用于在核酸測定中改善熔鏈分辨和多重性的探針本申請要求于2013年8月9日提交的美國臨時申請序列No.61/864.128的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，通過引用將其全部內(nèi)容并入本文。發(fā)明背景1.技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明一般性涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更特別地，其涉及核酸的檢測。2.

背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是不采用活的生物體對DNA進行酶復(fù)制的分子生物學(xué)技術(shù)。PCR通常用于醫(yī)學(xué)和生物研究實驗室以承擔(dān)多種任務(wù)，例如遺傳疾病的檢測、基因指紋的鑒定、感染性疾病的診斷、基因克隆、親子鑒定和DNA計算。由于其無可比擬的復(fù)制和精確能力，PCR被分子生物學(xué)家認(rèn)為是核酸檢測的首選方法。通常在PCR反應(yīng)的終點(end-point)或者平臺期進行DNA檢測，這使得難以對起始模板進行定量。實時PCR或動態(tài)PCR通過記錄反應(yīng)過程中的擴增子濃度，從而提高了終點PCR分析的能力。最通常通過與被擴增的靶標(biāo)有關(guān)的熒光信號的改變來記錄擴增子濃度。實時PCR相對于終點檢測的優(yōu)勢還在于，由于其在封閉的系統(tǒng)中進行，因此限制了污染。其它優(yōu)勢包括更高的靈敏度、動態(tài)范圍、速度和需要較少的過程。在實時PCR檢測方法中已經(jīng)采用了幾種測定化學(xué)。這些測定化學(xué)包括采用雙鏈DNA結(jié)合染料、雙標(biāo)記的寡核苷酸，例如發(fā)夾引物和發(fā)夾探針。然而，目前實時PCR的一個缺陷在于其受限的多重性(multiplexing)能力。目前的實時PCR技術(shù)采用在溶液中游離的報告熒光染料。在多重反應(yīng)中，該設(shè)計必須在每個測定中采用光譜不同的熒光色素。例如，設(shè)計來檢測4個靶序列的多重反應(yīng)將需要能夠通過光譜不同來區(qū)分4個不同的、游離漂浮的熒光色素的儀器，這還不包括對照。這些要求不僅限制了實際的多重能力，而且增加了成本，其原因在于這樣的設(shè)備通常需要多個發(fā)射源、檢測器和濾器。目前的實時PCR技術(shù)的多重能力為大約1-6重(plex)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于DNA擴增和檢測的系統(tǒng)和方法。特別是，本發(fā)明提供的系統(tǒng)和方法極大地提高了實時核酸擴增(例如經(jīng)PCR)的多重能力。在一個實施方案中，提供了用于檢測樣品中靶核酸存在的方法，其包括：(a)將所述樣品與第一引物組接觸，所述第一引物組包含第一引物，所述第一引物從5’至3’包含，(i)報告基團(reporter)；(ii)具有已知熔鏈點(meltpoint)的發(fā)夾；(iii)聚合酶延伸-阻斷修飾；(iv)至少一個非天然核苷酸，和(v)靶特異性序列，其與靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補；以及第二引物，其包含與所述靶核酸第二鏈上的區(qū)域互補的序列；(b)用所述第一引物組擴增所述靶核酸，其中在用淬滅基團(quencher)標(biāo)記的非天然核苷酸的存在下進行所述擴增，所述非天然核苷酸與所述第一引物的非天然核苷酸堿基配對；(c)通過檢測所述第一引物上報告基團的信號改變(例如信號淬滅)來檢測所述靶核酸分子的存在。因此，在一個更特定的實施方案中，提供了用于檢測樣品中第一和第二靶核酸分子的一個或兩者之存在的方法，其包括：(a)將所述樣品與至少第一和第二引物組接觸，每組引物包含第一引物，所述第一引物從5’至3’包含，(i)報告基團；(ii)具有已知熔鏈點的發(fā)夾；(iii)聚合酶延伸-阻斷修飾；(iv)至少一個非天然核苷酸，和(v)靶特異性序列，其與靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補；以及第二引物，其包含與所述靶核酸第二鏈上的區(qū)域互補的序列，其中所述第一和第二引物組的報告基團相同，并且其中所述第一和第二引物組包含具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾；(b)用所述第一和第二引物組擴增所述靶核酸(以獲得擴增產(chǎn)物)，其中在用淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸的存在下進行所述擴增，所述非天然核苷酸與所述第一和第二引物組之第一引物的非天然核苷酸堿基配對；(c)通過檢測所述第一或第二引物組之第一引物上的報告基團的信號改變來檢測靶核酸分子的存在；以及(d)改變所述樣品的溫度并確定對應(yīng)于所述報告基團未淬滅時的熔鏈點或熔鏈峰(meltpeak)，來確定第一靶核酸分子、第二靶核酸分子或兩者的存在是否導(dǎo)致所述報告基團的信號淬滅，由此檢測所述第一和第二靶核酸分子的一個或兩者的存在(例如，基于所述第一和第二引物組的發(fā)夾的可區(qū)分熔鏈點)。在某些方面，該實施方案中使用的報告基團可以為熒光團，例如連接在所述第一引物5’端的熒光團。因此，在一些情況下，信號的改變可以是熒光信號的降低。在另一方面，檢測所述第一引物上報告基團的信號改變還包括與擴增產(chǎn)物雜交，所述擴增產(chǎn)物包含報告基團和淬滅基團(例如暗淬滅基團(darkquencher))。在另一些方面，檢測報告基團的信號改變可以包括檢測信號的改變(或改變速率)，例如當(dāng)樣品溫度改變時信號未淬滅。在一方面，樣品溫度可以提高至高于(或者降低至低于)所述樣品中一個或更多個引物之發(fā)夾的熔鏈點。當(dāng)存在兩個或更多個引物組的情況下，改變樣品的溫度可以包括將樣品溫度從低于第一和第二引物組之兩個第一引物的發(fā)夾的熔鏈點的溫度提高至高于兩個發(fā)夾的熔鏈點的溫度。實施方案的某些方面涉及采用至少一個非天然核苷酸。在一些方面，非天然核苷酸為異堿基(isobase)，例如異鳥嘌呤(isoG)或異胞嘧啶(isoC)。在該方面，淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸為同源isoC(或isoG)。在另一些方面，第一和/或第二引物的至少一個在靶特異性序列中包含至少一個非天然核苷酸。例如，在某些方面，靶特異性序列中的非天然核苷酸調(diào)節(jié)序列特異性退火，由此增強了核苷酸的序列特異性擴增的引物-模板雜交(參見例如PCT公開WO2011/052078，通過引用并入本文)。在另一方面，所述實施方案的方法還包括：(a)將樣品與第二(或其它)引物組接觸，所述第二(或其它)引物組包含第一引物，所述第一引物從5’至3’包含，(i)報告基團；(ii)具有已知熔鏈點的發(fā)夾；(iii)聚合酶延伸-阻斷修飾；(iv)至少一個非天然核苷酸，和(v)靶特異性序列，其與第二(或其它)靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補；以及第二引物，其包含與所述第二(或其它)靶核酸第二鏈上的區(qū)域互補的序列；(b)用第二引物組擴增所述第二靶核酸(以獲得擴增產(chǎn)物)，其中在用淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸的存在下進行所述擴增，所述非天然核苷酸與所述第一引物的非天然核苷酸堿基配對；(c)通過檢測所述第二(或其它)引物組之第一引物上報告基團的信號改變，來檢測所述第二(或其它)靶核酸分子的存在。例如，可以順序或基本同時檢測所述第一和/或第二靶核酸的存在。在另一方面，所述第一和第二引物組可以包含可區(qū)分的報告基團。在另一方面，所述第一和第二引物組可以包含相同報告基團，以及在一些情況下，所述第一和第二引物組包含具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾(例如熔鏈點相互之間差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或者其中可得到的任意范圍)。在另一方面，所述方法為多重方法，其還包括：(a)將所述樣品與第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)引物組接觸，每組引物包含第一引物，所述第一引物從5’至3’包含，(i)報告基團；(ii)具有已知熔鏈點的發(fā)夾；(iii)聚合酶延伸-阻斷修飾；(iv)至少一個非天然核酸，和(v)靶特異性序列，其與第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補；以及第二引物，其包含與所述第三、第四、第五或第六靶核酸第二鏈上的區(qū)域互補的序列；(b)用所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)引物組擴增所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸，以獲得擴增產(chǎn)物，其中在用淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸的存在下進行所述擴增，所述非天然核苷酸與所述第一引物的非天然核苷酸堿基配對；(c)通過檢測所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)引物組的第一引物上報告基團的信號改變，來檢測所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸的存在。