本發(fā)明屬醫(yī)藥生物技術領域，具體涉及一類人羧酸酯酶1(hCE1)的特異性探針底物及其應用。

背景技術：

作為臟器和組織的特征標志物，hCE1在人群的肝臟中含量很高，其蛋白表達量在肝臟分布蛋白中排前十位。hCE1是一種膜結合蛋白，定位于細胞內質網(wǎng)中【CANCER RESEARCH 1998；58:3627-32&Drug Metab.Pharmacokinet.2006；21:173-85】，同時也會分泌到細胞外進入血液循環(huán)系統(tǒng)【Proteomics 2009；9:3989–99】。hCE1的基本代謝反應是催化含較小醇基和較大酰胺基底物的水解。雖然，在多種組織的中都檢測到hCE1的蛋白表達，但其在人肝臟組織含量遠高于其它組織。hCE1參與多種外源性物質的代謝清除，例如藥物奧司他韋、哌醋甲酯等。同時，hCE1在維持人體正常生理功能功能發(fā)揮不可忽視的作用，參與人體內膽固醇酯和游離脂肪酸的運輸和代謝過程，維持脂質代謝平衡【Chemistry&Biology,Vol.10,341–349,April,2003】。在正常健康人體中，hCE1除了以較高的含量分布在肝組織的細胞中，也有少量hCE1在血漿中被檢測到，更重要的是，肝細胞肝癌患者血漿中的hCE1是健康人群的2-5倍，因此hCE1被認為是肝細胞肝癌早期診斷的一種良好的潛在血清學標志物【Proteomics 2009,9,3989–3999】。此外，肝細胞破損相關的肝臟疾病患者也會有hCE1釋放入血，引起血漿中hCE1濃度發(fā)生變化，因此，血漿中hCE1可作為肝臟急性損傷的標志物。hCE1的分布存在很大的個體差異，hCE1酶的表達和功能本身會受到人體遺傳、年齡、疾病、性別、環(huán)境和共服藥物等多種因素的影響。因此，hCE1 酶的活性檢測方法具有廣闊的臨床應用前景，可用于評價人體肝臟功能異常、藥物及毒物導致的肝毒性、肝細胞癌早期診斷、肝功能個體化評估、以及部分前體藥物的個性化使用等。此外，hCE1作為維持人體脂質代謝平衡的重要蛋白，其抑制劑可作為降血脂藥物使用，hCE1也被FDA批準為重要的藥物作用靶點。hCE1活性的快速表征方法也可用于新藥研發(fā)早期發(fā)現(xiàn)及評估hCE1新型高效抑制劑。因此，開發(fā)高效、超靈敏、高特異性的hCE1活性檢測方法對于臨床樣本中hCE1活性的檢測，以及新藥高內涵高通量篩選至關重要。

技術實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明提供了一種人羧酸酯酶1(hCE1)的特異性探針底物及其應用，其經(jīng)hCE1水解后可生成具有熒光屬性的水解產物N-丁酸萘酰亞胺。該酶促反應具有選擇性高、代謝產物易檢測、酶活性及抑制劑活性評價快速省時的特點。

本發(fā)明的目的在于提供一類人羧酸酯酶1(hCE1)的特異性探針底物及其應用，該類特異性探針的水解產物具有良好的熒光屬性，易于檢測。利用該探針反應可對多種生物體系中的hCE1的分布和功能進行定量評價。

本發(fā)明一類人羧酸酯酶1(hCE1)的特異性熒光探針底物，該類底物的甲酯鍵可被hCE1特異性水解為相應的水解產物；該底物為4-羥基或4-烷氧基萘酰亞胺N-丁酰甲酯，其結構通式下：

其中R為-H、-CH₃取代基中的一種。

本發(fā)明還提供了一種hCE1的特異性熒光探針的應用，該類底物可被hCE1特異性識別并催化發(fā)生水解反應，通過定量檢測單位時間內水解產物N-丁酸萘酰亞胺的生成量即可測定不同酶源(單酶、組織、細胞、血漿)中的hCE1活性；

