專利名稱：哺乳動物細(xì)胞中dsRNA誘導(dǎo)CpG序列甲基化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用dsRNAs使DNAs中的CpG序列甲基化，并涉及包含dsRNAs的甲基化-誘導(dǎo)試劑。本發(fā)明也涉及應(yīng)用dsRNAs通過誘導(dǎo)啟動子區(qū)域中CpG序列的甲基化來抑制基因表達(dá)的方法，并涉及包含dsRNAs的基因表達(dá)-抑制劑。
背景技術(shù)：
在動物和植物中，雙鏈RNAs(dsRNAs)通過RNA干擾(RNAi)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默(Fire A.et al.Nature 391，806-811(1998)；Hammond，S.M.et al.Nature Rev.Genet.2，110-119(2001)；Hutvagner，G.，&Zamore，P.D.Curr.Opin.Genet.Dev.12，225-232(2002))。在此體系中，由RNAIII Dicer產(chǎn)生的小干擾RNAs(siRNAs)并入RNAi-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISCs)中(Tuschl，T.et al.Genes Dev.，13，3191-3197(1999)；Hammond，S.M.et al.Nature，404，293-296(2000)；Zamore，P.et al.Cell 101，25-33(2000)；Bernstein，E.et al.Nature 409，363-366(2001)；Elbashir，S.M.et al.Genes Dev.15，188-200(2001))。如此得到的siRNA-RISC復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中促進mRNA降解(Tuschl，T.et al.GenesDev.，13，3191-3197(1999)；Hammond，S.M.et al.Nature，404，293-296(2000)；Elbashir，S.M.et al.Nature，411，494-498(2001)；Hutvagner，G.，&Zamore，P.D.Science 297，2056-2060(2002)；Zeng，Y.，&Cullen，B.R.RNA，8，855-860(2002)；Kawasaki，H.，&Taira，K.Nucleic Acids Res.31，700-707(2003))。也有報道稱，在植物中，dsRNAs能夠誘導(dǎo)序列特異性的DNA甲基化并在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)(Pelissier，T.，&Wassenegger，M.RNA 6，55-65(2000)；Mette，M.F.et al.EMBO J.19，5194-201(2000)；Vaucheret，H.，&Fagard，M.Trends Genet.17，29-35(2001)；Jones，L.et al.Curr.Biol.11，747-757(2001)；Aufsatz，W.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，16499-16506(2002)；Hamilton，A.et al.EMBO J.21，4671-4769(2002)；Aufsatz，W.et al.EMBO J.21，6832-6841(2002))。換句話說，長的和短的dsRNAs都能在植物中誘導(dǎo)序列特異性的DNA甲基化，即RNA-指導(dǎo)的DNA甲基化(RdDM)。此外，導(dǎo)入的基因也可以誘導(dǎo)序列特異性的DNA甲基化(Vaucheret，H.，&Fagard，M.Trends Genet.17，29-35(2001)；Morel，J.B.et al.Curr.Biol.10，1591-1594(2000)；Beclin，C.et al.Curr.Biol.12，684-688(2002))。這些系統(tǒng)被認(rèn)為用作抗RNA和DNA病毒的防御系統(tǒng)。然而，這樣的機理是否存在于哺乳動物細(xì)胞中是不清楚的。需要進一步的研究以闡明與上述描述的系統(tǒng)相關(guān)的防御系統(tǒng)是否通過RMDM或?qū)氲幕虼嬖谟谌说募?xì)胞中。
基因啟動子的DNA甲基化通過調(diào)控特異性基因的表達(dá)在誘導(dǎo)腫瘤生成和發(fā)展中具有重要的作用(Li，E.Nature Rev.Genet.3，662-673(2002)；Esteller，M.Oncogene 21，5427-5440(2002))。許多蛋白參與DNA甲基化，諸如屬于MeCP2、MBD和DMNT家族的蛋白，已經(jīng)在人的細(xì)胞中得到鑒別和充分的特性研究。然而，關(guān)于這些蛋白怎樣被指導(dǎo)和被什么指導(dǎo)，以及同源物基因的特異性CpG目標(biāo)位點的甲基化在腫瘤生成和發(fā)展過程中如何被誘導(dǎo)仍然是不清楚的。合成的siRNAs和基于tRNA載體的siRNAs主要位于細(xì)胞質(zhì)中，此處也發(fā)生siRNA-介導(dǎo)的mRNAs的降解。一種可能性是siRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的一小部分可能被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核?？蛇x擇地，在細(xì)胞分裂過程中，由于此時核膜消失，siRNAs可能獲取接觸基因組DNAs的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者表明，合成的小干擾RNAs(siRNA)和基于載體的siRNAs都可以在人的細(xì)胞中誘導(dǎo)序列特異性的DNA甲基化。合成的靶向E-鈣粘蛋白啟動子上的CpG島的siRNAs(E-鈣粘蛋白-siRNAs)誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞中重要的DNA甲基化。結(jié)果，這些siRNAs在轉(zhuǎn)錄水平抑制E-鈣粘蛋白基因的表達(dá)。此外，E-鈣粘蛋白-siRNA-指導(dǎo)的DNA甲基化在DNMT1被特異性的siRNAs破裂時消失。此外，靶向erbB2啟動子的基于載體的siRNAs也誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞中的DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄基因沉默。因此，在人的細(xì)胞中，靶向目標(biāo)基因啟動子上的CpG島的siRNAs能夠在轉(zhuǎn)錄水平通過依賴于DNMT1的DNA甲基化誘導(dǎo)基因沉默，并可產(chǎn)生新型基因治療試劑。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)，并具體包括[1]DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，包括靶向哺乳動物細(xì)胞的DNA中包含CpG或CpNG(其中N為A、T、C或G中的任意一個)位點的dsRNA。
包含表達(dá)載體的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，所述的表達(dá)載體包含編碼靶向哺乳動物細(xì)胞的DNA中包含CpG或CpNG(其中N為A、T、C或G中的任意一個)位點的dsRNA的DNA。
[1]或[2]的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的dsRNA含有30個或30個以下的核苷酸。
[1]或[2]的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的dsRNA含有30個至5,000個核苷酸。
[1]至[4]之一的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的dsRNA含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
[2]的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的載體進一步編碼Dicer。
[2]的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中外顯子-內(nèi)含子-外顯子盒可操作地連接在啟動子的下游且編碼dsRNA的DNA插入內(nèi)含子中。
[7]的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的外顯子-內(nèi)含子-外顯子盒源于免疫球蛋白基因。
[2]至[7]之一的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中編碼dsRNA的DNA可操作地連接到表達(dá)載體中的PolI或PolII啟動子。
[9]的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的PolIII啟動子是tRNA啟動子、U6啟動子或H1啟動子中的任意一個。
[10]的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的PolII啟動子是SV40啟動子、CMV啟動子或SRα啟動子中的任意一個。
[2]至[11]之一的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的表達(dá)載體是一種病毒表達(dá)載體。
[2]至[12]之一的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的病毒表達(dá)載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)和慢病毒(lentivirus)中的任意一個。
[2]至[13]之一的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中編碼dsRNA的DNA可操作地連接到表達(dá)載體中包含四環(huán)素操作子(TetO)序列的啟動子。
DNA甲基化方法，包括將[1]-[14]之一的甲基化誘導(dǎo)試劑導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的步驟。
[15]的DNA甲基化方法，其中所述的哺乳動物是人。
基因表達(dá)-抑制劑，包括靶向哺乳動物細(xì)胞的基因啟動子中包含CpG或CpNG(其中N為A、T、C或G中的任意一個)位點的dsRNA。
包含表達(dá)載體的基因表達(dá)-抑制劑，所述的表達(dá)載體編碼靶向哺乳動物細(xì)胞的基因啟動子中包含CpG或CpNG(其中N為A、T、C或G中的任意一個)位點的dsRNA。
