專利名稱：核苷酸鏈修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核苷酸鏈修飾方法，尤其涉及用修飾物質(zhì)直接修飾核苷酸鏈的3’端，將核苷酸鏈標(biāo)記化、標(biāo)志化、固定化的方法。
背景技術(shù)：
以往，在基因分析中，用于將DNA、RNA、寡核苷酸、核酸等核苷酸鏈標(biāo)記化、標(biāo)志化的修飾物質(zhì)一直采用放射性同位素，但因?yàn)橛砂胨テ诋a(chǎn)生的使用期限的限制、使用場(chǎng)所的限制、被射線照射的問(wèn)題、廢棄的問(wèn)題等問(wèn)題，其使用逐漸減少。近年來(lái)，作為替代放射性同位素的修飾物質(zhì)，用熒光素等熒光物質(zhì)或者生物素等，對(duì)核苷酸鏈進(jìn)行修飾，將其標(biāo)記化、標(biāo)志化的方法被廣泛使用。修飾核苷酸鏈的方法可以分為5’端修飾法、3’端修飾法、內(nèi)部修飾法這3種。
5’端修飾法，提出過(guò)通過(guò)5’端的磷酸基用生物素修飾的方法(參照例如下述的非專利文獻(xiàn)1)。關(guān)于生物素，報(bào)道有利用生物素和親和素(avidin)的高親和性，用堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶等酶修飾，利用這些酶的化學(xué)發(fā)光使基因分析高靈敏度化的方法(參照例如非專利文獻(xiàn)2～3)。通過(guò)5’端的磷酸基修飾的方法除此之外還提出了很多(參照專利文獻(xiàn)1和非專利文獻(xiàn)4～13)。
但是在通過(guò)5’端的磷酸基修飾的方法中，對(duì)核苷酸鏈，修飾物質(zhì)的修飾量一般為1，而堿性磷酸酶會(huì)使核苷酸鏈5’端的磷酸基解離，所以為了實(shí)現(xiàn)高靈敏度化，一般必須避免與堿性磷酸酶的組合。堿性磷酸酶也存在于浮游在空氣中的細(xì)菌中，摻雜到基因分析中的情況下，與5’端的磷酸基結(jié)合的修飾物質(zhì)容易解離，修飾狀態(tài)變得缺乏穩(wěn)定性，也成為背景噪聲的主要原因。而作為5’端修飾法廣泛使用的亞磷酰胺法，由于反應(yīng)進(jìn)行得不完全，必須用液相色譜法等分離除去未反應(yīng)物，操作繁雜。
內(nèi)部修飾法，開發(fā)了在核苷酸鏈進(jìn)行復(fù)制的反應(yīng)時(shí)，將用于標(biāo)記化、標(biāo)志化的修飾物質(zhì)預(yù)先進(jìn)行修飾處理的脫氧核苷酸三磷酸摻入核苷酸鏈內(nèi)，使核苷酸鏈標(biāo)記化、標(biāo)志化的隨機(jī)引物法(random primer method)和切口平移法(nicktranslation method)(參照例如專利文獻(xiàn)4和非專利文獻(xiàn)20～22)。
該修飾方法，通過(guò)與作為基因擴(kuò)增反應(yīng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即PCR法(參照例如專利文獻(xiàn)5～8和非專利文獻(xiàn)23～25)組合，可以同時(shí)進(jìn)行核苷酸鏈的擴(kuò)增和標(biāo)記化、標(biāo)志化(參照例如非專利文獻(xiàn)26)，由此帶來(lái)基因分析的高靈敏度化，實(shí)現(xiàn)了以基因芯片為代表的基因分析的高效化(參照例如專利文獻(xiàn)9和非專利文獻(xiàn)27～29)。
在這些隨機(jī)引物法、切口平移法和PCR法中，從核苷酸鏈的摻入效率、修飾核苷酸鏈的合成等方面來(lái)看，多采用將胸苷用尿嘧啶或者預(yù)先以熒光物質(zhì)等標(biāo)記化、標(biāo)志化的尿嘧啶代替摻入的核苷酸鏈的形成。而且，作為用尿嘧啶代替的優(yōu)點(diǎn)，還有在使用PCR法時(shí)，向夾雜在反應(yīng)混合液中的來(lái)自外源性污染的核苷酸鏈中摻入尿嘧啶，通過(guò)用尿嘧啶DNA糖基化酶作用，防止來(lái)自污染的核苷酸鏈的擴(kuò)增的方法(參照例如專利文獻(xiàn)11～13和非專利文獻(xiàn)31～33)。
但是通過(guò)PCR法修飾物質(zhì)向核苷酸鏈內(nèi)的摻入，摻入數(shù)為10～20或30左右(參照例如非專利文獻(xiàn)30)，是隨機(jī)的，沒(méi)有達(dá)到完全的定量化。由于脫氧核苷酸三磷酸的標(biāo)記化、標(biāo)志化處理煩瑣，任意的標(biāo)記化、標(biāo)志化處理產(chǎn)物不是人人都能容易地得到的，因此修飾物質(zhì)的種類受到限制。而且，由于在核苷酸鏈內(nèi)摻入修飾物質(zhì)，在基因分析的雜交時(shí)，即核苷酸鏈形成雙鏈時(shí)，會(huì)產(chǎn)生因?yàn)樾揎椢镔|(zhì)引起的立體障礙。該方法也有用途限于將核苷酸鏈一開始就用熒光物質(zhì)等標(biāo)志化的缺點(diǎn)。
3’端修飾法，開發(fā)有合成預(yù)先進(jìn)行標(biāo)記化、標(biāo)志化處理的脫氧核苷酸三磷酸或雙脫氧核苷酸三磷酸(參照例如非專利文獻(xiàn)14和專利文獻(xiàn)2)，將該標(biāo)記化、標(biāo)志化的核苷酸通過(guò)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminaldeoxynucleotidyl transferase)添加在核苷酸鏈的3’端的加尾法(tailingmethod)(參照例如專利文獻(xiàn)3和非專利文獻(xiàn)15～18)。3’端修飾法可以根據(jù)需要修飾核苷酸鏈，與5’端修飾法相比修飾物質(zhì)的持續(xù)穩(wěn)定性更高，更適合作為修飾部位，所以被廣泛采用。
但是脫氧核苷酸三磷酸或雙脫氧核苷酸三磷酸的標(biāo)記化、標(biāo)志化處理煩瑣，任意的標(biāo)記化、標(biāo)志化處理產(chǎn)物不是人人都能容易地得到的，因此修飾物質(zhì)的種類受到限制。此外，在加尾階段，因?yàn)樵诤塑账徭?’端添加不需要的核苷酸序列，特別是在使用脫氧核苷酸三磷酸的情況下，根據(jù)反應(yīng)條件核苷酸的添加數(shù)是隨機(jī)的(參照例如非專利文獻(xiàn)19)，所以雖然可以實(shí)現(xiàn)基因分析的高靈敏度化，但定量性存在問(wèn)題。在3’端添加不需要的堿基序列也成為在基因分析的雜交時(shí)錯(cuò)配的主要原因。
就添加多余的堿基這一點(diǎn)，在專利文獻(xiàn)10中，提出了將添加的尿嘧啶的糖苷鍵用尿嘧啶DNA糖苷酶分解。但上述隨機(jī)引物法、切口平移法和PCR法中，將胸苷用尿嘧啶代替摻入的核苷酸鏈的形成被廣泛采用。在使用PCR法時(shí)，為了防止來(lái)自污染的核苷酸鏈的擴(kuò)增而使用的尿嘧啶也摻入了擴(kuò)增的核苷酸鏈中。因此，如果對(duì)于摻入尿嘧啶的核苷酸鏈?zhǔn)褂脤＠墨I(xiàn)10所記載的方法，尿嘧啶DNA糖基化酶不僅作用于添加在3’端的尿嘧啶，也作用于修飾對(duì)象核苷酸鏈中的尿嘧啶，結(jié)果核苷酸鏈自身被分解。
其他的3’端修飾法，也有在形成化學(xué)合成核苷酸鏈的合成初期，直接在3’端的核苷酸上結(jié)合用于標(biāo)記化、標(biāo)志化的修飾物質(zhì)的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)核苷酸鏈的修飾物質(zhì)較高的持續(xù)穩(wěn)定性。但化學(xué)合成得到的核苷酸鏈的核苷酸數(shù)，由于合成副產(chǎn)物、收率等合成能力的關(guān)系，在100左右，這里使用的在3’端直接結(jié)合修飾物質(zhì)的方法，對(duì)于用機(jī)體抽提和PCR等擴(kuò)增的核苷酸數(shù)超過(guò)100的核苷酸鏈的3’端修飾不適用。即，被修飾的核苷酸鏈的鏈長(zhǎng)有限制。
更進(jìn)一步，這3種修飾方法在核苷酸鏈以雙鏈的狀態(tài)存在時(shí)，難以對(duì)其中一條核苷酸鏈進(jìn)行選擇性的修飾。即，用以往的方法對(duì)核苷酸鏈進(jìn)行標(biāo)記化、標(biāo)志化的情況下，通常以雙鏈的狀態(tài)存在的核苷酸鏈的兩條鏈同時(shí)被修飾，難以對(duì)其中某一條核苷酸鏈選擇性地修飾，而將另一條核苷酸鏈分離除去。因此，對(duì)雙鏈內(nèi)的一條核苷酸鏈所含的基因信息進(jìn)行分析時(shí)，無(wú)所需信息的另一條核苷酸鏈也被用于分析，成為產(chǎn)生疑似結(jié)果的主要原因。
