本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種能夠和促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合并激活促紅細(xì)胞生成素受體或者能起促紅細(xì)胞生成素激動(dòng)作用的二硫鍵修飾的促紅細(xì)胞生成素?cái)M肽衍生物的結(jié)構(gòu)類似物，本發(fā)明還涉及該結(jié)構(gòu)類似物在治療以缺乏紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：人體中的促紅細(xì)胞生成素是由腎皮質(zhì)腎小管周圍間質(zhì)細(xì)胞和肝臟分泌的一種激素樣物質(zhì)，能夠促進(jìn)紅細(xì)胞生成。服用促紅細(xì)胞生成素可以使患腎病貧血的病人增加血流比溶度(即增加血液中紅細(xì)胞百分比)。各種貧血的特征是血液攜帶氧的容量下降，從而具有類似的表現(xiàn)和癥狀，包括皮膚和粘膜蒼白、虛弱、頭昏眼花、容易疲勞、嗜睡，導(dǎo)致生活質(zhì)量下降。重癥貧血患者表現(xiàn)為呼吸困難和心功能失常。貧血通常與血液缺乏紅血細(xì)胞或血紅素(hemoglobin)有關(guān)。貧血常見源因包括缺乏鐵、維生素B12和葉酸。貧血還可由慢性疾病(例如炎癥，包括骨髓受炎癥抑制造成的疾病等)發(fā)展而成。貧血還可由失血(例如由于事故、外科手術(shù)或藥物如阿司匹林和布洛吩引起的腸胃出血)引起。連續(xù)的失血還見于月經(jīng)周期嚴(yán)重失血的女性，以及胃潰瘍十二指腸潰瘍、痔瘡或胃癌或腸癌等病人。各種情況可能破壞紅血球(溶血)，從而導(dǎo)致貧血。例如，對細(xì)胞毒素的過敏反應(yīng)和各種化學(xué)制劑(例如磺酰胺和苯)的過敏反應(yīng)可導(dǎo)致溶血。溶血性貧血通常由化學(xué)性毒物、寄生蟲、傳染或鐮狀細(xì)胞貧血癥引起。另外，還有一些非常見情況，由于機(jī)體產(chǎn)生自身紅血球的抗體而導(dǎo)致溶血。骨髓疾病或損傷可導(dǎo)致貧血，因?yàn)楣撬枋巧杉t血球(即紅血球合成)的組織。射線輻照、疾病或各種化學(xué)制劑也可能導(dǎo)致骨髓破壞，產(chǎn)生再生障礙性貧血。進(jìn)行化療的癌癥病人?；加性偕系K性貧血。貧血還與腎功能不全有關(guān)，貧血的程度與腎功能不全的程度高度相關(guān)。大多數(shù)進(jìn)行腎透析的腎衰竭病人患有慢性貧血除了由腎臟產(chǎn)生以外，紅細(xì)胞生成素還可由星形細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生，并且紅細(xì)胞生成素和紅細(xì)胞生成素受體表達(dá)在腦周邊界面的毛細(xì)管上。此外，在大腦和脊椎局部失血、機(jī)械外傷、癲癇癥、excitotoxins和神經(jīng)炎癥時(shí)，全身給藥的紅細(xì)胞生成素可穿過血-腦屏障并降低神經(jīng)細(xì)胞的損失。美國國家科學(xué)學(xué)會會報(bào)(ProcNatlAcadSciUSA)98：4044-404)。在八十年代后期，Amgen介紹了一種經(jīng)基因工程產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素用于治療慢性腎衰竭病人的貧血。還可將紅細(xì)胞生成素給予待進(jìn)行化療和/或放療的癌癥病人，以降低對輸血的需求。紅細(xì)胞生成素可用于治療與HIV感染或疊氮胸苷(AZT)治療有關(guān)的貧血。盡管紅細(xì)胞生成素治療的市場擴(kuò)大了，但是將來的銷售受到產(chǎn)品高成本的不利影響。另外，重組紅細(xì)胞生成素治療需要每周1-3次靜脈內(nèi)給藥紅細(xì)胞生成素，治療期長達(dá)12個(gè)星期，這是一種限制自己服藥的治療方案，使病人感到不方便。此外，由于在重組人體紅細(xì)胞生成素中廣泛的不同程度的糖基化作用不易重復(fù)，因此人體血清紅細(xì)胞生成素的分子大小存在異質(zhì)性性腎衰竭病人的貧血。還可將紅細(xì)胞生成素給予待進(jìn)行化療和/或放療的癌癥病人，以降低對輸血的需求。紅細(xì)胞生成素可用于治療與HIV感染或疊氮胸苷(AZT)治療有關(guān)的貧血。促紅細(xì)胞生成素的部分生物學(xué)效應(yīng)可以通過和細(xì)胞膜表面的受體內(nèi)在作用來調(diào)節(jié)。某種程度上能夠作用促紅細(xì)胞生成素受體的肽已經(jīng)被確定和敘述。特別是確定了一組含有主要肽段的肽，這些肽可以和促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合并能剌激促紅細(xì)胞生成素細(xì)胞的分化增殖。但是能夠刺激紅細(xì)胞增殖分化的肽的EC50卻很低，在20nM和250nM之間，因此這些肽在臨床應(yīng)用上受到了較大的限制。雖然，二硫鍵是多肽和蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的組成部分，但它在天然的情況下卻是繼蛋白質(zhì)的二級、甚至三級結(jié)構(gòu)形成之后形成的，二硫鍵修飾廣泛存在于多肽蛋白質(zhì)藥物之中，對多肽和蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)具有重要影響。二硫鍵還原之后得到具有高反應(yīng)活性的巰基，然后通過重建三碳橋的方法替代了二硫鍵對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。實(shí)驗(yàn)證明，通過二硫鍵對多肽或者蛋白質(zhì)進(jìn)行定點(diǎn)修飾的方法，具有反應(yīng)效率高、產(chǎn)物易于分離、多肽和蛋白質(zhì)的生物活性滿足臨床使用等優(yōu)點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種生物活性更好、生物利用度更高的促紅細(xì)胞生成素?cái)M肽衍生物。本發(fā)明所涉及的非常見氨基酸如下表1：表1本發(fā)明涉及的非常見氨基酸一方面，本發(fā)明的目的是提供一種具有長效促紅細(xì)胞生成功能的促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物。再一方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物的制備方法以及其在用于制備治療以缺乏紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病的藥物中的用途。本發(fā)明所述序列如下：即EPO模擬肽單體通過二硫鍵形成二聚體，但是本發(fā)明所述的Fmoc固相多肽合成方法是指以聚合物樹脂作為固相反應(yīng)基質(zhì)，將氨基端Fmoc保護(hù)的氨基酸在偶聯(lián)試劑的存在下依次縮合，從而合成多肽的合成方法。