本發(fā)明涉及雜環(huán)并咪唑類衍生物、其制備方法以及含有該衍生物的藥物組合物、以及其作為治療劑和作為聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑的用途。
背景技術(shù)：
：化療藥物和電離輻射治療是治療癌癥的兩種常用方法。這兩種治療方法均會誘發(fā)DNA單鏈和/或雙鏈斷裂進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，目標(biāo)腫瘤細(xì)胞由于染色體損傷從而死亡。作為響應(yīng)DNA損傷信號的一個重要結(jié)果是細(xì)胞周期調(diào)控位點信號被激活，其目的在于保護(hù)細(xì)胞在DNA損傷的情況下不進(jìn)行有絲分裂從而避免細(xì)胞損傷。在大多數(shù)情況下，腫瘤細(xì)胞在表現(xiàn)出細(xì)胞周期調(diào)控位點信號缺損的同時具有很高的增值率。因此可以推斷，腫瘤細(xì)胞中存在特定的DNA修復(fù)機制，可以快速響應(yīng)并修復(fù)與增殖調(diào)節(jié)相關(guān)的染色體損傷，從而使其自身幸免于一些治療藥物的細(xì)胞毒性作用并保持繼續(xù)存活。在臨床應(yīng)用中，化療藥物的有效濃度或治療輻射強度可以對抗這些DNA修復(fù)機制，保證對目標(biāo)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。然而，腫瘤細(xì)胞通過增強其DNA損傷修復(fù)機制能夠?qū)χ委煯a(chǎn)生耐受作用，使之從致命的DNA損傷中存活下來。為了克服產(chǎn)生的耐受性，通常需要增加治療藥物的劑量或提高輻射強度，這一做法將對病灶附近的正常組織產(chǎn)生不利影響，從而使治療過程中伴有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，進(jìn)而加大了治療風(fēng)險。同時，不斷增加的耐受性將會降低治療效果，因此可以推斷，通過對DNA損傷信號修復(fù)機制的調(diào)節(jié)，能夠以腫瘤細(xì)胞特異性的方式實現(xiàn)對DNA損傷藥劑的細(xì)胞毒性的提高。以聚腺苷二磷酸-核糖基化活性為特征的PARPs(Poly(ADP-ribose)polymerases)，構(gòu)成了18種細(xì)胞核酶核細(xì)胞質(zhì)酶的超家族。這種聚腺苷二磷酸-核糖基化作用可以調(diào)節(jié)目的蛋白的催化活性和蛋白質(zhì)間相互作用，并且對許多基本生物過程進(jìn)行調(diào)控，包括DNA修復(fù)，細(xì)胞死亡，基因組穩(wěn)定性也與之相關(guān)。PARP-1活性約占總的細(xì)胞PARP活性的80％，它和與其最相近的PARP-2共同成為PARP家族中具備修復(fù)DNA損傷能力的成員。作為DNA損傷的感應(yīng)器和信號蛋白，PARP-1可以快速檢測并直接結(jié)合至DNA損傷位點，之后誘導(dǎo)聚集DNA修復(fù)所需的多種蛋白，進(jìn)而使DNA損傷得以修復(fù)。當(dāng)細(xì)胞中的PARP-1缺乏時，PARP-2可以替代PARP-1實現(xiàn)DNA損傷的修復(fù)。研究表明，與正常細(xì)胞相比，PARPs蛋白在實體瘤中的表達(dá)普遍增強。此外，對于DNA修復(fù)相關(guān)基因缺失(如BRCA-1或BRCA-2)的腫瘤(如乳腺腫瘤和卵巢癌)，表現(xiàn)出對PARP-1抑制劑的極端敏感，這表明PARP抑制劑作為單劑在治療這種被成為三陰性乳腺癌方面的潛在用途。同時，由于DNA損傷修復(fù)機制是腫瘤細(xì)胞應(yīng)對化療藥物和電離輻射治療產(chǎn)生耐受作用的主要機制，因此PARP-1被認(rèn)為是探索新的癌癥治療方法的一個有效靶點。早期開發(fā)設(shè)計的PARP抑制劑是以作為PARP催化底物的NAD的煙酰胺作為模板，開發(fā)其類似物。這些抑制劑作為NAD的競爭性抑制劑，與NAD競爭PARP的催化位點，進(jìn)而阻止聚(ADP-核糖)鏈的合成。沒有聚(ADP-核糖基化)修飾下的PARP無法從DNA損傷位點解離下來，將導(dǎo)致其他參與修復(fù)的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入損傷位點，進(jìn)而不能執(zhí)行修復(fù)過程。因此，在細(xì)胞毒性藥物或輻射的作用下，PARP抑制劑的存在使DNA受損的腫瘤細(xì)胞最終死亡。此外，作為PARP催化底物而被消耗的NAD，是細(xì)胞合成ATP過程中必不可少的，因此，在高PARP活性水平下，細(xì)胞內(nèi)的NAD水平會顯著下降，進(jìn)而影響胞內(nèi)的ATP水平。由于細(xì)胞內(nèi)的ATP含量不足，細(xì)胞無法實現(xiàn)ATP依賴的程序化死亡過程，只能轉(zhuǎn)向壞死這一特殊凋亡過程。在壞死的過程中，大量的炎癥因子會被釋放出來，從而對其他器官和組織產(chǎn)生毒性作用。因此，PARP抑制劑也可以用于治療與這一機制有關(guān)的多種疾病，包括神經(jīng)退行性疾病(如老年癡呆癥，亨廷頓舞蹈癥，帕金森病)，糖尿病，缺血或缺血再灌注過程中的并發(fā)疾病，如心肌梗死和急性腎衰竭，循環(huán)系統(tǒng)疾病，如感染性休克，及炎癥性疾病，如慢性風(fēng)濕病等。目前臨床在研的PARP抑制劑一共有14個，其中阿斯利康公司開發(fā)的AZD2281(結(jié)構(gòu)式如下)已于2014年12月經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市，治療適應(yīng)癥為對鉑類試劑化療敏感的晚期卵巢癌患者。相關(guān)專利申請為WO2002036576和盡管目前已公開了一系列的PARP抑制劑，但仍需要開發(fā)新的具有更好藥效、更優(yōu)藥代動力學(xué)性質(zhì)和更低毒性的化合物。經(jīng)過不懈努力，本發(fā)明涉及具有通式(Ⅰ)所示的結(jié)構(gòu)的化合物，并發(fā)現(xiàn)具有此類結(jié)構(gòu)的化合物表現(xiàn)出優(yōu)異的效果和作用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供一種如通式(Ⅰ)所示的新的雜環(huán)并咪唑類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明的目的之二在于提供上述雜環(huán)并咪唑類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法。本發(fā)明的目的之三在于提供一種制備上述雜環(huán)并咪唑類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的中間體。本發(fā)明的目的之四在于提供一種制備上述雜環(huán)并咪唑類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的中間體的制備方法。本發(fā)明的目的之五在于提供一種所述中間體用于制備上述通式(Ⅰ)所示化合物及其衍生物的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之六在于提供一種以上述雜環(huán)并咪唑類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分的藥物組合物。本發(fā)明目的之七在于提供一種上述雜環(huán)并咪唑類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在藥物中的應(yīng)用。作為本發(fā)明第一方面的雜環(huán)并咪唑類化合物，其為通式(Ⅰ)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：其中，通式(Ⅰ)中：R為氫、鹵素、C1-C6烷氧基或C1-C6鹵代烷基；X、Y、Z其中一個為氮，其余為碳?xì)浠蛘遆、Y、Z其中一個為碳?xì)?，其余為氮；M為氮或CR1；R1為氫、氧、C1-C6烷基或C1-C6鹵代烷基。進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明提供的結(jié)構(gòu)如通式(Ⅰ)所示的化合物，其中：R為氫、氟、甲氧基或者三氟甲基；X、Y、Z其中一個為氮，其余為碳?xì)浠蛘遆、Y、Z其中一個為碳?xì)?，其余為氮；M為氮或CR1；R1為氫、氧、甲基或三氟甲基。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種通式(Ⅰ)所示的化合物，其中R為氫、鹵素、C1-C3烷氧基或C1-C3鹵代烷基。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種通式(Ⅰ)所示的化合物，其中R為氫、氟、甲氧基或三氟甲基。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種通式(Ⅰ)所示的化合物，其中X和Z為氮，Y為碳?xì)浠蛘遆為氮，Y和Z為碳?xì)浠蛘遉為氮，X和Y為碳?xì)浠験為氮，X和Z為碳?xì)洹Ｔ诒景l(fā)明的一個具體實施方案中，一種通式(Ⅰ)所示的化合物，其中R1為氫、氧或C1-C6烷基或C1-C6鹵代烷基。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種通式(Ⅰ)所示的化合物，其中R1為氫、氧或C1-C3烷基或C1-C3鹵代烷基。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種通式(Ⅰ)所示的化合物，其中R1為氫、氧或甲基或三氟甲基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述通式(Ⅰ)的雜環(huán)并咪唑類化合物為4-(3-(哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(2氫)-酮類化合物以及其可藥用鹽。最優(yōu)選地，本發(fā)明通式(Ⅰ)所示的化合物選自如下化合物(1)～(21)：所述通式(Ⅰ)所示的化合物為互變異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體及其混合物形式。所述通式(Ⅰ)所示的化合物為藥學(xué)可接受的衍生物。本發(fā)明所述通式(Ⅰ)所示的化合物可以以藥學(xué)上可接受的鹽的形式存在。作為本發(fā)明第二方面的通式(Ⅰ)所示的化合物的制備方法，其反應(yīng)式如下：其中，R、X、Y、Z和M的定義如上述所述；R2為羥基、鹵素、二咪唑‐1‐ 基；其具體步驟如下：中間體(Ⅴ)與呔嗪類羧酸衍生物(Ⅵ)發(fā)生縮合反應(yīng)，生成通式(Ⅰ)所示的化合物。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，中間體(Ⅴ)由如下步驟制備：步驟1)：單保護(hù)的哌嗪與含有氨基、硝基取代的雜環(huán)鹵代物發(fā)生親核取代反應(yīng)，得到中間體(Ⅱ)；步驟2)：中間體(Ⅱ)發(fā)生催化氫化還原硝基，得到中間體(Ⅲ)；步驟3)：中間體(Ⅲ)通過與乙酸酐、三氟乙酸酐、原甲酸三甲酯、羰基二咪唑或疊氮化合物發(fā)生環(huán)合反應(yīng)，得到中間體(Ⅳ)；步驟4)：中間體(Ⅳ)脫除胺基保護(hù)基，得到中間體(Ⅴ)；其反應(yīng)式如下：其中，P為胺基保護(hù)基，X、Y、Z其中一個為氮，其余為碳?xì)浠蛘遆、Y、Z其中一個為碳?xì)?，其余為氮；M為氮或CR1；R1為氫、氧、甲基或三氟甲基。