另一方面，核苷酸鏈的修飾除了標(biāo)記化、標(biāo)志化，也有為了將核苷酸鏈固定到基板上而進(jìn)行的。該用途的基板最初使用疏水性和正電荷的單面或者兩面由硝化纖維素、尼龍、聚氟乙烯構(gòu)成的基板，固定化的核苷酸鏈有時(shí)會(huì)解離。近年來(lái)，逐漸使用進(jìn)行讓核苷酸鏈的5’端或3’端帶有氨基、醛基等官能團(tuán)的修飾處理，采用玻璃、硅等基板，通過(guò)進(jìn)行使其表面帶有醛基、環(huán)氧基或氨基的預(yù)處理，使核苷酸鏈在基板上固定化的方法。通過(guò)用這樣的方法在基板單位面積上固定化多個(gè)序列不同的核苷酸鏈，可實(shí)現(xiàn)基因分析芯片。但在這樣的核苷酸鏈的固定化中，存在上述的核苷酸鏈修飾的問(wèn)題。
(專利文獻(xiàn))1日本專利特許1706289號(hào)2日本專利特開昭61-115094號(hào)3日本專利特公平7-31194號(hào)
4日本專利特表2000-508709號(hào)5日本專利特許1814713號(hào)6日本專利特許2093730號(hào)7日本專利特許2093731號(hào)8日本專利特許2613877號(hào)9日本專利特表平10-503841號(hào)10日本專利特愿2002-049055號(hào)11日本專利特許2103155號(hào)12日本專利特表2000-502251號(hào)13日本專利特開平11-113599號(hào)(非專利文獻(xiàn))1Chu B.C.F等，Nucleic Acids Res.，第11卷，第6543頁(yè)，1983年2Beck.S.，Methods Enzymol.，第216卷，第143頁(yè)，1992年3Bronstein.I.等，Methods Enzymol.，第217卷，第398頁(yè)，1993年4Alves.A.M.等，Tetrahedron Lett.，第30卷，第3089頁(yè)，1989年5Cocuzza.A.J.，Tetrahedron Lett.，第30卷，第6287頁(yè)，1989年6Theisen.P.等，Tetrahedron Lett.，第33卷，第5033頁(yè)，1992年7Kempe.T.等，Nucleic Acids Res.，第13卷，第45頁(yè)，1985年8Smith.L.M.等，Nucleic Acids Res.，第13卷，第2399頁(yè)，1985年9Ansorge.W.等，Nucleic Acids Res.，第15卷，第4593頁(yè)，1987年10Cook.A.F.，Nucleic Acids Res.，第16卷，第4077頁(yè)，1988年11Roget.A等，Nucleic Acids Res.，第17卷，第1989年12Misiura.K.等，Nucleic Acids Res.，第18卷，第4545頁(yè)，1990年13Pieles.U.等，Nucleic Acids Res.，第18卷，第4355頁(yè)，1990年14Langer.P.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第78卷，第6633頁(yè)，1981年15Roychoudhury.R.等，Nucleic Acids Res.，第3卷，第101頁(yè)，1976年16Vincent.C.等，Nucleic Acids Res.，第10卷，第6787頁(yè)，1982年17Yousaf.S.I.等，Gene，第3卷，第309頁(yè)，1984年18Schmitz.G.G.等，Anal.Biochem.，第192卷，第222頁(yè)，1991年19Jackson.D.A.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第69卷，第2905頁(yè)，1972年
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本發(fā)明的目的還在于提供不僅單鏈的核苷酸鏈的3’端，還可以簡(jiǎn)便地對(duì)形成雙鏈的其中一條核苷酸鏈的3’端進(jìn)行選擇性地修飾的核苷酸鏈修飾方法。
發(fā)明的揭示為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的核苷酸鏈修飾方法的特征在于，對(duì)3’端存在具有特定堿基的核苷酸序列的作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈，用對(duì)含有所述特定堿基的核苷酸且特異性的分解酶進(jìn)行作用，在所述作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端加上對(duì)目標(biāo)修飾物質(zhì)具有結(jié)合能力的官能團(tuán)，并在具有所述官能團(tuán)的核苷酸鏈的3’端結(jié)合所述修飾物質(zhì)。通過(guò)將3’端存在具有成為酶底物的特定堿基的核苷酸序列的核苷酸鏈作為修飾對(duì)象，只分解所述的核苷酸序列部分，形成與目標(biāo)修飾物質(zhì)反應(yīng)并結(jié)合的官能團(tuán)。通過(guò)這樣做，可以對(duì)核苷酸鏈用修飾物質(zhì)直接修飾，在可以簡(jiǎn)便地標(biāo)記化、標(biāo)志化的同時(shí)，在以核苷酸鏈的固定化為目的的情況下，可以將修飾物質(zhì)作為連接物質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定、牢固的固定。
具有特定堿基的核苷酸序列位于作為主鏈的核苷酸鏈的3’端，以所述特定堿基是不存在于所述主鏈中的堿基為佳。由此，即使分解酶作用，也可以避免主鏈被分解，可以將主鏈部分的序列信息保持完整狀態(tài)。所謂的核苷酸鏈的序列信息以具有至少10個(gè)堿基左右的核苷酸序列為佳。
可以將具有特定堿基的核苷酸序列添加到作為主鏈的核苷酸鏈的3’端。所述方法是有目的地添加具有作為酶底物的堿基的核苷酸的方法。無(wú)論作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈?zhǔn)菃捂溸€是雙鏈，可以限定對(duì)核苷酸鏈的3’端用修飾物質(zhì)簡(jiǎn)便地修飾。通過(guò)適當(dāng)?shù)剡x擇添加的核苷酸序列，也排除不需要的堿基序列的摻入。
具體地，將在3’端區(qū)域具有與該核苷酸鏈3’端區(qū)域互補(bǔ)的序列的核苷酸鏈退火結(jié)合到作為修飾對(duì)象的單鏈核苷酸鏈上，可以在所述作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端添加含有特定堿基的互補(bǔ)核苷酸序列。
此外，將至少一條鏈作為修飾對(duì)象的雙鏈核苷酸鏈，用對(duì)作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端區(qū)域的堿基序列能特異性識(shí)別的限制性酶剪切，可以在剪切了的作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端添加含有特定堿基的互補(bǔ)核苷酸序列。
此外，在雙鏈核苷酸鏈中至少一條的作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端，將在5’端區(qū)域具有含有特定堿基的核苷酸序列的雙鏈核苷酸鏈用DNA連接酶連接，通過(guò)對(duì)從連接的核苷酸鏈的所述特定堿基到3’端的堿基序列用特異性識(shí)別的限制性酶剪切，可以在所述的作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端添加含有特定堿基的核苷酸序列。
核苷酸序列的添加可以通過(guò)使用DNA聚合酶摻入核苷酸進(jìn)行。
存在具有特定堿基的核苷酸序列的核苷酸鏈可以是化學(xué)合成的核苷酸鏈。
用分解酶作用之前，添加具有與特定堿基互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸為佳。通過(guò)使雙鏈核苷酸的堿基間產(chǎn)生互補(bǔ)結(jié)合，能夠提高酶的底物特異性，可以提高反應(yīng)效率。
