本發(fā)明屬于微生物油脂的生產(chǎn)，特別涉及一種利用產(chǎn)油微生物為全細(xì)胞催化劑，脂肪酸為?；w，進(jìn)行全細(xì)胞催化制備甘油脂的方法。
背景技術(shù)：
產(chǎn)油酵母、霉菌、細(xì)菌和一些藻類等產(chǎn)油微生物在一定條件下，將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)油脂，稱為微生物油脂。據(jù)報(bào)道，部分產(chǎn)油微生物在胞內(nèi)積累的油脂可以達(dá)到自身干重的70％以上(Li YH,Zhao ZB,Bai FW.High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4in fed-batch culture.Enzyme Microb Technol,2007,41(3):312-317)。利用微生物生產(chǎn)油脂，不受場(chǎng)地、季節(jié)及氣候的影響，不占用農(nóng)田耕地，生產(chǎn)時(shí)間短，容易實(shí)現(xiàn)油脂生產(chǎn)的規(guī)?；?、連續(xù)化。微生物油脂在脂肪酸組成上與動(dòng)、植物油油脂相似，因此，開發(fā)微生物油脂可以為生物能源產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供新原料，具有重要的應(yīng)用前景。
隨著社會(huì)生活的不斷發(fā)展，人們對(duì)于油脂化學(xué)品的需求量劇增的同時(shí)也呈現(xiàn)出產(chǎn)品需求種類的多樣化。油脂化學(xué)品廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、制藥、潤滑劑、去污劑等(Jin MJ,Slininger PJ,Dien BS,et al.Microbial lipid-based lignocellulosic biorefinery:feasibility and challenges.Trends Biotechnol.,2014,33(1),43-54.),還可用于追蹤人類脂肪代謝途徑，研究甘油酯在患有脂肪代謝疾病病人員體內(nèi)代謝情況(Cascio G,Schiera G.and Liegro ID.Dietary fatty acids in metabolic syndrome,diabetes and cardiovascular diseases.Curr.Diabetes Rev.,2012,8,2-17.Renata M and Dariush M.Trans fatty acids:effects on metabolic syndrome,heart disease and diabetes.Nat Rev Endocrinol.,5(6):335-344.)。充分開發(fā)利用微生物油脂，拓寬其應(yīng)用范圍，將顯著提高其自身價(jià)值，同時(shí)降低微生物油脂生產(chǎn)成本。
目前，利用產(chǎn)油酵母發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，絕大多數(shù)微生物積累的脂肪酸以油酸、棕櫚酸、硬脂酸為主，另外還能少量積累亞油酸、肉豆蔻酸、亞麻酸、二十碳酸、二十二碳酸和二十四碳酸等。利用產(chǎn)油生產(chǎn)這類脂肪酸，用途雖廣，但是限制了其進(jìn)一步的開發(fā)潛力。因此，拓寬產(chǎn)油酵母油脂產(chǎn)物的圖譜提高微生物油脂經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重要意義。
產(chǎn)油酵母和霉菌具有較強(qiáng)的油脂代謝和儲(chǔ)存能力，拓寬產(chǎn)油微生物油脂產(chǎn)物的圖譜相關(guān)研究已有文獻(xiàn)報(bào)道。首先，通過基因改造提高多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)(Xue Z,Sharpe PL,Hong SP,et al.Production of omega-3eicosapentaenoic acid by metabolic engineering of Yarrowia lipolytica.Nature Biotechnol.2013,31,734-740.)。第二，通過合成生物學(xué)手段開發(fā)利用產(chǎn)油酵母自身的異戊二烯途徑生產(chǎn)高價(jià)值的產(chǎn)品(Zhou YJ,Gao W,Rong QX,et al.“Modular pathway engineering of diterpenoid synthases and the mevalonic acid pathway for miltiradiene production”J.Am.Chem.Soc.2012,134(6),3234–3241.)。最后，利用天然代謝網(wǎng)絡(luò)，利用產(chǎn)油微生物自身對(duì)于脂肪酸積累的偏好性生產(chǎn)所需的產(chǎn)品(M,Laakso S.Esterification of conjugated linoleic acid by yeasts for increasing thevalue of plant materials.Process Biochem.2014,49,1831-1837)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
