本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，食品及飼料中鹿源DNA的PCR核酸擴(kuò)增以及側(cè)向流免疫膠體金試紙條試劑盒的制備和應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：
為防止牛海綿狀腦病(bovinespongiformencephalopathy,BSE)經(jīng)添加在動(dòng)物飼料中的牛肉、牛骨傳播，1994年歐盟和1997年美國分別在1994年和1997年制定禁止在反芻動(dòng)物的飼料中添加反芻動(dòng)物源性蛋白的法規(guī)，2000年歐盟將這項(xiàng)禁令擴(kuò)大到禁止向用于食用的動(dòng)物飼喂加工過的哺乳動(dòng)物、鳥類和魚類蛋白成分。我國農(nóng)業(yè)部于2004年頒布的《動(dòng)物源性飼料產(chǎn)品安全衛(wèi)生管理辦法》中規(guī)定禁止在反芻動(dòng)物飼料中使用動(dòng)物源性飼料產(chǎn)品(乳及乳制品除外)，但在食品及動(dòng)物飼料中人為摻入反芻動(dòng)物(主要是牛、羊)肉和骨制品的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。近年來，國內(nèi)外食品市場上假羊肉、假牛肉等以假亂真現(xiàn)象層出不窮，動(dòng)物源性食品摻雜摻假等各種食品安全事件的頻發(fā)越來越讓老百姓心驚膽顫。2013年初，歐洲的“馬肉風(fēng)波”愈演愈烈，使得消費(fèi)者“聞馬色變”。之后歐美的“魚肉風(fēng)波”又再一次拉響了食品安全的警鐘。要保證食品及飼料的安全，需要靈敏、便捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法提供基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的食品及飼料中動(dòng)物性成分鑒定主要通過顯微鏡檢、基于蛋白質(zhì)檢測(cè)的免疫學(xué)方法以及基于核酸檢測(cè)的各類PCR方法，近年還發(fā)展了近紅外檢測(cè)法(NIRS)。食品及飼料成分中摻入的各種動(dòng)物源成分在高溫處理和加工過程中易于受到破壞，不同種屬動(dòng)物的蛋白質(zhì)序列之間差異不大，難以區(qū)別，發(fā)明專利“SDS-PAGE法鑒別肉及肉制品中動(dòng)物源性成份”(公開號(hào)：CN102213720A)提供了一種以蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳方式鑒定豬、牛、羊、雞、魚的動(dòng)物蛋白的方法，但不同來源和處理方式的蛋白電泳譜帶不同，帶來結(jié)果判別的障礙，對(duì)于飼料中的動(dòng)物成分更難以實(shí)施。因?yàn)榛蚓幋a序列的簡并性特征和非編碼序列的存在，核酸成為較蛋白更易檢出差異的靶分子，特別是線粒體DNA，拷貝數(shù)高，存在物種間差異，對(duì)其差異片段的分析是主要的鑒定方法，這類方法因靈敏度高、特異性好、耗時(shí)少而發(fā)展迅速，主要的方法包括普通/熒光PCR方法及基因芯片技術(shù)。在以線粒體DNA序列進(jìn)行物種的種屬鑒別時(shí)，常用的區(qū)域包括編碼細(xì)胞色素B的Cytochromeb基因(cytB)、核糖體小亞基12SRNA編碼序列(12SribosomalRNA)、細(xì)胞色素C亞基I(cytochromeCoxidasesubunitI)的編碼基因coxI、編碼ATP8及ATP6的atp8及atp6基因以及控制區(qū)D-loop片段。這些區(qū)域的序列變異適中，即在種內(nèi)有一定的保守性，又體現(xiàn)出一定的種間差異。熒光定量PCR技術(shù)是一種高靈敏度核酸檢測(cè)和定量方法，基本原理是在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。熒光定量PCR技術(shù)使定性檢測(cè)邁上了可以量化的臺(tái)階，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無污染性，具有實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，特別是依賴探針結(jié)合的TaqMan方法，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。