優(yōu)選地，所述制備方法還包括將制得的多肽的純化，經(jīng)脫鹽及冷凍干燥得到多肽凍干粉的步驟；優(yōu)選地，所述純化使用HPLCC18半制備柱進(jìn)行，流動(dòng)相為乙腈。本發(fā)明還提供了所述促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物在制備用于治療以缺乏紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述以缺乏紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病選自末期腎功能衰竭或透析；AIDS相關(guān)性貧血，自身免疫性疾病，或惡性腫瘤；囊性纖維變性；早期早熟性貧血；與慢性炎性疾病相關(guān)的貧血；脊髓損傷；急性失血；衰老和伴有異常紅細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤疾病。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本專利涉及的促紅細(xì)胞生成素模擬肽及其可藥用鹽能夠明顯刺激小鼠外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的升高，說明它們刺激紅細(xì)胞生成，同時(shí)還能夠大大延長藥物在體內(nèi)的半衰期。促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物和促紅細(xì)胞生成素蛋白對成熟的紅細(xì)胞、血細(xì)胞壓積、血紅蛋白含量。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。實(shí)施例1促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物的合成以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物為多肽，其制備可使用Fmoc固相多肽合成方法，使用CSBio公司生產(chǎn)的CS336X型儀器進(jìn)行本發(fā)明的多肽的合成。合成的方法按照生產(chǎn)商的儀器說明書進(jìn)行。本文所述的Fmoc固相多肽合成方法是指以聚合物樹脂作為固相反應(yīng)基質(zhì)，將氨基端Fmoc保護(hù)的氨基酸在偶聯(lián)試劑的存在下依次縮合，從而合成多肽的合成方法。其具體方法參見Fmocsolidphasepeptidesynthesis:apracticalapproach,2000,OxfordUniversityPress。并通過氧化方法形成單體內(nèi)二硫鍵，例如20％DMSO氧化法以及碘氧化法。將制得的多肽使用HPLCC18半制備柱進(jìn)行純化，流動(dòng)相為乙腈。經(jīng)脫鹽及冷凍干燥得到多肽凍干粉。實(shí)施例2.促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物對小鼠的作用采用小鼠評價(jià)并比較促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物及促紅細(xì)胞生成素蛋白對小鼠紅細(xì)胞生成的影響。其中，EPO藥品購自沈陽三生制藥有限責(zé)任公司；昆明種小鼠，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重25～30g，均為雌性小鼠，試驗(yàn)中各組動(dòng)物數(shù)：10只，分為3組。其中，1組小鼠皮注射促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物，1組小鼠注射促紅細(xì)胞生成素蛋白，1組小鼠為空白對照，注射PBS緩沖液，劑量均為4.5mg/kg，連續(xù)三天，然后處死小鼠，取全血進(jìn)行外周血細(xì)胞及網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)用全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。結(jié)果如表2所示，發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物及促紅細(xì)胞生成素蛋白均能明顯刺激小鼠外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的升高，說明它們剌激紅細(xì)胞生成(見表2)。表2促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物對小鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞生成的影響名稱劑量網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)目空白PBS緩沖液123.34±2.55衍生物4.5mg/kg658.32±2.15EPO4.5mg/kg532.32±2.63實(shí)施例4.促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物對大鼠的作用采用大鼠評價(jià)并比較促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物及促紅細(xì)胞生成素蛋白對大鼠紅細(xì)胞生成的影響。其中，EPO藥品購自沈陽三生制藥有限責(zé)任公司；SD大鼠，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重25～30g，均為雌性大鼠，試驗(yàn)中各組動(dòng)物數(shù)：10只，分為3組。其中，1組大鼠皮注射促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物，1組大鼠注射促紅細(xì)胞生成素蛋白，1組大鼠為空白對照，注射PBS緩沖液，劑量均為4.5mg/kg，單次給藥后，連續(xù)三天取血進(jìn)行外周血細(xì)胞及網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)用全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，并計(jì)算衍生物的長效性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)衍生物1在單次給藥后2周內(nèi)依然具有刺激紅細(xì)胞生成作用，結(jié)果見表3。表3促紅細(xì)胞生成素模擬肽衍生物對大鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞生成的影響當(dāng)前第1頁1 2 3