所述生物樣本可為重組表達的hCE1、人或動物的細胞制備物、組織制備液或血漿及其他常見生物樣本。

具體測定方法為：

具體測定方法為：

1)體系中以式(1)所示任意化合物作為特異性探針底物；底物濃度選擇1/10～10K_m；；

2)在PBS或Tris-HCl等常用緩沖液中，反應溫度介于20-60℃之間，；孵育體系pH介于5.5～10.5之間，；

3)反應時間為5-120min，在確保以上底物相應的水解產物達到定量限且底物轉化率不超過20％時終止反應；

4)測定單位時間內水解產物生成量作為hCE1活性的評價標準。

所述具體測定方法中單點測定時底物濃度優(yōu)選K_m，優(yōu)選37℃為最優(yōu)反應時間，優(yōu)選pH 7.4為最優(yōu)反應pH。

所述底物消除率或水解產物的生成率介于0.1％～20％之間。

所述探針底物及其水解產物均具有熒光屬性，可采用熒光檢測器實現(xiàn)產物及底物的快速靈敏檢測；熒光檢測條件為：激發(fā)波長372nm，在420～520nm進行熒光發(fā)射譜的檢測。

本發(fā)明提供的一類hCE1的特異性熒光探針的應用，該特異性探針底物及其水解反應還可用于hCE1抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價。

本發(fā)明提供的一類hCE1的特異性熒光探針的應用，該特異性探針底物及相應hCE1活性檢測過程不會受到生物體系基質及雜質的干擾，可用于各種生物體系中hCE1酶活的定量檢測。

本發(fā)明提供了所述特異性熒光探針的應用，該特異性探針底物用于重組表達的hCE1、人或動物的細胞制備物、組織制備液、血漿等常見生物樣本中酶活的定量測定，以及利用該探針反應快速篩選hCE1酶的抑制劑。

本發(fā)明涉及的hCE1特異性探針反應具有如下優(yōu)點：

1.高特異性：萘酰亞胺N-丁酰甲酯類化合物可被hCE1特異性代謝成一個代謝產物，即甲酯鍵斷裂的水解產物，人體其余水解酶均不參與該反應。

2.高靈敏度：萘酰亞胺N-丁酰甲酯類化合物可被hCE1快速水解釋放出N-丁酸萘酰亞胺，且底物與產物均具有良好的熒光發(fā)射光譜特征，可利用熒光檢測器實現(xiàn)超靈敏檢測，其對目標物的檢測下限可達pM級。

附圖說明

圖1.N-丁酰甲酯-4-羥基-1,8萘酰亞胺的¹³C-NMR譜圖；

圖2.N-丁酰甲酯-4-羥基-1,8萘酰亞胺及水解產物的檢測色譜圖；

圖3.N-丁酰甲酯-4-甲氧基-1,8萘酰亞胺的人重組單酶篩選試驗結果；

圖4.12例HLM對N-丁酰甲酯-4-甲氧基-1,8萘酰亞胺的水解速率差異；

圖5.人血漿水解N-丁酰甲酯-4-甲氧基-1,8萘酰亞胺的化學抑制譜圖；

圖6.N-丁酰甲酯4-乙氧基-1,8萘酰亞胺測定不同細胞中hCE1的活性譜；

圖7.N-丁酰甲酯-4-甲氧基-1,8萘酰亞胺的合成路線。

具體實施方式

下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。

實施例1

N-丁酰甲酯-4-甲氧基-1,8萘酰亞胺的合成

將4.2mmol 4-氨基丁酸加入到含有1克(3.61mmol)4-溴-1，8萘酐的50ml乙醇溶液中，70-80℃反應過夜后，加入200ml水，析出大量固體，過濾，真空干燥得到米黃色固體N-丁酸-4-溴-1,8-萘酰亞胺，產率80-90％。將800mg化合物N-丁酸-4-溴-1，8-萘酰亞胺與2.54g碳酸鉀置于100ml單口瓶中，加入30ml甲醇，60-70℃反應過夜后，冷卻，用1M的鹽酸將pH調至酸性，析出大量黃色固體，過濾，大量水洗，真空干燥得到黃色固體N-丁酸-4-甲氧基-1,8-萘酰亞胺，產率80-90％。將0.1g N-丁酸-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺溶解于15mL甲醇,加入濃硫酸若干滴。反應體系攪拌回流8小時。冷卻到室溫后，真空干燥后通過硅膠柱純化，洗脫液二氯甲烷/甲醇(10:1)，真空得到干燥得到0.086g黃色固體，產率82.1％?；衔锝?jīng)高分辨質譜、核磁鑒定為N-丁酰甲酯-4-甲氧基-1，8-萘酰亞胺(圖1，圖7)。

