技術(shù)特征：
1.用于檢測靶核酸存在的體外方法，其包括：(a)將樣品與第一探針組接觸，所述探針組包含上游探針，其從5’至3’包含，(i)用報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對的第一成員標(biāo)記的至少一個(gè)非天然核苷酸；(ii)標(biāo)簽序列；和(iii)與所述靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補(bǔ)的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列的鏡像標(biāo)簽序列；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補(bǔ)的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補(bǔ)的3個(gè)或更多個(gè)堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時(shí)，所述探針組形成T-連接；(b)延伸所述上游探針以合成與所述下游探針上的鏡像標(biāo)簽序列互補(bǔ)的序列，以形成延伸的上游探針；(c)使所述延伸的上游探針與其自身雜交以形成發(fā)夾探針；(d)在用報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對的第二成員標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述發(fā)夾探針，所述非天然核苷酸能夠與所述上游探針中的所述至少一個(gè)非天然核苷酸堿基配對；以及(e)通過檢測所述發(fā)夾探針上的所述報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對來檢測所述靶核酸。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補(bǔ)的3至10個(gè)堿基的3’序列。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述上游探針包含與所述下游探針的標(biāo)簽序列互補(bǔ)的3至10個(gè)堿基的3’序列。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述下游探針還包含(iii)包含一個(gè)或更多個(gè)非天然堿基的isoprimer互補(bǔ)序列，其位于所述鏡像標(biāo)簽序列和與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補(bǔ)的序列之間，所述鏡像標(biāo)簽序列與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述上游探針包含與所述下游探針的isoprimer互補(bǔ)序列互補(bǔ)的3至10個(gè)堿基的3’序列。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游探針和所述下游探針的熔鏈點(diǎn)低于55℃。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對的第一成員為報(bào)告基團(tuán)。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述報(bào)告基團(tuán)為熒光團(tuán)。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中檢測所述報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對包括檢測熒光信號的改變。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中檢測所述報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對包括當(dāng)樣品溫度改變時(shí)檢測所述報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對的信號改變。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中檢測所述報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對包括當(dāng)樣品的溫度升高至高于發(fā)夾探針的熔鏈點(diǎn)時(shí)檢測所述報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對的信號改變。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述下游探針連接固體支持物。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個(gè)非天然核苷酸或淬滅基團(tuán)標(biāo)記的非天然核苷酸為isoG，另一個(gè)為isoC。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括：(a)使所述樣品與第二探針組接觸，所述第二探針組包含第二上游探針，其從5’至3’包含，(i)用報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對的第一成員標(biāo)記的至少一個(gè)非天然核苷酸；(ii)標(biāo)簽序列；和(iii)與第二靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補(bǔ)的序列；以及第二下游探針，其從5’至3’包含，(i)與所述第二上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列的鏡像標(biāo)簽序列；和(ii)與所述第二靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補(bǔ)的序列，其中所述第二上游探針包含與所述第二下游探針互補(bǔ)的3個(gè)或更多個(gè)堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時(shí)，所述第二探針組形成T-連接；(b)延伸所述第二上游探針以合成與所述第二下游探針上的鏡像標(biāo)簽序列互補(bǔ)的序列，以形成第二延伸的上游探針；(c)使所述第二延伸的上游探針與其自身雜交以形成第二發(fā)夾探針；(d)在用報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對的第二成員標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述第二發(fā)夾探針，所述非天然核苷酸能夠與所述第二上游探針的所述至少一個(gè)非天然核苷酸堿基配對；以及(e)通過檢測所述第二發(fā)夾探針上的所述報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對來檢測所述第二靶核酸。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其還包括：(a)將所述樣品與第三、第四、第五或第六探針組接觸，每組探針包含第三、第四、第五或第六上游探針，其從5’至3’包含，(i)用報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對的第一成員標(biāo)記的至少一個(gè)非天然核苷酸；(ii)標(biāo)簽序列；和(iii)與第三、第四、第五或第六靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補(bǔ)的序列；以及第三、第四、第五或第六下游探針，其從5’至3’包含，(i)與所述第三、第四、第五或第六上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列的鏡像標(biāo)簽序列；和(ii)與所述第三、第四、第五或第六靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補(bǔ)的序列，其中所述第三、第四、第五或第六上游探針包含與所述第三、第四、第五或第六下游探針互補(bǔ)的3個(gè)或更多個(gè)堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述第三、第四、第五或第六靶核酸雜交時(shí)，所述第三、第四、第五或第六探針組形成T-連接；(b)延伸所述第三、第四、第五或第六上游探針以合成與所述第三、第四、第五或第六下游探針上的鏡像標(biāo)簽序列互補(bǔ)的序列，以形成第三、第四、第五或第六延伸的上游探針；(c)使所述第三、第四、第五或第六延伸的上游探針與其自身雜交以形成發(fā)夾探針；(d)在用報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對的第二成員標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述第三、第四、第五或第六發(fā)夾探針，所述非天然核苷酸能夠與所述第三、第四、第五或第六上游探針的所述至少一個(gè)非天然核苷酸堿基配對；以及(e)通過檢測所述第三、第四、第五或第六發(fā)夾探針上的所述報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對來檢測所述第三、第四、第五或第六靶核酸。