在作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端可以使其帶有例如醛基。具體地，通過(guò)將DNA糖苷酶作為分解酶，可以使作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端帶有醛基。更具體地，當(dāng)特定堿基是次黃嘌呤時(shí)，通過(guò)將3-甲基腺嘌呤DNA糖苷酶作為分解酶，可以使作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端帶有醛基。
特定堿基和分解酶可以是各種組合，但是有時(shí)例如因?yàn)橄蚝塑账徭湏饺肽蜞奏ぴ诨蚍治龅母鞣N方法中被廣泛采用，不希望將其用作特定堿基。通過(guò)使用頻率低的次黃嘌呤及其分解酶，可以大幅提高實(shí)施核苷酸鏈的3’端修飾時(shí)使用者的便利性。此外，可以不管核苷酸鏈的堿基的結(jié)構(gòu)和鏈長(zhǎng)，對(duì)核苷酸鏈的3’端直接地、簡(jiǎn)便地，用任意的修飾物質(zhì)定量地、穩(wěn)定地修飾。該方法是可以排除不需要的堿基序列、被修飾的堿基向核苷酸鏈內(nèi)的摻入，只對(duì)核苷酸鏈3’端用修飾物質(zhì)進(jìn)行修飾的方法。
除了上述的次黃嘌呤和3-甲基腺嘌呤DNA糖苷酶的組合外，還可以使用例如以下表1中所示的組合，使作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端帶有醛基。
表1

表1(續(xù))

修飾物質(zhì)可以適用具有與使核苷酸鏈3’端帶有的官能團(tuán)形成化學(xué)鍵的氨基的物質(zhì)。
修飾物質(zhì)可以是使核苷酸鏈標(biāo)記化、標(biāo)志化的物質(zhì)。由此，可以將被修飾的核苷酸鏈作為基因分析中的檢出探針或靶。
這樣的修飾物質(zhì)可以適用熒光物質(zhì)、維生素、脂類、氨基酸、寡肽、蛋白質(zhì)或者生體外源性物質(zhì)。由于氨基酸、寡肽、蛋白質(zhì)具有氨基，通過(guò)使其他物質(zhì)帶有氨基，可以使之與核苷酸鏈3’端的醛基融合。由此，在核苷酸鏈上可以添加熒光物質(zhì)、維生素、脂類、氨基酸、寡肽、蛋白質(zhì)或者生體外源性物質(zhì)具有的功能。
修飾物質(zhì)可以是具有與用于基因分析的基板的結(jié)合能力的物質(zhì)。由此，可以將被修飾的核苷酸鏈作為檢出探針或靶穩(wěn)定地固定化在基板上。
這樣的修飾物質(zhì)可以適用氨基烷烴硫醇或者氨基硅烷偶聯(lián)化合物。這些化合物可以在貴金屬制、玻璃制或樹脂制的基板上穩(wěn)定地結(jié)合。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1是表示本發(fā)明實(shí)施方式1的核苷酸鏈修飾方法的原理的說(shuō)明圖；圖2表示了圖1所示的核苷酸鏈修飾方法的部分過(guò)程，將生成的醛衍生物用熒光素修飾的過(guò)程的化學(xué)反應(yīng)式；圖3表示了圖1所示的核苷酸鏈修飾方法的部分過(guò)程，將生成的醛衍生物用氨基烷烴硫醇修飾的過(guò)程和將其固定化在貴金屬基板上的過(guò)程的化學(xué)反應(yīng)式；圖4是表示本發(fā)明實(shí)施方式2的核苷酸鏈修飾方法的原理的說(shuō)明圖；圖5表示了圖4的核苷酸鏈的反應(yīng)中心部分的化學(xué)反應(yīng)式；圖6是表示本發(fā)明實(shí)施方式3的核苷酸鏈修飾方法的原理的說(shuō)明圖；圖7是表示本發(fā)明實(shí)施方式4的核苷酸鏈修飾方法的原理的說(shuō)明圖；圖8是表示本發(fā)明實(shí)施方式5的核苷酸鏈修飾方法的原理的說(shuō)明圖；圖9表示了本發(fā)明實(shí)施例1的核苷酸鏈修飾方法中各反應(yīng)過(guò)程的核苷酸鏈的聚丙烯酰胺電泳的結(jié)果；圖10表示了本發(fā)明實(shí)施例2的核苷酸鏈修飾方法中各反應(yīng)過(guò)程的核苷酸鏈的底片曝光的結(jié)果；圖11表示了本發(fā)明實(shí)施例3的核苷酸鏈修飾方法中各反應(yīng)過(guò)程的核苷酸鏈的聚丙烯酰胺電泳和底片曝光的結(jié)果。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下，參照附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。
(實(shí)施方式1)基于圖1對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式1進(jìn)行說(shuō)明。圖中，1、m和n表示0或者任意的自然數(shù)，堿基表示腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶等任意堿基，Hx表示次黃嘌呤，Cyt表示胞嘧啶。
通過(guò)將任意堿基序列的核苷酸鏈(I)和2’-脫氧次黃嘌呤核苷-5’-三磷酸(A)(如下所示構(gòu)造具有次黃嘌呤Hx)以末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶作用，在核苷酸鏈(I)的3’端添加含有次黃嘌呤的核苷酸序列，得到核苷酸鏈(II)。
通過(guò)讓具有胞嘧啶的數(shù)十個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的寡核苷酸鏈(B)退火結(jié)合到得到的核苷酸鏈(II)上，得到核苷酸鏈(III)。
通過(guò)對(duì)該成為部分雙鏈的核苷酸鏈(III)用3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶II型作用，進(jìn)行堿性熱處理，將具有次黃嘌呤的核苷酸的糖苷鍵切斷，將殘存的脫氧核糖-磷酸鍵切斷，得到在3’端具有醛基的核苷酸鏈(IV)。
通過(guò)將具有氨基的修飾物質(zhì)(H2N-R(關(guān)于修飾物質(zhì)在后面討論))與該核苷酸鏈(IV)反應(yīng)，得到核苷酸鏈(IV)與修飾物質(zhì)脫水縮合得到的席夫堿，即3’端被修飾物質(zhì)直接修飾的核苷酸鏈(V)。
如果目標(biāo)核苷酸鏈?zhǔn)强苫瘜W(xué)合成的數(shù)十個(gè)核苷酸鏈長(zhǎng)的核苷酸鏈，通過(guò)預(yù)先合成具有特定堿基序列的核苷酸鏈，可以省去第一階段的反應(yīng)。
如圖2所示，如果將已知作為熒光物質(zhì)的熒光素尸胺(C)與在3’端具有醛基的核苷酸鏈(IV)反應(yīng)，則得到在核苷酸鏈的3’端直接結(jié)合熒光素尸胺的修飾核苷酸鏈(VI)。
通過(guò)這樣用熒光素修飾，可以將核苷酸鏈熒光標(biāo)記化(標(biāo)志化)，能夠?qū)⒃摵塑账嶙鳛橛糜陔s交等基因分析的探針或靶。
如圖3所示，如果將具有氨基的硫醇，這里用8-氨基-1-辛硫醇(D)與在3’端具有醛基的核苷酸鏈(IV)反應(yīng)，則得到在核苷酸鏈的3’端直接結(jié)合8-氨基-1-辛烷硫醇?xì)埢男揎椇塑账徭?VII)。
通過(guò)將該修飾核苷酸鏈(VII)與貴金屬的基板(E)反應(yīng)，使硫醇基和基板(E)形成牢固的共價(jià)鍵，可以將核苷酸鏈(VII’)固定化在基板(E)上。
通過(guò)這樣固定化在基板(E)上，可以將把貴金屬用于基板的電化學(xué)測(cè)定法、晶體振蕩子微平衡法、表面等離子體振子共振法等測(cè)定法進(jìn)行基因分析。
用于將核苷酸鏈標(biāo)記化、標(biāo)志化的修飾物質(zhì)，具有對(duì)于核苷酸鏈3’端帶有的官能團(tuán)的結(jié)合能力即可。例如是熒光物質(zhì)的熒光素、德克薩斯紅(Texasred)、若丹明、以Cy3·Cy5為代表的花青化合物，或者非熒光物質(zhì)的生物素、異羥基洋地黃毒甙元等，通過(guò)在末端形成氨基，可以作為修飾物質(zhì)使用?？梢詫⒂眠@些修飾物質(zhì)標(biāo)記化(標(biāo)志化)的核苷酸鏈作為用于雜交等基因分析的探針或靶。