生物來源的油脂在化工生產(chǎn)中起到重要的作用。目前利用產(chǎn)油微生物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)油脂存在的問題是，生產(chǎn)的油脂中脂肪酸圖譜偏窄，而且集中于油酸和棕櫚酸，而硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、肉豆蔻酸、棕櫚油酸含量低，造成其應(yīng)用范圍窄、經(jīng)濟(jì)性差。發(fā)明人認(rèn)為以產(chǎn)油酵母或霉菌為平臺(tái)，脂肪酸為?；w，采用全細(xì)胞催化的方式，可顯著促進(jìn)底物的代謝效率，拓寬微生物油脂的產(chǎn)品圖譜，改善微生物油脂的技術(shù)經(jīng)濟(jì)性。因此，發(fā)明人利用大量產(chǎn)油微生物進(jìn)行了科學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)部分產(chǎn)油微生物菌株具有優(yōu)良的全細(xì)胞催化生產(chǎn)油酯的生理特性。
本發(fā)明在于提供一種以產(chǎn)油微生物為全細(xì)胞催化劑，以常見脂肪酸或常見脂肪酸與13C全標(biāo)記脂肪酸的混合物為?；w，直接或補(bǔ)充甘油、葡萄糖、蔗糖中的一種或幾種后，全細(xì)胞催化生產(chǎn)制備微生物油脂的方法。本發(fā)明工藝簡便、方法易行、可高效利用和轉(zhuǎn)化脂肪酸和甘油并合成甘油酯，該甘油酯可以用于精細(xì)化學(xué)品、醫(yī)藥、食品添加劑和材料中間體，能夠有效改善改善微生物油脂生產(chǎn)技術(shù)的經(jīng)濟(jì)性。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
以脂肪酸為脂肪?；w，以產(chǎn)油微生物作為全細(xì)胞催化劑，在水相中反應(yīng)獲得含有多種脂肪酸的甘油脂。
反應(yīng)環(huán)境為培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中接種產(chǎn)油微生物種子，接種量(以干細(xì)胞(Dry cell weight，DCW)計(jì))為0.5g/L-30g/L，微生物與脂肪酸的質(zhì)量比為5/100至60/100；在pH值3.0-8.0，溫度15℃-40℃下有氧發(fā)酵，至發(fā)酵液中脂肪酸濃度低于1g/L。
所述產(chǎn)油微生物為斯達(dá)式油脂酵母Lipomyces屬、絲孢酵母Trichosporon屬、隱球酵母Cryptococcus屬、冬孢酵母Rhodosporidium屬、Mortierella屬、Mucor屬或Endomycopsis屬菌株中的一種或二種以上。
所述脂肪酸為十碳酸、十一碳酸、月桂酸、十三碳酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、13C全標(biāo)記的十碳酸、十一碳酸、月桂酸、十三碳酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸中的一種或二種以 上。
在水相中反應(yīng)后，棄上清，沉淀經(jīng)2000-10000g離心3-30min，然后用1/5發(fā)酵體積的乙醇、石油醚各洗滌一次，置于60-110℃，烘干過夜，獲得菌體，提取獲得油脂。
反應(yīng)環(huán)境為產(chǎn)油微生物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有甘油、葡萄糖、蔗糖中的一種或二種或三種，其中甘油、葡萄糖、蔗糖中的一種或二種或三種的總量不高于脂肪酸質(zhì)量的20％，上述物質(zhì)在培養(yǎng)基中的總濃度2-50g/L；
培養(yǎng)基中還含有維持pH所需的緩沖鹽，上述緩沖鹽為3-(N-嗎啉基)丙磺酸、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸磷酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀、磷酸、鹽酸或硫酸中的一種或二種以上；
所述產(chǎn)油微生物培養(yǎng)在有氧條件下進(jìn)行，培養(yǎng)溫度15℃-40℃，pH值3.0-8.0。
所獲得含多種脂肪酸的甘油脂，底物脂肪酸占總脂肪酸質(zhì)量的40％-95％。
按照本發(fā)明所述方法制備得到的脂肪酸甘油酯可以在制備診斷脂肪代謝病標(biāo)記物中應(yīng)用。所述甘油酯用于精細(xì)化學(xué)品、醫(yī)藥、食品添加劑和材料中間體。
具體技術(shù)方案為：
1、制備產(chǎn)油培養(yǎng)基。通過下述方法的一種或它們的必要組合方法實(shí)現(xiàn)：
A.將脂肪酸制成質(zhì)量濃度為0.5％-10％的乳濁液，pH 3.0-8.0，滅菌后備用；或，
