專利名稱：新穎的桿菌029cel纖維素酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新穎纖維素酶，在此被稱作029cd。本發(fā)明 也描述了編碼該纖維素酶的核酸，包含所述纖維素酶的組合物，鑒定 新的纖維素酶的方法，和應(yīng)用所述組合物的方法。優(yōu)選地，纖維素酶 是從桿菌屬種類，優(yōu)選地是5.吸am^a^ms被分離出來的。本發(fā)明進 一步涉及新的纖維素酶在組合物中的應(yīng)用，在本領(lǐng)域中，認為所述組 合物中被添加了纖維素酶，而具有優(yōu)勢，所述應(yīng)用包括，作為去污劑 組合物中的添加劑，用在含纖維素織物的處理中，用在紙漿和紙的處 理中，以及用在淀粉的處理中，用于生產(chǎn)高果糖玉米漿或者乙醇。
背景技術(shù)：
纖維素(Cellulose)和半纖維素(hemicellulose)是由光合作 用生成的最豐富的植物材料。它們可以被許多微生物降解并用作能量 來源，這包括細菌、酵母和真菌，它們產(chǎn)生能夠?qū)⒍嗑畚锏孜锼鉃?單體糖的胞外酶(Aroetal.,2001)。由于不可再生資源途徑的限制，纖 維素成為主要的可再生能源的潛力是巨大的(Krishnaetal.，2001)。通 過生物學(xué)方法有效利用纖維素，是解決食品、飼料和燃料短缺的一個 途徑(Ohmiyaeta1.，1997)。[5] 纖維素酶(Cellulases)是水解纖維素(/3-1,4葡聚糖或者/5D-糖苷鍵)導(dǎo)致形成葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖(cellooligosaccharides) 和類似物質(zhì)的酶。纖維素酶在傳統(tǒng)上被分為三個主要類型內(nèi)切葡聚 糖酶(endogluca難s ) (EC 3.2丄4 ) ( "EG")， 外切葡聚糖酶
(exoglucanases )或者纖維二糖水解酶(cellobiohydrolases) (EC 3.2.1.91) ("CBH")和/5-葡萄糖苷酶([/3]-D-glucosideglucohydrolase; EC 3.2.1.21) ("BG")。 (Knowlesetal., 1987; Shulein, 1988)。內(nèi)切葡 聚糖酶主要作用于纖維素纖維的非晶體部分，而纖維二糖水解酶也可 以降解晶體纖維素(Nevalainen and Penttila, 1995)。因此，纖維二糖 水解酶在纖維素酶系統(tǒng)中的存在對于晶體纖維素的有效溶解是必需的
(Suumakki,eta1.2000)。 /3-葡萄糖苷酶的作用是從纖維二糖、纖維寡 糖和其它糖苷釋放出D-葡萄糖單位(Freer， 1993)。 [6] 為了有效地將晶體纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟牵暾睦w維素酶系 統(tǒng)是必需的，其包括來自CBH、 EG和BG類別中每一類的成分，而 孤立的成分在水解晶體纖維素方面的有效性較小(Filhoetal., 1996)。 已經(jīng)觀察到，在不同類別的纖維素成分之間存在協(xié)同關(guān)系。特別地， EG-型纖維素酶和CBH-型纖維素酶協(xié)同地相互作用，以更加有效地降 解纖維素。參見，例如，Wood, 1985。 盡管纖維素酶組合物在之前已被描述過， <旦仍存在著對新的 和改進的纖維素酶組合物的需求，它們將用于家用^先滌劑、石磨洗組 合物或者洗衣店洗滌劑，等等。顯示出改進的性能的纖維素酶是特別 有價值的。
發(fā)明概述 本發(fā)明的一個目的是，提供新的纖維素酶，其具有用于洗滌 劑，處理織物，生物量轉(zhuǎn)化和制造紙漿以及紙的有益性質(zhì)。 [9] 本發(fā)明的一個目的是，提供有纖維水解活性的多肽和編碼該 多月太的多核苷酸。所述多肽可以改進細胞壁物質(zhì)，例如纖維素和/或者 半纖維素的降解。該多肽也可以改進參與植物細胞壁物質(zhì)例如，生物 材料的降解的其它酶的穩(wěn)定性或者活性。
本發(fā)明的一個目的是，提供新的纖維素酶及其衍生物，生產(chǎn)這樣的纖維素酶的方法，和含有這種新的纖維素酶的組合物。本發(fā)明 進一步涉及在組合物中應(yīng)用新的纖維素酶及其衍生物，在本領(lǐng)域中， 認為所述組合物中被添加了纖維素酶，而具有優(yōu)勢，所述應(yīng)用包括， 作為去污劑組合物中的添加劑，用于處理織物，如含纖維素織物和對 其有用的纖維，作為動物飼料添加劑，用于處理紙漿和紙，以及用在 淀粉的處理中，用于生產(chǎn)高果糖玉米漿或者乙醇。 本發(fā)明的又一個目的是，提供通過來自重組宿主細胞的異源
表達，生產(chǎn)新的纖維素酶的方法。 本發(fā)明的又進一步的目的是，提供編碼本發(fā)明纖維素酶的核 酸序列。在一方面，核酸和氨基酸序列有助于商業(yè)生產(chǎn)本發(fā)明的新的 纖維素酶和纖維素酶組合物。 本發(fā)明的再進一步的目的是，提供新的纖維素酶，其具有極 好的特性，用于洗滌劑，處理織物，用作詞料添加劑以及用于制造紙 槳和紙。 在第一個方面，本發(fā)明包括具有編碼029cel的序列的分離的 多核苷酸，與W化e/基因編碼序列互補的序列，和含有該多核苷酸的 組合物。多核苷酸可以是mRNA、 DNA、 cDNA、基因組DNA、或者 它們的反義類似物。 在一種實施方案中，029cel多核苷酸可以包括分離的核酸分 子，在中度至高度嚴(yán)緊(stringency)的條件下，該分子和被顯示為SEQ ID NO : 2的核酸的互補序列雜交，其中所述核酸分子編碼顯示出纖維 素結(jié)合活性的029cd多肽。
與被顯示為SEQ ID NO : 2的序列具有至少80%、 85%、 90%、 95%、 98%或者更多序列同一性的多核苷酸，可以編碼029cel 蛋白。在一種具體的實施方案中，多核苷酸包括與SEQIDNO:2基 本相同的序列。本發(fā)明也預(yù)期了多核苷酸的片段，優(yōu)選地是長度至少 大約15-30個的核苷酸。 在第二個方面，提供了可以從桿菌"^//^)得到的新的纖 維素酶或其衍生物。優(yōu)選地，本發(fā)明的纖維素酶包括，根據(jù)圖3(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列、片段、或者其衍生物，與其活性部分具有大于 90%的序列同一性，優(yōu)選地，具有大于95%的序列同一性，和更優(yōu)選地，具有大于97%的序列同一性。 在第三方面，本發(fā)明涉及含有編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列 的構(gòu)建物，所述核苷酸序列和一個或者多個調(diào)控序列有效地連接，調(diào) 控序列指導(dǎo)多肽產(chǎn)物在合適的宿主中產(chǎn)生。 本發(fā)明進一步提供了重組的表達載體，其包括編碼029cd 或者片段或者其剪接變體的核酸序列，核酸序列和調(diào)控元件有效地連 接，調(diào)控元件對于在選出的宿主中表達蛋白是有效的。在一個相關(guān)方 面，本發(fā)明包括含有該載體的宿主細胞。 在第四方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明核酸構(gòu)建物的重組表達 載體。
在第五方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明核酸構(gòu)建物的重組宿主 本發(fā)明進一步包括，通過重組技術(shù)生成029cel的方法，這是 通過在可有效促進蛋白表達的條件下，培養(yǎng)含有編碼029cel核酸序列 的重組原核宿主細胞或者真核宿主細胞，并隨后從宿主細胞或者細胞 培養(yǎng)介質(zhì)中恢復(fù)蛋白而實施的。 在第六方面，本發(fā)明涉及用于生成本發(fā)明多肽的方法，方法 包括(a)培養(yǎng)微生物，以生成多肽，所述微生物在野生型形式下可 以生成多肽；和(b)回收多肽。 在第七方面，本發(fā)明提供了在纖維素向乙醇轉(zhuǎn)變中有用的酶 組合物。在一種優(yōu)選的實施方案中，酶組合物包括029cel。該組合物 可以進一步包括其它的纖維素酶，如內(nèi)切葡聚糖酶和/或者纖維二糖水 解酶。組合物可以以029cel被富集。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了通過從環(huán)境中分離總微 生物群落DNA而鑒定新的酶，在大腸桿菌中構(gòu)建基因組DNA文庫， 篩選庫中纖維素酶活性表達，在纖維素酶陽性克隆中鑒定纖維素酶基 因和確定新的纖維素酶的特征的方法。 此處進一步提供了用于檢測W9ce/核酸和029cel蛋白的分 析方法，這也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。 根據(jù)本發(fā)明的又一種實施方案，提供了用根據(jù)本發(fā)明的編碼 纖維素酶的核酸序列轉(zhuǎn)化合適的微生物的方法。提供了從所述的轉(zhuǎn)化微生物生成根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶的方法。 本發(fā)明的進一步的目的是，提供在鏈霉菌(5^eptom;;cM)中 特別有效的表達載體。鏈霉菌作為替代性的宿主細胞，用于生產(chǎn)各種 蛋白，并且相關(guān)于表達和生成纖維素酶，可以提供比桿菌宿主細胞優(yōu) 越的許多益處，特別是當(dāng)細胞在高細胞密度下生長時。優(yōu)選的表達載 體包括調(diào)控多核苷酸序列，它包含來自游動放線菌(Actinoplanes)葡 萄糖異構(gòu)酶基因的啟動子序列，來自鏈霉菌纖維素酶基因的信號序列， 和編碼纖維素酶，特別是根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶的DNA序列。 [29] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，從桿菌可以得到全長的纖維素
酶o 從下面的詳細描述，本發(fā)明的其它目的、特征和益處將是顯 然的。然而，應(yīng)該理解，詳細的說明和具體的實施例，盡管指出了本 發(fā)明的優(yōu)選實施方案，是僅通過例證的方式給出的，原因是，對于本 領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，從此詳細的說明中，在本發(fā)明的范圍和精神之 內(nèi)的各種變化和修改，將是顯然的。
附圖簡述

圖1示例了環(huán)境核苷酸序列(SEQIDNO : 1)。 圖2示例了編碼新的纖維素酶的核酸序列(SEQIDN0:2)。 圖3示例了本發(fā)明纖維素酶的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO :3)。
發(fā)明詳述現(xiàn)在，將通過參考下面的定義和實施例來詳細描述本發(fā)明。此處 提及的所有的專利和出版物，包括在這些專利和出版物中公開的序列， 都特意地以引用方式并入。
