本發(fā)明屬于生物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種從松子油中純化皮諾斂酸的方法。

背景技術(shù)：
紅松(PinuskoraiensisSieb.etZucc)又名果松，屬于松科植物，主要分布在我國東北長白山到小興安嶺一帶。屬珍稀植物。其果球大呈卵圓形，暗褐色，球內(nèi)結(jié)子，大如巴豆、故意稱紅松子。松子作為美味小食品，市場上售價(jià)很高，約為30元/公斤，其種仁油中含有多種極具開發(fā)價(jià)值的生理活性物質(zhì)，如維生素A、維生素E以及人體必需的多種不飽和脂肪酸、磷脂、甾醇、多糖、黃酮等，人們飲食結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)保健作用都具重要意義。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為松子為味美食品，油可食，具有降高血脂作用。據(jù)李時(shí)珍《本草綱目》記載：松子味甘，性小溫，無毒。主治骨關(guān)節(jié)風(fēng)濕、頭眩、祛風(fēng)濕、潤五臟、充饑，逐風(fēng)痹寒氣、補(bǔ)體虛、滋潤皮膚，久服輕身延年不老。另有潤肺功能，治燥結(jié)咳?，F(xiàn)代藥理研究表明松子油的主要功效都是其中的皮諾斂酸引起的，研究表明其不僅能夠降低膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)，升高高密度脂蛋白(HDL)，而且還能抑制、消除其他不飽和脂肪酸對(duì)機(jī)體的不利影響。同時(shí)，目前最新研究表明，它還具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛，對(duì)抗各種真菌、病毒感染，促進(jìn)中老年人排泄功能等作用。它被專家譽(yù)為洗血因子,是剛剛引起醫(yī)學(xué)界重視的新功能因子。能夠調(diào)節(jié)血脂異常，在美國已有以其為主要功能成分的減肥食品出售。并且它只存在于松子油中。皮諾斂酸結(jié)構(gòu)如下式所示：其結(jié)構(gòu)是含有三個(gè)不飽和鍵的不飽和脂肪酸，而松子油大部分都是飽和脂肪酸，如何從脂肪酸中分離開飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，一直是研究難點(diǎn)，一般非高壓的制備型液相色譜都很難分離開亞油酸和亞麻酸，目前方法有：低溫結(jié)晶法、尿素包合法、銀離子吸附分離法、柱色譜法、精餾分離法、硝酸銀絡(luò)合萃取法、色譜分離法、脂肪酶分離法和冷凍結(jié)晶法等。尿素包合法常用于分離不飽和脂肪酸，為得到高純度產(chǎn)品需要配合低溫結(jié)晶多次包合，存在造成收率低、尿素回收困難等缺點(diǎn)。分子蒸餾法，需要低溫高真空度下進(jìn)行，雖然能有效防止不飽和酸受熱氧化分解，但需高真空設(shè)備，通過多級(jí)蒸餾處理后可獲得不飽和脂肪酸，但需要有專用的分子蒸餾設(shè)備，耗能較高，投入成本高，并且研究顯示依靠單一的分子蒸餾手段不能獲得高純度的不飽和脂肪酸。銀離子吸附分離法具有選擇性，能獲得高純度的不飽和脂肪酸，但洗脫劑易造成環(huán)境污染且分離的規(guī)模較小，柱填料不能重復(fù)使用。柱色譜法是現(xiàn)代分離檢測方法，適用于少量定性分離不適用于大批量生產(chǎn)。硝酸銀絡(luò)合萃取法具有高選擇性，但此方法適用范圍小，溶劑價(jià)格高且回收再利用比較難。脂肪酶分離法利用脂肪酶對(duì)甘油三酯進(jìn)行選擇性水解從而達(dá)到分離目的，具有選擇性，但脂肪酶價(jià)格昂貴，固化效果不穩(wěn)定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種從松子油中純化皮諾斂酸的方法，提供一種操作簡便、安全、經(jīng)濟(jì)、不飽和脂肪酸純度和收率較高，并能適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)需求的不飽和脂肪酸的分離方法。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是，包括下列步驟：A.松子油的皂化處理；B.萃取液的配制；C.絡(luò)合皮諾斂酸；D.解離皮諾斂酸；E.皮諾斂酸洗脫。本發(fā)明一種實(shí)施方式是所述步驟A.