B.將脂肪酸制成質(zhì)量濃度為0.5％-10％的乳濁液，并添加不高于脂肪酸質(zhì)量20％的甘油，pH 3.0-8.0，滅菌后備用；或，
C.將脂肪酸制成質(zhì)量濃度為0.5％-10％的乳濁液，并添加不高于于脂肪酸質(zhì)量20％的甘油和葡萄糖的混合物，pH 3.0-8.0，滅菌后備用；
培養(yǎng)基中還含有維持pH所需的緩沖鹽，如3-(N-嗎啉基)丙磺酸、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸磷酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀、磷酸、鹽酸、硫酸中的一種或幾種組合。
2、產(chǎn)油微生物培養(yǎng)。向步驟1所述培養(yǎng)基中接種產(chǎn)油微生物種子，接種量(以干細(xì)胞(Dry cell weight，DCW)計(jì))為0.5g/L-30g/L，在15℃-40℃下有氧發(fā)酵，至發(fā)酵液中脂肪酸濃度低于1g/L。
3、菌體收集和微生物油脂提取。培養(yǎng)結(jié)束后，采用離心、過濾或其他必要的方法濃縮收集產(chǎn)油微生物細(xì)胞。參照文獻(xiàn)(李植峰，張玲、沈曉京 等.四種真菌油脂提取方法的比較研究。微生物學(xué)通報(bào),2001,28(6):72-75)使用酸熱-有機(jī)溶劑法提取獲得油脂，計(jì)算菌體油脂含量。將所得油脂進(jìn)行甲酯化，并進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)。
本發(fā)明使用的產(chǎn)油微生物菌體油脂含量可超過細(xì)胞干重20％(w/w)，并且具有轉(zhuǎn)運(yùn)和積累脂肪酸的生理特性的微生物，它們包括但不限于油脂酵母Lipomyces屬、絲孢酵母Trichosporon屬、隱球酵母Cryptococcus屬、冬孢酵母Rhodosporidium屬，油脂酵母Lipomyces，Mortierella屬、Mucor屬和Endomycopsis屬菌株。這些菌株可以直接從包括中國普通微生物菌種管理中心(CGMCC)及美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)等菌種保藏機(jī)構(gòu)購買或從自然界中分離，也可以使用與原來菌株性狀不同的人工或自然突變菌株。
本發(fā)明采用脂肪酸單獨(dú)培養(yǎng)的方法、脂肪酸與甘油混合的方法、脂肪酸與葡萄糖、甘油混合的方法或者組合必要的方法，制備含有脂肪酸的原料。
本發(fā)明的有益效果是：1)技術(shù)操作簡單有效，生產(chǎn)周期短；2)微生物全細(xì)胞催化合成甘油酯，相對(duì)于化學(xué)催化，條件溫和，無毒害廢棄物產(chǎn)生，更為綠色環(huán)保；3)利用微生物合成C13標(biāo)記的甘油酯微生物油脂，開拓了微生物油脂的應(yīng)用范圍，為提高微生物油脂價(jià)值提供了新的技術(shù)。
附圖說明
圖1為實(shí)施例1中全細(xì)胞催化產(chǎn)生的油脂脂肪酸組成分析結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面是具體實(shí)施例，它們有助于了解本專利以及不同工藝對(duì)微生物油脂生成的影響，但不局限于本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例1
1)將13C全標(biāo)記的油酸-13C18與常見油酸，按照1/19的質(zhì)量比制成終濃度20g/L乳化液，3-(N-嗎啉基)丙磺酸50mM，Tween 80 20g/L，pH 7.0，所得培養(yǎng)基滅菌121℃滅菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389(來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于33℃，200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)28小時(shí)，8000rpm離心5min，棄上清；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為6g/L，在33℃下通氣培養(yǎng)60小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余脂肪酸濃度低于為0.5g/L；將發(fā)酵液在5000g離心5min，棄上清，菌體用1/5發(fā)酵液體積的乙醇、石油醚各洗 滌一遍，105℃干燥過夜，得干菌體20.3g/L，油脂含量71.8％，甘油脂占總油脂的90.7％，含油酸的甘油三酯占總甘油三酯的95％，13C18標(biāo)記的油酸占總油酸質(zhì)量的5％。
實(shí)施例2
