專利名稱：白介素15(il－15)的特異性人抗體的制作方法
相關(guān)申請本申請要求遞交于2003年2月26日的美國系列號10/374,932和遞交于2003年3月5日的美國系列號10/379,741的優(yōu)先權(quán)，本申請還要求遞交于2002年8月23日的美國系列號10/226615和遞交于2001年8月23的美國系列號60/314731的權(quán)益，將其內(nèi)容并入本文作為參考。
背景技術(shù)：
白介素15(IL-15)是一種促炎細(xì)胞因子，一種14-15kD的糖蛋白。在多種細(xì)胞和組織中曾報(bào)道過組成型表達(dá)，所述細(xì)胞和組織包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和樹突細(xì)胞(Waldmann和Tagaya，1999；Fehniger和Caligiuri，2001)。如對于用IFN-γ和LPS刺激或用病毒、細(xì)菌或原生動物刺激的單核細(xì)胞所報(bào)道的，所述表達(dá)在炎性條件下上調(diào)(Kirman等，1998；Waldmann等，1998；Waldmann和Tagaya，1999；Fehniger和Caligiuri，2001)。而且，在慢性炎性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，局部產(chǎn)生的IL-15可能通過滑膜T細(xì)胞的募集和激活放大炎癥。已經(jīng)提出這種IL-15誘導(dǎo)的作用在疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Kirman等，1998；McInnes等，1996；McInnes等，1997；McInnes和Liew，1998；Fehniger和Caligiuri，2001)。
體外研究顯示IL-15與IL-2由于共有的受體組分而共有幾種生物學(xué)活性。在T細(xì)胞上存在的IL-15受體包括一種特有的α鏈，IL-15Rα，但是與IL-2R共有β鏈和γ鏈。結(jié)果，兩種受體都利用相同的Jak/STAT信號傳遞元件。不過，基于IL-2和IL-15及其受體的復(fù)雜調(diào)控和不同表達(dá)，已經(jīng)報(bào)道了體內(nèi)功能的顯著差異(Kirman等，1998；Waldmannand Tagaya，1999；Waldmann等，2001)。注意IL-15在天然殺傷(NK)細(xì)胞、NT-T細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞發(fā)育、存活、增殖和功能中必需的作用也是重要的(Kennedy等，2000；Liu等，2000)。
McInnes與合作者(McInnes等人，1997；McInnes and Liew，1998)報(bào)道了在源自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的T細(xì)胞中IL-15刺激之后TNF-α生產(chǎn)的誘導(dǎo)。另外，顯示IL-15激活的外周血T細(xì)胞通過細(xì)胞接觸依賴性機(jī)制誘導(dǎo)顯著的巨噬細(xì)胞的TNF-α生產(chǎn)。由于TNF-α在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的破壞性作用，這種細(xì)胞因子的抑制降低了疾病的活性(Bathon等，2000；Klippel，2000；Lovell等，2000；Maini和Taylor，2000)。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于特異性結(jié)合人IL-15和抑制由IL-15誘導(dǎo)的促炎作用的完全的人單克隆抗體的首次產(chǎn)生和分離，以及這些新抗體的特征和它們的在治療多種IL-15介導(dǎo)疾病中的治療價(jià)值的證明。例如，如本文所描述的，已經(jīng)顯示人抗體抑制TNFα的產(chǎn)生和T細(xì)胞增殖，二者都固有地包括在炎癥中。因此，本發(fā)明的人抗體提供一種治療和預(yù)防這類病癥(和任何其它IL-15介導(dǎo)的病癥)的改進(jìn)方法，部分歸因于它們特有的特異性(例如，表位和物種特異性)、親和力、結(jié)構(gòu)、功能活性和它們是完全是人抗體的事實(shí)，這使得當(dāng)向人類患者施用時(shí)它們比以往制備的其它IL-15抗體(例如，鼠和人源化抗體)顯著地更少具有免疫原性并且在治療上更加有效。本發(fā)明還基于諸如本文所述抗體的IL-15抑制性抗體的新治療用途的發(fā)現(xiàn)，包括炎性疾病，諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、移植排斥和癌癥的治療。
本發(fā)明的分離的人抗體包括多種抗體同種型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。一般，它們包括IgG1(例如，IgG1k)、IgG3和IgM同種型。所述抗體能夠是全長的(例如，IgG1或IgG3抗體)或者能夠只包括抗原結(jié)合部分(例如，F(xiàn)ab、F(ab′)2、Fv、單鏈Fv片段、分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或兩種或多種分離的CDRs的組合)。
在一種實(shí)施方案中，所述人抗體是重組人抗體。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述人抗體是由人IgG重鏈和人κ輕鏈核酸編碼的，所述核酸分別在其可變區(qū)包含如在SEQ ID NO1和SEQ ID NO3中所示的核苷酸序列，及其保守性序列修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述人抗體包括IgG重鏈和κ輕鏈區(qū)，其分別包含在SEQ ID NO2和SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列，及其保守性序列修飾。
本發(fā)明的人抗體能夠在宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生，如包含編碼所述抗體的重鏈和輕鏈的核酸的轉(zhuǎn)染瘤(例如，由永生化CHO細(xì)胞或淋巴細(xì)胞組成的轉(zhuǎn)染瘤)，或者直接從表達(dá)所述抗體的雜交瘤(例如，它包括融合到一個(gè)永生化細(xì)胞的、從轉(zhuǎn)基因非人動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的B細(xì)胞，所述小鼠具有包含編碼所述抗體的人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組)獲得。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，通過本文稱作146B7的雜交瘤或通過含有人重鏈和人輕鏈核酸的宿主細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞)轉(zhuǎn)染瘤生產(chǎn)所述抗體，所述人重鏈和人輕鏈核酸分別在其可變區(qū)包含如在SEQ ID NO1和SEQ ID NO3中所示的核苷酸序列，及其保守性修飾。在特定的實(shí)施方案中，由本文稱作146B7，146H5，404E4和404A8的雜交瘤生產(chǎn)所述抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合于位于IL-15的β-和/或γ-鏈相互作用域上的表位。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人抗體特異性結(jié)合于人IL-15并抑制IL-15誘導(dǎo)促炎作用的能力，例如，在IL-15結(jié)合于IL-15受體之后，抑制TNFα的產(chǎn)生和/或抑制諸如PBMC或CTLL-2 T細(xì)胞的T細(xì)胞的增殖。一般，當(dāng)通過表面等離子共振(SPR)技術(shù)在BIACORE 3000儀器中利用重組人IL-15作為分析物而抗體作為配體進(jìn)行測定時(shí)，人抗體以小于大約10-7M，如小于大約10-8M，10-9M或10-10M或甚至更低的解離平衡常數(shù)(KD)結(jié)合于IL-15。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述抗體以大約6.5×10-8M的解離平衡常數(shù)(KD)結(jié)合于人IL-15。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種特異性結(jié)合人IL-15的分離的人單克隆抗體，包含選自下列的至少一種CDR序列(i)SEQ ID NOs5，6，7，8，9和10；(ii)與在(i)中定義的序列具有至少90％同源性，優(yōu)選至少95％同源性，更加優(yōu)選至少98％，或至少99％同源性的序列；和(iii)在(i)或(ii)中定義的序列的片段，其保持特異性結(jié)合人IL-15的能力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種特異性結(jié)合人IL-15的分離的人單克隆抗體，包含
(i)SEQ ID NO7；(ii)與SEQ ID NO7具有至少90％同源性，優(yōu)選至少95％同源性，更加優(yōu)選至少98％，或至少99％同源性的序列；或(iii)在(i)或(ii)中定義的序列的片段，其保持特異性結(jié)合人IL-15的能力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種特異性結(jié)合人IL-15的分離的人單克隆抗體，包含(i)SEQ ID NOs5和8；(ii)SEQ ID NOs6和9；(iii)SEQ ID NOs7和10；(iv)與在(i)、(ii)或(iii)中定義的序列具有至少90％同源性，優(yōu)選至少95％同源性，更加優(yōu)選至少98％，或至少99％同源性的序列；或(v)在(i)、(ii)、(iii)或(iv)中定義的序列的片段，其保持特異性結(jié)合人IL-15的能力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種特異性結(jié)合人IL-15的分離的人單克隆抗體，包含選自下列的至少四種CDRs(i)SEQ ID NOs5，6，7，8，9或10；(ii)與在(i)中定義的序列具有至少90％同源性，優(yōu)選至少95％同源性，更加優(yōu)選至少98％，或至少99％同源性的序列；和(iii)在(i)或(ii)中定義的序列的片段，其保持特異性結(jié)合人IL-15的能力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種特異性結(jié)合人IL-15的分離的人單克隆抗體，包含(i)SEQ ID NOs5，6，7，8，9或10；(ii)與在(i)中定義的序列具有至少90％同源性，優(yōu)選至少95％同源性，更加優(yōu)選至少98％，或至少99％同源性的序列；或(iii)在(i)或(ii)中定義的序列的片段，其保持特異性結(jié)合人IL-15的能力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種分離的特異性結(jié)合人IL-15的人單克隆抗體，包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2；或與SEQ IDNO2具有至少90％同源性，優(yōu)選至少95％同源性，更加優(yōu)選至少98％，或至少99％同源性的序列的輕鏈可變區(qū)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種分離的特異性結(jié)合人IL-15的人單克隆抗體，包含具有氨基酸序列SEQ ID NO4；或與SEQ IDNO4具有至少90％同源性，優(yōu)選至少95％同源性，更加優(yōu)選至少98％，或至少99％同源性的序列的輕鏈可變區(qū)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種分離的特異性結(jié)合人IL-15的人單克隆抗體，它通過特異性結(jié)合位于人IL-15的γ鏈相互作用域上的表位，經(jīng)由IL-15Rγ-鏈抑制順式信號傳遞，并且它抑制相鄰細(xì)胞上的反式信號傳遞，所述相鄰細(xì)胞表達(dá)γ鏈或β和γ鏈作為IL-15R或另一種細(xì)胞因子受體的部分。
還在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的人單克隆抗體特異性結(jié)合人IL-15并干擾IL-15受體α，β和γ鏈組裝和/或抑制在相鄰細(xì)胞上的組裝，所述相鄰細(xì)胞表達(dá)β和γ鏈作為IL-15受體或另一種細(xì)胞因子受體的部分。
在另一方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分的核酸分子。因此，包括本發(fā)明編碼抗體的核酸的重組表達(dá)載體，和用這種載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞也被本發(fā)明所包括，如同通過培養(yǎng)這些宿主細(xì)胞制備本發(fā)明的抗體的方法一樣。
本發(fā)明還涉及一種表達(dá)載體，它包含編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，所述重鏈和輕鏈可變區(qū)分別包含如在SEQ ID NO2和SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列，及其保守性修飾。這種表達(dá)載體是本領(lǐng)域公知的。關(guān)于這點(diǎn)的例子包括利用，例如，網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯載體。
還在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供來自轉(zhuǎn)基因非人動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠的分離的B細(xì)胞，所述B細(xì)胞能夠表達(dá)多種特異性結(jié)合于IL-15的人單克隆抗體的同種型(例如，IgG，IgA和/或IgM)。優(yōu)選地，所述分離的B細(xì)胞從一種轉(zhuǎn)基因非人動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得，所述小鼠已經(jīng)用純化的或富集的IL-15抗原和/或表達(dá)IL-15的細(xì)胞進(jìn)行過免疫。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因非人動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠，具有一個(gè)包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。隨后將分離的B細(xì)胞進(jìn)行永生化以提供抗IL-15的人單克隆抗體的來源(例如，雜交瘤)。
因此，本發(fā)明還提供一種能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合IL-15的人單克隆抗體的雜交瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雜交瘤包括融合到一個(gè)永生化細(xì)胞的、從轉(zhuǎn)基因非人動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的B細(xì)胞，所述小鼠具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。所述轉(zhuǎn)基因非人動物能夠用純化的或富集的IL-15抗原的制劑和/或表達(dá)IL-15的細(xì)胞進(jìn)行免疫以生成產(chǎn)生抗體的雜交瘤。本發(fā)明提供的特定雜交瘤包括146B7，146H5，404E4和404A8。
還在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因非人動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠，它表達(dá)特異性結(jié)合IL-15的人單克隆抗體抗體。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因非人動物是一種具有一個(gè)包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠。所述轉(zhuǎn)基因非人動物能夠用純化的或富集的IL-15抗原的制劑和/或表達(dá)IL-15的細(xì)胞進(jìn)行免疫。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因非人動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠，能夠通過進(jìn)行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生多種抗IL-15的人單克隆抗體同種型(例如，IgG，IgA和/或IgM)。同種型轉(zhuǎn)換可以通過，例如，經(jīng)典的或非經(jīng)典的同種型轉(zhuǎn)換發(fā)生。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)與IL-15特異性反應(yīng)的人單克隆抗體的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括用純化的或富集的IL-15抗體的制劑和/或表達(dá)IL-15的細(xì)胞免疫一種轉(zhuǎn)基因非人動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠，所述轉(zhuǎn)基因非人動物具有一個(gè)包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。隨后獲得動物的B細(xì)胞(例如，脾B細(xì)胞)并與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成永生化的雜交瘤細(xì)胞，其分泌抗IL-15的人單克隆抗體。
在另一方面，本發(fā)明對人IL-15抗體進(jìn)行特征描述，所述抗體偶聯(lián)到治療性部分上，例如，細(xì)胞毒性藥物、酶活性毒素或其片段、放射性同位素或小分子抗癌藥物。
在另一方面，本發(fā)明提供組合物，例如藥物或診斷組合物，其包含一種可藥用的載體和至少一種特異性結(jié)合于IL-15的本發(fā)明的人單克隆抗體。所述組合物能夠進(jìn)一步包括其它治療劑，如其它免疫抑制劑，或化療劑。
還在另一方面，本發(fā)明提供利用一種或多種本發(fā)明的人抗體抑制IL-15的促炎作用的方法，如抑制IL-15誘導(dǎo)的TNFα生產(chǎn)和/或T細(xì)胞增殖，優(yōu)選不會抑制結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)/細(xì)胞因子(例如，IL-2)的活性(例如，TNFα生產(chǎn)和/或T細(xì)胞增殖)。
通過向患這類疾病的患者施用所述抗體，能夠使用本發(fā)明的人抗體治療和/或預(yù)防多種IL-15介導(dǎo)的疾病。
能夠利用本發(fā)明的方法和組合物治療(例如，改善)或預(yù)防的示范性疾病包括，但不限于，炎性病癥，如關(guān)節(jié)炎(例如，牛皮癬關(guān)節(jié)炎和包括活動性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)和幼年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)，炎性腸病。例如，已經(jīng)顯示所述抗體減輕角化不全、減小表皮厚度和減少牛皮癬中角質(zhì)細(xì)胞的增殖。還已經(jīng)顯示所述抗體減弱炎癥和/或預(yù)防涉及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的活化白細(xì)胞的趨化性。所述抗體還能夠用來治療感染疾病，如HIV感染。另外，所述抗體能夠用來治療移植排斥。因此，本發(fā)明的人單克隆抗體可以對于正在進(jìn)行或曾經(jīng)進(jìn)行過器官或組織移植的患者有用，所述器官或組織移植如心、肺、心-肺的聯(lián)合、氣管、腎、肝、胰、食管、腸、皮膚、四肢移植，臍帶移植，干細(xì)胞移植，胰島細(xì)胞移植等。
因而本發(fā)明的抗體可以用于同種異體移植和異種移植排斥的預(yù)防或用來逆轉(zhuǎn)、治療或否則改善急性同種異體移植或異種移植排斥情況。
能夠進(jìn)行治療的其它疾病包括移植物抗宿主疾病，例如輸血移植物抗宿主疾病和骨髓移植物抗宿主。還要進(jìn)一步地，所述抗體能夠用來治療多種涉及IL-15介導(dǎo)的新血管形成的疾病，如腫瘤生長和癌癥，例如T細(xì)胞白血病。具有增長的血管生成的其它例子包括炎性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種治療或預(yù)防病癥的方法，包括給受試者施用治療或預(yù)防所述病癥有效量的根據(jù)本發(fā)明的抗體，所述病癥與人IL-15的超量表達(dá)相關(guān)聯(lián)，和/或其中人IL-15誘導(dǎo)的作用的下調(diào)或抑制是有益的。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥選自關(guān)節(jié)炎，如強(qiáng)直性脊柱炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、骶髂關(guān)節(jié)炎(sacroileitis)和成人Still’s病；
結(jié)締組織病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、盤狀狼瘡、中樞神經(jīng)系統(tǒng)狼瘡、狼瘡腎炎、結(jié)節(jié)病、CNS結(jié)節(jié)病和多肌炎/皮肌炎；眼科病癥，如色素層炎和choreoritinitis；神經(jīng)系統(tǒng)病癥，如脊髓病/熱帶痙攣性癱瘓、重癥肌無力、宮頸癌、橫紋肌肉瘤、Ewing肉瘤和多發(fā)性硬化癥；胃腸和肝病，如急性重型肝炎、coeliaki、術(shù)后腸結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏??；變應(yīng)性病癥，如支氣管哮喘；血液系統(tǒng)病癥，如T細(xì)胞成淋巴母細(xì)胞白血病、成人T細(xì)胞白血病、Sezary綜合征、慢性淋巴細(xì)胞白血病、蕈樣肉芽腫病、前體B細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤、慢性髓細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病、大顆粒淋巴細(xì)胞增多、大顆粒淋巴細(xì)胞白血病、骨髓瘤、漿細(xì)胞瘤、漿細(xì)胞骨髓瘤、重鏈疾病(包括γ，μ和α疾病)，結(jié)節(jié)外天然殺傷細(xì)胞/T細(xì)胞淋巴瘤和攻擊性天然殺傷細(xì)胞白血??；皮膚病癥，如過敏性接觸性excema、大皰性類天皰瘡、燒傷后肥厚性瘢痕和紅苔蘚；肺病，如慢性阻塞性肺疾病、成纖維性肺泡炎和急性呼吸窘迫綜合征；惡性腫瘤，如結(jié)腸癌和惡性黑素瘤；源于移植的病癥，如同種異體移植和異種移植排斥，以及移植物抗宿主疾??；內(nèi)分泌病癥，如自身免疫性甲狀腺炎和格雷夫斯?。谎懿“Y，如Wegener肉芽腫病、細(xì)微多血管炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、巨細(xì)胞動脈炎和動脈粥樣硬化；婦產(chǎn)科病癥，如復(fù)發(fā)的自發(fā)流產(chǎn)和子宮內(nèi)膜異位癥；和感染性疾病，如敗血癥和AIDS。
還在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥選自強(qiáng)直性脊柱炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，潰瘍性結(jié)腸炎，同種異體移植排斥和移植物抗宿主疾病。
本發(fā)明的人抗體還可以與一種或多種其它治療劑相組合，如抗炎劑、DMARDs(病癥改進(jìn)性抗風(fēng)濕藥物)、免疫抑制劑、化療劑和牛皮癬劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，還可以加用一種或多種增強(qiáng)所述抗體促炎作用的抑制的藥劑治療受劑者，所述藥劑例如，抗炎劑，如，甾體類藥物或NSAID(非甾體類抗炎藥物)。優(yōu)選的藥劑包括，例如，阿司匹林和其它水楊酸鹽，Cox-2抑制劑，如羅非克西(Vioxx)和塞來克西(Celebrex)，NSAIDs如布洛芬(Motrin，Advil)，苯氧布洛芬(Nalfon)，萘普生(Naprosyn)，舒林酸(Clinoril)，雙氯芬酸(Voltaren)，吡羅昔康(Feldene)，酮洛芬(Orudis)，二氟尼柳(Dolobid)，萘丁美酮(Relafen)，依托度酸(Lodine)，奧沙普嗪(Daypro)和吲哚美辛(Indocin)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人抗體能夠與一種或多種DMARDs組合給藥，如氨甲喋呤(Rheumatrex)，羥化氯喹(Plaquenil)，柳氮磺胺吡啶(Asulfidine)，嘧啶合成抑制劑，例如來氟米特(Arava)，IL-1受體阻斷劑，例如ahakinra(Kineret)，和TNF-α阻斷劑，例如etanercept(Enbrel)，英夫單抗(Remicade)和adalimumab。
其它的例子是IL-10、可溶性IL-15R、抗-IL6R抗體、CTLA4Ig和抗CD20抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人抗體能夠與一種或多種免疫抑制劑組合給藥，如環(huán)孢霉素(Sandimmune，Neoral) 和硫唑嘌呤(Imural)。
其它的例子為霉酚酸、霉酚酸莫非替克(mycophenolatemofetil)、皮質(zhì)類固醇，如強(qiáng)的松、氨甲蝶呤、金鹽、柳氮磺胺吡啶、抗瘧藥、brequinar、來氟米特、咪唑立賓、15-去氧精胍素、6-巰基嘌呤、環(huán)磷酰胺、雷帕霉素、免疫抑制劑(FK-506)和抗胸腺細(xì)胞球蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人抗體可以與兩種或多種免疫抑制劑組合給藥，如強(qiáng)的松和環(huán)孢霉素；強(qiáng)的松、環(huán)孢霉素和硫唑嘌呤；或強(qiáng)的松、環(huán)孢霉素和霉酚酸莫非替克(mycophenolate mofetil)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人抗體可以與一種或多種化療劑組合給藥，如阿霉素(Adriamycin)，順鉑(Platinol)，博來霉素(Blenoxane)，卡莫司汀(Gliadel)，環(huán)磷酰胺(Cytoxan，Procytox，Neosar)，和苯丁酸氮芥(Leukeran)。本發(fā)明的人抗體可以結(jié)合放療進(jìn)行給藥。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人抗體可以與一種或多種治療牛皮癬的藥劑組合給藥，如包含煤焦油的局部藥物，維生素A，可的松或其它皮質(zhì)類固醇，口服或注射的藥物，如皮質(zhì)類固醇，氨甲蝶呤，維生素A類，例如acicretin(Neogitason)或環(huán)孢霉素(Sandimmune，Neoral)。其它治療可以包括暴露于陽光下或光療。
其它的實(shí)例是蒽環(huán)霉素，calcipotrien，tarazotene，etanercept，alefacept，efalizumab，6-硫鳥嘌呤，霉酚酸莫非替克，藤霉素(FK-506)，和羥基脲。其它實(shí)例是CTLA4Ig和英夫單抗。其它治療可以包括UVB(寬波和窄波紫外線B)，UVA(紫外線A)和PUVA(補(bǔ)骨脂素methoxalen加紫外線A)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物結(jié)合兩種或多種以上療法進(jìn)行給藥，如氨甲蝶呤+光療(PUVA或UVA)；氨甲蝶呤+阿昔曲??；阿昔曲丁+光療(PUVA或UVA)；氨甲蝶呤+阿昔曲丁+光療(PUVA或UVB；羥基脲+光療(PUVA或UVB)；羥基脲+阿昔曲??；環(huán)孢霉素+氨甲蝶呤；或calcipotrien+光療(UVB)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人抗體能夠與其它抗體組合給藥，如CD4特異性抗體和IL-2特異性抗體。本發(fā)明抗體與CD4特異性抗體或IL-2特異性抗體的組合被認(rèn)為對于治療自身免疫疾病和移植排斥特別有用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以與其它抗體組合給藥，例如，其它免疫抑制性人單克隆抗體，如結(jié)合于例如，MHC，CD2，CD3，CD7，CD28，B7，CD40，CD45，IFN-γ，TNF-α，IL-2R，IL-4，IL-5，IL-6R，IL-7，IL-8，IL-10，CD11a，CD20或CD58或其配體的抗體；或其它免疫調(diào)節(jié)性化合物，例如，可溶性IL-15R或IL-10。