松子油的皂化處理是指，取紅松松子油，置于4-8倍體積的60-100％乙醇溶液中，加入乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％-30％的氫氧化鈉或氫氧化鉀，室溫?cái)嚢?4-48h或加熱回流0.5-2h后，減壓回收乙醇溶液至原體積的1/2-1/5，加入蒸餾水至原體積的0.5-2倍，調(diào)pH2-3,加入相同體積正己烷或石油醚萃取2-3次，減壓回收有機(jī)溶劑得皂化后的松子油脂肪酸。本發(fā)明一種實(shí)施方式是所述步驟B.萃取液的配制是指：配制硫酸銅2mol/l-4mol/l的無機(jī)離子水液，并添加體積比1/8-1/3的甲醇；有機(jī)相為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-30％的季戊四醇四油酸酯的石油醚。本發(fā)明一種實(shí)施方式是所述步驟C.絡(luò)合皮諾斂酸是指，將皂化后的松子油脂肪酸用正己烷或石油醚溶解配成0.2-1.0g/ml有機(jī)溶液，按1:1-1:3配比加入步驟B配好的無機(jī)離子水液，和含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-30％的季戊四醇四油酸酯的石油醚，攪拌均勻放置0度-零下15度的反應(yīng)釜中，并攪拌低溫萃取30-60min。本發(fā)明一種實(shí)施方式是所述步驟D.解離皮諾斂酸是指，將萃取液倒入分液漏斗里靜置30min-60min，待液體完全靜置分層后，傾放出下層水液，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜加入等量的正己烷，加熱至50度-70度，攪拌萃取30min-60min。本發(fā)明一種實(shí)施方式是所述步驟E.皮諾斂酸洗脫是指，將上步萃取液靜置，分層后，放出正己烷部位，加入飽和NaCl溶液體積是正己烷的2-5倍，然后分層保留正己烷部位，后用蒸餾水洗脫，體積是正己烷的10-20倍，分層后正己烷部位加無水硫酸鈉放置過夜除水后，減壓蒸餾除去正己烷得產(chǎn)品。本發(fā)明選擇與銀離子同族的銅離子為無機(jī)水相離子，并選含季戊四醇四油酸酯為有機(jī)相，選擇性的萃取了含三個(gè)不飽和鍵的皮諾斂酸。這里的季戊四醇四油酸酯起到兩個(gè)作用，一是能結(jié)合飽和脂肪酸進(jìn)入有機(jī)相，二是能起到一種極化作用促進(jìn)銅離子與含三個(gè)不飽和鍵的皮諾斂酸絡(luò)合。一般銀離子能夠與三個(gè)雙鍵以上的不飽和脂肪酸絡(luò)合進(jìn)入水相，其原理是不飽和鍵的π電子進(jìn)入銀離子的空d軌道發(fā)生絡(luò)合，但由于銀離子比較昂貴限制了其應(yīng)用，本發(fā)明選擇了價(jià)格便宜的銅離子也能提供一個(gè)空軌道，在促極化劑的作用下不飽和脂肪酸的雙鍵變形從而易于提供π電子，銅離子與不飽和的脂肪酸絡(luò)合進(jìn)入水相，達(dá)到分離的目的。采用本發(fā)明方法最終得到的松子油不飽和酸達(dá)到99.5％以上，其中皮諾斂酸達(dá)到75％以上，并且所使用的萃取劑容易配制，成本低廉，本方法適合產(chǎn)業(yè)規(guī)?；a(chǎn)松子油中的皮諾斂酸。附圖說明圖1是松子油不飽和脂肪酸的HPLC測定圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1包括下列步驟：A.松子油的皂化處理；取紅松松子油，置于4倍體積的60％乙醇溶液中，加入乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％的氫氧化鈉或氫氧化鉀，室溫?cái)嚢?4h或加熱回流0.5h后，減壓回收乙醇溶液至原體積的1/5，加入蒸餾水至原體積的0.5倍，調(diào)pH2,加入相同體積正己烷或石油醚萃取2次，減壓回收有機(jī)溶劑得皂化后的松子油脂肪酸；B.萃取液的配制；萃取液的配制是指，配制一種含無機(jī)離子的水液及能夠與飽和脂肪酸結(jié)合的含季戊四醇四油酸酯的有機(jī)相，其中無機(jī)離子能夠與松子油中的皮諾斂酸絡(luò)合成水相進(jìn)而與松子油中其它脂肪酸分離的液體；配制硫酸銅2mol/l的無機(jī)離子水液，并添加體積比1/8的甲醇；有機(jī)相為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-30％的季戊四醇四油酸酯的石油醚；C.絡(luò)合皮諾斂酸；將皂化后的松子油脂肪酸用正己烷或石油醚溶解配成0.2g/ml有機(jī)溶液，按1：1配比加入步驟B配好的無機(jī)離子水液，和含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的季戊四醇四油酸酯的石油醚，攪拌均勻放置0度的反應(yīng)釜中，并攪拌低溫萃取30min；D.