用而來的殘余物而產(chǎn)生的。從約20年前就已經(jīng)開始研究在從陸生植物資源制備糖類中所需的纖維素酶，且其商業(yè)產(chǎn)品已由世界上最大的制造商例如丹麥諾維信提供。然而，海藻半乳聚糖降解酶即瓊脂水解酶的商業(yè)生產(chǎn)還未實現(xiàn)，且化學(xué)制備瓊脂水解酶的技術(shù)和方法還未被開發(fā)。因此，對于酶促糖化作用的研究仍然處于非常初級的階段。這種用于在使用酸性化學(xué)品的糖化作用后剩余的固相材料的酶促糖化技術(shù)可以有工業(yè)價值，且經(jīng)濟(jì)的酶制備、通過使用酶的糖化、以及分離與純化技術(shù)有很高的工業(yè)重要性。然而，在世界范圍還沒有可用的在海藻糖化作用后使用酶類生產(chǎn)半乳糖的方法，且在實驗室水平上也沒有關(guān)于完整過程發(fā)展的報道。該技術(shù)仍然停留在通過分析糖化作用后的液體來報告存在于糖化液體中的糖組分的水平上。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述問題，本發(fā)明人已經(jīng)研究了，能夠使用酶類通過特定單元過程的組合從紅藻殘余物制備固相半乳糖顆粒，從而完成本發(fā)明。在一方面，本發(fā)明提供一種制備半乳糖的方法。該方法可以包括：通過包括紅藻的糖化和過濾的步驟來制備紅藻殘余物；使紅藻殘余物與含瓊脂水解酶的溶液反應(yīng)，以獲得糖混合物；過濾糖混合物；濃縮過濾的糖混合物；以及通過包括向濃縮的糖混合物添加醇的步驟來沉淀半乳糖。紅藻可以是選自角叉菜屬(Chondrus)、麒麟菜屬(Eucheuma)、杉藻屬(Gigartina)、雞毛菜屬(Pterocladia)、沙菜屬(Hypnea)、Iridaea屬、卡帕藻屬(Kappaphycus)、石花菜屬(Gellidium) 和江蘺屬(Gracilaria)中的一種或多種。當(dāng)制備紅藻殘余物時，糖化作用可以在約80～150℃的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選地，糖化作用可以是紅藻的水解作用，且水解作用可以通過包括添加濃度為約0.1％(w/v)～15％(w/v)的酸的步驟進(jìn)行。具體地，酸可以是選自硫酸(H2SO4)、鹽酸(HCl)、氫溴酸(HBr)、硝酸(HNO3)、醋酸(CH3COOH)、甲酸(HCOOH)、高氯酸(HClO4)、磷酸(H3PO4)和對甲苯磺酸(PTSA)中的一種或多種。當(dāng)制備紅藻殘余物時，紅藻的過濾可以通過硅膠柱色譜法或使用過濾器的過濾來進(jìn)行。瓊脂水解酶可以從Saccharophagusdegradans2-40獲得。優(yōu)選地，含有瓊脂水解酶的溶液可以通過包括培養(yǎng)Saccharophagusdegradans2-40；從培養(yǎng)基中取出Saccharophagusdegradans2-40；以及使留在培養(yǎng)基中的瓊脂水解酶濃縮的步驟獲得。具體地，Saccharophagusdegradans可以在溫度約30～40℃下培養(yǎng)約36～72小時。糖混合物可以通過包括使用柱層析過濾糖混合物，且另外使用微孔過濾器過濾糖混合物的步驟進(jìn)行過濾。柱層析可以包含平均粒徑為約0.1～0.5mm的硅膠，且微孔過濾器可以具有約0.45～0.9μm的孔徑大小。優(yōu)選地，可以在約0.1～100mL/min的流量下進(jìn)行糖混合物的過濾。過濾的糖混合物可以通過在真空下對過濾的糖混合物進(jìn)行蒸餾而濃縮。優(yōu)選地，可以在約30～60℃的溫度、約10～120mbar的壓力下進(jìn)行濃縮。當(dāng)沉淀半乳糖時，沉淀可以在約-10℃～25℃的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選地，在沉淀中添加的醇可以是選自甲醇、乙醇和丙醇中的一種或多種。制備半乳糖的方法還可以包括額外的沉淀后過濾，以獲得半乳糖顆粒。在另一方面，本發(fā)明提供由本文所述方法制備的半乳糖。由此制備的半乳糖可以包括D-半乳糖、L-半乳糖或其混合物。