在物種鑒定應(yīng)用方面，國內(nèi)已經(jīng)發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)涵蓋了鹿、羊、鹿、駱駝、馬、驢、豬、兔、狗和魚等哺乳動(dòng)物或水生生物。鑒于反芻動(dòng)物的重要性，發(fā)明專利“鑒別反芻動(dòng)物源性成分的熒光PCR檢測(cè)試劑及制備方法和應(yīng)用”(公開號(hào)：CN101659996A)描述了一種能同時(shí)鑒別牛、羊和山羊的熒光PCR方法，以三條探針進(jìn)行動(dòng)物來源甄別，公開號(hào)為CN102876805的發(fā)明專利“鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定用引物體系”以鑒定鹿血制品為目的，設(shè)計(jì)了一套用于鑒別鹿、豬、牛、羊、馬、驢、兔、雞來源成分的多重PCR引物，以凝膠電泳方式進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于鹿源性制品的檢測(cè)，主要目的是防止以其他動(dòng)物源制品替代鹿源成分，出于此種目的，既有總括性的方法，比如發(fā)明專利“快速檢測(cè)鹿源性鹿產(chǎn)品真?zhèn)蔚腜CR試劑盒及制備方法(公開號(hào)CN102618653)”及發(fā)明專利“一種快速檢測(cè)鹿產(chǎn)品的多重PCR試劑盒及制備方法(公開號(hào)CN102618653)”分別提供了一套鹿特異引物及多重引物進(jìn)行鑒定的方法，也有基于特定品種進(jìn)行鑒定的方法描述，比如發(fā)明專利“快速檢測(cè)塔里木馬鹿源性鹿產(chǎn)品PCR試劑盒及制備方法(CN102618652)”、“一種快速檢測(cè)馬鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒(CN102605097)”、“一種快速檢測(cè)水鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒及制備方法(CN102605096)”以及“一種快速檢測(cè)馴鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒及制備方法(CN102605095)”分別描述了以常規(guī)PCR結(jié)合凝膠電泳鑒別塔里木馬鹿、馬鹿、水鹿及馴鹿的方法。上述方法均為常規(guī)的PCR方法，需要對(duì)產(chǎn)物凝膠電泳后進(jìn)行圖像采集和分析，耗費(fèi)時(shí)間較長，且難以保證檢測(cè)的靈敏度。通過將免疫學(xué)檢測(cè)的方法移植于核酸產(chǎn)物檢測(cè)可以有效提高核酸產(chǎn)物的檢測(cè)效率。通過將PCR擴(kuò)增使用的引物標(biāo)記特定的蛋白質(zhì)或化合物可以在其擴(kuò)增產(chǎn)物中引入同時(shí)包括兩種化合物/蛋白質(zhì)標(biāo)記的核酸復(fù)合物，這個(gè)標(biāo)記的產(chǎn)物可以通過抗體或者配體以類似雙抗體夾心的方式進(jìn)行檢測(cè)，這個(gè)過程類似常規(guī)的免疫金標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，這種方法已經(jīng)在單核苷酸多態(tài)性以及恒溫?cái)U(kuò)增靶基因的方法中使用，特別是對(duì)病原微生物或疾病關(guān)聯(lián)基因的鑒定，公開號(hào)為CN102134596A的發(fā)明專利“一種基于核酸橫向流試紙條檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法”即以此方法進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)。而公開號(hào)為CN102520172A的發(fā)明專利“單增李斯特氏菌核酸層析檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用”描述了一種分別采用生物素和地高辛標(biāo)記引物的單增李斯特氏菌基因組檢測(cè)方法。因此類方法僅對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無進(jìn)行判斷，不對(duì)產(chǎn)物的分子量確認(rèn)，因此在擴(kuò)增反應(yīng)中的干擾因素更多一些，常見的引起假陽性的原因包括：非特異性擴(kuò)增、引物二聚體、擴(kuò)增產(chǎn)物間的異常復(fù)性，解決引物二聚體、異常退火造成的干擾可以從PCR聚合酶的選擇、引物序列優(yōu)化、dNTP底物、雜交過程的控制幾個(gè)方面開展。