解離皮諾斂酸；將萃取液倒入分液漏斗里靜置30min，待液體完全靜置分層后，傾放出下層水液，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜加入等量的正己烷，加熱至50度，攪拌萃取30min；E.皮諾斂酸洗脫；將上步萃取液靜置，分層后，放出正己烷部位，加入飽和NaCl溶液體積是正己烷的2倍，然后分層保留正己烷部位，后用蒸餾水洗脫，體積是正己烷的10倍，分層后正己烷部位加無水硫酸鈉放置過夜除水后，減壓蒸餾除去正己烷得產(chǎn)品。實(shí)施例2包括下列步驟：A.松子油的皂化處理；取紅松松子油，置于6倍體積的80％乙醇溶液中，加入乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)20％的氫氧化鈉或氫氧化鉀，室溫?cái)嚢?6h或加熱回流1.25h后，減壓回收乙醇溶液至原體積的7/20，加入蒸餾水至原體積的1.25倍，調(diào)pH2.5,加入相同體積正己烷或石油醚萃取3次，減壓回收有機(jī)溶劑得皂化后的松子油脂肪酸；B.萃取液的配制；配制硫酸銅3mol/l的無機(jī)離子水液，并添加體積比1/5的甲醇；有機(jī)相為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-30％的季戊四醇四油酸酯的石油醚；C.絡(luò)合皮諾斂酸；將皂化后的松子油脂肪酸用正己烷或石油醚溶解配成0.6g/ml有機(jī)溶液，按1：2配比加入步驟B配好的無機(jī)離子水液，和含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的季戊四醇四油酸酯的石油醚，攪拌均勻放置零下7.5度的反應(yīng)釜中，并攪拌低溫萃取45min；D.解離皮諾斂酸；將萃取液倒入分液漏斗里靜置45min，待液體完全靜置分層后，傾放出下層水液，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜加入等量的正己烷，加熱至60度，攪拌萃取45min；E.皮諾斂酸洗脫；將上步萃取液靜置，分層后，放出正己烷部位，加入飽和NaCl溶液體積是正己烷的3.5倍，然后分層保留正己烷部位，后用蒸餾水洗脫，體積是正己烷的15倍，分層后正己烷部位加無水硫酸鈉放置過夜除水后，減壓蒸餾除去正己烷得產(chǎn)品。所得松子油不飽和脂肪酸的HPLC測定，如圖1所示，可以看出主要由兩種脂肪酸構(gòu)成，其中保留時(shí)間3.4min的是皮諾斂酸含量75.12％，保留時(shí)間4.6min的是亞油酸含量22.25％，整個(gè)樣品的不飽和酸純度達(dá)到97.35％。實(shí)施例3包括下列步驟：A.松子油的皂化處理；取紅松松子油，置于8倍體積的100％乙醇溶液中，加入乙醇溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％的氫氧化鈉或氫氧化鉀，室溫?cái)嚢?8h或加熱回流2h后，減壓回收乙醇溶液至原體積的1/2，加入蒸餾水至原體積的2倍，調(diào)pH3,加入相同體積正己烷或石油醚萃取3次，減壓回收有機(jī)溶劑得皂化后的松子油脂肪酸；B.萃取液的配制；配制硫酸銅4mol/l的無機(jī)離子水液，并添加體積比1/3的甲醇；有機(jī)相為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-30％的季戊四醇四油酸酯的石油醚；C.絡(luò)合皮諾斂酸；將皂化后的松子油脂肪酸用正己烷或石油醚溶解配成1.0g/ml有機(jī)溶液，按1:3配比加入步驟B配好的無機(jī)離子水液，和含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的季戊四醇四油酸酯的石油醚，攪拌均勻放置零下15度的反應(yīng)釜中，并攪拌低溫萃取60min；D.解離皮諾斂酸；將萃取液倒入分液漏斗里靜置60min，待液體完全靜置分層后，傾放出下層水液，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜加入等量的正己烷，加熱至70度，攪拌萃取60min；E.皮諾斂酸洗脫；將上步萃取液靜置，分層后，放出正己烷部位，加入飽和NaCl溶液體積是正己烷的5倍，然后分層保留正己烷部位，后用蒸餾水洗脫，體積是正己烷的20倍，分層后正己烷部位加無水硫酸鈉放置過夜除水后，減壓蒸餾除去正己烷得產(chǎn)品。