除非本文另有定義，此處應(yīng)用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語， 皆具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所普遍理解的含義。Singleton, et al.， DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED,， John Wiley and Sons, New York (1994)和Hale & Marham， THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial, NY (1991)向技術(shù)人員提供了本發(fā)明中應(yīng)用的許多術(shù) 語的一般性解釋。盡管與此處描述的方法和材料相似或者等價的任意 方法和材料可以被用于本發(fā)明的實踐或者試驗中，但仍描述了優(yōu)選的 方法和材料。數(shù)字范圍包括用于限定該范圍的端值。除非另有指明， 核酸以5，-3，的方向從左至右書寫；氨基酸序列以氨基末端向羧基末端 的方向從左至右書寫。關(guān)于本領(lǐng)域的定義和術(shù)語，實踐者可以特別地 參考Sambrook et al.， 1989和A應(yīng)bel FM et al., 1993。應(yīng)該理解，本發(fā) 明不限于所描述的具體的方法學(xué)、方案和試劑，因為它們可以變化。 [36] 本文提出的標(biāo)題不是對本發(fā)明各個方面或者各種實施方案 的限制，可以通過參考整個說明書來考慮它們。因此，通過將說明書 作為一個整體來參考，下面即將被定義的術(shù)語可以被更加全面地定義。 [37] 本文引用的所有出版物均特意地通過引用方式并入本文，以 用于描述和揭示可能與本發(fā)明聯(lián)系使用的組合物和方法學(xué)。 1.定義 "纖維素酶"(cellulase)、"纖維水解酶"(cellulolytic enzymes) 或者"纖維素酶酶"(cellulaseenzymes)是指此處描述的發(fā)明的細菌內(nèi) 切葡聚糖酶(endoglucanases)。纖維素酶的三種不同類型協(xié)同作用， 以將纖維素及其衍生物轉(zhuǎn)化為葡萄糖。 術(shù)語"纖維素酶"是指酶的一個種類，該酶能夠水解纖維素多 聚物為較短的纖維寡糖寡聚物、纖維二糖和/或者葡萄糖。纖維素酶的 許多例子，如外切葡聚糖酶、外切纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶和 葡糖苷酶，已經(jīng)從可水解纖維素的生物體中獲得，特別地，包括真菌 和細菌。這些微生物產(chǎn)生的酶是具有三種類型的功能的蛋白餛合物 內(nèi)切蔔聚糖酶(EG)、纖維二糖水解酶(CBH)和/5-葡糖苷酶，它們 在纖維素向葡萄糖的轉(zhuǎn)變中是有用的。纖維素酶的這三種不同形式協(xié)
同作用，以將纖維素及其衍生物轉(zhuǎn)化為葡萄糖。 許多微生物都產(chǎn)生水解纖維素的酶，包括腐木真菌木霉 (Trichoderma)、堆肥細菌高溫單孢菌(Thermomonospora)、桿菌 (Bacillus)和纖維單胞菌(Cellulomonas);鏈霉菌(Streptomyces);
禾口真菌腐質(zhì)霉(Humicola)、曲霉(Aspergillus)和鐮 包菌(Fusarium)。 術(shù)語"宿主細胞"是指含有載體并支持表達構(gòu)建物的復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄和翻譯(表達)的細胞。用于本發(fā)明的宿主細胞可以 是原核細胞，如大腸桿菌，或者真核細胞，如酵母、植物、昆蟲、兩 棲動物或者哺乳動物細胞。在根據(jù)本發(fā)明的一種實施方案中，"宿主細 胞"意味著桿菌屬細胞。在根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實施方案中，"宿 主細胞"意味著鏈霉菌細胞。鏈霉菌是指，是鏈霉菌屬的一個成員的任
意菌株，如在Buchanan et al. ， The Shorter Bergey's Manual For Determinative Bacteriology (Williams & Wilkens 1982)中所分類。特別優(yōu) 選白勺t走霧菌株包,舌51. //v/dews、iS. n/6/gZ"osMS、禾口 5". coe/z'co/or。51. /fv/cfe打s 在Lomovskaya et al.， J. Virology 9: 258 (1972)中有所描述。然而，技術(shù) 人員將認識到，可以應(yīng)用任何合適的宿主細胞，例如細菌、真菌、真 核細胞和植物細胞。 術(shù)語"重組體"，當(dāng)用于例如細胞或者核酸、蛋白、載體吋， 表示該細胞、核酸、蛋白或者載體己經(jīng)通過異源性核酸或蛋白的導(dǎo)入 或者天然核酸或蛋白的改造而被修飾，或者該細胞衍生于如此修飾的 細胞。因此，例如，重組細胞表達在該細胞的天然(非重組)形式中 未發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達的是天然基因，但是該天然基因在其它情況 下是異常地表達、表達不足或者根本不表達。 術(shù)語"促分泌信號序列"表示編碼多肽("促分泌肽"或者"促分 泌信號肽")的DNA序列，促分泌肽作為更大的多肽的一部分，指導(dǎo) 該更大的多肽穿過合成它的細胞的分泌通路。在通過所述分泌通路的 過程中，該更大的肽通常被切割，去除促分泌肽，以生成促分泌信號 肽和通常被稱為成熟多肽的較小的肽。 如此處所應(yīng)用，短語"全纖維素酶制備物(whole cellulase preparation)"和"全纖維素酶組合物(whole cellulase composition)"可 以互換地應(yīng)用，可以指天然發(fā)生和非天然發(fā)生的組合物。"天然發(fā)生的" 組合物是由天然發(fā)生的來源產(chǎn)生的，其含有，例如， 一個或者多個纖 維二糖水解酶類型、 一個或者多個內(nèi)切葡聚糖酶類型，和一個或者多 個6-葡糖苷酶成分，其中這些成分中的每一個以由所述來源所產(chǎn)生的 比率被發(fā)現(xiàn)。 一些真菌產(chǎn)生全纖維素酶系統(tǒng)，其包括外切纖維二糖水 解酶或者CBH-類型纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶或者EG-類型纖維素酶， 和B-葡糖苷酶或者BG-類型纖維素酶(Schulein, 1988)。然而，有吋這些系統(tǒng)缺乏CBH-類型的纖維素酶，并且細菌纖維素酶也典型地幾乎 不包括CBH-類型的纖維素酶或者不包括CBH-類型的纖維素酶。天然 發(fā)生的組合物是由就纖維素水解酶而言未加以修飾的生物體產(chǎn)生的組 合物，因此酶成分的比率與由天然生物體生成的相比沒有改變。 [45] "非天然發(fā)生的"組合物包括那些如下產(chǎn)生的組合物(1)以 天然發(fā)生的比率或者非天然發(fā)生的比率即改變的比率將纖維水解酶成 分組合起來；或者(2)修飾生物體，以過量表達或者抑制表達一種或 者多種纖維素水解酶；或者(3)修飾生物體，以致于至少一種纖維素 水解酶被剔除，或者(4)修飾生物體，以表達異源的纖維水解酶成分。 [46] 如此處所應(yīng)用，術(shù)語"啟動子"是指核酸序列，其功能是指導(dǎo) 下、游基因的轉(zhuǎn)錄。啟動子通常適用于表達靶基因的宿主細胞。啟動子 與其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)核酸序列和翻譯調(diào)節(jié)核酸序列(也被稱為"調(diào)控序 列")，對表達特定的基因是必需的。通常地，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和翻譯調(diào) 節(jié)序列包括但不限于，啟動子序列、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始序列 和轉(zhuǎn)錄終止序列、翻譯起始序列和翻譯終止序列，以及增強子或者激 活子序列。啟動子可以是通常與下游基因相關(guān)聯(lián)的啟動子，或者啟動 子可以是異源的，即來自另一基因或者另一微生物，只要它是作用是 指導(dǎo)基因。當(dāng)轉(zhuǎn)化宿主細胞是桿菌時，優(yōu)選的啟動子叩rE啟動子。在 一方面，啟動子是可誘導(dǎo)型啟動子。在一方面，當(dāng)宿主細胞是絲狀真 菌時，啟動子是瑞氏木霉(里氏木霉，(Z re^ez')) c6W啟動子，其 在GenBank中的收錄編號(AccessionNumber)是D86235。在另一個 方面，啟動子是來自瑞氏木霉的^^//或者木聚糖酶的啟動子。 [47] 當(dāng)一個核酸被置于與另一個核酸序列的功能聯(lián)系中時，該核 酸便是"有效連接的(operablylinked)"。例如，如果多肽是以參與該 多^:的分泌的前蛋白形式被表達，那么編碼促分泌前導(dǎo)序列即信號肽
的DNA便與該多肽的DNA是有效連接的；如果啟動子或增強子可影 響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么該啟動子或增強子便是有效連接于該序列； 或者，如果核糖體結(jié)合位點被定位以致于可協(xié)助翻譯，那么該核糖體 結(jié)合位點便是有效連接于編碼序列。通常地，"有效連接"意味著被連 接的DNA序列是相鄰的，而且在促分泌前導(dǎo)序列的情形中，是相鄰 的和處于正確的閱讀框架中的。然而，增強子不一定是相鄰的。連接可以通過在方便的限制性位點進行連接而完成。如果這樣的位點不存 在，可以按照常規(guī)的實踐，應(yīng)用合成的寡核苷酸接頭或者連接子。 "DNA構(gòu)建物"或者"DNA載體"是指核酸序列，其包括編碼 新的纖維素酶的一個或者多個DNA片段。"表達載體"包含在"DNA載 體"之中。典型的表達載體含有調(diào)節(jié)序列，如轉(zhuǎn)錄終止子和翻譯終止子， 轉(zhuǎn)錄起始序列和翻譯起始序列，信號序列，和對調(diào)節(jié)特異核酸表達有 用的啟動子。術(shù)語"啟動子"以其通常的意義被應(yīng)用，是指多核苷酸序 列，參與調(diào)控編碼蛋白的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄起始。"信號序列"是指 信號肽或者蛋白質(zhì)的一部分，所述蛋白質(zhì)能夠指導(dǎo)所需蛋白質(zhì)以生物 活性形式從宿主中運輸。細胞外蛋白的成熟形式缺乏信號序列，其在 分泌過程中被切割。盡管不意圖于限制本發(fā)明，信號肽中的氨基酸殘 基數(shù)目可以在大約5至大約100個氨基酸殘基之間。信號序列可以被 修飾，以提供克隆位點，以允許連接DNA或者插入編碼纖維素酶的 DNA。載體任選地包括一般的表達序列盒，包括至少一個獨立的終止 子序列，允許序列盒在原核生物、真核生物或者兩者中復(fù)制的序列(例 如，穿梭載體)和用于原核系統(tǒng)和真核系統(tǒng)的選擇標(biāo)記。載休適于在 原核生物、真核生物或者兩者中復(fù)制和整合。參見，Giliman and Smith, Gene 8: 81-97 (1979); Roberts et al., Nature 328: 731-734 (1987); Berger and Ki讓el, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL 152， Academic Press, Inc., San Diego, CA ("Berger") ; Scheider， B., et al.， Protein Expr. Purif 6435: 10 (1995); Sambrook et al.， MOLECULAR CLO麗G國A LABORATORY MANUAL (2ND ED.) VOL. 1-3, Cold Springs Harbor Publishing (1989) ("Sambrook");和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al., (eds.)， Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1997 Supplement) ("Ausuber)。在鏈霉菌中有用的載體是已知的，并 參見美國專利4,338,397; 4,411, 994; 4,513,085; 4,513,086; 4,745,05 6; 5,514,590;和5,622,866號以及W088/07079。 