還在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種體外或體內(nèi)檢測樣品中IL-15抗原的存在的方法，以便例如，診斷IL-15介導(dǎo)的疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，這通過在允許形成抗體與IL-15之間復(fù)合物的條件下，將待試驗(yàn)樣品與對照樣品一起和本發(fā)明的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分相接觸來實(shí)現(xiàn)。隨后在兩種樣品中檢測復(fù)合物的形成(例如，利用ELISA)，樣品之間復(fù)合物形成的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異都是試驗(yàn)樣品中IL-15抗原存在的指征。
由下列詳述和權(quán)利要求本發(fā)明的其它特征和益處是顯而易見的。
附圖簡述

圖1包括了顯示人IL-15特異性抗體146B7，147H5，404A8和404E4結(jié)合于人IL-15(hIL-15) 和突變IL-15蛋白Q108S和D8SQ108的圖。在ELISA中檢查抗體的系列稀釋物與hIL-15或突變IL-15蛋白D8SQ108S和Q108S的結(jié)合。
圖2和3分別顯示來自抗體146B7的VH和VL區(qū)的氨基酸(SEQ IDNOs2和4)和核苷酸(SEQ ID NOs1和3)序列。指出構(gòu)架(FR)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。
圖4A-D包括顯示抗體146B7進(jìn)行的IL-15介導(dǎo)的TNF-α釋放的抑制的圖。用hIL-15(0，50，100ng/ml)組合146B7抗體或一種同種型對照抗體(0.1，1，10μg/ml)對人PBMC進(jìn)行孵育72小時(shí)。通過ELISA測量產(chǎn)生的TNF-α的量。顯示來自兩個(gè)健康志愿者的數(shù)據(jù)。
圖5是顯示抗體146B7對于IL-2或IL-15介導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)的作用的圖。用hIL-15(0，50，100ng/ml) 或用hIL-2(100ng/ml)結(jié)合以146B7(0.1，1，10μg/ml)對人PBMC進(jìn)行孵育72小時(shí)。通過ELISA測量產(chǎn)生的TNF-α的量。
圖6是顯示抗體146B7，146H5，404E4和404A8對于hIL-15誘導(dǎo)的CTLL-2增殖的抑制活性的圖。用hIL-15(60pg/ml) 結(jié)合以146B7，146H5，404E4和404A8的系列稀釋物對缺乏hIL-2的CTLL-2細(xì)胞進(jìn)行孵育48小時(shí)。測量[3H]-胸苷摻入以表示增殖(cpm)。結(jié)果表示為平均值。
圖7-9包括顯示抗體146B7(圖7)，404E4(圖8) 和404A8(圖9)對于IL-15誘導(dǎo)的PBMC增殖的抑制性活性的圖。用hIL-15(0，25，100ng/ml；分別為圖7A、8A和9A)或hIL-2(0，10，100ng/ml；分別為圖7B，8B，和9B)結(jié)合0.1、1、10μg/ml的146B7(圖7)、404E4(圖8)或404A8(圖9)對人PBMC進(jìn)行孵育72小時(shí)。測量[3H]-胸苷摻入以表示增殖(cpm)。
圖10是顯示抗體146B7結(jié)合于IFNγ刺激的單核細(xì)胞的圖。在IFNγ(500U/ml)存在的情況下培養(yǎng)人PBMCs最多達(dá)2天(37℃)。在分析后通過流式細(xì)胞分析和對單核細(xì)胞的門控測定至少5000細(xì)胞/樣品的熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)顯示刺激指數(shù)(S.I.＝(平均熒光陽性染色)/(平均熒光背景染色))。
圖11顯示人單核細(xì)胞與抗體146B7(圖片B)或與同種型對照抗體(圖片A)的結(jié)合。在用IFNγ(500U/ml)培養(yǎng)細(xì)胞之后分離人PBMCs并制備細(xì)胞沉淀物。用蘇木精對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染。
圖12顯示人牛皮癬皮膚與146B7(圖片B)或與同種型對照抗體(hIgG1)(圖片A)的結(jié)合。在知情同意之后從患者中獲得人銀屑斑，并保存于-80℃待分析。用生物素化的抗體對組織進(jìn)行染色并在辣根過氧化酶激活之后進(jìn)行顯影。
圖13A是顯示在用146B7或賦形劑處理SCID小鼠之后類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎組織中具核細(xì)胞的百分比的圖。用蘇木精和曙紅(H&E)對組織進(jìn)行染色并用Photo Shop 6.0版進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)顯示為在146B7處理(n＝4) 或賦形劑處理(n＝2)之后小鼠的核的平均數(shù)和s.e.m.。圖13B和13C顯示在用146B7(圖13C)或用PBS(圖13B)處理之后，在SCID小鼠中異種移植的RA組織的代表性H&E染色。
圖14包括顯示在SCID/牛皮癬小鼠中抗體146B7治療效果的圖。將活檢組織固定于福爾馬林中進(jìn)行石蠟包埋并在H&E中染色并且用于Ki-67核抗原。圖14A顯示通過表皮評估的牛皮癬的嚴(yán)重性，其是從角質(zhì)層到皮釘(rete pegs)的開始部分進(jìn)行測量的。圖14B顯示從角質(zhì)層到皮釘?shù)淖钌畈糠譁y量的表皮厚度。圖14C顯示角化不全的等級。圖14D顯示上層真皮中炎性單核細(xì)胞的數(shù)目。圖14E顯示Ki-67+循環(huán)角質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目。
圖15顯示在用抗體146B7(圖片C)，用CsA(圖片B)，或用賦形劑(圖片A)處理之后，在SCID小鼠中移植的人牛皮癬皮膚的H&E染色。移植后三周，小鼠每兩天以10mg/kg的劑量接受PBS(placebo)，CsA(環(huán)孢霉素A)(Sandoz)持續(xù)15天，或者在第1天以20mg/kg的劑量和在第8和15天以10mg/kg的劑量接受146B7。最后一次注射后一周，處死小鼠，從每個(gè)異種移植物中取4mm的針刺生物活檢組織。將活檢組織固定于福爾馬林中進(jìn)行石蠟包埋并在H&E中染色。
圖16顯示在用抗體146B7(圖片C)，用CsA(圖片B)，或用賦形劑(圖片A)處理之后，在SCID小鼠中移植的人牛皮癬皮膚的Ki-67染色。移植后三周，小鼠每兩天以10mg/kg的劑量接受PBS(安慰劑)，CsA(環(huán)孢霉素A)(Sandoz)持續(xù)15天，或者在第1天以20mg/kg的劑量和在第8和15天以10mg/kg的劑量接受146B7。最后一次注射后一周，處死小鼠，從每個(gè)異種移植物中取4mm的針刺生物活檢組織。將活檢組織固定于福爾馬林中進(jìn)行石蠟包埋并在Ki-67中染色。
圖17是顯示抗體146B7結(jié)合于受體結(jié)合的IL-15的圖。用IL-15Rα涂布平板并用IL-15進(jìn)行孵育。10分鐘后，將生物素化的146B7加到孔中。在ELISA讀數(shù)器中于405nm評估146B7與受體結(jié)合的IL-15的結(jié)合。
圖18是顯示在IL-15結(jié)合于Raji細(xì)胞上表達(dá)的其受體之后，抗體146B7結(jié)合于IL-15的圖。在表達(dá)IL-15R的Raji細(xì)胞與IL-15一起孵育之后，10分鐘以后向細(xì)胞中加入生物素化的146B7。通過FACS分析來評估146B7與受體結(jié)合的IL-15的結(jié)合。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了新的基于抗體的療法，用于治療和診斷多種由IL-15介導(dǎo)的病癥(即，由IL-15的促炎作用所引起的病癥)。如本文所用的，術(shù)語“IL-15的促炎作用”包括由IL-15誘導(dǎo)的任何體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，如TNFα和其它炎性介質(zhì)的生產(chǎn)，以及T細(xì)胞的募集/增殖。本發(fā)明的療法采用分離的人單克隆抗體，它特異性結(jié)合于存在于IL-15上的表位。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在非人轉(zhuǎn)基因動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠中生產(chǎn)人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動物能夠通過進(jìn)行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換生產(chǎn)多種抗IL-15的人單克隆抗體的同種型(例如，IgG，IgA和/或IgE)。因此，本發(fā)明的各個(gè)方面包括抗體及其藥物組合物，以及用于生產(chǎn)這種單克隆抗體的非人轉(zhuǎn)基因動物、B細(xì)胞、宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤和雜交瘤。利用本發(fā)明的方法檢測結(jié)合IL-15，和/或在體外或體內(nèi)抑制IL-15介導(dǎo)的功能的方法，也為本發(fā)明所包括。還包括將試劑靶向結(jié)合IL-15的細(xì)胞的方法。
為了可以更加容易地理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語。其它的定義在整個(gè)詳述中給出。
本文中術(shù)語″IL-15，”“IL-15抗原”和“白介素15”可交換使用，并且包括任何由細(xì)胞天然表達(dá)的變體或同功型。
如本文所稱的術(shù)語“抗體”包括完整的抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或單鏈?！翱贵w”是指包括至少兩條由二硫鍵內(nèi)部連接的重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白。每條重鏈包括一個(gè)重鏈可變區(qū)(這里縮寫為VH)和一個(gè)重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域，CH1，CH2和CH3組成。每條輕鏈由一個(gè)輕鏈可變區(qū)(這里縮寫為VL)和一個(gè)輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域，CL組成。VH和VL區(qū)可以被進(jìn)一步分為稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的超變區(qū)，中間鑲嵌更保守的區(qū)域，叫做構(gòu)架區(qū)(FR)。每條VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，從氨基端到羧基端以下列順序排列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含一個(gè)與抗原相互作用的結(jié)合域。抗體的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)的結(jié)合。
本文所使用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱為“抗體部分”)是指保持與抗原(如EGFR)特異性結(jié)合能力的抗體的一個(gè)或更多片段。已經(jīng)介紹過抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長抗體的片段來完成。在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部位”范圍內(nèi)的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，即由VL，VH，CL和CHI結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab′)2片段，即包含兩個(gè)由鉸鏈區(qū)的二硫橋連接的Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體一個(gè)單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)由一個(gè)VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward et al，(1989)Nature 341544-546)；以及(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由各自的基因編碼，它們可以用重組方法通過合成的接頭連接，合成接頭使它們可以作為單蛋白鏈產(chǎn)生，其中VL和VH區(qū)配對形成單價(jià)分子(稱作單鏈Fv(scFv)；見Bird et al(1988)Science242423-426；及Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。這種單鏈抗體也意欲包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”范圍中。這些抗體片段用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的傳統(tǒng)技術(shù)獲得，為使用而進(jìn)行的片段篩選與完整抗體的方法相同。
本文所使用的術(shù)語“單克隆抗體”表示表現(xiàn)出對一種特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力的抗體。因此，術(shù)語“人單克隆抗體”是指具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)并表現(xiàn)出單結(jié)合特異性的抗體。在一種實(shí)施方案中，人單克隆抗體由包含一個(gè)從轉(zhuǎn)基因非人動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的B細(xì)胞與永生化細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜交瘤產(chǎn)生，轉(zhuǎn)基因小鼠有一個(gè)包含一個(gè)人類重鏈轉(zhuǎn)基因和一個(gè)人類輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。
如本文所用的術(shù)語“重組人抗體″意欲包括所有用重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的人抗體，如(a)從轉(zhuǎn)基因?yàn)槿嗣庖咔虻鞍谆虻膭游?如小鼠)或由其制備的雜交瘤中分離的抗體(在下面的第一部分詳述)；(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化而表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞，如轉(zhuǎn)染瘤分離的抗體，(c)由重組組合人抗體文庫分離的抗體，和(d)用其它涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。所述重組人抗體來源于人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)。然而在某些實(shí)施方案中，這種重組人抗體經(jīng)歷了體外誘變(或，當(dāng)使用轉(zhuǎn)基因?yàn)槿薎g序列的動物時(shí)，體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體VH和VL區(qū)的氨基酸序列來源于人種系VH和VL序列并與其相關(guān)，可能在體內(nèi)并不天然存在于人抗體種系的所有組成成分。
如本文所用的，“異源抗體”是與產(chǎn)生這種抗體的轉(zhuǎn)基因非人生物相聯(lián)系而定義的。此術(shù)語是指這樣一種抗體，它具有與存在于不構(gòu)成轉(zhuǎn)基因非人動物的生物中的氨基酸序列或編碼核酸序列相對應(yīng)，并一般是從轉(zhuǎn)基因非人動物以外的物種獲得的氨基酸序列或編碼核酸序列。
如本文所用的，“分離的抗體”意在表示基本上不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體(例如，特異性結(jié)合IL-15的分離的抗體基本上不含特異性結(jié)合除了IL-15以外的抗原的抗體)。不過，特異性結(jié)合IL-15表位的分離的抗體可能具有對其它相關(guān)細(xì)胞因子或其它來自不同物種的IL-15蛋白的交叉反應(yīng)性。但是，所述抗體優(yōu)選總是結(jié)合人IL-15。此外，分離的抗體一般基本上不含其它細(xì)胞材料和/或化合物。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，在一種充分定義的組合物中將具有不同IL-15特異性的“分離的”單克隆抗體組合在一起。
如本文所用的，術(shù)語“特異性結(jié)合”是指抗體與預(yù)定的抗原結(jié)合。一般，抗體以低于約1×107M-1，如大約低于10-8M，10-9M或10-10M或甚至更低的親和力(KD)結(jié)合，這是通過表面等離子共振(SPR)技術(shù)在BIACORE3000儀器中測定，其中使用重組的人IL-15作為分析物，并且將抗體作為配體，并且與預(yù)定抗原結(jié)合的親和力至少比與預(yù)定抗原或密切相關(guān)抗原以外的非特異性抗原(如BSA，酪蛋白)的親和力大兩倍。短語“識別抗原的抗體”和“抗原的特異性抗體”在這里可以與術(shù)語“特異性與抗原結(jié)合的抗體”互換使用。
如本文所用的，術(shù)語“KD″意指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)。
如本文所用的，“同種型”表示由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類型(例如，IgM或IgG1)。
如本文所用的，“同種型轉(zhuǎn)換”表示一種抗體的類型或同種型從一種Ig類型轉(zhuǎn)變成另一種Ig類型的現(xiàn)象。
如本文所用的，“非轉(zhuǎn)換同種型”是指在沒有發(fā)生同種型轉(zhuǎn)換的情況下產(chǎn)生的重鏈同種型類型；編碼非轉(zhuǎn)換同種型的CH基因一般是功能性重排的VDJ基因下游的第一個(gè)CH基因。同種型轉(zhuǎn)換被分類為經(jīng)典或非經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換。經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換是通過涉及轉(zhuǎn)基因中至少一個(gè)轉(zhuǎn)換序列區(qū)的重組事件而發(fā)生的。非經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換可以通過例如在人σμ和人∑μ之間的同源重組(伴δ缺失)而發(fā)生。其它非經(jīng)典轉(zhuǎn)換機(jī)制，如轉(zhuǎn)基因間和/或染色體間重組及其它機(jī)制，可以發(fā)生并完成同種型轉(zhuǎn)換。
如本文所用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)換序列”是指那些負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)換組合的DNA序列?！稗D(zhuǎn)換供體”序列，一般是一個(gè)μ轉(zhuǎn)換區(qū)，將處在轉(zhuǎn)換重組過程中被去除的結(jié)構(gòu)區(qū)的5′(上游)?！稗D(zhuǎn)換受體”區(qū)將在將被去除的結(jié)構(gòu)區(qū)和替代恒定區(qū)(如γ，ε等)之間。由于不存在重組經(jīng)常發(fā)生的特定位點(diǎn)，從結(jié)構(gòu)一般不能預(yù)測最終的基因序列。
如本文所用的，“糖基化模式”被定義為與蛋白，更具體地說是免疫球蛋白共價(jià)連接的糖單位模式。當(dāng)本領(lǐng)域技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)異源抗體的糖基化模式與轉(zhuǎn)基因的CH基因所來源的物種相比，與非人轉(zhuǎn)基因動物物種的糖基化模式更相似時(shí)，異源抗體糖基化模式的特征可以在于基本上與非人轉(zhuǎn)基因動物物種產(chǎn)生的抗體的上天然存在的糖基化模式相似。
如本文所用的，應(yīng)用于一種對象的術(shù)語“天然存在的”是指某種對象可以在自然中發(fā)現(xiàn)。例如，可以從天然來源中分離并沒有通過人在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行有意的修飾的生物(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列就是天然存在的。
如本文所用的術(shù)語“重排的”是指一條重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的一種構(gòu)型，其中的V段在分別編碼基本上完整的VH或VL結(jié)構(gòu)域的一種構(gòu)象中緊鄰D-J或J段。重排的免疫球蛋白基因座可以通過與種系DNA比較而識別；重排基因座將有至少一個(gè)重組的七聚體/九聚體同源元件。
如本文所用的關(guān)于V片段的術(shù)語“未重排的”或“種系構(gòu)型”是指V段未重組因此不與D或J段緊鄰的構(gòu)型。
如本文所用的，術(shù)語“核酸分子”意在包括DNA和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA。
如本文所用的，關(guān)于結(jié)合IL-15的編碼抗體或抗體部分(例如，VH，VL，CDR3)的術(shù)語“分離的核酸分子”意指一種核酸分子，其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列不含其它編碼結(jié)合除了IL-15以外抗原的抗體或抗體部分的核苷酸序列，所述其它序列可以天然地位于人基因組DNA中核酸的側(cè)翼。SEQ ID NOS1-4相應(yīng)于包含本發(fā)明的人抗IL-15抗體146B7的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列。具體地，SEQ ID NO1和2相應(yīng)于146B7抗體的VH，SEQ ID NO3和4相應(yīng)于146B7抗體的VL。
本發(fā)明還包括SEQ ID NOs1-4中所示序列的“保守性序列修飾”，即，不顯著影響或改變由該核苷酸序列編碼或包含該氨基酸序列的抗體結(jié)合特性的核苷酸和氨基酸序列修飾。這類保守性序列修飾包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變等將修飾導(dǎo)入SEQ ID NOs1-4中。保守氨基酸取代包括氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代。本領(lǐng)域中已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電的極性側(cè)鏈的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β分支側(cè)鏈的氨基酸(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，優(yōu)選用來自于同一側(cè)鏈家族的另一種氨基酸殘基替代人抗IL-15抗體中的非必須氨基酸殘基。
或者，在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以沿著全部或部分的抗IL-15抗體編碼序列隨機(jī)引入突變，如通過飽和突變，并且能夠?qū)Φ玫降男揎椏笽L-15抗體篩選結(jié)合活性。
因此，由本文所公開的(重鏈和輕鏈可變區(qū))核苷酸序列編碼的抗體和/或含有此處公開的氨基酸序列(即SEQ ID NOs1-4)的抗體包括基本上由經(jīng)保守修飾的相似序列編碼的，或含有經(jīng)保守修飾的相似序列的抗體。下文提供了關(guān)于如何基于此處公開為SEQ ID Nosl-4的部分(即重鏈和輕鏈可變區(qū))序列產(chǎn)生所述基本相似的抗體的進(jìn)一步討論。
對于核酸，術(shù)語“基本同源”指兩個(gè)核酸或其指定序列，當(dāng)最優(yōu)比對和比較時(shí)，在有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牒腿笔闆r下，至少約80％的核苷酸，通常至少約90到95％，更優(yōu)選至少約98％到99.5％的核苷酸是相同的。另外，在選擇性雜交條件下片段與其互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交時(shí)也存在基本同源。
對于氨基酸序列來說，術(shù)語“同源性”表示當(dāng)與適當(dāng)?shù)牟迦牖蛉笔нM(jìn)行優(yōu)化比對和比較時(shí)，兩種氨基酸序列之間同一性的程度。
兩個(gè)序列間的百分比同一性是一個(gè)關(guān)于序列間相同位置數(shù)量的函數(shù)(即同源％＝相同位置數(shù)/總位置數(shù)×100)，考慮在最優(yōu)比對兩個(gè)序列時(shí)需要引入的空位數(shù)量和每個(gè)空位的長度。序列比較和判斷兩個(gè)序列的百分比同一性可以用數(shù)學(xué)算法來完成，在下面的非限制實(shí)施例中描述。
兩個(gè)核苷酸序列的百分比同一性可以用GCG軟件包(在http//www.gcg.com可以找到)中的GAP程序判斷，使用NWSgapdna.CMP矩陣，以及40，50，60，70，或80的空位權(quán)重和1，2，3，4，5或6的長度權(quán)重。兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的百分比同一性也可以用引入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller算法判斷(CABIOS，411-17(1989))，使用PAM120權(quán)重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。此外，兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的百分比同一性也可以用引入GCG軟件包(在http//www.gcg.com可以找到)中GAP程序中的Needleman和Wunsh算法判斷(J.Mol.Biol.(48)444-453(1970))，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，以及16，14，12，10，8，6或4的空位權(quán)重和1，2，3，4，5或6的長度權(quán)重。
本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步用作“詢問序列”來進(jìn)行對公共數(shù)據(jù)庫的檢索，如鑒定相關(guān)序列。這種檢索可以按Altschul，等在(1990)J.Mol.Biol.215403-10中所描述的，用NBLAST和XBLAST程序(2.0版)執(zhí)行。BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程序執(zhí)行，分?jǐn)?shù)＝100，字長＝12，從而獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白檢索可以用XBLAST程序執(zhí)行，分?jǐn)?shù)＝50，字長＝3，從而獲得與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列。為比較目的而獲得有空位的比對，有空位的BLAST可以按照Altschul等在(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402中的描述來使用。當(dāng)使用BLAST和有空位的BLAST程序時(shí)，可以使用各自程序(如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。見http//www.ncbi.nlm.nih.gov.