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種通式(Ⅰ)所示的化合物，其中X和Z為氮，Y為碳?xì)浠蛘遆為氮，Y和Z為碳?xì)浠蛘遉為氮，X和Y為碳?xì)浠験為氮，X和Z為碳?xì)?。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種通式(Ⅰ)所示的化合物，其中R1為氫、氧、C1-C6烷基或C1-C6鹵代烷基。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種通式(Ⅰ)所示的化合物，其中R1為氫、氧、C1-C3烷基或C1-C3鹵代烷基。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種通式(Ⅰ)所示的化合物，其中R1 為氫、氧、甲基或三氟甲基。優(yōu)選地，所述呔嗪類羧酸衍生物(Ⅵ)所示的化合物如下：優(yōu)選地，所述中間體Ⅴ所示的化合物如下：在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述縮合反應(yīng)中使用的縮合劑選自1,1'-羰基二咪唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述縮合反應(yīng)中使用的溶劑選自二氯甲烷、乙酸乙酯、二甲亞砜、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯啉酮、丙酮。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述縮合反應(yīng)中加入無機堿或有機堿。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述有機堿選自三乙胺、二乙胺、二異丙基乙胺、哌啶。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，中間體(Ⅲ)通過與亞硝酸鈉、乙酸酐、三氟乙酸酐、原甲酸三甲酯或疊氮化合物發(fā)生環(huán)合反應(yīng)，得到中間體(Ⅳ)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，中間體(Ⅲ)通過與乙酸酐、三氟乙酸酐、原甲酸三甲酯或疊氮化鈉發(fā)生環(huán)合反應(yīng)，得到中間體(Ⅳ)。作為本發(fā)明第三方面的制備上述通式(Ⅰ)所示雜環(huán)并咪唑類化合物的中間 體，其為以下結(jié)構(gòu)式(V)所示的化合物：其中，中間體(V)中：X、Y、Z其中一個為氮，其余為碳?xì)浠蛘遆、Y、Z其中一個為碳?xì)洌溆酁榈?；M為氮或CR1；R1為氫、氧、烷基、烷氧基或鹵代烷基。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，X和Z為氮，Y為碳?xì)浠蛘遆為氮，Y和Z為碳?xì)浠蛘遉為氮，X和Y為碳?xì)浠蛘遈為氮，X和Z為碳?xì)?。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，R1為氫、氧、C1-C6烷基或C1-C6鹵代烷基。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，R1為氫、氧、C1-C3烷基或C1-C3鹵代烷基。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，R1為氫、氧、甲基或三氟甲基。具體優(yōu)選地，所述中間體(Ⅴ)所示的化合物如下：作為本發(fā)明第四方面的上述中間體(Ⅴ)的制備方法，其中，中間體(Ⅴ)由如下步驟制備：步驟1)：單保護(hù)的哌嗪與含有氨基、硝基取代的雜環(huán)鹵代物發(fā)生親核取代 反應(yīng)，得到中間體(Ⅱ)；步驟2)：中間體(Ⅱ)發(fā)生催化氫化還原硝基，得到中間體(Ⅲ)；步驟3)：中間體(Ⅲ)通過與亞硝酸鈉、乙酸酐、三氟乙酸酐、原甲酸三甲酯或疊氮化合物發(fā)生環(huán)合反應(yīng)，得到中間體(Ⅳ)；步驟4)：中間體(Ⅳ)脫除胺基保護(hù)基，得到中間體(Ⅴ)。其反應(yīng)式如下：其中，P為胺基保護(hù)基，X、Y、Z其中一個為氮，其余為碳?xì)浠蛘遆、Y、Z其中一個為碳?xì)?，其余為氮；M為氮或CR1；R1為氫、氧、甲基或三氟甲基。本發(fā)明的一個具體實施方案中，中間體(Ⅲ)通過與乙酸酐、三氟乙酸酐、原甲酸三甲酯或疊氮化鈉發(fā)生環(huán)合反應(yīng)，得到中間體(Ⅳ)。本發(fā)明第五方面的中間體(Ⅴ)用于制備上述通式(Ⅰ)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的應(yīng)用。作為本發(fā)明第六方面的藥用組合物，包含構(gòu)成活性成分的治療有效量的通式(Ⅰ)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和一種或多種藥用載體物質(zhì)、賦形劑和/或稀釋劑。所述的藥物組合物制成片劑、膠囊劑、水性混懸劑、油性混懸劑、可分散的粉劑、顆粒劑、錠劑、乳劑、糖漿劑、乳膏劑、軟膏劑、栓劑或注射劑。所述的藥物組合物中，所述通式(Ⅰ)所示的化合物以游離形式存在。作為本發(fā)明第七方面的應(yīng)用，其中是所述通式(Ⅰ)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療因PARP活性抑制而改善的疾病藥物中的應(yīng)用。作為本發(fā)明第七方面的應(yīng)用，其中是所述藥物組合物在制備治療因PARP活性抑制而改善的疾病藥物中的應(yīng)用。其中，所述因PARP活性抑制而改善的疾病為血管疾病、膿毒性休克、缺血 性損傷、神經(jīng)毒性、出血性休克、炎性疾病、多發(fā)性硬化癥、神經(jīng)退化性疾病或糖尿病。文獻(xiàn)Cantoni等(Biochim.Biophys.Acta，1989，1014：1-7)和Liaudet等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97(3)，2000，97(3)：10203-10208)提供了上述疾病與PARP活性之間關(guān)系的研究情況的研究。作為本發(fā)明第七方面的應(yīng)用，其中是所述通式(Ⅰ)所示的化合物在制備用于腫瘤治療的輔助藥物中的應(yīng)用。作為本發(fā)明第七方面的應(yīng)用，其中是所述通式(Ⅰ)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于腫瘤治療的輔助藥物中的應(yīng)用。作為本發(fā)明第七方面的應(yīng)用，其中是所述藥物組合物在制備用于癌癥治療的輔助藥物中的應(yīng)用。作為本發(fā)明第七方面的應(yīng)用，其中是所述通式(Ⅰ)所示的化合物在制備用于癌癥化療的藥物或強化放療藥物中的應(yīng)用。作為本發(fā)明第七方面的應(yīng)用，其中是所述通式(Ⅰ)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于癌癥化療的藥物或強化放療藥物中的應(yīng)用。作為本發(fā)明第七方面的應(yīng)用，其中是所述藥物組合物在制備用于癌癥化療的藥物或強化放療藥物中的應(yīng)用。作為本發(fā)明第七方面的應(yīng)用，其中是所述通式(Ⅰ)所示的化合物在制備缺乏同源重組(HR)依賴性的DNA雙鏈斷裂(DSB)修復(fù)的個體化癌癥治療的藥物中的應(yīng)用。作為本發(fā)明第七方面的應(yīng)用，其中所述通式(Ⅰ)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備缺乏同源重組(HR)依賴性的DNA雙鏈斷裂(DSB)修復(fù)的個體化癌癥治療的藥物中的應(yīng)用。作為本發(fā)明第七方面的應(yīng)用，其中是所述藥物組合物在制備缺乏同源重組(HR)依賴性的DNA雙鏈斷裂(DSB)修復(fù)的個體化癌癥治療的藥物中的應(yīng)用。作為優(yōu)選地，所述的癌癥的同源重組(HR)依賴性的DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑是缺陷的。其中，作為優(yōu)選地，所述癌癥含有一種或多種相對于正常細(xì)胞通過同源重組(HR)依賴性的DNA雙鏈斷裂修復(fù)的能力而減低或喪失的癌細(xì)胞。作為優(yōu)選地，所述癌癥具有BRCA-1或BRCA-2缺陷、突變表型。其中進(jìn) 一步優(yōu)選地，所述癌癥為BRCA-1或/和BRCA-2缺陷、突變的癌癥。作為優(yōu)選地，所述癌癥為乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、結(jié)腸癌或肝癌。為了檢驗本發(fā)明提供的化合物對于PARP酶的作用水平，采用生化水平酶活性測試來確定本發(fā)明的各種化合物對PARP酶的活性。PARP是一種轉(zhuǎn)錄后修飾酶，DNA損傷可以激活該酶，PARP在體內(nèi)的催化過程主要是一種NAD依賴的poly(ADP-ribose)過程，其底物主要是包括PARP在內(nèi)的一些核蛋白，histone為其中一種，本發(fā)明通過測定PARP在NAD作用下對包被于96孔板中Histonepoly(ADP-ribose)程度，測定PARP活性，相應(yīng)地測定PARP抑制劑作用后PARP活性，從而評價該類化合物對PARP活性的抑制程度。具體實施方式以下結(jié)合實施例用于進(jìn)一步描述本發(fā)明，但這些實施例并非限制著本發(fā)明的范圍。本發(fā)明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照原料或商品制造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規(guī)試劑。除非有相反陳述，下列用在說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語具有下述含義。本發(fā)明中，術(shù)語“C1-C6烷基”是指具有直鏈或支鏈部分并含有1至6個碳原子的飽和一價烴基。此類基團(tuán)的實例包括但不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁基。術(shù)語“C1-C6鹵代烷基”是指直鏈或支鏈部分并含有1至6個碳原子的飽和一價烴基中氫原子部分或全部被鹵素原子取代形成的化合物。術(shù)語“C1-C6烷氧基”是指氧原子相連的直鏈或支鏈部分并含有1至6個碳原子的飽和一價烴基。包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、叔丁氧基。術(shù)語“對映異構(gòu)體”是指互為鏡像關(guān)系的立體異構(gòu)體。術(shù)語“非對映異構(gòu)體”是指分子具有兩個或多個手性中心，并且分子間為非鏡像關(guān)系的立體異構(gòu)體。術(shù)語“構(gòu)象異構(gòu)體”是指有機分子由單鍵旋轉(zhuǎn)而產(chǎn)生的異構(gòu)體。術(shù)語“互變異構(gòu)體”是指某些有機化合物的結(jié)構(gòu)在兩種官能團(tuán)異構(gòu)體間產(chǎn)生平衡互相轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象，相應(yīng)的異構(gòu)體成為互變異構(gòu)體。術(shù)語“內(nèi)消旋體”是指分子內(nèi)含有不對稱性的原子，但因具有對稱因素而形成的不旋光性化合物。