如此處所應(yīng)用，術(shù)語"基因"是指參與生成多肽鏈的DNA片 段，可以包括或者不包括編碼區(qū)之前的區(qū)域和之后的區(qū)域，例如，5， 非翻譯區(qū)(5'UTR)或者"前導(dǎo)"序列和3'UTR或者"尾部"序列，也可以包括或者不包括各個編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。 當(dāng)用于談及核酸部分時，術(shù)語"異源的"("heterologous")表 示，該核酸含有2個或者更多個子序列(subsequences),其在正常情 況下在自然界中未發(fā)現(xiàn)相互之間具有同樣的關(guān)系。例如，該核酸典型 地通過重組產(chǎn)生，具有例如來源于不相關(guān)的基因的2個或者更多個序 列，它們被排列以形成具有新功能的核酸，例如，所述的序列可以是 一個來源的啟動子和另一個來源的編碼區(qū)域。類似地，異源蛋白常常 涉及兩個或者更更多個子序列，其在自然界中并未發(fā)現(xiàn)具有同樣的相 互關(guān)系(例如，融合蛋白)。術(shù)語"％同源性"(homology)與術(shù)語"％同一性"(identity)在此 可以互換應(yīng)用，并指在應(yīng)用序列聯(lián)配程序聯(lián)配時，編碼029cel的核酸 序列之間或者029cd氨基酸序列之間的核酸序列同一性水平或者氨基 酸序列同一性水平。例如，如此處所應(yīng)用，80%的同一性是指，由特定的算法確定的 具有80%序列同一性的相同物質(zhì)，并因而特定序列的同源物與特定序 列長度具有大于80%的序列同一性。序列同一性的代表性水平包括但 不限于，與特定序列具有80%、 85%、 90%、 95%或者更多的序列同 一性，特定序列例如此處描述的029cel編碼序列。用于確定兩個序列之間的同一性的代表性計算機程序包括但不 限于，BLAST程序組，例如，BLASTEN， BLASTX，和TBLASTX， BLASTP 和 TBLASTN ， 這可以在萬維網(wǎng)的 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST中公開f尋到。也參見，Altschul,et al., 1990 和Altschul,et al.， 1997。當(dāng)相對于Genbank DNA序列和其它公用數(shù)據(jù)庫的核酸序列評價 特定的核酸序列時，典型地應(yīng)用BLASTN程序來進行序列搜索。對于 在Genbank蛋白序列和其它公用數(shù)據(jù)庫中搜索所有閱讀框已被翻譯的 核酸序列，BLASTX程序是優(yōu)選的。BLASTN和BLASTX是應(yīng)用缺 省參數(shù)空位開放罰分為11.0，和空位延伸罰分為1.0來運行的，并利 用BLOSUM-62矩陣。為了在兩個或者更多的序列之間確定"％同一性"，應(yīng)用例如 MacVector版本6.5中的CLUSTAL-W程序，對選擇序列進行優(yōu)選的比對(alignment),該操作采用缺省參數(shù)，包括空位開放罰分為10.0， 和空位延伸罰分為O.l，和BLOSUM30相似性矩陣。 [56] 如此處所應(yīng)用，術(shù)語"分離的"或者"純化的"是指與同其天然 聯(lián)系的至少一種成分分離開的核酸或者氨基酸。 [57] 在本文中，術(shù)語"大體上純化的多肽"(substantially pure polypeptide)意味著，含有與其天然相關(guān)的其它多肽物質(zhì)的最多10% 重量的多肽制備物(優(yōu)選更低百分比的其它多肽物質(zhì)，例如，最多8 %重量，最多6%重量，最多5%重量，最多4%重量，最多3%重量， 最多2%重量，最多1%重量，和最多1/2%重量)。因此，優(yōu)選地，大 體上純化的多肽是至少92%純度的，即，該多肽構(gòu)成制備物中存在的 總多肽物質(zhì)的至少92%重量，優(yōu)選更高的百分比，如至少94%純度， 至少95%純度，至少96%純度，至少96%純度，至少97%純度，至 少98%純度，至少99%純度，和至少99.5%純度。此處公開的多肽優(yōu) 選地處于大體上純化的形式。具體來說，優(yōu)選地，此處公開的多肽是 處于"基本純化的形式"(essentially pure form)，即，多肽制備物基本 上不含有與其天然相關(guān)的其它多肽物質(zhì)。這可以通過，例如，用公知 的重組方法制備多肽而完成。在此處，術(shù)語"大體上純化的多肽"與術(shù) 語"分離的多肽"和術(shù)語"分離形式的多肽"是同義的。 [58] —般來說，在中度至高度嚴(yán)緊(stringency)的條件下，編碼 029cel的核酸分子會和此處提供為SEQIDNO: 2 (029cel)的序列雜 交。然而，在一些情形下，應(yīng)用的是具有大體上不同的密碼子用圖的 編碼029cel的核苷酸序列，而由該編碼029cel的核苷酸序列編碼的蛋 白質(zhì)具有和天然蛋白質(zhì)相同的或者大體上相同的氨基酸序列。例如， 根據(jù)特定密碼子被宿主應(yīng)用的頻率，編碼序列可以被修飾以有利于 029cel在特定原核細胞或者真核細胞表達系統(tǒng)中更快地表達，例如， Te'o, et al. (2000)描述了在絲狀真菌中表達基因的最優(yōu)化方式。 [59] 如果兩個序列在中度至高度嚴(yán)緊的雜交和洗脫條件下彼此 特異地雜交，那么便認為其中一個核酸對于另一個參照核酸，是"可選 擇性地雜交"的。雜交溫度是基于核酸結(jié)合復(fù)合物或者探針的解鏈溫度 (Tm)。例如"最大的嚴(yán)緊性"典型地發(fā)生在大約Tm-5。C (低于探針的 Tm5°C);"高嚴(yán)緊性"發(fā)生在低于Tm大約5-l(TC;"中度"或者"中間嚴(yán)緊性"發(fā)生在低于探針的Tm大約10-20°C;"低嚴(yán)緊性"發(fā)生在低于 Tm大約20-25。C。從功能上來說，最大嚴(yán)緊條件可以被用來鑒定與雜 交探針具有嚴(yán)格同一性或者接近嚴(yán)格的同一性的序列，而高嚴(yán)緊條件 被用來鑒定與探針具有大約80%或者更多的序列同一性的序列。 [60] 中度嚴(yán)緊和高度嚴(yán)緊的雜交條件在本領(lǐng)域是公知的(參見， 例如，Sambrook, et al， 1989, Chapters 9 and 11,以及Ausubel, F. M., et al., 1993,在此特意地并入作為參考)。高度嚴(yán)緊條件的例子包括，在 大約42。C，在50%甲酰胺、5xSSC、 5xDenhardt's溶液、0.5%SDS和 100/ig/ml變性載體DNA中雜交，隨后，用2xSSC和0.5% SDS室溫 洗滌2次，用O.lxSSC和0.5%SDS在42t:再洗滌2次。 [61] 如本文所應(yīng)用，當(dāng)用于描述細胞時，術(shù)語"轉(zhuǎn)化的"、"穩(wěn)定 轉(zhuǎn)化的"或者"轉(zhuǎn)基因的"是指該細胞具有非天然的(異源的)核酸序列， 其被整合入細胞的基因組中或者作為附加體質(zhì)粒，經(jīng)過多代之后依然 被維持。 如本文所應(yīng)用，術(shù)語"表達"是指根據(jù)基因的核酸序列產(chǎn)生多 肽的過程。此過程既包括轉(zhuǎn)錄又包括翻譯。 在談及將核酸序列插入到細胞中時，術(shù)語"導(dǎo)入"是指嘴染" 或者"轉(zhuǎn)化"或者"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，包括將核酸序列整合到真核細胞或者原核細 胞中，其中所述核酸序列可以被并入到細胞的基因組(例如，染色體、 質(zhì)粒、質(zhì)體或者線粒體DNA)，轉(zhuǎn)變?yōu)樽灾鲝?fù)制子，或者短暫地表達 (例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。
接下來，術(shù)語"029cel表達"是指029cel纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄 和翻譯，其產(chǎn)物包括前體RNA、 mRNA、多肽、翻譯后加工的多肽。 作為例子，對029cel表達的分析包括029cel蛋白的蛋白質(zhì)印跡
(Western blot)、 029cel mRNA的RNA印跡(Northern blot)分析和 反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析，和內(nèi)切葡聚糖酶活性分析， 如Shoemaker S. P. and Bro職R. D. Jr. (Biochim. Biophys. Acta, 1978， 523: 133-146)和Schulen (1988)中所描述。如本文中所使用的，術(shù)語"表面活性靴'是指在本領(lǐng)域通常被認為 具有表面活性性質(zhì)的任何化合物。因此，例如，表面活性劑包括陰離 子表面活性劑、陽離子表面活性劑和非離子型表面活性劑，如通常發(fā)現(xiàn)于洗滌劑中的那些表面活性劑。陰離子表面活性劑包括線性的或者
分支的垸基苯磺酸鹽；具有線性或分支烷基基團或者烯基基團的垸基 或烯基醚硫酸鹽；烷基或烯基硫酸鹽；烯烴磺酸鹽和烷基磺酸鹽。兼 性表面活性劑包括季銨磺酸鹽和甜菜堿型兼性表面活性劑。這樣的兼 性表面活性劑在同一分子中既有正電荷基團又有負電荷基團。非離子 型表面活性劑可以包括聚乙二醇，以及更高級的脂肪酸鏈烷醇酰胺或 者其氧化烯加合物、脂肪酸甘油單酯，和類似物。 [66] 如本文所應(yīng)用，術(shù)語"含纖維素的織物(cellulose containing fabric)"是指任何縫制或者非縫制的織物、紗或者纖維，由含棉或者 不含棉的纖維素制成，或者由含棉或者不含棉的纖維素混合物制成， 所述的纖維素混合物包括天然纖維素和人造纖維素(如黃麻、亞麻、 苧麻、人造絲和萊賽爾纖維(lyocell))。 如本文中所使用的，術(shù)語"含棉織物(co加n-containing fabric)"指縫制或者非縫制的織物、紗或纖維，其由純棉或棉混合物 制成，棉混合物包括棉織物(cotton woven fabrics)、棉編織物(cotton knits)、斜紋粗棉布(cotton denims)、棉紗(cotton yarns)、原棉和類 似物。 如本文中所應(yīng)用，術(shù)語"石磨洗組合物"是指用于石磨洗含纖 維素的織物的制劑。石磨洗組合物被用于在出售之前，即，在生產(chǎn)過 程中修飾含纖維素的織物。與之不同，洗滌劑組合物主要用于清潔污 染的衣服，而不是用在生產(chǎn)過程中。 如本文中所應(yīng)用，術(shù)語"洗滌劑組合物(detergent composition)"是指打算應(yīng)用于洗滌介質(zhì)中用于洗滌污染的含纖維素織 物的混合物。就本發(fā)明來說，除了纖維素酶和表面活性劑，這樣的組 合物還可以包括另外的水解酶、助洗劑、漂白劑、漂白催化劑、上藍 劑(bluing agents)和熒光染料、結(jié)塊抑制劑、掩蔽劑(masking agents)、 纖維素酶激活劑、抗氧化劑和增溶劑。