核酸可以在完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或部分純化或基本純凈形式中存在。當(dāng)用包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和其它本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將核酸從其它細(xì)胞成分或其它污染物如其它細(xì)胞的核酸或蛋白中純化出來時(shí)，核酸就是“分離的”或“表現(xiàn)為基本純凈”。見F.Ausubel，et al.Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。
來自cDNA，基因組或混合物的本發(fā)明的核酸組合物盡管通常是天然序列(除修飾的限制位點(diǎn)等)，但可以依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行突變而提供基因序列。對于編碼序列，這些突變可以按照需要影響氨基酸序列。具體而言，本發(fā)明考慮了與天然V，D，J，恒定區(qū)，轉(zhuǎn)換區(qū)和其它類似序列同源或由其衍生的DNA序列(“衍生”表示一個(gè)序列與另一個(gè)序列相同或由其修飾而來)。
當(dāng)核酸與另一個(gè)核苷酸序列置于功能關(guān)系時(shí)，就被“可操作性連接”。例如，如果啟動子或增強(qiáng)子影響一個(gè)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就被可操作性連接到該序列。對于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，可操作性連接表示被連接的DNA序列是鄰接的并且對連接讀框中的兩個(gè)鄰接的蛋白編碼區(qū)是必要的。對于轉(zhuǎn)換序列，可操作性連接提示該序列可以影響轉(zhuǎn)換重組。
如本文所用的，術(shù)語“載體”意指可以將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)到與其連接序列的核酸分子。載體的一種類型是“質(zhì)粒”，指可以將額外的DNA片段連接到其中的雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA片段可以與病毒基因組連接。某些載體可以在其引入的宿主細(xì)胞(如有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動物載體)中自主復(fù)制。其它載體(如非附加型哺乳動物載體)可以在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)整合到宿主細(xì)胞的基因組中，與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體可以指導(dǎo)與其可操作性連接的基因的表達(dá)。這種載體在這里被稱作“重組表達(dá)載體”(或簡稱為“表達(dá)載體”)。總的說來，應(yīng)用在重組DNA技術(shù)中的表達(dá)載體通常以質(zhì)粒形式存在。在本詳述中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常使用的載體。然而，本發(fā)明意欲包括有相同功能的載體的其它表達(dá)形式，如病毒載體(如復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒)。
如本文所用的，術(shù)語“重組宿主細(xì)胞”(或簡稱為“宿主細(xì)胞”)意指重組表達(dá)載體引入的細(xì)胞。必須理解這些術(shù)語并不僅指特定受試細(xì)胞，也指這些細(xì)胞的后代。由于突變或環(huán)境影響可能在后代中出現(xiàn)某些修飾，這些后代實(shí)際上可能不會與母體細(xì)胞相同，但仍然包括在這里用到的術(shù)語“宿主細(xì)胞“的范圍內(nèi)。
如本文所用的，術(shù)語“受試者”包括任何人或非人動物。例如，本發(fā)明的方法和組合物能夠用于治療患有炎性疾病，如關(guān)節(jié)炎，例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受試者。術(shù)語“非人動物”包括所有的脊椎動物，例如哺乳類和非人哺乳類，如非人靈長類、羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。
在下面的各小節(jié)中將對本發(fā)明的各個(gè)方面作更詳細(xì)的說明。
I.抗IL-15的人抗體的生產(chǎn)可以利用多種已知技術(shù)，如Kohler和Milstein，Nature256495，(1975)所介紹的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)來生產(chǎn)本發(fā)明的人單克隆抗體。盡管體細(xì)胞雜交法在理論上是優(yōu)選的，還可以利用生產(chǎn)單克隆抗體的其它技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病毒或致癌轉(zhuǎn)化，利用人抗體基因文庫的噬菌體展示技術(shù)。
用于制備生產(chǎn)本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤的優(yōu)選動物體系是鼠類體系。在小鼠中雜交瘤生產(chǎn)是本領(lǐng)域公知的，包括免疫方案和分離并融合免疫化脾細(xì)胞的技術(shù)。
在一種實(shí)施方案中，抗IL-15的人單克隆抗體可以用攜帶所述人免疫系統(tǒng)的部分而非小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠來產(chǎn)生。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明采用在本文中稱為“HuMAb”小鼠的轉(zhuǎn)基因小鼠，它含有編碼未重排的人重鏈(μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微基因座，以及滅活內(nèi)源性γ和κ鏈基因座的靶突變(Lonberg，N.Et al.(1994)Nature 368(6474)856-859)。因此，此小鼠顯示小鼠IgM或κ的表達(dá)減少，并且由于免疫應(yīng)答，引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷了類型轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變而產(chǎn)生高親和力人IgGk單克隆抗體(Lonberg，N et al.(1994)，supra；綜述于Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 11349-101；Lonberg N.and Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93，和Harding，F(xiàn).And Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Aci764536-546)。HuMAb小鼠的制備在下面的第II部分和以下文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述，Taylor，L.Et al.(1992)Nucleic Acids Research 206287-6295；Chen，J，et al.(1993)International Immunology 5647-656；Tuaillon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 903720-3724；Choi et al.(1993)Nature Genetics 4117-123；Chen J.et al.(1993)EMBO J.12821-830；Tuaillon et al.(1994)J.Immunol.1522912-2920；Lonberg et al.，(1994)Nature 368(6474)856-859；Lonberg，N.9(1994)Handbook of Experience Pharmacology11349-101；Taylor，L.Et al.(1994)International Immunology 6；579-591；Lonberg，N.And Hszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93；Harding，F(xiàn).and Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764536-546；Fishwild，D.Et al.(1996)Nature Biotechnology14845-851，在此完整引入其全部內(nèi)容作為參考。還可進(jìn)一步參考都屬于Lonberg and kay，and GenPharm International的美國專利5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；屬于Surani et al.的美國專利No.5,545,807；公開于1998年6月11日的國際公開WO98/24884；公開于1994年11月10日的WO94/25585；公開于1993年6月24日的WO93/1227；公開于1992年12月23日的WO92/22645；公開于1992年3月19日的WO92/03918，在此完整引入其公開內(nèi)容作為參考。另外，具體地，HCO12轉(zhuǎn)基因HuMAb小鼠的制備在實(shí)施例2中進(jìn)行描述。
免疫為了制備IL-15的完全的人單克隆抗體，可以通過例如Lonberg等，(1994)Nature368(6474)856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology14845-851和WO94/24884所述的方法用純化或富集的IL-15抗原制劑和/或表達(dá)IL-15的細(xì)胞對包含人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠(例如，HCo12、HCo7或KM小鼠)進(jìn)行免疫?；蛘撸梢杂镁幋a人IL-15的DNA免疫小鼠。優(yōu)選地，在第一次輸注時(shí)，所述小鼠為6-16周齡。例如，可以通過腹膜內(nèi)注射方式用IL-15抗原的純化或富集的制劑(5-50μg)對HuMab小鼠進(jìn)行免疫。在用IL-15抗原的純化或富集的制劑進(jìn)行免疫不產(chǎn)生抗體時(shí)，還可以用表達(dá)IL-15的細(xì)胞，例如，一種細(xì)胞系來免疫小鼠以促進(jìn)免疫應(yīng)答。
用各種抗原積累的經(jīng)驗(yàn)業(yè)已顯示，當(dāng)用存在于完全弗氏佐劑中的抗原通過腹膜內(nèi)(IP)或皮下(SC)進(jìn)行起始免疫，然后每隔一周用存在于不完全弗氏佐劑中的抗原進(jìn)行IP/SC免疫(一共多達(dá)10次)時(shí)，所述HuMAb轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)答最強(qiáng)。在免疫方案過程中，可以通過眼眶后取血獲得的血漿樣品監(jiān)測免疫應(yīng)答?？梢酝ㄟ^ELISA對所述血漿進(jìn)行篩選(如下所述的)，并且可以將具有足夠滴度的抗IL-15人免疫球蛋白的小鼠用于融合。在處死并取出脾臟之前3天，可以通過靜脈內(nèi)注射抗原對所述小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
制備產(chǎn)生抗IL-15的入單克隆抗體的雜交瘤為了制備生產(chǎn)抗IL-15的人單克隆抗體的雜交瘤，可以從免疫小鼠中分離脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞并且與合適的永生化細(xì)胞系，如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系相融合。隨后可以對得到的雜交瘤篩選抗原特異性抗體的生產(chǎn)。例如，通過50％的PEG(w/v)使來自免疫過的小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液與SP2/0-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，CRL1580)融合。以大約1×105每孔的密度將細(xì)胞鋪在平底微量滴定板上，然后在選擇培養(yǎng)基中孵育2周，該培養(yǎng)基在通常使用的試劑之外含有10％胎克隆血清，5-10％origen雜交瘤克隆因子(IGEN)和1×HAT(Sigma)。大約2周之后在HAT被HT取代的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后通過ELISA對各個(gè)孔篩選人抗IL-15單克隆IgM和IgG抗體。一旦發(fā)生了廣泛的雜交瘤的生長，通?？梢栽?0-14天之后對培養(yǎng)基進(jìn)行觀察?？梢詫⒖贵w分泌雜交瘤重新鋪平板，再次篩選，并且如果仍然對于人IgG呈陽性的話，可以通過限制稀釋將抗IL-15單克隆抗體亞克隆至少2次。然后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以便在組織培養(yǎng)基中制備抗體用于鑒定。
生產(chǎn)抗IL-15的人單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的制備利用，例如本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合，還可以在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中生產(chǎn)本發(fā)明的人抗體(Morrison，S.(1985)Science 2291202)。
例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將目的基因，例如，人抗體基因連接入一種表達(dá)載體中，如在WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338841中公開的GS基因表達(dá)系統(tǒng)或其它本領(lǐng)域公知的表達(dá)系統(tǒng)所用的真核表達(dá)質(zhì)粒。可以將純化的具有克隆的抗體基因的質(zhì)粒導(dǎo)入真核宿主細(xì)胞如CHO細(xì)胞或NSO細(xì)胞或其它真核細(xì)胞像源于植物的細(xì)胞、真菌或酵母的細(xì)胞中。用于導(dǎo)入這些基因的方法可以是本領(lǐng)域所公開的方法，如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染胺或其它的方法。將這些抗體基因?qū)胨拗骷?xì)胞中后，可以鑒定并篩選表達(dá)該抗體的細(xì)胞。這些細(xì)胞代表轉(zhuǎn)染瘤，其可以隨后進(jìn)行擴(kuò)增以增加它們的表達(dá)水平并進(jìn)行提高以生產(chǎn)抗體?？梢詮倪@些培養(yǎng)物上清液和/或細(xì)胞分離并純化重組抗體。
選擇性地，可以將這些克隆的抗體基因表達(dá)于其它表達(dá)系統(tǒng)中，如大腸桿菌，或表達(dá)于完整的生物中，或能夠進(jìn)行合成性表達(dá)。
利用部分抗體序列表達(dá)完整抗體抗體主要通過位于六個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。因此，CDRs中的氨基酸序列在各個(gè)抗體之間比在CDRs外的序列更多樣。因?yàn)镃DR序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，可以通過構(gòu)建包含來自于嫁接至來自于具有不同特性的不同抗體的構(gòu)架序列上的特異性天然抗體的CDR序列的表達(dá)載體而表達(dá)模擬特異性天然抗體的特性的重組抗體(見，例如，Riechmann，L.et al.，1998，Nature 332323-327；Jones，P.et al.，1986，Nature321522-525；和Queen，C.et al.，1989，Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.8610029-10033)?？梢詮陌N系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫獲得所述構(gòu)架序列。這些種系序列與成熟抗體基因序列不同，因?yàn)樗鼈儾话ㄍ耆M裝的可變區(qū)基因，所述基因是通過B細(xì)胞成熟過程中的V(D)J連接而形成的。種系基因序列也將不同于各個(gè)平均跨可變區(qū)的高親和力第二全部組成成分抗體的序列。例如，體突變在構(gòu)架區(qū)的氨基末端部分相對不常見。例如，體突變在構(gòu)架區(qū)1的氨基末端部分和構(gòu)架區(qū)4的羧基末端部分相對不常見。此外，許多體突變不顯著改變抗體的結(jié)合特性。因此，為了重建具有相似于原始抗體的結(jié)合特性的完整重組抗體，并不必須獲得特定抗體的完整DNA序列(見1999年3月12日提交的PCT/US99/05535，在此引入作為參考)?？鏑DR區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列一般足夠用于此目的。用部分序列確定哪一種種系可變區(qū)和連接基因片段貢獻(xiàn)于重組抗體可變區(qū)基因。然后用種系序列填充可變區(qū)的缺少部分。重鏈和輕鏈前導(dǎo)序列在蛋白成熟中切割，并且不貢獻(xiàn)于最終抗體的特性。為此，必須使用相應(yīng)的種系前導(dǎo)序列而表達(dá)構(gòu)建體。為了加入缺少的序列，可以通過連接或PCR擴(kuò)增將克隆的cDNA序列與合成的寡核苷酸結(jié)合?；蛘?，可以將完整的可變區(qū)合成為一組短的、重疊的寡核苷酸并且通過PCR擴(kuò)增結(jié)合，以產(chǎn)生完整的合成可變區(qū)克隆。這一過程具有某些優(yōu)點(diǎn)，如去除或引入特定的限制位點(diǎn)，或優(yōu)化特定的密碼子。
用來自于雜交瘤的重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列設(shè)計(jì)一組重疊的合成寡核苷酸，以產(chǎn)生與天然序列具有相同氨基酸編碼能力的合成V序列。合成重鏈和κ鏈可以以三種方式不同于天然序列打斷重復(fù)核苷酸堿基串以促進(jìn)寡核苷酸合成和PCR擴(kuò)增；根據(jù)Kozak規(guī)則摻入最優(yōu)翻譯起始位點(diǎn)(Kozak，1991，J.Biol.Chem.266L19867019870)，以及將HindIII位點(diǎn)工程化至翻譯起始位點(diǎn)上游。
對于重鏈和輕鏈可變區(qū)，最優(yōu)化的編碼鏈和相應(yīng)的非編碼鏈序列在相應(yīng)非編碼寡核苷酸大約中點(diǎn)分解為大約30-50個(gè)核苷酸。因此，對于每條鏈，寡核苷酸可以組裝為跨150-400個(gè)核苷酸的片段的重疊雙鏈組。然后用合并物作為模板來產(chǎn)生150-400個(gè)核苷酸的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。一般地，單可變區(qū)寡核苷酸組將分解為兩個(gè)合并物，它們可以分別擴(kuò)增以產(chǎn)生兩個(gè)重疊的PCV產(chǎn)物。然后通過PCT擴(kuò)增結(jié)合重疊產(chǎn)物，以形成完整的可變區(qū)。也可能需要在PCR擴(kuò)增中引入重鏈或輕鏈恒定區(qū)的重疊片段(包括κ輕鏈的BbsI位點(diǎn)或γ重鏈的AgeI位點(diǎn))，從而產(chǎn)生可以容易克隆至表達(dá)載體構(gòu)建體中的片段。
然后將重新構(gòu)建的重鏈和輕鏈可變區(qū)與克隆的啟動子、翻譯起始位點(diǎn)、恒定區(qū)、3’非翻譯區(qū)、聚腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)序列結(jié)合，以形成表達(dá)載體構(gòu)建體。重鏈和輕鏈表達(dá)構(gòu)建體可以結(jié)合至共轉(zhuǎn)染、系列轉(zhuǎn)染、或分開轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中的單一載體中，所述宿主細(xì)胞然后融合形成表達(dá)兩條鏈的宿主細(xì)胞。
用于構(gòu)建表達(dá)載體以表達(dá)人IgGκ的質(zhì)粒描述如下(實(shí)施例1)。構(gòu)建質(zhì)粒以使得PCR擴(kuò)增的V重鏈和Vκ輕鏈cDNA序列能用于重新構(gòu)建完整的重鏈和輕鏈小基因。這些質(zhì)粒能用作完整地表達(dá)人或嵌合IgG1κ或IgG4κ抗體。本發(fā)明的完全的人和嵌合抗體還包括IgG2，IgG3，IgE，IgA，IgM和IgD抗體。構(gòu)建相似的質(zhì)粒用于表達(dá)其它重鏈同種型，或用于表達(dá)含有λ輕鏈的抗體。
因而，在發(fā)明的另一方面，將本發(fā)明的人抗IL-15抗體146B7、147H5、404A8和404E4的結(jié)構(gòu)特征用于產(chǎn)生結(jié)構(gòu)相關(guān)的人抗IL-15抗體，它至少保留本發(fā)明抗體的一種功能特征，如結(jié)合IL-15。更具體地，可以將146B7、147H5、404A8和404E4的一種或多種CDR區(qū)與已知的人構(gòu)架區(qū)和CDRs重組結(jié)合以產(chǎn)生本發(fā)明的其它的、重組工程化的人抗IL-15抗體。
因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制備抗IL-15抗體的方法，包括制備一種抗體，其包含(1)人重鏈構(gòu)架區(qū)和人重鏈CDRs，其中至少一種人重鏈CDRs包含選自圖2中所示的CDRs氨基酸序列的氨基酸序列(或?qū)?yīng)SEQ ID NO2中的氨基酸殘基)；和(2)人輕鏈構(gòu)架區(qū)和人輕鏈CDRs，其中至少一種人輕鏈CDRs包含選自圖3中所示的CDRs氨基酸序列的氨基酸序列(或?qū)?yīng)SEQ ID NO4中的氨基酸殘基)；其中該抗體保留結(jié)合IL-15的能力。
利用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合測試，如在實(shí)施例中給出的那些(例如，ELISA分析)來測定抗體結(jié)合IL-15的能力。
由于在本領(lǐng)域中眾所周知抗體重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在抗體對抗原的結(jié)合特異性/親和力中發(fā)揮著特別重要的作用，所以如上所示制備的本發(fā)明的重組抗體優(yōu)選包含146B7、147H5、404A8和404E4的重鏈和輕鏈CDR3s。另外該抗體可以包含146B7、147H5、404A8和404E4的CDR2s。另外該抗體可以包含146B7、147H5、404A8和404E4的CDR1s。該抗體可以進(jìn)一步包含CDRs的任何組合。
因此，在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供抗IL-15抗體，包含(1)人重鏈構(gòu)架區(qū)、人重鏈CDR1區(qū)、人重鏈CDR2區(qū)和人重鏈CDR3區(qū)，其中人重鏈CDR3區(qū)選自146B7、147H5、404A8和404E4的CDR3s，例如，如圖2中所示的146B7的人重鏈CDR區(qū)(或?qū)?yīng)于SEQ ID NO2中的氨基酸殘基)；(2)人輕鏈構(gòu)架區(qū)、人輕鏈CDR1區(qū)、人輕鏈CDR2區(qū)和人輕鏈CDR3區(qū)，其中人輕鏈CDR3區(qū)選自146B7、147H5、404A8和404E4的CDR3s，例如，如圖3中所示的146B7的人輕鏈CDR區(qū)(或?qū)?yīng)于SEQ ID NO4中的氨基酸殘基)，其中該抗體結(jié)合IL-15。該抗體可以進(jìn)一步包含146B7、147H5、404A8和404E4的重鏈CDR2和/或輕鏈CDR2。該抗體可以進(jìn)一步包含146B7、147H5、404A8和404E4的重鏈CDR1和/或輕鏈CDR1。
上述工程化的抗體的CDR1、2和/或3可以包含本文公開的146B7、147H5、404A8和404E4的那些確切氨基酸序列。不過，普通技術(shù)人員會理解從146B7、147H5、404A8和404E4的CDR確切氨基酸序列而來的一些偏差是可能的，同時(shí)仍然保留有效結(jié)合IL-15的抗體的能力(例如，保守性序列修飾)。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，工程化的抗體可以由與一種或多種146B7、147H5、404A8和404E4的CDRs具有例如90％、95％、98％或99.5％同一性的一種或多種CDRs組成。
除了簡單地結(jié)合IL-15之外，可以對工程化的抗體，如上述的抗體保有本發(fā)明的抗體的其它功能特性進(jìn)行選擇，如(1)結(jié)合人IL-15和抑制IL-15誘導(dǎo)的促炎作用；(2)抑制IL-15誘導(dǎo)的TNFα生產(chǎn)或T細(xì)胞增殖；(3)當(dāng)通過表面等離子共振(SPR)技術(shù)在BIACORE 3000儀器中利用重組人IL-15作為分析物而抗體作為配體進(jìn)行測定時(shí)，以小于大約10-7M的解離平衡常數(shù)(KD)結(jié)合人IL-15；(4)結(jié)合位于人IL-15的β和/或γ鏈相互作用結(jié)構(gòu)域上的表位；(5)干擾人IL-15的Asp8結(jié)合人IL-15受體的β亞基和/或人IL-15的Gln108結(jié)合人IL-15受體的γ亞基；(6)結(jié)合受體結(jié)合的人IL-15；(7)結(jié)合人IL-15并抑制人IL-15誘導(dǎo)角化不全的能力；(8)結(jié)合人IL-15并抑制人IL-15誘導(dǎo)表皮增厚的能力；(9)結(jié)合人IL-15并抑制人IL-15誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞增殖的能力；和/或(10)結(jié)合人IL-15并抑制人IL-15誘導(dǎo)激活的白細(xì)胞趨化性的能力。
抗IL-15的人單克隆抗體的鑒定可以利用多種已知的技術(shù)鑒定本發(fā)明的人單克隆抗體與IL-15的結(jié)合。一般，最初通過ELISA對抗體進(jìn)行鑒定。簡言之，可以用PBS中的純化的IL-15涂布微量滴定板，隨后用不相關(guān)的蛋白質(zhì)如稀釋于PBS中的牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行封閉。將來自IL-15免疫的小鼠血漿的稀釋物加到每個(gè)孔中并于37℃孵育1-2小時(shí)。用PBS/Tween20洗滌板并且隨后用偶聯(lián)到堿性磷酸酶上的山羊抗人IgG Fc特異性多克隆試劑于37℃孵育1小時(shí)。洗滌后，用ABTS底物將板進(jìn)行顯影，并于OD405進(jìn)行分析。優(yōu)選地，產(chǎn)生最高滴度的小鼠將被用于融合。
可以利用上述的ELISA分析篩選抗體，并且因而，篩選產(chǎn)生顯示與IL-15免疫原陽性反應(yīng)性的抗體的雜交瘤。隨后可以對優(yōu)選以高親和力結(jié)合IL-15的抗體進(jìn)行亞克隆并進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。隨后可以選擇保持親本細(xì)胞的反應(yīng)性(通過ELISA)的來自每個(gè)雜交瘤的一個(gè)克隆，用于制成細(xì)胞文庫，并用于抗體純化。
為了純化人抗IL-15抗體，可以將選擇的雜交瘤生長于滾瓶、兩升的旋轉(zhuǎn)燒瓶或其它培養(yǎng)系統(tǒng)中。在用蛋白A-瓊脂糖(Pharmacia，Piscataway，NJ)進(jìn)行親和層析以純化蛋白質(zhì)之前，可以對上清液進(jìn)行過濾并濃縮。將緩沖液換成PBS之后，可以通過OD280使用1.43的消光系數(shù)或優(yōu)選通過濁度分析測定濃度。可以通過凝膠電泳和通過抗原特異性方法檢查IgG。
為了確定所選擇的人抗IL-15單克隆抗體是否結(jié)合獨(dú)特的表位，可以使用市場上現(xiàn)有的試劑(Pierce，Rockford，IL)對每種抗體進(jìn)行生物素化。生物素化的MAb結(jié)合可以用鏈霉抗生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行檢測。為了測定純化抗體的同種型，可以進(jìn)行本領(lǐng)域公知的技術(shù)進(jìn)行同種型ELISAs。例如，可以用10□g/ml的抗人Ig涂布微量滴定板的孔于4℃過夜。在用5％BSA封閉之后，用10□g/ml的單克隆抗體或純化的同種型對照于環(huán)境溫度下對板進(jìn)行反應(yīng)2小時(shí)。隨后可以將孔與人IgGl或其它的人同種型特異性偶聯(lián)的探針反應(yīng)。如上所述對板進(jìn)行顯影和分析。
為了檢測單克隆抗體結(jié)合表達(dá)IL-15的活體細(xì)胞，可以使用流式細(xì)胞術(shù)。簡言之，將細(xì)胞系和/或表達(dá)膜結(jié)合的IL-15的PBMCs(在標(biāo)記生長條件下生長)與各種濃度的單克隆抗體于4℃混合1小時(shí)，所述抗體在包含0.1％BSA和0.01％NaN3的PBS中。洗滌后，將細(xì)胞與熒光素標(biāo)記的抗人IgG抗體在與一抗染色相同的條件下進(jìn)行反應(yīng)。能夠通過利用光和側(cè)向散射特性以門控單個(gè)細(xì)胞的FACScan儀器對樣品進(jìn)行分析并且測定標(biāo)記抗體的結(jié)合。除了流式細(xì)胞術(shù)之外(或代替流式細(xì)胞術(shù))，還可以利用一種使用熒光顯微鏡的可供選擇的測試法?？梢酝耆c上述一樣對細(xì)胞進(jìn)行染色并通過熒光顯微鏡進(jìn)行檢查。這種方法能夠觀察到單個(gè)細(xì)胞，但可能根據(jù)抗原的密度具有減小的敏感性。