此外，半乳糖可以是白色固體顆粒形式。優(yōu)選地，半乳糖可以具有約163～170℃的熔點以及約80wt％或更高的純度。本發(fā)明的其他方面在下文中公開。附圖說明圖1是示出根據(jù)本發(fā)明示例性實施方式的制備半乳糖的示例性方法的流程圖；以及圖2是根據(jù)本發(fā)明示例性實施方式的通過酶促處理獲得的示例性半乳糖顆粒的照片。具體實施方式本文所用的術(shù)語僅出于描述具體的示例性實施方式的目的，而不意在限制本發(fā)明。本文所用的單數(shù)形式“一個”、“一種”以及“該”也意在包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文清楚地指出其他意思。還應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)在本說明書中使用時，術(shù)語“包括、包含”和/或“含有”指出所述特征、整數(shù)、步驟、操作、要素、和/或部件的存在，但不排除一個或多個其他特征、整數(shù)、步驟、操作、要素、部件和/或其集合的存在或添加。如本文所用，術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)所列項的任何和所有組合。除非特別指出或從上下文清晰得到，本文使用的術(shù)語“約”應(yīng)理解為在本領(lǐng)域的正常容忍范圍內(nèi)，例如在均值的2個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)?！凹s”可以理解為在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％內(nèi)。除非另外從上下文清晰得出，本文中提供的所有數(shù)值都被術(shù)語“約”修飾。在下文中，將具體解釋根據(jù)各種示例性實施方式的用于從紅藻或紅藻殘余物中制備半乳糖的樹脂復(fù)合材料和方法。組成紅藻細(xì)胞壁的多糖包括纖維素、木聚糖、甘露聚糖、瓊脂和卡拉膠。例如，已知瓊脂是構(gòu)成紅藻細(xì)胞壁外層和細(xì)胞間隙的粘性多糖的主要組分。瓊脂是由半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖(AHG)作為單元組成的聚合物，其由α-1,3-鍵和β-1,4-鍵交替鍵合(KazlowskiB,PanCL,KoYT(2008),Separationandquantificationofneoagaroandagaro-oligosaccharideproductsgeneratedfromagarosedigestionbybetaagaraseandHClinliquidchromatographysystems.CarbohydrateResearch, 343,2443-2450)。經(jīng)由α-1,3-鍵連接的3,6-脫水-L-半乳糖和半乳糖的單元，稱為新瓊脂二糖(neoagarbiose)，已使用核磁共振法(NMR)分析，3,6-脫水-L-半乳糖和半乳糖(D-半乳糖)構(gòu)成新瓊脂二糖(KimHT,LeeS,LeeD等人(2009),OverexpressionandmolecularcharacterizationofAga50Dfromsaccharophagusdegradans2-40.Appliedmicrobiologyandbiotechnology,1432-0614(網(wǎng)上發(fā)布))。因為降解瓊脂的海洋微生物例如Bacillusgelaticus最早由Gran在1902年分離出，已報道噬瓊膠菌屬(Agarivorans)、交替單胞菌屬(Alteromonas)、噬胞菌屬(Cytophaga)和產(chǎn)微球莖菌屬(Microbulbifer)(SwartzMN,NancyG.(1958)，Agarasefromanagar-digestingbacterium.Journalofbacteriology,77,403-409)。