在一方面，所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)引物組中各自可以包含可區(qū)分的報告基團或具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾。因此，在另外一些方面，根據(jù)實施方案的多重方法可以包括采用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多不同引物組，其中每個引物組包含(1)包含具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾的第一引物，或(2)可區(qū)分的報告基團，以使得每個不同引物組的信號可以被單獨分辨。在另一些方面，根據(jù)實施方案的至少一組引物包含第二引物，所述第二引物包含至少一個報告基團標(biāo)記的非天然核苷酸(例如，以提供所述引物組的第二報告基團信號)。例如，至少一組引物可包含第一引物，所述第一引物從5’至3’包含，(i)報告基團；(ii)具有已知熔鏈點的發(fā)夾；(iii)聚合酶延伸-阻斷修飾；(iv)至少一個非天然核酸，和(v)靶特異性序列，其與靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補；以及第二引物，其包含與所述靶核酸第二鏈上的區(qū)域互補的序列和至少一個報告基團標(biāo)記的非天然核苷酸，其中所述引物產(chǎn)生的擴增子的熔鏈點可與所述第一引物發(fā)夾的熔鏈點區(qū)分開?？商鎿Q地，或者另外地，所述第二引物可以包含這樣的序列，所述序列具有至少一個報告基團標(biāo)記的非天然核苷酸，其中所述報告基團不同于所述第一引物的報告基團。因此，當(dāng)溫度改變至(1)高于所述第一引物發(fā)夾的熔鏈點時和(2)高于所述引物所產(chǎn)生的擴增子的熔鏈點時，這樣的引物組會產(chǎn)生可分辨的信號改變。這樣的其它信號可以進一步確認(rèn)靶核酸分子的存在。由此，在另一個實施方案中提供了組合物，其包含根據(jù)實施方案的至少第一引物組。例如，引物組可包含第一引物，所述第一引物從5’至3’包含，(i)報告基團；(ii)具有已知熔鏈點的發(fā)夾；(iii)聚合酶延伸-阻斷修飾(其可以形成部分發(fā)夾)；(iv)至少一個非天然核苷酸，和(v)靶特異性序列，其與靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補；以及第二引物，其包含與所述靶核酸第二鏈上的區(qū)域互補的序列。在某些方面，根據(jù)實施方案的引物組的第二引物包含至少一個報告基團標(biāo)記的非天然核苷酸。在一些方面，所述組合物還包含淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸、聚合酶、參照探針、參照樣品和/或游離核苷酸。在另一方面，組合物還包含第二(或其它)引物組，所述第二(或其它)引物組包含第一引物，所述第一引物從5’至3’包含，(i)報告基團；(ii)具有已知熔鏈點的發(fā)夾；(iii)聚合酶延伸-阻斷修飾；(iv)至少一個非天然核苷酸，和(v)靶特異性序列，其與第二靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補；以及第二引物，其包含與所述第二靶核酸第二鏈上的區(qū)域互補的序列。在某些方面，所述第一和第二引物組包含可區(qū)分的報告基團和/或具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾。在一些方面，所述組合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多不同引物組。在另一方面，提供了試劑盒，其包含(a)第一引物組，其包含第一引物，所述第一引物從5’至3’包含，(i)報告基團；(ii)具有已知熔鏈點的發(fā)夾；(iii)聚合酶延伸-阻斷修飾；(iv)至少一個非天然核苷酸，和(v)靶特異性序列，其與靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補；以及第二引物，其包含與所述靶核酸第二鏈上的區(qū)域互補的序列；和(b)淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸。在另一方面，所述試劑盒至少包含二、三、四、五或六個不同引物組。在某些方面，所述引物組包含可區(qū)分的報告基團或具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾。在一些方面，所述試劑盒還包含聚合酶、參照探針、游離核苷酸或試劑盒的使用說明。在另一個實施方案中，提供了用于檢測樣品中靶核酸存在的方法，其包括：將所述樣品與第一探針組接觸，所述探針組包含上游探針，其從5’至3’包含，(i)用報告基團-淬滅基團對的第一成員(例如報告基團)標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；(ii)標(biāo)簽序列；和(iii)與所述靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列的鏡像標(biāo)簽序列(mirroredtagsequence)；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接(T-junction)；(b)延伸所述上游探針以合成與所述下游探針上的鏡像標(biāo)簽序列互補的序列，以形成延伸的上游探針；(c)使所述延伸的上游探針與其自身雜交以形成發(fā)夾探針；(d)在用報告基團-淬滅基團對的第二成員(例如淬滅基團)標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述發(fā)夾探針，所述非天然核苷酸能夠與所述上游探針中的所述至少一個非天然核苷酸堿基配對；以及(e)通過檢測所述上游探針和所述發(fā)夾探針上標(biāo)記物(label)的信號改變來檢測所述靶核酸。例如，在一些方面，所述上游探針包含與所述下游探針互補的3至10個堿基(例如，至少3、4、5、6、7、8或9個堿基)的3’序列，例如與所述下游探針的標(biāo)簽序列互補。在另一些方面，所述下游探針還包含(iii)包含一個或更多個非天然堿基的isoprimer互補序列，其位于所述鏡像標(biāo)簽序列和與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列之間，所述鏡像標(biāo)簽序列與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列。因此，在一些方面，所述上游探針包含與所述下游探針的isoprimer互補序列互補的3至10個堿基(例如，至少3，4，5，6，7，8或9個堿基)的3’序列。在某些方面，在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游和下游探針的熔鏈點低于60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50℃。因此，在一個更特定的實施方案中，提供了用于檢測樣品中第一和第二靶核酸分子的一個或兩者之存在的方法，其包括(a)使所述樣品與第二探針組接觸，所述第二探針組包含上游探針，其從5’至3’包含，(i)用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；(ii)標(biāo)簽序列；和(iii)與第二靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列的鏡像標(biāo)簽序列；和(ii)與所述第二靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接；(b)延伸所述上游探針以合成與所述下游探針上的鏡像標(biāo)簽序列互補的序列，以形成延伸的上游探針；(c)使所述延伸的上游探針與其自身雜交以形成發(fā)夾探針；(d)在用報告基團-淬滅基團對的第二成員標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述發(fā)夾探針，所述非天然核苷酸能夠與所述上游探針的所述至少一個非天然核苷酸堿基配對；以及(e)通過檢測所述上游探針和所述發(fā)夾探針上標(biāo)記物的信號改變(例如，基于第一和第二探針組發(fā)夾探針的可區(qū)分熔鏈點)來檢測所述第二靶核酸。