如本文中所應(yīng)用，術(shù)語"活性的"或者"生物活性的"是指與特 定蛋白相關(guān)聯(lián)的生物活性，它們在此可以互換應(yīng)用。例如，與蛋白酶 相關(guān)聯(lián)的酶活性是蛋白水解，因此，活性蛋白酶具有蛋白水解活性。 這樣，特定蛋白的生物活性是指本領(lǐng)域技術(shù)人員通常認為該蛋白具有的任何生物活性。 當(dāng)應(yīng)用于酶溶液時，029cel成分通常被加入的量足以允許可 溶性糖以最大速度從生物材料中釋放出來。加入的029cel成分的量取 決于要被糖化的生物材料的類型，這可以被技術(shù)人員容易地確定。然 而，當(dāng)被應(yīng)用時，029cel成分相對于纖維素酶組合物中存在的任何其 它纖維素酶類型成分的重量百分比是從優(yōu)選地大約1、優(yōu)選地大約5、 優(yōu)選地大約10、優(yōu)選地大約15或者優(yōu)選地大約20的重量百分比至優(yōu) 選地大約25、優(yōu)選地大約30、優(yōu)選地大約35、優(yōu)選地大約40、優(yōu)選 地大約45或者優(yōu)選地大約50的重量百分比。進一步地，優(yōu)選的范圍 可以是，大約0.5至大約15的重量百分比、大約0.5至大約20的重量 百分比、從大約1至大約10的重量百分比、從大約1至大約15的重 量百分比、從大約1至大約20的重量百分比、從大約1至大約25的 重量百分比、從大約5至大約20的重量百分比、從大約5至大約25 的重量百分比、從大約5至大約30的重量百分比、從大約5至大約 35的重量百分比、從大約5至大約40的重量百分比、從大約5至大 約45的重量百分比、從大約5至大約50的重量百分比、從大約10 至大約20的重量百分比、從大約10至大約25的重量百分比、從大約 10至大約30的重量百分比、從大約10至大約35的重量百分比、從 大約10至大約40的重量百分比、從大約10至大約45的重量百分比、 從大約10至大約50的重量百分比、從大約15至大約20的重量百分 比、從大約15至大約25的重量百分比、從大約15至大約30的重量 百分比、從大約15至大約35的重量百分比、從大約15至大約30的 重量百分比、從大約15至大約45的重量百分比、從大約15至大約 50的重量百分比。
II.分子生物學(xué) 本發(fā)明依賴于重組遺傳學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。公開了用于本 發(fā)明的一般性方法的基本文獻包括Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler， Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990),禾卩Ausubel et al.， eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)。[73] 為了獲得克隆基因的高水平表達，異源基因優(yōu)選地位于，距 啟動子的距離與在天然發(fā)生的纖維素酶基因中大約相同的位置。然而， 如本領(lǐng)域中已知，此距離可以出現(xiàn)一些變化，而不喪失啟動子功能。 [74] 本領(lǐng)域中的技術(shù)人員意識到，天然的啟動子可以通過一個或 者多個核苷酸的替換、取代、添加或者刪除被修飾，而不改變其功能。 本發(fā)明實踐包含對啟動子的這些改變但不受其所限。 [75] 表達載體/構(gòu)建物典型地含有轉(zhuǎn)錄單位或者表達序列盒，其含 有用于異源序列表達所需的所有附加的元件。因此，典型的表達序列 盒含有啟動子，它有效地連接于異源核酸序列和轉(zhuǎn)錄物、核糖體結(jié)合 位點及翻譯終止的有效聚腺苷酸化所需的信號。序列盒的附加元件可 以包括增強子和，如果基因組DNA被用作結(jié)構(gòu)基因，包括內(nèi)含子， 其帶有功能性剪接供體部位和受體部位。 本發(fā)明實踐不受對遺傳構(gòu)建物中啟動子的選擇所P艮。在啟動 子選擇中唯一的限制是，它在所應(yīng)用的宿主細胞中是有功能的。當(dāng)轉(zhuǎn) 化宿主細胞是桿菌時，優(yōu)選的啟動子是aprE啟動子。 [77] 除啟動子序列之外，表達序列盒還應(yīng)該含有結(jié)構(gòu)基因下游的 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，以提供有效的終止。終止區(qū)可以從與啟動子序列相同的 基因獲得，或者可以從不同的基因獲得。 用于轉(zhuǎn)運遺傳信息進入細胞的具體表達載體不是特別嚴(yán)格 的?？梢詰?yīng)用用于真核細胞或者原核細胞中的任意常規(guī)表達載體。標(biāo) 準(zhǔn)的細菌表達載體包括噬菌體X和M13，以及質(zhì)粒如基于pBR322的 質(zhì)粒，Pskf， pET23D，和融合表達系統(tǒng)如MBP， GST和LacZ。表位 標(biāo)簽也可以被加入重組蛋白，以提供方便的分離方法，例如，c-myc。 [79] 典型地包括在表達載體中的元件也包括，復(fù)制子，編碼抗生 素抗性的基因以允許選擇出含有重組質(zhì)粒的細菌，和質(zhì)粒的非必需區(qū) 中的單一限制性位點，以允許異源序列的插入。選擇的具體抗生素抗 性基因是不嚴(yán)格的，本領(lǐng)域中已知的眾多抵抗基因中的任意一個均是 適合的。 本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)化載體的全部或者部分被穩(wěn) 定地整合到絲狀真菌的基因組中。然而，轉(zhuǎn)化也可以導(dǎo)致自我復(fù)制的 染色體外轉(zhuǎn)化載體的維持，這也被本發(fā)明預(yù)期。[81] 應(yīng)用入噬菌體(表達)載體和大腸桿菌宿主細胞，可以克隆出 編碼本發(fā)明纖維素酶的基因。(替代性地，可以應(yīng)用在保守結(jié)構(gòu)域上設(shè) 計的共有引物，進行PCR克隆。)申請人已經(jīng)揭示了，編碼本發(fā)明纖 維素酶的基因的轉(zhuǎn)化和在大腸桿菌中的表達，導(dǎo)致形成活性蛋白。在 大腸桿菌中的第一個克隆步驟之后，根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶基因可以 被轉(zhuǎn)運至更優(yōu)選的工業(yè)表達宿主中，如桿菌屬或者鏈霉菌屬，絲狀真 菌，如曲霉(^s^/^7/m)或者木霉(7hWK^/m加)，或者酵母如酵母 屬(&cc/wram;;ces)。在這些宿主微生物中可以獲得的高水平表達及 分泌，使纖維素酶在發(fā)酵介質(zhì)中積累，隨后，纖維素酶從發(fā)酵介質(zhì)中 被回收。 在Ferrari etal.的美國專利5，264，366號中，提供了對于蛋白 酶刪除桿菌株的優(yōu)選的普通的轉(zhuǎn)化及表達方案，該專利在此并入，作 為參考。在例如，Berkaetal.的美國專利5,364,770號中，描述了在曲 霉中的轉(zhuǎn)化和表達，該專利在此并入，作為參考。 [83] 許多標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染方法可以被用來產(chǎn)生表達大量異源蛋白的 瑞氏木霉細胞系。用于將DNA構(gòu)建物導(dǎo)入產(chǎn)纖維素酶木霉株的一些 已公開的方法包括，Lorito, Hayes， DiPietro and Harman， 1993, Curr. Genet. 24: 349-356; Goldman, VanMontagu and Herrera-Estrella, 1990， Curr. Genet. 17: 169-174; Penttila， Nevalainen, Ratto， Salminen and Knowles， 1987, Gene 6: 155-164，對于曲霉菌，Yelton, Hamer and Timberlake， 1984， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470- 1474,對于鐮刀 菌，Bajar， Podila and Kolattukudy， 1991， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8202-8212,對于f連霉菌，Hopwood et al" 1985, The John Innes Foundation, Norwich, UK，以及對于芽孢桿菌，Brigidi， DeRossi， Bertarini, Riccardi and Matteuzzi, 1990, FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138)，所有的文獻在此并入，作為參考。 然而，用于將外源核苷酸序列導(dǎo)入宿主細胞的任何已知的方 法都可以被應(yīng)用。這些方法包括應(yīng)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、凝聚胺法 (polybrene)、原生質(zhì)體融合、電穿孔、生物彈射、脂質(zhì)體、微注射、 等離子體載體、病毒載體和用于將克隆的基因組DNA、 cDNA、合成 的DNA或其它外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入宿主細胞的任何其它己知的方法(參見，例如，Sambrook et al.,見上文)。也可以應(yīng)用美國專利6,255,115 中描述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法。這里的要求僅是所使用的具體遺傳 工程方法能夠成功地將至少1個基因?qū)肽軌虮磉_該異源基因的宿主 細胞。 表達載體被導(dǎo)入細胞之后，將轉(zhuǎn)染的細胞在有利于基因表達 的條件下培養(yǎng)，所述表達是在纖維素酶基因啟動子序列調(diào)控下進行的。 大量的轉(zhuǎn)化細胞可以如下面所描述而被培養(yǎng)。最后，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將產(chǎn) 物從培養(yǎng)物中回收。 因此，本發(fā)明在此提供了本發(fā)明的纖維素酶的表達和增加的 分泌，所述纖維素酶的表達是在纖維素酶基因啟動子序列的調(diào)控下進 行的，包括天然發(fā)生的纖維素酶基因，融合DNA序列，和各種異源 構(gòu)建物。本發(fā)明也提供了用于表達和分泌高水平的本發(fā)明纖維素酶的 方法。
III.鑒定核酸和編碼的蛋白序列 [87] 應(yīng)用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，制備來自桿菌^d//^ agam^aera打s (DSM 8721)的基因組文庫。該生物體產(chǎn)生堿性纖維素 酶，(內(nèi)切-1，4-/3-葡聚糖酶)，屬于糖基水解酶的纖維素酶家族5，內(nèi)切 葡聚糖酶5A ， EC 3.2,1.4, Swiss-Port: 085465， entry name GUN5—BACAG. EBI序列號AF067428)，其基因長度是1203bp， (Daviesetal. 1998)。纖維素酶陽性克隆是用1/3000的頻率在平板分析 中檢測的。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，在用于分離基因的方法中，應(yīng)用 基于此酶的編碼序列的簡并引物。然而，出乎意料的是，應(yīng)用已知引 物擴增已知的及XgaraWflerara纖維素酶時，沒有得到PCR產(chǎn)物。因 此，編碼纖維素酶的完整插入序列是通過引物步移法(primer walking) 被確定的。 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，用于分離基因的方法利用了其與含 有如序列表所示的SEQ ID NO: 2的全部或者部分的核苷酸序列的同 源性。此方法的例子包括
a)用核苷酸序列作為探針，篩選預(yù)測含有029cel基因的基因文庫。b)根據(jù)核苷酸序列信息制備引物，然后用預(yù)測含有029cel基 因的樣品作為模板，進行PCR反應(yīng)。
更具體地，上述的方法a)包括
a)制備預(yù)測含有纖維素酶基因的基因文庫，用含有如序列表所示 的SEQ ID NO: 2核苷酸序列的全部或者部分的核苷酸序列篩選該基 因文庫，從基因文庫中選出與含有如序列表所示的SEQ ID NO: 2核 苷酸序列的全部或者部分的核苷酸序列雜交的序列，然后分離選出的 序列，并從已從基因文庫選出并分離的序列中分離029cel序列。
基因文庫可以是基因組DNA文庫或者cDNA文庫，可以根
據(jù)已知的方法來制備。
IV.蛋白表達 本發(fā)明的蛋白是通過培養(yǎng)用表達載體轉(zhuǎn)化的細胞而生產(chǎn)的， 表達載體含有本發(fā)明的纖維素酶基因，該基因的表達處于啟動子序列 的調(diào)控之下。本發(fā)明對于增加蛋白的細胞內(nèi)和/或者細胞外生成是特別 有用的。蛋白可以是同源的或者是異源的。