[17]或[18]的基因表達(dá)-抑制劑，其中dsRNA的類型不相同并且每個dsRNAs靶向一個不同的包含CpG或CpNG(其中N為A、T、C或G中的任意一個)的位點。
[17]至[19]之一的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的dsRNA含有30個或30個以下的核苷酸。
[17]至[19]之一的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的dsRNA含有30個至5,000個核苷酸。
[17]至[21]之一的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的dsRNA含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
[18]的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的載體進一步編碼Dicer。
[18]的基因表達(dá)-抑制劑，其中外顯子-內(nèi)含子-外顯子盒可操作地連接到啟動子的下游且編碼dsRNA的DNA插入該內(nèi)含子中。
[18]的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的外顯子-內(nèi)含子-外顯子盒是衍生于免疫球蛋白基因。
[18]至[25]之一的基因表達(dá)-抑制劑，其中編碼dsRNA的DNA可操作地連接到表達(dá)載體中的PolI或PolII啟動子。
[26]的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的PolIII啟動子是tRNA啟動子、U6啟動子或H1啟動子中的任意一個。
[26]的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的PolII啟動子是SV40啟動子、CMV啟動子或SRα啟動子中的任意一個。
[18]至[28]之一的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的表達(dá)載體是一種病毒表達(dá)載體。
[29]的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的病毒表達(dá)載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和慢病毒中的任意一個。
[18]至[30]之一的基因表達(dá)-抑制劑，其中編碼dsRNA的DNA可操作地連接到表達(dá)載體中包含四環(huán)素操作子(TetO)序列的啟動子。
[17]至[31]的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的基因是與疾病相關(guān)的基因，其表達(dá)涉及疾病。
[32]的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述疾病為腫瘤。
[33]的基因表達(dá)一抑制劑，其中所述基因為erbB2。
細(xì)胞增殖-抑制劑，包括[34]的基因表達(dá)-抑制劑作為活性成分。
基因表達(dá)-抑制方法，包括將[18]至[34]之一的基因表達(dá)-抑制劑導(dǎo)入細(xì)胞的步驟。
[36]的基因表達(dá)-抑制方法，進一步包括將靶向基因編碼區(qū)的dsRNAs導(dǎo)入細(xì)胞的步驟。
[36]或[37]的基因表達(dá)-抑制方法，其中所述的哺乳動物細(xì)胞源自人。
在第一個實施方案中，本發(fā)明提供甲基化誘導(dǎo)試劑，該試劑應(yīng)用dsRNA在哺乳動物細(xì)胞中以序列特異性的方式將CpG或CpNG序列甲基化。本發(fā)明的甲基化誘導(dǎo)試劑包括哺乳動物細(xì)胞中靶向含有CpG或CpNG序列的DNA位點的dsRNAs，或編碼所述dsRNAs的載體。
本發(fā)明中，“DNAs中的CpG或CpNG”可為選自將要被甲基化的DNAs中任意的CpG或CpNG序列。甲基化具有在體內(nèi)調(diào)控各種生物活性的功能。例如，CpG序列的甲基化或者在啟動子區(qū)域的CpG序列的甲基化抑制下游基因的表達(dá)。因此，在本發(fā)明中，優(yōu)選哺乳動物基因的啟動子區(qū)域中的CpG或CpNG序列。此處，CpNG中的“N”代表A、G、C或T中的任意一個。
本發(fā)明的“位點”可包括CpG或CpNG的至少一個單元，并且優(yōu)選地，可選包含兩個或兩個以上CpG單元的CpG島作為位點。通過應(yīng)用包含兩個或兩個以上CpG單元的位點作為靶物，可將兩個或兩個以上甲基導(dǎo)入該位點。這可以增強甲基化的生物學(xué)效應(yīng)(biological effect)。
短語“靶向...的dsRNAs”指與上述包含CpG或CpNG位點的雙鏈DNAs互補的dsRNAs。更具體地，該術(shù)語指通過將與上述包含CpG的位點的(+)和(-)鏈互補的兩條單鏈RNAs進行配對形成的雙鏈RNAs。術(shù)語“靶向的”優(yōu)選指通過將每條鏈與包含甲基將要導(dǎo)入的CpG或CpNG序列的雙鏈DNA位點互補的RNA鏈進行配對形成的dsRNAs。然而，如實施例所描述，甲基也可以導(dǎo)入靠近對應(yīng)于dsRNAs的位點的CpG或CpNG序列。因此，短語“靶向...的dsRNAs”不僅還包括如上所述的直接對應(yīng)于“包含CpG或CpNG序列的DNA位點”的dsRNAs，而且還包括與不對應(yīng)于甲基將要導(dǎo)入的位點的DNA序列互補的dsRNAs。所述的dsRNAs與甲基將要導(dǎo)入的DNA序列位點之間的距離可為，例如大約50-60個核苷酸的范圍。換句話說，作為靶物的CpG或CpNG序列可通過應(yīng)用與距離位點大約50-60個核苷酸的位置互補的dsRNAs進行甲基化，該位點包含甲基將要導(dǎo)入的CpG或CpNG。如下所述，目標(biāo)DNA序列不需要與RNA序列非常好互補，而且dsRNA鏈中任意一條或兩條都可包含非互補的核苷酸。
任何用于RNA干擾(RNAi)的dsRNA構(gòu)建體可用作本發(fā)明中的“dsRNAs(雙鏈RNAs)”。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，用于近年來廣泛應(yīng)用的RNAi的dsRNAs誘導(dǎo)哺乳動物中的DNA的甲基化。然后，本發(fā)明者根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)開發(fā)了用于哺乳動物的DNA甲基化試劑。目前，在哺乳動物細(xì)胞中用于RNAi的dsRNAs包括人工合成的dsRNAs和應(yīng)用表達(dá)載體在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的dsRNAs。因此，兩種類型的dsRNAs也都可用作本發(fā)明的甲基化-誘導(dǎo)試劑。
長dsRNAs對于哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞毒性在人工合成的dsRNAs導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞時必須加以考慮。因此，優(yōu)選短dsRNAs用作人工合成的dsRNAs(在下文中稱為“合成的dsRNAs”)。短dsRNAs可在，例如15-49個堿基對的范圍，優(yōu)選15-35個堿基對，更優(yōu)選21-30個堿基對。
此外，考慮到細(xì)胞毒性，從表達(dá)載體產(chǎn)生的dsRNAs(在下文中稱為“基于載體的dsRNAs”等等)也優(yōu)選短dsRNAs。然而，長dsRNAs可通過應(yīng)用設(shè)計的表達(dá)后立即切割長dsRNAs產(chǎn)生短dsRNAs的構(gòu)建體表達(dá)。用于消除長dsRNAs的酶當(dāng)它們侵入細(xì)胞質(zhì)時可產(chǎn)生細(xì)胞毒性。因此，當(dāng)直接在存在基因組DNAs的細(xì)胞核表達(dá)時不僅短dsRNAs，而且長dsRNAs均可以應(yīng)用。因此，基于載體的dsRNAs可為，例如15-50,000個堿基對的范圍，優(yōu)選21-10,000個堿基對，更優(yōu)選30-5,000個堿基對。上面描述的短dsRNAs優(yōu)選用于特異性靶物CpGs或CpNGs的甲基化，相比之下，長dsRNAs適合將DNAs的更大范圍中的CpGs或CpNGs甲基化。
能夠應(yīng)用表達(dá)載體表達(dá)長dsRNAs，然后在表達(dá)后立即將其切割為短dsRNAs的構(gòu)建體的實施例是用于表達(dá)如Dicer的酶的構(gòu)建體，Dicer可在表達(dá)長dsRNAs的同時將長dsRNAs切割為短dsRNAs。更具體地，這樣的表達(dá)載體包括編碼長dsRNAs的DNA和Dicer基因。當(dāng)它們都在細(xì)胞中同時表達(dá)時，Dicer能在它們表達(dá)后立即將長dsRNAs切割為短dsRNAs。更具體的構(gòu)建體能根據(jù)下文中的實施例制備。
應(yīng)用表達(dá)載體在包含基因組DNAs的細(xì)胞核中直接表達(dá)dsRNAs的例證性的構(gòu)建體，為其編碼dsRNAs的DNA插入含有外顯子-內(nèi)含子-外顯子的表達(dá)盒中的內(nèi)含子的構(gòu)建體。真核生物的內(nèi)含子在細(xì)胞核內(nèi)通過加工從RNA前體上切除。因此，當(dāng)含有上述外顯子-內(nèi)含子-外顯子的表達(dá)盒在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時，內(nèi)顯子在細(xì)胞核內(nèi)從RNA前體上切除，而插入該內(nèi)含子的dsRNAs誘導(dǎo)基因組DNA中在目標(biāo)位點的甲基化，而不激活細(xì)胞質(zhì)的酶以及其他。在下述的實施例中，真正地確認(rèn)應(yīng)用含有外顯子-內(nèi)含子-外顯子的表達(dá)盒表達(dá)的長dsRNAs誘導(dǎo)DNA甲基化，但不產(chǎn)生細(xì)胞毒性反應(yīng)。
含有外顯子-內(nèi)含子-外顯子的表達(dá)盒可從任何基因中衍生，只要該表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中沒有負(fù)效應(yīng)且不抑制DNA的甲基化，即本發(fā)明的目的。能夠用于本發(fā)明的“外顯子-內(nèi)含子-外顯子”單元包括，例如，cdk抑制子p16基因、Bcl2基因等等，而優(yōu)選的實施例為從免疫球蛋白衍生的外顯子-內(nèi)含子-外顯子單元。外顯子-內(nèi)含子-外顯子單元可包含至少一個兩側(cè)有兩個外顯子的內(nèi)含子。也可以應(yīng)用包含兩個或兩個以上的內(nèi)含子的單元，舉例，如外顯子-(內(nèi)含子-外顯子-內(nèi)含子)n-外顯子(其中，n代表1或1以上的整數(shù))。通過應(yīng)用包含編碼靶向不同DNA位點的dsRNAs的內(nèi)含子的單元，兩個或兩個以上位點能同時被甲基化。
