本發(fā)明涉及固定化酶領(lǐng)域，具體涉及一種固定化頭孢菌素C?；讣捌渲苽浞椒?。

背景技術(shù)：

頭孢菌素C?；甘且活怤端親核(N-terminal nucleophilic，Ntn)水解酶，可直接催化頭孢菌素C(cephalosporin C，CPC)生成7-氨基頭孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)，而7-ACA又是醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)半合成頭孢菌素的重要中間體，需求量很大。因此該酶的固定化在工業(yè)上具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前已報(bào)道的固定化頭孢菌素C酰化酶，主要采用共價(jià)法，如參考文獻(xiàn)Characteristic of immobilized cephalosporin C acylase and itsapplication in one-step enzymatic conversion of cephalosporin C to 7-aminocephalosporanic acid.Xiangwei Zhu,Hui Luo,Yanhong Chang,Houbo Su,Qiang Li,Huimin Yu,Zhongyao Shen,World Journal of Microbiology and Biotechnology April 2011Vol 27,Issue 4,pp823-829中選用三種不同的環(huán)氧樹(shù)脂，比較它們的固定化效果，篩選出了一個(gè)較好的載體；參考文獻(xiàn)Immobilization and thermostability characterization of cephalosporin C acylase.Kai Hua Han,Hui Luo,Yao Zhen Xie,Shun Yao,Yan Hong Chang,Hui Min Yu,Qiang Li,Zhong Yao Shen,Advanced Materials Research Jan 2013Volumes 634-638,p682-688中選用5種不同的環(huán)氧樹(shù)脂，比較它們的固定化效果，并對(duì)其中的一個(gè)載體進(jìn)行了固定化條件的優(yōu)化；中國(guó)專利申請(qǐng)(CN103343117A)中也報(bào)道了在醋酸鈉緩沖液中用不同的載體對(duì)頭孢菌素C酰化酶進(jìn)行固定化的效果。

上述方法存在如下缺點(diǎn)：所需的固定化時(shí)間均在20小時(shí)或更長(zhǎng)。這在 工業(yè)上會(huì)增加生產(chǎn)成本，不利于大批量的商品化生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題：針對(duì)現(xiàn)有頭孢菌素C?；腹潭ɑ夹g(shù)中的固定化時(shí)間較長(zhǎng)、均在20小時(shí)或更長(zhǎng)，增加了生產(chǎn)成本的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新的固定化頭孢菌素C?；讣捌渲苽浞椒?。該方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有固定化用時(shí)大大縮短，且在相同條件下得到的固定化酶具有更高的酶活性、穩(wěn)定性和重復(fù)利用性，克服了現(xiàn)有文獻(xiàn)的缺點(diǎn)，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的因用時(shí)過(guò)長(zhǎng)造成的成本增加問(wèn)題，更適用于工業(yè)生產(chǎn)。

本發(fā)明技術(shù)方案之一：一種制備固定化頭孢菌素C?；傅姆椒ǎ浒ㄏ率霾襟E：將ES-1樹(shù)脂和頭孢菌素C?；冈?.5-1.0mol/L，pH 7.0-10.5的磷酸鹽緩沖液中混合，15-35℃固定化8-20h，得固定化頭孢菌素C?；?。

本發(fā)明較佳地還可以包括下述步驟：將得到的固定化頭孢菌素C?；赣?.01-0.1mol/L磷酸鹽緩沖液或水洗滌，較佳地洗滌3-5次，以除去表面未結(jié)合的蛋白。

本發(fā)明較佳地還可以包括固定化頭孢菌素C?；傅幕钚詸z測(cè)方法。所述檢測(cè)方法為：將收集的固定化頭孢菌素C?；讣尤牒蓄^孢菌素C的PBS緩沖液中反應(yīng)，檢測(cè)7-ACA的生成量，計(jì)算它的表觀酶活回收率。