其中，已知Saccharophagusdegradans2-40是能夠降解許多復(fù)合多糖諸如瓊脂糖的需氧棒狀、γ-亞群的變形菌(EkborgNA,GonzalezJM等人(2005)，Saccharophagusdegradansgen.nov.,sp.Nov.,aversatilemarinedegraderofcomplexpolysaccharides，Internationaljournalofsystematicsandevolutionarymicrobiology,55,1545-1549.)。以前其被劃分為產(chǎn)微球莖菌屬，但在2005年正式命名為Saccharophagusdegradans2-40。菌株的基因組序列(美國能源部聯(lián)合基因組研究所)在2008年被揭露(WeinerRM,TalyorLE,HenrissatB等人(2008)，Completegenomesequenceofthecomplexcarbohydrate-degradingmarinebacterium,Saccharophagusdegradansstrain2-40,PLOSGenetics,4,e1000087)。因此，在一個方面，本發(fā)明提供一種制備半乳糖的方法。如圖1所示，該方法可以包括：通過包括紅藻的糖化和過濾的步驟來制備紅藻殘余物；使紅藻殘余物與含有瓊脂水解酶的溶液反應(yīng)以獲得糖混合物；過濾糖混合物；濃縮過濾的糖混合物；以及通過包括向濃縮的糖混合物添加醇的步驟來沉淀半乳糖。在示例性實施方式中，紅藻的糖化作用可以在約80～150℃、約100～150℃或特別地約120～150℃的溫度下進(jìn)行，但不限于此。此外，糖化過程可以是紅藻的水解，其中水解可以通過添加濃度為約0.05～15％(w/v)、約0.05～10％(w/v)、約0.05～5％(w/v)、約 0.1～15％(w/v)、約0.1～10％(w/v)、約0.1～5％(w/v)、約0.5～15％(w/v)、約0.5～10％(w/v)、約0.5～5％(w/v)、約1～15％(w/v)、約1～10％(w/v)、或特別地為約1～5％(w/v)的酸而進(jìn)行，但不限于此。此外，酸可以是選自硫酸(H2SO4)、鹽酸(HCl)、氫溴酸(HBr)、硝酸(HNO3)、醋酸(CH3COOH)、甲酸(HCOOH)、高氯酸(HClO4)、磷酸(H3PO4)和對甲苯磺酸(PTSA)中的一種或多種，但不限于此。此外，紅藻可以包含或生產(chǎn)半乳糖或其聚合物。具體地，紅藻可以屬于角叉菜屬、麒麟菜屬、杉藻屬、雞毛菜屬、沙菜屬、Iridaea屬、卡帕藻屬、石花菜屬或江蘺屬。例如，可以使用例如江蘺屬或石花菜屬(瓊脂)的紅藻，但不限于此。此外，紅藻可以提供為原料紅藻的干燥產(chǎn)物、洗滌原料紅藻后的干燥產(chǎn)物、或其粉末，但不限于此。此外，用于制備紅藻殘余物的過濾可以至少使用柱層析或使用過濾器進(jìn)行，但不限于此。本領(lǐng)域通常使用的任何過濾器都可以使用而沒有限制。具體地，柱層析可以包含硅膠或二氧化硅樹脂。硅膠可以是具有約0.1～0.5mm、約0.1～0.4mm、約0.1～0.3mm、或特別地為約0.1～0.2mm的平均粒徑的顆粒形式。硅膠可以是可以使用的各種中性硅膠，但硅膠不限于特定的二氧化硅材料。過濾器可以具有約1～20μm、約1～15μm、約1～10μm、約3～20μm、約3～15μm、約3～10μm、約5～20μm、約5～15μm、或特別地為約5～10μm的孔徑大小，但不限于此。由此制備的紅藻殘余物可以作為過濾后剩余的固體而獲得。紅藻殘余物可以接著與含有瓊脂水解酶的溶液反應(yīng)，以獲得可包含在紅藻細(xì)胞壁產(chǎn)生的半乳糖的糖混合物。糖混合物可以是液體，例如水溶液。與使用酸性材料和其他化學(xué)品的糖化技術(shù)相比，通過酶促處理例如瓊脂水解酶獲得包含半乳糖的糖混合物的方法，可以大大降低生產(chǎn)成本。例如，使用酶促處理的方法不需要對使用酸性材料的糖化過程中注入的酸性材料進(jìn)行中和。此外，該方法還可以改善在濃縮過程中的操作穩(wěn)定性和效率。反應(yīng)可以在約30～70℃、約30～60℃、約40～70℃、約40～60℃、或特別地約50℃的反應(yīng)溫度下進(jìn)行，但不限于此。