通過蛋白質(zhì)印跡能夠進(jìn)一步測試抗IL-15人IgG與IL-15抗原的反應(yīng)性。簡言之，可以制備來自表達(dá)IL-15的細(xì)胞的細(xì)胞提取物并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳后，分離的抗原將被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上進(jìn)行檢測，所述硝酸纖維素膜用20％的小鼠血清進(jìn)行封閉，并用單克隆抗體作為探針。人IgG結(jié)合利用抗人IgG堿性磷酸酶進(jìn)行檢測并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)進(jìn)行顯影。
II.產(chǎn)生制備人單克隆抗IL-15抗體的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體非人動物仍在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了諸如轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體非人動物，它能夠表達(dá)特異性結(jié)合IL-15的人單克隆抗體。在一種特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠，從而當(dāng)用IL-15抗原和/或表達(dá)IL-15的細(xì)胞進(jìn)行免疫時(shí)該小鼠產(chǎn)生人抗IL-15抗體。人重鏈轉(zhuǎn)基因可以整合入小鼠的染色體DNA中，如轉(zhuǎn)基因的，例如本文詳細(xì)描述和示例的HuMab小鼠的情況一樣。或者，人重鏈轉(zhuǎn)基因可以保持于染色體外，如WO02/43478中所述的轉(zhuǎn)染色體(例如，KM)小鼠的情況一樣。這類轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體動物能夠通過進(jìn)行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生抗IL-15的人單克隆抗體的多種同種型(例如IgG、IgA和/或IgE)。同種型轉(zhuǎn)換可以通過，例如傳統(tǒng)的或非傳統(tǒng)的同種型轉(zhuǎn)換發(fā)生。
設(shè)計(jì)以異源抗體所有組成成分并應(yīng)答外來抗原刺激的轉(zhuǎn)基因非人動物要求包含在轉(zhuǎn)基因動物中的異源免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞發(fā)育途徑中正確行使功能。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，異源重鏈轉(zhuǎn)基因的正確功能包括同種型轉(zhuǎn)換。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因是為產(chǎn)生同種型轉(zhuǎn)換和下列內(nèi)容的一項(xiàng)或多項(xiàng)而建立的(1)高水平和細(xì)胞類型特異性表達(dá)，(2)功能基因重排，(3)激活并應(yīng)答等位基因排斥，(4)表達(dá)足夠的初級組成成分，(5)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，(6)體細(xì)胞超變，和(7)免疫應(yīng)答中轉(zhuǎn)基因抗體基因座的顯性化。
并不是前面的標(biāo)準(zhǔn)都需要滿足。例如，在那些轉(zhuǎn)基因動物的內(nèi)源性免疫球蛋白基因座被功能性破壞的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因不需要激活等位基因排斥。此外，在轉(zhuǎn)基因包含一個(gè)功能性重排的重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白基因的實(shí)施方案中，不需要第二條標(biāo)準(zhǔn)的功能基因重排，至少對于已經(jīng)重排的轉(zhuǎn)基因時(shí)如此。分子免疫學(xué)的背景知識可以參考fundamental Immunology，2ndedition(1989)，Paul William E.，ed.Raven press，N.Y.，在此引入作為參考。
在某些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因非人動物包含重排、未重排或重排和未重排組合的轉(zhuǎn)基因動物種系中的異源免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因。每個(gè)重鏈轉(zhuǎn)基因包含至少一個(gè)CH基因。另外，重鏈轉(zhuǎn)基因可包含能夠支持編碼轉(zhuǎn)基因動物B細(xì)胞中的多個(gè)CH基因的異源性轉(zhuǎn)基因的同種型轉(zhuǎn)換功能的同種型轉(zhuǎn)換序列。這些轉(zhuǎn)換序列可以在作為轉(zhuǎn)基因CH基因來源的物種的種系免疫球蛋白基因座中天然存在，或者這些轉(zhuǎn)換序列可以從得到轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的物種(轉(zhuǎn)基因動物)中的序列衍生而來。例如，如果摻入與小鼠重鏈基因座中天然存在的序列相同的轉(zhuǎn)換序列，用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的人轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體可以產(chǎn)生更高頻率的同種型轉(zhuǎn)換事件，正如假設(shè)的那樣，小鼠轉(zhuǎn)換序列經(jīng)優(yōu)化而與小鼠轉(zhuǎn)換重組酶系統(tǒng)作用，而人轉(zhuǎn)換序列則不是。轉(zhuǎn)換序列可以用傳統(tǒng)克隆方法分離和克隆，或可以按照已發(fā)表的免疫球蛋白轉(zhuǎn)換區(qū)序列相關(guān)序列信息從重疊合成寡核苷從頭合成(Mills et al.，Nucl.Acids Res.15；7305-7316(1991)；Sideras et al.，Intl.Immunol.1631-642(1989)，在此引入作為參考)。對于前面的每種轉(zhuǎn)基因動物，可以在轉(zhuǎn)基因動物很大比例的B細(xì)胞(至少10％)中發(fā)現(xiàn)功能性重排的異源性重鏈和輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因。
用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物的轉(zhuǎn)基因包括一個(gè)含有編碼至少一個(gè)可變基因片段、一個(gè)多樣性基因片段、一個(gè)連接基因片段和至少一個(gè)恒定區(qū)基因片段的DNA的重鏈轉(zhuǎn)基因。免疫球蛋白輕鏈轉(zhuǎn)基因含有編碼至少一個(gè)可變基因片段、一個(gè)連接基因片段和至少一個(gè)恒定區(qū)基因片段的DNA。編碼輕鏈和重鏈基因片段的基因片段與衍生它們的轉(zhuǎn)基因非人動物是異源性的，或者說它們與不包括轉(zhuǎn)基因非人動物的物種中編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因片段的DNA相對應(yīng)。在本發(fā)明一個(gè)方面，轉(zhuǎn)基因經(jīng)構(gòu)建使各個(gè)基因片段未重排，或不重排，以便編碼一個(gè)功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈。這種未重排的轉(zhuǎn)基因支持在暴露于IL-15抗原時(shí)V，D和J基因片段(功能性重排)重組并優(yōu)選支持D區(qū)基因片段的全部或部分摻入轉(zhuǎn)基因非人動物中得到的未重排免疫球蛋白重鏈。
在另一種實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因包含一個(gè)未重排“微基因座”。這樣的轉(zhuǎn)基因一般包含C，D和J片段的基本部分和V基因片段的亞型。在這種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中，不同的調(diào)節(jié)序列，如啟動子、增強(qiáng)子、類型轉(zhuǎn)換區(qū)、RNA加工的剪接供體和剪接受體、重組信號等，包含從異源性DNA衍生的相應(yīng)序列。這些調(diào)節(jié)序列可以從摻入與本發(fā)明使用的非人動物相同或相關(guān)物種得到的轉(zhuǎn)基因。例如，人免疫球蛋白基因片段可以在轉(zhuǎn)基因中與嚙齒類動物免疫球蛋白增強(qiáng)子序列結(jié)合用于轉(zhuǎn)基因小鼠。另外，合成的調(diào)節(jié)序列可以摻入轉(zhuǎn)基因，其中這種合成調(diào)節(jié)序列與已知的哺乳動物基因組中天然存在的功能性DNA序列不同源。合成調(diào)節(jié)序列是根據(jù)共有序列規(guī)則而設(shè)計(jì)的，例如那些指定剪接受體位點(diǎn)或啟動子/增強(qiáng)子基序的允許序列的規(guī)則。例如，包含與天然存在的種系Ig基因座相比，具有非必需DNA部分(如間插序列；內(nèi)含子或其部分)的至少一個(gè)內(nèi)部(即不在該部分的末端)缺失的基因組免疫球蛋白基因座的一部分的微基因座。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生人IL-15抗體的包含至少一個(gè)，一般2-10個(gè)，有時(shí)25-50或更多拷貝的WO98/24884實(shí)施例12所描述的轉(zhuǎn)基因(如pHC1或pHC2)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動物與含有WO98/24884實(shí)施例5，6，8或14所描述輕鏈轉(zhuǎn)基因的一個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)基因動物雜交，其后代與WO98/24884實(shí)施例10所描述的JH缺失動物雜交，在此特意引入其內(nèi)容作為參考。對于這三種性狀的每一種，動物都雜交到純合型。這些動物有如下基因型單拷貝(每單套染色體)的人重鏈未重排微基因座(在WO98/24884實(shí)施例12中有描述)，單拷貝(每單套染色體)的重排人K輕鏈構(gòu)建體(在WO98/24884實(shí)施例14中有描述)，以及在每個(gè)內(nèi)源性小鼠重鏈基因座去掉所有功能性JH片段的一個(gè)缺失(在WO98/24884實(shí)施例10中有描述)。這種動物與對于JH片段缺失為純合型的小鼠(WO98/24884實(shí)施例10)雜交，產(chǎn)生對JH缺失為雜合子(WO98/24884實(shí)施例10)且對人重鏈和輕鏈構(gòu)建體為半合子的后代。給得到的動物注射抗原并用來產(chǎn)生抗這些抗原的人單克隆抗體。
從這種動物分離的B細(xì)胞對于人重鏈和輕鏈?zhǔn)菃翁禺愋缘模驗(yàn)樗鼈冎话總€(gè)基因的一個(gè)拷貝。此外，它們對于人或小鼠重鏈將是單特異性的，因?yàn)閮?nèi)源性小鼠重鏈基因拷貝由于WO98/24884實(shí)施例9和12介紹的跨JH缺失而都是非功能性的。此外，B細(xì)胞的絕大部分對于人或鼠輕鏈?zhǔn)菃翁禺愋缘模驗(yàn)閱慰截愔嘏湃甩瘦p鏈基因的表達(dá)將在絕大部分B細(xì)胞中等位和同種型排斥內(nèi)源性小鼠κ和λ鏈基因的重排。
用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠呈現(xiàn)出免疫球蛋白產(chǎn)物的大部分組成成分，理想的是基本上類似于天然小鼠。這樣，例如在內(nèi)源性Ig基因被滅活的實(shí)施方案中，總免疫球蛋白水平將為約0.1到10mg/ml血清，優(yōu)選0.5到5mg/ml，理想地至少為1.0mg/ml左右。當(dāng)一個(gè)可以實(shí)現(xiàn)將IgM轉(zhuǎn)換到IgG的轉(zhuǎn)基因被引入轉(zhuǎn)基因小鼠時(shí)，成年小鼠血清IgG與IgM的比例優(yōu)選為約10∶1。IgG與IgM的比例在未成熟小鼠中將低得多。總的說來，大于約10％，優(yōu)選40-80％的脾和淋巴結(jié)B細(xì)胞專門表達(dá)人IgG蛋白。
理想的是所述組成成分接近天然小鼠，通常至少占它的大約10％，優(yōu)選25-50％或更多。一般，會產(chǎn)生至少大約1000個(gè)不同的免疫球蛋白(理想為IgG)，優(yōu)選104-106或更多，這主要取決于導(dǎo)入小鼠基因組中的V、J和D區(qū)的數(shù)量。這些免疫球蛋白通常識別大約1/2或更多的高抗原性蛋白，例如，葡萄球菌蛋白。通常，所述免疫球蛋白對預(yù)先選定的抗原呈現(xiàn)低于10-7M的親和力(KD)，如低于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低。
在一些實(shí)施方案中，可能優(yōu)選產(chǎn)生有預(yù)定所有組成成分的小鼠來限制在對存在于預(yù)定抗原類型的抗體應(yīng)答中的V基因選擇。有預(yù)定所有組成成分的重鏈轉(zhuǎn)基因可以包含例如在人預(yù)定抗原類型的抗體應(yīng)答中優(yōu)選使用的人VH基因。另外，一些VH可能由于各種原因從定義的所有組成成分中被排除(如，不太可能編碼對預(yù)定抗原的高親和力V區(qū)；進(jìn)行體細(xì)胞突變和親和力銳減(affinity sharpening)的傾向性?。换?qū)μ囟ㄈ巳菏敲庖咴缘?。這樣，在包含各種重鏈或輕鏈基因片段的轉(zhuǎn)基因重排之前，這些基因片段可以通過如雜交或DNA測序被輕易識別為是從轉(zhuǎn)基因動物以外的生物物種中得到。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠可以按前面所描述的用IL-15抗原的富集或純化制劑和/或表達(dá)IL-15的細(xì)胞免疫。此小鼠將產(chǎn)生通過轉(zhuǎn)基因內(nèi)轉(zhuǎn)換重組(順式轉(zhuǎn)換)進(jìn)行類型轉(zhuǎn)換并表達(dá)與IL-15反應(yīng)的免疫球蛋白的B細(xì)胞。這些免疫球蛋白可以是人抗體(也稱作人序列抗體)，其中重鏈和輕鏈多肽由可能包括體來源于細(xì)胞突變和V區(qū)重組連接的序列和種系編碼序列的人轉(zhuǎn)基因序列編碼；盡管由于體細(xì)胞突變和不同V-J和V-D-J重組結(jié)合可能出現(xiàn)其它非種系序列，這些人序列免疫球蛋白可以稱作與由人VL或VH基因片段和人JL或JH片段編碼的多肽序列基本等同。對于這樣的人序列抗體，每條鏈的可變區(qū)一般至少80％由人種系V，L，在重鏈中為D基因片段編碼；通常至少85％的可變區(qū)由轉(zhuǎn)基因中存在的人種系序列編碼；經(jīng)常90％或95％或更多的可變區(qū)由轉(zhuǎn)基因中存在的人種系序列編碼。然而，由于非種系序列由體細(xì)胞突變和VJ和VDJ連接而引入，人序列抗體將經(jīng)常有一些不像在小鼠種系中的人轉(zhuǎn)基因那樣由人V，D，或J基因片段編碼的可變區(qū)序列(恒定區(qū)序列少一些)。典型說來，這些非種系序列(或各個(gè)核苷酸位點(diǎn))將在CDR或其附近，或在已知體細(xì)胞突變簇集的區(qū)域簇集。
能結(jié)合預(yù)定抗原的人抗體可以由同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生，以便產(chǎn)生包含人序列γ鏈(如γ1、γ2a、γ2B或γ3)和人序列輕鏈(如κ)的人抗體。所述同種型轉(zhuǎn)換的人抗體通常包含一個(gè)或多個(gè)體細(xì)胞突變，一般通常存在于可變區(qū)中，并且通常在CDR中或大約10個(gè)殘基內(nèi)，作為親和力成熟，和通過抗原，特別是在進(jìn)行第二次(或隨后)抗原刺激之后進(jìn)行B細(xì)胞篩選的結(jié)果。這些高親和力人抗體可以具有低于10-7M的結(jié)合親和力(KD)，如低于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低。
本發(fā)明的另一方面包括源于本文所述的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠的B細(xì)胞。所述B細(xì)胞可用于制備表達(dá)以高親和力(例如，低于10-7M)結(jié)合人IL-15的人單克隆抗體的雜交瘤。因此，在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種雜交瘤，當(dāng)通過表面等離子共振(SPR)技術(shù)在BIACORE 3000儀器中利用重組人IL-15作為分析物而抗體作為配體進(jìn)行測定時(shí)它產(chǎn)生具有低于10-7M的親和力(KD)的人抗體，如低于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低，其中所述抗體包含一種人序列輕鏈，所述輕鏈由(1)具有與由人VL基因片段和人JL片段所編碼的多肽序列基本上相同的多肽序列的輕鏈可變區(qū)，和(2)具有與由人CL基因片段所編碼的多肽序列基本上相同的多肽序列的輕鏈恒定區(qū)組成；和一種人序列重鏈，所述重鏈由(1)具有與由人VH基因片段、任選D區(qū)和人JH片段所編碼的多肽序列基本上相同的多肽序列的重鏈可變區(qū)，和(2)具有與由人CH基因片段編碼的多肽序列基本上相同的多肽序列的恒定區(qū)組成。
對IL-15高親和力的人單克隆抗體的產(chǎn)生可以用一種在具有一個(gè)包含整合人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠中擴(kuò)增人可變區(qū)基因片段所有所有組成成分的方法來促進(jìn)，上述方法包括將一個(gè)包含在上述整合人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因中不存在的V區(qū)基因片段的V基因轉(zhuǎn)基因引入基因組。通常，V區(qū)轉(zhuǎn)基因是一個(gè)包含人VH或VL(VK)基因片段陣列的一部分的酵母人工染色體，可能在人基因組中天然存在或可能用重組方法分別剪接在一起，可能包括無序或省略V基因片段。通常YAC包括至少5個(gè)或更多功能性V基因片段。在這種變異中，可以產(chǎn)生用V所有組成成分?jǐn)U增方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中此小鼠表達(dá)包含一個(gè)由在V區(qū)轉(zhuǎn)基因存在的V區(qū)基因片段編碼的可變區(qū)序列和在人Ig轉(zhuǎn)基因上編碼的C區(qū)的免疫球蛋白鏈。通過V所有組成成分?jǐn)U增方法，可以產(chǎn)生至少有5個(gè)不同V轉(zhuǎn)基因小鼠；可以產(chǎn)生包含至少24個(gè)或更多V基因的小鼠。一些V基因片段可以是非功能性的(如偽基因等)；這些片段可以保留或如果需要，可以由熟練的技術(shù)人員用重組方法去除。
當(dāng)小鼠種系被工程化為含有一個(gè)具有擴(kuò)增V片段所有組成成分，基本上在包含J和C基因片段的人Ig轉(zhuǎn)基因中不存在的功能性YAC時(shí)，這種性狀可以被增殖并雜交到其它遺傳背景，包括有一個(gè)擴(kuò)增的V片段所有組成成分的功能性YAC雜交到有不同人Ig轉(zhuǎn)基因的小鼠種系所在的背景。有一個(gè)擴(kuò)增V片段所有組成成分的多功能性YAC可以雜交到一個(gè)種系而與一種人Ig轉(zhuǎn)基因(或多種人Ig轉(zhuǎn)基因)一起作用。盡管這里稱作YAC轉(zhuǎn)基因，這些轉(zhuǎn)基因在整合到基因組時(shí)可能基本缺乏酵母序列，如酵母中自主復(fù)制必需的序列；這些序列可以在酵母中復(fù)制后而不再必要時(shí)(即在引入小鼠ES細(xì)胞或小鼠受精卵前)由基因工程選擇性地去除(如限制性消化和脈沖電場凝膠電泳或其它適當(dāng)方法)。增殖人序列免疫球蛋白表達(dá)特性的方法，包括雜交具有人Ig轉(zhuǎn)基因，也可任選具有含有擴(kuò)增V片段所有組成成分的功能性YAC的轉(zhuǎn)基因小鼠。VH和VL基因片段都可在YAC上存在。轉(zhuǎn)基因小鼠可以雜交到實(shí)施者希望的任何背景，包括攜帶其它人轉(zhuǎn)基因，包括人Ig轉(zhuǎn)基因和/或編碼其它人淋巴細(xì)胞蛋白的轉(zhuǎn)基因的背景。本發(fā)明也提供了由具有擴(kuò)增的V區(qū)所有組成成分的YAC轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的高親和力人序列免疫球蛋白。盡管前面描述了本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的優(yōu)選實(shí)施方案，但本發(fā)明也考慮了其它實(shí)施方案，可以分為4類I.包含一個(gè)未重排重鏈和重排輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物；II.包含一個(gè)未重排重鏈和未重排輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物；III.包含一個(gè)重排重鏈和未重排輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物；IV.包含一個(gè)重排重鏈和重排輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物；在這些轉(zhuǎn)基因動物分類中，優(yōu)選的優(yōu)先順序?yàn)镮I＞I＞III＞IV，其中內(nèi)源性輕鏈基因(或至少K基因)通過同源重組(或其它方法)被剔除，以及I＞II＞III＞IV，其中內(nèi)源性輕鏈基因沒有被剔除并且必需由等位排斥顯性化。
III.抗體偶聯(lián)物/免疫毒素在另一方面，本發(fā)明描述了與諸如細(xì)胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性同位素的治療成分偶聯(lián)的人抗IL-15單克隆抗體。
當(dāng)與細(xì)胞毒素偶聯(lián)時(shí)，這些偶聯(lián)抗體就叫做“免疫毒素”。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒試劑包括任何對細(xì)胞有害(如殺滅細(xì)胞)的試劑，其例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩葡糖苷、長春新堿、長春花堿、秋水仙堿、阿霉素、北豆根堿、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-脫氫表雄酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、嘌呤霉素及其類似物或同源物。治療試劑包括，但不局限于抗代謝物(如氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-巰基鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟鳥嘧啶)，烷化劑(如二氯甲基二乙胺、thioepachlorambucil、美法倫、亞硝基脲氮芥(BSNU)和羅氮芥(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C和順二氯二胺鉑(II)((DDP)順鉑)、anthracycline(如道諾紅霉素(以前稱作道諾霉素)和亞德里亞霉素)，抗生素(如放線菌素(以前稱作放射霉素)、博來霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC)，以及抗有絲分裂劑(如長春新堿、長春花堿)。本發(fā)明的抗體可以與放射性同位素如放射性碘偶聯(lián)，產(chǎn)生治療IL-15相關(guān)病癥的細(xì)胞毒放射性藥物。
本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物可以用來修飾某種生物反應(yīng)。治療部分并不限于經(jīng)典化療劑的范圍。例如，藥物部分可以是一種具有所需要生物活性的蛋白或多肽。這種蛋白可以包含如酶活性毒素或其活性片段，如紅豆因、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌素、或白喉毒素；蛋白如腫瘤壞死因子或γ干擾素；或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑如，淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)，白介素-2(“IL-2”)，白介素-6(“IL-6”)，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)，粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其它生長因子。
將所述治療部分偶聯(lián)于抗體的技術(shù)是公知的，參見，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs InCancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(編輯)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等(編輯)，pp.623-53(Marcel DEkker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In CancerTherapyA Review”，in Monoclonal Antibodies 84Biological AndClinical Applications，Pinchera等(編輯)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective of The Therapeutic Use ofRadiobeled Ant ibody In Cancer Therapy”，in Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(編輯)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“The Preparation AndCytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。
IV.藥物組合物另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，如藥物組合物，它包含一種或幾種本發(fā)明的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分的組合，與可藥用的載體一起配制。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，此組合物包括多種(如兩種或以上)本發(fā)明的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分的組合。優(yōu)選地，組合物的每種抗體或其抗原結(jié)合部分與獨(dú)特的、預(yù)選的IL-15表位相結(jié)合。
本發(fā)明的藥物組合物也可用于聯(lián)合治療，即與其它試劑組合。例如，聯(lián)合治療可以包括本發(fā)明的組合物和至少一種其它的治療劑，如抗炎劑，DMARDs(改變疾病的抗風(fēng)濕性藥物)，免疫抑制劑，化療劑和牛皮癬藥劑。本發(fā)明的藥物組合物還可以結(jié)合放療給藥。與其它抗體，如CD4特異性抗體和IL-2特異性抗體的共給藥，也為本發(fā)明所包括。據(jù)認(rèn)為這類與CD4特異性抗體和IL-2特異性抗體的組合對于治療自身免疫疾病和移植排斥特別有用。
如本文所用的，“可藥用載體”包括任何和所有生理相容的溶劑、分散劑、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌試劑、等滲的和吸收延緩試劑等。優(yōu)選地，這種載體適合靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髓或表皮使用(如通過注射或輸注)。取決于給藥途徑，活性化合物，即抗體、雙特異性和多特異性分子可以用一種物質(zhì)包被，使化合物不受酸和其它可能滅活此混合物的自然條件的影響。
“可藥用鹽”是指保持母體化合物需要的生物活性并且不帶來任何不需要的毒性作用的鹽(見，例如Berge，S.M.，et al.(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。這些鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括那些從如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、磷等無毒無機(jī)酸以及如脂肪酸單和二羧酸、苯取代烷酸、羥基烷酸、芳香酸、脂肪酸和芳香磺酸等無毒有機(jī)酸衍生的鹽。堿加成鹽包括從如鈉、鉀、鎂、鈣等堿金屬和N，N’-聯(lián)苯二亞胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等無毒有機(jī)胺衍生的鹽。