術(shù)語“外消旋體”是指一種具有旋光性的手性分子與其對映體的等摩爾混合物。術(shù)語“代謝產(chǎn)物和代謝產(chǎn)物前體或前藥”是指通過代謝過程產(chǎn)生或消耗的物質(zhì)；前藥是指藥物經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾得到的化合物，在體外沒有活性，在生物體或人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為原來的藥物而發(fā)揮藥效。術(shù)語“衍生物”是指化合物中的原子或基團(tuán)被其他原子或基團(tuán)取代而衍生的較復(fù)雜的產(chǎn)物。術(shù)語“治療有效量”是指實現(xiàn)所需生物反應(yīng)的任意量。術(shù)語“鹵素”和“鹵代”是指F、Cl、Br、I。“藥物組合物”指將本發(fā)明中的化合物中的一個或多個與別的化學(xué)成分，例如藥學(xué)上可接受的載體，混合。藥物組合物的目的是促進(jìn)給藥給動物的過程?！八幱幂d體”指的是對有機體不引起明顯的刺激性和不干擾所給予化合物的生物活性和性質(zhì)的藥物組合物中的非活性成分，例如但不限于：碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖(例如乳糖、甘露醇等)、淀粉、環(huán)糊精、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鎂、丙烯酸聚合物或甲基丙烯酸聚合物、凝膠、水、聚乙二醇、丙二醇、乙二醇、蓖麻油或氫化蓖麻油或多乙氧基氫化蓖麻油、芝麻油、玉米油、花生油等。前述的藥物組合物中，除了包括藥學(xué)上可接受的載體外，還可以包括在藥(劑)學(xué)上常用的輔劑，例如：抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、抗微生物劑、保質(zhì)劑、調(diào)色劑、增溶劑、增稠劑、表面活性劑、絡(luò)合劑、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、糖類、維生素、礦物質(zhì)、微量元素、甜味劑、色素、香精或它們的結(jié)合等。本發(fā)明公開了一種化合物及該化合物作為聚(ADP-核糖)聚合酶抑制劑的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本申請內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要 指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：制備實施例化合物的結(jié)構(gòu)式通過核磁共振(NMR)或/和質(zhì)譜(MS)來確定的。NMR位移(δ)以10-6(ppm)的單位給出。測定溶劑為氘代甲醇、氘代二甲亞砜、氘代氯仿，內(nèi)標(biāo)為四甲基硅烷。MS的測定用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀(生產(chǎn)商：島津，型號：LCMS-2020)本發(fā)明的已知的起始原料可以采用或按照本領(lǐng)域已知的方法來合成，或可從市售產(chǎn)品中直接購得。實施例1化合物(1)：4-(3-(4-(1氫-[1,2,3]三唑[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-氟芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：步驟1：4-(6-氨基-5-硝基吡啶-2-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備將溶有化合物單叔丁氧羰基保護(hù)哌嗪(1.86g,10mmol)的二甲基甲酰胺(10mL)中加入6-氯-3-硝基-2-氨基吡啶(1.91g,11mmol)和二異丙基乙基胺(1.55g,12mmol)，室溫反應(yīng)8小時后減壓除去溶劑，殘余物經(jīng)快速柱層析分離 (二氯甲烷：甲醇＝50：1)得到白色固體化合物a：4-(6-氨基-5-硝基哌啶-2-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(2.72g，收率84％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝324。步驟2：4-(5,6-二氨基吡啶-2-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備將10％鈀碳(259mg)加入溶有化合物a(2.59g,8mmol)的甲醇(20mL)溶液中，常溫下氫化7小時，過濾，殘余物經(jīng)快速柱層析分離(二氯甲烷：甲醇＝10：1)得到黃色固體化合物b：4-(5,6-二氨基哌啶-2-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(2.25g，收率93％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝294。步驟3：4-(1氫-[1,2,3]三唑[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備在一個溶有化合物b(1.76g,6mmol)的乙酸溶液(30mL)中加入亞硝酸鈉(0.42g,6mmol)，升溫至回流，反應(yīng)8小時后冷卻，減壓除去溶劑，殘余物經(jīng)快速柱層析分離(二氯甲烷：甲醇＝10：1)得到淡黃色固體化合物c：4-(1氫-[1,2,3]三唑[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(1.64g，收率90％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝305。步驟4：5-(哌嗪-1-基)-1氫-[1,2,3]三唑[4,5-b]哌啶的制備在一個溶有化合物c(1.52g,5mmol)的二氯甲烷溶液(10mL)中加入三氟乙酸(2.28g,20mmol)，室溫反應(yīng)8小時后減壓除去溶劑，殘余物用二氯甲烷(20mL)溶解，加入碳酸氫鈉直至pH＝8，濃縮除去溶劑，殘余物經(jīng)快速柱層析分離(二氯甲烷：甲醇＝10：1)得到淡黃色固體化合物d：5-(哌嗪-1-基)-1氫-[1,2,3]三唑[4,5-b]哌啶(0.87g，收率86％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝205。步驟5：2-氟-4-((3-氧代異苯并呋喃-1(3氫)-亞基)甲基)苯氰的制備冰浴下，在一個溶有甲醇鈉(61.8g，1.14mol)的無水甲醇溶液(1L)中緩慢加入亞磷酸二甲酯(97mL，1.06mol)。保持反應(yīng)體系溫度低于5℃，20分鐘內(nèi)緩慢滴加2-羧基苯甲醛(135g，0.9mol)。上述反應(yīng)體系逐漸升至室溫，并在半小時內(nèi)逐漸滴加甲基磺酸(81.6mL，1.26mol)。減壓除去溶劑后，殘余物用水(600mL)稀釋，并用二氯甲烷(500mL)萃取三次。合并有機相，并用水(100mL)萃取兩次，有機相用無水硫酸鎂干燥。減壓除去溶劑得到淡黃色固體化合物3-氧代-1,3-二氫苯并異呋喃-1-基亞磷酸二甲酯，未經(jīng)純化直接投入下一步反應(yīng)。將溶有上步反應(yīng)未經(jīng)純化的化合物3-氧代-1,3-二氫苯并異呋喃-1-基亞磷酸二甲酯(35g，0.14mol)的四氫呋喃溶液(330mL)中加入2-氟-5-甲?；角?20.9g， 0.14mol)，體系降溫至15℃，30分鐘內(nèi)緩慢滴加三乙胺(19.5mL，0.14mol)。上述反應(yīng)體系逐漸升至室溫，減壓除去溶劑，殘余物用水(250mL)打漿，過濾得到白色固體化合物e：2-氟-4-((3-氧代異苯并呋喃-1(3氫)-亞基)甲基)苯氰(37.2g，收率96％)。步驟6：2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氫呔嗪-1-基)甲基)苯甲酸的制備在一個溶有化合物e(37g，0.14mol)的水溶液(200mL)中加入13N氫氧化鈉溶液(50mL)，升溫至90℃攪拌1小時。將上述反應(yīng)體系降至70℃后加入水合肼(100mL，2mol)，保持該溫度攪拌18小時。反應(yīng)液冷卻至室溫，使用8N的鹽酸調(diào)節(jié)上述體系至pH＝4，過濾，濾餅依次用水(60mL)洗滌兩次，乙醚(50mL)洗滌三次，真空干燥得到白色固體化合物f：2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氫呔嗪-1-基)甲基)苯甲酸(30.1g，收率77％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝299。步驟7：4-(3-(4-(1氫-[1,2,3]三唑[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-氟芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備在一個溶有化合物f(50mg，0.17mmol)的二甲基甲酰胺溶液(5mL)中加入化合物d(49mg，0.24mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(77mg，0.2mmol)和三乙胺(70mg，0.7mmol)，室溫攪拌過夜。濃縮除去溶劑，殘余物經(jīng)快速柱層析分離(二氯甲烷：甲醇＝10：1)得到白色固體化合物(1)：4-(3-(4-(1氫-[1,2,3]三唑[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-氟芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(16mg，收率20％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝485。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.57(s,1H),8.24-8.12(m,2H),7.96-7.74(m,1H),7.89-7.81(m,3H),7.43-7.38(m,2H),7.26-7.21(m,1H),7.05-6.99(m,1H),4.32(s,2H),3.73(br,6H),3.57(br,2H)。實施例2化合物(2)：4-(4-氟-3-(4-(2-甲基-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：步驟1：4-(2-甲基-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備在一個溶有化合物b(1.47g,5mmol)的乙酸溶液(30mL)中加入乙酸酐(0.56g,5.5mmol)，升溫至回流，反應(yīng)8小時后冷卻，減壓除去溶劑，殘余物經(jīng)快速柱層析分離(二氯甲烷：甲醇＝10：1)得到淡黃色固體化合物g：4-(2-甲基-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(0.73g，收率46％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝318。