1)將13C全標(biāo)記的棕櫚酸-13C16與常見棕櫚酸按1/9的質(zhì)量比制成乳化液，棕櫚酸10g/L，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸30mM，Tween 80 20g/L，pH5.0，所得培養(yǎng)基滅菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Trichosporon cutaneum AS 2.571(菌株來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，8000rpm離心5min，棄上清；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為4g/L，在30℃下通氣培養(yǎng)48小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中硬脂酸濃度小于0.3g/L；將發(fā)酵液在10000g離心3min，棄上清，菌體用1/5發(fā)酵液體積的乙醇、石油醚各洗滌一遍，60℃干燥過夜，得干菌體10.5g/L，油脂含量51.3％，甘油三脂占總油脂的84％，含棕櫚酸的甘油三酯占總油脂的87％，含13C全標(biāo)記的棕櫚酸-13C16占總棕櫚酸質(zhì)量的10％。
實(shí)施例3
1)將月桂酸制成乳化液，月桂酸10g/L，Tween 80 10g/L，用5M氫氧化鈉和4M鹽酸調(diào)整并保持pH 6.5，所得培養(yǎng)基滅菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(來源于美國典型微生物菌種保藏中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于28℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)20小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為4g/L，在28℃下通氣培養(yǎng)60小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余葡萄糖和甘露糖的月桂酸濃度分別為低于0.1g/L和9.9g/L；將發(fā)酵液在2000g離心30min，棄上清，菌體用1/5發(fā)酵液體積的乙醇、石油醚各洗滌一遍，110℃干燥過夜，得干菌體9.3g/L，油脂含量57.4％，甘油三酯占總油脂的88.5％，含月桂酸的甘油三酯含量占總甘油三酯的48％。
實(shí)施例4
1)將癸酸酸制成乳化液，癸酸5g/L，Tween 80 10g/L，用5M氫氧化鈉和2M硫酸調(diào)整并保持pH 4.5，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Lypomyces starkeyi AS 2.1560(來源于中國普通微生物菌 種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于35℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為3g/L，在35℃下通氣培養(yǎng)120小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余癸酸的濃度低于1.0g/L；將發(fā)酵液在5000g離心10min，棄上清，菌體用1/5發(fā)酵液體積的乙醇、石油醚各洗滌一遍，105℃干燥過夜，得干菌體6.3g/L，油脂含量的42.8％，甘油三脂占總油脂含量的84.9％，含癸酸的甘油三酯含量占總甘油三酯的40％。
實(shí)施例5
1)將肉豆蔻酸制成乳化液，肉豆蔻酸50g/L，Tween 80 20g/L，用0.1M磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液維持pH 7.5，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1608(來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為10g/L，在37℃下通氣培養(yǎng)120小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余肉豆蔻酸的濃度＜1.0g/L；將發(fā)酵液在5000g離心5min，棄上清，菌體用1/5發(fā)酵液體積的乙醇、石油醚各洗滌一遍，105℃干燥過夜，得干菌體36.4g/L，油脂含量62.8％，甘油三脂占總油脂的87％，含肉豆蔻酸的甘油三酯含量占總甘油三脂的75％。
實(shí)施例6
1)將亞油酸制成乳化液，亞油酸5g/L，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸50mM，Tween 80 20g/L，pH 5.5，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Yarrowia lipolytica AS 2.1398(來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于33℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)26小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為3g/L，在35℃下通氣培養(yǎng)48小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余亞油酸的濃度為0.9g/L；固液分離收集菌體，干燥，得干菌體5.3g/L，油脂含量42.8％，甘油三脂占總油脂的83％，含亞油酸的甘油三酯含量占總甘油三酯的40％。