實施例2

體外測定人重組單酶中hCE1的選擇性

(1)預先準備198μl hCE1代謝反應體系，包括pH 7.4的PBS緩沖液(100mM)、人重組各單酶(5μg/mL)，于37℃條件下震蕩預孵3分鐘；

(2)向反應體系中加入2μl濃度為5mM的N-(4-丁酸甲酯)-4-甲氧基-1,8萘酰亞胺起始反應；

(3)15分鐘后，加入200μl冰乙腈，劇烈震蕩后，終止反應；

(4)用高速冷凍離心機在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘后，取上清，進行液相-熒光檢測(液相檢測波長247nm；熒光檢測Ex＝362nm，Em＝450nm)(圖2)；重組人hCE1特異性參與其水解，其它酯酶均不參與其水解，證實該類化合物具有非常好的選擇性(圖3)。

實施例4

不同個體來源肝微粒體中hCE1的活性定量評估

(1)選取12例個體人肝微粒體(HLM)稀釋至100μg/mL，準備hCE1代謝反應體系，包括pH 7.4的PBS緩沖液(100mM)、人肝微粒體(1μg/mL)、于37℃條件下震蕩預孵3分鐘；

(2)向反應體系中加入2μl濃度為5mM的N-(4-丁酰甲酯)-4-甲氧基-1,8萘酰亞胺起始反應；

(3)30分鐘后，加入200μl冰乙腈，劇烈震蕩后，終止反應；

(4)用高速冷凍離心機在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘后，取上清，進行進行液相-熒光檢測(液相檢測波長247nm；熒光檢測Ex＝362nm，Em＝450nm)，將所獲色譜峰面積代入標準曲線后得到12例人肝微粒體(HLM)對N-(4-丁酰甲酯)-4-甲氧基-1,8萘酰亞胺的代謝速率(圖4)。

實施例5

人血漿樣本中hCE1的活性化學抑制實驗

(1)準備hCE1代謝反應體系，包括pH 7.4的PBS緩沖液(100mM)、人血漿樣本(10μL)、不同酯酶特異性抑制劑(1μL)于37℃條件下震蕩預孵3分鐘；

(2)向反應體系中加入1μl濃度為10mM的N-(4-丁酰甲酯)-4-甲氧基-1,8萘酰亞胺起始反應；

(3)60分鐘后，加入200μl冰乙腈，劇烈震蕩后，終止反應；

(4)用高速冷凍離心機在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘后，取上清，進行進行液相-熒光檢測(液相檢測波長247nm；熒光檢測Ex＝362nm，Em＝450nm)，N-(4-丁酰甲酯)-4-甲氧基-1,8萘酰亞胺在血漿中的水解活性能夠被羧酸酯酶特異性抑制劑BNPP顯著抑制，而其它酯酶抑制劑對其水解沒有顯著的抑制活性，證實N-(4-丁酰甲酯)-4-甲氧基-1,8萘酰亞胺能夠特異性檢測人體血漿中的hCE1的活性(圖5)。

實施例6

定量測定人五種腫瘤細胞中hCE1的活性

hCE1代謝反應體系總體積為200μL包括pH 7.4的PBS緩沖液100mM，及五種腫瘤細胞制備成的微粒體0.5mg/Ml,37℃下震蕩預孵3分鐘，向反應體系中加入2μl濃度為5mM的N-(4-丁酰甲酯)-4-乙氧基-1,8萘酰亞胺起始反應，35分鐘后，加入200μl冰乙腈，劇烈震蕩后，終止反應，取上清進行液相-熒光分析，將所獲色譜峰面積代入標準曲線后得到五種腫瘤細胞微粒體對N-(4-丁酰甲酯)-4-乙氧基-1,8萘酰亞胺的水解速率(圖6)。