選擇具有熱啟動(dòng)(Hot-start)功能的DNA聚合酶可以明顯降低引物二聚體和非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。在引物優(yōu)化方面，公開號(hào)為CN102146432A的發(fā)明專利-“一對(duì)部分同序引物減少其二聚體的方法”描述了一種在引物5′端帶有短回文序列的引物設(shè)計(jì)方法，該引物常溫下自身環(huán)化，避免形成異源二聚體，公開號(hào)為CN102719547A的發(fā)明專利-“檢測(cè)HER2基因表達(dá)水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑”也采用了類似的方法用于實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增；公開號(hào)為CN101842494A的發(fā)明專利-“使用嵌合引物降低異源二聚體形成”描述了一種使用嵌合引物進(jìn)行擴(kuò)增的方法；在對(duì)反應(yīng)底物的優(yōu)化中，公開號(hào)CN101171343A的發(fā)明專利“含有假異胞嘧啶核酸堿基衍生物的3′修飾寡核苷酸及其作為引物或探針的應(yīng)用”提供了一種使用特別修飾的核苷酸作為底物以減少引物二聚體形成的方法，使用探針或者引入內(nèi)控探針也可以降低非特異擴(kuò)增的干擾，公開號(hào)為CN101957373A的發(fā)明專利“一種加入內(nèi)控核酸對(duì)病原體核酸進(jìn)行半定量檢測(cè)的方法”即采用內(nèi)控探針來降低干擾，上述方法中，使用熱啟動(dòng)技術(shù)和環(huán)化引物是通行的方法，其余方法或者采用了特殊合成的底物及底物，或者需要通過探針引入第二次雜交過程，都會(huì)增加檢測(cè)過程的復(fù)雜程度，特別是探針雜交方法，因需要保溫過程而失去了試紙條方法的便利性。本發(fā)明引物設(shè)計(jì)中，在保持特異性基礎(chǔ)上，對(duì)引物對(duì)及引物內(nèi)5′及3′末端退火的自由能進(jìn)行評(píng)估后選擇合適的區(qū)域避免二聚體的形成，針對(duì)試紙條檢測(cè)方法二聚體的干擾情況以適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增子長度，配合展開緩沖液中去污劑及變性劑的濃度優(yōu)化，可以實(shí)現(xiàn)引物二聚體和非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的有效清除。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
將生物小分子或化合物標(biāo)記的核酸分子可以被該小分子或化合物的抗體特異性識(shí)別，從而通過免疫學(xué)方法檢測(cè)。常見的可用于核酸分子標(biāo)記的分子包括半抗原分子生物素(Biotin)、地高辛(Digoxin)，熒光染料分子羅丹明(RBITC)、異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、Cy3、Cy5等。上述標(biāo)記分子中，地高辛、異硫氰酸熒光素都易于獲得特異的抗體，而生物素分子與其配體-鏈親和素具有高度特異的結(jié)合特性，因此這幾種分子都可以選擇用于核酸分子的標(biāo)記和免疫學(xué)檢測(cè)。本發(fā)明旨在將抗原或半抗原小分子標(biāo)記單鏈寡核酸作為引物，對(duì)待檢的靶核酸特異性擴(kuò)增，形成的復(fù)合物分子同時(shí)具備兩種抗原或半抗原標(biāo)記，免疫原性的，該復(fù)合物即可用與特異抗體或特異配體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的免疫膠體金檢測(cè)。