本發(fā)明的組合物可以通過許多本領(lǐng)域中公知的方法給藥。正如熟練的技術(shù)人員所鑒定的，給藥途徑和/或方式將由希望結(jié)果的不同而改變?；钚曰衔锟梢杂帽Ｗo(hù)化合物避免迅速釋放的載體制備，如包括植入物、經(jīng)皮貼劑、和微膠囊運(yùn)送系統(tǒng)的控釋制劑?？梢允褂萌缫蚁┮宜嵋蚁?、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、和聚乳酸等生物可降解的和生物相容的多聚體。制備這種制劑的許多方法被授予專利并且在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中是公知的。見如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
為通過某種給藥途徑而給予本發(fā)明的化合物，必須將其包被于防止其被滅活的物質(zhì)中或與這種物質(zhì)共同給藥。例如，這種化合物可以用適當(dāng)?shù)妮d體例如脂質(zhì)體或稀釋劑而給予受試者。可藥用的稀釋劑包括鹽和水緩沖液包括水包油包水CGF乳狀液以及傳統(tǒng)脂質(zhì)體(Strejanet al.(1984)J.Neuroimmunol.727)。
可藥用載體包括為臨時(shí)制備無菌注射液或分散劑所用的無菌水溶液或分散液和無菌粉末。這些針對藥用活性物質(zhì)的媒介和試劑的使用在本領(lǐng)域中是公知的。除了與活性化合物不相容的傳統(tǒng)介質(zhì)或試劑外，考慮了將其使用在本發(fā)明的藥物組合物中。此組合物中也可摻入補(bǔ)充的活性化合物。
治療組合物在生產(chǎn)和儲存條件下一般必需是無菌和穩(wěn)定的。此組合物可以配制為溶液、微乳狀液、脂質(zhì)體或其它適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是包括如水、乙醇、多羥基化合物(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)，及其適當(dāng)?shù)幕旌衔锏娜軇┗蚍稚⒔橘|(zhì)?？梢酝ㄟ^例如使用包膜如卵磷脂、在分散時(shí)保持要求的顆粒大小及使用表面活性劑來保持適當(dāng)?shù)囊簯B(tài)。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中加入延緩吸收的試劑如一硬脂酸鹽和明膠來延長注射組合物的吸收。
無菌注射液可以通過在適當(dāng)溶劑中加入要求的劑量的活性化合物和上面列舉的一種或幾種成分的組合，并按要求進(jìn)行滅菌微量過濾。一般說來，分散劑通過將活性化合物加入一種包含上面所列舉的基本分散介質(zhì)和要求的其它成分的無菌載體。對于制備無菌注射液的無菌粉末，優(yōu)選制備方法為真空干燥和冷凍干燥(低壓凍干)，產(chǎn)生活性成分粉末，再加上從前面無菌過濾的溶液得到的其它需要成分。
調(diào)整劑量方案來提供最優(yōu)的需要反應(yīng)(如治療反應(yīng))。例如，可以給予單次濃注，可以隨時(shí)間給予一些分開的劑量，或由治療狀況的緊急程度按比例減少或增加劑量。為給藥方便和劑量統(tǒng)一，以劑量單位的形式配制腸胃外組合物非常有好處。這里用到的劑量單位形式是指作為受治療受試者的單位劑量的生理區(qū)分的單位；每個(gè)單位包含預(yù)定量的活性化合物，經(jīng)計(jì)算可以與要求的藥物載體協(xié)同作用，產(chǎn)生需要的治療效果。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格由以下內(nèi)容指定并直接依賴于(a)活性化合物的獨(dú)特特征和需要達(dá)到的特定療效及(b)本領(lǐng)域中固有的限制如治療所用化合物個(gè)體敏感性的限制。
可藥用抗氧化劑的例子包括(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、硫酸鈉等；(2)脂溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)，丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α生育酚等及(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
對于治療組合物來說，本發(fā)明的制劑包括適合口服、鼻、局部(包括頰和舌下)、直腸、陰道和/或腸胃外給藥的制劑。所述制劑能以單位劑型方便地提供，并且可以通過藥物學(xué)領(lǐng)域的任何已知方法制備。用于產(chǎn)生單一劑型的可以與載體材料組合的活性成分的量，根據(jù)被治療的受試者和特定的給藥方式而改變。可以與載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量，通常是能產(chǎn)生治療效果的組合物的量。一般，以百分比衡量，該量將為活性成分的約0.001-99％，優(yōu)選約0.005-70％，最優(yōu)選約0.01-30％。
本發(fā)明適于陰道給藥的制劑也包括含有本領(lǐng)域中公知的適當(dāng)載體的陰道栓、填塞物、油膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧制劑。局部或經(jīng)皮給予本發(fā)明的組合物的劑型包括粉末、噴霧、軟膏、糊劑、油膏、洗液、凝膠、溶液、貼劑和吸入劑?；钚曰衔锟梢栽跓o菌條件下與可藥用載體，以及可能要求的任何防腐劑、緩沖液或推進(jìn)劑混合。
這里用到的短語“腸胃外給藥”和“給藥于腸胃外”表示腸道和局部給藥以外的給藥方式，通常是注射、并包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、被膜下、蛛網(wǎng)膜下、脊髓內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。
在本發(fā)明的藥物組合物中使用的適合水或非水載體包括水、乙醇、多羥基化合物(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)，及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?、植物油，如橄欖油、及可注射有機(jī)酯，如亞油酸?？梢酝ㄟ^例如使用包被物如卵磷脂、在分散時(shí)保持要求的顆粒大小及使用表面活性劑來保持適當(dāng)?shù)囊簯B(tài)。
這些組合物也可以包含佐劑，如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。預(yù)防微生物的出現(xiàn)可以通過滅菌程序，以及通過引入各種抗細(xì)菌和抗真菌劑如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚山梨酸等。也可能在組合物中需要包括等滲試劑，如糖、氯化鈉等。另外，可以通過在組合物中加入延緩吸收的試劑如一硬脂酸鋁和明膠來延長可注射藥物形式的吸收。
當(dāng)本發(fā)明的化合物在作為藥物給人和動物施用時(shí)，它們可以單獨(dú)給藥，或者作為藥物組合物給藥，所述組合物包含，例如，0.01-99.5％(更優(yōu)選0.005-70％，如0.01-30％)的活性成分結(jié)合以可藥用的載體。
無論選擇什么樣的給藥途徑，可以以合適的水合形式應(yīng)用的本發(fā)明的化合物和/或本發(fā)明的藥物組合物，能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的傳統(tǒng)方法配制成可以藥用的劑量形式。
本發(fā)明的藥物組合物中的實(shí)際劑量水平可以改變，從而獲得可以達(dá)到特定病人所需的治療反應(yīng)的活性成分的量、組合物和給藥方式，而對病人無毒。選定的劑量水平將取決于各種藥代動力學(xué)因素包括本發(fā)明使用的特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性，給藥途徑、給藥時(shí)間、所使用的特定化合物的分泌速度、療程、其它與所使用的特定組合物聯(lián)合使用的藥物、化合物和/或物質(zhì)、年齡、性別、體重、狀況、治療病人的一般健康和過去史等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的因素。本領(lǐng)域中有常規(guī)技術(shù)的醫(yī)生或獸醫(yī)可以輕易判斷并處方需要的藥物組合物的量。例如，醫(yī)生或獸醫(yī)可以以低于獲得需要的療效要求劑量的用于藥物組合物中的本發(fā)明的化合物劑量開始，并逐漸增加劑量，直到達(dá)到需要的療效?？傊?，本發(fā)明的組合物的適當(dāng)劑量是有效產(chǎn)生療效的最低劑量的化合物的量。這種有效劑量一般將取決于前面所描述的因素。優(yōu)選給藥方式為靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下，優(yōu)選接近靶位點(diǎn)給藥。如果需要，治療組合物的的有效日劑量可以選擇作為2、3、4、5、6或更多亞劑量，在一天中的適當(dāng)間隔，以單位劑型分別給藥。盡管本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)給藥，優(yōu)選將化合物作為藥物制劑(組合物)使用。
治療組合物可以通過本領(lǐng)域中的公知醫(yī)學(xué)設(shè)備給藥。例如，在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療組合物可以用無針皮下注射設(shè)備給藥，如在美國專利5,399,163，5,383,851，5,312,335，5,064,413，4,941,880，4,790,824或4,596,556中公開的設(shè)備。本發(fā)明中有用的公知植入物和組件的例子包括美國專利4,487,603，它公開了以控制速率分散藥物的可植入微量滴注泵；美國專利4,486,194，它公開了經(jīng)皮用藥的治療設(shè)備；美國專利4,447,233，它公開了以精確滴注速度運(yùn)送藥物的藥物輸注泵；美國專利4,447,224，它公開了連續(xù)運(yùn)送藥物的可變流量可植入滴注泵；美國專利4,439,196，它公開了一種有多室容器的滲透性藥物運(yùn)送系統(tǒng)；以及美國專利4,475,196，它公開了一種滲透性藥物運(yùn)送系統(tǒng)。在此引入這些專利文獻(xiàn)作為參考。許多其它的這種植入物、運(yùn)送系統(tǒng)和組件在本領(lǐng)域中的技術(shù)人員中是公知的。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體可以為保證體內(nèi)適當(dāng)分布而制劑。例如，血腦屏障(BBB)排除了許多高度親水的化合物。為保證本發(fā)明的治療化合物穿過BBB(如果需要)，它們可以在例如脂質(zhì)體中配制。關(guān)于生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，見，如美國專利4,522,811；5,374,548及5,399,331。脂質(zhì)體可以包括一個(gè)或多個(gè)選擇性運(yùn)送到特定細(xì)胞或器官內(nèi)的部分，這樣增強(qiáng)了導(dǎo)向性藥物運(yùn)送(見，如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。作為例子的導(dǎo)向部分包括葉酸或生物素(見，如Low et al的美國專利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.1531038)；抗體(P.G.Bloeman et al.(1995)FEBS Lett.357140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39180)；表面活性蛋白A受體(Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233134)，可以包含本發(fā)明的制劑和發(fā)明分子成分的不同種類；p120(Schreier etal.(1994)J.Biol.Chem.2699090)；也見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4273。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療化合物在脂質(zhì)體中配制；在一種更優(yōu)的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體包含導(dǎo)向部分。在一種最優(yōu)實(shí)施方案中，脂質(zhì)體中的治療化合物由濃集注射運(yùn)送至腫瘤或感染附近的位點(diǎn)。組合物必須為液體，必需在可以容易注射的范圍內(nèi)。必需在生產(chǎn)和儲存條件下保持穩(wěn)定，并且必需防止微生物如細(xì)菌和真菌污染。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以對本發(fā)明的單克隆抗體進(jìn)行配制以阻止或減少它們通過胎盤的運(yùn)輸。這可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，例如，通過抗體的PEG化或通過利用F(ab)2’片段。還可以參見另外的參考文獻(xiàn)″Cunningham-Rundles C，Zhuo Z，Griffith B，KeenanJ.(1992)Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulinconjugates.Resistance to enzymatic degradation.Jlmmunol Methods.152177-190；和″Landor M.(1995)Maternal-fetal transfer ofimmunoglobulins，Ann AllergyAsthma Immunol 74279-283。當(dāng)抗體用于治療或預(yù)防復(fù)發(fā)的自發(fā)性流產(chǎn)時(shí)這特別有效。
對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的“治療有效劑量”優(yōu)選導(dǎo)致患者中的ACR20初步定義的改進(jìn)，更加優(yōu)選ACR50初步定義的改進(jìn)并且甚至更加優(yōu)選ARC70初步定義的改進(jìn)。
ACR20初步定義的改進(jìn)定義為在關(guān)節(jié)觸痛計(jì)數(shù)(TCJ)和腫脹關(guān)節(jié)(SWJ)中≥20％的改善，和在下列5種評估患者疼痛評估(VAS)、患者整體評估(VAS)、醫(yī)生整體評估(VAS)、患者自我評估的失能(HAQ)、急性期反應(yīng)物(CRP或ESR)的3種中≥20％的改善。
ACR50和ACR70分別以相同的方式定義為≥50％和≥70％的改善。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參見Felson等.American College of RheumatologyPreliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis；Arthritis Rheumatism(1995)38727-735。
可以在一種動物模型系統(tǒng)中評估一種化合物抑制癌癥的能力以預(yù)測其在人腫瘤中的效力。或者，可以通過熟練技術(shù)人員已知的測試法體外檢測該化合物抑制細(xì)胞生長或凋亡的能力來評估該化合物的特性。一種治療性化合物的治療有效量可以減少腫瘤大小，或者在受試者中改善癥狀。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠基于諸如受試者體形、受試者癥狀的嚴(yán)重性和所選的特定組合物或給藥途徑的因素來確定這種量。
還可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法評估所述抗體治療或預(yù)防牛皮癬的能力。
所述組合物必須是無菌的，并且其流動性必須達(dá)到使該組合物能夠通過注射器輸送的程度。除了水之外，所述載體可以是等滲的緩沖鹽溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物。例如，合適的流動性可以通過使用諸如卵磷脂的包被物，對于分散劑來說通過保持需要的粒度，以及通過使用表面活性劑來保持。在許多情況下，優(yōu)選在所述組合物中添加等滲劑，例如，糖類，諸如甘露糖醇或山梨醇的聚醇，和氯化鈉?？梢酝ㄟ^在該組合物中添加諸如一硬脂酸鋁或明膠的能延長吸收的制劑而實(shí)現(xiàn)可注射組合物的長期吸收。
當(dāng)所述活性化合物如上所述受到適當(dāng)保護(hù)時(shí)，該化合物就可以口服，例如，用一種惰性稀釋劑或可同化的食用載體進(jìn)行保護(hù)。
V.本發(fā)明的用途和方法本發(fā)明的抗IL-15的人抗IL-15抗體(包括所述抗體的衍生物和結(jié)合物)和包含該抗體的組合物可以用于很多體外和體內(nèi)的診斷和治療用途。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人抗體用于抑制IL-15誘導(dǎo)的T細(xì)胞和/或單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的TNF-α生產(chǎn)，優(yōu)選不抑制由諸如IL-2的其它細(xì)胞因子誘導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)。通過將所述抗體與IL-15接觸(例如，通過給予受試者所述抗體)，抑制IL-15通過IL-15受體傳遞信號的能力，并且因此也抑制T細(xì)胞和/或單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的TNF-α生產(chǎn)。優(yōu)選的抗體結(jié)合對于IL-15特異性的表位(例如，特定亞基，如γ亞基)，并且因而有利地抑制IL-15誘導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)，但不干擾結(jié)構(gòu)上相關(guān)的細(xì)胞因子，如IL-2的TNF-α生產(chǎn)。
或者，利用人抗體干擾IL-15受體IL-15受體α-，β-和γ-鏈組裝和/或抑制鄰近細(xì)胞上的組裝，所述鄰近細(xì)胞表達(dá)β-和γ-鏈作為IL-15受體或另一種細(xì)胞因子受體的部分。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，利用本發(fā)明的人抗體抑制IL-15誘導(dǎo)的T細(xì)胞募集和/或增殖，優(yōu)選不抑制由其它結(jié)構(gòu)上相關(guān)的細(xì)胞因子，如IL-2的誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖。隨著TNF-α生產(chǎn)，通過將所述抗體與IL-15接觸(例如，通過給予受試者所述抗體)，抑制IL-15通過IL-15受體傳遞信號的能力，并且因此也抑制了由IL-15進(jìn)行的T細(xì)胞刺激。
因此，仍在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種通過以對于治療或預(yù)防由IL-15介導(dǎo)的病癥(例如，自身免疫病，如牛皮癬，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，或炎性腸病，或感染性病癥，如HIV)有效的量給受試者施用本發(fā)明的人抗體來治療或預(yù)防該病癥的方法?？贵w可以單獨(dú)給藥或與另一種治療劑一起給藥，所述治療劑如抗炎劑，例如，甾體或非甾體抗炎劑，或與抗體結(jié)合或協(xié)同性作用來治療或預(yù)防IL-15介導(dǎo)的疾病的細(xì)胞毒素。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，利用本發(fā)明的人抗體治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。所述抗體限制IL-15在與諸如RA的疾病相關(guān)聯(lián)的炎癥的進(jìn)展中發(fā)揮的作用。T細(xì)胞，特別是CD4+T-輔助細(xì)胞參與RA中炎癥過程的起始和維持。另一種細(xì)胞因子TNF-α也參與炎癥途徑，它最終導(dǎo)致RA患者的關(guān)節(jié)破壞和失能。IL-15的局部合成在T細(xì)胞的激活和募集中和在TNF-α和其它炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在RA進(jìn)展中IL-15的作用涉及一種過程，其中由巨噬細(xì)胞合成的IL-15誘導(dǎo)T細(xì)胞募集。激活的T細(xì)胞隨后(1)維持巨噬細(xì)胞活化；和(2)誘導(dǎo)TNF-α生產(chǎn)。被刺激的巨噬細(xì)胞促進(jìn)更多IL-15的合成和T細(xì)胞激活，因而繼續(xù)該循環(huán)。除了它對于TNF-α和巨噬細(xì)胞的作用之外，IL-15還激活嗜中性粒細(xì)胞并影響局部B細(xì)胞免疫球蛋白分泌，特別是類風(fēng)濕因子合成。
因此，本發(fā)明的抗IL-15抗體能夠用于預(yù)防或阻斷引發(fā)RA的IL-15的以上作用，并且因而能夠用于預(yù)防或治療這種疾病。例如，本發(fā)明的抗IL-15抗體能夠用于抑制炎癥和/或預(yù)防涉及RA的激活的白細(xì)胞的趨化性。
本發(fā)明的人抗體可以用來抑制對于氨甲蝶呤反應(yīng)不足的類風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎患者中的結(jié)構(gòu)破壞的進(jìn)展，減輕體征和癥狀，并且延緩中度到重度活動性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中的結(jié)構(gòu)破壞，所述患者包括以前DMARD治療未失敗的患者。
還可以利用本發(fā)明的人抗體阻斷或抑制IL-15的其它作用。IL-15在包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、樹突細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的多種細(xì)胞中表達(dá)。角質(zhì)細(xì)胞是粘膜組織的表皮和上皮層的主要組分。角質(zhì)細(xì)胞生長的控制由細(xì)胞因子和生長因子的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)，某些所述因子由角質(zhì)細(xì)胞本身產(chǎn)生。源于角質(zhì)細(xì)胞的IL-15有助于牛皮癬斑中T細(xì)胞的聚集、增殖和存活。已知多種疾病(其中角質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目提高)導(dǎo)致表皮過度增生，其對于至少某些相關(guān)疾病癥狀負(fù)責(zé)。這些疾病包括慢性病如牛皮癬和特應(yīng)性皮炎，以及像慢性手濕疹、接觸性皮炎、病毒性疣(HPV相關(guān)的)、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、諸如由于糖尿病引起的傷口愈合不良的傷口愈合不良的疾病。因此，本發(fā)明提供一種通過以對于治療或預(yù)防病癥有效的量給予患者本發(fā)明的人抗IL-15抗體來治療或預(yù)防這類病癥的方法。例如，能夠利用本發(fā)明的抗IL-15抗體阻斷或抑制牛皮癬中的角化不全，減小牛皮癬中的表皮厚度，并且減少牛皮癬中角質(zhì)細(xì)胞的增殖。
IL-15還調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的功能(Reinecker等，(1996)Gastroenterology 1111706-13)。具體地，IL-15可以引起粘膜上皮細(xì)胞上和腸上皮細(xì)胞系上的變化，因而參與炎性腸病，例如乳糜瀉病的發(fā)病機(jī)制。IL-15在這類疾病中的作用被患有乳糜瀉病的未治療患者的小腸中IL-15+細(xì)胞的選擇性過度呈現(xiàn)所顯示(WO 00/02582)。因而，已經(jīng)顯示IL-15直接參與乳糜瀉病的起始和維持。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過將抗體以對于治療或預(yù)防病癥有效的量向患者給藥，本發(fā)明的抗IL-15人抗體(即，它抑制IL-15的促炎作用)可以用來治療和/或預(yù)防乳糜瀉病。
此外，本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)IL-15還促進(jìn)新血管的形成，一種稱作新血管形成或血管發(fā)生的過程。因此，本發(fā)明抗體的另一種用途包括涉及新血管形成的疾病的預(yù)防或治療。除了炎性疾病之外，這些疾病包括多種依賴新血管形成或特征為新血管形成的癌癥。
本發(fā)明的人抗體還可以用于阻斷或抑制與諸如HIV的感染性疾病相關(guān)聯(lián)的IL-15的作用。因此，本發(fā)明抗體的另一種用途包括感染性疾病，例如HIV-1的預(yù)防或治療。
例如，所述抗體可以在體外或體內(nèi)用于診斷由IL-15介導(dǎo)的多種疾病。具體地，所述抗體能夠用于檢測IL-15的水平，或細(xì)胞的水平，所述細(xì)胞在其膜表面包含IL-15，或包含連接到其受體上的IL-15(受體結(jié)合的人IL-15)。隨后可以將這種水平的IL-15的檢測與某些疾病癥狀相關(guān)聯(lián)?；蛘?，所述抗體可以用于抑制或阻斷IL-15功能，這接下來能夠預(yù)防或改善由IL-15功能所引發(fā)的疾病癥狀。
如前所述，本發(fā)明的人抗IL-15抗體能夠與一種或其它的更多治療劑一起共同給藥，例如，一種免疫抑制劑或一種抗炎劑以提高整體抗炎作用。所述抗體能夠連接到所述藥劑上(作為一種免疫復(fù)合物)或能夠與所述藥劑分開進(jìn)行給藥。在后一種情況中(分開給藥)，所述抗體能夠在所述藥劑之前、之后或同時(shí)進(jìn)行給藥。合適的治療劑包括，但不限于，抗炎劑、DMARDs(改變疾病的抗風(fēng)濕性藥物)、免疫抑制劑、化療劑和牛皮癬藥劑。根據(jù)本發(fā)明的人抗體還可以結(jié)合放療進(jìn)行給藥。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人抗體可以結(jié)合其它的抗體，如CD4特異性抗體和IL-2特異性抗體進(jìn)行給藥。據(jù)認(rèn)為本發(fā)明人抗體與CD4特異性抗體和IL-2特異性抗體的組合對于治療自身免疫疾病和移植排斥特別有用。
包含本發(fā)明的人抗IL-15抗體和，任選地，使用說明書的試劑盒也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。所述試劑盒可以進(jìn)一步包含一種或多種其它試劑，如免疫抑制劑，或一種或多種其它的本發(fā)明的人抗體(例如，一種具有互補(bǔ)活性的人抗體，它與第一種人抗體結(jié)合IL-15抗原中的不同表位)。
因此，用本發(fā)明的抗體治療的患者能夠另外用另一種治療劑，如增強(qiáng)或擴(kuò)大人抗體治療作用的抗炎劑進(jìn)行給藥(在本發(fā)明人抗體給藥之前，同時(shí)或之后)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人抗體能夠通過將化合物連接到所述抗體而用于將所述化合物(例如，治療劑、標(biāo)記、細(xì)胞毒素、免疫抑制劑等)靶向細(xì)胞，所述細(xì)胞具有IL-15結(jié)合于其表面(例如，膜結(jié)合的)或結(jié)合于IL-15受體上。因此，本發(fā)明還提供定位來自體內(nèi)、體內(nèi)或體外的表達(dá)IL-15和IL-15受體的細(xì)胞的方法(例如，用一種可檢測的標(biāo)記，如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案描述于下列實(shí)施例中。
通過下列實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，所述實(shí)施例不應(yīng)被認(rèn)為是進(jìn)一步限制性的。特此將整個(gè)本說明書中的序列表內(nèi)容、圖和引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請都并入本文作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1 Cmu靶向小鼠的制備CMD靶向載體的構(gòu)建質(zhì)粒pICEmu包含一個(gè)跨mu基因，從Balb/C基因組λ噬菌體文庫中獲得的鼠Ig重鏈基因座的EcoRI/XhoI片段(Marcu et al.Cell22187，1980)。此基因組片段被亞克隆到質(zhì)粒pICEM19H的XhoI/EcoR位點(diǎn)(Marsh et al；Gene 32，481-485，1984)。包含在pICEmu的重鏈序列從mu內(nèi)含子增強(qiáng)子3′的EcoRI位點(diǎn)向下游延伸到mu基因最后一個(gè)跨膜外顯子下游約1kb的XhoI位點(diǎn)；然而，通過在大腸桿菌中傳代，許多mu轉(zhuǎn)換重復(fù)區(qū)域被去除。