例如，可以順序檢測或基本同時檢測所述第一和/或第二靶核酸的存在。在另一方面，所述第一和第二探針組可以包含可區(qū)分的報告基團。在另一方面，所述第一和第二探針組可以包含相同報告基團，以及在一些情況下，所述第一和第二引物組形成具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾(例如，熔鏈點相互之間差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或者其中可得到的任意范圍)。在另一方面，所述方法為多重方法，其還包括：(a)將樣品與第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)探針組接觸，每組探針包含上游探針，其從5’至3’包含，(i)用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；(ii)標(biāo)簽序列；和(iii)與第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列的鏡像標(biāo)簽序列；和(ii)與所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接；(b)延伸所述上游探針以合成與所述下游探針上的鏡像標(biāo)簽序列互補的序列，以形成延伸的上游探針；(c)使所述延伸的上游探針與其自身雜交以形成發(fā)夾探針；(d)在用報告基團-淬滅基團對的第二成員標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述發(fā)夾探針，所述非天然核苷酸能夠與所述上游探針的所述至少一個非天然核苷酸堿基配對；以及(e)通過檢測所述上游探針和所述發(fā)夾探針上標(biāo)記物的信號改變，來檢測所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸。在一些方面，實施方案的多重方法包括具有一個、二個、三個、四個、五個或六個可區(qū)分報告基團的探針組，和/或形成具有一個、二個、三個、四個、五個或六個可區(qū)分熔鏈溫度的發(fā)夾探針的探針組。因此，在一些方面，實施方案的多重方法可以用于檢測(例如，在同一反應(yīng)中)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個不同靶核酸序列。在某些方面，本實施方案中使用的報告基團可以為熒光團，例如連接至所述第一探針(例如在5’端)的熒光團。因此，在一些情況下，信號改變可以為熒光信號的降低。在另一些方面，檢測報告基團的信號改變可以包括檢測信號的改變(或者改變速率)，例如當(dāng)樣品溫度改變時信號未淬滅。在一方面，樣品溫度可以提高至高于(或降低至低于)樣品中一個或更多個探針的發(fā)夾的熔鏈點。當(dāng)兩個或更多個探針組存在的情況下，改變樣品的溫度可以包括將樣品的溫度從低于第一和第二探針兩者之發(fā)夾的熔鏈點的溫度提高至高于兩個發(fā)夾探針的熔鏈點的溫度。因此，在另一個實施方案中，提供包含第一探針組的組合物，所述探針組包含上游探針，其從5’至3’包含，(i)用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；(ii)標(biāo)簽序列；和(iii)與靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列的鏡像標(biāo)簽序列；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接。在另一方面，組合物還包含第二(或其它)探針組，所述第二(或其它)探針組包含上游探針，其從5’至3’包含，(i)用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；(ii)標(biāo)簽序列；和(iii)與第二靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列的鏡像標(biāo)簽序列；和(ii)與所述第二靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接。在某些方面，所述第一和第二探針組包含可區(qū)分的報告基團和/或形成具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾探針。在一些方面，所述組合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多個可區(qū)分的探針組。在另一個實施方案中，提供了試劑盒，其包含(a)第一探針組，所述探針組包含上游探針，其從5’至3’包含，(i)用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；(ii)標(biāo)簽序列；和(iii)與靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列的鏡像標(biāo)簽序列；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接；以及(b)報告基團標(biāo)記的或者淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸。在另一方面，所述試劑盒至少包含兩個、三個、四個、五個或六個可區(qū)分的探針組。在某些方面，所述探針組包含可區(qū)分的報告基團或形成具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾探針。在一些方面，所述試劑盒還包含聚合酶、參照探針、游離核苷酸，或試劑盒的使用說明。在另一個實施方案中，提供了用于檢測樣品中靶核酸存在的方法，其包括：(a)將所述樣品與第一探針組接觸，所述第一探針組包含上游探針，其從5’至3’包含，(i)標(biāo)簽序列，其包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；(ii)與所述靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)鏡像標(biāo)簽序列，其與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列，并至少包含第一未標(biāo)記的非天然核苷酸；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接；(b)在用報告基團-淬滅基團對的第二成員標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探針，所述非天然核苷酸能夠與所述上游探針中的所述至少一個非天然核苷酸堿基配對以合成與所述下游探針上的鏡像標(biāo)簽序列互補的序列，從而形成延伸的上游探針；(c)使所述延伸的上游探針與其自身雜交以形成發(fā)夾探針；以及(d)通過檢測所述上游探針和所述發(fā)夾探針上標(biāo)記物的信號改變來檢測所述靶核酸。在一些方面，所述上游探針包含與所述下游探針互補(例如與所述下游探針的標(biāo)簽序列互補)的3至10個堿基(例如，至少3、4、5、6、7、8或9個堿基)的3’序列。在另一些方面，所述下游探針還包含(iii)包含一個或更多個非天然堿基的isoprimer互補序列，其位于所述鏡像標(biāo)簽序列和與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列之間，所述鏡像標(biāo)簽序列與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列并至少包含第一未標(biāo)記的非天然核苷酸。因此，在一些方面，所述上游探針包含與所述下游探針的isoprimer互補序列互補的3至10個堿基(例如，至少3、4、5、6、7、8或9個堿基)的3’序列。在某些方面，在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游和下游探針的熔鏈點低于60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50℃。