本發(fā)明中，所述ES-1樹(shù)脂為本領(lǐng)域常規(guī)，購(gòu)自天津南開(kāi)和成科技有限公司，所述ES-1樹(shù)脂也被稱為ESS-1樹(shù)脂或ES-V-1樹(shù)脂，為一種負(fù)載有環(huán)氧基團(tuán)的載體。較佳地，所述ES-1樹(shù)脂為預(yù)處理后的ES-1樹(shù)脂。所述預(yù)處理包括下述步驟：所述ES-1樹(shù)脂在0.01-0.1mol/L pH8.0-8.5的磷酸鹽緩沖液中，20-30℃靜置15-30min，得預(yù)處理后的ES-1樹(shù)脂。所得的預(yù)處理后的ES-1樹(shù)脂較佳地還可以洗滌、抽干，所述洗滌的次數(shù)為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為3～5次，所述抽干為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為使用真空泵抽干。所述預(yù)處理后的ES-1較佳地于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明中，所述頭孢菌素C?；笧楸绢I(lǐng)域常規(guī)，包括野生型頭孢菌素 C?；富蛘呔哂蓄^孢菌素C?；富钚缘耐蛔凅w。所述頭孢菌素C?；傅闹苽浞椒楸绢I(lǐng)域常規(guī)，較佳地為通過(guò)含有頭孢菌素C?；富蛑亟M載體的轉(zhuǎn)化體表達(dá)純化制得，更佳地為通過(guò)含有表達(dá)頭孢菌素C酰化酶的pET28a(+)重組載體的E.coli BL21(DE3)菌株表達(dá)純化制得。

本發(fā)明中，所述頭孢菌素C酰化酶與ES-1樹(shù)脂加入的比例較佳地為150-280U/g，更佳為200U/g。所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.5-1.0mol/L，較佳地為0.7-1.0mol/L，更佳地為0.9-1.0mol/L，最佳地為1.0mol/L，所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.0-10.5，較佳地為8.5-10.5，更佳地為9.0-10.0，最佳地為9.5。所述固定化為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為震蕩或攪拌固定化。所述震蕩為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為通過(guò)旋轉(zhuǎn)固定化，更佳地為用搖床旋轉(zhuǎn)。所述旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為120-180r/min，更佳地為120-150r/min，最佳地為150r/min。所述固定化的溫度為15-35℃，較佳地為15-25℃，更佳地為25℃，所述固定化的時(shí)間為8-20h，較佳地為8-12h，更佳地為10-12h，最佳地為12h。

本發(fā)明中，較佳地還可以包括下述步驟：將得到的固定化酶用0.01-0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液或水洗滌，以除去表面未結(jié)合的蛋白。所述洗滌為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為洗滌3～5次。所得洗滌后的固定化酶較佳地還可以抽濾，所述抽濾為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為使用真空泵抽濾。所得的抽濾后的固定化酶較佳地保存在4℃?zhèn)溆谩Ｋ隽姿猁}緩沖液為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為磷酸鈉緩沖液。所述磷酸鹽緩沖液pH值為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為8.0-8.5。

本發(fā)明中，固定化頭孢菌素C?；傅幕钚詸z測(cè)方法為：將收集的固定化酶加入含有頭孢菌素C的PBS緩沖液中反應(yīng)，檢測(cè)7-ACA的生成量，計(jì)算表觀酶活回收率。所述PBS緩沖液的濃度為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為0.1mol/L。所述PBS緩沖液中頭孢菌素C的含量為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為5mg/ml。所述反應(yīng)的時(shí)間為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為15min。所述檢測(cè)7-ACA的生成量的方法為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為HPLC。

本發(fā)明技術(shù)方案之二：一種固定化頭孢菌素C?；?，其包括ES-1 樹(shù)脂和固定于ES-1樹(shù)脂上的頭孢菌素C?；?。較佳地，所述頭孢菌素C?；竿ㄟ^(guò)氨基酸殘基與ES-1樹(shù)脂上的環(huán)氧基團(tuán)形成共價(jià)鍵；所述固定于ES-1樹(shù)脂上的頭孢菌素C?；傅谋碛^酶活為75-120U/g。

在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有固定化頭孢菌素C?；傅募夹g(shù)中的固定化時(shí)間長(zhǎng)，酶活性回收率低的問(wèn)題，提供了一種固定化時(shí)間縮短至12h、酶活回收率提高到40％以上的固定化頭孢菌素C酰化酶的方法，該方法解決了現(xiàn)有技術(shù)高生產(chǎn)成本的問(wèn)題，更適用于工業(yè)生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書選擇。

以下實(shí)施例中的頭孢菌素C酰化酶通過(guò)文獻(xiàn)[CPC?；傅娜斯ず铣珊椭亟M表達(dá)，安明，于慧敏，羅暉等，清華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008,48(9)：119-123]記載的方法制備得到：在37℃，200r/min條件下培養(yǎng)重組大腸桿菌10-12h制作種子培養(yǎng)液。從種瓶中按2％接種量轉(zhuǎn)接到卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)約1h至菌密度OD600達(dá)到0.6，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，28℃下誘導(dǎo)24h，收集菌體，再用金屬親合法純化出其中的目的蛋白，即重組頭孢菌素C?；?。