因此，一方面，本發(fā)明提供一種試紙條法檢測(cè)食品及飼料制品中鹿源成分的檢測(cè)技術(shù)，主要包括：1)選擇Genbank數(shù)據(jù)庫中Cervuselaphus、Cervushortulorum、Cervusnipponcentrali、Cervusnipponkopschi、Cervusnipponsichuanicus、Cervusnipponyakushimae、Przewalskiumalbirostris等不同鹿的亞種(品種)的50種全長線粒體或部分序列，按照細(xì)胞色素B的Cytochromeb基因(cytB)、核糖體小亞基12SRNA編碼序列(12SribosomalRNA)、CoxI和D-loop區(qū)和ATP8-ATP6間序列經(jīng)種內(nèi)和種間序列比對(duì)后，分別設(shè)計(jì)獨(dú)特的引物經(jīng)過有效性和特異性測(cè)試，確定了兩條獨(dú)特的擴(kuò)增引物，，其中正向引物Deer-D-F具有如下序列：5′-GTACATAAAATTAATGTATTAGGAC-3′，用抗原或半抗原分子生物素(Biotin)、異硫氰酸熒光素(FITC)或地高辛(Digoxin)中的一種標(biāo)記；下游引物Deer-D-R的序列為5′-ATTAAATAGCTACCCCCACGATTC-3′，以不同于上游引物的一種標(biāo)記，；在適宜的擴(kuò)增條件下，可擴(kuò)增鹿線粒體基因組D-Loop區(qū)域一段長度為270bps的DNA片段；當(dāng)無被檢核酸模板存在時(shí)，無特異性核酸片段擴(kuò)增產(chǎn)物；2)將一種標(biāo)準(zhǔn)的通用抗體，如抗FITC抗體與膠體金顆粒交聯(lián)，在顆粒表面形成包被的抗體；3)將另一種標(biāo)記分子的抗體或配體，如抗地高辛抗體或生物素分子的配體-鏈親和素分子以線條狀固定于膜上形成檢測(cè)線；4)當(dāng)存在待檢的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，因上、下游引物的作用，擴(kuò)增產(chǎn)物中同時(shí)帶有上述三種標(biāo)記物中的兩種，形成標(biāo)記分子1-擴(kuò)增產(chǎn)物-標(biāo)記分子2的復(fù)合物；5)將步驟4)形成的標(biāo)志物1-擴(kuò)增產(chǎn)物-標(biāo)志物2與膠體金顆粒表面包被的標(biāo)志物1的抗體結(jié)合，形成抗標(biāo)志物1抗體-標(biāo)志物1-擴(kuò)增產(chǎn)物-標(biāo)志物2有色顆粒復(fù)合物；6)將步驟5)得到的有色顆粒復(fù)合物在溶液中通過毛細(xì)現(xiàn)象沿纖維膜向上流動(dòng)至涂布有標(biāo)志物2的抗體或配體的線條上，復(fù)合物因與標(biāo)志物2的抗體(配體)結(jié)合而沉積，滯留在檢測(cè)線上，形成肉眼可見的有色線條，判定為陽性；7)當(dāng)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物不存在時(shí)，不發(fā)生上述步驟4)-6)，不能形成標(biāo)志物1-擴(kuò)增產(chǎn)物-標(biāo)志物2復(fù)合物，也就不能形沉積于檢測(cè)線上標(biāo)志物2的抗體(配體)之上，不形成可見的條帶，判為陰性。另一方面，本發(fā)明還提供了用于核酸序列檢測(cè)的展開液，該展開液可以減少引物二聚體對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾；另一方面，本發(fā)明提供了用于食品及飼料中鹿源成分快速檢測(cè)的試紙條，其包括在帶有不干膠的襯墊，按順序有：1：吸水濾紙墊；2：結(jié)合物墊，附有第一種核酸標(biāo)記物的抗體或配體的生色顆粒(膠體金或乳膠)；3：側(cè)向?qū)游龌|(zhì)(硝酸纖維素膜或尼龍膜)；4：檢測(cè)帶，附有第二種核酸標(biāo)記物的抗體；5：質(zhì)控帶，附有可結(jié)合特定種屬來源抗體的抗體；6：襯底；7：吸水墊。另一方面，本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的通用標(biāo)準(zhǔn)試紙條。最后，本發(fā)明還提供了上述檢測(cè)方法和試紙條在食品及飼料中鹿源成分檢測(cè)中的用途。本發(fā)明說明書中所使用的技術(shù)術(shù)語解釋：引物：DNA合成的起始物。一般為一對(duì)單鏈寡核苷酸，在與模板雜交后，DNA合成從其3′末端開始。標(biāo)記：將可檢測(cè)的信號(hào)分子(如半抗原，熒光，放射性等)與單鏈寡核苷酸相偶聯(lián)的方法。雜交：特指互補(bǔ)的DNA單鏈通過堿基配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)。展開：經(jīng)擴(kuò)增反應(yīng)的PCR產(chǎn)物在展開緩沖液的層析作用下由試紙條吸水墊底端開始向檢測(cè)線、質(zhì)控線方向移動(dòng)的過程。