氨基酸、肽、蛋白質(zhì)也可以用作修飾物質(zhì)。氨基酸中，因?yàn)楸奖彼?、色氨酸、酪氨酸具有熒光性，可以用于?biāo)記化、標(biāo)志化。不具有熒光性的氨基酸和肽，通過(guò)在側(cè)鏈上結(jié)合上熒光素等(下稱標(biāo)記化合物)，也可以用于標(biāo)記化、標(biāo)志化。
氨基酸連接成的肽，由于存在對(duì)應(yīng)于氨基酸數(shù)的側(cè)鏈，所以可以連接多個(gè)標(biāo)記化合物。例如，三聚賴氨酸中側(cè)鏈上存在3個(gè)氨基，可以任意地結(jié)合具有羧基、琥珀酰亞胺基等的標(biāo)記化合物達(dá)到總共3個(gè)。
不局限于肽，使用將具有氨基的烷基、烯丙基、環(huán)烷基、芳香族、糖類等烴類以標(biāo)記化合物修飾得到的物質(zhì)，也可以用作修飾物質(zhì)，對(duì)核苷酸鏈進(jìn)行修飾，實(shí)現(xiàn)核苷酸鏈的標(biāo)記化、標(biāo)志化。
還可以將例如堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、具有有色性或熒光性的運(yùn)鐵蛋白、血紅蛋白、綠色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白、水母蛋白(aeguorin)等蛋白質(zhì)用作修飾物質(zhì)，對(duì)核苷酸鏈進(jìn)行標(biāo)記化、標(biāo)志化，對(duì)基因分析，尤其是原位雜交，十分有用。
除此之外，在表面形成氨基的金膠體、銀膠體等貴金屬膠體，磁性微粒，聚苯乙烯珠粒等高分子微粒為代表的微粒等也可以用作核苷酸鏈的修飾物質(zhì)。
要將核苷酸鏈固定化在貴金屬上的情況下，可以采用在統(tǒng)稱為烷烴硫醇的硫醇化合物中具有氨基的化合物作為修飾物質(zhì)。因?yàn)榭梢酝ㄟ^(guò)修飾物質(zhì)將核苷酸鏈固定化在貴金屬上，可以將把貴金屬用于基板的電化學(xué)測(cè)定法、晶體振蕩子微平衡法、表面等離子體振子共振法等測(cè)定法進(jìn)行基因分析。
烷烴硫醇只要存在與貴金屬結(jié)合的硫醇基和氨基，可以對(duì)結(jié)構(gòu)等無(wú)特別限制地使用。氨基、硫醇基間的烴殘基可以是直鏈狀、具支鏈狀、環(huán)狀、烯丙基鏈狀、芳香環(huán)狀等各種形態(tài)，其碳原子數(shù)、氨基的位置等也有各種可能。
基板晶體振蕩子微平衡法、表面等離子體振子共振法等中，廣泛使用金的基板，但根據(jù)測(cè)定法等，也可以使用鉑、銀、銅、鈀、銦、鎳、鐵、鋁及它們的合金等作為基板。
修飾物質(zhì)可以使用具有氨基的硅烷偶聯(lián)化合物，由此，可以將核苷酸鏈固定化在玻璃、硅、二氧化硅、氧化鋁、云母以及聚苯乙烯、尼龍、環(huán)氧樹脂等高分子樹脂等的基板上，也可適用于以往的各種基因分析方法。
硅烷偶聯(lián)化合物只要是具有氨基和烷氧基的化合物，就和烷烴硫醇一樣，可以對(duì)結(jié)構(gòu)等無(wú)特別限制地使用?？梢允褂玫墓柰榕悸?lián)化合物有例如γ-氨基丙基三乙氧基硅烷、N-β(氨基乙基)-γ-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷、N-β(氨基乙基)-γ-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-β(氨基乙基)-γ-氨基丙基三乙氧基硅烷、γ-氨基丙基三甲氧基硅烷等。
本來(lái)不具有氨基的物質(zhì)，通過(guò)使用適當(dāng)?shù)木哂邪被拈g隔基團(tuán)(spacer)，也可以對(duì)核苷酸鏈進(jìn)行修飾。例如具有羧基的物質(zhì)，通過(guò)使用1，2-二氨基乙烷、1，6-二氨基己烷等具有二氨基結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，作為間隔基團(tuán)，可以對(duì)核苷酸鏈進(jìn)行修飾。
更進(jìn)一步，具有肼基、氨基氧基、氰基的物質(zhì)，或者類似格利雅試劑(Grignard reagent)具有鹵化鎂的物質(zhì)，也可以作為修飾物質(zhì)使用。
(實(shí)施方式2)圖4表示了本發(fā)明實(shí)施方式2的核苷酸鏈修飾方法的原理，圖5表示了圖4的核苷酸鏈的反應(yīng)中心部分的化學(xué)反應(yīng)式。
在圖4和圖5中，N0表示腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶中任意的堿基，N1表示與N0形成互補(bǔ)的堿基對(duì)的腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶中任意的堿基。N2表示與N0不形成互補(bǔ)的堿基對(duì)的腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶中任意的堿基，N3表示與N2形成互補(bǔ)的堿基對(duì)的腺嘌呤、次黃嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶中任意的堿基。C表示胞嘧啶，Hx表示次黃嘌呤，這些N0、N1、N2、N3、C、Hx均包含于2’-脫氧核苷酸(以下簡(jiǎn)稱核苷酸)中。N0、N1、N2、N3只表示了部分，并沒(méi)有限定個(gè)數(shù)。
dITP、dATP、dCTP、dTTP分別表示2’-脫氧次黃嘌呤核苷-5’-三磷酸、2’-脫氧腺嘌呤核苷-5’-三磷酸、2’-脫氧胞嘧啶核苷-5’-三磷酸、2’-脫氧胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸。NH2-R表示如前所述的具有氨基的任意的修飾物質(zhì)。
作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈(2-1表示圖4中的編號(hào)。以下同)在3’端區(qū)域有堿基N0的序列。將另外得到的核苷酸鏈(2-2)與該核苷酸鏈(2-1)退火結(jié)合，形成雙鏈核苷酸。核苷酸鏈(2-2)在3’端具有與核苷酸鏈(2-1)3’端區(qū)域的堿基N0互補(bǔ)的任意堿基N1的序列，在其靠近5’端具有胞嘧啶C，接著具有與堿基N0不互補(bǔ)的任意堿基N2的序列，退火結(jié)合后5’端區(qū)域突出。
對(duì)該部分雙鏈的核苷酸通過(guò)將DNA聚合酶作為催化劑，摻入dITP、dATP、dCTP、dTTP形成完整的雙鏈核苷酸。這時(shí)形成的核苷酸鏈(2-3)是在核苷酸鏈(2-1)的3’端加上與核苷酸鏈(2-2)單鏈區(qū)域互補(bǔ)的核苷酸序列的核苷酸鏈，具有對(duì)應(yīng)于核苷酸鏈(2-2)的胞嘧啶C的次黃嘌呤Hx。
通過(guò)對(duì)形成的完整的雙鏈核苷酸以3-甲基腺嘌呤DNA糖苷酶II型作用，并進(jìn)行堿性熱處理，含有次黃嘌呤Hx的核苷酸(脫氧核糖)的1’位碳原子和氧原子之間糖苷鍵特異性地分解，由此形成的核苷酸鏈(2-4)的3’端帶有醛基。
然后，添加具有氨基的修飾物質(zhì)(NH2-R)，通過(guò)使各個(gè)醛基和氨基反應(yīng)，形成席夫堿。這時(shí)形成的核苷酸鏈(2-5)是目標(biāo)產(chǎn)物，成為在初始物質(zhì)核苷酸鏈(2-1)3’端直接結(jié)合修飾物質(zhì)的核苷酸鏈。
修飾結(jié)束后，將不需要的核苷酸鏈(2-2)分離除去。該核苷酸鏈(2-2)的除去可以通過(guò)對(duì)結(jié)合修飾物質(zhì)的雙鏈核苷酸進(jìn)行熱處理，或者使核苷酸鏈(2-2)5’端成為磷酸基，以將其特異性分解的λ核酸外切酶作用，容易進(jìn)行。通過(guò)預(yù)先將核苷酸鏈(2-2)的堿基N1、N2的鳥嘌呤部分替換成次黃嘌呤，可以通過(guò)3-甲基腺嘌呤DNA糖苷酶II型將其小片段化。
(實(shí)施方式3)圖6表示了本發(fā)明實(shí)施方式3的核苷酸鏈修飾方法的原理。該方法中，在雙鏈核苷酸中作為修飾對(duì)象的其中一條核苷酸鏈上，添加含有作為上述3-甲基腺嘌呤DNA糖苷酶II型酶底物的次黃嘌呤的核苷酸序列。
圖中，N0、N1、N2、C、Hx、5’和3’的含義與前述相同，N4表示與N2形成互補(bǔ)堿基對(duì)的腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶中任意的堿基，A、G、T分別表示腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶。