因此，在另一個實施方案中，提供了用于檢測樣品中第一和第二靶核酸分子的一個或兩者之存在的方法，其還包括：(a)使所述樣品與第二探針組接觸，所述第二探針組包含上游探針，其從5’至3’包含，(i)標(biāo)簽序列，其包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；和(ii)與第二靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)鏡像標(biāo)簽序列，其與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列，并至少包含第一未標(biāo)記的非天然核苷酸；和(ii)與所述第二靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接；(b)在用報告基團-淬滅基團對的第二成員標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探針以合成與所述下游探針上的鏡像標(biāo)簽序列互補的序列，并形成延伸的上游探針，所述非天然核苷酸能夠與所述上游探針的所述至少一個非天然核苷酸堿基配對；(c)使所述延伸的上游探針與其自身雜交以形成發(fā)夾探針；以及(d)通過檢測所述上游探針和所述發(fā)夾探針上標(biāo)記物的信號改變來檢測所述第二靶核酸(例如，基于第一和第二探針組發(fā)夾探針的可區(qū)分熔鏈點)。例如，可以順序或基本同時檢測所述第一和/或第二靶核酸的存在。在另一方面，所述第一和第二探針組可以包含可區(qū)分的報告基團。在另一方面，所述第一和第二探針組可以包含相同報告基團，在一些情況下，所述第一和第二探針組形成具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾探針(例如熔鏈點相互之間差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或者其中可得到的任意范圍)。在另一方面，所述方法為多重方法，其還包括：(a)將樣品與第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)探針組接觸，所述探針組包含上游探針，其從5’至3’包含，(i)標(biāo)簽序列，其至少包含第一報告基團標(biāo)記的非天然核苷酸；和(ii)與第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)鏡像標(biāo)簽序列，其與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列，并至少包含第一未標(biāo)記的非天然核苷酸；和(ii)與所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接；(b)在用報告基團-淬滅基團對的第二成員標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探針以合成與所述下游探針上鏡像標(biāo)簽序列互補的序列，并形成延伸的上游探針，所述非天然核苷酸能夠與所述上游探針的所述至少一個非天然核苷酸堿基配對；(c)使所述延伸的上游探針與其自身雜交以形成發(fā)夾探針；以及(d)通過檢測所述上游探針和所述發(fā)夾探針上標(biāo)記物的信號改變來檢測所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸。在一些方面，實施方案的多重方法包括具有一個、二個、三個、四個、五個或六個可區(qū)分報告基團的探針組，和/或形成具有一個、二個、三個、四個、五個或六個可區(qū)分熔鏈溫度的發(fā)夾探針的探針組。因此，在一些方面，實施方案的多重方法可以用于檢測(例如，在同一反應(yīng)中)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個不同靶核酸序列。在某些方面，本實施方案中使用的報告基團可以為熒光團，例如連接所述第一探針(例如在5’端)的熒光團。因此，在一些情況下，信號的改變可以是熒光信號的降低。在另一些方面，檢測報告基團的信號改變可以包括檢測信號的改變(或改變速率)，例如當(dāng)樣品溫度改變時信號未淬滅。在一方面，樣品溫度可以提高至高于(或者降低至低于)所述樣品中一個或更多個探針的發(fā)夾的熔鏈點。當(dāng)存在兩個或更多個引物組的情況下，改變樣品的溫度可以包括將樣品溫度從低于第一和第二探針兩者的發(fā)夾的熔鏈點的溫度提高至高于兩個發(fā)夾探針的熔鏈點的溫度。因此，另一個實施方案提供了組合物，其包含上游探針，所述上游探針從5’至3’包含，(i)標(biāo)簽序列，其包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；和(ii)與靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)鏡像標(biāo)簽序列，其與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列，并且至少包含第一未標(biāo)記的非天然核苷酸；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接。在另一方面，組合物還包含第二(或其它)探針組，所述第二(或其它)探針組包含上游探針，所述上游探針從5’至3’包含，(i)標(biāo)簽序列，其包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；和(ii)與第二靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)鏡像標(biāo)簽序列，其與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列，并且至少包含第一未標(biāo)記的非天然核苷酸；和(ii)與所述第二靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接。在某些方面，所述第一和第二探針組包含可區(qū)分的報告基團和/或形成具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾探針。在一些方面，所述組合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多個可區(qū)分的探針組。在另一個實施方案中，提供試劑盒，其包含：(a)第一探針組，所述探針組包含上游探針，所述上游探針從5’至3’包含，(i)標(biāo)簽序列，其包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；和(ii)與靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)鏡像標(biāo)簽序列，其與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列，并且至少包含第一未標(biāo)記的非天然核苷酸；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接；和(b)報告基團標(biāo)記的或者淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸。在另一方面，所述試劑盒至少包含兩個、三個、四個、五個或六個可區(qū)分的探針組。在某些方面，所述探針組包含可區(qū)分的報告基團和/或形成具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾探針。在一些方面，所述試劑盒還包含聚合酶、參照探針、游離核苷酸或試劑盒的使用說明。在另一個實施方案中，提供了用于檢測樣品中靶核酸存在的方法，其包括：(a)將所述樣品與第一探針組接觸，所述探針組包含上游探針，所述上游探針從5’至3’包含，(i)經(jīng)報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少第一非天然核苷酸；和(ii)與靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)包含標(biāo)簽序列和所述標(biāo)簽序列之反向互補序列的發(fā)夾標(biāo)簽，以使得所述序列形成發(fā)夾；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接；(b)延伸所述上游探針以合成與所述下游探針上的發(fā)夾標(biāo)簽序列互補的序列，并形成延伸的上游探針；(c)使所述上游探針與其自身雜交以形成發(fā)夾探針；(d)在用報告基團-淬滅基團對的第二成員標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述發(fā)夾探針，所述非天然核苷酸能夠與所述上游探針中的所述至少一個非天然核苷酸堿基配對；以及(e)通過檢測所述上游探針和所述發(fā)夾探針上標(biāo)記物的信號改變來檢測所述靶核酸。在一些方面，所述上游探針包含與所述下游探針互補(例如與所述下游探針的標(biāo)簽序列互補)的3至10個堿基(例如，至少3、4、5、6、7、8或9個堿基)的3’序列。在另一些方面，所述下游探針還包含(iii)包含一個或更多個非天然堿基的isoprimer互補序列，其位于所述鏡像標(biāo)簽序列和與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列之間，所述鏡像標(biāo)簽序列與所述上游探針的標(biāo)簽序列具有相同序列并且至少包含第一未標(biāo)記的非天然核苷酸。