實(shí)施例1

(1)將ES-1樹(shù)脂(購(gòu)自天津南開(kāi)和成科技有限公司)置于400ml pH8.0的0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液中在25℃下靜置15min，用水洗滌3次后用真空泵抽干，于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)取1g預(yù)處理好的ES-1樹(shù)脂，加入200U的酶液，在1.0mol/L，pH9.5 的磷酸鉀緩沖液中，于25℃、150r/min的搖床震蕩固定12h；

(3)將上述得到的固定化酶用0.1mol/L，pH8.0的磷酸鈉緩沖液洗滌3次，以除去表面未結(jié)合的蛋白，并用真空泵抽濾，得到的固定化酶保存在4℃?zhèn)溆茫?/p>

(4)將得到的固定化酶進(jìn)行表觀酶活回收率的測(cè)定，即將回收的固定化酶加入到含有5.0mg/ml CPC的pH8.0的0.1mol/L的PBS溶液中，于37℃，150r/min搖床反應(yīng)15min，用HPLC檢測(cè)7-ACA的生成量。與游離酶進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算此時(shí)所得固定化酶的表觀酶活回收率達(dá)到60％，固定化酶的表觀酶活為120U/g。

實(shí)施例2

(1)同實(shí)施例1，先將載體進(jìn)行預(yù)處理；

(2)取1g預(yù)處理好的ES-1樹(shù)脂，加入200U的酶液，在0.5mol/L，pH8.5磷酸鉀緩沖液中，于35℃、150r/min的搖床震蕩固定8h；

(3)回收固定化酶，同實(shí)施例1的步驟(3)；

(4)檢測(cè)活性，同實(shí)施例1的步驟(4)，此時(shí)的固定化酶的表觀酶活回收率為41％，固定化酶的表觀酶活為82U/g。

實(shí)施例3

其它操作如實(shí)施例1，僅不同處在于固定化時(shí)磷酸鉀緩沖液濃度為0.5mol/L，此時(shí)的固定化酶的表觀酶活回收率為45％，固定化酶的表觀酶活為90U/g。

實(shí)施例4

其它操作步驟如實(shí)施例1，僅不同處在于固定化的時(shí)間為20h，此時(shí)的表觀酶活回收率為48％，固定化酶的表觀酶活為96U/g。

實(shí)施例5

其它操作如實(shí)施例1，不同處僅在于ES-1樹(shù)脂未經(jīng)過(guò)預(yù)處理，此時(shí)的固定化酶的表觀酶活回收率為40％，固定化酶的表觀酶活為80U/g。

實(shí)施例6

(1)將ES-1樹(shù)脂(購(gòu)自天津南開(kāi)和成科技有限公司)置于400ml pH8.5的0.01mol/L的磷酸鉀緩沖液中在30℃下靜置30min，用水洗滌3次后用真空泵抽干，于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)取1g預(yù)處理好的ES-1樹(shù)脂，加入200U的酶液，在1.0mol/L，pH10.5的磷酸鉀緩沖液中，于15℃、150r/min的搖床震蕩固定12h；

(3)將上述得到的固定化酶用0.1mol/L，pH8.0的磷酸鈉緩沖液洗滌3次，以除去表面未結(jié)合的蛋白，并用真空泵抽濾，得到的固定化酶保存在4℃?zhèn)溆?。此時(shí)的表觀酶活回收率為42％，固定化酶的表觀酶活為84U/g。

實(shí)施例7

(1)將ES-1樹(shù)脂(購(gòu)自天津南開(kāi)和成科技有限公司)置于400ml pH8.2的0.05mol/L的磷酸鉀緩沖液中在20℃下靜置20min，用水洗滌3次后用真空泵抽干，于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)取1g預(yù)處理好的ES-1樹(shù)脂，加入200U的酶液，在0.5mol/L，pH9.0的磷酸鉀緩沖液中，于25℃、150r/min的搖床震蕩固定12h；

(3)將上述得到的固定化酶用0.1mol/L，pH8.0的磷酸鈉緩沖液洗滌3次，以除去表面未結(jié)合的蛋白，并用真空泵抽濾，得到的固定化酶保存在4℃?zhèn)溆?。此時(shí)的表觀酶活回收率為45％，固定化酶的表觀酶活為90U/g。