步驟2：2-甲基-5-(哌嗪-1-基)-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶的制備采用實施例1步驟4制備化合物d類似的方法，通過化合物g與三氟乙酸發(fā)生脫除保護(hù)基反應(yīng)制得化合物h：2-甲基-5-(哌嗪-1-基)-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶(320mg，收率82％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝218。步驟3：4-(4-氟-3-(4-(2-甲基-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物h與化合物f發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(2)：4-(4-氟-3-(4-(2-甲基-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(26mg，收率32％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝498。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.55(s,1H),8.23-8.12(m,2H),7.96-7.75(m,1H),7.89-7.80(m,3H),7.44-7.38(m,2H),7.27-7.22(m,1H),7.06-6.98(m,1H),4.33(s,2H),3.72(br,4H),3.56(br,4H),2.63(s,3H)。實施例3化合物(3)：4-(4-氟-3-(4-(2-三氟甲基)-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：步驟1：4-(2-三氟甲基-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備在一個溶有化合物b(1.47g,5mmol)的三氟乙酸溶液(30mL)中加入三氟乙酸酐(1.16g,5.5mmol)，升溫至回流，反應(yīng)8小時后冷卻，減壓除去溶劑，殘余物經(jīng)快速柱層析分離(二氯甲烷：甲醇＝10：1)得到淡黃色固體化合物i：4-(2-三氟甲基-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(0.69g，收率37％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝372。步驟2：5-(哌嗪-1-基)-2-三氟甲基-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶的制備采用實施例1步驟4制備化合物d類似的方法，通過化合物i與三氟乙酸發(fā)生脫除保護(hù)基反應(yīng)制得化合物j：5-(哌嗪-1-基)-2-三氟甲基-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶(269mg，收率78％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝272。步驟3：4-(4-氟-3-(4-(2-三氟甲基)-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物j與化合物f發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(3)：4-(4-氟-3-(4-(2-甲基-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(38mg，收率41％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝552。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.59(br,1H),8.25(d,1H,J＝8.1Hz),7.98-7.89(m,3H),7.87-7.80(m,2H),7.45-7.38(m,2H),7.26-7.20(m,1H),6.92(d,1H,J＝9.0Hz),4.33(s,2H),3.73(br,2H),3.63(br,2H),3.46(br,4H)。實施例4化合物(4)：4-(3-(4-(1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-氟芐基) 呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：步驟1：4-(1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備在一個溶有化合物b(1.47g,5mmol)的原甲酸三甲酯溶液(6g)中加入對甲苯磺酸(86mg,0.5mmol)，升溫至回流，反應(yīng)8小時后冷卻，減壓除去溶劑，殘余物經(jīng)快速柱層析分離(二氯甲烷：甲醇＝10：1)得到淡黃色固體化合物k：4-(1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(0.73g，收率48％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝304。步驟2：5-(哌嗪-1-基)-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶的制備采用實施例1步驟4制備化合物d類似的方法，通過化合物k與三氟乙酸發(fā)生脫除保護(hù)基反應(yīng)制得化合物l：5-(哌嗪-1-基)-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶(307mg，收率73％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝204。步驟3：4-(3-(4-(1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-氟芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物l與化合物f發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(4)：4-(3-(4-(1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-氟芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(25mg，收率31％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝484。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.61(br,1H),8.27-8.24(m,1H),8.16(s,1H),8.00-7.97(m,1H),7.93-7.82(m,4H),7.45-7.39(m,2H),7.28-7.22(m,1H),6.83-6.80(m,1H),4.34(s,2H),3.73(br,2H),3.58(br,2H),3.42(br,4H)。實施例5化合物(5)：4-(4-氟-3-(4-(2-氧代-2,3-二氫-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：步驟1：4-(2-氧代-2,3-二氫-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備在一個溶有化合物b(1.47g,5mmol)的無水四氫呋喃溶液(20mL)中加入羰基二咪唑(1.62g,10mmol)，升溫至回流，反應(yīng)8小時后冷卻，減壓除去溶劑，殘余物經(jīng)快速柱層析分離(二氯甲烷：甲醇＝10：1)得到淡黃色固體化合物m：4-(2-氧代-2,3-二氫-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(1.24g，收率78％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝320。步驟2：5-(哌嗪-1-基)-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-2(3氫)-酮的制備采用實施例1步驟4制備化合物d類似的方法，通過化合物m與三氟乙酸發(fā)生脫除保護(hù)基反應(yīng)制得化合物n：5-(哌嗪-1-基)-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-2(3氫)-酮(331mg，收率79％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝220。步驟3：4-(4-氟-3-(4-(2-氧代-2,3-二氫-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物n與化合物f發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(5)：4-(4-氟-3-(4-(2-氧代-2,3-二氫-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(32mg，收率36％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝500。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.58(br,1H),10.97(br,1H),10.39(br,1H),8.28-8.26(m,1H),7.99-7.96(m,1H),7.92-7.81(m,2H),7.46-7.42 (m,1H),7.39-7.37(m,1H),7.27-7.20(m,1H),7.11(d,1H,J＝8.4Hz),6.36(d,1H,J＝8.4Hz),4.33(s,2H),3.73(br,2H),3.40(br,2H),3.26-3.21(br,4H)。實施例6化合物(6)：4-(3-(4-(3氫-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)哌嗪-1-羰基)-4-氟芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：步驟1：4-(4-氨基-5-硝基哌啶-2-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備采用實施例1步驟1制備化合物a類似的方法，通過化合物單叔丁氧羰基保護(hù)哌嗪與2-氯-5-硝基-4-氨基吡啶發(fā)生親核取代反應(yīng)制得化合物o：4-(4-氨基-5-硝基哌啶-2-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(1.1g，收率86％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝324。步驟2：4-(4,5-二氨基哌啶-2-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備采用實施例1步驟2制備化合物b類似的方法，通過化合物o發(fā)生催化氫化反應(yīng)制得化合物p：4-(4,5-二氨基哌啶-2-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(0.9g，收率97％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝294。