因此，在一些方面，所述上游探針包含與所述下游探針的isoprimer互補序列互補的3至10個堿基(例如，至少3、4、5、6、7、8或9個堿基)的3’序列。在某些方面，在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游和下游探針的熔鏈點低于60、59、58、57、56、55、54、53、52、51或50℃。因此，在另一個實施方案中提供了用于檢測樣品中第一和第二靶核酸分子的一個或兩者之存在的方法，其還包括：(a)將所述樣品與第二探針組接觸，所述第二探針組包含上游探針，所述上游探針從5’至3’包含，(i)用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少第一非天然核苷酸；和(ii)與第二靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)包含標(biāo)簽序列和所述標(biāo)簽序列之反向互補序列的發(fā)夾標(biāo)簽，以使得所述序列形成發(fā)夾；和(ii)與所述第二靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接；(b)延伸所述上游探針以合成與所述下游探針上的發(fā)夾標(biāo)簽序列互補的序列，并形成延伸的上游探針；(c)使所述延伸的上游探針與其自身雜交以形成發(fā)夾探針；(d)在用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述發(fā)夾探針，所述非天然核苷酸能夠與所述上游探針中的所述至少一個非天然核苷酸堿基配對；以及(e)通過檢測所述上游探針和所述發(fā)夾探針上標(biāo)記物的信號改變來檢測所述第二靶核酸(例如，基于第一和第二探針組發(fā)夾探針的可區(qū)分熔鏈點)。例如，可以順序或基本同時檢測所述第一和/或第二靶核酸的存在。在另一方面，所述第一和第二探針組可以包含可區(qū)分的報告基團。在另一方面，所述第一和第二探針組可以包含相同的報告基團，在一些情況下，所述第一和第二探針組形成具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾探針(例如，熔鏈點相互之間差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或者其中可得到的任意范圍)。在另一方面，所述方法為多重方法，其還包括：(a)將樣品與第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)探針組接觸，每組探針包含上游探針，所述上游探針從5’至3’包含，(i)用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少第一非天然核苷酸；和(ii)與第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)包含標(biāo)簽序列和所述標(biāo)簽序列之反向互補序列的發(fā)夾標(biāo)簽，以使得所述序列形成發(fā)夾；和(ii)與所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接；(b)延伸所述上游探針以合成與所述下游探針上的發(fā)夾標(biāo)簽序列互補的序列，并形成延伸的上游探針；(c)使所述延伸的上游探針與其自身雜交以形成發(fā)夾探針；(d)在用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述發(fā)夾探針，所述非天然核苷酸能夠與所述上游探針中的所述至少一個非天然核苷酸堿基配對；以及(e)通過檢測所述上游探針和所述發(fā)夾探針上標(biāo)記物的信號改變來檢測所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸。在一些方面，實施方案的多重方法包括具有一個、二個、三個、四個、五個或六個可區(qū)分報告基團的探針組，和/或形成具有一個、二個、三個、四個、五個或六個可區(qū)分熔鏈溫度的發(fā)夾探針的探針組。因此，在一些方面，實施方案的多重方法可以用于檢測(例如，在同一反應(yīng)中)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個不同靶核酸序列。在某些方面，本實施方案中使用的報告基團可以為熒光團，例如連接在所述第一探針(例如在5’端)的熒光團。因此，在一些情況下，信號的改變可以是熒光信號的降低。在另一些方面，檢測報告基團的信號改變可以包括檢測信號的改變(或改變速率)，例如當(dāng)樣品溫度改變時信號未淬滅。在一方面，樣品溫度可以提高至高于(或者降低至低于)所述樣品中一個或更多個探針的發(fā)夾的熔鏈點。當(dāng)存在兩個或更多個引物組的情況下，改變樣品的溫度可以包括將樣品溫度從低于第一和第二探針兩者的發(fā)夾的熔鏈點的溫度提高至高于兩個發(fā)夾的熔鏈點的溫度。因此，另一個實施方案提供了包含第一探針組的組合物，所述探針組包含上游探針，所述上游探針從5’至3’包含，(i)用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少第一非天然核苷酸；和(ii)與靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)包含標(biāo)簽序列和所述標(biāo)簽序列之反向互補序列的發(fā)夾標(biāo)簽，以使得所述序列形成發(fā)夾；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接。在另一方面，組合物還包含第二(或其它)探針組，所述第二(或其它)探針組包含上游探針，所述上游探針從5’至3’包含，(i)用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少第一非天然核苷酸；和(ii)與第二靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)包含標(biāo)簽序列和所述標(biāo)簽序列之反向互補序列的發(fā)夾標(biāo)簽，以使得所述序列形成發(fā)夾；和(ii)與所述第二靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接。在某些方面，所述第一和第二探針組包含可區(qū)分的報告基團和/或形成具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾探針。在一些方面，所述組合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多個可區(qū)分的探針組。在另一個實施方案中，提供了試劑盒，其包含：(a)第一探針組，所述探針組包含上游探針，所述上游探針從5’至3’包含，(i)用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少第一非天然核苷酸；和(ii)與靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；以及下游探針，其從5’至3’包含，(i)包含標(biāo)簽序列和所述標(biāo)簽序列之反向互補序列的發(fā)夾標(biāo)簽，以使得所述序列形成發(fā)夾；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，其中所述上游探針包含與所述下游探針互補的3個或更多個堿基的3’序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接；以及(b)報告基團標(biāo)記的或者淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸。在另一方面，所述試劑盒至少包含兩個、三個、四個、五個或六個可區(qū)分的探針組。在某些方面，所述探針組包含可區(qū)分的報告基團或形成具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾探針。在一些方面，所述試劑盒還包含聚合酶、參照探針、游離核苷酸，或試劑盒的使用說明。在另一個實施方案中，提供了用于檢測樣品中靶核酸存在的方法，其包括：(a)將所述樣品與至少第一引物組接觸，所述第一引物組包含第一引物，其從5’至3’包含，(i)包含至少一個未標(biāo)記的非天然核苷酸的標(biāo)簽序列；和(ii)靶特異性序列，其與靶核酸第二鏈上的第一區(qū)域互補；以及第二引物，其包含與所述靶核酸第一鏈上的區(qū)域互補的序列；(b)用所述引物擴增所述靶核酸，以產(chǎn)生擴增的樣品；(c)將所述擴增的樣品與探針接觸，所述探針從5’至3’包含，(i)與所述第一引物的標(biāo)簽序列相同的標(biāo)簽序列，其包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；(d)在用報告基團-淬滅基團對的第二成員標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述探針，所述非天然核苷酸能夠與所述第一引物中的至少一個未標(biāo)記的非天然核苷酸堿基配對，以形成延伸的探針；以及(e)使所述延伸的探針與其自身雜交以形成發(fā)夾探針；(f)通過檢測所述探針和所述發(fā)夾探針上標(biāo)記物的信號改變來檢測所述靶核酸。