實(shí)施例7
1)將甘油和油酸混合液(13C全標(biāo)記的油酸-13C18與常見油酸按1/19 的質(zhì)量比終濃度20g/L)配制成混合乳化液，甘油4g/L，脂肪酸20g/L，50mM 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸，Tween 80 20g/L，pH 5.5，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1390(來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為10g/L，在35℃下通氣培養(yǎng)72小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余甘油和油酸的濃度分別為0.0g/L和0.9g/L；將發(fā)酵液在5000g離心5min，棄上清，菌體用1/5發(fā)酵液體積的乙醇、石油醚各洗滌一遍，105℃干燥過夜，得干菌體26.3g/L，油脂含量56.3％，甘油三酯占總油脂的92％，含油酸甘油三酯占甘油三酯的90％，13C全標(biāo)記的油酸-13C18占總油酸的5％。
實(shí)施例8
1)將甘油和十一酸配制成混合乳化液，甘油2g/L，十一酸10g/L，pH 8.0，所得培養(yǎng)基滅菌121℃滅菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1608(來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于28℃，200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)36小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為5g/L，在35℃下通氣培養(yǎng)38小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余葡萄糖和甘露糖的濃度分別為2.0g/L和0.7g/L；將發(fā)酵液在5000g離心5min，棄上清，菌體用1/5發(fā)酵液體積的乙醇、石油醚各洗滌一遍，105℃干燥過夜，得干菌體11.3g/L，油脂含量64.5％，甘油三酯占總油脂的87％，含十一酸的甘油三酯占總甘油三酯的84.7％。
實(shí)施例9
1)將甘油和肉豆蔻酸混合液(13C全標(biāo)記的肉豆蔻酸-13C14與常見肉豆蔻酸按1/29的質(zhì)量比混合)配制成混合乳化液，甘油10g/L，脂肪酸60g/L，50mM 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸，Tween 80 20g/L，pH 5.5，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Rhodotorula glutinis AS 2.703(來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為25g/L，在35℃下通氣培養(yǎng)112小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余甘油和油酸的濃度分別為0.0g/L和0.9g/L；將發(fā)酵液在5000g離心5min，棄上清，菌體用1/5發(fā)酵液體積的乙醇、石油醚各洗滌一遍，105℃干燥過夜，得干菌體60.3g/L，油脂含量71.3％，甘油三酯占總油脂的89％，含肉豆蔻酸的甘油三酯占總甘油三酯的90％，13C標(biāo)記的肉豆蔻酸-13C14占總?cè)舛罐⑺岬?.3％。
實(shí)施例10
1)將甘油和月桂酸配制成混合乳化液，甘油4g/L，月桂酸27g/L，50mM磷酸鹽緩沖液，Tween 80 20g/L，pH 7.5，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Cryptococcus albidus ATCC 56298(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為10g/L，在35℃下通氣培養(yǎng)65小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余甘油和油酸的濃度分別為0.0g/L和0.5g/L；將發(fā)酵液在5000g離心5min，棄上清，菌體用1/5發(fā)酵液體積的乙醇、石油醚各洗滌一遍，105℃干燥過夜，得干菌體23.3g/L，油脂含量61.3％，甘油三脂占總油脂的89％，含月桂酸的甘油三酯含量占甘油三酯的50％。
實(shí)施例11