步驟3：4-(3氫-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備采用實施例4步驟1制備化合物k類似的方法，通過化合物p與原甲酸三甲酯發(fā)生環(huán)合反應(yīng)化合物q：4-(3氫-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(0.6g，收率82％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝304。步驟4：6-(哌嗪-1-基)-3氫-咪唑并[4,5-c]吡啶的制備采用實施例1步驟4制備化合物d類似的方法，通過化合物q與三氟乙酸發(fā)生脫除保護(hù)基反應(yīng)制得化合物r：6-(哌嗪-1-基)-3氫-咪唑并[4,5-c]吡啶(279mg，收率75％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝204。步驟5：4-(3-(4-(3氫-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)哌嗪-1-羰基)-4-氟芐基)呔嗪 -1(二氫)-酮的制備采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物r與化合物f發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(6)：4-(3-(4-(3氫-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)哌嗪-1-羰基)-4-氟芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(16mg，收率20％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝484。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.57(s,1H),12.35(s,1H),8.54(s,1H),8.25(d,1H,J＝7.8Hz),8.09(s,1H),7.98-7.80(m,3H),7.42-7.37(m,2H),7.26-7.20(m,2H),6.76(s,1H),4.33(s,2H),3.75(br,2H),3.50(br,2H),3.39(br,4H)。實施例7化合物(7)：4-(3-(4-(3氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)哌嗪-1-羰基)-4-氟芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：步驟1：4-(5-氨基-6-硝基哌啶-3-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備采用實施例1步驟1制備化合物a類似的方法，通過化合物單叔丁氧羰基保護(hù)哌嗪與5-溴-2-硝基-3-氨基吡啶發(fā)生親核取代反應(yīng)制得化合物s：4-(5-氨基-6-硝基哌啶-3-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(0.7g，收率82％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝324。步驟2：4-(5,6-二氨基哌啶-3-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備采用實施例1步驟2制備化合物b類似的方法，通過化合物s發(fā)生催化氫化反應(yīng)制得化合物t：4-(5,6-二氨基哌啶-3-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(0.52g，收率91％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝294。步驟3：4-(3氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備采用實施例4步驟1制備化合物k類似的方法，通過化合物t與原甲酸三甲酯發(fā)生環(huán)合反應(yīng)化合物u：4-(3氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(0.36g，收率73％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝304。步驟4：6-(哌嗪-1-基)-3氫-咪唑并[4,5-b]吡啶的制備采用實施例1步驟4制備化合物d類似的方法，通過化合物u與三氟乙酸發(fā)生脫除保護(hù)基反應(yīng)制得化合物v：6-(哌嗪-1-基)-3氫-咪唑并[4,5-b]吡啶(126mg，收率82％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝204。步驟5：4-(3-(4-(3氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)哌嗪-1-羰基)-4-氟芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物v與化合物f發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(7)：4-(3-(4-(3氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)哌嗪-1-羰基)-4-氟芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(16mg，收率22％)。MS(ESI):m/z484[M+1]+.1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.59(s,1H),8.25-8.20(m,3H),7.98-7.79(m,3H),7.51-7.45(m,1H),7.42-7.37(m,3H),7.26-7.20(m,1H),4.33(s,2H),3.78(br,2H),3.55-3.47(m,2H),3.19-3.14(m,2H),3.03(br,2H)。實施例8化合物(8)：4-(3-(4-(7氫-嘌呤-2-基)哌嗪-1-羰基)-4-氟芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：步驟1：2-氯-5-硝基-4-氨基嘧啶的制備將溶有2,4-二氯-5-硝基嘧啶(500mg,2.5mmol)的四氫呋喃(10mL)中加入碳酸氫鈉(238mg,2.8mmol)和氨水(0.3mL)，55℃反應(yīng)2小時后減壓除去溶劑，殘余物經(jīng)快速柱層析分離(二氯甲烷：甲醇＝100：1)得到白色固體化合物w：2-氯-5-硝基-4-氨基嘧啶(0.47g，收率84％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝175。步驟2：4-(4-氨基-5-硝基嘧啶-2-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備采用實施例1步驟1制備化合物a類似的方法，通過化合物單叔丁氧羰基保 護(hù)哌嗪與化合物w發(fā)生親核取代反應(yīng)制得化合物x：4-(4-氨基-5-硝基嘧啶-2-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(0.61g，收率87％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝325。步驟3：4-(4,5-二氨基哌啶-2-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備采用實施例1步驟2制備化合物b類似的方法，通過化合物x發(fā)生催化氫化反應(yīng)制得化合物z：4-(4,5-二氨基哌啶-2-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(0.26g，收率76％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝295。步驟4：4-(7氫-嘌呤-2-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯的制備采用實施例4步驟1制備化合物k類似的方法，通過化合物y與原甲酸三甲酯發(fā)生環(huán)合反應(yīng)化合物z：4-(3氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯(0.36g，收率73％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝305。步驟5：2-(哌嗪-1-基)-7氫-嘌呤的制備采用實施例1步驟4制備化合物d類似的方法，通過化合物z與三氟乙酸發(fā)生脫除保護(hù)基反應(yīng)制得化合物a’：2-(哌嗪-1-基)-7氫-嘌呤(141mg，收率74％)。MS(ESI)m/z:[M+H]+＝205。步驟6：4-(3-(4-(7氫-嘌呤-2-基)哌嗪-1-羰基)-4-氟芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物a’與化合物f發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(8)：4-(3-(4-(7氫-嘌呤-2-基)哌嗪-1-羰基)-4-氟芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(88mg，收率74％)。MS(ESI)m/z:485[M+1]+.1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.78(s,1H),12.57(s,1H),8.72(s,1H),8.26-8.24(m,1H),8.12(s,1H),7.98-7.96(m,1H),7.91-7.87(m,1H),7.84-7.80(m,1H),7.45-7.41(m,1H),7.39-7.37(m,1H),7.25-7.21(m,1H),4.32(s,2H),3.81-3.79(m,2H),3.72-3.65(m,4H),3.28-3.26(m,2H)。實施例9化合物(9)：4-(3-(4-(2-羰基-2,3-二氫-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：步驟1：3-(1,3-二氧代-2,3-二氫-1氫-茚-2-基)苯氰的制備冰浴下，在一個溶有異苯并呋喃-1(3氫)-酮(51g，0.38mol)和三氰基苯甲醛(52g，0.39mol)的丙酸乙酯溶液(200mL)中在40分鐘內(nèi)緩慢加入溶有25％甲醇鈉的甲醇溶液(320mL)。保持反應(yīng)體系溫度低于30℃，上述反應(yīng)體系逐漸升至室溫并加熱至回流1小時，繼續(xù)加入甲醇(100mL)并在回流狀態(tài)下攪拌1小時。將上述反應(yīng)體系冷卻至室溫減壓除去溶劑后，殘余物用水(1L)稀釋并過濾。濾餅用乙醚(200mL)洗滌三次，使用醋酸(110mL)將化合物酸化。過濾，濾餅用水(100mL)洗滌后得到紅色固體化合物b’：3-(1,3-二氧代-2,3-二氫-1氫-茚-2-基)苯氰(69g，收率94％)。步驟2：3-((4-氧代-3,4-二氫呔嗪-1-基)甲基)苯甲酸的制備采用實施例1步驟6制備化合物f類似的方法，通過化合物b’發(fā)生水解反應(yīng)制得化合物c’：3-((4-氧代-3,4-二氫呔嗪-1-基)甲基)苯甲酸(28g，收率55％)。