在某些方面，所述探針還包含(iii)位于所述標(biāo)簽序列和與所述靶核酸第一鏈上之第一區(qū)域互補的序列之間的聚合酶延伸阻斷修飾。因此，在另一個實施方案中，提供了用于檢測樣品中第一和第二靶核酸分子的一個或兩者之存在的方法，其還包括：(a)將所述樣品與至少第二引物組接觸，所述第二引物組包含第一引物，其從5’至3’包含，(i)包含至少一個未標(biāo)記的非天然核苷酸的標(biāo)簽序列；和(ii)靶特異性序列，其與第二靶核酸第二鏈上的第一區(qū)域互補；以及第二引物，其包含與所述第二靶核酸第一鏈上的區(qū)域互補的序列；(b)用所述引物擴增所述靶核酸，以生成擴增的樣品；(c)將所述擴增的樣品與第二探針接觸，所述第二探針從5’至3’包含，(i)與所述第一引物的標(biāo)簽序列相同的標(biāo)簽序列，其包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；和(ii)與所述第二靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；(d)在用報告基團-淬滅基團對的第二成員標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述探針，所述非天然核苷酸能夠與所述第一引物中的至少一個未標(biāo)記的非天然核苷酸堿基配對，以形成延伸的探針；以及(e)使所述延伸的探針與其自身雜交以形成發(fā)夾探針；(f)通過檢測所述探針和所述發(fā)夾探針上標(biāo)記物的信號改變來檢測所述第二靶核酸(例如，基于第一和第二探針之發(fā)夾探針的可區(qū)分熔鏈點)。例如，可以順序或基本同時檢測所述第一和/或第二靶核酸的存在。在另一方面，所述第一和第二探針可以包含可區(qū)分的報告基團。在另一方面，所述第一和第二探針可以包含相同的報告基團，在某些情況下，所述第一和第二探針組形成具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾探針(例如，熔鏈點相互之間差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，或者其中可得到的任意范圍)。第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)。在另一方面，所述方法為多重方法，其還包括：(a)將樣品與第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)引物組接觸，所述引物組包含第一引物，其從5’至3’包含，(i)包含至少一個未標(biāo)記的非天然核苷酸的標(biāo)簽序列；和(ii)靶特異性序列，其與第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸第二鏈上的第一區(qū)域互補；以及第二引物，其包含與所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸第一鏈上的區(qū)域互補的序列；(b)用所述引物擴增所述靶核酸，以產(chǎn)生擴增的樣品；(c)將所述擴增的樣品與第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)探針接觸，所述探針從5’至3’包含，(i)與所述第一引物的標(biāo)簽序列相同的標(biāo)簽序列，其包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；和(ii)與所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；(d)在用報告基團-淬滅基團對的第二成員標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述探針，所述非天然核苷酸能夠與所述第一引物中的至少一個未標(biāo)記的非天然核苷酸堿基配對，以形成延伸的探針；以及(e)使所述延伸的探針與其自身雜交以形成發(fā)夾探針；(f)通過檢測所述探針和所述發(fā)夾探針上標(biāo)記物的信號改變來檢測所述第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十八、第二十四、第三十或第三十六(或其中可得到的任意范圍)靶核酸。在一些方面，實施方案的多重方法包括具有一個、二個、三個、四個、五個或六個可區(qū)分報告基團的探針，和/或形成具有一個、二個、三個、四個、五個或六個可區(qū)分熔鏈溫度的發(fā)夾探針的探針。因此，在一些方面，實施方案的多重方法可以用于檢測(例如，在同一反應(yīng)中)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個不同靶核酸序列。在某些方面，本實施方案中使用的報告基團可以為熒光團，例如連接至所述探針(例如在5’端)的熒光團。因此，在一些情況下，信號改變可以為熒光信號的降低。在另一些方面，檢測報告基團的信號改變可以包括檢測信號的改變(或者改變速率)，例如當(dāng)樣品溫度改變時信號未淬滅。在一方面，樣品溫度可以提高至高于(或降低至低于)樣品中一個或多個探針的發(fā)夾的熔鏈點。當(dāng)存在兩個或更多個探針組的情況下，改變樣品的溫度可以包括將樣品的溫度從低于第一和第二探針兩者發(fā)夾的熔鏈點的溫度提高至高于兩個發(fā)夾探針的熔鏈點的溫度。因此，在另一個實施方案中，提供了包含第一引物的組合物，所述第一引物從5’至3’包含，(i)包含至少一個未標(biāo)記的非天然核苷酸的標(biāo)簽序列；和(ii)靶特異性序列，其與靶核酸第二鏈上的第一區(qū)域互補；以及第二引物，其包含與所述靶核酸第一鏈上的區(qū)域互補的序列；和探針，所述探針從5’至3’包含，(i)與所述第一引物的標(biāo)簽序列相同的標(biāo)簽序列，其包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列。在另一方面，組合物還包含第二(或其它)引物組和探針，所述第二(或其它)引物組包含第一引物，所述第一引物從5’至3’包含，(i)包含至少一個未標(biāo)記的非天然核苷酸的標(biāo)簽序列；和(ii)靶特異性序列，其與第二靶核酸第二鏈上的第一區(qū)域互補；以及第二引物，其包含與所述第二靶核酸第一鏈上的區(qū)域互補的序列；和第二探針，其從5’至3’包含，(i)與所述第一引物的標(biāo)簽序列相同的標(biāo)簽序列，其包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；和(ii)與所述第二靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列。在某些方面，所述第一和第二(或其它)探針包含可區(qū)分的報告基團和/或形成具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾探針。在一些方面，所述組合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多個可區(qū)分的探針。在另一個實施方案中，提供了試劑盒，其包含(a)第一引物組，其包含第一引物，所述第一引物從5’至3’包含，(i)包含至少一個未標(biāo)記的非天然核苷酸的標(biāo)簽序列；和(ii)靶特異性序列，其與靶核酸第二鏈上的第一區(qū)域互補；以及第二引物，其包含與所述靶核酸第一鏈上的區(qū)域互補的序列；(b)探針，所述探針從5’至3’包含，(i)與所述第一引物的標(biāo)簽序列相同的標(biāo)簽序列，其包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標(biāo)記的至少一個非天然核苷酸；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；和(c)報告基團標(biāo)記的或者淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸。在某些方面，所述探針包含可區(qū)分的報告基團或形成具有可區(qū)分熔鏈點的發(fā)夾探針。在一些方面，所述試劑盒還包含聚合酶、參照探針、游離核苷酸，或試劑盒的使用說明。