此外，反應(yīng)可以進(jìn)行約48小時或更長，例如約48～96小時、約48～84小時、約48～72小時、或特別地為約48～60小時的反應(yīng)時間，但不限于此。瓊脂水解酶可以由包含微生物或菌株的培養(yǎng)物獲得，通過包括培養(yǎng)能夠產(chǎn)生瓊脂水解酶的菌株，以及從培養(yǎng)基除去菌株的步驟而生產(chǎn)。瓊脂水解酶可以從諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)、噬瓊膠菌屬、交替單胞菌屬、噬胞菌屬、產(chǎn)微球莖菌屬、Saccharophagus屬等的菌株獲得或生產(chǎn)，且例如瓊脂水解酶可以由Saccharophagusdegradans2-40生產(chǎn)。菌株可以在約30～40℃、約33～40℃、約35～40℃、或特別地在約37℃的溫度下培養(yǎng)36～72小時、36～66小時、36～60小時、36～52小時、42～72小時、42～66小時、42～60小時、42～52小時或48小時，以適當(dāng)?shù)鼗虼罅康厣a(chǎn)瓊脂水解酶，但培養(yǎng)條件可以不限于此。此外，在上述菌株中生產(chǎn)瓊脂水解酶的培養(yǎng)基可以通過向1L水中添加約2.3％的人工海水、約0.5％的氯化銨、1.5％的瓊脂和50mM的Tris-HCl而制備。人工海水可以制備成具有與35‰鹽度的海水相同的化學(xué)組成。例如，人工海水可以通過混合溶液1與溶液2而制備，其中溶液1通過在500ml蒸餾水中溶解約23.9g的NaCl、約4.0g的Na2SO4、約0.7g的NaHCO3、約0.1g的KBr、約30mg的H3BO3和約3mg的NaF而制備，溶液2通過在455ml蒸餾水中溶解約10.8g的MgCl2·6H2O、約1.5g的CaCl·2H2O和約25mg的SrCl2·6H2O而制備。過濾可以包括使用硅膠柱層析的初次過濾，以及在初次過濾步驟后使用微孔過濾器的二次過濾。初次過濾可以使用硅膠柱層析進(jìn)行一個或多個循環(huán)，例如1～10個循環(huán)、1～5個循環(huán)、或1～3個循環(huán)。具體地，硅膠柱層析可以除去糖混合物中的雜質(zhì)，諸如任何顆粒和蛋白質(zhì)組分。此外，硅膠顆?？梢跃哂屑s0.1～0.5mm、約0.1～0.4mm、約0.1～0.3mm或約0.1～0.2mm的平均粒徑，且可以使用各種中性硅膠，但硅膠不限于特定的二氧化硅材料。此外，填充在硅膠柱中的硅膠體積相對于注入的糖混合物體積可以合適地為1/2～1/5。如果體積比超出該范圍， 分離效率會降低或雜質(zhì)顆粒的量會增加，從而生成在最終的顆?；^程中硅膠顆?？赡芘c半乳糖顆粒共存的問題。此外，在二次過濾中使用的微孔過濾器可以具有約0.45～0.9μm的孔徑大小。當(dāng)使用具有0.45μm或更小孔徑的過濾器時，過濾過程的操作穩(wěn)定性會降低，導(dǎo)致不經(jīng)濟(jì)的過程。當(dāng)使用具有大于0.9μm孔徑的過濾器時，一些微顆粒無法過濾，從而降低最終產(chǎn)物的純度。糖混合物在柱層析中的流量可以為約0.1～100mL/min、約0.1～約80mL/min、約0.1～約60mL/min、約0.1～約40mL/min、約0.1～20mL/min、約0.1～10mL/min、約0.1～5mL/min或特別地為約3.5mL/min，但不限于此。適合于大規(guī)模系統(tǒng)的流量可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)整。過濾后的糖混合物，例如經(jīng)過初次和二次過濾的糖混合物，可以進(jìn)行濃縮。例如，糖混合物可以通過真空下蒸餾而濃縮以除去水或其他溶劑，使用真空蒸餾裝置，但不限于特定的裝置。優(yōu)選地，糖混合物可以濃縮到過濾糖混合物體積的約1/10～1/20。此外，糖混合物的濃縮可以在約30～60℃的溫度下進(jìn)行。當(dāng)溫度高于約60℃時，要濃縮的半乳糖會發(fā)生部分脫色。當(dāng)溫度低于30℃時，操作時間會增加。此外，濃縮可以在約10～120mbar的壓力下進(jìn)行。