MS(ESI)m/z:281[M+1]+。步驟3：4-(3-(4-(2-羰基-2,3-二氫-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物c’與化合物n發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(9)：4-(3-(4-(2-羰基-2,3-二氫-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(37mg，收率46％)。MS(ESI)m/z:482[M+1]+.1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.58(br,1H),10.95(br,1H),10.37(br,1H),8.27-8.24(m,1H),7.97-7.80(m,3H),7.42-7.35(m,3H),7.26-7.23(m,1H),7.11-7.09(m,1H),6.34(d,1H,J＝8.7Hz),4.35(s,2H),3.69-3.47(m,4H),3.24-3.14(m,4H)。實施例10化合物(10)：4-(3-(4-(1氫-[1,2,3]三唑[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備的制備，具體反應(yīng)式如下：采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物c’與化合物d發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(10)：4-(3-(4-(1氫-[1,2,3]三唑[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(41mg，收率52％)。MS(ESI)m/z:467[M+1]+.1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.53(s,1H),8.21-8.10(m,2H),7.93-7.71(m,1H),7.87-7.80(m,3H),7.41-7.35(m,3H),7.24-7.20(m,1H),7.02-6.96(m,1H),4.30(s,2H),3.71(br,6H),3.55(br,2H)。實施例11化合物(11)：4-(3-(4-(2-甲基-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備的制備，具體反應(yīng)式如下：采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物c’與化合物h發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(11)：4-(3-(4-(2-甲基-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(34mg，收率45％)。MS(ESI)m/z:480[M+1]+.1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.52(s,1H),8.21-8.10(m,2H),7.94-7.72(m,1H),7.87-7.77(m,3H),7.41-7.34(m,3H),7.26-7.21(m,1H),7.03-6.97(m,1H),4.31(s,2H),3.71(br,4H),3.52(br,4H),2.61(s,3H)。實施例12化合物(12)：4-(3-(4-(2-三氟甲基)-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備的制備，具體反應(yīng)式如下：采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物c’與化合物j發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(12)：4-(3-(4-(2-三氟甲基)-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(36mg，收率42％)。MS(ESI)m/z:534[M+1]+.1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.56(br,1H),8.22(d,1H,J＝8.1Hz),7.95-7.87(m,3H),7.83-7.76(m,3H),7.42-7.36(m,2H),7.22-7.17(m,1H),6.91(d,1H,J＝9.0Hz),4.30(s,2H),3.72(br,2H),3.61(br,2H),3.42(br,4H)。實施例13化合物(13)：4-(3-(4-(1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備的制備，具體反應(yīng)式如下：采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物c’與化合物l發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(13)：4-(3-(4-(1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(48mg，收率58％)。MS(ESI)m/z:466[M+1]+.1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.57(br,1H),12.50(br,1H),8.23(d,1H,J＝7.6Hz),8.00(s,1H),7.96-7.93(m,1H),7.88-7.72(m,3H),7.40-7.34(m,3H),7.25-7.24(m,1H),6.79-6.73(m,1H),4.33(s,2H),3.68-3.38(m,8H)。實施例14化合物(14)：4-(3-(4-(1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-甲氧基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：步驟1：3-溴-4-甲氧基苯甲酸甲酯的制備在一個溶有4-甲氧基苯甲酸甲酯(1.5g，9mol)的水溶液(10mL)中于室溫下緩慢加入溴酸鉀(251mg，1.5mmol)和液溴(722mg，4.5mmol)。保持反應(yīng)體系溫度低于30℃攪拌2.5小時。將上述反應(yīng)體系加入甲基叔丁基醚(25mL)，萃取后有機相用飽和食鹽水洗滌，干燥濃縮所得殘余物經(jīng)快速柱層析分離(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)得到白色固體化合物d’：3-溴-4-甲氧基苯甲酸甲酯(2.1g，收率95％)。步驟2：3-氰基-4-甲氧基苯甲酸甲酯的制備在一個溶有化合物d’(1.1g，4.4mol)的二甲基甲酰胺溶液(10mL)中加入氰化亞銅(1.2g，13.22mmol)。加熱至140℃攪拌6小時。將上述反應(yīng)體系冷卻后加入乙酸乙酯(25mL)，萃取后有機相用飽和食鹽水洗滌，干燥濃縮所得殘余物經(jīng)快速柱層析分離(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)得到白色固體化合物e’：3-氰基-4-甲氧基苯甲酸甲酯(662mg，收率79％)。步驟3：5-(羥甲基)-2-甲氧基苯氰的制備在一個溶有化合物e’(1g，5.2mol)的四氫呋喃溶液(25mL)中加入硼氫化鋰(0.45g，20.7mmol)。室溫下攪拌過夜。將上述反應(yīng)體系干燥濃縮，所得殘余物經(jīng)快速柱層析分離(石油醚：乙酸乙酯＝2：1)得到白色固體化合物f’：5-(羥甲基)-2-甲氧基苯氰(845mg，收率100％)。步驟4：5-甲?；?2-甲氧基苯氰的制備在一個溶有化合物f’(845mg，5.2mol)的二氯甲烷溶液(50mL)中加入(1,1,1- 三乙?；?-1,1-二氫-1,2-苯碘酰-3(1氫)-酮(2.6g，6.2mmol)。室溫下攪拌2小時。將上述反應(yīng)體系干燥濃縮，所得殘余物經(jīng)快速柱層析分離(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)得到白色固體化合物g’：5-甲酰基-2-甲氧基苯氰(845mg，收率100％)。步驟5：2-甲氧基-5-((3-氧代異苯并呋喃-1(3氫)-亞基)甲基)苯氰的制備采用實施例1步驟5制備化合物e類似的方法，通過化合物g’與3-氧代-1,3-二氫苯并異呋喃-1-基亞磷酸二甲酯發(fā)生反應(yīng)制得化合物h’：2-甲氧基-5-((3-氧代異苯并呋喃-1(3氫)-亞基)甲基)苯氰(795mg，收率67％)。步驟6：2-甲氧基-5-((4-氧代-3,4-二氫呔嗪-1-基)甲基)苯甲酸的制備采用實施例1步驟6制備化合物f類似的方法，通過化合物h’發(fā)生水解反應(yīng)制得化合物i’：2-甲氧基-5-((4-氧代-3,4-二氫呔嗪-1-基)甲基)苯甲酸(318mg，收率63％)。MS(ESI)m/z:311[M+1]+。步驟7：4-(3-(4-(1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-甲氧基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物i’與化合物l發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(14)：4-(3-(4-(1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-甲氧基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(77mg，收率49％)。MS(ESI)m/z:496[M+1]+.1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.55(br,1H),8.23(d,1H,J＝7.6Hz),8.19(s,1H),7.95(d,1H,J＝8.4Hz),7.88-7.80(m,3H),7.39-7.31(m,1H),7.16-7.15(m,1H),7.01(d,1H,J＝8.4Hz),6.80(d,1H,J＝9.2Hz),4.24(s,2H),3.73(s,3H),3.70-3.69(m,2H),3.56-3.54(m,2H),3.37-3.36(m,2H),3.18-3.16(m,2H)。實施例15化合物(15)：4-(3-(4-(1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-三氟甲基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：步驟1：3-溴-4-三氟甲基苯甲酸甲酯的制備在一個溶有3-溴-4-三氟甲基苯甲酸(4.1g，15.4mol)的甲醇溶液(30mL)中于室溫下緩慢加入濃硫酸(1mL)。反應(yīng)加熱至60℃攪拌6小時。冷卻至室溫，將上述反應(yīng)體系加入乙酸乙酯(25mL)，萃取后有機相用飽和食鹽水洗滌，干燥濃縮所得殘余物經(jīng)快速柱層析分離(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)得到白色固體化合物j’：3-溴-4-三氟甲基苯甲酸甲酯(4.2g，收率96％)。