人工合成的dsRNAs和應(yīng)用載體表達(dá)的dsRNAs可以具有或者不具有一端帶有環(huán)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)(有時稱作“莖-環(huán)結(jié)構(gòu)”)。
在其端部沒有環(huán)的dsRNAs的兩個無環(huán)端可為平末端或粘性(突出)末端。粘性(突出)末端結(jié)構(gòu)不僅包括帶有報告siRNA的3’突出端的結(jié)構(gòu)(Elbashir，S.M et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNAinterference in cultured mammalian cells.Nature 411，494-498(2001)；Caplen，N.J.et al.Specific inhibition of gene expression by small double-strandedRNAs in invertebrate and vertebrate systems.Proc Natl Acad Sci USA 98，9742-9747(2001))，而且包括帶有5’突出端的結(jié)構(gòu)，只要它們誘導(dǎo)DNA的甲基化。突出的核苷酸數(shù)目不僅限于上述參考文獻(xiàn)中報道的2至3個，而可以是任何個數(shù)的核苷酸，只要RNAi效應(yīng)能夠被誘導(dǎo)。核苷酸的數(shù)目可為，例如1-8的范圍，優(yōu)選2-4。
術(shù)語“具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的dsRNAs”指包含莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的dsRNAs，其通過接頭RNA等連接于雙鏈RNA的一端。發(fā)卡dsRNAs的長度基于雙鏈RNA的部分(莖的部分)。因此，當(dāng)作為雙鏈RNA部分(莖的部分)的長度進行測定時，合成的dsRNAs可為，例如15-49個堿基對的范圍，優(yōu)選15-35個堿基對，更優(yōu)選21-30個堿基對；而如上所述，基于載體的dsRNAs則為，例如15-50,000個堿基對的范圍，優(yōu)選21-10,000個堿基對，更優(yōu)選30-5,000個堿基對。
接頭的長度是沒有限制的，只要是不抑制莖部配對的長度。例如，三葉草(cloverleaf)的tRNA結(jié)構(gòu)可用作接頭部分以穩(wěn)定莖部配對并抑制編碼莖部的DNAs之間的重組?？商鎿Q地，即使當(dāng)接頭的長度抑制莖部配對時，構(gòu)建體可包含這樣的結(jié)構(gòu)，例如在接頭部分含有內(nèi)含子，在前體RNA到成熟RNA的加工期間內(nèi)含子被切除，而使莖部配對成為可能。
通過dsRNAs中的RNA配對形成的雙鏈RNA部分不僅包括完全互補的雙鏈RNAs，也包括在它們的有義RNA鏈上含有不配對部分，諸如錯配(其中對應(yīng)的核苷酸不是互補的)和突起(其中一條鏈沒有對應(yīng)的核苷酸)的雙鏈RNAs。雙鏈RNA可包含上述不配對的部分，只要它們既不抑制dsRNAs的形成，又不抑制甲基化的誘導(dǎo)。
“突起”如上所述優(yōu)選包含一至兩個不配對的核苷酸，且突起的個數(shù)依據(jù)dsRNAs的長度而變化。例如，對于包含大約30個核苷酸的dsRNAs，有義RNA鏈在雙鏈RNA的區(qū)域包含一至七個突起，優(yōu)選大約一至五個突起。上述“錯配”的個數(shù)也依據(jù)dsRNA的長度而變化。例如，對于包含大約30個核苷酸的dsRNAs，有義RNA鏈在雙鏈RNA的區(qū)域包含一至七個錯配，優(yōu)選大約一至五個錯配。dsRNAs可以突起和錯配都包含。在這種情況下，突起和錯配的個數(shù)可為，例如，總共1-7個的范圍，優(yōu)選總共1-5個。
如上所述，基于載體的dsRNAs的結(jié)構(gòu)在其末端可具有或不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)。當(dāng)帶有兩個無環(huán)末端的dsRNAs應(yīng)用載體表達(dá)時，編碼dsRNAs每一條鏈的DNAs(下文中，一條鏈稱為“有義RNA鏈”而另一條稱為“反義RNA鏈”)前后相連地置于載體中，且啟動子和終止子分別安排在每個DNA的上游和下游。通過將如上所述構(gòu)建的載體導(dǎo)入細(xì)胞，每條RNA鏈在細(xì)胞中表達(dá)并退火以形成dsRNAs。
與此同時，發(fā)卡dsRNAs的表達(dá)載體可由構(gòu)造單元構(gòu)建，該構(gòu)造單元中的編碼反義和有義鏈的DNAs與反方向通過編碼接頭RNAs的DNAs(接頭DNAs)連接。所述的單元含有“有義RNA鏈-環(huán)-反義RNA鏈”，優(yōu)選以這個次序。啟動子可與上述單元的一個末端連接以構(gòu)建發(fā)卡dsRNAs的表達(dá)載體。用于構(gòu)建發(fā)卡dsRNA表達(dá)載體的接頭DNAs在長度和序列上沒有限制，只要該序列不是抑制siRNAs形成的終止序列等等，而且只要接頭的序列和長度允許成熟RNAs的莖部的配對。例如，如上所述的編碼tRNAs的DNAs能用作接頭DNAs。
作為表達(dá)這些dsRNAs的啟動子，可以優(yōu)選應(yīng)用PolII和PolIII啟動子。PolIII啟動子包括，例如U6啟動子、tRNA啟動子、腺病毒VA1啟動子、5S rRNA啟動子、7SK RNA啟動子、7SL RNA啟動子和H1RNA啟動子。當(dāng)應(yīng)用U6啟動子，將四個尿苷殘基加到RNAs的3’末端；然而，最終產(chǎn)生的siRNAs的3’突出端通過將零個、一個、兩個、三個或四個腺嘌呤添加到反義-編碼DNAs和有義-編碼DNAs，能自由調(diào)整為四個、三個、兩個、一個或零個核苷酸。當(dāng)應(yīng)用其他的啟動子時，突出的核苷酸的個數(shù)也能通過同樣的方法自由地調(diào)整。
當(dāng)應(yīng)用PolIII啟動子時，優(yōu)選將終止子添加在有義-編碼DNAs和反義-編碼DNAs的3’末端，以只表達(dá)短RNAs并適當(dāng)?shù)赝Ｖ罐D(zhuǎn)錄。終止子的類型沒有限制，只要其序列允許由啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄的終止。例如，包含四個或四個以上連續(xù)的Ts(胸腺嘧啶)或As(腺嘌呤)的序列，或者能形成回文結(jié)構(gòu)的序列能用作終止子。特別優(yōu)選含有四個或四個以上連續(xù)的Ts(胸腺嘧啶)的序列。
PolII啟動子包括逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子，巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus)啟動子、T7啟動子、T3啟動子、SP6啟動子、RSV啟動子、EF-1α啟動子、β-肌動蛋白啟動子、γ-球蛋白啟動子、SRα啟動子及其他。這些PolII啟動子優(yōu)選用于表達(dá)中等長度的dsRNAs。當(dāng)應(yīng)用PolII產(chǎn)生短dsRNAs時，也優(yōu)選應(yīng)用通過自處理，如核酶，切割RNA的手段。反義或有義目標(biāo)RNAs能通過RNA切割手段的組合應(yīng)用產(chǎn)生，所述的RNA切割手段通過自處理以剪切由PolII啟動子表達(dá)的中等長度的RNA鏈。也可通過將莖-環(huán)序列立即插入PolII啟動子的下游，并將polyA附加信號置于序列的下游以產(chǎn)生莖-環(huán)RNAs。能夠構(gòu)建這樣基于核酶的單元用于產(chǎn)生反義或有義RNAs，例如，根據(jù)WO 03/046186。有自處理活性的核酶包括錘頭狀核酶(hammerheadribozymes)、發(fā)卡核酶(hairpin ribozymes)、HDV核酶和源自四膜蟲屬(Tetrahymena)的核酶(Biochem.Biophys.Res.Commu n.，Vol.186，pp.1271-1279(1992)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.90，pp.11302-11306(1993)；BIO medica，Vol.7，pp.89-94(1992)；Gene，Vol.122，pp.85-90(1992))。
siRNAs可以通過應(yīng)用如上述啟動子的可誘導(dǎo)的啟動子在優(yōu)選的時間表達(dá)。這樣的可誘導(dǎo)的啟動子包括其中加入四環(huán)素操縱子(TetO)序列以允許由四環(huán)素轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的tRNA啟動子和U6啟動子(Ohkawa，J.& Taira，K.Controlof the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsivederivative of the human U6 snRNA promoter.Hum Gene Ther.11，577-585(2000)；Fig.12)。可選擇地，應(yīng)用組織特異性的啟動子或如Cre-LoxP系統(tǒng)的DNA重組系統(tǒng)，組織特異性的DNA甲基化可以通過以組織特異性的方式表達(dá)dsRNAs在組織中被誘導(dǎo)。根據(jù)WO 03/046186，如上所述，應(yīng)用如Cre-LoxP系統(tǒng)的DNA重組系統(tǒng)，能夠構(gòu)建的dsRNAs的表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明的“載體”可根據(jù)載體將要導(dǎo)入的細(xì)胞的類型適當(dāng)?shù)剡x擇。例如，當(dāng)應(yīng)用哺乳動物細(xì)胞時，載體可包括，但不限于，病毒載體諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體(adeno-associated viral vectors)、牛痘病毒載體(vaccinia viral vectors)、慢病毒載體(lentiviral vectors)、皰疹病毒載體(herpes viral vectors)、alpha病毒載體、EB病毒載體、乳頭狀瘤病毒載體(papilloma viral vectors)和泡沫病毒載體(foamy viral vectors)；以及非病毒載體諸如陽離子脂質(zhì)體、配體-DNA復(fù)合物和基因槍(Y.Niitsu et al.，Molecular Medicine 351385-1395(1998))。除病毒載體之外，也可優(yōu)選地應(yīng)用啞鈴形(dumbbell)DNAs(Zanta M.A.et al.，Gene deliverya single nuclearlocalization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus.ProcNatl Acad Sci USA.1999 Jan 5；96(1)91-6)、抗核酸酶的修飾的DNAs和裸質(zhì)粒(naked plasmids)(Liu F，Huang L.Improving plasmid DNA-mediated livergene transfer by prolonging its retention in the hepatic vasculature.J.Gene Med.2001 Nov-Dec；3(6)569-76)。