1)將甘油和棕櫚酸混合液(13C全標(biāo)記的棕櫚酸-13C16與常見肉豆蔻酸按1/30的質(zhì)量比混合)13C標(biāo)記的棕櫚酸配制成混合乳化液，甘油5g/L，脂肪酸33g/L，50mM 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸，Tween 80 20g/L，pH 5.5，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Rhodotorula minuta AS 2.1517(來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)24小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為12g/L，在30℃下通氣培養(yǎng)65小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余葡萄糖和甘露糖的濃度分別為0.2g/L和1.3g/L；固液分離收集菌體，干燥，得干菌體27.3g/L，油脂含量64.1％，甘油三酯占總油脂的93％，含棕櫚酸的甘油三酯占總甘油三酯的85％，13C全標(biāo)記的棕櫚酸占總棕櫚酸的3％。
實(shí)施例12
1)將甘油和十三酸配制成混合乳化液，甘油2g/L，十三酸10g/L，50mM 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸，Tween 80 5g/L，pH 5.5，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Lipomyces starkeyi CICC 1715(源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)24小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為0.5g/L，在30℃下通氣培養(yǎng)10小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余葡萄糖和甘露糖的濃度分別為0.4g/L和0g/L；固液分離收集菌體，干燥，得干菌體1.1g/L，油脂含量57.6％，甘油三脂占總油脂的88％，含十三酸甘油三酯的含量占總甘油三脂的89％。實(shí)施例13
1)將甘油和亞油酸配制成混合乳化液，甘油10g/L，亞油酸54g/L，50mM 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸，pH 6.5，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油霉菌Mortierella isabellina AS 3.3410(來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為5g/L，在35℃下通氣培養(yǎng)100小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余甘油和油酸的濃度分別為0.0g/L和0.9g/L；固液分離收集菌體，干燥，得干菌體30.3g/L，油脂含量69.5％，甘油三酯占總油脂的92％，油酸占總脂肪酸的72％，亞油酸占總脂肪酸的15％。
實(shí)施例14
1)將葡萄糖、甘油和油酸配制成混合乳化液，葡萄糖2g/L，甘油4g/L，油酸30g/L，50mM 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸，pH 3.0，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油霉菌卷枝毛霉Mucor circinelloides ITCC 6025(來源于印度典型培養(yǎng)物保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，180轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)36小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為12g/L，在37℃下通氣培養(yǎng)84小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余甘油和油酸的濃度分別為0.0g/L和0.9g/L；固液分離收集菌體，干燥，得干菌體40.3g/L，油脂含量71.3％，甘油三酯占總油脂的92％，油酸占總脂肪酸的81％，亞油酸占總脂肪酸的 16％。
實(shí)施例15
1)將葡萄糖、甘油和亞油酸配制成混合乳化液，葡萄糖3g/L，甘油5g/L，亞油酸混合物(亞油酸-13C18與常規(guī)亞油酸的質(zhì)量比例為1/19)40g/L，Tween 80 20g/L，用5M氫氧化鈉調(diào)節(jié)并保持pH 3.5，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Rhodotorula lactosa AS 2.1514(來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為10g/L，在20℃下通氣培養(yǎng)96小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余甘油和油酸的濃度分別為0.0g/L和0.9g/L；固液分離收集菌體，干燥，得干菌體30.3g/L，油脂含量71.3％，甘油三酯占總油脂的94％，亞油酸占總脂肪酸的40％，13C全標(biāo)記的亞油酸-13C18占總亞油酸的5％(附圖1)。