核酸：脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通稱?？乖桶肟乖壕邆涿庖咴缘奈镔|(zhì)。通常為大分子蛋白質(zhì)或細(xì)胞組分。但有些小分子也具備免疫原性，被稱為半抗原((Hapten)。半抗原常被用于標(biāo)記探針。抗體：能與抗原或半抗原特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子。復(fù)合體：由兩種或兩種以上分子特異性結(jié)成的結(jié)合物。引物二聚體：在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)過程中，因引物對(duì)間、或單條引物相互退火形成的二聚體分子，由兩條不同引物構(gòu)成的二聚體為異二聚體，因帶有兩種標(biāo)記而可能引起與種抗體(配體)的結(jié)合而造成假陽性，由單一引物退火形成的二聚體為同二聚體，僅帶有一種標(biāo)記而不會(huì)引起假陽性，但過多的二聚體形成會(huì)降低擴(kuò)增效率。免疫試紙條：用于快速檢測(cè)的醫(yī)學(xué)工具。又稱為呈色薄膜層析。核酸聚合酶：合成核酸長鏈的酶類。分為DNA聚合酶和RNA聚合酶兩大類。有益效果：由于本發(fā)明是以標(biāo)記的特異性引物擴(kuò)增適當(dāng)長度的基因片段，能夠保證檢測(cè)的高度特異性，從而保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明的新穎之處避免了擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋和探針雜交等流程，保持了免疫膠體金(試紙條)技術(shù)直觀、快速、方便、成熟、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，又具備PCR擴(kuò)增方法高度靈敏度、高度特異性的特點(diǎn)，因此，本發(fā)明的方法是一種有效的鹿源動(dòng)物成分檢測(cè)方法。作為一個(gè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的通用技術(shù)平臺(tái)，本發(fā)明的方法及其試紙條可以廣泛用于食品、飼料中動(dòng)物源成分的鑒定及食源性病原微生物的檢測(cè)，在農(nóng)牧業(yè)、海關(guān)檢驗(yàn)檢疫都有廣泛的應(yīng)用前景。目前雖有多種基于PCR的動(dòng)物源成分鑒定方法，但其引物設(shè)計(jì)和產(chǎn)物片段都適于探針法或凝膠電泳，而對(duì)于膠體金試紙條法中降低引物二聚體及非特異復(fù)性的干擾去除缺乏必要的考慮，解決方法也并不適用。本發(fā)明目的在于提供一種基于免疫膠體金方法檢測(cè)鹿源動(dòng)物成分的PCR引物、擴(kuò)增和檢測(cè)方法，以及該方法的應(yīng)用。其他常見物種，如羊、豬、牛、驢、兔、駱駝、鴨、鵝、雞、狐貍、貂等的鑒定都可以采用與此類似的方法完成。核酸試紙條檢測(cè)方法的發(fā)明將大大簡化核酸擴(kuò)增后的檢測(cè)程序。結(jié)果判讀簡單明了、直觀(檢測(cè)示意結(jié)果如附圖2)。本專利所申請(qǐng)的食品及飼料中鹿源成分試紙條快速檢測(cè)技術(shù)作為一種新型的核酸擴(kuò)增后檢測(cè)技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn)：操作簡單：只需要把核酸擴(kuò)增后的樣品直接滴到核酸試劑檢測(cè)版上即可，不需要專業(yè)人員操作，便于推廣；快速：檢測(cè)5分鐘后判讀結(jié)果；靈敏：與瓊脂糖凝膠電泳相比，檢測(cè)靈敏度提高100倍以上；特異性高：由于在檢測(cè)過程中加使用的為特異性標(biāo)記引物，使結(jié)果更加準(zhǔn)確；價(jià)格便宜：費(fèi)用大大低于傳統(tǒng)的凝膠電泳和ELISA檢測(cè)。附圖說明圖1顯示本發(fā)明的核酸序列擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的試紙條的基本結(jié)構(gòu)；1：吸水濾紙墊；2：結(jié)合物墊，附有第一種核酸標(biāo)記物的抗體或配體的生色顆粒(膠體金或乳膠)；3：側(cè)向?qū)游龌|(zhì)(硝酸纖維素膜或尼龍膜)；4：檢測(cè)帶，附有第二種核酸標(biāo)記物的抗體；5：質(zhì)控帶，附有可結(jié)合特定種屬來源抗體的抗體；6：襯底；7：吸水墊。