基于載體的dsRNA的每條RNA鏈不需要從同一個載體表達(dá)。dsRNAs可設(shè)計為反義和有義RNAs從不同的載體表達(dá)。
在第二個實施方案中，本發(fā)明提供了用于甲基化DNAs的方法。本發(fā)明的甲基化方法包括將指導(dǎo)dsRNAs表達(dá)的質(zhì)?；蛴米魃鲜龅腄NA甲基化-誘導(dǎo)試劑的dsRNAs導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的步驟。
哺乳動物細(xì)胞的類型并沒有具體地限制，且所述的細(xì)胞可源自人、猴、狗、小鼠、大鼠、兔等等。將dsRNAs或載體導(dǎo)入上述哺乳動物細(xì)胞的方法的類型也沒有具體的限制。這些方法可選自磷酸鈣法(Virology，Vol.52，p.456(1973))、電穿孔法(Nucleic Acids Res.，Vol.15，p.1311(1987))、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(lipofection)法(J.Clin.Biochem.Nutr.，Vol.7，p.175(1989))、病毒感染介導(dǎo)的導(dǎo)入法(Sci.Am.，p.34，March(1994))、基因槍法及其他。導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法包括電穿孔法(Nature，Vol.319，p.791(1986))、聚乙二醇法(EMBO J.，Vol.3，p.2717(1984))、粒子槍法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.85，p.8502(1988))、土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的導(dǎo)入法(Nucleic.Acids Res.，Vol.12，p.8711(1984))等等?？蛇x擇地，為了方便起見，dsRNAs或載體可應(yīng)用市場上可買到的試劑盒導(dǎo)入，如實施例中所述。
甲基化能通過如實施例中的甲基化特異性的PCR分析或亞硫酸氫鹽測序法(bisulfite sequencing method)進行確認(rèn)。實施例中描述了這些分析的具體步驟。當(dāng)應(yīng)用長dsRNAs時，它們的細(xì)胞毒性可根據(jù)elfα活性進行評估，其在實施例中詳細(xì)描述。
在導(dǎo)入上述的DNA甲基化-誘導(dǎo)試劑的細(xì)胞中，DNAs以序列-特異性的方式被甲基化。此處，術(shù)語“序列-特異性的方式”指在dsRNAs的目標(biāo)位點中CpG或CpNG的甲基化。實施例中的發(fā)現(xiàn)顯示，組蛋白H3甲基化和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1參與了dsRNA指導(dǎo)的DNA甲基化。
DNA甲基化是一種用于控制各種生物活性的機制。因此，上述的DNA甲基化-誘導(dǎo)試劑和用于誘導(dǎo)DNA甲基化的方法對于闡明由甲基化調(diào)控的體內(nèi)機制是有用的。
在第三個實施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制基因表達(dá)的試劑，及應(yīng)用這些試劑的基因表達(dá)方法。
DNA甲基化是一種用于調(diào)控基因表達(dá)的機制。具體地，基因啟動子區(qū)域的CpG島的甲基化引起DNA構(gòu)象的改變，導(dǎo)致基因表達(dá)的抑制。因此，基因表達(dá)可通過應(yīng)用上面的甲基化-誘導(dǎo)試劑在基因啟動子區(qū)域使CpG島甲基化進行抑制。與抑制mRNAs翻譯為蛋白質(zhì)的siRNAs不同，本發(fā)明所述的基因表達(dá)-抑制劑抑制DNAs轉(zhuǎn)錄為mRNAs。因此，本發(fā)明的基因表達(dá)-抑制劑能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的沉默(或在轉(zhuǎn)錄步驟的基因敲除)。
當(dāng)上述的甲基化-誘導(dǎo)試劑用作基因表達(dá)-抑制劑，dsRNA或編碼dsRNA的載體被構(gòu)建為靶向哺乳動物中基因啟動子上包含CpG或CpNG(其中N為A、T、C或G中的任一個)的位點。此外，通過基因-表達(dá)抑制試劑甲基化的程度越高，基因表達(dá)越被有效地抑制。因此，目標(biāo)位點的個數(shù)優(yōu)選不是1個而是兩個或兩個以上。當(dāng)上述甲基化-誘導(dǎo)試劑靶向兩個或兩個以上位點時，它們優(yōu)選應(yīng)用靶向不同位點的dsRNAs的組合，且這些dsRNAs可為上述基于載體的長dsRNAs(例如，從長dsRNAs和Dicer共表達(dá)系統(tǒng)衍生的dsRNAs，或系統(tǒng)，其中編碼dsRNAs的DNAs插入外顯子-內(nèi)含子-外顯子中的內(nèi)含子)或短dsRNAs。
如上所述，本發(fā)明的基因表達(dá)-抑制劑在轉(zhuǎn)錄水平抑制表達(dá)。因此，為了更加徹底地(intensive)抑制基因表達(dá)，用于RNAi的dsRNAs可與本發(fā)明的基因表達(dá)-抑制劑聯(lián)合應(yīng)用。具體地，基因表達(dá)-抑制劑可通過將靶向編碼區(qū)的dsRNAs(siRNAs)和靶向基因啟動子區(qū)域的CpG島的dsRNAs組合進行制備。通過應(yīng)用與如上所述的本發(fā)明的基因表達(dá)-抑制劑組合的siRNAs，本發(fā)明的基因表達(dá)-抑制劑將在轉(zhuǎn)錄水平抑制基因表達(dá)，而且即使mRNAs被轉(zhuǎn)錄，所述的siRNAs也會抑制它們的翻譯。因此，強基因-敲除試劑可通過將本發(fā)明的基因表達(dá)-抑制劑與靶向同一基因的siRNAs組合進行制備。
其表達(dá)根據(jù)本發(fā)明加以抑制的基因沒有具體地限制，而且可以為任何基因，只要它們在它們的啟動子區(qū)域包含CpG或CpNG。當(dāng)在具體的表型表達(dá)增強的基因被選取作為用于表達(dá)抑制的目標(biāo)“基因”時，它們的表達(dá)通過應(yīng)用上述的基因-抑制劑將基因啟動子甲基化進行抑制。因此，通過選擇與具體的表型相關(guān)的基因，本發(fā)明的基因-抑制劑作為用于分析那種具體表型的試劑，或作為用于制備基因敲除的動物(knockdown animals)的工具是有用的，并因此在生物化學(xué)中是極為有用的。
當(dāng)選擇在疾病中表達(dá)增強的基因作為上述“基因”時，上述的基因表達(dá)-抑制劑用于通過與疾病相關(guān)的基因啟動子的甲基化抑制它們的表達(dá)。實際上，通過選擇與腫瘤生成有關(guān)的基因，例如erbB，然后將靶向erbB啟動子中CpG島的dsRNAs導(dǎo)入癌細(xì)胞，癌細(xì)胞的增殖可通過抑制erbB的表達(dá)進行抑制。因此，靶向與癌癥有關(guān)的基因的基因表達(dá)-抑制劑可用作研究疾病(如癌癥)的試劑或在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域作為癌癥的治療試劑。


圖1為顯示siRNA指導(dǎo)的E-鈣粘蛋白啟動子的DNA甲基化的圖和照片。a)顯示E-鈣粘蛋白啟動子中的siRNA靶位點的圖。每個位點(1至10)包含一個或兩個CpG序列。HpaI、AciI、AccI和HhaI為CpG甲基化-敏感的限制酶。b)顯示應(yīng)用基于PCR的甲基化實驗方法進行siRNA-指導(dǎo)的E-鈣粘蛋白啟動子的DNA甲基化的檢測分析的照片。所有靶向CpG位點的siRNAs誘導(dǎo)啟動子的DNA甲基化。GAPDH為抗HpaI、AciI、AccI和HhaI限制酶切消化的控制基因。明顯地，擴增的GAPDH基因片段的水平在所有的樣品中幾乎一樣，并在實驗誤差的范圍內(nèi)下降。c)顯示甲基化抑制劑5-aza存在或不存在的情況下，E-鈣粘蛋白啟動子的DNA甲基化的相對程度的圖。該siRNA-指導(dǎo)的E-鈣粘蛋白啟動子的DNA甲基化通過基于PCR的甲基化檢測方法測定。條帶強度應(yīng)用NIH圖像分析程序通過密度法確定。
圖2為顯示靶向E-鈣粘蛋白啟動子的CpG位點的E-鈣粘蛋白-siRNA的效果的圖。a)顯示在含有E-鈣粘蛋白-siRNA的細(xì)胞中E-鈣粘蛋白mRNA的相對水平的圖。每個細(xì)胞樣品中的總RNA以RT-PCR進行分析。E-鈣粘蛋白mRNA的水平應(yīng)用GAPDH的mRNA水平進行歸一化。b)在含有E-鈣粘蛋白-siRNA的細(xì)胞中5-aza存在或不存在的情況下，E-鈣粘蛋白mRNA的相對水平。每個細(xì)胞樣品中的總RNA以RT-PCR進行分析。c)含有E-鈣粘蛋白-siRNA的細(xì)胞中E-鈣粘蛋白的相對水平。每個細(xì)胞樣品中的E-鈣粘蛋白通過Western印跡應(yīng)用特異性的抗體檢測。每個細(xì)胞樣品中的E-鈣粘蛋白的相對水平應(yīng)用NIH圖像分析程序通過密度法確定。
圖3為顯示靶向DNMT1-敲除細(xì)胞中E-鈣粘蛋白啟動子的E-鈣粘蛋白-siRNA的效果的圖和照片。a)DNMT-1-siRNA和突變體DNMT-1-siRNA的序列。帶下劃線的字母代表DNMT-1-siRNA中的核苷酸突變。b)顯示MCF-7細(xì)胞中存在或不存在DNMT1-siRNA的情況下，DNMT-1 mRNA水平的照片。DNMT-1 mRNA的水平通過RT-PCR確定。c)顯示在MCF-7細(xì)胞中存在或不存在E-鈣粘蛋白-siRNA和DNMT-1-siRNA的情況下，E-鈣粘蛋白啟動子中DNA甲基化程度的圖。條帶強度應(yīng)用NIH圖像分析程序通過密度法確定。d)顯示在MCF-7細(xì)胞中存在或不存在E-鈣粘蛋白-siRNA和DNMT-1-siRNA的情況下，E-鈣粘蛋白mRNA水平的圖。每個細(xì)胞樣品中的總RNA應(yīng)用特異性的抗體通過RT-PCR分析。