本發(fā)明的蛋白也可以被修飾，修飾的方式是，形成含有與另 一個異源多肽或者氨基酸序列融合的所需蛋白的嵌合分子。在一種實 施方式中，這樣的嵌合分子包括，用標(biāo)記多肽進行所需蛋白的融合， 標(biāo)記多肽提供了抗標(biāo)簽抗體可以選擇性地與之結(jié)合的表位。表位標(biāo)記 通常被置于所需蛋白的氨基或者羧基末端。 各種標(biāo)記多肽和它們各自的抗體在本領(lǐng)域中是公知的。例子 包括，聚組氨酸(poly-his)或者聚組氨酸苷氨酸(poly-his-gly)標(biāo)記;HISS 和金屬鰲合標(biāo)記，flu HA標(biāo)記多肽及其抗體12CA5 (Field et aL, Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)); c-myc標(biāo)記及其8F9,3C7,6E10，G4,B7 和9E10抗體(Evan et al.， Molecular and Cellular Biology 5: 3610-3616 (1985));和單純皰疹病毒糖蛋白D (gD)標(biāo)記及其抗體(Paborsky etal.， Protein Engineering 3 (6): 547-553 (1990))。其它的標(biāo)記多肽包括 FLAG-肽(Hopp et al., BioTechnology 6 : 1204-1210 (1988)); KT3抗原 決定基肽(Martin et al., Science 255: 192-194 (1992));微管蛋白抗原決定基肽(Ski皿er et al., J. Biol. Chem. 266: 15163-15166 (1991));和T7 基因10蛋白肽標(biāo)記(Lutz-Freyermuth et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6393-6397 (1990》。 適于表達所述029cel基因的條件包括，向培養(yǎng)物提供用于本 發(fā)明的纖維素酶生長和/或者表達所需的成分。根據(jù)對宿主細胞的選 擇，以及隨著對欲表達蛋白的選擇，用于生成蛋白的最佳條件將會有 所變化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過常規(guī)的實驗或者優(yōu)化，可以容易地確 定該條件。 在表達之后，所需蛋白典型地被純化或者分離出來。根據(jù)樣 品中存在的其它成分，用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的各種方式，可以將 所需蛋白分離或者純化出來。標(biāo)準(zhǔn)的純化方法包括電泳技術(shù)、分子技 術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)和層析技術(shù)，層析技術(shù)包括離子交換層析、疏水層析、 親和層析、和反相HPLC層析、和層析聚焦。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)的抗 所需蛋白的抗體柱，將所需蛋白純化出來。超濾技術(shù)和透析過濾技術(shù) 與蛋白濃縮相結(jié)合，也是有用的。關(guān)于合適的純化技術(shù)的一般指導(dǎo)， 參見Scopes, Protein Purification (1982)。根據(jù)所需蛋白的用途，所需的 純化程度將有所不同。在一些情況下，不需要進行純化。
V.纖維素酶的效用 [96] 根據(jù)本發(fā)明，對織物的處理預(yù)期了，用含有本發(fā)明纖維素酶 的組合物對織物進行加工或者清潔。這種處理包括但不限于，石磨洗， 修飾含纖維素織物的質(zhì)地、手感和/或者外觀，或者在含纖維素織物的 生產(chǎn)或者清潔/修復(fù)期間應(yīng)用的其它技術(shù)。另外地，在本發(fā)明的內(nèi)容中 的處理預(yù)期了，從纖維素織物或者纖維中去除"不成熟的"或者"死的" 棉。不成熟的棉比成熟的棉更加不定形，這是由于，例如，不均勻染 色。本發(fā)明中預(yù)期的組合物進一步包括，用于清洗污染的人造的含纖 維織物的纖維素酶成分。例如，本發(fā)明的纖維素酶可以被用于洗衣店 的洗滌劑組合物中。根據(jù)本發(fā)明的有用的洗滌劑組合物包括特殊配方， 如預(yù)洗、預(yù)浸泡和家用恢復(fù)顏色組合物。這種處理組合物，如此處所 應(yīng)用，可以以需要稀釋的濃縮物形式存在，或者以稀釋液的形式存在， 或者以可以被直接用于含纖維素織物的形式存在。用于織物的纖維素酶處理的普通處理技術(shù)，在例如歐洲專利出版物220 016號和英國專
利申請出版物1,368,599及2,095,275中有所描述。
根據(jù)本發(fā)明，對纖維素物質(zhì)的處理進一步預(yù)期了，對動物飼
料、紙漿和/或者紙、食物和谷物的處理，處理的目的在本領(lǐng)域中是已
知的。例如，已知纖維素酶增加動物飼料的價值，改進木紙漿的濾水
性能，增加食物產(chǎn)物并在谷物濕磨過程及干磨過程中降低谷物中的纖維。 根據(jù)本發(fā)明的處理包括，制備包含有效量的纖維素酶或者纖 維素酶與其它任選成分的結(jié)合物的水溶液，任選成分包括，例如，緩
沖液、表面活性劑、和/或者洗滌劑。有效量的纖維素酶組合物是指， 足以用于其意圖用途的纖維素酶濃度。因此，例如，根據(jù)本發(fā)明，在 石磨洗中的"有效量"的纖維素酶是指，會提供所需效果，例如，在接 縫處及在纖維嵌條(fabricpanels)上產(chǎn)生磨過的和褪色的外觀(look) 的量。相似地，在意圖改進含纖維素織物手感和/或者表觀(外觀， appearance)的組合物中，"有效量"的纖維素酶是指，在手感上產(chǎn)生可 測定的改善的量，例如，改進了織物的光滑度，或者在表觀上產(chǎn)生可 測定的改善的量，例如，去除可降低織物外觀的清晰度的小球和fabril (原纖維)。應(yīng)用的纖維素酶量也取決于采用的設(shè)備，使用的處理參數(shù) (纖維素酶處理溶液的溫度，暴露于纖維素酶溶液的時間，和類似參 數(shù))，和纖維素酶的活性(例如， 一種特別的溶液需要較低濃度的纖維 素酶，其中與較不活化的纖維素酶組合物相比，應(yīng)用了更活化的纖維
素酶組合物)。根據(jù)上述的因素以及所需的結(jié)果，技術(shù)人員可以容易地 確定纖維素酶在欲處理織物被加入其中的水處理液中的確切濃度。在 石磨洗方法中通常優(yōu)選的是，纖維素酶在水處理液中存在的濃度為， 從大約0.5至5,000 ppm總蛋白，和最優(yōu)選的是大約10至200ppm總 蛋白。在用于改善含纖維素織物的手感和/或者外觀的組合物中，通常 優(yōu)選的是，纖維素酶在水處理液中存在的濃度為，從大約0.1至2000 ppm總蛋白，和最優(yōu)選的是大約0.5至200 ppm總蛋白。 [99] 在一種優(yōu)選的處理方案中，在處理組合物中采用緩沖液，以 致于緩沖液的濃度足以將溶液的pH值維持在應(yīng)用的纖維素酶顯示活 性的范圍內(nèi)。纖維素酶顯示活性的pH值取決于所使用的纖維素酶的性質(zhì)。纖維素酶顯示活性的pH值取決于技術(shù)人員可以容易地考慮的 幾個因素。例如，在一種優(yōu)選的實施方案中，選擇緩沖液及緩沖液的 濃度，以使最終的纖維素酶溶液的pH值維持在最大化纖維素酶活性 所需的pH范圍內(nèi)。對本發(fā)明纖維素酶的最佳pH范圍的確定可以根據(jù) 公知的技術(shù)來確認。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在纖維素酶活性范 圍內(nèi)的pH值的合適的緩沖液也是己知的。 除了纖維素酶和緩沖液，處理組合物可以優(yōu)選地含有表面 活性劑。合適的表面活性劑包括與應(yīng)用的纖維素酶及織物相容的任意 表面活性劑，包括，例如，陰離子型表面活性劑、非離子型表面活性 劑和兼性表面活性劑。合適的陰離子表面活性劑包括但不限于，線性 的或者分支的烷基苯磺酸鹽；具有線性或分支烷基基團或者烯基基團 的烷基或烯基醚硫酸鹽；垸基或烯基硫酸鹽；烯烴磺酸鹽；烷基磺酸 鹽和類似物質(zhì)。陰離子表面活性劑的合適的平衡離子包括但不限于， 堿金屬離子如鈉和鉀；堿土金屬離子如鈣和鎂；胺離子，和具有碳原 子數(shù)2或3的1至3個烷醇基團的鏈烷醇胺。兼性表面活性劑包括， 例如，季銨磺酸鹽和甜菜堿型兼性表面活性劑。這樣的兼性表面活性 劑在同一分子中既有正電荷基團又有負電荷基團。非離子型表面活性 劑通常包括聚乙二醇，以及更高級的脂肪酸鏈烷醇酰胺或者其氧化烯 加合物，和脂肪酸甘油單酯。也可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式， 應(yīng)用表面活性劑的混合物。 可以制備濃縮的纖維素酶混合物，用于此處描述的本方法 中。這樣的濃縮物含有濃縮量的上述纖維素酶組合物，緩沖液和表面 活性劑，優(yōu)選地存在于水溶液中。當(dāng)如此制備時，纖維素酶濃縮物可 以容易地用水被稀釋，以致于快速并精確地制備出具有每種成分所需 濃度的纖維素酶審U備物。配制水性濃縮物時，可以將這些濃縮物稀釋， 以致于達到上面所示的，在纖維素酶溶液中的成分的所需濃度。顯然 地，這種纖維素酶濃度使得協(xié)助形成纖維素酶溶液，以及使得組合物 可行地被轉(zhuǎn)運至其將被應(yīng)用的位置。處理濃縮物可以是本領(lǐng)域中承認 的任意方式，例如，液體、乳劑、凝膠、或者漿糊。這樣的形式對于 本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是已知的。
當(dāng)應(yīng)用固體纖維素酶濃縮物時，纖維素酶組合物可以是顆粒、粉末、團塊或者固體片?？梢耘渲祁w粒，以致于含有物質(zhì)以降低 顆粒進入清洗介質(zhì)的溶解速度。這樣的物質(zhì)和顆粒在美國專利5,254,283中公開，該專利在此以整體并入，作為參考。 [103] 也可以如所需，將其它物質(zhì)與本發(fā)明的纖維素酶組合物使 用，或者放在本發(fā)明的纖維素酶組合物中，根據(jù)組合物的最終用途， 其它物質(zhì)包括石頭、輕石、填充劑、溶劑、酶激活劑、和抗再沉積劑。 [104] 通過舉例的方式，將詳細描述石磨洗方法，然而，本領(lǐng)域的 技術(shù)人員可以容易地改變描述的參數(shù)，用于其它用途，即改善織物的 手感和/或者外觀。通過用石磨洗組合物混合處理組合物，將含纖維素 織物與含纖維素酶的石磨洗組合物接觸，所述石磨洗組合物含有有效 量的纖維素酶，并因此使纖維素酶與織物接近。隨后，攪動含纖維素 酶和水溶液和織物。如果處理組合物是水溶液，可以將織物直接浸泡 在溶液中。相似地，當(dāng)石磨洗組合物是濃縮物時，稀釋濃縮物進入帶 有含纖維素織物的水浴中。當(dāng)石磨洗組合物處于固體形式，例如，預(yù) 洗凝膠或者固體棒時，可以通過直接向織物或者洗液應(yīng)用組合物，接 觸石磨洗組合物。[105] 在使酶的作用有效賦予含纖維織物石磨洗外觀的條件下，用 石磨洗溶液孵育含纖維織物。例如，在石磨洗期間，可以調(diào)節(jié)pH值， 液體比例，溫度和反應(yīng)時間，以最佳化石磨洗組合物作用的條件。所 需的"有效"條件是指允許纖維素酶與含纖維織物有效地反應(yīng)的pH，液 體比例，和溫度，在此情形下產(chǎn)生石磨洗的效果。最大化用于應(yīng)用根 據(jù)本發(fā)明的石磨洗組合物的條件的方法，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范 圍內(nèi)。[106] 此處應(yīng)用的，在石磨洗過程中的液體比例，即，石磨洗組合 物溶液的重量(即，洗液)與織物重量的比，通常是在粗斜紋棉布織 物中足以獲得所需的石磨洗效應(yīng)的量，并取決于應(yīng)用的方法。