雙鏈核苷酸由第1核苷酸鏈(2-11)和第2核苷酸鏈(2-12)構(gòu)成，其中核苷酸鏈(2-11)為修飾對(duì)象。核苷酸鏈(2-11)在3’端區(qū)域具有堿基N0的序列，核苷酸鏈(2-12)在5’端區(qū)域具有堿基N1的序列。
對(duì)該雙鏈核苷酸進(jìn)行加熱處理或者堿性處理解離為單鏈，將第3核苷酸鏈(2-13)退火結(jié)合到解離的核苷酸鏈(2-11)，形成部分雙鏈的核苷酸。第2核苷酸鏈(2-13)在3’端具有與核苷酸鏈(2-11)的3’端區(qū)域的堿基N0互補(bǔ)的任意的堿基N1的序列，在靠近5’端具有胞嘧啶C，接著具有與堿基N0不互補(bǔ)的任意的堿基N2的序列，在退火后從胞嘧啶C開始5’端成為單鏈。
對(duì)該部分雙鏈的核苷酸通過(guò)將DNA聚合酶作為催化劑，摻入dITP、dATP、dCTP、dTTP形成完整的雙鏈核苷酸。這時(shí)形成的核苷酸鏈(2-14)是在核苷酸鏈(2-11)的3’端加上與核苷酸鏈(2-2)單鏈區(qū)域互補(bǔ)的核苷酸序列的核苷酸鏈，對(duì)應(yīng)于核苷酸鏈(2-2)的胞嘧啶C的位置上具有次黃嘌呤Hx。
對(duì)該完整的雙鏈核苷酸可以通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施方式2同樣的操作，使核苷酸鏈(2-11)的3’端帶有醛基，使其結(jié)合修飾物質(zhì)，除去不需要的核苷酸鏈。
在這里示例了只將其中一條核苷酸鏈作為修飾對(duì)象的情況的修飾方法，但可以知道將兩條核苷酸鏈都作為修飾對(duì)象的情況下也同樣是可以修飾的。
(實(shí)施方式4)圖7表示了本發(fā)明實(shí)施方式4的核苷酸鏈修飾方法的原理。該方法是在形成雙鏈的核苷酸鏈上存在適當(dāng)?shù)南拗菩悦讣羟形稽c(diǎn)的情況下的核苷酸鏈修飾方法。
圖中，N0、N1、A、G、T、C、Hx的含義與前述相同，N2、N4表示任意選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、次黃嘌呤、尿嘧啶等堿基的相互互補(bǔ)的堿基。
雙鏈核苷酸由第1核苷酸鏈(2-21)和第2核苷酸鏈(2-22)構(gòu)成，其中核苷酸鏈(2-21)為修飾對(duì)象。在核苷酸鏈(2-21)的3’端區(qū)域(核苷酸鏈(2-22)的5’端區(qū)域)存在限制性酶Bam HI可識(shí)別、剪切的堿基序列(GGATCC/CCTAGG)。
首先，將雙鏈核苷酸用Bam HI剪切，形成由N0的3’端只存在G的核苷酸(2-23)和N1的5’端存在CCTAG的核苷酸(2-24)構(gòu)成的部分雙鏈的核苷酸。
對(duì)該部分雙鏈的核苷酸通過(guò)將DNA聚合酶作為催化劑，摻入dITP、dATP、dCTP、dTTP形成完整的雙鏈核苷酸。這時(shí)形成的核苷酸鏈(2-25)是在核苷酸鏈(2-23)的3’端加上與核苷酸鏈(2-24)單鏈區(qū)域互補(bǔ)的核苷酸序列的核苷酸鏈，對(duì)應(yīng)于核苷酸鏈(2-24)的胞嘧啶C的位置上具有次黃嘌呤Hx。
對(duì)該完整的雙鏈核苷酸可以通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施方式2同樣的操作，在核苷酸鏈(2-21)的3’端只添加1核苷酸并使其帶有醛基，使其結(jié)合修飾物質(zhì)，除去不需要的核苷酸鏈。
(實(shí)施方式5)圖8表示了本發(fā)明實(shí)施方式5的核苷酸鏈修飾方法的原理。在該方法中，連接在堿基序列中預(yù)先摻入次黃嘌呤的雙鏈核苷酸。
圖中，N0、N1、C、Hx的含義與前述相同，N2、N4表示任意選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、次黃嘌呤、尿嘧啶等堿基的相互互補(bǔ)的堿基。
雙鏈核苷酸由第1核苷酸鏈(2-31)和第2核苷酸鏈(2-32)構(gòu)成，其中核苷酸鏈(2-31)為修飾對(duì)象。核苷酸鏈(2-31)在3’端區(qū)域具有堿基N0的序列，核苷酸鏈(2-32)在5’端區(qū)域具有與核苷酸鏈(2-31)的3’端區(qū)域形成互補(bǔ)堿基對(duì)的堿基N1的序列。
在該雙鏈核苷酸上，以DNA連接酶作為催化劑連接另外的雙鏈核苷酸。該另外的雙鏈核苷酸使用由在次黃嘌呤Hx兩側(cè)具有堿基N4的序列的核苷酸鏈(2-33)和在胞嘧啶C的兩側(cè)具有與堿基N4互補(bǔ)的堿基N2的核苷酸鏈(2-34)構(gòu)成的核苷酸鏈，連接后使得在修飾對(duì)象核苷酸鏈(2-31)的3’端為核苷酸鏈(2-33)。由此，形成由核苷酸鏈(2-35)(核苷酸鏈(2-31)和核苷酸鏈(2-33))和核苷酸鏈(2-36)(核苷酸鏈(2-31)和核苷酸鏈(2-33))構(gòu)成的雙鏈核苷酸。
對(duì)該完整的雙鏈核苷酸可以通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施方式2同樣的操作，使核苷酸鏈(2-31)的N0序列旁的3’端帶有醛基，使其結(jié)合修飾物質(zhì)，除去不需要的核苷酸鏈。
在該實(shí)施方式5中，從次黃嘌呤Hx的位置開始在5’端(和從胞嘧啶C的位置開始在3’端)使其具有對(duì)應(yīng)于3堿基對(duì)(N2-N4)的核苷酸序列，這部分核苷酸序列也可以省略。
但是，如果在連接處形成由限制性酶識(shí)別的序列，通過(guò)DNA連接酶的連接反應(yīng)效率提高，所以預(yù)先在次黃嘌呤Hx的位置開始的5’端(和胞嘧啶C的位置開始的3’端)使其具有對(duì)應(yīng)于3～4個(gè)堿基對(duì)的核苷酸序列為佳。
例如，核苷酸鏈(2-31)3’端的堿基N0的序列和核苷酸鏈(2-32)5’端的堿基N1的序列為如下序列(I)的情況下，如果使核苷酸鏈(2-33)中次黃嘌呤Hx的位置開始的5’端和核苷酸鏈(2-34)中胞嘧啶C的位置開始的3’端具有如下序列(II)，在連接處形成序列(III)，由于該序列(III)為限制性酶Hinc II識(shí)別剪切的序列，連接反應(yīng)高效地進(jìn)行。
··GTC 3-5-GAC····GTCGAC····CAG 5-3-CTG····CAGCTG··(I)(II) (III)連接的2組雙鏈核苷酸的末端，可以是如上述的核苷酸鏈的平頭末端，也可以是如由Bam HI剪切部位的一條核苷酸鏈突出的粘性末端。
這樣的通過(guò)限制性酶的剪切和通過(guò)DNA連接酶的連接，以往便被使用于向基因的載體等的插入。通過(guò)同時(shí)使用本發(fā)明方法，可以將向基因(核苷酸鏈)的載體等的插入和通過(guò)修飾物質(zhì)的修飾在同一反應(yīng)條件下實(shí)現(xiàn)，可以不浪費(fèi)從微量的試樣通過(guò)PCR法等擴(kuò)增的珍貴的核苷酸鏈樣本，并有效地使用。例如，作為基因表達(dá)載體的pET類載體(Studier，F(xiàn).等，Methods Enzymol，第185卷，第60頁(yè))在其基因插入位點(diǎn)具有Bam HI位點(diǎn)，所以可以通過(guò)適用實(shí)施方式4中所示的方法，同時(shí)實(shí)現(xiàn)核苷酸鏈的修飾和向載體的插入。
作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的鏈長(zhǎng)至少3以上即可，但用于基因分析必須限定核苷酸鏈的序列，因此核苷酸鏈的鏈長(zhǎng)至少10以上為佳。
設(shè)置于次黃嘌呤Hx的3’端的核苷酸序列在使用實(shí)施方式2和實(shí)施方式3的方法的情況下，對(duì)應(yīng)于至少1堿基對(duì)的鏈長(zhǎng)即可，但在使用實(shí)施方式4和實(shí)施方式5的方法的情況下，至少2～4堿基對(duì)的鏈長(zhǎng)為佳。這是因?yàn)橐瓜拗菩悦负瓦B接酶充分作用，需要比各酶識(shí)別的序列區(qū)域稍長(zhǎng)的鏈長(zhǎng)。
上述各種實(shí)施方式中，示例了添加含有次黃嘌呤Hx的核苷酸序列和將含有次黃嘌呤Hx的核苷酸作為酶底物用3-甲基腺嘌呤DNA糖苷酶II型作用的方法，但并不局限于此。在3’端含有表1(前示)的堿基的核苷酸和DNA糖苷酶的組合也同樣可以對(duì)核苷酸鏈3’端用目標(biāo)修飾物質(zhì)修飾。