圖4為顯示在erbB2啟動子中tRNA-shRNA-指導(dǎo)的DNA甲基化的圖和照片。a)顯示靶向erbB2啟動子的tRNA-shRNA載體結(jié)構(gòu)的圖。選擇erbB2啟動子中的5個CpG位點作為tRNA-shRNAs的靶物。b)顯示由tRNA-shRNAs表達(dá)的siRNAs通過Northern印跡的檢測結(jié)果的照片。所有的siRNAs在啟動子erbB2中表達(dá)tRNA-shRNA的細(xì)胞內(nèi)進行檢測。c)顯示在erbB2啟動子中誘導(dǎo)tRNA-shRNA-指導(dǎo)的DNA甲基化的結(jié)果的照片。erbB2啟動子的siRNA-指導(dǎo)的DNA甲基化通過基于PCR的甲基化測定方法檢測。條帶強度應(yīng)用NIH圖像分析程序通過密度法確定。d)顯示表達(dá)靶向erbB2啟動子(位點1至5)的tRNA-shRNA的細(xì)胞中erbB2 mRNA的相對水平和表達(dá)靶向編碼區(qū)(位點6)的tRNA-shRNA的細(xì)胞中erbB2 mRNA的相對水平的圖。每個細(xì)胞樣品中的總RNA應(yīng)用特異性的抗體通過RT-PCR分析。e)顯示表達(dá)tRNA-dsRNAs的細(xì)胞的生長速率的圖。生長速率通過如在方法部分描述的步驟確定。
圖5為顯示MCF-7細(xì)胞中erbB2 mRNA相對水平的圖，在所述的MCF-7細(xì)胞中單獨或與編碼Dicer的tRNA-shRNA結(jié)合，導(dǎo)入靶向erbB2啟動子的稍長的shRNA(其莖長度范圍29-100nt)。每個細(xì)胞樣品中的總RNA應(yīng)用特異性的引物通過RT-PCR分析。
圖6為顯示MCF-7細(xì)胞中存在或不存在PKR活化的分析結(jié)果的圖，在所述的MCF-7細(xì)胞中單獨或與能表達(dá)Dicer的tRNA-shRNA載體等結(jié)合，導(dǎo)入長hRNA?；罨鶕?jù)eIF2α磷酸化的程度進行分析。
圖7為顯示在導(dǎo)入靶向E-鈣粘蛋白啟動子的siRNAs的MCF-7細(xì)胞中序列特異性甲基化的檢測結(jié)果的圖。帶陰影的方框表示當(dāng)抗位點1或位點3的siRNA被導(dǎo)入(+)或不導(dǎo)入(-)細(xì)胞時，在位點1或3的對應(yīng)序列被甲基化。發(fā)現(xiàn)不僅CpG序列而且CpNG序列充當(dāng)甲基化的目標(biāo)序列。對于存在或不存在靶向位點3的siRNA之間的比較得到相似的結(jié)果。序列特異性的甲基化通過亞硫酸氫鹽測序法檢測。
圖8為顯示siRNA-指導(dǎo)的甲基化也在正常的人乳腺細(xì)胞中被誘導(dǎo)的檢測結(jié)果的圖。序列特異性的甲基化通過亞硫酸氫鹽測序法檢測。
圖9為顯示在導(dǎo)入靶向E-鈣粘蛋白啟動子的siRNAs的MCF-7細(xì)胞中，E-鈣粘蛋白啟動子中甲基化區(qū)域的范圍的圖。結(jié)果顯示，鄰近目標(biāo)區(qū)域的CpG序列也被甲基化。位點3的siRNA也使位點2區(qū)域甲基化。序列特異性的甲基化通過上面描述的亞硫酸氫鹽測序法檢測。
圖10為顯示應(yīng)用靶向erbB2啟動子的shRNA(tRNA-shRNA和U6-shRNA)的表達(dá)載體，誘導(dǎo)序列特異性的甲基化的結(jié)果的11為顯示甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1或HMT表達(dá)被siRNA的抑制對于甲基化的影響的分析結(jié)果的圖，所述的甲基化是由靶向E-鈣粘蛋白啟動子的siRNA誘導(dǎo)的。A)在存在或不存在靶向DNMT1啟動子的siRNA的情況下，應(yīng)用靶向E-鈣粘蛋白啟動子的siRNA時，序列特異性的甲基化程度差異的分析。B)在存在或不存在靶向HMT啟動子的siRNA的情況下，應(yīng)用靶向E-鈣粘蛋白啟動子的siRNA時，序列特異性的甲基化程度差異的分析。序列特異性的甲基化通過如上所述的亞硫酸氫鹽測序法檢測。
圖12為顯示dsRNA表達(dá)載體(pSV-BGI)構(gòu)造的圖，所述載體設(shè)計為允許長dsRNA在細(xì)胞核中定位。所述載體包含PolII啟動子。編碼長dsRNAs的基因被插入β球蛋白基因的內(nèi)含子中，其表達(dá)受啟動子的控制。內(nèi)含子在細(xì)胞核內(nèi)被加工。因此，插入內(nèi)含子的長dsRNAs在細(xì)胞核中釋放。
圖13為顯示應(yīng)用攜帶tRNA啟動子或U6啟動子的長dsRNA表達(dá)載體或長dsRNA在細(xì)胞核中的表達(dá)載體pSV-BGI在erbB2啟動子中誘導(dǎo)甲基化的結(jié)果的圖。
圖14為比較在MCF-7細(xì)胞中erbB2蛋白的表達(dá)水平的圖，在所述的MCF-7細(xì)胞中導(dǎo)入攜帶tRNA啟動子或U6啟動子的長dsRNA表達(dá)載體或長dsRNA在細(xì)胞核中的表達(dá)載體pSV-BGI。
圖15為顯示表達(dá)長dsRNA的每個載體的細(xì)胞毒性的圖。細(xì)胞毒性應(yīng)用導(dǎo)入每個載體的細(xì)胞中的PKR活化作為指示劑進行估計。PKR活化通過確定eIF2α磷酸化的程度進行檢測。
本發(fā)明的最優(yōu)實施方式在下文中，將應(yīng)用實施例具體地描述本發(fā)明，然而，這不能解釋為對此進行限制。
“siRNAs”在所有下面描述的實施例中單獨指短dsRNAs，而短dsRNAs，諸如為了RNA干擾的目的，被用于誘導(dǎo)DNA甲基化。這樣，除非其他的規(guī)定，此處，siRNAs指用于誘導(dǎo)DNA甲基化的短dsRNAs。
實施例1哺乳動物細(xì)胞中合成的siRNA指導(dǎo)的DNA甲基化本發(fā)明者合成了靶向E-鈣粘蛋白啟動子的CpG島的siRNA(E-鈣粘蛋白-siRNA)以檢測合成的siRNAs是否能誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中DNA的甲基化。
已有報道，在一些腫瘤的細(xì)胞系中，E-鈣粘蛋白由于其啟動子的異常甲基化而沉默(Herman，J.G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93，9821-9826(1996)；Graff，J.R.et al.J.Biol.Chem.272，22322-22329(1997)；Corn，P.G.etal.Clin.Cancer Res.6，4243-4248(2000))。本發(fā)明者在本研究中采用MCF-7細(xì)胞，因為MCF-7細(xì)胞的E-鈣粘蛋白啟動子中的CpG位點沒有被甲基化。作為對照，發(fā)明者應(yīng)用HL-60細(xì)胞，其E-鈣粘蛋白啟動子的CpG位點已被甲基化(Corn，P.G.et al.Clin.Cancer Res.6，4243-4248(2000))。E-鈣粘蛋白啟動子中的十個CpG位點被用作siRNA靶物(圖1a)。
Japan Bio Services Co.，Ltd合成了靶向E-鈣粘蛋白啟動子的siRNAs(E-鈣粘蛋白-siRNA)，和靶向DMNT1 mRNA的siRNAs(DMNT1-siRNA)(JbioS；Saitama，Japan)。E-鈣粘蛋白-siRNA的目標(biāo)序列如下位點1(SEQ ID NO1)5′-AGG CCG CUC GAG CGA GAG UGC AGUG-3′位點2(SEQ ID NO2)5′-GCC GGU GUG GUG GCA CAC GCC UGUA-3′位點3(SEQ ID NO3)5′-CCG GCA GGC GGA GGU UGC AGU GAGC-3′位點4(SEQ ID NO4)5′-ACU GCC CCU GUC CGC CCC GAC UUGU-3′位點5(SEQ ID NO5)5′-CGG CGG GGC UGG GAU UCG AAC CCAG-3′
位點6(SEQ ID NO6)5′-UCA CCG CGU CUA UGC GAG GCC GGGU-3′位點7(SEQ ID NO7)5′-CGG GUG GGC GGG CCG UCA GCU CCGC-3′位點8(SEQ ID NO8)5′-CGC CCU GGG GAG GGG UCC GCG CUGC-3′位點9(SEQ ID NO9)5′-GCG GUA CGG GGG GCG GUG CUC CGGG-3′位點10(SEQ ID NO10)5′-CGG UGC UCC GGG GCU CAC CUG GCUG-3′然后，制備抗這些目標(biāo)位點的25個核苷酸的siRNAs，各個合成的有義和反義RNA鏈通過常規(guī)的方法退火(Elbashir，S.M.et al.Genes Dev.15，188-200(2001))。
MCF-7細(xì)胞在含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。每種上面的E-鈣粘蛋白-siRNAs(200nM)根據(jù)供應(yīng)商的方案，應(yīng)用OligofectamineTM(Invitrogen，CA，USA)導(dǎo)入MCF-7細(xì)胞。導(dǎo)入siRNA之后，細(xì)胞培養(yǎng)96小時。然后，從細(xì)胞收集總DNAs，并從DNAs中分離基因組DNAs。
然后進行基于PCR的甲基化分析。具體地，分離的上述基因組DNAs以甲基化-敏感的酶(HpaI、AciI、AccI和HhaI；圖1a)在供應(yīng)商的方案中推薦的條件下消化。酶消化之后，E-鈣粘蛋白啟動子區(qū)域通過PCR從50ngDNA中應(yīng)用如下面列出的啟動子擴增E-鈣粘蛋白正向引物((SEQ ID NO29)5′-TCT AGA AAA ATT TTT TAA AA-3′)和反向引物((SEQ ID NO30)5′-AGA GGG GGT GCG TGG CTG CA-3′)；或erbB2正向引物((SEQ ID NO31)5′-CCC GGG GGT CCT GGA AGC CA-3′)和反向引物((SEQ ID NO32)5′-CCC GGG GGG GCT CCC TGG TTT-3′)。
此分析基于甲基化-敏感的上述酶切割啟動子中未甲基化的CpG島并因而DNAs沒有被擴增的原理(Qian，X.et al.Am.J.Pathol.153，1475-1482(1998))?；诖嗽恚瑔幼又蠧pG島的甲基化能夠通過測定此分析中的擴增產(chǎn)物進行檢測。
在對比實驗中，E-鈣粘蛋白啟動子的完整基因組DNA以PstI，其能夠切割E-鈣粘蛋白啟動子，和HindIII處理，其不能切割啟動子。所有的樣品通過兩個獨立實驗中的每種酶消化以消除不完全消化的可能性。兩組消化產(chǎn)物中每組至少重復(fù)兩次PCR擴增。為了防止PCR反應(yīng)中的循環(huán)過多，應(yīng)用循環(huán)曲線數(shù)的方法，采用完整的模板和以限制性酶PstI消化的模板(其得不到PCR產(chǎn)物)，確定每對引物所需的循環(huán)數(shù)。
對于E-鈣粘蛋白有特異性的引物列在下面。