實(shí)施例16
1)將葡萄糖、甘油和棕櫚酸配制成混合乳化液，葡萄糖40g/L，甘油10g/L，棕櫚酸100g/L，Tween 80 20g/L，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)并保持pH 5.5，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Rhodotorula glutinis AS 2.499(來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為25g/L，在35℃下通氣培養(yǎng)140小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余甘油和油酸的濃度分別為0.0g/L和0.9g/L；固液分離收集菌體，干燥，得干菌體88.7g/L，油脂含量71.3％，甘油三酯占總油脂的92％，含棕櫚酸的甘油三酯占總甘油三酯的93％。
實(shí)施例17
1)將葡萄糖、甘油和肉豆蔻酸配制成混合乳化液，葡萄糖2g/L，甘油5g/L，肉豆蔻酸44g/L，50mM 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸，pH 6.5，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油霉菌Endomycopsis burtonii CICC 1365(源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW)計(jì))為10g/L，在15℃下通氣培養(yǎng)42小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余葡萄糖、甘油和油酸的濃度分別為0.0g/L、0.0g/L和0.9g/L；固液分離收集菌體，干燥，得干菌體36.3g/L，油脂含量71.3％，甘油三酯占總油脂的87％，含肉豆蔻酸的甘油三脂占總甘油三酯的94％，
實(shí)施例18
1)將葡萄糖、甘油和月桂酸配制成混合乳化液，葡萄糖1g/L，甘油2g/L，月桂酸15g/L，50mM 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸，Tween 80 10g/L，pH3.0，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Rhodotorula glutinis AS 2.107(來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為2g/L，在40℃下通氣培養(yǎng)12小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余甘油和油酸的濃度分別為0.0g/L和0.9g/L；固液分離收集菌體，干燥，得干菌體4.3g/L，油脂含量71.3％，甘油三酯占總油脂的87％，含月桂酸的甘油三酯占總甘油三酯的85％。
實(shí)施例19
1)將葡萄糖、甘油和十一碳酸混合物(十一碳酸-13C11與常見十一碳酸質(zhì)量比為1/99)配制成混合乳化液，葡萄糖5g/L，甘油9g/L，十一碳酸70g/L，50mM磷酸鹽緩沖液，Tween 80 20g/L，pH 7.0，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1390(來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于25℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為15g/L，在35℃下通氣培養(yǎng)92小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余葡萄糖、甘油和油酸的濃度分別為0.0g/L、0.0g/L和0.9g/L；固液分離收集菌體，干燥，得干菌體51.7g/L，油脂含量68.7％，甘油三酯占總油脂的91％，含十一碳酸的甘油三酯占總甘油三酯的95％，13C標(biāo)記的十一碳酸-13C11占總十一碳酸的1％。
實(shí)施例20
1)將葡萄糖、甘油和癸酸配制成混合乳化液，葡萄糖1g/L，甘油2g/L， 癸酸15g/L，Tween 80 5g/L，0.1M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH 8.0，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1390(來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為2g/L，在30℃下通氣培養(yǎng)20小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余葡萄糖、甘油和油酸的濃度分別為0.0、0.0g/L和0.9g/L；固液分離收集菌體，干燥，得干菌體10.3g/L，油脂含量69.3％，甘油三脂占總油脂的89％，含癸酸的甘油三酯占總甘油三脂的87％。