以下，例舉具體的實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
(實(shí)施例1)作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈?zhǔn)褂煤塑账釘?shù)30的單鏈化學(xué)合成核苷酸鏈(委托Sigma-Genosya公司合成)。該核苷酸鏈編碼大腸桿菌16S核糖體核酸基因的第8～37位，5’端起具有以下的堿基序列。A、T、G、C分別表示脫氧核苷酸中的堿基腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶。
AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCT(序列1)首先，按照核苷酸鏈為5μM，將其混合到2單位(以下省略為u)/μl末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Invitrogen公司制)、10mM 2’-脫氧次黃嘌呤核苷-5’-三磷酸、2mM氯化鈷、1mM二硫蘇糖醇、0.1M二甲砷酸鉀(pH 7.2)的50μl的反應(yīng)液中，在37℃下反應(yīng)4小時(shí)，將具有次黃嘌呤堿基的核苷酸序列加尾到核苷酸鏈3’端。
將該核苷酸鏈通過(guò)乙醇沉淀回收，添加100μM寡聚脫氧胞嘧啶(核苷酸數(shù)18，New England BioLabs公司制)，將其退火結(jié)合到加尾到核苷酸鏈3’端的核苷酸序列的次黃嘌呤堿基上。
接著，將核苷酸鏈混合到0.3u/μl 3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶II型(Trevigen制)、1mM乙二胺四乙酸、1mM乙二醇醚二胺四乙酸、1mM二硫蘇糖醇、10mm 2-〔4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基〕乙磺酸-氫氧化鉀(pH7.4)的反應(yīng)液中，在37℃下反應(yīng)一晝夜，將在核苷酸鏈3’端加尾的核苷酸序列的糖苷鍵切斷。
在反應(yīng)液中按照0.1M添加氫氧化鈉，在100℃下加熱5分鐘，使核苷酸鏈3’端殘存的磷酸基解離，在3’端形成醛基。
將該核苷酸鏈通過(guò)乙醇沉淀回收，在0.1M碳酸鈉(pH 9.5)的條件下自5mM熒光素尸胺(Molecular Probes公司制)混合，使反應(yīng)液體積為50μl，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)，使核苷酸鏈3’端的醛基和存在于熒光素尸胺中的氨基之間形成席夫堿。然后，按照1mg/ml添加硼氫化鈉，使反應(yīng)液體積為100μl，通過(guò)在4℃下反應(yīng)一晝夜，將席夫堿還原，使結(jié)合穩(wěn)定化。
將該修飾過(guò)程用7摩爾脲-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Molecular Cloning第2版12.23頁(yè)1989年)追蹤的結(jié)果如圖9所示。圖中左側(cè)的數(shù)字和箭頭表示具有各堿基數(shù)的核苷酸鏈的電泳位置。核苷酸鏈的檢測(cè)根據(jù)銀染色法(Electrophoresis第4卷第92頁(yè)1983年)進(jìn)行。
泳道A、B和C分別表示分子量標(biāo)記、寡居胞嘧啶和未處理的核苷酸鏈。泳道D表示于3’端加尾了具有次黃嘌呤的核苷酸序列的核苷酸鏈，核苷酸數(shù)增加到100以上。泳道E表示寡聚脫氧胞嘧啶退火結(jié)合的核苷酸鏈。泳道F表示在3’端形成醛基的核苷酸鏈，核苷酸數(shù)減少到30。泳道G表示3’端被用熒光素尸胺修飾并穩(wěn)定化了的核苷酸鏈。
在泳道D中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)具有次黃嘌呤的核苷酸的加尾，而發(fā)現(xiàn)殘留了一些未反應(yīng)的核苷酸鏈，這可能是由于加尾反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶添加量的增加等，核苷酸鏈變得容易消解。
作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶也具有氨基，也有可能在核苷酸鏈內(nèi)部發(fā)生反應(yīng)，自我聚合，但如泳道F所示，沒(méi)有發(fā)生自我聚合。不過(guò)如果有必要，可以使用在核苷酸鏈的化學(xué)合成時(shí)被用到的苯甲?；惗□；冗m當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基對(duì)核苷酸鏈的氨基進(jìn)行保護(hù)。
(實(shí)施例2)將在實(shí)施例1中電泳的各個(gè)過(guò)程的核苷酸鏈，根據(jù)Southern的方法(J.Mol.Biol.第98卷，第503頁(yè)，1975年)印跡到尼龍膜(Schleicher & Schuell公司制)上。
對(duì)尼龍膜上的核苷酸鏈滴加用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗熒光素抗體(Amersham Biosciences公司制)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法(Amersham Biosciences公司制，ECL檢測(cè)試劑)使底片(Amersham Biosciences公司制，Hyperfilm ECL)曝光檢測(cè)熒光素的有無(wú)。結(jié)果如圖10所示。圖中左側(cè)的數(shù)字和箭頭與圖9相同，表示具有各堿基數(shù)的核苷酸鏈的位置。
泳道A表示分子量標(biāo)記。該標(biāo)記使用以末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶加尾處理了的預(yù)先熒光素標(biāo)記的2’，3’-二脫氧尿苷-5’-三磷酸(EnzoDiagnostics公司制)。
泳道B～F中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)發(fā)光的檢出，可以知道核苷酸鏈沒(méi)有被熒光素修飾。
泳道G中，檢出核苷酸數(shù)30的核苷酸鏈的發(fā)光，可以知道修飾核苷酸鏈確實(shí)被熒光素尸胺修飾。
泳道G中，核苷酸數(shù)18的寡聚脫氧胞嘧啶也被熒光素尸胺修飾。這是由于已加尾的次黃嘌呤的核苷酸鏈部分隨機(jī)退火結(jié)合有寡聚脫氧胞嘧啶，局部沒(méi)有形成雙鏈，存在3-甲基腺嘌呤DNA糖苷酶II型不發(fā)生作用的地方。而且，由此生成較少核苷酸數(shù)的寡聚脫氧次黃嘌呤，其3’端形成醛基，熒光素尸胺對(duì)其醛基進(jìn)行修飾，在這些反應(yīng)中寡聚脫氧次黃嘌呤和寡聚脫氧胞嘧啶再退火結(jié)合。但是，將不需要的寡聚脫氧胞嘧啶，通過(guò)與用適當(dāng)?shù)姆椒ü潭ɑ谀z層析、離子交換層析或者聚苯乙烯珠粒等微粒上的寡聚脫氧次黃嘌呤、寡聚脫氧鳥嘌呤或者將它們混合得到的寡聚核苷酸退火結(jié)合，可以容易地分離除去。
以上，如實(shí)施例1和實(shí)施例2所示，根據(jù)本發(fā)明的方法，可以在核苷酸鏈3’端直接以修飾物質(zhì)進(jìn)行修飾。
上述各實(shí)施例中所示的核苷酸鏈的結(jié)構(gòu)和鏈長(zhǎng)、修飾物質(zhì)、反應(yīng)條件、反應(yīng)組成等只是示例，并不局限于此，可以任意改變。
(實(shí)施例3)作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈?zhǔn)褂脤?duì)應(yīng)于人骨骼肌肌球蛋白重鏈1的cDNA序列第5831～5850位(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的基因庫(kù)網(wǎng)站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)，登錄號(hào)NM_005963，截至2004年2月)的核苷酸數(shù)20的單鏈脫氧核苷酸鏈(委托Sigma-Genosys公司合成)。與該核苷酸鏈互補(bǔ)的核苷酸鏈?zhǔn)褂煤塑账釘?shù)29的單鏈脫氧核苷酸鏈(委托Sigma-Genosys公司合成)。修飾物質(zhì)使用氨基氧基甲基羰基腙-Cy5。各核苷酸鏈具有以下堿基序列。