位點1正向引物((SEQ ID NO33)5′-TCT AGA AAA ATT TTT TAA AAA A-3′)和反向引物((SEQ ID NO34)5′-AGC CTC CTG AAG TGT TGG ATTA-3′)位點2正向引物((SEQ ID NO35)5′-ACA TGG TGA AAC CCC GTC TTG T-3′)和反向引物((SEQ ID NO36)5′-TGT CTC AGC CTA TTG AGT AGC T-3′)位點3正向引物((SEQ ID NO37)5′-TAG GCT GAG ACA GGA GAG TCTC-3′)和反向引物((SEQ ID NO38)5′-CCA GGC TGG AGT GCA GTG GCAC-3′)位點4正向引物((SEQ ID NO39)5′-GGC AAT ACA GGG AGA CAC AGCG-3′)和反向引物((SEQ ID NO40)5′-ACA CCA CCA CGC CAG GCT AATT-3′)位點5正向引物((SEQ ID NO41)5′-TTC TGA TCC CAG GTC TTA GTG A-3′)和反向引物((SEQ ID NO42)5′-TAG GTG GGT TAT GGG ACC TGCA-3′)
位點6正向引物((SEQ ID NO43)5′-AGC AAC TCC AGG CTA GAG GGTC-3′)和反向引物((SEQ ID NO44)5′-GCG CGG ACC CCT CCC CAG GGCG-3′)位點7正向引物((SEQ ID NO45)5′-GGC TAG AGG GTC ACC GCG TCTA-3′)和反向引物((SEQ ID NO46)5′-TAC CGC TGA TTG GCT GAG GG-3′)位點8正向引物((SEQ ID NO47)5′-CGG GTG GGC GGG CCG TCA GCT-3′)和反向引物((SEQ ID NO48)5′-ATT GGC TGA GGG TTC ACC TGCC-3′)位點9正向引物((SEQ ID NO49)5′-GGC AGG TGA ACC CTC AGC CAA T-3′)和反向引物((SEQ ID NO50)5′-TGC GTG GCT GCA GCC AGG TGAG-3′)位點10正向引物((SEQ ID NO51)5′-GGC AGG TGAACC CTC AGC CAA T-3′)和反向引物((SEQ ID NO52)5′-TGC GTG GCT GCA GCC AGG TGAG-3′)GAPDH被用作對照基因。以不能消化GAPDH基因的HpaI、AciI、AccI、HhaI、PstI和HindIII酶處理之后，DNA片段應(yīng)用特異性的正向引物((SEQ ID NO63)5′-GTC TTC ACC ACC ATG GAG AAG GCT-3′)和反向引物((SEQ ID NO64)5′-GCC ATC CAC AGT CTT CTG GGT GGC-3′)通過PCR擴增。因而發(fā)現(xiàn)在各個樣品中部分GAPDH基因的擴增水平是可比較的，并且在實驗誤差的范圍內(nèi)下降。
如圖1b所示，在每個包含單個E-鈣粘蛋白-siRNA(位點1至10)或者所有E-鈣粘蛋白-siRNAs混合物的MCF-7細(xì)胞系中，檢測甲基化的DNAs。此外，在包含所有E-鈣粘蛋白-siRNAs混合物的MCF-7細(xì)胞中，甲基化的DNA的水平在DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(簡寫為5-aza)存在的情況下降低，(圖1c)。這些發(fā)現(xiàn)顯示，靶向E-鈣粘蛋白啟動子CpG區(qū)的siRNA可以誘導(dǎo)序列特異性的DNA甲基化。
實施例2由E-鈣粘蛋白-siRNA指導(dǎo)的DNA甲基化與E-鈣粘蛋白基因表達(dá)的相關(guān)性本發(fā)明者應(yīng)用對E-鈣粘蛋白啟動子有特異性的引物進行RT-PCR以測試E-鈣粘蛋白-siRNA指導(dǎo)的DNA甲基化是否與E-鈣粘蛋白基因的表達(dá)具有相關(guān)性。
將總RNAs應(yīng)用ISOGENTM(Nippon Gene；Toyama，Japan)根據(jù)供應(yīng)商的方案從MCF-7細(xì)胞中分離。應(yīng)用RNA PCR Kit ver.2(TaKaRa)和下列引物進行RT-PCRE-鈣粘蛋白正向引物((SEQ ID NO21)5′-ATG GGC CCT TGG AGCCGC AGC CTC-3′)和下游引物((SEQ ID NO22)5′-GAG CAA TTC TGCTTG GAT TCC AGA-3′)對照GAPDH正向引物((SEQ ID NO27)5′-ATG GGG AAG GTG AAGGTC GGA GTC-3′)和反向引物((SEQ ID NO28)5′-TGG AAT TTG CCATGG GTG GA-3′)應(yīng)用上述引物擴增的PCR產(chǎn)物通過電泳在2％的瓊脂糖凝膠進行分析。
如圖2a所示，在每個包含單個E-鈣粘蛋白-siRNA的MCF-7細(xì)胞系中，E-鈣粘蛋白mRNA的水平比在野生型(WT)MCF-7細(xì)胞中大約低30％-70％。
相比之下，在包含所有E-鈣粘蛋白-siRNAs混合物的MCF-7細(xì)胞中，E-鈣粘蛋白mRNA的水平，比在轉(zhuǎn)染入任何一種siRNAs的MCF-7細(xì)胞中顯著地降低。這說明累加效應(yīng)(圖中“位點1至10”的柱形)的存在。值得注意的是，以5-aza-2’-dC處理幾乎完全終止了E-鈣粘蛋白-siRNAs的活性(圖2b)。
E-鈣粘蛋白的水平應(yīng)用對E-鈣粘蛋白有特異性的抗體通過Western印跡分析進行檢測。
Western印跡分析通過以前報道的方法(Kawasaki，H.et al.Nature，393，284-289(1998)；Kawasaki，H.et al.Nature 405，195-200(2000))進行。單獨地收獲包含每個靶向每個靶向E-鈣粘蛋白啟動子的E-鈣粘蛋白-siRNAs的tRNA-shRNA的MCF-7細(xì)胞?？偟鞍?每20μg)通過SDS-PAGE(10％聚丙烯酰胺凝膠)分離，然后通過電印跡法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(polyvinylenedifluoride)(PVDF)膜(Funakoshi；Tokyo，Japan)上。得到的免疫復(fù)合物以對于E-鈣粘蛋白有特異性的多克隆抗體(Santa Cruz；CA，USA)和肌動蛋白(UBI；CA，USA)應(yīng)用ECL kit(Amersham Co.；Buckinghamshire，UK)進行觀察。E-鈣粘蛋白的相對水平根據(jù)肌動蛋白的水平歸一化。
如圖2c所示，應(yīng)用對E-鈣粘蛋白有特異性的抗體進行Western印跡分析，如上所述，被用于確定E-鈣粘蛋白不僅在mRNA水平而且在蛋白質(zhì)水平降低。這些發(fā)現(xiàn)清楚地顯示，靶向E-鈣粘蛋白啟動子的siRNAs在轉(zhuǎn)錄水平被用作基因沉默子(gene silencer)。另外，發(fā)現(xiàn)在E-鈣粘蛋白基因啟動子中siRNA指導(dǎo)的DNA甲基化與基因表達(dá)水平以累加的方式反向相關(guān)。
實施例3人細(xì)胞中siRNA-指導(dǎo)的DNA甲基化涉及DNMT已知哺乳動物細(xì)胞中DNA甲基化通常是由DNA甲基化酶(DNMT)引起的(Bestor，T.H.Human Mol.Genet.9，2395-2402(2000))。本發(fā)明者試圖應(yīng)用靶向DMNT mRNA的siRNAs抑制DNMT基因的表達(dá)，以考察DNMT是否與人細(xì)胞中siRNA-指導(dǎo)的DNA甲基化有關(guān)。DNMT1是人細(xì)胞中主要的DNA甲基化酶(Rhee，I.et al.Nature 416，552-556(2002)；Robert，M.F.et al.Nature Genet.33，61-65(2003))。因而，本發(fā)明者合成了靶向DNMT1 mRNA的siRNA(Robert，M.F.et al.Nature Genet.33，61-65(2003))(圖3a)。應(yīng)用其有義和反義鏈每條包含四個點突變的突變體DNMT1-siRNA作為對照。
DMNT1-siRNA和突變體DMNT1-siRNA的序列在圖3a中(SEQ ID NOs65to 68)顯示。為了制備這些siRNAs，有義和反義合成的RNA鏈通過常規(guī)的方法分別退火(Elbashir，S.M.et al.Genes Dev.15，188-200(2001))。
將上述的DNMT1-siRNA和突變體DNMT1-siRNA(每種200mM)應(yīng)用OligofectamineTM通過如實施例2所述的同樣的步驟導(dǎo)入MCF-7細(xì)胞中。導(dǎo)入96小時后，應(yīng)用ISOGENTM(Nippon Gene；Toyama，Japan)收集總RNAs。DNMT1 mRNA的水平通過RT-PCR進行測定。
應(yīng)用RNA PCR Kit ver.2(TaKaRa)和下列引物進行RT-PCRDNMT1正向引物((SEQ ID NO25)5′-ATG GCT CGC GCC AAA ACA GTC ATG A-3′)和反向引物((SEQ ID NO26)5′-CTC GGG ACT GGG ATC CAT GAGAAT-3′)。對照實驗應(yīng)用GAPDH正向引物((SEQ ID NO27)5′-ATG GGGAAG GTG AAG GTC GGA GTC-3′)和反向引物((SEQ ID NO28)5′-TGGAAT TTG CCA TGG GTG GA-3′)通過同樣的步驟進行。得到的PCR產(chǎn)物通過電泳在2％的瓊脂糖凝膠中進行分析。
如圖3b所示，在含有DNMT1-siRNA的MCF-7細(xì)胞中，DNMT1 mRNA的水平比在WT-MCF-7細(xì)胞中在顯著地降低。發(fā)現(xiàn)在含有突變體DNMT1-siRNA的MCF-7細(xì)胞中的DNMT1 mRNA水平與其在野生型MCF-7細(xì)胞中可以比較。
導(dǎo)入DNMT1-siRNA的MCF-7細(xì)胞中的DNMT-1蛋白水平也應(yīng)用DNMT1-特異性的抗體通過Western印跡分析進行檢測。得到的數(shù)據(jù)在此處的圖中未給出。確定DNMT1-siRNA的導(dǎo)入不僅在mRNA水平而且在蛋白水平使DNMT-1降低。
然后，將上面的E-鈣粘蛋白-siRNA的混合物(位點1至10)導(dǎo)入含有DNMT1-siRNA的MCF-7細(xì)胞中，以評估降低的DNMT-1基因表達(dá)水平對于siRNA-指導(dǎo)的DNA甲基化的影響。siRNAs應(yīng)用OligofectamineTM導(dǎo)入。96小時后，從細(xì)胞中收集總DNAs，并從DNAs中分離出基因組DNAs。E-鈣粘蛋白啟動子區(qū)域的甲基化程度應(yīng)用分離的基因組DNAs和實施例1中所述的基于PCR的甲基化分析方法進行分析。
如圖3c所示，在包含DNMT1-siRNA的MCF-7細(xì)胞中，由E-鈣粘蛋白-siRNA指導(dǎo)的DNA的甲基化程度，比在WT MCF-7細(xì)胞和含有突變體DNMT1-siRNA的MCF-7細(xì)胞中顯著地降低。因而，闡明了DNMT1對于人細(xì)胞中siRNA指導(dǎo)的DNA甲基化是必需的。