優(yōu)選地， 液體比例是從大約4:1至大約50:1，更優(yōu)選地，從大約5:1至大約20:1， 和最優(yōu)選地，從大約10:1至大約15:1。[107] 在用本發(fā)明的石磨洗組合物進行石磨洗期間，反應(yīng)溫度是由 兩個競爭性因子來控制的。首先，高溫通常對應(yīng)于增加的反應(yīng)動力學(xué)， 艮P，更快的反應(yīng)，與低溫時所需的反應(yīng)時間相比，這使反應(yīng)時間減少。因此，反應(yīng)溫度通常是至少大約l(TC及更高的溫度。其次，纖維素酶 是這樣一種蛋白，其在特定的反應(yīng)溫度以外喪失活性，該溫度取決于 所應(yīng)用的纖維素酶的性質(zhì)。因此，如果允許反應(yīng)溫度升得過高，由于 纖維素酶的變性，纖維水解活性喪失。而本領(lǐng)域中使用纖維素酶的標(biāo) 準(zhǔn)溫度通常在35 。C至65°C范圍內(nèi)，并且這些反應(yīng)條件也將被預(yù)期適合 于本發(fā)明的纖維素酶，對于應(yīng)用的具體的纖維素酶，最佳的溫度條件 應(yīng)該根據(jù)公知的技術(shù)來確定。[108] 反應(yīng)時間取決于石磨洗發(fā)生的具體條f^。例如，pH值，溫 度和纖維素酶的濃度均會影響最佳反應(yīng)時間。通常地，反應(yīng)時間是從 大約5分鐘至大約5小時，和優(yōu)選地，從大約10分鐘至大約3小時， 和最優(yōu)選地，從大約20分鐘至大約1小時。[109] 根據(jù)本發(fā)明的又一種實施方案，本發(fā)明的纖維素酶可以被用 在洗滌劑組合物中。根據(jù)本發(fā)明的洗滌劑組合物作為預(yù)洗組合物，預(yù) 浸泡組合物，或者用于正常清洗或漂洗循環(huán)期間的清潔，是有用的。 優(yōu)選地，本發(fā)明的洗滌劑組合物包括有效量的纖維素酶，表面活性劑， 并任選地包括下面描述的其它成分。[110] 用于本發(fā)明洗滌劑組合物的纖維素酶的有效量是，足以對含 纖維素織物施加所需影響的量，已知該影響是由纖維素酶產(chǎn)生的，例 如，去球，軟化，抗起球，表面纖維去除，抗暗淡和清潔。優(yōu)選地， 洗滌劑組合物中應(yīng)用的纖維素酶的濃度是，從大約10 ppm至大約 20，000ppm洗滌劑。[111] 用于洗滌劑組合物的纖維素酶的濃度被優(yōu)選地選出，因此， 一旦被稀釋入清洗介質(zhì)，纖維素酶的濃度范圍是，大約0.01至大約 1000ppm總蛋白，優(yōu)選地，從大約0.02ppm至大約500ppm總蛋白， 和更優(yōu)選地，從大約0,5 ppm至大約250 ppm總蛋白。用于洗滌劑組 合物的纖維素酶的量將取決于，洗滌劑被加入水以形成洗液時所稀釋 的程度。[112] 本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是本領(lǐng)域中認可的任意形式，例 如，作為液體，在顆粒中，在凝膠中，在乳劑中，或者在漿糊中。此 形式對于技術(shù)人員是公知的。當(dāng)應(yīng)用固體洗滌劑組合物時，纖維素酶 被優(yōu)選地制備為顆粒。優(yōu)選地，顆?？梢员慌渲疲灾掠诟搅嗟睾欣w維素酶保護劑。顆?？梢员慌渲疲灾掠诤形镔|(zhì)以降低顆粒進入洗液的分解速度。這樣的物質(zhì)和顆粒在美國專利5,254,283中有所描 述，其在此以整體并入，作為參考。[113] 本發(fā)明的纖維素酶組合物應(yīng)用表面活性制劑，即，表面活性 齊廿，包括陰離子、非離子和兼性表面活性劑，它們在洗滌劑組合物中 的用途是公知的。[114] 用于本發(fā)明洗滌劑組合物的合適的陰離子表面活性劑包括， 線性的或者分支的烷基苯磺酸鹽；具有線性或分支烷基基團或者烯基 基團的烷基或烯基醚硫酸鹽；烷基或烯基硫酸鹽；烯烴磺酸鹽；和烷 基磺酸鹽。陰離子表面活性劑的合適的平衡離子包括，堿金屬離子如 鈉和鉀；堿土金屬離子如鈣和鎂；胺離子，和具有碳原子數(shù)2或3的 1至3個烷醇基團的鏈垸醇胺。兼性表面活性劑包括季銨磺酸鹽和甜 菜堿型兼性表面活性劑。這樣的兼性表面活性劑在同一分子中既有正 電荷基團又負電荷基團。非離子型表面活性劑通常包括聚乙二醇，以 及更高級的脂肪酸鏈烷醇酰胺或者其氧化烯加合物，脂肪酸甘油單酯， 和類似物質(zhì)。英國專利申請?zhí)?094826A中公開了用于本發(fā)明的合適 的表面活性劑，該公開在此并入，作為參考。也可以應(yīng)用這些表面活 性劑的混合物。表面活性劑或者表面活性劑的混合物在本發(fā)明洗滌劑 組合物中應(yīng)用的量通常是，總洗滌劑組合物的從大約1重量百分比至 大約95重量百分比，和優(yōu)選地，占總洗滌劑組合物的從大約5重量百 分比至大約45重量百分比。除了纖維素酶組合物和表面活性劑，本發(fā) 明的洗滌劑組合物可以任選地包括下列成分中的一種或者多種 除纖維素酶之外的水解酶[115] 合適的水解酶包括，作用于酯鍵的羧酸酯水解酶，硫酯水解 酶，磷酸單酯水解酶，和磷酸二酯水解；作用于糖基化合物的糖苷水 解酶；水解N-糖基化合物的酶；作用于醚鍵的硫醚水解酶；和作用于 肽鍵的氨基-?；?肽水解酶，肽-氨基酸水解酶，酰基-氨基酸水解酶， 二肽水解酶，和肽基-肽水解酶。在它們之中，優(yōu)選的是羧酸酯水解酶， 糖苷水解酶，和肽基-肽水解酶。合適的水解酶包括(1)屬于肽基-肽 水解酶的蛋白酶，如胃蛋白酶，胃蛋白酶B，凝乳酶，胰蛋白酶，木 瓜凝乳蛋白酶，無花果蛋白酶，凝血酶，纖維蛋白溶酶，腎素，枯草桿菌蛋白酶，aspergillopeptidase A，膠原酶，clostridiopeptidase B，激 肽釋放酶，gastrisin，組織蛋白酶D，菠蘿蛋白酶，角蛋白酶，糜蛋 白酶C，胃蛋白酶C， aspergillopeptidase B，尿激酶，羧肽酶A和B， 和氨基肽酶；(2)糖苷水解酶(是其基本成分的纖維素酶從此組中被排 除)a-淀粉酶，/3-淀粉酶，葡糖淀粉酶，轉(zhuǎn)化酶，溶菌酶，果膠酶，幾 丁質(zhì)酶和葡聚糖酶。在它們之中，優(yōu)選的是a-淀粉酶和!3-淀粉酶。它 們作用于酸性至中性體系中，但是，從細菌獲得的酶在堿性體系中顯 示了高度活性；(3)羧酸酯水解酶包括羧基酯酶，脂肪酶，果膠酯酶， 和葉綠素酶。在它們之中，特別有效的是脂肪酶。 [116] 根據(jù)用途，將除纖維素酶之外的水解酶如所需要地加入洗滌 劑組合物中。優(yōu)選地，它將以0.001至5重量百分比，和更優(yōu)選地， 以0.02至3重量百分比的量被并入，這是對純化的蛋白而言的。酶應(yīng) 用的形式應(yīng)該是顆粒，顆粒單獨由粗制酶制成，或者是與洗滌劑組合 物中的其它成分聯(lián)合制成。粗制酶顆粒是以這樣的量被應(yīng)用的，純化 的酶在顆粒中占0.001至50的重量百分比。顆粒被應(yīng)用的量是0.002 至20重量百分比，和優(yōu)選地是O.l至IO重量百分比。關(guān)于纖維素酶， 這些顆?？梢员慌渲?，以致于包含酶保護劑和分解延緩物質(zhì)。 陽離子表面活性劑和長鏈脂肪酸鹽 這樣的陽離子表面活性劑和長鏈脂肪酸鹽包括飽和的或不 飽和的脂肪酸鹽，烷基或烯基醚羧酸鹽，a-磺基脂肪酸鹽或酯，氨基 酸-型表面活性劑，磷酸酯表面活性劑，季銨鹽，包括那些具有3至4 個烷基取代基和多達1個芐基取代的垸基取代基的季銨鹽。英國專利 申請?zhí)?094826A中公開了合適的陽離子表面活性劑和長鏈脂肪酸鹽， 其公開在此并入，作為參考。組合物可以含有從大約1至大約20重量 百分比的這樣的陽離子表面活性劑和長鏈脂肪酸鹽。 助洗劑
A. 二價螯合劑 組合物可以含有從大約0至大約50重量百分比的一種或者 多^^增潔劑組分，該組分選自下列化合物的堿金屬鹽和鏈烷醇胺鹽 磷酸鹽，膦酸鹽，膦?；人猁}，氨基酸鹽，氨基聚乙酸鹽高分子電 解質(zhì)，非解離聚合物，二羧酸鹽，和鋁硅酸鹽。英國專利申請?zhí)?094826A中公開了合適的二價螯合劑，其公開在此并入，作為參考。 B.堿性電解質(zhì)或者無機電解質(zhì) 組合物可以含有從大約1至大約50的重量百分比，優(yōu)選地， 從大約5至大約30的重量百分比,這基于將下列化合物的一種或者多 種的堿金屬鹽的組合物作為堿性電解質(zhì)或者無機電解質(zhì)硅酸鹽，碳 酸鹽和硫酸鹽以及有機堿如三乙醇胺，二乙醇胺，單乙醇胺和三異丙 醇胺。
抗再沉積劑 組合物可以含有從大約0.1至大約5重量百分比的作為抗再 沉積劑的下列化合物中的一種或者多種聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙 烯吡咯垸酮和羧甲基纖維素。 在它們之中，羧甲基纖維素和/或聚乙二醇與本發(fā)明的纖維素 酶的聯(lián)合，提供了特別有用的去污組合物。 漂白劑 本發(fā)明的纖維素酶與漂白劑聯(lián)合應(yīng)用，進一步改進洗滌效 果，所述漂白劑如單過硫酸鉀，過碳酸鈉，過硼酸鈉，硫酸鈉/過氧化 氫加合物和氯化鈉/過氧化氫加合物或者/和光敏漂白染料如磺化肽菁 的鋅或鋁鹽。相似地，可以應(yīng)用如歐洲專利684 304中描述的漂白劑 和漂白催化劑。 上藍劑和熒光染料 如果需要，各種上藍劑和熒光染料可以被并入本組合物。英 國專利申請2 094 826A號中公開了合適的上藍劑和熒光染料，其公開 在此并入，作為參考。 結(jié)塊抑制劑 下列結(jié)塊抑制劑可以被并入粉末狀洗滌劑對甲苯磺酸鹽， 二甲苯磺酸鹽，醋酸鹽，磺基琥珀酸鹽，云母，細磨的二氧化硅，粘 土，硅酸銬(如Micro-Cell of Johns Manville Co.)，碳酸鈣和氧化鎂。 抗氧化劑 抗氧化劑包括，例如，叔丁基羥基甲苯，4，4，-亞丁基雙(6-叔-丁基-3-甲基苯酚)，2,2，-亞丁基雙(6-叔-丁基-4-甲基苯酚)，單苯 乙烯化甲酚，聯(lián)苯乙烯化甲酚，單苯乙烯化苯酚，聯(lián)苯乙烯化苯酚和1,1-雙(4-羥基-苯酚)環(huán)己烷。 增溶劑 增溶劑包括，例如，低級醇如乙醇，苯磺酸鹽，低級烷基苯 磺酸鹽如對甲苯磺酸鹽，二元醇如丙二醇，苯乙酮-磺酸鹽，乙酰胺， 吡啶二羧酸酰胺，苯甲酸鹽和尿素。 本發(fā)明的洗滌劑組合物可以被用在從酸性至堿性pH的寬的 pH范圍內(nèi)。在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的洗滌劑組合物可以被 用在pH值從高于5至不大于大約12的微酸、中性、或者堿性洗滌劑 清洗介質(zhì)中。 除了上述成分，如果需要，可以在本發(fā)明的洗滌劑組合物中 應(yīng)用香料，緩沖液，防腐劑，染料和類似物質(zhì)。這些成分可以方便地 以迄今為止在本領(lǐng)域中所應(yīng)用的量被使用。 當(dāng)本發(fā)明中應(yīng)用的洗滌劑的基本成分是粉末形式時，它可以 是經(jīng)任意已知的制備方法而制備的物質(zhì)，這包括噴霧干燥法和制粒法。 特別是經(jīng)噴霧干燥法，凝聚法，干燥混合法或非-塔式路線方法 (non-tower route methods)獲得的洗滌劑基本成分，是優(yōu)選的。由噴 霧干燥法得到的洗滌劑基本成分不受制備條件所限制。由噴霧干燥法 得到的洗滌劑基本成分是中空的顆粒，這是通過噴射耐熱成分的水性 漿液，如表面活性劑和助洗劑，進入熱的空間而實現(xiàn)的。噴霧干燥之 后，可以加入香料，酶，漂白劑，無機堿性助洗劑。通過如噴霧-干燥 -制粒法或者凝聚法得到高密度的顆粒洗滌劑基本成分，在制備基本成 分后，也可以加入各種成分。 當(dāng)洗滌劑基本成分是液體時，它可以是均一的溶液或者非均
一的分散體。為了通過洗滌劑中的纖維素酶去除羧甲基纖維素的分解，
在并入組合物之前，需要將羧甲基纖維素顆粒化或者包被。 本發(fā)明的洗滌劑組合物可以和含纖維素織物，例如，污染的
織物孵育，用在工業(yè)用途或者家用中，采用的溫度，反應(yīng)時間和液體
比例是在這些環(huán)境中可以方便采用的條件。 根據(jù)本發(fā)明的洗滌劑可以被附加地配制為預(yù)洗，配制是在合 適的溶液，在中間pH下進行的，在此情況下，有足夠的活性，以提 供所需的改進軟化，去球，防起球，表面纖維去除或者清潔作用。當(dāng)洗滌劑組合物是預(yù)浸泡(例如，預(yù)洗或者預(yù)處理)組合物時，或是作 為液體，噴霧劑，凝膠或是作為漿糊組合物，應(yīng)用的纖維素酶通常是，