當(dāng)壓力大于120mbar時，操作時間會增加。當(dāng)壓力為10mbar或更小時，過程穩(wěn)定性會降低?？梢詮臐饪s的糖混合物中沉淀半乳糖。具體地，醇可以添加到濃縮的糖混合物中以引發(fā)半乳糖顆粒的形成(顆?；?，從而沉淀半乳糖。沉淀可以在約-10℃～25℃的溫度下進(jìn)行，或者可選地，溫度為約-10℃～25℃的醇可以添加到濃縮的糖混合物中。沉淀的半乳糖固體顆?？梢允褂谜婵者^濾設(shè)備獲得。醇可以是選自具有1～4個碳原子的直鏈或支鏈醇中的一種或多種，例如甲醇、乙醇和丙醇(如異丙醇)，但不限于此。醇的濃度可以為約10～100％(v/v)、約20～100％(v/v)、約30～100％(v/v)、約40～100％(v/v)、約50～100％(v/v)、約60～100％(v/v)、約70～100％(v/v)、約80～100％(v/v)、約90～100％(v/v)、約95～100％(v/v)、或約98～100％(v/v)，例如約99％(v/v)。在特定實施方式中， 醇可以是濃度為約10～100％(v/v)、約20～100％(v/v)、約30～100％(v/v)、約40～100％(v/v)、約50～100％(v/v)、約60～100％(v/v)、約70～100％(v/v)、約80～100％(v/v)、約90～100％(v/v)、約95～100％(v/v)、或約98～100％(v/v)的醇，例如99％(v/v)的甲醇、乙醇和丙醇(如異丙醇)。醇的注入體積可以適當(dāng)?shù)貫闈饪s糖混合物體積的約5～10倍。當(dāng)體積為約5倍或更少時，顆粒的沉淀不能適當(dāng)?shù)匕l(fā)生。當(dāng)體積為約10倍或更多時，過量使用會使成本增加。通過制備半乳糖的方法而制備的半乳糖可以包括D-半乳糖、L-半乳糖或其混合物。此外，半乳糖可以以白色固體顆?；蚍勰┑男问将@得。如果半乳糖以固體顆粒形式獲得，當(dāng)半乳糖用作其他化學(xué)反應(yīng)的起始材料時，具有易于稱重、注入量的精確控制、易于存儲以及體積減小的優(yōu)點。如果將液相半乳糖用作隨后化學(xué)反應(yīng)的起始材料，上述優(yōu)點無法預(yù)期，因此，生產(chǎn)過程會變得非常困難。另一方面提供一種通過制備半乳糖的方法而制備的半乳糖。通過制備半乳糖方法而制備的半乳糖可以包括D-半乳糖、L-半乳糖或其混合物。此外，半乳糖可以是白色固體顆粒的形式，但不限于此。此外，半乳糖可以具有約163～170℃的熔點，例如約167～169℃。考慮到純的半乳糖具有約167～169℃的熔點，半乳糖可以是具有純度為約80wt％或更高、85wt％或更高、90wt％或更高、95wt％或更高、96wt％或更高、97wt％或更高、98wt％或更高、或99wt％或更高的半乳糖。本發(fā)明涉及一種通過紅藻殘留物的酶促處理來制備半乳糖的方法。具體地，制備半乳糖的方法可以包括制備殘余物，使殘余物與酶反應(yīng)，濃縮所制備的糖混合物，以及使包含在糖混合物中的半乳糖沉淀并顆?；８鶕?jù)本發(fā)明的制備方法表明提出以高收率獲得半乳糖的重要工業(yè)技術(shù)，例如，不是通過丟棄從使用酸性化學(xué)品的傳統(tǒng)糖化方法中獲得的各種固體材料，而是通過用酶處理它們。此外，該方法為培養(yǎng)紅藻的漁村提供了經(jīng)濟(jì)利益，并解決了由海藻無人管理引起的環(huán)境問題。在下文中，本發(fā)明將參考以下實施例進(jìn)行更詳細(xì)的描述。然而，這些實施例僅用于示例說明的目的，且本發(fā)明的范圍不意在由這些實施例進(jìn)行限制。實施例制備例：含有瓊脂水解酶的溶液的制備培養(yǎng)海洋菌株Saccharophagusdegradans2-10(可從美國弗吉尼亞州馬納薩斯的ATCC(美國模式培養(yǎng)物保藏中心)得到)。具體而言，培養(yǎng)基組成為在1L水中的2.3％的人工海水(產(chǎn)品名稱：AquariumSystems,Mentor,Ohio)、0.5％的氯化銨(Sigma-Aldrich公司)、50mM的Tris-HCl(Sigma-Aldrich公司)和1.5％的瓊脂(Sigma-Aldrich公司)，且培養(yǎng)在5L-發(fā)酵反應(yīng)器中于溫度35℃的條件下進(jìn)行48小時。