圖2是核酸檢測(cè)試紙條的檢測(cè)結(jié)果示意圖；圖3是顯示用實(shí)施例1的方法，采用特異性標(biāo)記引物檢測(cè)鹿線粒體PCR-試紙條的檢測(cè)結(jié)果；圖4是用實(shí)施例1的方法，對(duì)設(shè)計(jì)的不同引物進(jìn)行的有效性測(cè)試結(jié)果，所設(shè)計(jì)的引物中針對(duì)12sRNA和CytB基因的引物具有更好的信號(hào)強(qiáng)度，而其他引物雖然序列上滿足要求，但因生物樣本的多樣性，實(shí)際應(yīng)用并不能進(jìn)行有效檢測(cè)。圖5是對(duì)各區(qū)段引物進(jìn)行特異性檢測(cè)的結(jié)果，以選定的引物對(duì)分別對(duì)鼠、牛、兔、馬、羊、狗、豬、貓、鹿、貂、驢、羊駝、雞、鴨和鵝進(jìn)行檢測(cè)，上、中、下三部分別是CytB引物、12sRNA和D-loop區(qū)引物的特異性結(jié)果，可見雖然都具有可接受的特異性，但D-loop區(qū)序列具有明顯的優(yōu)勢(shì)，信號(hào)更強(qiáng)，背景也更低。圖6是顯示用實(shí)施例2的方法，采用檢測(cè)鹿線粒體特異性標(biāo)記引物的特異性PCR-試紙條的檢測(cè)結(jié)果；圖7是用實(shí)施例2的方法，顯示核酸擴(kuò)增后試紙條與凝膠電泳檢測(cè)法的敏感度比較結(jié)果。具體實(shí)施方式如下實(shí)施例舉例說明本發(fā)明的檢測(cè)方法及其檢測(cè)效果。實(shí)施例僅用來舉例，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的任何限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍在所附的權(quán)利要求書說明。實(shí)施例1選擇Genbank數(shù)據(jù)庫中Cervuselaphus、Cervushortulorum、Cervusnipponcentrali、Cervusnipponkopschi、Cervusnipponsichuanicus、Cervusnipponyakushimae、Przewalskiumalbirostris等不同鹿的亞種(品種)的50種全長線粒體或部分序列，按照細(xì)胞色素B的Cytochromeb基因(cytB)、核糖體小亞基12SRNA編碼序列(12SribosomalRNA)、CoxI和D-loop區(qū)和ATP8-ATP6間序列經(jīng)種內(nèi)和種間序列比對(duì)后，對(duì)于出現(xiàn)兩種或以上核苷酸的位置，以規(guī)范的PROSITE方式記錄為單字符序列，對(duì)雞、鵝、兔、鼠、貓、豬、羊、狐貍、鹿、馬、牛、大鼠、駱駝、狗和狐貍等其他十五個(gè)物種的代表性序列進(jìn)行相似的分析，獲得各物種線粒體中12sRNA、ATP8和ATP6部分序列、CytB、CoxI和D-loop區(qū)的保守序列，不同物種相應(yīng)區(qū)域的序列進(jìn)行第二輪序列比對(duì)，獲得在序列上存在種內(nèi)特異，種間差異的片段，這部分序列可能作特異性的片段用于作為PCR檢測(cè)的引物和探針。但因?yàn)榫€粒體在進(jìn)化上的特點(diǎn)，在不同物種間具有一定的相似性，而即便在同種物種內(nèi)，也存在品種間和亞種間的差異，在上述序列內(nèi)即可見差異對(duì)于引物選擇和實(shí)際擴(kuò)增效果的影響。在本發(fā)明中，我們針對(duì)線粒體上述5個(gè)區(qū)域分別設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，通過對(duì)不同來源的同種生物材料的檢測(cè)作為其有效性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇有效的引物進(jìn)行特異性檢測(cè)以最終確定特異性引物。1材料與方法鼠、牛、兔、馬、羊、狗、豬、貓、鹿、貂、驢、羊駝、雞、鴨和鵝線粒體DNA1.2引物設(shè)計(jì)1.3PCR擴(kuò)增體系：1.3PCR擴(kuò)增體系：模板DNA：鹿線粒體DNA1.0μlPrimerF/R0.8μldNTP2.0μl10XPCRbuffer2.0μlHSTaqDNApolymerase0.2μlddH2O13.2μl總體積20μl反應(yīng)條件：95℃5min94℃30sec55℃30sec72℃30sec72℃5min共30循環(huán)同時(shí)分別取5μl用于核酸試紙條檢測(cè)，引物有效性的檢測(cè)結(jié)果見圖4。