基于預(yù)浸泡或者預(yù)處理組合物總重量的從大約0.0001至大約1的重量
百分比。在這種組合物中，任選地應(yīng)用表面活性劑，并且應(yīng)用時，其
存在的濃度通常是，基于預(yù)浸泡總重量的從大約0.005至大約20的重 量百分比。該組合物的剩余物含有預(yù)浸泡中應(yīng)用的傳統(tǒng)成分，即，稀 釋劑，緩沖液，其它的酶(蛋白酶)，和類似物質(zhì)，應(yīng)用的濃度是傳統(tǒng) 的濃度。 預(yù)期了，可以將含有此處描述的纖維素酶的組合物，作為適 于恢復(fù)褪色織物顏色的獨立組合物，用于家用(參見，例如，美國專 利4,738,682號，其在此以整體并入，作為參考)以及用在除斑劑中和 用于去球和抗起球(防起球)。 根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶的應(yīng)用，在飼料添加劑和紙漿及紙的
處理中，是特別有效的。在例如PCT出版物95/16360號和芬蘭的授
權(quán)專利87372號中分別描述了這些其它工業(yè)應(yīng)用。 為了進一步闡述本發(fā)明及其優(yōu)勢，給出下面的具體實施例，
需理解，提供它們是為了說明本發(fā)明，而不應(yīng)該以任何方式被解釋為
對發(fā)明范圍的限制。
實施例 下面的實施例是提供用來例證的，而不是要限制所要求的發(fā) 明。
實施例1 樣品收集和處理 本實施例例證了如何收集樣品及處理樣品，以得到足夠的 DNA，以創(chuàng)建cDNA文庫。用安裝在可彎曲可伸長的lm竿末端的250ml不銹鋼燒杯， 從肯尼亞的Sonachi (Crater)湖的沿岸收集水樣品(250ml)，并放置在 可密封的塑料容器內(nèi)(Whirlpak)，用于在室溫下運送至實驗室。表面水 顯是28。C， pH是lO，電導(dǎo)率是7.23mScm"(27。C時)。[139] 為了收集微生物菌叢，將來自肯尼亞的Sonachi (Crater)湖 的水樣品(750ml)通過一系列無菌膜濾器(47mm直徑)原位過濾(用 手動真空泵)，直至水流停止，其中無菌膜濾器由硝酸纖維素或者醋酸 纖維素組成，孔的大小逐漸降低。濾器的順序是8/mi， 3jwn和0.22gm。 4每分別的膜濾器立即放置在10ml冷的無菌細胞穩(wěn)定緩沖液中(TES)， 纟l沖液含有10mM Tris HCl，pH為8.0; 1 mM EDTA和5% w/v的NaCl， 在30ml的無菌塑料普通試管中，并在冷凍的冷箱中冰上保存，直至 它們被進一步處理，這通常是在取樣的4小時之內(nèi)。通過與無菌的玻 璃珠(5ml)混合，劇烈漩渦振蕩，分散濾器中的微生物物質(zhì)，并通 過13,000g離心5分鐘，將微量離心管中的細胞沉淀下來。將微生物 物質(zhì)等分至微量離心管中，體積估計為含有相等的108至109細菌細 月包，總共得到12管。用GenomicPrepTM Cells and Tissue DNA isolation kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ， USA)，按照制造商的 指導(dǎo)，抽取DNA。將每一試管中的DNA重懸浮于提供的細胞裂解液 600m1中，并在8(TC孵育5分鐘以裂解細胞。經(jīng)此方法制備的樣品在 室溫中穩(wěn)定至少18個月，并以此形式被運送回實驗室。按照制造商的 方案，經(jīng)RNA酶A處理，蛋白沉淀和DNA的異丙醇沉淀，完成DNA 提取。將每一 DNA溶解在10mM， pH8.5的無菌Tris緩沖液100/il中。 通過在0.5w/v的瓊脂糖凝膠上跑5jLd樣品，并與已知量的細 菌基因組DNA相比較，估計DNA的產(chǎn)量。收集樣品，總共得到 200/xgDNA。由于產(chǎn)量低，用從水樣品提取的大約30%的額外物質(zhì)補 充該物質(zhì)，所述水樣品是與原位物質(zhì)同時收集的并在實驗室4'C保存 直至被需要。DNA的這些量，大約30pg，是初步實驗顯示的所需的 起始物質(zhì)的量，以進行實驗和大批限制性消化和按大小的分級分離，
以得到足夠的物質(zhì)用于文庫構(gòu)建。
實施例2 文庫構(gòu)建 下面的實施例詳細描述了如何制備DNA文庫，用于在大腸
桿菌中篩選并檢測新的序列。 DNA的制備[142] 將收集的DNA用于構(gòu)建基因組DNA文庫。用部 分消化純化的DNA，得到的平均片段長度是大約5kb。通過在TAE (0.04M Tris-醋酸鹽，0.001 MEDTApH 8.0)的0.5%瓊脂糖凝膠中電 泳，將限制酶切的DNA以其大小分級分離。切取1.5至10kb范圍的 物質(zhì)，并置于在瓊脂糖凝膠的未使用部分中切取的相同大小的孔中， 通過反向電流濃縮為窄的條帶。切取DNA條帶，并根據(jù)制造商的指 示，用QIAGEN (Crawley, UK) QIAEXII gel extraction kit提取DNA。 用乙醇沉淀洗脫的DNA，并將DNA重懸浮在pH8.5的10mM Tris HCl 緩沖液中。 X文庫的制備 按照制造商的方案，用ZAP-ExpressTM vector kit (用BamHl 預(yù)先消化并用堿性磷酸酶處理)和Gigapak III Gold packaging extract (Stratagene， Amsterdam, The Netherlands),將限制酶切的DNA克隆入X 載體。如每一方案，通過將含有 5xlO fU的等分試樣和宿主大腸桿 菌株XL1-Blue MRF鋪板在150mm佩氏培養(yǎng)皿上并在緩沖液中洗脫噬 菌體，擴增初級文庫。在液氮中冷凍之后，將擴增的文庫于-8(TC保存 在7% v/v的二甲基亞砜中。原始的總滴定度是1.8 x 106 pfii，擴增之 后為6.8xl()9pfUmr1。 文庫質(zhì)量的評定 如制造商所描述，用ExAssist helper phage (Stratagene)從 XZAP文庫提取噬菌粒載體pBK-CMV，并將其用于轉(zhuǎn)染大腸桿菌菌株 XLOLR。通過在含有50/xg ml'1卡那霉素的Luria-Bertani (LB)瓊脂上 鋪板，將含質(zhì)粒的克隆分離出來。在Xgal[5-溴-4-氯-3-吲哚-Z3-D-半乳 糖苷]和IPTG[異丙基硫代-z3-D-半乳糖苷]存在下，用藍白斑篩選確定 克隆有效性。如果沒有DNA被克隆入X載體，在誘導(dǎo)劑IPTG存在下， ]3-半乳糖苷基因被表達，導(dǎo)致底物類似物Xgal切割，在菌落中產(chǎn)生藍 色色彩。然而，如果基因組DNA的片段已被成功克隆入X載體，它 破壞了/3-半乳糖苷基因的表達，因此不生成酶，菌落保持白色。因此， 可以用藍白菌落的比例來計算含有插入序列的克隆的百分數(shù)。對于本 文庫，藍白斑篩選得到的比例是，7個藍色菌落對286個白色菌落， 這提示97%的克隆含有基因組DNA的插入片段。隨機選取24個菌落，并用Wizard@Plus SV Miniprep DNA purification system (Promega UK, Southampton)制備質(zhì)粒DNA。用BamHl克隆位點側(cè)翼的Pstl和HindIII 進行限制性內(nèi)切酶分析，隨后用瓊脂糖凝膠電泳確定插入片段長度。 24個克隆中，有1個克隆未發(fā)現(xiàn)可檢測的插入片段。其余的克隆含有 從1.5kb至8.0kb范圍的插入片段。
實施例3
- 對文庫篩選纖維素酶 用在大腸桿菌克隆中的平板分析，篩選pBK-CMV噬菌粒 中DNA文庫的纖維素酶活性。為了檢測纖維素酶活性，將基因組文 庫鋪板于含卡那霉素，0.5%w/v羧甲基纖維素(低粘度鈉鹽；Sigma, Poole, UK)和IPTG的LB瓊脂上(在7cm直徑的佩氏培養(yǎng)皿中，將 1.5jul0.5M溶液，鋪在瓊脂表面上)。37。C過夜生長后，用隨后被冷卻 至5(TC的溶解于水的3ml熔化的0.7X w/v瓊脂糖，覆蓋菌落。凝固 之后，用0.1^w/v剛果紅溶液充滿平板30分鐘，隨后用1M氯化鈉 清洗2次。顯示細胞外纖維素酶活性的陽性克隆被黃色的卣素包繞， 這與紅色的背景相對(R. Teather and P. J. Wood, Applied & Environmental Microbiology, 43: 770-780,1982)。 對110,000個大腸桿菌pBK-CMV進行篩選，產(chǎn)生4個清楚 表明了潛在的產(chǎn)纖維素酶菌落的區(qū)。在勻漿取自透明區(qū)的圓柱狀瓊脂 樣本，對單一的菌落種菌劃線并通過剛果紅實驗證實表現(xiàn)型之后，這 之中的3個區(qū)成功地被恢復(fù)為產(chǎn)纖維素酶克隆。
實施例4 纖維素酶陽性克隆的評定 從這些纖維素酶陽性克隆中分離質(zhì)粒DNA，如上所描述通 過限制性消化確定插入片段的大小。如凝膠電泳所確定，全部三個質(zhì) 粒具有相同大小(大約3.5kb)并在消化后具有相同大小的片段。這提 示，所有三個分離物是一致的，是通過單一克隆的擴增而得到的。這 被質(zhì)粒DNA的第一輪測序(用pBKCMV質(zhì)粒中的引物位點)所證實。 這是由萊斯特大學(xué)(Leicester University)的蛋白和核酸化學(xué)實驗室(Protein and Nucleic Acid Chemistry Laboratory)應(yīng)用Perkin Elmer 'BigDye， terminator chemistry和377型ABI自動化DNA測序儀來實施 的。序列的完全覆蓋是通過從插入片段的5'和3，末端的'引物步移' 而《尋至lj的。用Applied Biosystems multisequence editor Seqed version 1.0.3編輯該序列。用可以從萊斯特大學(xué)(the University of Leicester) 得到的GCG Wisconsin Package, version 10.2-UNIX中的程序匯編該序 列。這鑒定到了 3410個核苷酸堿基的環(huán)境DNA插入片段(圖1)。
實施例5 纖維素酶基因的鑒定 [148] 用MapDraw程序的ORF査找工具(DNASTAR, Brighton, MA， USA)或者來自Vector NTI Suite的ORF搜索(InforMax私North Bethesda， MD， USA)，鑒定克隆029cel插入環(huán)境DNA的核苷酸序列中 的可能的開放閱讀框(ORF)。
這鑒定了由對應(yīng)于含581個氨基酸的蛋白的1746個核苷酸 組成的ORF，從插入序列的3004位處起始并在1259位處結(jié)束。用 EditSeq (DNASTAR)切除此ORF，并通過BLAST程序檢測。 [150] 圖2顯示了此ORF的核苷酸序列。 用BLASTn程序檢測核苷酸序列，BLASTn程序在非冗余 核苷酸序歹U數(shù)據(jù)庫(non-redundant nucleotide sequence database)中比 較了核酸査詢序列，提示與任何已知序列沒有顯著的相似性。 [152] 用BLASTx程序檢測核苷酸序列，BLASTx程序在蛋白序 列數(shù)據(jù)庫中比較了核酸查詢序列(兩條鏈)的六框架概念翻譯產(chǎn)物 (six-frame conceptual translation products)，令人驚訝地顯示，禾卩許多 細菌內(nèi)切纖維素酶具有非常低的相似性(不大于29%)。最高比對分 數(shù)揭示了與CelJ的527個氨基酸區(qū)有25%的同一性(132個氨基酸)， 其中CelJ是含有1601個氨基酸的酶，是C7o欣Wwm ^mwoce//,(蛋 白標(biāo)號BAA1207070.1,編號D83704.1)的celluloseme的最大催化成 分。非常可能的是，用基于己知纖維素酶基因序列的DNA探針，用 常規(guī)的方法，具有如此低的同源性的酶將不會業(yè)已被檢測到，特別是 在已經(jīng)表征的纖維素酶具有十分高度的多樣性的情況下。[153] 圖3顯示了由581個氨基酸組成的翻譯蛋白。
實施例6 酶特征分析