實(shí)施例21
將葡萄糖、甘油和十三酸配制成混合乳化液，葡萄糖10g/L，甘油4g/L，十三酸14g/L，Tween 80 20g/L，碳酸鈉調(diào)節(jié)pH 4.5，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Lipomyces kononenkoae CICC 1714(源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW計(jì))為7g/L，在35℃下通氣培養(yǎng)36小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余葡萄糖、甘油和脂肪酸的濃度分別為0.0g/L、0.0g/L和0.9g/L；固液分離收集菌體，干燥，得干菌體19.4g/L，油脂含量65.6％，甘油三酯占總甘油酯的92％，含十三酸的甘油三酯占總甘油三酯的89％。
實(shí)施例22
1)將肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亞油酸按照25:35:35:5的比例混合后制成乳化液，總脂肪酸濃度為50g/L，加入10g/L的甘油和20g/L的葡萄糖，Tween 80 20g/L，0.2M磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液維持pH 6.5，所得培養(yǎng)基除菌后備用；
2)產(chǎn)油酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(來源于美國典型微生物菌種保藏中心)在液體種子培養(yǎng)基中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)24小時(shí)；
3)向步驟(1)所述培養(yǎng)基中接入步驟(2)制備的產(chǎn)油微生物種子液，接種量(以DCW)計(jì))為15g/L，在30℃下通氣培養(yǎng)80小時(shí)；
4)終止發(fā)酵，此時(shí)發(fā)酵液中殘余葡萄糖、甘油和脂肪酸的濃度分別為0.0g/L，0.1g/L和1.9g/L；固液分離收集菌體，干燥，得干菌體49.7g/L，油脂含量57.4％，TAG的含量78.5％，所得油脂中肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亞油酸的含量分別為35％、20％、39％和6％，脂肪酸組成類似可可脂，可以作為可可脂替代品。
上述實(shí)施例中所得油脂用途舉例說明
實(shí)施例1中所得的甘油脂，添加到小鼠食物中，研究油酸甘油酯在其體內(nèi)的代謝，了解油脂代謝相關(guān)疾病的機(jī)理。選取雄性的C57BL/6小鼠40只，體重(15±1)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為對(duì)照組和高脂組各20只。對(duì)照組給予普通基礎(chǔ)飼料，實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)高脂飼料(基礎(chǔ)飼料中添加實(shí)施例1中的油脂，使飼料64％能量來自脂肪，24％能量來自碳水化合物，12％能量來自蛋白質(zhì)，喂養(yǎng)6周。自由飲水，每周稱重1次。兩組小鼠禁食12h后，各隨即取10只摘眼球取血，制血清，-80℃保存待測(cè)。取附睪周圍及腹部皮下脂肪組織，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆?，采用ELISA法測(cè)定血清中PAI-1的水平。剩余的兩組小鼠則采用同位素示蹤法對(duì)油脂代謝進(jìn)行追蹤和采用代謝組學(xué)對(duì)小鼠肝臟、腹部皮下脂肪組織以及血液中脂肪酸的構(gòu)成進(jìn)行分析。結(jié)果表明高脂組小鼠體質(zhì)量、血清PAI-1的水平比對(duì)照組分別高15％和200％。高脂肪組小鼠肝臟、腹部皮下脂肪組織以及血液中13C全標(biāo)記脂肪酸含量占到總脂肪酸的4.7％，4.9％和5.1％，對(duì)照組組內(nèi)13C全標(biāo)記脂肪酸<1％。
實(shí)施例3所制備的甘油酯因含有月桂酸，經(jīng)分離可作為精細(xì)化學(xué)品、醫(yī)藥中間體、材料中間體。
實(shí)施例5中所得甘油酯，分離后可以作為食品、藥品、飲料的添加劑。
實(shí)施例6中的油脂可以作為功能性油脂，用于生產(chǎn)保健品。
實(shí)施例10中的油脂，所得油脂可以用作食品添加劑、藥物中間體。
實(shí)施例17中所得油脂經(jīng)過分離提純，可用于防粘劑、潤滑油、抗塵劑和渾濁劑。
實(shí)施例12和實(shí)施例21中所得含十三酸的油脂，可用作生產(chǎn)香皂、洗滌劑、化妝品表面活性劑、化學(xué)纖維油劑以及農(nóng)副除草劑和殺蟲劑的原料。
實(shí)施例22中所得油脂可以作為可可脂的替代品，用于巧克力、奶制品的生產(chǎn)。