此外，也考察了E-鈣粘蛋白-siRNA是否影響在包含DNMT1-siRNA的MCF-7細(xì)胞中E-鈣粘蛋白的表達(dá)。具體地，將DNMT1-siRNA(或突變體DNMT1-siRNA)導(dǎo)入MCF-7細(xì)胞，然后進一步將E-鈣粘蛋白-siRNA導(dǎo)入同樣的細(xì)胞。應(yīng)用實施例1中的描述的試劑盒導(dǎo)入這些siRNAs。E-鈣粘蛋白-siRNA導(dǎo)入96小時后，從MCF-7細(xì)胞中收集總RNAs，而E-鈣粘蛋白mRNA的水平通過RT-PCR檢測。RT-PCR通過實施例2中描述的步驟進行。
如圖3d所示，靶向E-鈣粘蛋白啟動子的siRNA不改變E-鈣粘蛋白基因在包含靶向DNMT1 mRNA的siRNAs(DNMT1-siRNA)的MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)水平。相比之下，E-鈣粘蛋白-siRNA使在包含突變體DNMT1-siRNA的MCF-7細(xì)胞中E-鈣粘蛋白基因表達(dá)的水平降低。這些發(fā)現(xiàn)顯示DNMT1-siRNA對于DNA甲基化的抑制在轉(zhuǎn)錄水平影響E-鈣粘蛋白-siRNA-介導(dǎo)的基因沉默。
實施例4應(yīng)用發(fā)卡RNA(shRNA)的表達(dá)載體抑制erbB2基因的表達(dá)已知erbB2基因是被過量表達(dá)的且在一些腫瘤細(xì)胞系，如MCF-7細(xì)胞系，未被甲基化。與此同時，erbB2基因在各種正常細(xì)胞系中，由于其啟動子的甲基化而沉默(Hattori，M.et al.Cancer Lett.169，155-164(2001))?？紤]到將來通過應(yīng)用siRNA調(diào)控DNA甲基化進行基因治療，本發(fā)明者構(gòu)建了靶向上面的erbB2啟動子的短發(fā)卡RNA(shRNA)的表達(dá)載體。
本發(fā)明者先前已經(jīng)表明tRNAval產(chǎn)生的shRNA誘導(dǎo)人細(xì)胞中siRNA-指導(dǎo)的基因沉默(Kawasaki，H.，& Taira，K.Nucleic Acids Res.31，700-707(2003))。因此，發(fā)明者應(yīng)用包含pPUR(Clontech，CA，USA)骨架和插入EcoRI與BamHI位點之間合成的tRNAval的人基因啟動子的pPUR-tRNA質(zhì)粒(Kawasaki，H.，&Taira，K.Nucleic Acids Res.31，700-707(2003))，構(gòu)建了靶向erbB2啟動子的tRNA-shRNA的表達(dá)載體。選取erbB2啟動子中的五個CpU島(位點1至5)作為靶向erbB2啟動子的tRNA-shRNA的目標(biāo)序列。目標(biāo)序列(位點1至5)顯示如下。
位點1(SEQ ID NO11)5′-UUA UCC CGG ACU CCG GGG GAG GGGGCA GAG-3′位點2(SEQ ID NO12)5′-UGC AGG CAA CCC AGC UUC CCG GCGCUA GGA-3′位點3(SEQ ID NO13)5′-CCA GCU UCC CGG CGC UAG GAG GGACGC ACC-3′位點4(SEQ ID NO14)5′-CAG GCC UGC GCG AAG AGA GGG AGAAAG UGA-3′位點5(SEQ ID NO15)5′-GGA GGG GGC GAG CUG GGA GCG CGCUUG CUC-3′
合成的編碼dsRNA的寡核苷酸，其靶向上述的erbB2啟動子并包含環(huán)形基序，它作為雙鏈序列通過PCR合成。用SacI和KpnI消化后，得到的片段被克隆到上述的pPUR-tRNA中，tRNA基因啟動子的下游。
然后，用實驗確認(rèn)目標(biāo)shRNAs是否從MCF-7細(xì)胞中shRNA的表達(dá)質(zhì)粒中產(chǎn)生。將shRNA表達(dá)質(zhì)粒通過實施例1中描述的同樣的方法瞬時導(dǎo)入MCF-7細(xì)胞。導(dǎo)入72小時后，提取總RNAs并以Northern印跡分析。結(jié)果顯示，經(jīng)適當(dāng)處理以在表達(dá)tRNA-shRNA的細(xì)胞中產(chǎn)生shRNA(圖4b)。通過應(yīng)用表達(dá)質(zhì)粒確認(rèn)在細(xì)胞中產(chǎn)生shRNA后，這些表達(dá)質(zhì)粒被用于誘導(dǎo)erbB2啟動子的甲基化。
然后測定erbB2啟動子中DNA甲基化的程度是否被應(yīng)用每個如上所述的表達(dá)載體產(chǎn)生的shRNA所改變。此分析通過基于PCR的甲基化分析方法進行，如實施例2中所示。具體地，每個pPUR-tRNA-shRNA表達(dá)質(zhì)粒應(yīng)用EffectinTM試劑(QIAGEN，Hiddeln，Germany)根據(jù)附上的供應(yīng)商的方案導(dǎo)入MCF-7細(xì)胞中。導(dǎo)入96小時后，從細(xì)胞中收集基因組DNA，并測定erbB2啟動子中甲基化的程度。
基因組DNA(500ng)以甲基化-敏感的酶HpaI和HhaI進行消化(圖4a)。消化后，50ng的DNA應(yīng)用下列啟動子通過PCR進行擴增erbB2正向引物((SEQ ID NO31)5′-CCC GGG GGT CCT GGA AGC CA-3′)和反向引物((SEQ ID NO32)5′-CCC GGG GGG GCT CCC TGG TTT-3′)。在對照實驗中，erbB2啟動子完整的基因組DNA以能切割erbB2啟動子的PstI和不能切割該啟動子的HindIII處理。
如實施例1中，所有的樣品通過每一種酶在兩次獨立的實驗中進行消化以消除不完全消化的可能性。兩組消化產(chǎn)物中每組至少重復(fù)兩次PCR擴增。為了防止PCR反應(yīng)中的循環(huán)過多，應(yīng)用循環(huán)曲線數(shù)的方法，采用完整的模板和以限制性酶PstI消化的模板(其得不到PCR產(chǎn)物)，確定每對引物所需的循環(huán)數(shù)。對erbB2(earbB2)啟動子有特異性的引物列在下面位點1正向引物((SEQ ID NO53)5′-CAG GAA AGT TTA AGA TAA AAC C-3′)和反向引物((SEQ ID NO54)5′-CTC GGA GAA TCC CTA AAT GCAG-3′)
位點2正向引物((SEQ ID NO55)5′-CGA GGA AAA GTG TGA GAA CGGC-3′)和反向引物((SEQ ID NO56)5′-CGC GCA GGC CTG GGT GCG TCCC-3′)位點3正向引物((SEQ ID NO57)5′-CGA GGA AAA GTG TGA GAA CGGC-3′)和反向引物((SEQ ID NO58)5′-CAG GCC TGG GTG CGT CCC TC-3′)位點4正向引物((SEQ ID NO59)5′-GAG GGA CGC ACC CAG GCC TG-3′)和反向引物((SEQ ID NO60)5′-CTG GGA GTG GCA ACT CCC AGCT-3′)位點5正向引物((SEQ ID NO61)5′-AGA CTT GTT GGA ATG CAG TT-3′)和反向引物((SEQ ID NO62)5′-CTT CAT TCT TAT ACT TCC TCA A-3′)GAIPDH用作對照基因。以不能切割該基因的HpaI、AciI、AccI、HhaI、PstI和HindIII處理后，DNAs片段應(yīng)用特異性的正向引物((SEQ ID NO63)5′-GTC TTC ACC ACC ATG GAG AAG GCT-3′)和反向引物((SEQ ID NO64)5′-GCC ATC CAC AGT CTT CTG GGT GGC-3′)通過PCR擴增。發(fā)現(xiàn)各個樣品中擴增的部分DAPDH基因的水平是可比較的，并且在實驗誤差的范圍內(nèi)下降。
如圖4c所示，erbB2啟動子中的DNA甲基化在表達(dá)tRNA-shRNA或所有tRNA-shRNAs的混合物(位點1至5)的MCF-7細(xì)胞中無例外地進行檢測。應(yīng)用U6啟動子(未給出數(shù)據(jù))產(chǎn)生的shRNAs得到了相似的結(jié)果。這顯示出基于載體的siRNAs也能誘導(dǎo)人細(xì)胞中序列特異性的DNA甲基化。
然后，本發(fā)明者應(yīng)用RT-PCR確定erbB2 mRNA的水平以測試基于載體的siRNA是否抑制erbB2基因的表達(dá)。RT-PCR通過如實施例2中描述的同樣的步驟進行，除了應(yīng)用erbB2正向引物((SEQ ID NO23)5′-ATG GAGCTG GCG GCC TTG TGC CGC-3′)和反向引物((SEQ ID NO24)5′-TTGTTC TTG TGG AAG ATG TCC TTC C-3′)。
如圖4d所示，表達(dá)單個tRNA-shRNA的細(xì)胞中，erbB2mRNA的水平比其在WT MCF-7細(xì)胞中部分地降低。如上所示(圖2a)，表達(dá)所有tRNA-shRNAs(1至5位點)的細(xì)胞中，erbB2 mRNA的水平比其在WT MCF-7細(xì)胞或表達(dá)任何一種tRNA-shRNAs的細(xì)胞中顯著地降低。這顯示基于載體的shRNA抑制在轉(zhuǎn)錄水平是累加的。因此顯示，哺乳動物細(xì)胞中基于siRNA-指導(dǎo)的啟動子甲基化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可為普遍的機理，如本發(fā)明者應(yīng)用在這里描述的本發(fā)明的兩個實施例所示。
靶向erbB2基因編碼區(qū)域(位點6)的tRNA-shRNA與上面所有的tRNA-shRNAs(1至5位點)共同轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞，然后通過如上所述的同樣的步驟進行RT-PCR。結(jié)果，目標(biāo)基因的表達(dá)被更有效地抑制，如圖4d中所示。
此外，本發(fā)明者考察了各種細(xì)胞系的生長速率以評估表達(dá)靶向erbB2基因啟動子的tRNA-shRNA的細(xì)胞表型。每個細(xì)胞系的生長速率應(yīng)用CellProliferation Kit II(Roche Ltd.，Switzerland)根據(jù)供應(yīng)商的說明書進行測定(Kawasaki，H.，&Taira，K.Nucleic Acids Res.31，700-707(2003))。
如圖4e所示，表達(dá)所有tRNA-shRNAs(1至5位點)的MCF-7細(xì)胞增殖比野生型MCF-7細(xì)胞明顯更慢。這些結(jié)果顯示，表達(dá)所有tRNA-shRNAs(1至5位點)的MCF-7細(xì)胞的生長速率降低與細(xì)胞中erbB2 mRNA的水平降低相關(guān)。這說明靶向erbB2基因啟動子的本發(fā)明者的tRNA-shRNAs可用作細(xì)胞生長-抑制劑，特別是作為抑制腫瘤(neoplasms)，如癌癥的治療試劑。