在另一個實施方案中，提供了用于檢測至少第一靶核酸之存在的方法，其包括：(a)將樣品與第一靶特異性引物-探針組接觸，所述引物-探針組包含：(i)引物，其與所述靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補；(ii)靶特異性探針，其與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補，并且包含不與所述靶核酸互補的5’標(biāo)簽序列；(iii)第一測定探針，其包含與所述靶特異性探針的標(biāo)簽序列互補的第一區(qū)域和位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域；和(iv)第二測定探針，其與所述第一測定探針的第二區(qū)域互補，其中所述第一和第二測定探針的一個標(biāo)記有報告基團，而另一個標(biāo)記有淬滅基團；(b)在適合于所述靶核酸雜交的條件下，將所述樣品與所述靶特異性引物和靶特異性探針一起孵育；(c)用具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶對雜交的靶特異性探針進行切割，以將所述標(biāo)簽序列從所述靶特異性探針釋放；(d)將釋放的標(biāo)簽序列與所述第一測定探針雜交；(e)沿著所述第一測定探針延伸雜交的標(biāo)簽序列，并切割與所述第一測定探針雜交的所述第二測定探針；(f)通過檢測所述第一或第二測定探針上報告基團信號的改變(例如未淬滅)來至少檢測第一靶核酸。在某些方面，檢測報告基團的信號改變包括檢測對應(yīng)于測定探針的熔鏈峰的減少或消除，這指示了所述第二測定探針被切割，并指示了所述靶核酸的存在。在另一些方面，所述引物-探針組之組分(i)-(iv)的一個或更多個分別與樣品接觸。例如，可以在所述靶特異性引物和/或探針之后添加所述第一或第二測定探針。在某些方面，所述報告基團可以為熒光團，信號改變可以為熒光信號的未淬滅。在一些方面，所述第一和/或第二測定探針至少包含第一非天然核苷酸，例如isoG和/或isoC。在某些方面，所述第一測定探針的第二區(qū)域包含2至5個非天然核苷酸，而所述第二測定探針包含與所述第一測定探針的2至5個非天然核苷酸堿基配對的2至5個非天然核苷酸。在另一些方面，所述第一測定探針的至少第一非天然核苷酸標(biāo)記有報告基團，所述第二測定探針的至少第一非天然核苷酸標(biāo)記有淬滅基團(或反之)。在一些優(yōu)選方面，所述第一測定探針的每個非天然核苷酸標(biāo)記有報告基團，所述第二測定探針的每個非天然核苷酸標(biāo)記有淬滅基團(或反之)。在某些方面，所述第一和第二測定探針具有已知熔鏈點，并且檢測報告基團的信號改變包括樣品溫度改變時檢測報告基團的信號改變。在某些方面，樣品的溫度可以提高至高于(或降低至低于)所述第一和第二測定探針的熔鏈點，以觀察報告基團的信號改變。在另一方面，所述第一靶特異性探針包含與所述靶核酸第一鏈上的第二區(qū)域互補的序列，其長度為5、10、15、20、25、30至40、50、75、100、125、150、175或200個核苷酸。在一方面，所述5’標(biāo)簽序列的長度為6至50個核苷酸。在另一些方面，根據(jù)實施方案的靶特異性引物-探針組之第一測定探針的第二區(qū)域包含聚合酶延伸-阻斷修飾。因此，當(dāng)延伸所述靶特異性探針的標(biāo)簽序列時，第二測定探針只有一部分被切割，這導(dǎo)致了所述第一和第二測定探針之間的熔鏈點發(fā)生改變。所觀察到的熔鏈點或熔鏈峰的這種改變可以用于檢測靶核酸分子的存在。因此，在一些方面，至少檢測第一靶核酸序列包括檢測樣品溫度改變時報告基團(第一或第二測定探針上)的信號改變。在一個特定方面，實施方案的方法包括檢測第一和第二靶核酸分子的一個或兩者之存在的方法，其包括(a)將樣品與至少第一和第二靶特異性引物-探針組接觸，每個引物-探針組包含：(i)引物，其與所述靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補；(ii)靶特異性探針，其與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補，并且包含不與所述靶核酸互補的5’標(biāo)簽序列；(iii)第一測定探針，其包含與所述靶特異性探針的標(biāo)簽序列互補的第一區(qū)域和位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域；和(iv)第二測定探針，其與所述第一測定探針的第二區(qū)域互補，其中所述第一和第二測定探針的一個標(biāo)記有報告基團，而另一個標(biāo)記有淬滅基團；并且其中所述第一和第二測定探針具有已知熔鏈點，其中所述第一引物-探針組的第一和第二測定探針的熔鏈點可與所述第二引物-探針組的第一和第二測定探針的熔鏈點區(qū)分開；(b)在適合于所述靶核酸雜交的條件下，將所述樣品與所述引物-探針組的靶特異性引物和靶特異性探針一起孵育；(c)用具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶對雜交的靶特異性探針進行切割，以將所述標(biāo)簽序列從所述靶特異性探針釋放；(d)將釋放的標(biāo)簽序列與所述第一測定探針雜交；(e)沿著所述第一測定探針延伸雜交的標(biāo)簽序列，并切割與所述第一測定探針雜交的所述第二測定探針；(f)通過檢測所述第一和/或第二引物-探針組的第一或第二測定探針上報告基團的信號未淬滅來檢測靶核酸；以及(g)通過對所述第一和第二測定探針進行熔鏈曲線分析來確定所述第一靶特異性引物-探針組、第二靶特異性引物-探針組或兩者的第二測定探針是否被切割，其中對應(yīng)于特定第一和第二測定探針組之熔鏈峰的減少或消除指示了所述第二測定探針被切割，并且指示所述第一或第二靶核酸的存在。因此，在一些方面，順序或基本同時檢測所述第一和第二(或其它)靶核酸的存在。在另一方面，所述第一引物-探針組的報告基團與所述第二引物-探針組的報告基團相同。在某些方面，所述第一5’標(biāo)簽和第一抗標(biāo)簽報告基團探針(anti-tagreporterprobe)的熔鏈點可與所述第二5’標(biāo)簽和第二抗標(biāo)簽報告基團探針的熔鏈點區(qū)分開。因此，在一些方面，實施方案的方法是多重方法，其包括采用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36個或更多個引物-探針組，以檢測靶核酸分子，其中每個引物-探針組包含(1)可區(qū)分的報告基團或(2)具有可區(qū)分熔鏈點的第一和第二測定探針。在另一些方面，所述第一測定探針的第二區(qū)域至少包含第一非天然核苷酸(例如2至5個非天然核苷酸)，所述第二測定探針至少包含與至少所述第一測定探針的第一非天然核苷酸堿基配對的第一非天然核苷酸(例如與所述第一測定探針的非天然核苷酸堿基配對的2至5個非天然核苷酸)。在某些方面，實施方案的第一測定探針包含聚合酶延伸阻斷序列，例如一個或更多個非天然核苷酸位置。因此，在某些方面，提供了用于檢測第一和第二靶核酸的一個或兩者之存在的方法，其包括(a)將樣品與至少第一和第二靶特異性引物-探針組接觸，每個引物-探針組包含：(i)引物，其與所述靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補；(ii)靶特異性探針，其與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補，并且包含不與所述靶核酸互補的5’標(biāo)簽序列；(iii)第一測定探針，其包含與所述靶特異性探針的標(biāo)簽序列互補的第一區(qū)域和位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域，所述第二區(qū)域包含聚合酶延伸-阻斷修飾；和(iv)第二測定探針，其與所述第一測定探針的第二區(qū)域互補，所述第二區(qū)域包含延伸-阻斷修飾，其中所述第一和第二測定探針的一個標(biāo)記有報告基團，另一個標(biāo)記有淬滅基團；(b)在適合于所述靶核酸雜交的條件下，將所述樣品與所述引物-探針組的靶特異性引物和靶特異性探針一起孵育；(c)用具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶對雜交的靶特異性探針進行切割，以將所述標(biāo)簽序列從所述靶特異性探針釋放；(d)將釋放的標(biāo)簽序列與所述第一測定探針雜交；(e)沿著所述第一測定探針將雜交的標(biāo)簽序列延伸至延伸阻斷序列，從而將與所述第一測定探針雜交的所述第二測定探針的一部分切割，其中在所述切割之后，所述第一和第二測定探針具有已知熔鏈點，并且其中在所述切割之后，所述第一引物-探針組的第一和第二測定探針的熔鏈點可與所述第二引物-探針的第一和第二測定探針的熔鏈點區(qū)分開；(f)通過對所述第一和第二測定探針進行熔鏈曲線分析來確定所述第一靶特異性引物-探針組、第二靶特異性引物-探針組或兩者的第二測定探針是否被切割，由此檢測靶核酸，其中對應(yīng)于特定第一和第二測定探針組之熔鏈峰的溫度遷移(shift)指示了所述第二測定探針被切割，并且指示所述第一或第二靶核酸的存在。因此，將第二測定探針的一部分(與所述延伸阻斷序列互補的5’序列)切割之后，實現(xiàn)了所述測定探針的可區(qū)分熔鏈點。在一些方面，在切割所述第二測定探針(的一部分)之后，所述第一靶特異性引物-探針組的第一和第二測定探針的熔鏈點與所述第二靶特異性引物-探針組的第一和第二測定探針的熔鏈點相差2℃至10℃。在另一些方面，在切割所述第二測定探針之前，所述第一靶特異性引物-探針組的第一和第二測定探針的熔鏈點與所述第二靶特異性引物-探針組的第一和第二測定探針的熔鏈點相同。