培養(yǎng)物在6000rpm下離心(Continent512R，HanilScienceIndustrialCo.)30分鐘，從而獲得1000ml包含得自Saccharophagusdegradans2-40的瓊脂水解酶的液體上清液。實施例1：制備源自紅藻的半乳糖步驟1：制備紅藻殘余物將在韓國Chunnam沿海地區(qū)收集的江蘺屬紅藻干燥并粉碎。然后，將350mL的蒸餾水和150mL的1NHCl溶液添加到500cc燒瓶中，且將該溶液調(diào)節(jié)到0.3NHCl。將由此干燥并粉碎的25g江蘺添加到溶液中，接著在120℃下震搖4小時。接著，在停止震搖后，將溶液靜置在室溫下(25℃)，并使用填充有二氧化硅顆粒的柱過濾，以獲得15g紅藻殘余物。步驟2：獲得含有半乳糖的糖混合物將在制備例中制備的10mL含有瓊脂水解酶的溶液，相對于在步驟1中獲得的1g紅藻殘余物進(jìn)行混合?；旌虾螅谷芤涸?0℃下反應(yīng)48小時，獲得200cc的含有半乳糖的糖混合物。步驟3：過濾初次過濾步驟通過將糖混合物以3.5mL/min的流量施加到填充有平均直徑為0.1～0.5mm的100mL中性硅膠顆粒的柱中。接著，使流經(jīng)硅膠柱的液體材料使用平均孔徑為0.45μm的微孔過濾器進(jìn)行二次 過濾。通過這些過濾程序，得到已除去固相材料的150ml液體糖混合物。步驟4：濃縮和顆粒化(沉淀)在水浴溫度55℃和90mbar低壓下，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV10)來將液體糖混合物濃縮至濃縮前體積的約1/20。然后，將低溫下存儲的99％(v/v)乙醇添加到濃縮后的材料中，以沉淀顆粒。關(guān)于這方面，注入乙醇的體積是濃縮后材料的約20倍。之后，沉淀的顆粒進(jìn)行真空過濾，以獲得10g半乳糖顆粒。獲得的半乳糖顆粒如圖2所示。比較例1以與實施例1相同的方式進(jìn)行制備，除步驟2使用市售酶纖維素酶(Viscozyme；Novozyme)代替在制備例中制備的含有瓊脂水解酶的溶液外。比較例2以與實施例1相同的方式進(jìn)行制備，除進(jìn)行濃縮和顆?；襟E而無過濾步驟外。比較例3以與實施例1相同的方式進(jìn)行制備，除在過濾步驟中進(jìn)行硅膠柱層析而不進(jìn)行微孔過濾，并然后進(jìn)行濃縮和顆?；襟E外。比較例4以與實施例1相同的方式進(jìn)行制備，除在濃縮后的顆粒化步驟中用99％(v/v)的己烷代替乙醇外。在這一點上，注入的己烷的體積是濃縮后材料體積的約20倍。比較例5是以與實施例1相同的方式進(jìn)行制備，除在濃縮后的顆?；襟E中用99％(v/v)的乙酸乙酯代替乙醇外。在這一點上，注入的乙酸乙酯的體積是濃縮后材料體積的約20倍。實驗例1：半乳糖顆粒形成的測試檢測實施例1和比較例1～5的半乳糖顆粒的形成。結(jié)果在下列表1中給出。[表1]分類顆粒形成實施例1顆粒比較例1粘性物質(zhì)/無顆粒比較例2粘性物質(zhì)/無顆粒比較例3粘性物質(zhì)/無顆粒比較例4粘性物質(zhì)/無顆粒比較例5粘性物質(zhì)/無顆粒如表1所示，在實施例1中形成顆粒，而比較例1～5中僅生成粘性物質(zhì)且無顆粒形成。實驗例2：用于半乳糖形成測試的熔點測量為考察實施例1和比較例1～5是否生成半乳糖，使用差示掃描量熱儀(DSC)(美國，TAinstruments)測量指示其純度的熔點。具體而言，半乳糖試劑的熔點測量為167～169℃。測量實施例1和比較例1～5的熔點，且結(jié)果在下列表2中給出。[表2]熔點(℃)實施例1167比較例165比較例266比較例350比較例445比較例545如表2所示，發(fā)現(xiàn)實施例1具有167℃的熔點，其在半乳糖試劑的167～169℃熔點范圍內(nèi)，表明產(chǎn)生了半乳糖。相比之下，發(fā)現(xiàn)比較例1～5具有45～65℃的熔點，其不在半乳糖試劑的熔點范圍內(nèi)，表明沒有產(chǎn)生半乳糖。當(dāng)前第1頁1 2 3