導(dǎo)向載體按如下方法建立。將一個(gè)1.3kb的HindIII/SmaI片段從pICEmu切除并亞克隆到HindIII/SmaI消化的pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)。此pICEmu片段從位于Cmu1 5′端約1kb的HindIII位點(diǎn)延伸到Cmu1內(nèi)部的SmaI位點(diǎn)。產(chǎn)生的質(zhì)粒用SmaI/SpeI消化，然后插入一個(gè)約4kb的從pICEmu得到的，從Cmu13′的SmaI位點(diǎn)延伸到最后一個(gè)Cmu外顯子下游的XbaI位點(diǎn)的SmaI/XbaI片段。產(chǎn)生的質(zhì)粒pTAR1在SmaI位點(diǎn)被線性化，插入一個(gè)neo表達(dá)盒。該盒包含一個(gè)在小鼠磷酸甘油激酶(pkg)啟動子(XbaI/TaqI片段；Adra et al.(1987)Gene 6065-74)轉(zhuǎn)錄控制下并包含pkg聚腺苷酸化位點(diǎn)(PvuII/HindIII片段；Boer et al.(1990)Biochemical Genetics 28299-308)的neo基因。該盒從質(zhì)粒pKJ1(Tybulewicz et al.(1991)Cell 651153-1163有描述)得到，neo盒作為EcoRI/HindIII片段被切除并亞克隆到EcoRI/HindIII消化的pGEM-7Zf(+)而產(chǎn)生pGEM-7(KJ1)。Neo盒從pGEM-7(KJ1)通過EcoRI/SalI消化被切除，為平端，并被亞克隆到質(zhì)粒pTAR1的SmaI位點(diǎn)，與基因組Cmu序列方向相反。產(chǎn)生的質(zhì)粒被Not I線性化，插入一個(gè)單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)盒，這樣可以允許有同源重組的ES克隆富集，如Mansour et al.(1988)Nature 336348-352的描述。該盒包含了其兩端為小鼠pgk啟動子和聚腺苷酸化位點(diǎn)的tk基因編碼序列，如Tybulewicz et al.(1991)Cell 651153-1163的描述。產(chǎn)生的CMD導(dǎo)向載體包含與重鏈基因座總共約5.3kb的同源性，并設(shè)計(jì)產(chǎn)生在第一個(gè)Cmu外顯子的唯一SmaI位點(diǎn)插入neo表達(dá)盒的突變mu基因。導(dǎo)向載體在電穿孔到ES細(xì)胞之前，用在質(zhì)粒序列內(nèi)部切割的PvuI線性化。
靶ES細(xì)胞的產(chǎn)生和分析AB-1 ES細(xì)胞(McMahon，A.P.and Bradley，A.，(1990)Cell621073-1085)在有絲分裂不活躍的SNL76/7細(xì)胞飼養(yǎng)層(ibid.)上生長，基本如(Robertson，E.J.(1987)，Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cellsa Practical Approach(E.J.Robertson，ed.)OxfordIRL Press，p.71-112)所描述。線性化的CMD導(dǎo)向載體通過Hasty等描述的方法(Hasty，P.R.Et al.(1991)Nature 350243-246)被電穿孔到AB-1細(xì)胞中。被電穿孔的細(xì)胞以1-2×106個(gè)細(xì)胞/平皿的密度被平鋪到100mm的平皿。24小時(shí)后，將G418(200mg/ml活性成分)和FIAU(5×10-7M)加入培養(yǎng)基，抗藥克隆允許培養(yǎng)8-9天。挑選克隆，用胰蛋白酶消化，分為兩部分，并進(jìn)一步擴(kuò)展。然后從每個(gè)克隆得到的細(xì)胞的一半被冷凍，另一半為進(jìn)行載體和靶序列之間的同源重組而進(jìn)行分析。
DNA分析通過DNA印跡雜交執(zhí)行。按Laird等描述的方法(Laird，P.W.et al.，(1991)Nucleic Acids Res.194293)將DNA從克隆中分離。分離的基因組DNA用SpeI消化并用一個(gè)與mu內(nèi)含子增強(qiáng)子和mu轉(zhuǎn)換區(qū)之間的序列雜交的915bp的SacI片段即探針A探測。探針A檢測野生型基因座的一個(gè)9.9kb的SacI片段和mu基因座的一個(gè)與CMD導(dǎo)向載體同源重組(neu表達(dá)盒包含一個(gè)SpeI位點(diǎn))的7.6kb的鑒別帶。在DNA印跡分析篩選的1132個(gè)抗G418和FIAU克隆中，3個(gè)顯示出了提示mu基因座同源重組的7.6kb的Spe I帶。用酶BglI，BstXI和EcoRI進(jìn)一步消化這3個(gè)克隆，證明載體被同源性整合到mu基因中。當(dāng)與探針A雜交后，用BglI，BstXI或EcoRI消化的野生型DNA的印記分別產(chǎn)生15.7，7.3和12.5kb的片段，而靶mu等位基因的存在分別由7.7，6.6，和14.3kb的片段提示。由SpeI消化檢測的所有3個(gè)陽性克隆表現(xiàn)出預(yù)期的鑒別neo盒插入Cmu1外顯子的BglI，BstXI和EcoRI限制片段。
具有突變mu基因的小鼠的產(chǎn)生將這三個(gè)編號為264，272和408的靶ES克隆融化并按Bradley在Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cellsa Practical Approach(E.J.Robertson，ed.)OxfordIRL Press，p.113-151)中描述的方法注射入C57BL/6J胚泡。將被注入的胚泡轉(zhuǎn)移到假孕雌性小鼠中產(chǎn)生表現(xiàn)從引入ES細(xì)胞和宿主胚泡細(xì)胞衍生的細(xì)胞混合的嵌合小鼠。ES細(xì)胞對嵌合體的貢獻(xiàn)可以由黑色C57BL/BJ背景上的從ES細(xì)胞系衍生的灰色皮毛顏色數(shù)量用肉眼估計(jì)?？寺?72和408只產(chǎn)生低百分比的嵌合體(即低百分比灰色色素)，但克隆264產(chǎn)生高百分比的雄性嵌合體。這些嵌合體與C57BL/J6雌鼠雜交并產(chǎn)生灰色后代，提示ES細(xì)胞基因組的種系轉(zhuǎn)移。對靶mu基因的篩選是通過對尾部解剖得到的DNA用BglI消化進(jìn)行DNA印跡分析而執(zhí)行的(如前面所描述的ES細(xì)胞DNA分析)。約50％的灰色后代除了野生型的15.7kb帶，也表現(xiàn)出7.7kb的雜交BglI帶，證明了靶mu基因的種系轉(zhuǎn)移。
mu基因功能性滅活的轉(zhuǎn)基因小鼠的分析為判斷neo盒插入到Cmu1是否滅活了Ig重鏈基因，將一只克隆264的嵌合體與一只JHD突變純合小鼠雜交，JHD突變由于去除JH基因段而導(dǎo)致重鏈表達(dá)失活(Chen et al，(1993)Immunol.5647-656)。產(chǎn)生四只灰色后代。從1月齡的這些動物中得到血清并用ELISA測定鼠IgM的存在。四只后代中的兩只完全缺失IgM(見表1)。從尾部解剖得到的DNA用BglI消化并與探針A雜交，以及通過用StuI消化并與一個(gè)475bp的EcoRI/StuI片段(ibid)雜交，DNA印跡分析測定的四只動物的基因型證明，不能表達(dá)血清IgM的動物重鏈基因座中的一個(gè)等位基因有JHD突變，另一個(gè)有Cmul突變。JHD突變的雜合小鼠顯示野生型水平的血清Ig。這些資料證明Cmul突變滅活mu基因的表達(dá)。
表1
表1表示由ELISA檢測的，有CMD和JHD突變(CMD/JHD)的小鼠，JHD突變雜合子小鼠(+/JHD)，野生型(129SV×C57BL/6J)F1小鼠(+/+)及B細(xì)胞缺陷JHD突變純合小鼠(JHD/JHD)的血清IgM水平。
實(shí)施例2 HCO12轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
HCO12人量鏈轉(zhuǎn)基因HCO12轉(zhuǎn)基因通過共同注射80kb的pHC2插入片段(Taylor etal.，1994，Int.Immunol.，6579-591)和25kb的pVx6插入片段產(chǎn)生。質(zhì)粒pVx6按如下方法建立。
一個(gè)包含種系人VH1-18(DP-14)基因以及約2.5kb的5′側(cè)翼和5kb的3′側(cè)翼基因組序列的8.5kb的HindIII/SalI DNA片段被亞克隆到質(zhì)粒載體pSP72(Promega，Madison，WI)產(chǎn)生質(zhì)粒p343.7.16。一個(gè)包含種系人VH5-51(DP-73)基因以及約5kb的5′側(cè)翼和1kb的3′側(cè)翼基因組序列的7kb的BanHI/HindIII DNA片段被克隆到基于pBR322的質(zhì)粒克隆載體pGP1f(Taylor et al.1992，Nucleic AcidsRes.206287-6295)產(chǎn)生質(zhì)粒p251f。從pGP1f衍生的一個(gè)新克隆載體pGP1k(SEQ ID NO13)被EcoRV/BamHI消化并與一個(gè)包含種系人VH3-23(DP-47)基因以及約4kb的5′側(cè)翼和5kb的3′側(cè)翼基因組序列的10kb的EcoRV/BamHI DNA片段連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒p112.2RR.7被BamHI/SalI消化并與p251f的7kb的純化BamHI/SalI插入片段連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒pVx4用XhoI消化并與p343.7.16的8.5kb的XhoI/SalI插入片段連接。
獲得了一個(gè)VH1-18基因與另外兩個(gè)V基因方向相同的克隆。然后這個(gè)稱為pV×6的克隆被NotI消化，按Hogan等的描述(B.Hoganet al.，Manipulating the Mouse embryo，A Laboratory Manual，2ndedition，1994，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)，純化的26kb插入片段與純化的pHC2的80kb NotI插入片段以1∶1的摩爾比共同注射到半天的(C57BL/6J×DBA/2J)F2胚胎原核中。從注入的胚胎發(fā)育的小鼠建立了三個(gè)包含從Vx6和HC2得到的序列的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因小鼠系。這些系被指定為(HCO12)14881，(HCO12)15083，(HCO12)15087。然后將這三個(gè)系的每一個(gè)與包含實(shí)施例1中描述的CMD突變、JKD突變(Chen et al.1993，EMBOJ.12811-820)和(Kco5)9272轉(zhuǎn)基因(Fishwild et al.1996，NatureBiotechnology 14845-851)的小鼠雜交。產(chǎn)生的小鼠在破壞內(nèi)源性小鼠重鏈和κ輕鏈基因座為純合的背景下表達(dá)人重鏈和κ輕鏈轉(zhuǎn)基因。
實(shí)施例3抗IL-15的人單克隆抗體的生產(chǎn)用添加了完全弗氏佐劑(CFA，批號121024LA，DifcoLaboratories，Detroit，Michigan，USA)或不完全弗氏佐劑(ICFA，批號121195LA，Difco)的人重組IL-15(hIL-15，Immunex corp.，Seattle，USA)通過皮下(SC)、腹膜內(nèi)(IP)或靜脈內(nèi)(IV)對如上制備的并由Medarex，San José，CA，USA提供的HCo12和HCo7轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫。在幾種情況下，利用偶聯(lián)到KLH上的hIL-15進(jìn)行免疫。在用添加了完全或不完全弗氏佐劑的hIL-15加強(qiáng)幾次后，對小鼠血清測試抗IL-15的人抗體的存在。
導(dǎo)致最終克隆146B7，146H5，404E4和404A8的轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫方案小鼠號碼146(HCo12)，ID 995-146，雌性170699 SC 12μg hIL-15于CFA(Difco，批號121024LA)中010799 SC 12μg hIL-15于ICFA(Difco，批號121195LA)中150799 SC 12μg hIL-15于ICFA中020899 SC 12μg hIL-15-KLH于ICFA中070999 SC 12μg hIL-15-KLH于ICFA中280999 SC 12μg hIL-15-KLH于CFA中111099 IV 30μg hIL-15于PBS中121099 IV 30μg hIL-15于PBS中151099該小鼠的淋巴結(jié)和脾細(xì)胞與SP2/0融合小鼠號碼404(HCo7)，ID 997-404，雌性201099 IP 25μg hIL-15-KLH于CFA(Difco，批號121024LA)中031199 IP 12.5μg hIL-15，12.5μg hIL-15-KLH，25μg于ICFA(Difco，批號121195LA)中101199 IV 12.5μg hIL-15，12.5μg hIL-15-KLH121199 IV 12.5μg hIL-15，12.5μg hIL-15-KLH191199該小鼠的淋巴結(jié)和脾細(xì)胞與SP2/0融合培養(yǎng)基融合配偶體培養(yǎng)基(FPM)
將Iscoves改進(jìn)的Dulbecco’s培養(yǎng)基添加100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，1mM丙酮酸鈉，0.5mMβ-巰基乙醇(LifeTechnologies，Paisley，Scotland)和10％熱滅活的胎牛血清(HyClone，Utah，USA)。
融合選擇培養(yǎng)基(FSM)添加了30ml Origen雜交瘤克隆因子(IGEN，Gaithersburg，MD，USA)，HAT(1管瓶，制造商推薦的濃度，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)和0.5mg/ml卡那霉素(Life Technologies，Paisley，Scotland)的FPM。
融合克隆培養(yǎng)基(FCM)添加了20ml Origen雜交瘤克隆因子(IGEN，Gaithersburg，MD，USA)，HT(1管瓶，制造商推薦的濃度，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)和0.5mg/ml卡那霉素(Life Technologies，Paisley，Scotland)的FPM。
雜交瘤的制備脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的融合為了獲得雜交瘤，從小鼠中移除脾、腹股溝和主動脈旁的淋巴結(jié)。以細(xì)胞比例1∶2將脾和淋巴節(jié)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合。將細(xì)胞離心下來并于37℃將沉淀輕輕重懸于1ml聚乙烯二醇(50％w/v，溶于PBS，Sigma-Aldrich，Irvine，UK)。在將細(xì)胞渦漩60秒之后，加入25ml FPM-2并將細(xì)胞于37℃孵育30-60分鐘。孵育后，以0.75×105細(xì)胞/孔(于100μl)的細(xì)胞濃度在FSM中于96孔板里培養(yǎng)細(xì)胞。3天后，向每個(gè)孔中加入100μl FSM。
用hIL-15免疫的HCo7和HCo12小鼠的脾和淋巴結(jié)的融合導(dǎo)致幾種產(chǎn)生抗IL-15的雜交瘤的產(chǎn)生。分離出下列四種穩(wěn)定的產(chǎn)生完全的人抗IL-15抗體的克隆(1)146LyD7F7B7重新命名為146B7；(2)146DE2E12A3H5重新命名為146H5；(3)404CG11B7E4重新命名為404E4；和(4)404FB12E7A8重新命名為404A8。這些克隆都是人IgG1/k亞類。
雜交瘤的篩選在融合后的第7和第11天之間，利用下列ELISAs對所述孔篩選人抗體的存在在培養(yǎng)物上清液中篩選人IgG存在的ELISA
為了實(shí)施ELISA以檢測人IgG抗體的存在，將100μl/孔的于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的0.9μg/ml兔-α-k-輕鏈抗體(DAKO，Glostrup，Denmark)加至Nunc Maxisorp ELISA板(于室溫孵育過夜)。在用添加了雞血清(2％；Life Technologies，Paisley，Scotland)和Tween-20(0.05％；PBSTC)的PBS封閉板之后，加入培養(yǎng)物上清液。孵育1.5小時(shí)之后，洗滌板并加入稀釋于PBSTC中0.5μg/ml的偶聯(lián)了辣根過氧化物酶(DAKO，Glostrup，Denmark)的兔-α-人IgG(Fab2-片段)。孵育1小時(shí)之后，洗滌孔并根據(jù)生產(chǎn)商的方法加入底物ABTS(2，2’-連氮基雙-3-ethylbenzthiazoline-磺酸，RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)，并在EL808 ELISA讀數(shù)器(Bio-tek Instruments，Winooski，VT，USA)中于405nm評估抗體結(jié)合。
篩選IL-15特異性抗體存在的ELISA對包含人IgG/k抗體的孔進(jìn)一步測試在IL-15特異性ELISA中人抗IL-15抗體的存在。為了實(shí)施ELISA，將100μl/孔的于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的1μg/ml IL-15加至Nunc Maxisorp ELISA板(于室溫孵育過夜)。在用添加了雞血清(2％；Life Technologies，Paisley，Scotland)和Tween-20(0.05％；PBSTC)的PBS封閉板之后，加入培養(yǎng)物上清液。孵育1.5小時(shí)之后，洗滌板并加入1/5000稀釋于PBSTC中的偶聯(lián)了辣根過氧化物酶的α-人IgG Fc(Jackson Immunoresearch，West Grove，Pennsylvania，USA)。孵育1小時(shí)之后，洗滌孔并根據(jù)生產(chǎn)商的方法加入底物ABTS(2，2’-連氮基雙-3-ethylbenzthiazoline-磺酸，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)，并在EL808 ELISA讀數(shù)器(Bio-tek Instruments，Winooski，VT，USA)中于405nm評估抗體結(jié)合。
雜交瘤的亞克隆為了獲得穩(wěn)定的抗IL-15細(xì)胞系，通過細(xì)胞的限制性稀釋(至0.5細(xì)胞/孔)在96孔板中對雜交瘤進(jìn)行亞克隆。
在大約10天后用上面提到的IL-15 ELISA對亞克隆進(jìn)行測試。在幾個(gè)亞克隆過程中，F(xiàn)SM經(jīng)由FCM到FPM進(jìn)行同相改變。用下面描述的ELISA測定所述亞克隆的同種型。
通過ELISA進(jìn)行抗IL-15抗體的同種型測定為了實(shí)施同種型ELISA，將100μl/孔的于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的1μg/ml抗人Fc(Jackson Immuno research)加至Nunc MaxisorpELISA板(于室溫孵育過夜)。在用添加了雞血清(2％；LifeTechnologies，Paisley，Scotland)和Tween-20(0.05％；PBSTC)的PBS封閉板之后，加入培養(yǎng)物上清液。孵育1.5小時(shí)之后，洗滌板并加入偶聯(lián)了堿性磷酸酶(Zymed，plaats，land)的小鼠-α-HuIgG1，或偶聯(lián)了辣根過氧化物酶(Zymed)的小鼠-α-HuIgG3。孵育1小時(shí)之后，洗滌孔并根據(jù)生產(chǎn)商的方法加入底物ABTS(2，2’-連氮基雙-3-ethylbenzthiazoline-磺酸，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)。在EL808 ELISA讀數(shù)器(Bio-tek Instruments，Winooski，VT，USA)中于405nm評估抗體結(jié)合。
實(shí)施例4完全的人抗IL-15抗體的表位特異性為了在治療上發(fā)揮功能并抑制IL-15誘導(dǎo)的促炎作用，IL-15特異性抗體需要識別參與和IL-15受體IL-2Rβ鏈和/或γ鏈相互作用的IL-15表位。
利用突變體蛋白質(zhì)(Pettit等所描述的)評估完全的人抗IL-15抗體，146B7，146H5，404A8和404E4的表位特異性。所用的IL-15突變體包括IL-15突變體Q108S(殘基108上的Gln被Ser替換；γ鏈相互作用位點(diǎn)上的突變)和突變體D8SQ108S(殘基108上的Gln被Ser替換并且在位置8上的Asp被取代為Ser；IL-15的β和γ鏈相互作用位點(diǎn)上的突變)。
測定hIL-15特異性抗體146B7，147H5，404A8和404E4結(jié)合hIL-15和突變體IL-15蛋白的ELISA為了實(shí)施ELISA，將100μl的于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的1μg/ml IL-15或hIL-15突變體蛋白加至Nunc Maxisorp ELISA板進(jìn)行涂布。在用添加了雞血清(2％；Life Technologies，Paisley，Scotland)和Tween-20(0.05％；PBSTC)的PBS封閉板之后，對hIL-15特異性抗體的系列稀釋物進(jìn)行孵育。洗滌后，加入1/5000稀釋于PBSTC中的偶聯(lián)了過氧化物酶的α-人IgG Fc(Jackson Immunoresearch，West Grove，Pennsylvania，USA)。在洗滌底物之后，根據(jù)生產(chǎn)商的方法加入ABTS(2，2’-連氮基雙-3-ethylbenzthiazoline-磺酸，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)，并在EL808 ELISA讀數(shù)器(Bio-tek Instruments，Winooski，VT，USA)中于405nm評估抗體結(jié)合。
完全的人IL-15特異性抗體146B7，146H5，404A8和404E4結(jié)合hIL-15和IL-15突變體蛋白Q108S和D8SQ108S顯示于圖1中。146B7和146H5都不能結(jié)合這些突變體IL-15蛋白。由于兩種突變體都攜帶Q108S突變，146B7和146H5所識別的表位在IL-15的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域中，它與IL-15受體的γ鏈相互作用。404A8和404E4都能夠結(jié)合所述突變體蛋白，所以，這些抗體識別IL-15的β和γ鏈相互作用結(jié)構(gòu)域之外的表位。146B7和146H5都在與IL-15受體的γ鏈相互作用的區(qū)域上結(jié)合IL-15。這與獲自增殖分析的數(shù)據(jù)相一致，所述增殖分析利用本發(fā)明的完全的人抗IL-15抗體。如下面詳細(xì)描述的，404A8和404E4都不能夠抑制IL-15誘導(dǎo)的CTLL-2細(xì)胞和人PBMCs的增殖。146B7和146H5都能夠抑制IL-15誘導(dǎo)的增殖。另外，通過阻斷IL-15與IL-15受體γ亞基的相互作用來實(shí)現(xiàn)增殖的抑制。
實(shí)施例5146B7的VH和VL區(qū)序列利用下列方法測定146B7的重排VH和VL區(qū)的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列。這些序列給出有關(guān)所用的VH和VL種系家族的信息；在這些種系序列中的點(diǎn)突變歸因于在動物免疫的過程中B細(xì)胞的親和力成熟。
RNA制備根據(jù)生產(chǎn)商的方法用RNAzol(Biogenesis，Poole，England)從5×106146B7雜交瘤細(xì)胞中制備總RNA。
cDNA制備根據(jù)生產(chǎn)商的方法用AMV反轉(zhuǎn)錄酶與緩沖液(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany)，oligo d(T)15(Promega，Madison，WI，USA)，dNTP(Boehringer Mannheim corp.，USA)和RNAsin(Promega)從3μg總RNA中制備來自146B7的RNA的cDNA。
用來擴(kuò)增VH和VL區(qū)以進(jìn)行克隆的PCR引物所用的引物對VH
FR1 5’引物(1)AB62 CAg gTK CAg CTg gTg CAg TC(2)AB63 SAg gTg CAg CTg KTg gAg TC(3)AB65 gAg gTg CAg CTg gTg CAg TCVH前導(dǎo)區(qū)5’引物(4)AB85 ATg gAC Tgg ACC Tgg AgC ATC(5)AB86 ATg gAA TTg ggg CTg AgC Tg(6)AB87 ATg gAg TTT ggR CTg AgC Tg(7)AB88 ATg AAA CAC CTg Tgg TTC TTC(8)AB89 ATg ggg TCA ACC gCC ATC CTVH3’引物(9)AB90 TgC CAg ggg gAA gAC CgA TggVKFR1 5’引物(1)AB8RAC ATC CAg ATg AYC CAg TC(2)AB9gYC ATC YRg ATg ACC CAg TC(3)AB10 gAT ATT gTg ATg ACC CAg AC(4)AB11 gAA ATT gTg TTg ACR CAg TC(5)AB12 gAA ATW gTR ATg ACA CAg TC(6)AB13 gAT gTT gTg ATg ACA CAG TC(7)AB14 gAA ATT gTg CTg ACT CAg TCVk前導(dǎo)區(qū)5’引物(8)AB123 CCC gCT Cag CTC CTg ggg CTC CTg(9)AB124 CCC TgC TCA gCT CCT ggg gCT gC(10)AB125 CCC AgC gCA gCT TCT CTT CCT CCT gC(11)AB126 ATg gAA CCA Tgg AAg CCC CAg CAC AgC
VK3’引物(12)AB16 Cgg gAA gAT gAA gAC AgA Tg用來擴(kuò)增VH和VL區(qū)以進(jìn)行克隆的PCR條件用AmpliTaq聚合酶(Perkin Elmer)在GeneAmp PCR System9700(Perkin Elmer Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)上進(jìn)行PCR反應(yīng)。
PCR循環(huán)方案94°2’11個(gè)循環(huán)94°30”65°30”，-1°/循環(huán)72°30”30個(gè)循環(huán)94°30”55°30”72°30”72°10’冷卻至4°在pGEMT-載體系統(tǒng)I中VH和VL的克隆在于瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物后，用S-400或S300微離心柱(Amersham Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ，USA)，或用QIAEX II凝膠提取試劑盒(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)對產(chǎn)物進(jìn)行純化。對于每個(gè)實(shí)驗(yàn)來說，根據(jù)生產(chǎn)商的方法，利用FR1或前導(dǎo)區(qū)引物，將兩種獨(dú)立擴(kuò)增的每個(gè)VH和VL區(qū)的PCR產(chǎn)物克隆于pGEMT載體系統(tǒng)I(Promega)中。
在轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α之后，利用T7和SP6通過于55°下30個(gè)循環(huán)的菌落PCR篩選單個(gè)菌落。利用Qiaprep Spin微量制備試劑盒(Qiagen)純化來自每一單個(gè)菌落的質(zhì)粒DNA。為了進(jìn)一步分析，實(shí)施Nco1/Not1(NE Biolabs，United Kingdom and RocheDiagnostics)消化并在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。
測序在克隆于pGEMT載體系統(tǒng)I.T7之后對V區(qū)進(jìn)行測序并根據(jù)方案將Sp6引物(Eurogentec，Luik，Belgium)與測序試劑盒ABI PrismBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction試劑盒(AppliedBiosystems，Warrington，United Kingdom)結(jié)合使用。反應(yīng)在ABIPRISM 377測序儀(PE Applied Biosystems)上進(jìn)行并且用程序DNAStar，SeqmanII分析序列。隨后將序列與VBASE(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/intro.htm)中的種系V基因序列進(jìn)行比對。
146B7的VH和VL區(qū)的克隆和測序通過PCR擴(kuò)增來自雜交瘤146B7的VH和VL區(qū)并克隆于pGEMT載體系統(tǒng)I中以測定cDNA序列。將核苷酸和相應(yīng)的氨基酸序列分別顯示于圖2(SEQ ID NOs1和2)和圖3(SEQ ID NOs3和4)中。還顯示出構(gòu)架(FR)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。根據(jù)Vbase中比對的146B7 VH區(qū)的種系家族VH5-51(VH5-亞群)，D2-15/D2(DH-片段)，JH4b(JH-片段)。根據(jù)Vbase中比對的146B7 VL區(qū)的種系家族A27(VKIII-亞群)和JK2(JK-片段)。有關(guān)VH和VL區(qū)的更多信息顯示于Kabat數(shù)據(jù)庫http//immuno.bme.nwu.edu/或httn//www.Vbase.com.