16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中基本同時(shí)檢測所述第一和第二靶核酸的存在。17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中順序檢測所述第一和第二靶核酸的存在。18.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述第一和第二探針組包含可區(qū)分的標(biāo)記物。19.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述第一和第二探針組包含相同的標(biāo)記物。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中由所述第一和第二探針組形成的所述發(fā)夾探針包括可區(qū)分的熔鏈點(diǎn)。21.如權(quán)利要求15所述的方法，其中由所述第一、第二、第三、第四、第五和第六探針組形成的所述發(fā)夾探針各自包括可區(qū)分的標(biāo)記物或可區(qū)分的熔鏈點(diǎn)。22.如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括進(jìn)行多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中檢測所述報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對包括在進(jìn)行多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)之前和之后檢測所述報(bào)告基團(tuán)的信號。24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中檢測所述報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對包括僅在進(jìn)行多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)之后檢測所述報(bào)告基團(tuán)的信號。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其還包括將所檢測到的標(biāo)記物之信號與非雜交探針上標(biāo)記物的參照信號相比較。26.如權(quán)利要求22所述的方法，其還包括對樣品中靶核酸的量進(jìn)行定量。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中對所述樣品中靶核酸的量進(jìn)行定量包括：采用標(biāo)準(zhǔn)曲線；確定所述靶核酸的相對量；采用終點(diǎn)定量；或者通過將相對于背景可檢測到信號的PCR循環(huán)數(shù)與存在的靶標(biāo)量相關(guān)聯(lián)，來確定所述靶核酸的量。28.包含第一探針組的組合物，所述探針組包含上游探針，其從5’至3’包含，(i)用報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對的第一成員標(biāo)記的至少一個(gè)非天然核苷酸；(ii)標(biāo)簽序列；和(iii)與靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補(bǔ)的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列的鏡像標(biāo)簽序列；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補(bǔ)的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補(bǔ)的3個(gè)或更多個(gè)堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時(shí)，所述探針組形成T-連接。29.如權(quán)利要求28所述的組合物，其還包含第二探針組，所述第二探針組包含第二上游探針，其從5’至3’包含，(i)用報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對的第一成員標(biāo)記的至少一個(gè)非天然核苷酸；(ii)標(biāo)簽序列；和(iii)與第二靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補(bǔ)的序列；以及第二下游探針，其從5’至3’包含，(i)與所述第二上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列的鏡像標(biāo)簽序列；和(ii)與所述第二靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補(bǔ)的序列，其中所述第二上游探針包含與所述第二下游探針互補(bǔ)的3個(gè)或更多個(gè)堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時(shí)，所述第二探針組形成T-連接。30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述第一和第二探針組包含可區(qū)分的標(biāo)記物，或者形成具有可區(qū)分熔鏈點(diǎn)的發(fā)夾探針。31.如權(quán)利要求29所述的組合物，其包含至少四組探針。32.如權(quán)利要求28所述的組合物，其還包含用報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的或者用淬滅基團(tuán)標(biāo)記的非天然核苷酸。33.如權(quán)利要求28所述的組合物，其還包含聚合酶、參照探針或游離核苷酸。34.試劑盒，其包含：(a)第一探針組，所述探針組包含上游探針，其從5’至3’包含，(i)用報(bào)告基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對的第一成員標(biāo)記的至少一個(gè)非天然核苷酸；(ii)標(biāo)簽序列；和(iii)與靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補(bǔ)的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列的鏡像標(biāo)簽序列；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補(bǔ)的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補(bǔ)的3個(gè)或更多個(gè)堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時(shí)，所述探針組形成T-連接；以及(b)用報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的或者用淬滅基團(tuán)標(biāo)記的非天然核苷酸。35.如權(quán)利要求34所述的試劑盒，其包含至少四組探針。36.如權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中所述探針組包含可區(qū)分的標(biāo)記物，或者形成具有可區(qū)分熔鏈點(diǎn)的發(fā)夾探針。37.如權(quán)利要求34所述的試劑盒，其還包含聚合酶、參照探針、游離核苷酸、參照樣品或試劑盒的使用說明。38.用于檢測靶核酸存在的方法，其包括：(a)將樣品與第一探針組接觸，所述探針組包含上游探針，所述...