步驟2：3-氰基-4-三氟甲基苯甲酸甲酯的制備采用實施例14步驟2制備化合物e’類似的方法，通過化合物j’發(fā)生氰基化反應(yīng)制得化合物k’：3-氰基-4-三氟甲基苯甲酸甲酯(1.6g，收率64％)。MS(ESI)m/z:230[M+1]+。步驟3：5-(羥甲基)-2-三氟甲基苯氰的制備采用實施例14步驟3制備化合物f’類似的方法，通過化合物k’發(fā)生還原反應(yīng)制得化合物l’：5-(羥甲基)-2-三氟甲基苯氰(1.2g，收率87％)。MS(ESI)m/z:202[M+1]+。步驟4：5-甲?；?2-三氟甲基苯氰的制備采用實施例14步驟4制備化合物g’類似的方法，通過化合物l’發(fā)生還原反應(yīng)制得化合物m’：5-甲?；?2-三氟甲基苯氰(1.3g，收率96％)。MS(ESI)m/z:200[M+1]+。步驟5：2-三氟甲基-5-((3-氧代異苯并呋喃-1(3氫)-亞基)甲基)苯氰的制備采用實施例1步驟5制備化合物e類似的方法，通過化合物m’與3-氧代-1,3-二氫苯并異呋喃-1-基亞磷酸二甲酯發(fā)生反應(yīng)制得化合物n’：2-三氟甲基-5-((3- 氧代異苯并呋喃-1(3氫)-亞基)甲基)苯氰(721mg，收率69％)。步驟6：2-三氟甲基-5-((4-氧代-3,4-二氫呔嗪-1-基)甲基)苯甲酸的制備采用實施例1步驟6制備化合物f類似的方法，通過化合物n’發(fā)生水解反應(yīng)制得化合物o’：2-三氟甲基-5-((4-氧代-3,4-二氫呔嗪-1-基)甲基)苯甲酸(678mg，收率86％)。MS(ESI)m/z:349[M+1]+。步驟7：4-(3-(4-(1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-三氟甲基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物o’與化合物l發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(15)：4-(3-(4-(1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-三氟甲基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(65mg，收率53％)。MS(ESI)m/z:534[M+1]+.1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.57(s,1H),8.24(d,1H,J＝0.8Hz),8.23(s,1H),7.96-7.80(m,4H),7.73(d,1H,J＝8.0Hz),7.54(d,1H,J＝8.0Hz),7.50(s,1H),6.77(d,1H,J＝8.4Hz),4.42(s,2H),3.82-3.77(m,1H),3.68-3.62(m,1H),3.59-3.52(m,2H),3.36-3.29(m,2H),3.19-3.10(m,2H)。實施例16化合物(16)：4-(3-(4-(1氫-[1,2,3]三唑[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-三氟甲基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物o’與化合物d發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(16)：4-(3-(4-(1氫-[1,2,3]三唑[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-三氟甲基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(70mg，收率57％)。MS(ESI)m/z:535[M+1]+.1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.57(s,1H),8.24(d,1H,J＝7.2Hz),8.17(d,1H,J＝8.8Hz),7.95-7.81(m,3H),7.74(d,1H,J＝8.0Hz),7.55(d,1H,J＝8.0Hz),7.51(s,1H),6.98(d,1H,J＝9.6Hz),4.42(s,2H),3.80-3.62(m,4H),3.50-3.46(m,2H),3.36-3.30(m,2H)。實施例17化合物(17)：4-(3-(4-(2-氧代-2,3-二氫-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-三氟甲基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物o’與化合物n發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(17)：4-(3-(4-(2-氧代-2,3-二氫-1氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羰基)-4-三氟甲基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(67mg，收率53％)。MS(ESI)m/z:550[M+1]+.1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.57(s,1H),10.95(s,1H),10.37(s,1H),8.23(d,1H,J＝7.2Hz),7.94-7.80(m,3H),7.73(d,1H,J＝8.0Hz),7.54(d,1H,J＝8.0Hz),7.47(s,1H),7.09(d,1H,J＝8.0Hz),6.33(d,1H,J＝8.0Hz),4.42(s,2H),3.70-3.64(m,1H),3.64-3.59(m,1H),3.42-3.25(m,2H),3.14-3.08(m,4H)。實施例18化合物(18)：4-(3-(4-(3氫-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)哌嗪-1-羰基)-4-甲氧基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物i’與化合物r發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(18)：4-(3-(4-(3氫-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)哌嗪-1-羰基)-4-甲氧基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(54mg，收率34％)。MS(ESI)m/z:496[M+1]+.1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.55(s,1H),8.56(s,1H),8.23(s,1H),8.22(s,1H),7.93(d,1H,J＝8.0Hz),7.87-7.77(m,3H),7.31(d,1H,J＝8.0Hz),7.15(s,1H), 7.00(d,1H,J＝8.0Hz),6.82(s,1H),4.23(s,2H),3.71(br,5H),3.47-3.46(m,2H),3.32-3.18(m,4H)。實施例19化合物(19)：4-(3-(4-(3氫-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)哌嗪-1-羰基)-4-三氟甲基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物o’與化合物r發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(19)：4-(3-(4-(3氫-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)哌嗪-1-羰基)-4-甲氧基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(46mg，收率46％)。MS(ESI)m/z:534[M+1]+.1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.57(s,1H),8.55(s,1H),8.24(d,1H,J＝8.0Hz),8.17(s,1H),7.95-7.72(m,5H),7.55(d,1H,J＝8.0Hz),7.48(s,1H),6.80(s,1H),4.43(s,2H),3.81-3.79(m,1H),3.78-3.77(m,1H),3.68-3.64(m,2H),3.49-3.46(m,2H),3.17-3.12(m,2H)。實施例20化合物(20)：4-(3-(4-(3氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)哌嗪-1-羰基)-4-三氟甲基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物o’與化合物v發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(20)：4-(3-(4-(3氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)哌嗪-1-羰基)-4-三氟甲基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(37mg，收率41％)。MS(ESI)m/z:534[M+1]+.1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.57(s,1H),8.47(s,1H),8.24(s,1H), 8.22(s,1H),7.95-7.73(m,5H),7.55(d,1H,J＝8.0Hz),7.50(s,1H),7.49(s,1H),4.43(s,2H),3.85-3.82(m,1H),3.73-3.70(m,1H),3.20-3.19(m,4H),2.98(m,2H)。實施例21化合物(21)：4-(3-(4-(3氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)哌嗪-1-羰基)-4-甲氧基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮的制備，具體反應(yīng)式如下：采用實施例1步驟7制備化合物(1)類似的方法，通過化合物i’與化合物v發(fā)生縮合反應(yīng)制得化合物(21)：4-(3-(4-(3氫-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)哌嗪-1-羰基)-4-甲氧基芐基)呔嗪-1(二氫)-酮(66mg，收率42％)。MS(ESI)m/z:496[M+1]+.1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ12.55(s,1H),8.37(s,1H),8.23(s,1H),8.21(s,1H),7.94-7.76(m,3H),7.49(s,1H),7.31(d,1H,J＝8.0Hz),7.15-7.12(m,1H),7.00(d,1H,J＝8.0Hz),6.93(s,1H),4.23(s,2H),3.77(s,3H),3.76(br,2H),3.23-3.13(m,4H),3.05-2.97(m,2H)。生物學(xué)評價例1PARP酶活性測定實驗實驗原理：核蛋白的多聚ADP核糖化是發(fā)生在DNA損傷應(yīng)答時的翻譯后。PARP，全稱是聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，在有NAD存在時，催化多聚(ADP-核糖)連接到臨近的核蛋白上，從而引發(fā)經(jīng)由堿基切補修復(fù)通路的DNA修復(fù)機制。