實(shí)施例6 146B7的親和力結(jié)合特性根據(jù)下列方法利用BIACORE 3000儀器通過表面等離子共振(SPR)技術(shù)分析146B7的親和力以測定生物分子蛋白質(zhì)相互作用。對由生物分子結(jié)合引起的表面層上SPR信號的變化進(jìn)行檢測并強(qiáng)調(diào)表面層上物質(zhì)濃度的變化。利用下列定義表示親和力ka＝締合速率常數(shù)(M-1sec-1)；kd＝解離速率常數(shù)(sec-1)；KA＝締合平衡常數(shù)＝ka/kd(M-1)；和KD＝解離平衡常數(shù)＝kd/ka(M)。
實(shí)施不同的操作以獲得146B7對于人IL-15(hIL-15)的親和力。將來自兩個(gè)不同供體的人重組IL-15(Immunex corp.，Seattle，USA andPeprotech，Rocky Hill，NJ，USA)偶聯(lián)到CM5傳感器芯片上。將偶聯(lián)到感應(yīng)器芯片上的化合物定義為配體。在其它實(shí)驗(yàn)中146B7被用作配體。
在每一種動力學(xué)分析中，將分析物146B7或hIL-15的結(jié)合與參考對照CM5感應(yīng)器芯片的結(jié)合相比較，所述分析物適合偶聯(lián)到感應(yīng)器芯片上的配體。對分析物的系列稀釋物(0，3.125，6.25，12.5，25，50μg/ml)進(jìn)行測試。將締合和解離曲線對于模型Langmuir 1∶1中的單體相互作用進(jìn)行擬合，以測定ka和kd并計(jì)算KA和KD。利用BIA-Evaluation Version 3.1對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對于二價(jià)相互作用使用模型“二價(jià)分析物”。對所有分析對漂移基線進(jìn)行校正。
為了測定146B7的抗體親和力，對于源自兩個(gè)不同供應(yīng)商Immunex和Peprotech的人重組IL-15于BIACORE 3000上測量抗體146B7的親和力。利用146B7作為配體而hIL-15作為分析物，測定單價(jià)相互作用(擬合Langmuir 1∶1的曲線)。
對于IL-15(Immunex Corp.)的146B7的親和力測量如下締合速率常數(shù)ka1.07(±0.17)×105M-1sec-1解離速率常數(shù)kd6.56(±0.09)×10-3sec-1締合平衡常數(shù)KA1.55(±0.21)×107M-1解離平衡常數(shù)KD6.59(±0.88)×10-8M為了測定146B7的活性，將IL-15(Immunex Corp.)用作配體面146B7用作分析物。當(dāng)利用擬合所表達(dá)的抗體的二價(jià)相互作用的Langmuir(1∶1)曲線分析分析獲得的數(shù)據(jù)時(shí)，測定抗體的親和性。
對于IL-15(Immunex Corp.)的146B7的親和性測量如下締合速率常數(shù)ka7.30(±0.81)×105M-1sec-1解離速率常數(shù)kd1.45(±2.05)×10-3sec-1締合平衡常數(shù)KA5.03(±3.40)×108M-1解離平衡常數(shù)KD1.55(±1.24)×10-9M還對來自Peprotech的IL-15的146B7的親和力和親和性進(jìn)行測定。對于IL-15的兩種不同來源未見到親和力和親和性的主要差異。
如在以下實(shí)施例中所描述的，146B7以劑量依賴的方式抑制IL-15誘導(dǎo)的增殖，正如通過[3H]-胸苷摻入所測量的那樣，所述實(shí)施例是有關(guān)通過完全的人抗IL-15抗體抑制人白介素15(hIL-15)誘導(dǎo)的CTLL-2細(xì)胞和PBMC增殖。對于來自這些增殖抑制實(shí)驗(yàn)的IC50(于50％抑制時(shí)的濃度，一種更加功能性的測定親和力的方式)進(jìn)行計(jì)算3.1±0.91nM。這一IC50與利用146B7作為配體而重組IL-15作為分析物通過BIACORE 3000測量的親和性相一致(KD1.5nM)，并確認(rèn)了這里獲得的親和力和親和性測量值。
實(shí)施例7由完全的人抗IL-15抗體抑制IL-15誘導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)利用下列方法使用健康志愿者的源于外周血的單核細(xì)胞(PBMC)研究完全的人抗IL-15抗體146B7，146H5，404E4和404A8對于IL-15誘導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)的作用。為了評估對于IL-15的特異性，還檢查了這些抗體對于IL-2介導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)的作用。
細(xì)胞培養(yǎng)將培養(yǎng)物維持于RPMI-1640，所述RPMI-1640具有2mM L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素(全部來自LifeTechnologies，Paisley，Scotland)和10％熱滅活的胎牛血清(HyClone，Utah，USA)。
外周血單核細(xì)胞(PBMC)的純化在征得同意后從健康志愿者體內(nèi)抽取新鮮人血液，加入肝素抗凝。利用Ficoll(Pharmacia，Uppsala，Sweden)通過密度梯度離心進(jìn)行PBMC的純化。
試驗(yàn)化合物HIL-15，批號6870-011，Immunex corp.，Seattle，Washington，USA.
hIL-2，Chiron Benelux BV，Amsterdam，The Netherlands.
所用的完全的人抗體146B7(批次070101)和146B7RDJW07，404A8(批次030101)和批次(batch080101)和作為同種型對照抗體T1(97-2B11-2B12，批次190900)。
由抗IL-15抗體抑制由PBMC進(jìn)行的人IL-15(hIL-15)或hIL-2誘導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)在hIL-2存在或缺乏以及有或無抗IL-15抗體的情況下以5×105細(xì)胞/孔將PBMC三重或四重培養(yǎng)于96孔平底培養(yǎng)板中。將同種型對照抗體(T1)包括為陰性對照。加入伴刀豆球蛋白A(2.5μg/ml，Calbiochem)作為增殖的陽性對照。于37℃和5％CO2中孵育細(xì)胞72小時(shí)。收集上清液以通過ELISA(U-CyTech，Utrecht，TheNetherlands)定量人TNF-α的量。
通過PBMC對146B7和一種同種型對照抗體對于IL-15介導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)的作用進(jìn)行測試。146B7以一種劑量依賴的方式抑制hIL-15介導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)，而所述同種型對照抗體并不抑制hIL-15誘導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)(圖4)。顯示兩個(gè)健康志愿者的數(shù)據(jù)。404E4和404A8不能抑制hIL-15誘導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)。
為了確定抗IL-15抗體的特異性，對它們對于hIL-2介導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)的作用進(jìn)行評估。146B7沒有誘導(dǎo)hIL-2介導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)的抑制(圖5)。在hIL-2介導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)中沒有見到404E4或404A8的劑量依賴的抑制。
只見到146B7對于hIL-15介導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)的劑量依賴性抑制，而未見到404E4和404A8的抑制。所述抑制作用對于hIL-15是特異性的；IL-2介導(dǎo)的TNF-α生產(chǎn)未被抑制。
實(shí)施例8由完全的人抗IL-15抗體抑制CTLL-2細(xì)胞和PBMC的人白介素15(hIL-15)誘導(dǎo)的增殖利用下列方法使用CTLL-2細(xì)胞(Gillis等.，1978)和外周血單核細(xì)胞(PBMC)等對抗體146B7，146H5，404E4和404A8測試其抑制T細(xì)胞增殖的能力。
細(xì)胞培養(yǎng)將培養(yǎng)物維持于RPMI-1640，所述RPMI-1640具有2mM L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素(全部來自LifeTechnologies，Paisley，Scotland)和10％熱滅活的胎牛血清(HyClone，Utah，USA)。將CTLL-2細(xì)胞(Gillis等，1978)培養(yǎng)于添加了36單位的hIL-2/ml(Chiron Benelux BV，Amsterdam，The Netherlands)的上述培養(yǎng)基中，并在實(shí)驗(yàn)開始之前不予補(bǔ)充hIL-2持續(xù)3-4天。在使用前洗滌CTLL-2細(xì)胞三次。
外周血單核細(xì)胞(PBMC)的純化在征得同意后從健康志愿者體內(nèi)抽取新鮮人血液，加入肝素抗凝。利用Ficoll(Pharmacia，Uppsala，Sweden)通過密度梯度離心進(jìn)行PBMC的純化。
試驗(yàn)化合物
HIL-15，批號6870-011，Immunex corp.，Seattle，Washington，USA.
hIL-2，Chiron Benelux BV，Amsterdam，The Netherlands.
顯示于圖6中的此報(bào)告中用于CTLL-2分析的抗IL-15抗體146B7，146H5，404A8，404E4.
用于PBMC分析的抗IL-15抗體146B7(批次070101)，404A8(批次030101)和404E4(批次080101)。
由抗IL-15抗體抑制人IL-15(hIL-15)或hIL-2誘導(dǎo)的CTLL-2增殖在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，都以5×103細(xì)胞/孔在hIL-2或hIL-15存在或缺乏的情況下將細(xì)胞三重接種于96孔板中。為了評估對于增殖的作用，添加四種抗IL-15抗體的每一種。將細(xì)胞于37℃和5％CO2中孵育16小時(shí)。在收獲(Harvester 96，Tomtec，Orange CT，USA)前16個(gè)小時(shí)，加入[3H]胸苷(1μCi/孔，Amersham Life Sciences，LittleChalfont，Buckinhamshire，UK)。
如在圖6中所示的，如由減少的[3H]胸苷摻入所反映的，IL-15誘導(dǎo)的CTLL-2細(xì)胞的增殖以劑量依賴的方式被146B7和146H5所減少。404E4和404A8二者都不能夠阻斷hIL-15誘導(dǎo)的CTLL-2細(xì)胞的增殖。
由抗IL-15抗體抑制hIL-15(hIL-15)或hIL-2誘導(dǎo)的PBMC增殖以5×104細(xì)胞/孔在hIL-2或hIL-15存在或缺乏的情況下將PBMC三重接種于96孔U底板中(Nunc，Nalge Nunc International，Denmark)。加入伴刀豆球蛋白A(2.5μg/ml，Calbiochem)作為增殖的陽性對照。于37℃和5％CO2中孵育細(xì)胞72小時(shí)。在收獲(Harvester 96，Tomtec，Orange CT，USA)前16個(gè)小時(shí)，加入[3H]胸苷(1μCi/孔，Amersham Life Sciences，Little Chalfont，Buckinhamshire，UK)。
146B7能夠劑量依賴性地抑制IL-15誘導(dǎo)的[3H]胸苷摻入，并且所以抑制增殖(IC50＝3.1±0.91nM)(圖7)。404E4和404A8二者都不能夠阻斷hIL-15誘導(dǎo)的PBMC增殖(圖8-9)。未根據(jù)以往進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)所獲得的數(shù)據(jù)對146H5進(jìn)行測試。
為了確定146B7，404E4和404A8對于IL-15抗體的特異性，還對這些抗體評估其對于hIL-2介導(dǎo)的增殖的作用。測試的抗IL-15抗體中沒有抗體呈現(xiàn)出hIL-2誘導(dǎo)的增殖的作用(圖7-9)。
實(shí)施例9人抗IL-15抗體146B7結(jié)合存在于人PBMCs上的人IL-15試驗(yàn)化合物在征得同意之后獲自健康志愿者的人PBMCs。
抗體146B7(批次號MDX015)，Medarex Inc.，Annandale，NJ，USA.
146B7和人IgG的生物素化首先將N-羥基琥珀酰亞胺基-生物素(Sigma)稀釋于DMSO(最終稀釋液100mg/m1)中并且隨后稀釋于0.1M NaHCO3(最終稀釋液1mg/ml，Sigma)。每1mg的抗體(稀釋于1ml)加入600μl的生物素溶液(避光，2小時(shí)，RT)。將抗體-生物素溶液在slide-a-lyzerTM透析盒(10,000 MWCO，Pierce，Perbio Science，Netherlands)中透析(于4℃過夜)以除去未標(biāo)記的生物素。第二天，通過分光光度測定法(Ultrospec 2100pro)于OD 280nm測定生物素化抗體的濃度。
外周血的刺激為了誘導(dǎo)IL-15，通過靜脈穿刺從健康志愿者體內(nèi)獲得血液。將PBMCs培養(yǎng)于RPMI-1640(Biowhittaker Europe)中最多2天(37℃)，所述RPMI-1640添加了青霉素(5U/ml)，鏈霉素(50μg/ml)，L-谷氨酰胺(2mM)(Biowhittaker Europe)，和10％胎牛血清(Optimum C241，Multicell，Wisent Inc.)，并且用500U/ml IFNγ(Boehringer Ingelheim)進(jìn)行刺激。
流式細(xì)胞分析將細(xì)胞與RPMI 1640(Biowhittaker Europe)中的10％人AB血清(CLB，Amsterdam，Netherlands)一起預(yù)孵育，所述RPMI-1640添加了青霉素(5U/ml)，鏈霉素(50μg/ml)，L-谷氨酰胺(2mM)(Biowhittaker Europe)和10％胎牛血清(Optimum C241，Multicell，Wisent Inc.)。在透化(20分鐘，4℃，于Cytofix/CytopermTM試劑盒中，Becton Dickinson，San Diego，CA)和于Perm/WashTM緩沖液(Cytofix/CytopermTM試劑盒)中洗滌后，通過流式細(xì)胞分析將PBMC進(jìn)行IL-15的染色。通過在整個(gè)染色過程中利用Perm/WashTM緩沖液(Cytofix/CytopermTM試劑盒)實(shí)現(xiàn)持續(xù)性通透。在用生物素化的146B7或用生物素化的hIgG1(20μg/ml，30min，4℃)孵育細(xì)胞和在Perm/WashTM緩沖液中洗滌之后，隨后將細(xì)胞與鏈親和素-藻紅蛋白(DAKO)一起孵育30分鐘(4℃)。在通過流式細(xì)胞分析和對單核細(xì)胞門控而進(jìn)行分析后，測定至少5000細(xì)胞/樣品的熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)顯示刺激指數(shù)(S.I.)，它計(jì)算如下S.I.＝(平均熒光陽性染色)/(平均熒光背景染色))。
免疫細(xì)胞化學(xué)為了檢測存在于人單核細(xì)胞之中的IL-15，由全血樣品制得細(xì)胞離心制品。在將5×104細(xì)胞(200μl)離心到Superfrost-Plus顯微鏡載玻片(Menzel)后，將載玻片進(jìn)行空氣干燥(＜60min)，固定于2％低聚甲醛/PBS(8min，4℃)中，用PBS洗滌并再次進(jìn)行空氣干燥。在染色前，將細(xì)胞離心制品在PBS(+0.1％皂苷；PBSS)中透化，其隨后在整個(gè)染色過程中被使用。為了阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，將細(xì)胞離心制品與稀釋于檸檬酸/磷酸緩沖液(pH 5.8，20min，RT)中的0.05％(v/v)過氧化氫(H2O2)一起孵育。在用PBSS洗滌之后，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Biotin Blocking Kit，Vector Lab.，DAKO)對內(nèi)源性生物素的活性進(jìn)行阻斷。在用PBSS洗滌之后，通過將細(xì)胞離心制品與PBSS中的10％(v/v)人合并AB血清(CLB，Amsterdam，Netherlands)一起孵育(30min)來阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。其后，將細(xì)胞離心制品與生物素化的一抗一起孵育(60min，RT)，在用PBSS洗滌之后，與復(fù)合了生物素化的辣根過氧化物酶的鏈親和素(streptABComplex/HRP，DAKO；1∶100于PBSS中，包含2％人AB血清；30min，RT)一起孵育。在PBSS中洗滌之后，將細(xì)胞離心制品與3-氨基-9-乙基咔唑(0.5mg/ml)和H2O2(0.01％)在醋酸鈉緩沖液(50mM，pH 4.9)中一起孵育10分鐘(RT)，以檢測HRP活性。用流動的自來水洗滌細(xì)胞離心物5分鐘，用蘇木精(DAKO)復(fù)染1分鐘，再用流動的自來水洗滌5分鐘，并包埋于faramount或glycergel(DAKO)中。
流式細(xì)胞分析
146B7與IFNγ刺激的人單核細(xì)胞的結(jié)合顯示于圖10中。生物素化的146B7結(jié)合未刺激的單核細(xì)胞，顯示在未刺激細(xì)胞中IL-15的存在。用IFNγ刺激單核細(xì)胞導(dǎo)致146B7與細(xì)胞的結(jié)合增強(qiáng)，在培養(yǎng)的第一天達(dá)到最大值。對照抗體hIgG1顯示與未刺激單核細(xì)胞的稍許結(jié)合。用IFNγ刺激通過單核細(xì)胞上Fcγ受體的增強(qiáng)表達(dá)來提高h(yuǎn)IgG1的結(jié)合。
免疫細(xì)胞化學(xué)圖11顯示用146B7，或用對照抗體hIgG1的人單核細(xì)胞的染色。在用146B7孵育細(xì)胞后觀察到清楚的細(xì)胞質(zhì)紅色染色，但用對照抗體則沒有觀察到。因此，146B7結(jié)合單核細(xì)胞中的hIL-15并且在用IFNγ進(jìn)行刺激后這種結(jié)合得以上調(diào)。圖11還顯示IL-15染色主要是細(xì)胞內(nèi)的。
實(shí)施例10通過免疫組織化學(xué)檢測到人抗IL-15抗體146B7結(jié)合組織中的IL-15試驗(yàn)化合物人牛皮癬皮膚-在征得同意后獲得組織樣品。Louise Villadsen，Department of Dermatology，Gentofte University Hospital，Copenhagen，Denmark.