實(shí)施例8

(1)將ES-1樹(shù)脂(購(gòu)自天津南開(kāi)和成科技有限公司)置于400ml pH8.0的0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液中在25℃下靜置15min，用水洗滌5次后用真空泵抽干，于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)取1g預(yù)處理好的ES-1樹(shù)脂，加入150U的酶液，在0.9mol/L，pH7.0的磷酸鈉緩沖液中，于30℃、120r/min的搖床震蕩固定12h；

(3)將上述得到的固定化酶用0.01mol/L，pH8.0的磷酸鈉緩沖液洗滌3次，以除去表面未結(jié)合的蛋白，并用真空泵抽濾，得到的固定化酶保存在4℃?zhèn)溆?。此時(shí)的表觀酶活回收率為50％，固定化酶的表觀酶活為75U/g。

實(shí)施例9

(1)將ES-1樹(shù)脂(購(gòu)自天津南開(kāi)和成科技有限公司)置于400ml pH 8.0的0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液中在25℃下靜置15min，用水洗滌3次后用真空泵抽干，于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)取1g預(yù)處理好的ES-1樹(shù)脂，加入280U的酶液，在0.6mol/L，pH9.5的磷酸鉀緩沖液中，于20℃、180r/min的搖床震蕩固定12h；

(3)將上述得到的固定化酶用去離子水洗滌5次，以除去表面未結(jié)合的蛋白，并用真空泵抽濾，得到的固定化酶保存在4℃?zhèn)溆谩４藭r(shí)的表觀酶活回收率為40％，固定化酶的表觀酶活為112U/g。

以下對(duì)比例中用到的載體中，Eupergit C250L為單體聚合多孔小球狀樹(shù)脂，顆粒直徑分布在120-250μm，擔(dān)載量約為25mmol環(huán)氧基團(tuán)/100g，具有良好的機(jī)械操作強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，在pH 0-14的酸堿范圍內(nèi)均保持穩(wěn)定；LX-1000EP：分子中具有兩個(gè)或兩個(gè)以上活性環(huán)氧基團(tuán)的低聚物，粒徑150-300μm；ES-1，ES-105，ES-103B粒徑大小都是100-300μm，但是在骨架、比表面積等方面都有差異。

對(duì)比例1

環(huán)氧樹(shù)脂LX-1000EP固定CPC?；?/p>

(1)同實(shí)施例1對(duì)ES-1、LX-1000EP樹(shù)脂(購(gòu)自西安藍(lán)曉科技有限公司)，進(jìn)行預(yù)處理；

(2)取1g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的ES-1、LX-1000EP樹(shù)脂，分別加入200U的酶，同時(shí)在1mol/L，pH8.0的磷酸鉀緩沖液中，于25℃，150r/min的搖床震蕩24h；

(3)回收固定化酶，同實(shí)施例1的步驟(3)；

(4)檢測(cè)活性，同實(shí)施例1的步驟(4)。此時(shí)得到的固定化酶ES-1、LX1000-EP的表觀酶活回收率分別為45％、28％。

對(duì)比例2

環(huán)氧樹(shù)脂Eupergit C250L(購(gòu)自Sigma Chemical Co.參考文獻(xiàn)：Eupergit C250L固定化D-海因酶及其催化性質(zhì)，丁成勇，徐曉瀅，馬喆，等。生物 加工過(guò)程，2006,11,4(4)：41-45.)固定化CPC?；?/p>

(1)同實(shí)施例1對(duì)Eupergit C250L、ES-1樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理；

(2)取1g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的Eupergit C250L、ES-1樹(shù)脂，分別加入等量的酶液，同時(shí)在1mol/L，pH8.0的磷酸鉀緩沖液中，于25℃，150r/min的搖床震蕩24h；

(3)回收固定化酶，同實(shí)施例1的步驟(3)；

(4)檢測(cè)活性，同實(shí)施例1的步驟(4)。此時(shí)得到的固定化酶ES-1、Eupergit C250L的表觀酶活回收率分別為45％、30％。

對(duì)比例3

環(huán)氧樹(shù)脂ES105固定化CPC?；?/p>

(1)同實(shí)施例1對(duì)ES105(購(gòu)自天津南開(kāi)和成科技有限公司)、ES-1樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理；

(2)取1g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的ES105、ES-1樹(shù)脂，分別加入等量的酶液，同時(shí)在1mol/L，pH8.0的磷酸鉀緩沖液中，于25℃，150r/min的搖床震蕩24h；