被修飾的核苷酸鏈TGCTG AAAGG TGACC AAAGA (序列2)互補(bǔ)的核苷酸鏈ATCGGATCCTCTTTGGTCACCTTTCAGCA (序列3)步驟1通過(guò)將被修飾的核苷酸鏈(以下記作MYH1)和互補(bǔ)的核苷酸鏈(以下記作MYH1-Bam HI)按照最終濃度分別為10μM和20μM，懸浮于50mM氯化鈉、10mM氯化鎂、1mM二硫蘇糖醇、10mM Tris-HCl(pH 7.5)的緩沖液(溶液總量100μl)中，在65℃下加溫10分鐘后，冷卻30分鐘以上至室溫，形成cMYH1-Bam HI的5’區(qū)域(CTTTCAGCA)突出的雙鏈。
步驟2將形成的雙鏈核苷酸用乙醇沉淀回收，通過(guò)加入到10mM dITP、10mM dATP、10mM dTTP、10mM dCTP、50mM氯化鈉、20mM氯化鎂、40mM Tris-HCl(pH 7.5)的溶液中，按照最終濃度0.5u/μl添加T7DNA聚合酶的修飾酶シ-ケネ-スver.2.0(USB公司)(溶液總量100μl)，在37℃下反應(yīng)4小時(shí)，在MYH1的3’端添加含有與MYH1-Bam HI互補(bǔ)的次黃嘌呤的核苷酸序列，形成29對(duì)堿基對(duì)的完整的雙鏈核苷酸。這時(shí)形成的MYH1以(序列1)-HxHxATCCHxAT表示。
步驟3將形成的雙鏈核苷酸用乙醇沉淀回收，通過(guò)加入到1mm乙二胺四乙酸、1mM乙二醇-二(2-氨基乙醚)四乙酸(＝乙二醇醚二胺四乙酸)、1mM二硫蘇糖醇、10mM 4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸-氫氧化鉀(pH 7.4)的溶液中，按照最終濃度0.2u/μl添加3-甲基腺嘌呤DNA糖苷酶II(Trevi gen公司)(溶液總量100μl)，在37℃下反應(yīng)一晝夜，將具有次黃嘌呤的脫氧核糖的糖苷鍵水解，使MYH1的3’端帶有醛基。該MYH1以(序列1)-CHO表示。
步驟4將在MYH1末端具有醛基的雙鏈核苷酸通過(guò)加入到50mM 4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸-氫氧化鉀(pH 7.2)的溶液中，按照最終濃度240μM添加作為修飾物質(zhì)的氨基氧基甲基羰基腙-Cy5(溶液總量100μl)，在室溫下反應(yīng)一晝夜，使得在MYH1的3’端的醛基和Cy5的氨基之間形成席夫堿。該MYH1以(序列1)-CHHNOCHNHNH-Cy5表示。
各步驟的核苷酸鏈用16％聚丙烯酰胺凝膠電泳(90mM Tris-硼酸·2mM乙二胺四乙酸緩沖液)跟蹤的結(jié)果如圖11所示。核苷酸鏈用SYBRGold(MolecularProbes公司)染色。圖中的M表示分子量標(biāo)記，20bp、30bp、50bp、100bp分別表示20堿基對(duì)、30堿基對(duì)、50堿基對(duì)、100堿基對(duì)的雙鏈核苷酸的電泳位置。
泳道1的條帶表示被修飾的核苷酸鏈(MYH1)；泳道2的條帶表示互補(bǔ)的核苷酸鏈(MYH1-Bam HI)；泳道3中在30堿基對(duì)左右位置出現(xiàn)的條帶表示在步驟1中形成的部分雙鏈的核苷酸；泳道4中與泳道3相比移動(dòng)速度稍慢的條帶表示在步驟2中形成的29堿基對(duì)的完整的雙鏈核苷酸；在泳道5中與泳道4相比移動(dòng)速度稍快的條帶表示MYH1上帶有醛基的雙鏈核苷酸；泳道6中的條帶表示MYH1被修飾物質(zhì)修飾了的雙鏈核苷酸。
在泳道5和泳道6之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)移動(dòng)速度的顯著差異，將電泳后的各泳道的雙鏈核苷酸根據(jù)Southern的方法(J.Mol.Biol.第98卷，第503頁(yè)，1975年)印跡到尼龍膜(Schleicher & Schuell公司)上，利用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗花青抗體(Rockland公司)，用底片(商品名Hyperfilm ECL，AmershamBiosciences公司)考察魯米諾反應(yīng)引起的化學(xué)發(fā)光的有無(wú)，只有泳道6的雙鏈核苷酸使底片曝光(泳道6’)。其結(jié)果，在泳道6的雙鏈核苷酸上結(jié)合了辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗花青抗體，即表示所述抗體可結(jié)合的氨基氧基甲基羰基腙-Cy5結(jié)合到了MYH1上。
作為修飾物質(zhì)的氨基氧基甲基羰基腙-Cy5(花青類色素)，以Cy5-肼(Amersham Biosciences公司)作為初始物質(zhì)，按照Ide等(Ide etal.，Biochemistry，第32卷，第8276頁(yè)，1993年)和Gruber等(Gruber et al.，Bioconjugate Chemistry，第11卷，第161頁(yè)，2000年)的方法，如下進(jìn)行合成并純化。

將1mM Cy5-肼和3mM叔丁氧基羰基氨基氧基乙酸(t-Boc-NH-O-CH2COOH)(Fluka公司)在3mM N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和3mM 1-羥基-1H-苯并噻唑(HOBt)的存在下(溶液總量300μl)，在4℃下反應(yīng)一晝夜使其縮合，將該反應(yīng)混合物濃縮后，通過(guò)添加50％三氟乙酸(TFA)(2000μl)，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，將縮合物的叔丁氧基羰基(t-Boc)切去，最后將反應(yīng)物混合物用5％N，N’-二異丙基乙胺(DIPEA)中和，通過(guò)用C18硅膠柱純化，得到目標(biāo)化合物。收率為13.4％。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明可以對(duì)單鏈核苷酸、以及雙鏈核苷酸中選出的一條或者兩條核苷酸鏈的3’端直接用修飾物質(zhì)，在與核苷酸鏈鏈長(zhǎng)無(wú)關(guān)的情況下進(jìn)行修飾。可以通過(guò)選擇不存在于主鏈部分的堿基，例如本來(lái)不作為基因存在、且在PCR擴(kuò)增等時(shí)沒(méi)有摻入核苷酸鏈的堿基作為特定的堿基，來(lái)避免主鏈部分的分解。本發(fā)明的方法是可以在不考慮核苷酸鏈(主鏈部分)的堿基結(jié)構(gòu)和鏈長(zhǎng)的情況下，對(duì)核苷酸鏈的3’端直接地、簡(jiǎn)便地，用任意的修飾物質(zhì)定量地、穩(wěn)定地修飾。
因此，可以在只對(duì)具有目標(biāo)的基因信息的核苷酸鏈標(biāo)記化、標(biāo)志化的同時(shí)，在以核苷酸鏈的固定化為目的的情況下，將修飾物質(zhì)作為連接物質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定、牢固的固定化，還可以防止基因分析的疑似結(jié)果。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的核苷酸鏈修飾方法可以對(duì)作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端，不論核苷酸鏈?zhǔn)菃捂溁蚴请p鏈，用任意的修飾物質(zhì)定量地、穩(wěn)定地修飾，可用于需要核苷酸鏈的標(biāo)記化、標(biāo)志化、固定化等的基因分析等。