Trevigen公司生產(chǎn)的HTUniversalChemiluminescentPARPAssayKit能夠測量出這種被生物素標(biāo)記的ADP-核糖與組蛋白的結(jié)合水平。試劑與耗材1.HTUniversalChemiluminescentPARPAssayKitwithHistone-coatedStripWells，美國Trevigen，貨號：4676-096-K。2.讀板儀，美國PerkinElmer，EnVisionMultilabelPlateReader。溶液與緩沖液1.洗液含有0.1％TritonX-100的PBS溶液。2.20XPARP緩沖液用去離子水將20XPARP緩沖液稀釋20倍即得到1X緩沖液，該緩沖液被用來稀釋重組PARP酶，PARPCocktail和被測試化合物。3.10XPARPCocktail按照以下方法配制1XPARPCocktail：10XPARPCocktail2.5μl/well，10X活化DNA2.5μl/well，1XPARP緩沖液20μl/well。4.PARPEnzyme僅在使用前，用1XPARP緩沖液小心稀釋重組酶，稀釋好的酶溶液要盡快使用，未用完的要廢棄掉。5.Strep-HRP僅在使用前，用1XStrep稀釋液稀釋Strep-HRP500倍得到1X溶液。6.化學(xué)發(fā)光底物僅在使用前，將相同體積的PeroxyGlowA和B溶液混合均勻得到辣根過氧化物酶的底物。實驗方法化合物配制1.用DMSO將10mM各被測化合物母液稀釋至10μM，1μM。2.僅在實驗開始前，將溶解在DMSO中的每個化合物的梯度濃度溶液用1XPARP緩沖液稀釋20倍，得到5X的化合物溶液，即可用來進(jìn)行檢測，陽性對照(POSITIVE)和陰性對照(NEGATIVE)孔為1XPARP緩沖液(DMSO含量5％)，其中，采用AZD2281(Olaparib，阿斯利康制藥公司)作為對照化合物。操作步驟1.每孔加入50μl1XPARP緩沖液潤濕組蛋白，在室溫孵育孔板30分鐘，然后將孔里的1XPARP緩沖液吸出，并在紙巾上將殘留液體拍干凈。2.根據(jù)化合物(1)至(21)及對照化合物AZD2281，將稀釋好的5X化合物溶液加入對應(yīng)的孔中，每孔10μl，陽性對照(POSITIVE)和陰性對照(NEGATIVE)孔為1XPARP緩沖液(DMSO含量5％)。3.用1XPARP緩沖液將PARP酶稀釋至每15μl溶液含有0.5Unit，然后在除了陰性對照孔以外的其他孔加入15μl酶溶液，陰性對照孔只加入1XPARP緩沖液，室溫孵育孔板10分鐘。4.繼續(xù)加入25μl的1XPARPCocktail到每個孔中。5.27℃孵育孔板60分鐘。6.孵育結(jié)束后，將孔里的反應(yīng)液吸出，并在紙巾上將殘留液體拍干凈。接著用含有0.1％TritonX-100的PBS溶液沖洗孔板4遍，每次每孔用200μl，并在紙巾上將殘留液體拍干凈。7.接下來，在每孔中加入稀釋好的1XStrep-HRP溶液，然后在27℃孵育孔板60分鐘。8.孵育結(jié)束后，將孔里的反應(yīng)液吸出，并在紙巾上將殘留液體拍干凈。接著用含有0.1％TritonX-100的PBS溶液沖洗孔板4遍，每次每孔用200μl，并在紙巾上將殘留液體拍干凈。9.洗板結(jié)束后，將相同體積的PeroxyGlowA和B溶液混合均勻，每孔加入100μl，立即放入讀板儀記錄化學(xué)發(fā)光信號。數(shù)據(jù)處理每孔中的讀數(shù)需要被轉(zhuǎn)換成抑制率。化合物的抑制率可以使用下列公式計算得出：注：陽性對照孔讀數(shù)為positive孔讀數(shù)，意義為酶100％活性；陰性對照孔讀數(shù)為negative孔讀數(shù)，意義為酶0％；活性X為每個樣品各個濃度的讀數(shù)。表1化合物對PARP-1酶的抑制活性實施例化合物的編號IC50(PARP)/nM(1)2(2)9(3)6(4)1(5)1(6)3(7)8(8)11(9)2(10)5(11)17(12)10(13)1(14)4(15)2(16)7(17)6(18)13(19)8(20)2(21)15對照化合物AZD22818結(jié)論：本發(fā)明優(yōu)選化合物對PARP-1酶的抑制增殖具有明顯的抑制活性。例2細(xì)胞增殖抑制測定實驗下面的實驗用于在體外條件下測定本發(fā)明所述化合物對三陰性表型的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-436細(xì)胞的增殖抑制活性。試劑與耗材1.1株腫瘤細(xì)胞，MDA-MB-436，由輝源生物科技(上海)有限公司提供，均通過了支原體檢測。2.L15培養(yǎng)液，美國Invitrogen，貨號：11415-064。3.胎牛血清,美國Hyclone，貨號：CH30160.03。4.青霉素-鏈霉素液體，美國Invitrogen，貨號：15140-122。5.DMSO，美國Sigma，貨號D4540。6.96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Corning，貨號：3610。7.CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssay，美國Promega，貨號：G7571。8.讀板儀，美國PerkinElmer，EnVisionMultilabelPlateReader。細(xì)胞培養(yǎng)液1.L15完全細(xì)胞培養(yǎng)液：含有10％胎牛血清和100U青霉素和100μg/ml鏈霉素的L15培養(yǎng)液。實驗方法化合物配制1.用DMSO將個待測化合物配制成60mM的母液，-80°冰箱分裝保存。用DMSO將待測化合物母液稀釋至一系列的梯度濃度溶液，這些濃度包括6mM,2mM,0.6mM,0.2mM,60μM,20μM。2.僅在實驗開始前，在無菌條件下將配制好的待測化合物梯度濃度溶液用完全細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋100倍，此時，待測化合物的梯度濃度包括60μM,20μM,6μM,2μM,0.6μM,0.2μM,此為2×化合物溶液，即可用來處理細(xì)胞。3.用DMSO將上述(1)至(21)化合物及對照化合物AZD2281母液稀釋至一系列的梯度濃度溶液，這些濃度包括20μM,2μM,0.2μM,0.02μM,0.002μM,0.0002μM。在實驗開始前，在無菌條件下將配制好的待測化合物梯度濃度溶液用完全細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋100倍，此時，陽性化合物的梯度濃度包括200nM,20nM,2nM,0.2nM,0.02nM,0.002nM，此為2×化合物溶液，即可用來處理細(xì)胞。操作步驟1.化合物處理前一天將細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。接種密度為：8000細(xì)胞/50μl/孔。2.第二天，將配制好的2×化合物溶液按照化合物排列圖加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入50μl。3.輕輕震蕩細(xì)胞板，將其放置在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)120小時。4.孵育結(jié)束后按照CellTiterGlo試劑說明書要求在細(xì)胞板中加入配制好的試劑，充分混勻后室溫避光孵育10分鐘。5.將細(xì)胞板放入讀板儀進(jìn)行分析，設(shè)定讀取化學(xué)發(fā)光并記錄數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)處理每孔中的讀數(shù)需要被轉(zhuǎn)換成細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率可以使用下列公式計算得出：處理后的數(shù)據(jù)將用GraphPadPrism5分析軟件來做非線性回歸分析，得到劑量效應(yīng)曲線，并計算出待測化合物對MDA-MB-436細(xì)胞的半數(shù)殺傷濃度(ED50)。表2化合物對MDA-MB-436細(xì)胞的增殖抑制活性實施例化合物的編號ED50(MDA-MB-436)/μM(1)>25(2)>25(3)>25(4)0.7(5)>25(6)18(7)>25(8)1.4(9)>25(10)>25(11)>25(12)>25(13)0.7(14)6.8(15)23(16)>25(17)>25(18)>25(19)>25(20)>25(21)>25對照化合物AZD2281>25結(jié)論：本發(fā)明的部分優(yōu)選化合物對MDA-MB-436細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制活性。例3測試本發(fā)明化合物對小鼠的抑瘤實驗下面的實驗用于在體內(nèi)條件下評價并比較本發(fā)明所述化合物單用對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-436移植瘤、人乳腺癌細(xì)胞株MX-1移植瘤或人胰腺癌細(xì)胞株CAPAN-1移植瘤的療效。受試化合物實施例化合物(4)實驗動物BALB/cA-nude裸小鼠，6-7周，♀，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。合格證號：SCXK(滬)2012-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級。實驗步驟裸小鼠皮下接種人乳腺癌MDA-MB-436細(xì)胞或者人乳腺癌MX-1或者人胰腺癌CAPAN-1，待腫瘤生長至100-200mm3后，將動物隨機分組(D0)。給藥劑量和給藥方案見表1。每周測2-3次瘤體積，稱鼠重，記錄數(shù)據(jù)。腫瘤體積(V)計算公式為：V＝1/2×a×b2其中a、b分別表示長、寬。T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)X100其中T、C為實驗結(jié)束時的腫瘤體積；T0、C0為實驗開始時的腫瘤體積。表3化合物在人乳腺癌MDA-MB-436裸小鼠移植瘤模型上的給藥劑量、給藥方案和抑瘤療效結(jié)果化合物給藥途徑給藥劑量給藥頻率給藥天數(shù)抑瘤率化合物(4)口服30毫克/公斤1天1次連續(xù)14天191％AZD2281口服30毫克/公斤1天1次連續(xù)14天83％結(jié)論：本發(fā)明的部分優(yōu)選化合物單獨給藥對人乳腺癌MDA-MB-436移植瘤模型具有明顯的抗癌活性。表4化合物在人乳腺癌MX-1裸小鼠移植瘤模型上的給藥劑量、給藥方案和抑瘤療效結(jié)果化合物給藥途徑給藥劑量給藥頻率給藥天數(shù)抑瘤率化合物(4)口服50毫克/公斤1天1次連續(xù)21天193％AZD2281口服50毫克/公斤1天1次連續(xù)21天13％結(jié)論：本發(fā)明的部分優(yōu)選化合物單獨給藥對人乳腺癌MX-1移植瘤模型具有明顯的抗癌活性。表5化合物在人胰腺癌CAPAN-1裸小鼠移植瘤模型上的給藥劑量、給藥方案和抑瘤療效結(jié)果化合物給藥途徑給藥劑量給藥頻率給藥天數(shù)抑瘤率化合物(4)口服50毫克/公斤1天1次連續(xù)21天128％AZD2281口服50毫克/公斤1天1次連續(xù)21天57％結(jié)論：本發(fā)明的部分優(yōu)選化合物單獨給藥對人胰腺癌CAPAN-1移植瘤模型具有明顯的抗癌活性。當(dāng)前第1頁1 2 3