(3)回收固定化酶，同實(shí)施例1的步驟(3)；

(4)檢測(cè)活性，同實(shí)施例1的步驟(4)。此時(shí)得到的固定化酶ES-1、ES105的表觀酶活回收率分別為45％、35％。

對(duì)比例4

環(huán)氧樹(shù)脂ES103B固定化CPC酰化酶

(1)同實(shí)施例1對(duì)ES103B(購(gòu)自天津南開(kāi)和成科技有限公司)、ES-1樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理；

(2)取1g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的ES103B和ES-1樹(shù)脂，分別加入等量的酶液，同時(shí)在1mol/L，pH8.0的磷酸鉀緩沖液中，于25℃，150r/min的搖床震蕩24h；

(3)回收固定化酶，同實(shí)施例1的步驟(3)；

(4)檢測(cè)活性，同實(shí)施例1的步驟(4)。此時(shí)得到的固定化酶ES-1、ES103B的表觀酶活回收率分別為45％、33％。

對(duì)比例5

(1)將ES-1樹(shù)脂和ES-105樹(shù)脂分別在各自最優(yōu)的條件下進(jìn)行固定化，即將1g預(yù)處理的ES-1樹(shù)脂和200U的頭孢菌素C?；腹餐糜?.0mol/L pH9.5的磷酸鹽緩沖液中，于25℃搖床150r/min固定12h后；將1g預(yù)處理的ES-105載體和200U的頭孢菌素C?；腹餐糜?.5mol/L pH8.0的磷酸鉀緩沖液中，于20℃搖床150r/min固定28h；

(2)回收固定化酶，同實(shí)施例1的步驟(3)；

(3)將回收到的固定化酶分別置于50℃中水浴處理2h，檢測(cè)殘留的固定化酶活力，即將固定化酶加入到含有5.0mg/ml CPC的pH8.5的0.1mol/L的PBS溶液中，于37℃，150r/min搖床反應(yīng)1h(參考文獻(xiàn)并加以改進(jìn)：國(guó)產(chǎn)固定化GL-7-ACA?；钢苽?-ACA的工藝優(yōu)化，中南林學(xué)院學(xué)報(bào)，莫章樺，劉友全，張小飛，2006，26(1)：44-47)，用HPLC檢測(cè)7-ACA的生成量，計(jì)算酶的轉(zhuǎn)化效率，。得到的ES-1和ES-105的殘留活力分別為初始活力的92.61％，67.20％。

對(duì)比例6

(1)將ES-1樹(shù)脂和ES-105樹(shù)脂分別在各自最優(yōu)的條件下進(jìn)行固定化，同對(duì)比例5的步驟(1)；

(2)回收固定化酶，同實(shí)施例1的步驟(3)；

(3)將回收到的固定化酶分別置于4℃，在pH7.0的磷酸鉀緩沖液中處理2h，檢測(cè)殘留的固定化酶活力，同對(duì)比例5的步驟(3)。得到的ES-1和ES-105的殘留活力分別為初始活力的71.69％，62.23％。

對(duì)比例7

(1)將ES-1樹(shù)脂和ES-105樹(shù)脂分別在各自最優(yōu)的條件下進(jìn)行固定化，同對(duì)比例5的步驟(1)；

(2)回收固定化酶，同實(shí)施例1的步驟(3)；

(3)分別檢測(cè)各固定化酶活性，同實(shí)施例1的步驟(4)。重復(fù)反應(yīng)15批，分別計(jì)算得到ES-1和ES-105固定化酶第15批的反應(yīng)活性為第一批反 應(yīng)活性的90.11％和81.53％。

對(duì)比例8

(1)分別取1g實(shí)施例1預(yù)處理好的ES-1樹(shù)脂，加入200U的酶液，在1.0mol/L，pH8.0的磷酸鉀緩沖液中，于25℃、150r/min的搖床震蕩固定8h，12h，16h，20h，24h；

(2)將上述得到的固定化酶用0.1mol/L，pH8.0的磷酸鈉緩沖液洗滌3次，以除去表面未結(jié)合的蛋白，并用真空泵抽濾，得到的固定化酶保存在4℃?zhèn)溆谩?/p>

(3)檢測(cè)活性，同實(shí)施例1的步驟(4)。計(jì)算8h，12h，16h，20h，24h固定化酶的表觀酶活回收率分別為50％、55％、52％、48％、45％。

應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明的相關(guān)條件作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。