例如，除了聚合酶延伸-阻斷修飾的位置之外，所述第一和第二靶特異性引物-探針組的第一測定探針的第二區(qū)域可以相同。在另一些方面，所述第一測定探針的第二區(qū)域至少包含第一非天然核苷酸(例如2至5個非天然核苷酸)，所述第二測定探針至少包含至少與所述第一測定探針的第一非天然核苷酸堿基配對的第一非天然核苷酸(例如與所述第一測定探針的非天然核苷酸堿基配對的2至5個非天然核苷酸)。在另一方面，所述方法還包括將樣品與靶特異性引物接觸，所述靶特異性引物與靶核酸第二鏈上的區(qū)域互補。在一些方面，方法還可包括進行多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)。在一些方面，檢測報告基團的信號改變包括在進行多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)之前、期間、或之后(或循環(huán)期間)檢測信號。在另一方面，檢測報告基團的信號改變包括僅在進行多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)之后檢測信號。在該方面，所述方法還包括將所檢測到的報告基團之信號與預(yù)定比相比較，所述預(yù)定比為所述報告基團的信號和非雜交探針上報告基團的參照信號的比。在一些方面，實施方案的方法還包括對所述樣品中靶核酸的量進行定量。例如，對所述樣品中靶核酸的量進行定量包括：采用標(biāo)準(zhǔn)曲線；確定所述靶核酸的相對量；采用終點定量；或者通過將相對于背景可檢測到信號的PCR循環(huán)數(shù)與存在的靶標(biāo)量相關(guān)聯(lián)，來確定所述靶核酸的量。在另一個實施方案中，提供了包含實施方案的一個或多個引物-探針組的組合物。例如，組合物可以包含(i)引物，其與所述靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補；(ii)靶特異性探針，其與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補，并且包含不與所述靶核酸互補的5’標(biāo)簽序列；(iii)第一測定探針，其包含與所述靶特異性探針的標(biāo)簽序列互補的第一區(qū)域和位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域；和(iv)第二測定探針，其與所述第一測定探針的第二區(qū)域互補，其中所述第一測定探針或第二測定探針標(biāo)記有報告基團，另一個標(biāo)記有淬滅基團。在另一些方面，所述第一測定探針包含與所述靶特異性探針的標(biāo)簽序列互補的第一區(qū)域和位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域，所述第二區(qū)域至少包含第一非天然核苷酸；并且第二測定探針(iv)包含與所述第一測定探針的第二區(qū)域互補的序列，和至少與所述第一測定探針的非天然核苷酸堿基配對的第一非天然核苷酸，其中所述第一測定探針的非天然核苷酸或所述第二測定探針的非天然核苷酸標(biāo)記有報告基團，另一個標(biāo)記有淬滅基團。在某些方面，所述組合物還包含能夠與所述測定探針的非天然核苷酸堿基配對的(未標(biāo)記的)非天然核苷酸。在另一些方面，實施方案的測定探針包含2至5個非天然核苷酸。在一些方面，組合物還包含與所述靶核酸第二鏈上的區(qū)域互補的靶特異性引物、具有核酸外切酶活性的聚合酶、參照探針、參照樣品和/或游離核苷酸。在一些方面，所述組合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或更多個可區(qū)分的引物-探針組。在另一個實施方案中，提供了試劑盒，其包含實施方案的一個或更多個引物-探針組。在另一方面，所述試劑盒還包含具有核酸外切酶活性的聚合酶、參照探針、游離核苷酸、游離非天然核苷酸、參照樣品或試劑盒的使用說明。在另一個實施方案中，提供了用于檢測靶核酸存在的方法，其包括：(a)將樣品與第一探針組接觸，所述探針組包含上游探針，所述上游探針包含與所述靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；和下游探針，其從5’至3’包含，(i)標(biāo)簽序列，其包含具有報告基團的非天然核苷酸；和(ii)與所述靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接；(b)在淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探針，所述非天然核苷酸能夠與所述下游探針的非天然核苷酸堿基配對；以及(c)通過檢測所述下游探針上標(biāo)記物的信號改變來檢測所述靶核酸。例如，在一些方面，所述上游探針包含與所述下游探針的標(biāo)簽序列互補的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個堿基的3’序列(例如與所述下游探針的標(biāo)簽序列互補的3至10個堿基的3’序列)。在一些方面，所述上游探針的3’序列定義為與所述下游探針的標(biāo)簽序列具有互補序列，小于所述標(biāo)簽序列的全長。在某些方面，然而，在靶序列不存在下，所述上游和下游探針基本沒有特異性雜交。在某些方面，在延伸之前，在所述靶核酸不存在下，所述上游和下游探針的熔鏈點低于55、50、45、40或35℃。在所述方法的另一方面，延伸所述上游探針包括合成與所述下游探針的標(biāo)簽序列互補的3’延伸，其包含淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸。在本文中，T-連接是指當(dāng)與靶序列雜交時上游和下游探針形成的結(jié)構(gòu)。特別是，所述上游和下游探針基本與所述靶核酸的相鄰序列雜交，以使得所述下游探針的5’標(biāo)簽游離，并且不與靶標(biāo)堿基配對。在一些方面，然而，所述下游探針的5’標(biāo)簽與所述上游探針的3’部分堿基配對(參見例如圖4A，中間圖)。在一些方面，下游探針(和/或上游探針)可以連接固體支持物，例如珠(例如編碼的珠)或表面。在一方面，下游探針的5’非天然核苷酸為isoG(或isoC)。在該方面，淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸為同源isoC(或isoG)。因此，在一些方面，延伸所述上游探針包括合成與所述下游探針的標(biāo)簽序列互補的3’延伸，其包含所述淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸。在另一些方面，檢測所述下游探針上報告基團的信號改變還包括將延伸的上游探針和下游探針雜交。如本文進一步詳述的，在某些方面，所述報告基團為熒光團，檢測報告基團的信號改變包括檢測熒光信號的降低。在某些方面，檢測報告基團的信號改變包括樣品溫度改變時檢測報告基團的信號改變。例如，檢測報告基團的信號改變包括當(dāng)樣品的溫度提高至高于(或降低至低于)延伸的上游探針和下游探針的熔鏈點時，檢測報告基團的信號改變。在另一方面，方法包括：(a)將樣品與第二探針組接觸，所述探針組包含上游探針，所述上游探針包含與第二靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；和下游探針，其從5’至3’包含，(i)標(biāo)簽序列，其包含報告基團標(biāo)記的非天然核苷酸；和(ii)與所述第二靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接；(b)在淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探針，所述非天然核苷酸能夠與所述下游探針的非天然核苷酸堿基配對；以及(c)通過檢測所述下游探針上標(biāo)記物的信號改變來檢測所述第二靶核酸。例如，可以順序或基本同時檢測所述第一和第二靶核酸的存在。在某些方面，所述第一和第二探針組包含相同報告基團或可區(qū)分的報告基團。在另一些方面，第一和第二探針組包括在所述上游和下游探針之間可區(qū)分的熔鏈點。在另一方面，實施方案的方法為多重方法，其包括：(a)將樣品與第三、第四、第五或第六探針組接觸，每組探針包含與第三、第四、第五或第六靶核酸第一鏈上的第一區(qū)域互補的序列；和下游探針，其從5’至3’包含，(i)包含報告基團的5’非天然核苷酸；(ii)標(biāo)簽序列和(iii)與所述第三、第四、第五或第六靶核酸第一鏈上之位于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域互補的序列，以使得當(dāng)與所述靶核酸雜交時，所述探針組形成T-連接；(b)在淬滅基團標(biāo)記的非天然核苷酸存在下，延伸所述上游探針，所述非天然核苷酸能夠與所述下游探針的非天然核苷酸堿基配對；以及(c)通過檢測所述下游探針上標(biāo)記物的信號改變來檢測所述第三、第四、第五或第六靶核酸。優(yōu)選地，所述第一、第二、第三、第四、第五和/或第六探針組各自包括在所述上游探針和下游探針之間...