鹽的影響 在5ml緩沖液(20 mM TRIS-HC1, pH8.0; 500 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 0.1% Triton X-100)中懸浮含029cel基因的大腸桿菌 pBK-CMV細胞，并在冰上經(jīng)超聲降解破裂。在不同的NaCl濃度下， 在羧甲基纖維素(CMC)上經(jīng)瓊脂擴散分析，測定超聲降解的提取物。 超聲降解提取物(100/d)并將IO倍稀釋物中的一份置于在CMC-瓊 脂板中打孔的孔中，所述瓊脂板含有不同量的NaCl。在37t下孵育 板16小時，以毫米測定得到的提示纖維素水解的透明區(qū)。纖維素酶 029cel在0-25X w/vNaCl范圍內(nèi)是有活性的，盡管在25% w/vNaCl 時的活性低于在0% w/vNaCl時的活性。
pH的影響 用Grant&Tindall描述的pH-梯度板方法，研究pH對纖維 素酶活性的影響(Isolation of alkaliphilic bacteria, In : Microbial Growth and Survival in Extreme Environments, Academic Press, London, 1980, pp. 27-36)。將含有CMC的瓊脂培養(yǎng)基倒入正方形的替氏培養(yǎng)皿中1cm 深，并使其凝固。從板的邊緣切取1cm寬的統(tǒng)一的槽，將含有20% w/v Na2CO3.10H2O和0.2 M NaOH (通過在60。C混合等量的無菌0.4 M NaOH/40% w/v Na2CO3.10H2O和4% w/v瓊脂制備)的瓊脂倒入槽內(nèi)。 使板在37'C生長過夜，以允許形成從pH12至pH17的均一梯度。為 了檢測029cd纖維素酶的pH耐受性，以合適的角度穿過(瓊脂)梯 度切取窄的槽，至原來的槽，并用lml超聲降解破裂的細胞提取物充 滿。使板在37'C放置過夜。用剛果紅處理板30分鐘，以看見纖維素 水解帶。結(jié)果提示，029cel纖維素酶在達到大約pH 11.5時是有活性 的。 應(yīng)該理解，此處描述的實施例和實施方案僅是為了說明的 目的，基于它的各種修改或變化將被提示給本領(lǐng)域的技術(shù)人員，并包含在本申請的精神和見識內(nèi)以及待審的權(quán)利要求范圍內(nèi)。此處引用的 所有出版物、專利和專利申請以其整體在此并入作為參考，用于各個 論題。
權(quán)利要求
1.分離的多核苷酸，選自下列(a)核酸序列，與如SEQ ID NO1顯示序列具有至少85％的序列同一性，或者其互補序列；(b)核酸序列，其編碼或者互補于編碼029cel的多肽的序列，所述多肽與圖3(SEQ ID NO3)顯示的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性；(c)核酸序列，其編碼或者互補于編碼029cel的多肽的序列，所述多肽與圖3(SEQ ID NO3)顯示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性；(d)核酸序列，其編碼或者互補于編碼029cel的多肽的序列，所述多肽與圖3(SEQ ID NO3)顯示的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；(e)核酸序列，其編碼或者互補于編碼029cel的多肽的序列，所述多肽具有圖3(SEQ ID NO3)顯示的氨基酸序列；其中所述分離的多核苷酸編碼具有纖維素酶生物學(xué)活性的多肽，并且其中的同一性是通過MacVector版本6.5的CLUSTAL-W程序被確定的，采用缺省參數(shù)操作，包括空位開放罰分為10.0，和空位延伸罰分為0.1，和BLOSUM 30相似性矩陣。
2. 分離的多核苷酸，選自下列(a) 顯示為SEQIDNO:l的核酸序列，或者其互補序列；(b) 在高度嚴(yán)緊的條件下，與顯示為SEQIDNO:l的序列雜交的 核酸序列，或者其互補序列或其片段；(c) 顯示為SEQIDNO:2的核酸序列，或者其互補序列；和(d) 在高度嚴(yán)緊的條件下，與顯示為SEQIDNO:2的序列雜交的 核酸序列，或者其互補序列或其片段；其中所述分離的核苷酸編碼具有纖維素酶生物學(xué)活性的多肽， 并且其中雜交是在42'C下，在50%甲酰胺，6 X SSC， 5 X Denhardt's 溶液，0.5% SDS和100 pg/ml變性的載體DNA中進行的，隨后在2. X SSPE和0.5% SDS在室溫中洗滌2次，并在0.1 SSPE和0.5% SDS在42。C再洗滌2次。
3. 權(quán)利要求1所述的分離的核苷酸，其中所述核苷酸選自mRNA， DNA， cDNA，基因組DNA，及其反義類似物。
4. 權(quán)利要求3所述的分離的核苷酸，其中所述核苷酸是RNA分子。
5. 權(quán)利要求1所述的分離的核苷酸，編碼具有纖維素酶活性的酶， 其中所述的酶是從木霉來源被分離的。
6. 權(quán)利要求5所述的分離的核苷酸，其中所述的酶是從瑞氏木霉 被分離的。
7. 表達構(gòu)建物，包括編碼氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基 酸序列具有纖維素酶活性，并且(i )與SEQIDNO : 3顯示的氨基酸 序列具有至少85%的序列同一性；或者(ii)在中度至高度嚴(yán)緊的條 件下，能夠與探針雜交，所述探針被設(shè)計為，與圖2所公開的核苷酸 序列雜交，或者(iii)與核苷酸序列互補，所述核苷酸序列與編碼SEQ ID NO : 3顯示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少85%的同一性，其 中同一性是通過MacVector版本6.5的CLUSTAL-W程序被確定的， 采用缺省參數(shù)操作，包括空位開放罰分為10.0，和空位延伸罰分為0.1， 和BLOSUM 30相似性矩陣。
8. 表達載體，包括權(quán)利要求1的多核苷酸。
9. 表達載體，包括權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，有效連接于被 宿主細胞識別的調(diào)控序列，所述宿主細胞是用所述載體轉(zhuǎn)化的。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達載體，包括調(diào)節(jié)多核苷酸序列，其 包括來自游動放線菌"c" 0p/awM)葡萄糖異構(gòu)酶基因的啟動子序列， 來自鏈霉菌(&w/^m;^M)纖維素酶基因的信號序列，和編碼纖維素酶029cel的多核苷酸序列。
11. 表達載體，含有權(quán)利要求8所述的表達構(gòu)建物。
12. 用權(quán)利要求8所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
13. 權(quán)利要求12所述的宿主細胞，其為原核細胞。
14. 權(quán)利要求12所述的宿主細胞，其為真核細胞。
15. 大體上純化的029cel多肽，具有纖維素酶活性，包括選自下列 的序列(a) 與圖3 (SEQIDN0:3)顯示的氨基酸序列具有至少85%序 列同一性的氨基酸序列；(b) 與圖3 (SEQIDNO:3)顯示的氨基酸序列具有至少90%序 列同一性的氨基酸序列；(c) 與圖3 (SEQIDNO:3)顯示的氨基酸序列具有至少95%序 列同一性的氨基酸序列；(d) 圖3 (SEQIDNO:3)顯示的氨基酸序列；(e) 如SEQ ID NO : 3顯示的氨基酸序列的大體上純化的生物活 性片段；其中同一性是通過MacVector版本6.5的CLUSTAL-W程序被 確定的，采用缺省參數(shù)操作，包括空位開放罰分為10.0，和空位延 伸罰分為O.l，和BLOSUM30相似性矩陣。
16. 提供了大體上純化的029cd纖維素酶多肽或者衍生物，其可以 從桿菌(&d〃M)中得到。
17. 產(chǎn)生纖維素酶的方法，包括下列步驟(a) 在合適的條件下，合適的培養(yǎng)介質(zhì)中，培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求12 的宿主細胞，以生產(chǎn)纖維素酶；(b) 獲得所述的生成的纖維素酶。
18. 權(quán)利要求17所述的方法，其中所述宿主細胞是絲狀真菌或者酵 母細胞。
19. 權(quán)利要求17所述的方法，其中所述宿主細胞是細菌。
20. 權(quán)利要求17所述的方法，其中所述細菌是鏈霉菌.
21. 具有纖維素酶活性的純化的酶，由權(quán)利要求17所述的方法制備。
22. 重組的宿主細胞，包括029cel基因中的刪除、插入或者其它改 變，這失活所述基因并且防止029cel多肽產(chǎn)生。
23. 反義寡核苷酸，與編碼029cel多肽的信使RNA互補，所述多肽 具有SEQ ID NO : 3顯示的氨基酸序列；其中當(dāng)暴露于產(chǎn)纖維素酶 宿主細胞時，所述寡核苷酸降低或者抑制所述宿主細胞生成纖維素 酶。
24. 權(quán)利要求23的反義寡核苷酸，其中宿主細胞是絲狀真菌。
25. 洗滌劑組合物，所述組合物包括選自下列的多肽(a) 與圖3 (SEQIDNO:3)顯示的氨基酸序列具有至少85%序 列同一性的氨基酸序列；(b) 與圖3 (SEQIDNO:3)顯示的氨基酸序列具有至少90%序 列同一性的氨基酸序列；(c) 與圖3 (SEQIDNO:3)顯示的氨基酸序列具有至少95%序 列同一性的氨基酸序列；(d) 圖3SEQ ID NO : 3顯示的氨基酸序列；(e) 如SEQ ID NO : 3顯示的氨基酸序列的大體上純化的生物活 性片段；其中同一性是通過MacVector版本6.5的CLUSTAL-W程序被 確定的，采用缺省參數(shù)操作，包括空位開放罰分為10.0，和空位延伸罰分為0.1，和BLOSUM 30相似性矩陣。
26. 洗滌劑組合物，包括表面活性劑和根據(jù)權(quán)利要求15的纖維素酶。
27. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的洗滌劑，其中所述洗滌劑是洗衣店洗滌劑。
28. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的洗滌劑，其中所述洗滌劑是餐盤洗滌劑。
29. 詞料添加劑，包括根據(jù)權(quán)利要求15的纖維素酶。
30. 處理木漿的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求15所述的纖維素酶接觸 所述木漿。
31. 將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求15所述的纖維 素酶接觸所述生物質(zhì)。
32. 權(quán)利要求31所述的方法，進一步包括產(chǎn)生高果糖玉米漿。
33. 產(chǎn)生乙醇的方法，所述方法包括下列步驟(a) 用含029cel的酶組合物接觸生物材料組合物，以產(chǎn)生糖溶液;(b) 向糖溶液加入促發(fā)酵的微生物；和(c) 在足以生成乙醇的下，培養(yǎng)促發(fā)酵的微生物。
34. 鑒定新的纖維素酶的方法，包括(a) 從環(huán)境中分離總微生物群落DNA;(b) 在大腸桿菌中構(gòu)建基因組DNA文庫；(C)篩選文庫中纖維素酶活性的表達；(d) 鑒定纖維素酶陽性克隆中的纖維素酶基因；禾口(e) 描述新的纖維素酶的特征。
全文摘要
本發(fā)明提供了被命名為029cel的新穎纖維素酶的核酸序列，和相應(yīng)的029cel氨基酸序列。本發(fā)明也提供了包括編碼029cel核酸序列的表達載體和宿主細胞，重組的029cel蛋白，以及制備它們的方法。
文檔編號C12N9/42GK101410520SQ200480011154
公開日2009年4月15日 申請日期2004年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月29日
發(fā)明者B·E·瓊斯, S·希普希, S·格蘭特, W·D·格蘭特 申請人:金克克國際有限公司