序列表<110>松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社(MATSUSHITA ELECTRIC INDUSTRIAL CO.，LTD.)<120>核苷酸鏈修飾方法<130>pct4020<150>JP 2004-187133<151>2004-06-25<150>JP 2003-186151<151>2003-06-30<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>編碼大腸桿菌(Escherichia coli)16S rRNA基因的第8-37位堿基<400>1agagtttgat catggctcag attgaacgct 30<210>2<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>編碼人成熟肌球蛋白重鏈1第5831～5850位的寡聚脫氧核苷酸<400>2tgctgaaagg tgaccaaaga 20<210>3<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>與人成熟肌球蛋白重鏈1第5850～5831位互補(bǔ)的序列，在5’端外加9個(gè)Bam HI限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別的核苷酸<400>3atcggatcct ctttggtcac ctttcagca 29
權(quán)利要求
1.核苷酸鏈修飾方法，其中，對(duì)3’端存在具有特定堿基的核苷酸序列的作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈，用對(duì)含有所述特定堿基的核苷酸特異的分解酶進(jìn)行作用，在所述作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端加上對(duì)目標(biāo)修飾物質(zhì)具有結(jié)合能力的官能團(tuán)，并在具有所述官能團(tuán)的核苷酸鏈的3’端結(jié)合所述修飾物質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，具有特定堿基的核苷酸序列位于作為主鏈的核苷酸鏈的3’端，所述特定堿基是不存在于所述主鏈中的堿基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，將具有特定堿基的核苷酸序列添加到作為主鏈的核苷酸鏈的3’端。
4.如權(quán)利要求3所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，將具有特定堿基的核苷酸序列通過(guò)加尾法添加。
5.如權(quán)利要求3所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，將在3’端區(qū)域具有與該核苷酸鏈3’端區(qū)域互補(bǔ)的序列的核苷酸鏈退火結(jié)合到作為修飾對(duì)象的單鏈核苷酸鏈上，從而在所述作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端添加含有特定堿基的互補(bǔ)核苷酸序列。
6.如權(quán)利要求3所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，將至少一條核苷酸鏈作為修飾對(duì)象的雙鏈核苷酸，用對(duì)作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端區(qū)域的堿基序列能特異性識(shí)別的限制性酶剪切，從而在剪切了的作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端添加含有特定堿基的互補(bǔ)核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求3所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，在雙鏈核苷酸中至少一條的作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端，將在5’端區(qū)域具有含有特定堿基的核苷酸序列的雙鏈核苷酸用DNA連接酶連接，通過(guò)對(duì)該連接的核苷酸鏈的所述特定堿基到3’端的堿基序列用特異性識(shí)別的限制性酶剪切，從而在所述的作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端添加含有特定堿基的核苷酸序列。
8.如權(quán)利要求5或6所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，核苷酸序列的添加通過(guò)使用DNA聚合酶摻入核苷酸而進(jìn)行。
9.如權(quán)利要求1所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，存在具有特定堿基的核苷酸序列的核苷酸鏈?zhǔn)腔瘜W(xué)合成的核苷酸鏈。
10.如權(quán)利要求1所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，用分解酶作用之前，添加具有與特定堿基互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸。
11.如權(quán)利要求1所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，使其在作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端帶有的官能團(tuán)為醛基。
12.如權(quán)利要求1所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，將DNA糖苷酶作為分解酶使作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端帶有醛基。
13.如權(quán)利要求1所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，特定堿基是次黃嘌呤，將3-甲基腺嘌呤DNA糖苷酶作為分解酶，使作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈的3’端帶有醛基。
14.如權(quán)利要求1所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，修飾物質(zhì)具有與核苷酸鏈3’端帶有的官能團(tuán)形成化學(xué)鍵的氨基。
15.如權(quán)利要求1或14所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，修飾物質(zhì)是使核苷酸鏈標(biāo)記化、標(biāo)志化的物質(zhì)。
16.如權(quán)利要求15所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，修飾物質(zhì)是熒光物質(zhì)、維生素、脂類、氨基酸、寡肽、蛋白質(zhì)或者生體外源性物質(zhì)。
17.如權(quán)利要求1或14所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，修飾物質(zhì)是具有與用于基因分析的基板結(jié)合的能力的物質(zhì)。
18.如權(quán)利要求17所述的核苷酸鏈修飾方法，其特征還在于，修飾物質(zhì)是氨基烷烴硫醇或者氨基硅烷偶聯(lián)化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供的核苷酸鏈修飾方法的特征在于，對(duì)3’端存在具有次黃嘌呤(Hx)等特定堿基的核苷酸序列的作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈(I)，用對(duì)含有所述特定堿基的核苷酸特異的分解酶進(jìn)行作用，在所述作為修飾對(duì)象的核苷酸鏈(I)的3’端加上對(duì)目標(biāo)修飾物質(zhì)(例如具有氨基的NH
文檔編號(hào)C12P19/34GK1780909SQ20048001135
公開日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月30日
發(fā)明者上甲茂樹 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社