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，加入到95μL展開液中進(jìn)行檢測(cè)點(diǎn)于樣品墊，5分鐘后觀察結(jié)果。1.4PCR特異性實(shí)驗(yàn)利用建立起來的PCR反應(yīng)體系對(duì)；1：鼠；2：牛；3：兔；4：鹿；5：羊；6：狗；7：豬；8：貓；9：雞；10：鴨；11：鵝；11：NTC(水)驗(yàn)證其特異性。2結(jié)果2.1PCR反應(yīng)體系及條件采用TaKaRa公司的HSTaqDNApolymerase，總反應(yīng)體系為20μl。用Bio-RadPCR儀進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)參數(shù)為：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s進(jìn)行擴(kuò)增，30個(gè)循環(huán)后轉(zhuǎn)入72℃5min，4℃保存。取5μl產(chǎn)物在含溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行電泳，電泳后判斷有無特異性條帶。不同的引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增的電泳結(jié)果如附圖5中，經(jīng)擴(kuò)增系統(tǒng)優(yōu)化后的電泳和試紙條檢測(cè)結(jié)果顯示于圖6.2.2特異性試驗(yàn)本發(fā)明建立的PCR方法對(duì)鹿線粒體DNA具有較好的特異性，對(duì)其他哺乳動(dòng)物及家禽類物種等無交叉反應(yīng)。實(shí)施例2核酸試紙條檢測(cè)方法的靈敏性，將PCR模板以1/10，1/102，1/103，1/104，1/105，1/106，1/107，1/108，1/109，1/1010的比例稀釋后，按已建立的PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增。1材料與方法材料：鹿線粒體DNA1.2引物設(shè)計(jì)1.3PCR擴(kuò)增體系：模板DNA：質(zhì)粒DNA10μlPrimerF/R0.8μldNTP2.0μl10XPCRbuffer2.0μlHSTaqDNApolymerase0.2μlddH2O4.2μl總體積20μl反應(yīng)條件：95℃5min94℃30sec57℃30sec72℃80sec72℃5min共30循環(huán)分別取5μl用于瓊脂糖凝膠電泳。凝膠電泳條件為：1XTBE緩沖液，電壓100V，電泳時(shí)間30分。同時(shí)分別取5μl用于核酸試紙條檢測(cè)，取5μl樣品點(diǎn)于樣品墊，加入到95μL展開液中進(jìn)行檢測(cè)，5分鐘后觀察結(jié)果。2結(jié)果2.1PCR反應(yīng)體系及條件采用TaKaRa公司的HSTaqDNApolymerase，總反應(yīng)體系為20μl。用Bio-RadPCR儀進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)參數(shù)為：94℃5min，94℃30s，56.5℃30s，72℃80s進(jìn)行擴(kuò)增，30個(gè)循環(huán)后轉(zhuǎn)入72℃5min，4℃保存。取5μL產(chǎn)物在含溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行電泳，電泳后判斷有無特異性條帶。核酸擴(kuò)增后試紙條與凝膠電泳的敏感度比較結(jié)果顯示于附圖7中，由附圖7的結(jié)果可以看出，與傳統(tǒng)的凝膠電泳相比，其敏感度增加100倍。GTACATAAAATTAATGTATTAGGACATATTATGTATAATAGTACATTATATTATATGCCCCATGCTTATAAGCATGTATTTTCTATTATTTACAGTACATAGTACATGATGTTGTTCATCGTACATAGCGCATTAAGTCAAATCAGTCCTCGTCAACATGCGTATCCCGTCCCCTAGATCACGAGCTTAATCACCATGCCGCGTGAAACCAGCAACCCGCTGGGCAGGGATCCCTCTTCTCGCTCCGGGCCCATGAATCGTGGGGGTAGCTATTTAAT