抗體146B7(批次號MDX015)，Medarex，Annandale，NJ，USA146B7和人IgG的生物素化首先將N-羥基琥珀酰亞胺基-生物素(Sigma)稀釋于DMSO(最終稀釋液100mg/ml)中并且隨后稀釋于0.1M NaHCO3(最終稀釋液1mg/ml，Sigma)。每1mg的抗體(稀釋于1ml)加入600μl的生物素溶液(避光，2小時(shí)，RT)。將抗體-生物素溶液在slide-a-lyzerTM透析盒(10,000 MWCO，Pierce，Perbio Scienee，Netherlands)中透析(于4℃過夜)以除去未標(biāo)記的生物素。第二天，通過分光光度測定法(Ultrospec 2100pro)于OD 280nm測定生物素化抗體的濃度。
免疫組織化學(xué)將組織保存于-80℃直到進(jìn)行分析。融解后，將組織切片固定于丙酮中(10min，RT)并進(jìn)行空氣干燥。為了阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，將切片與稀釋于檸檬酸/磷酸緩沖液中的0.05％(v/v)過氧化氫(H2O2)一起孵育(pH 5.8，20min，RT)。在用PBS-Tween20(PBST，0.05％v/v)洗滌之后，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Biotin BlockingKit，Vector Lab.，DAKO)對內(nèi)源性生物素的活性進(jìn)行阻斷。在用PBST洗滌之后，通過將組織切片與PBST中的10％(v/v)人合并AB血清(CLB，Amsterdam，Netherlands)一起孵育(30min)來阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。吸去血清并且隨后將切片與生物素化的一抗(146B7或hIgG1)一起孵育60分鐘(RT)，所述抗體稀釋于包含2％人AB血清的PBS中。在PBST中洗滌之后，將所有的組織切片與streptABComplex/HRP(DAKO；1∶100稀釋于包含2％人AB血清的PBS中；30min，RT)。在PBST中洗滌之后，將所有組織切片與3-氨基-9-乙基咔唑(0.5mg/ml)和H2O2(0.01％)在醋酸鈉緩沖液(50mM，pH 4.9)中一起孵育10分鐘(RT)，以檢測HRP活性。用流動的自來水洗滌細(xì)胞離心物5分鐘，用蘇木精(DAKO)復(fù)染1分鐘，再用流動的自來水洗滌5分鐘，并包埋于faramount或glycergel(DAKO)中。
結(jié)果在用146B7染色組織切片后在牛皮癬皮膚中觀察到清楚的角質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)染色，但用對照抗體則沒有觀察到(圖12；146B7染色獲自牛皮癬斑的IL-15陽性角質(zhì)細(xì)胞)。
實(shí)施例11人抗IL-15抗體146B7在SCID小鼠-人組織嵌合體中阻斷IL-15在關(guān)節(jié)炎和牛皮癬組織中炎癥的顯著抑制試驗(yàn)化合物滑膜組織-在征得同意后獲自幼年型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者；AlexeiGrom，division of pediatric rheumatology，Children’s Hospital MedicalCenter，Cincinnati，Ohio，USA.
角質(zhì)活檢組織-在征得同意后獲得組織樣品。Louise Villadsen，Department of Dermatology，Gentofte Universlty Hospital，Copenhagen，Denmark.
抗體146B7(批次號MDX015)，Medarex Inc.，Annandale，NJ，USA用于牛皮癬實(shí)驗(yàn)。
抗體146B7(批次號15-00RDJW07)，Medarex Inc.，Annandale，NJ，USA用于牛皮癬實(shí)驗(yàn)。
在SCID小鼠-人滑膜組織嵌合體中阻斷IL-15在關(guān)節(jié)置換手術(shù)之后從幼年型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者獲得新鮮滑膜組織樣品。在無菌條件下收集樣品。將來自完整滑膜組織樣品的切碎的組織片段充分混合以確保每個(gè)制品的均勻性。將切碎的組織(2-4移植物/動物；100mg/位點(diǎn))皮下移植于SCID/NOD小鼠(JacksonLaboratories)的背部。每只動物都在移植物移植的當(dāng)天，以及移植后的第7、14和21天接受146B7(500μg，i.p.)。在移植后第28天將動物處死。將滑膜移植物切出并置于福爾馬林上進(jìn)行H&E染色。
來自SCID小鼠-人滑膜組織嵌合體的組織的H&E類色的量化(改進(jìn)自Lehr等，J.Histochem.Cytochem.1997，45，1559)在利用X10物鏡(Zeiss microscope；Axiovision software)獲得獲自SCID小鼠-人滑膜組織嵌合體的切片的數(shù)字圖像(2600×2060，jpg)后，利用Photoshop，version 6.0(Adobe Systems，Mountainview，CA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析并減少到1300×1300像素。在每個(gè)切片中選擇六個(gè)X10視野從而最佳地反映整個(gè)載玻片上組織的總體染色。在全部染色核(暗核上的magic wand，耐受度為10)的選擇之后，制成選擇區(qū)域的光密度曲線并記錄平均染色強(qiáng)度(在相似/圖像直方圖指令的選擇之后)。隨后，選擇背景并對染色進(jìn)行量化(暗核上的magic wand，耐受度為10)。將染色強(qiáng)度計(jì)算為核染色與背景染色之間的差異。這被命名為具有任意單位的細(xì)胞化學(xué)指數(shù)。數(shù)據(jù)顯示為平均值和s.e.m。通過斯氏t檢驗(yàn)來分析數(shù)據(jù)。
在SCID小鼠-人牛皮癬組織嵌合體中阻斷IL-15從兩位患者的牛皮癬斑中獲取角質(zhì)活檢組織，分開并移植到C.B-17SCID(Jackson Laboratories)小鼠上。移植三周后小鼠以10mg/kg的劑量每兩天接受PBS(安慰劑)，CsA(環(huán)孢霉素A)(Sandoz)持續(xù)15天，或在第一天以20mg/kg的劑量并且在第8和15天以10mg/kg的劑量接受146B7。最后一次注射后一個(gè)星期，處死小鼠，從每個(gè)異種移植物中取4mm的穿刺生物活檢組織。將活檢組織固定于福爾馬林中進(jìn)行石蠟包埋并在H&E中染色(圖15)，以及用于Ki-67核抗原(圖16)。
來自SCID小鼠-人牛皮癬組織嵌合體的組織的免疫組織化學(xué)類色的量化對于H&E染色的切片評估表皮厚度(μm)，角化不全的等級(檢定等級從0到3)，上層真皮中炎性單核細(xì)胞的數(shù)目。對于Ki-67染色的切片評估循環(huán)角質(zhì)細(xì)胞數(shù)/mm2切片。計(jì)算每個(gè)處理組中4只小鼠的平均值，并將來自每位患者的數(shù)據(jù)概括為平均值和s.e.m.。
SCID/RA模型切片的顯微鏡觀察顯示最暗的染色核，所述核屬于浸潤細(xì)胞。所以，將核的數(shù)目(測量為相對表面積)認(rèn)作對于浸潤的測量。與賦形劑的治療相比，注射146B7減少浸潤到炎性滑膜組織中的細(xì)胞數(shù)目(圖13a，p＜0.05)。圖13B和13C顯示146B7對于細(xì)胞浸潤到異種移植滑膜組織的作用(圖13C)，并且與賦形劑的治療相比，顯示具有暗核的細(xì)胞數(shù)目的減少(圖13B)。
SCID/牛皮癬模型圖14顯示用146B7或?qū)φ寨煼ㄖ委煹腟CID/牛皮癬小鼠。與賦形劑PBS相比，注射146B7減小牛皮癬的嚴(yán)重性，所述嚴(yán)重性是當(dāng)從角質(zhì)層到皮釘?shù)钠鹗继庍M(jìn)行測量時(shí)通過表皮厚度進(jìn)行評估的(圖14A)PBS(177.8±42.2μm)，CsA(91.0±15.2μm)，146B7(62.5±9.1μm)。當(dāng)從角質(zhì)層到皮釘?shù)淖钌畈糠诌M(jìn)行測量時(shí)也觀察到表皮厚度的減小(圖14B)PBS(433.8±32.1μm)，CsA(303.8±62.9μm)和146B7(208.0±33.8μm)。另外，角化不全的等級也被146B7治療所減輕(圖14C)PBS(1.6±0.4)，CsA(1.3±0.3)，146B7(0.5±0.3)。另外，146B7減少上真皮中炎性單核細(xì)胞的數(shù)目(圖14D)PBS(33.3±1.9單核細(xì)胞)，CsA(19.4±8.5)，146B7(16.4±0.1)。人Ki-67的表達(dá)嚴(yán)格地與細(xì)胞增殖相關(guān)聯(lián)。在分裂間期中，抗原能夠在核中專有地被檢測到，而在有絲分裂中大多數(shù)蛋白復(fù)位到染色體的表面。Ki-67蛋白在細(xì)胞周期的全部活動期(G(1)，S，G(2)，和有絲分裂)中存在，而對于靜息細(xì)胞(G(0))缺失的事實(shí)使得它成為一種優(yōu)良的標(biāo)記，用于測定給定細(xì)胞群所謂的生長比例。146B7減少Ki-67+循環(huán)角質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目(圖14E)PBS(247.9±77.0)，CsA(116.0±24.1)，146B7(73.8±9.9)。
用146B7治療抑制炎性細(xì)胞浸潤到類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的人SCID模型的炎癥性組織中。另外，在具有移植的人銀屑斑的SCID小鼠中，與用CsA治療相比，用146B7治療減輕牛皮癬的嚴(yán)重性。事實(shí)上，用146B7治療，人/SCID小鼠中炎癥、表皮厚度、分裂的角質(zhì)細(xì)胞數(shù)目以及角化不全嚴(yán)重性顯著減少。
實(shí)施例12人抗IL-15抗體146B7識別受體結(jié)合的IL-15試驗(yàn)化合物hIgG1-人對照抗體(Sigma).
抗體146B7-Medarex Inc.，Annandale，NJ，USA，MDX015.
具有IL-15Rα的組成性表達(dá)的Raji細(xì)胞(Martin Glennie，TenovusResearch Laboratory，Southampton General Hospital，Southampton，U.K.).
146B7和人IgG的生物素化首先將N-羥基琥珀酰亞胺基-生物素(Sigma)稀釋于DMSO(最終稀釋液100mg/ml)中并且隨后稀釋于0.1M NaHCO3(最終稀釋液1mg/ml，Sigma)。每1mg的抗體(稀釋于1ml)，加入600μl的生物素溶液(避光，2小時(shí)，RT)。將抗體-生物素溶液在slide-a-lyzerTM透析盒(10,000 MWCO，Pierce，Perbio Science，Netherlands)中透析(于4℃過夜)以除去未標(biāo)記的生物素。第二天，通過分光光度測定法(Ultrospec 2100pro)于OD 280nm測定生物素化抗體的濃度。
通過ELISA檢驗(yàn)到146B7結(jié)合于IL-15-IL-15Rα復(fù)合物上在用IL-15Rα(R&D systems，Minneapolis，MN，USA)涂布(于室溫過夜)平底微量滴定板(Greiner)之后，用PBS和雞血清(2％，RT，60min)對板進(jìn)行孵育。在PBS(+0.05％Tween 20PBST)中洗滌之后，隨后用幾種未標(biāo)記的IL-15的稀釋液(50μl，RT，Immunex，Seattle，USA)對板進(jìn)行孵育。10分鐘后，將生物素化的抗體以不同濃度加入到孔(50μl)中(于室溫90分鐘)。在PBST中洗滌之后，用1∶10,000稀釋于PBST-C(PBST和2％雞血清)中的鏈親和素-多聚-辣根過氧化物酶(CLB，Amsterdam，Netherlands)對板進(jìn)行孵育(于室溫60分鐘)。最后，洗滌板并且隨后根據(jù)生產(chǎn)商的方法用ABTS緩沖液中的底物ABTS(2，2’-連氮基雙-3-ethylbenzthiazoline-磺酸，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)進(jìn)行孵育。用2％草酸(50μl)停止顏色反應(yīng)。在EL808ELISA讀數(shù)器(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT，USA)中于405nm對結(jié)合進(jìn)行評估。
146B7結(jié)合Raji細(xì)胞上的IL-15-IL-15R復(fù)合物用10％人合并AB血清(CLB，Amsterdam，Netherlands)在FACS緩沖液(PBS，0.05％BSA，0.02％NaNO3)中對Raji細(xì)胞進(jìn)行預(yù)孵育(于4℃20分鐘)。將Raji細(xì)胞(1-2*105細(xì)胞/ml)置于孔中，并以幾種濃度加入50μl的未標(biāo)記IL-15(用10％人AB血清稀釋于FACS緩沖液中)。在孵育細(xì)胞30分鐘(4℃)和在FACS緩沖液中洗滌兩次后，將50μl的生物素化抗體(146B7或hIgG1)加到孔中(于4℃30分鐘)。在FACS緩沖液中洗滌兩次后，向每個(gè)孔加入50μl的鏈親和素-藻紅蛋白(于4℃30分鐘)。在FACS緩沖液中洗滌兩次后，將細(xì)胞于200μl FACS緩沖液中取出，并在利用CellQuest軟件通過流式細(xì)胞術(shù)(FACS Calibur，Becton Dickinson)進(jìn)行分析之后測定至少5000細(xì)胞/樣品的熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)顯示刺激指數(shù)(S.I.)，其計(jì)算如下S.I.＝(平均熒光陽性染色)/(平均熒光背景染色)。
ELISA在ELISA中146B7結(jié)合IL-15/IL-15R復(fù)合物顯示于圖17中。146B7的結(jié)合隨著結(jié)合于其受體上的IL-15的濃度提高而提高。沒有觀察到對照抗體結(jié)合IL-15或IL-15R的作用。
結(jié)合表達(dá)IL-15R的Raji細(xì)胞146B7結(jié)合Raji細(xì)胞上的IL-15/IL-15R復(fù)合物顯示于圖18中。146B7以劑量依賴的方式結(jié)合IL-15/IL-15R復(fù)合物。沒有觀察到hIgG1結(jié)合Raji細(xì)胞上的IL-15/IL-15R復(fù)合物(圖18)。
146B7能夠在這種細(xì)胞因子結(jié)合于其受體上之后結(jié)合IL15。146B7結(jié)合IL-15上的不涉及結(jié)合受體的表位。
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等同方案只利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，或能夠確定本發(fā)所述發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等同方案。這類等同方案為下列權(quán)利要求所包括。在獨(dú)立權(quán)利要求中公開的實(shí)施方案的任何組合都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
并入作為參者特此將本文提到的全部出版物、專利和待審專利申請的全部內(nèi)容都并入作為參考。
序列表<110>Genmab A/S.et al.
<120>白介素15(IL-15)的特異性人抗體<130>AMJ-001CP2PC<150>10/379741<151>2003-03-05<150>10/374932<151>2003-02-26<150>US 60/314731<151>2001-08-23<150>US 10/226615<151>2002-08-23<160>31<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>390<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)...(390)<400>1gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15tct etg aag atc tcc tgt aag gtt tct gga tacttc ttt acc acc tac96Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Phe Phe Thr Thr Tyr20 25 30tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tat atg 144Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met35 40 45ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc 192Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac 240Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga ggg ggt aac tgg aac tgc ttt gac tac tgg ggc cag gga acc 336Ala Arg Gly Gly Ash Trp Asn Cys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110ctg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc 384Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115 120 125ctg gca 390Leu Ala130<210>2<211>130<212>PRT<213>人<400>2Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Phe Phe Thr Thr Tyr20 25 30Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met35 40 45Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Gly Ash Trp Ash Cys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115 120 125Leu Ala130
<210>3<211>357<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(357)<400>3gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc agc 96Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser20 25 30tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45atc tat ggt gca tcc cgc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt 192Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag 240Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cgg tat ggt agc tca cac 288Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Gly Ser Ser His85 90 95act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc agc cga act gtg gct gca 336Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ser Arg Thr Val Ala Ala100 105 110cca tot gtc ttc atc ttc ccg 357Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro115<210>4<211>119<212>PRT
<213>人<400>4Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Gly Ser Ser His85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ser Arg Thr Val Ala Ala100 105 110Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro115<210>5<211>5<212>PRT<213>人<400>5Thr Tyr Trp Ile Gly1 5<210>6<211>17<212>PRT<213>人<400>6Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln1 5 10 15Gly<210>7<211>8<212>PRT<213>人
<400>7Gly Asn Trp Asn Cys Phe Asp Tyr1 5<210>8<211>12<212>PRT<213>人<400>8Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala1 5 10<210>9<211>7<212>PRT<213>人<400>9Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr1 5<210>10<211>8<212>PRT<213>人<400>10Gln Arg Tyr Gly Ser Ser His Thr1 5<210>11<211>20<212>DNA<213>人<400>11caggtkcagc tggtgcagtc 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人
<400>12saggtgcagc tgktggagtc 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人<400>13gaggtgcagc tggtgcagtc 20<210>14<211>20<212>DNA<213>人<400>14atggactgga cctggagcat 20<210>15<211>21<212>DNA<213>人<400>15catggaattg gggctgagct g21<210>16<211>20<212>DNA<213>人<400>16atggagtttg grctgagctg 20<210>17<211>21<212>DNA<213>人<400>17atgaaacacc tgtggttctt c21<210>18<211>20<212>DNA<213>人
<400>18atggggtcaa ccgccatcct 20<210>19<211>21<212>DNA<213>人<400>19tgccaggggg aagaccgatg g21<210>20<211>20<212>DNA<213>人<400>20racatccaga tgayccagtc 20<210>21<211>20<212>DNA<213>人<400>21gycatcyrga tgacccagtc 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人<400>22gatattgtga tgacccagac 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人<400>23gaaattgtgt tgacrcagtc 20<210>24<211>20<212>DNA
<213>人<400>24gaaatwgtra tgacacagtc 20<210>25<211>20<212>DNA<213>人<400>25gatgttgtga tgacacagtc 20<210>26<211>20<212>DNA<213>人<400>26gaaattgtgc tgactcagtc 20<210>27<211>24<212>DNA<213>人<400>27cccgctcagc tcctggggct cctg 24<210>28<211>23<212>DNA<213>人<400>28ccctgctcag ctcctggggc tgc 23<210>29<211>26<212>DNA<213>人<400>29cccagcgcag cttctcttcc tcctgc 26<210>30<211>27<212>DNA
<213>人<400>30atggaaccat ggaagcccca gcacagc 27<210>31<211>20<212>DNA<213>人<400>31cgggaagatg aagacagatg 20
權(quán)利要求
1.一種分離的特異性結(jié)合人IL-15的人單克隆抗體，包含選自下列的至少一種CDR序列(i)SEQ ID NOs5，6，7，8，9和10；(ii)與在(i)中定義的序列具有至少90％同源性，優(yōu)選至少95％同源性，更加優(yōu)選至少98％，或至少99％同源性的序列；和(iii)在(i)或(ii)中定義的序列的片段，其保持特異性結(jié)合人IL-15的能力。
2.權(quán)利要求1的抗體，包含(i)SEQ ID NO7；(ii)與SEQ ID NO7具有至少90％同源性，優(yōu)選至少95％同源性，更加優(yōu)選至少98％，或至少99％同源性的序列；或(iii)在(i)或(ii)中定義的序列的片段，其保持特異性結(jié)合人IL-15的能力。
3.權(quán)利要求1的抗體，包含(i)SEQ ID NOs5和8；(ii)SEQ ID NOs6和9；(iii)SEQ ID NOs7和10；(iv)與在(i)、(ii)或(iii)中定義的序列具有至少90％同源性，優(yōu)選至少95％同源性，更加優(yōu)選至少98％，或至少99％同源性的序列；或(v)在(i)、(ii)、(iii)或(iv)中定義的序列的片段，其保持特異性結(jié)合人IL-15的能力。
4.權(quán)利要求1的抗體，包含選自下列的至少四種CDRs(i)SEQ ID NOs5，6，7，8，9和10；(ii)與在(i)中定義的序列具有至少90％同源性，優(yōu)選至少95％同源性，更加優(yōu)選至少98％，或至少99％同源性的序列；和(iii)在(i)或(ii)中定義的序列的片段，其保持特異性結(jié)合人IL-15的能力。
5.權(quán)利要求1的抗體，包含(i)SEQ ID NOs5，6，7，8，9和10；(ii)與在(i)定義的序列具有至少90％同源性，優(yōu)選至少95％同源性，更加優(yōu)選至少98％，或至少99％同源性的序列；或(iii)在(i)或(ii)中定義的序列的片段，其保持特異性結(jié)合人IL-15的能力。
6.一種分離的特異性結(jié)合人IL-15的人單克隆抗體，包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2；或與SEQ ID NO2具有至少90％同源性，優(yōu)選至少95％同源性，更加優(yōu)選至少98％，或至少99％同源性的序列的重鏈可變區(qū)。
7.一種分離的特異性結(jié)合人IL-15的人單克隆抗體，包含具有氨基酸序列SEQ ID NO4；或與SEQ ID NO4具有至少90％同源性，優(yōu)選至少95％同源性，更加優(yōu)選至少98％，或至少99％同源性的序列的輕鏈可變區(qū)。
8.一種分離的特異性結(jié)合人IL-15的人單克隆抗體，它通過特異性結(jié)合位于人IL-15的γ鏈相互作用域上的表位，經(jīng)由IL-15Rγ-鏈抑制順式信號傳遞，并且它抑制相鄰細(xì)胞上的反式信號傳遞，所述相鄰細(xì)胞表達(dá)γ鏈或β和γ鏈作為IL-15R或另一種細(xì)胞因子受體的部分。
9.一種分離的人單克隆抗體，它特異性結(jié)合人IL-15并干擾IL-15受體α，β和γ鏈組裝。
10.一種分離的人單克隆抗體，它特異性結(jié)合人IL-15并抑制在相鄰細(xì)胞上的組裝，所述相鄰細(xì)胞表達(dá)β和γ鏈作為IL-15受體或另一種細(xì)胞因子受體的部分。
11.權(quán)利要求9的抗體，其中所述抗體還抑制在相鄰細(xì)胞上的組裝，所述相鄰細(xì)胞表達(dá)β和γ鏈作為IL-15受體或另一種細(xì)胞因子受體的部分。
12.一種治療或預(yù)防與人IL-15的超量表達(dá)相關(guān)聯(lián)的和/或其中人IL-15誘導(dǎo)的作用的下調(diào)或抑制是有益的病癥的方法，包括以對于治療或預(yù)防所述病癥有效的量給受試者施用特異性結(jié)合人IL-15的分離的人單克隆抗體。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述病癥選自關(guān)節(jié)炎、結(jié)締組織病、眼科病癥、神經(jīng)系統(tǒng)病癥、胃腸和肝病、變應(yīng)性病癥、血液系統(tǒng)病癥、皮膚病癥、肺病、惡性腫瘤、源于移植的病癥、內(nèi)分泌病癥、血管病癥、婦產(chǎn)科病癥和感染疾病。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述病癥選自強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、潰瘍性結(jié)腸炎、同種異體移植排斥和移植物抗宿主疾病。
全文摘要
公開了一種分離的人單克隆抗體以及相關(guān)的基于抗體的組合物和分子，所述單克隆抗體特異性結(jié)合IL－15(例如，人IL－15)。所述人抗體能夠產(chǎn)生于轉(zhuǎn)染瘤或非人轉(zhuǎn)基因動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠中，所述轉(zhuǎn)基因小鼠能夠通過V－D－J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生人單克隆抗體的多種同種型。還公開了包含所述人抗體的藥物組合物、非人轉(zhuǎn)基因動物和產(chǎn)生所述人抗體的雜交瘤，以及利用所述人抗體的治療和診斷方法。
文檔編號C12N5/18GK1780856SQ200480011288
公開日2006年5月31日 申請日期2004年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月26日
發(fā)明者J·G·J·范德溫克爾, M·A·范迪克, J·舒爾曼, A·F·格里特森, O·D·M·S·巴德斯加德, J·彼得森 申請人:根馬布股份公司