進行測序以確定構(gòu)建的在此實施例中描述的發(fā)卡(莖-環(huán))RNA分子的表達(dá)載體的序列，然而，由于莖-環(huán)結(jié)構(gòu)是堅硬的，該序列難以進行分析。甚至為了易于序列分析當(dāng)莖-環(huán)RNA分子的結(jié)構(gòu)變?yōu)橐环N時，通過將1至10個錯配序列或突起導(dǎo)入莖序列的有義鏈，考慮到DNA甲基化或RNAi-介導(dǎo)的目標(biāo)基因的抑制(未給出數(shù)據(jù))，其分子仍然顯示出可以相比于完好互補的莖-環(huán)RNA分子的活性。
實施例5長hRNAs和Dicer基因的共表達(dá)長(30個30個以上核苷酸)發(fā)卡(或莖-環(huán))RNA分子(“長hRNAs”)的表達(dá)導(dǎo)致動物細(xì)胞中PKR活化和非特異性的翻譯抑制。因此，為了應(yīng)用hRNAs誘導(dǎo)RNAi起作用，必須制備包含30個或30個以下核苷酸的莖-環(huán)RNA分子，與此同時，由于RNAi依賴于目標(biāo)基因的序列發(fā)揮效用，為了選擇有效的目標(biāo)序列，應(yīng)制備多種類型的shRNAs。
這樣，本發(fā)明者發(fā)明了用于長hRNAs(25至500個核苷酸)和Dicer基因的共表達(dá)系統(tǒng)。具體地，構(gòu)建了載體，其具有含有在PolII啟動子下游連接的Dicer基因的Dicer表達(dá)盒，和包含在PolIII啟動子下游連接的短莖-環(huán)RNA分子編碼DNA的hRNA表達(dá)盒，然后將該載體導(dǎo)入細(xì)胞。首先，發(fā)現(xiàn)Dicer基因和靶向erbB2基因編碼區(qū)的長hRNAs的共表達(dá)產(chǎn)生的表達(dá)-抑制作用比應(yīng)用常規(guī)hRNAs(圖5)得到的效果更強。
此外，應(yīng)用eIF2α磷酸化作為PKR活化的指示劑以分析PKR是否在此系統(tǒng)中被激活。具體地，應(yīng)用特異性識別磷酸化的eIF2α的抗體進行Western印跡，并相對于其內(nèi)部參照β-肌動蛋白，磷酸化的eIF2α的量應(yīng)用NIH圖像程序估計。
在結(jié)果中難以觀察到eIF2α磷酸化(圖6)。因此確認(rèn)在此系統(tǒng)中，PKR活化幾乎不被誘導(dǎo)。
這顯示，在此系統(tǒng)中，Dicer被表達(dá)，而且細(xì)胞中共表達(dá)的長莖-環(huán)RNAs被迅速地處理為siRNAs。此外，通過將錯配序列(G-T配對等)和突起(2至10個核苷酸)在1至100個位置導(dǎo)入莖序列的有義鏈，能更有效地防止PKR活化。
實施例6確認(rèn)siRNA-指導(dǎo)的序列特異性的甲基化在如上所述的實施例中，目標(biāo)基因啟動子區(qū)域的序列特異性的甲基化，其由合成的siRNAs或表達(dá)載體表達(dá)的siRNAs介導(dǎo)，通過甲基化特異性的PCR進行分析。在此實施例中，本發(fā)明者應(yīng)用亞硫酸氫鹽測序法，其能夠在序列水平確認(rèn)siRNA-指導(dǎo)的甲基化。分析中應(yīng)用的亞硫酸氫鹽試劑將未甲基化的胞嘧啶，而不是甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。因此，通過從已導(dǎo)入siRNAs等的細(xì)胞中回收DNAs、將DNAs與亞硫酸氫鹽試劑反應(yīng)、分析它們的序列并確認(rèn)替換的尿嘧啶的存在或不存在，能夠估計胞嘧啶的甲基化。用亞硫酸氫鹽試劑的處理應(yīng)用CpGenome DNA-modification kit(Intergen；USA)進行。
具體地，如在實施例l中所述，將靶向E-鈣粘蛋白啟動子的合成的siRNAs(每個對應(yīng)于位點1至10的siRNAs)應(yīng)用Oligofectamine(Invitrogen；USA)各個導(dǎo)入人乳腺癌(breast cancer)細(xì)胞(MCF-7細(xì)胞)。導(dǎo)入96小時后回收基因組DNAs，并應(yīng)用CpGenome DNA-modification kit(Intergen；USA)以亞硫酸氫鹽試劑處理。與亞硫酸氫鹽試劑溫育后，啟動子DNA通過PCR進行擴增。將擴增的啟動子DNA應(yīng)用TA cloning kit(Invitrogen；USA)插入質(zhì)粒載體。將得到的質(zhì)粒載體測序以監(jiān)測甲基化的頻率。
一些結(jié)果在圖7中顯示(通過將十個隨機選擇的大腸桿菌克隆的質(zhì)粒進行測序來評估甲基化；對應(yīng)于質(zhì)粒中甲基化的核苷酸的方框涂上陰影)。發(fā)現(xiàn)靶向E-鈣粘蛋白啟動子的合成的siRNAs(位點1至10各一個；每個單獨地導(dǎo)入)以序列特異性的方式指導(dǎo)CpG序列的甲基化。也發(fā)現(xiàn)，除了CpG序列之外，一些CpNG序列(其中N代表A、T、C或G中的任意一個)被甲基化。siRNAs-指導(dǎo)的甲基化不僅在應(yīng)用癌細(xì)胞(如MCF-7細(xì)胞)的實驗中，而且在應(yīng)用正常乳腺細(xì)胞的實驗中(圖8)被檢測到。此外，也發(fā)現(xiàn)這些siRNAs不僅指導(dǎo)siRNA序列所連接的部分的甲基化，而且影響(產(chǎn)生甲基化于)鄰近的區(qū)域(圖9)。
應(yīng)用亞硫酸氫鹽測序分析的上述實驗顯示，靶向E-鈣粘蛋白啟動子的合成的siRNAs誘導(dǎo)序列特異性的甲基化。
此外，亞硫酸氫鹽測序分析也用于測試erbB2啟動子中的DNA甲基化是否以位點-特異性的方式被基于tRNA啟動子的siRNA表達(dá)質(zhì)粒所誘導(dǎo)。表達(dá)質(zhì)粒的導(dǎo)入和基因組DNAs的回收通過如上述實施例同樣的步驟完成。
亞硫酸氫鹽測序分析顯示，和合成的siRNAs一樣，由tRNA啟動子表達(dá)的siRNAs以序列特異性的方式(圖10A)誘導(dǎo)甲基化。同樣地，也發(fā)現(xiàn)由U6啟動子表達(dá)的siRNAs誘導(dǎo)序列特異性的甲基化(圖10B)。
實施例7siRNA-指導(dǎo)的甲基化的機理分析已知siRNAs誘導(dǎo)植物和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)中組蛋白H3上Lys9的甲基化(Zilberman D，Cao X，Jacobsen SE.ARGONAUTE4control oflocus-specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation.Science.2003 Jan 31；299(5607)716-9；Volpe TA，Kidner C，Hall IM，Teng G，Grewal SI，Martienssen RA.Regulation of heterochromatic silencing and histone H3lysine-9methylation by RNAi.Science.2002 Sep 13；297(5588)1833-7)。
因此，上面靶向E-鈣粘蛋白或erbB2啟動子的siRNAs是否也誘導(dǎo)動物細(xì)胞中組蛋白H3上Lys9的甲基化也進行了實驗。
將siRNAs的混合物，每個靶向E-鈣粘蛋白啟動子的位點1至10，導(dǎo)入MCF-7細(xì)胞。96小時后收獲細(xì)胞，以1％甲醛處理，然后在裂解緩沖液中裂解。將抗組蛋白H3中甲基化的Lys9的抗體加入裂解物并輕輕地混合8小時。將Protein Sepharose A加入混合物用于降落反應(yīng)(pull-down reaction)。以200μl含有1％SDS和0.1M NaHCO3的溶液洗脫后，洗脫的物質(zhì)應(yīng)用甲醛進行交聯(lián)。然后，應(yīng)用對E-鈣粘蛋白啟動子有特異性的引物進行PCR。擴增的產(chǎn)物進行電泳且得到的條帶應(yīng)用溴化乙錠(ethidium bromide)染色用于檢測。
應(yīng)用抗組蛋白H3中甲基化的Lys9的抗體，上述的染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實驗顯示，組蛋白H3上Lys9的甲基化被siRNAs以序列特異性的方式誘導(dǎo)(圖11)。當(dāng)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)的表達(dá)被siRNA(有義tatggaatattatcttgtaaa(SEQ ID NO69)；反義tttacaagataatattccata(SEQ ID NO70))抑制時，組蛋白H3上Lys9和CpG序列的甲基化程度被明顯地降低(圖11)。當(dāng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1)的表達(dá)被siRNA抑制，CpG序列甲基化的程度明顯地降低，而組蛋白H3上Lys9則被正常地甲基化(圖11)。這些發(fā)現(xiàn)顯示，siRNAs通過組蛋白H3上的Lys9誘導(dǎo)E-鈣粘蛋白啟動子區(qū)域中CpG序列的甲基化。
實施例8動物細(xì)胞中長dsRNAs的RNA干擾此處描述的實驗顯示，合成的siRNAs和由tRNA啟動子或U6啟動子表達(dá)的siRNAs，通過以序列特異性的方式誘導(dǎo)CpG和CpNG序列的甲基化，在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。然而，實驗中應(yīng)用的siRNAs包含21至30個核苷酸，因而能預(yù)測誘導(dǎo)導(dǎo)致目標(biāo)基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平只有部分抑制的部分甲基化。通常，基因啟動子區(qū)域的CpG島長度范圍為大約1kbp至幾kbp。覆蓋整個區(qū)域的各種siRNAs必須實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上對于目標(biāo)基因表達(dá)的有效抑制。然而，構(gòu)建許多類型的合成的siRNAs或siRNA表達(dá)載體是無效果的。
長dsRNAs通常通過激活干擾素介導(dǎo)的信號途徑增強基因表達(dá)的非特異性抑制。然而，有報道稱定位于細(xì)胞核的長dsRNAs并不激活干擾素介導(dǎo)的信號途徑。
因此，為了在細(xì)胞核中定位長dsRNAs，本發(fā)明者設(shè)想將編碼長dsRNAs的基因插入其表達(dá)受PolII啟動子控制的β球蛋白內(nèi)含子(圖12)。長dsRNAs從由載體在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)處理以切割內(nèi)含子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物中釋放。該dsRNAs通過內(nèi)源性的Dicer-樣核糖核酸酶III被處理成為包含21至25個核苷酸的短RNAs。
事實上，本發(fā)明者構(gòu)建了質(zhì)粒pSV-BGI，其中將編碼包含500個核苷酸靶向erbB2啟動子的dsRNA的基因插入其表達(dá)受PolII啟動子控制的β球蛋白內(nèi)含子。此外，他們也構(gòu)建了載體，其中將編碼dsRNA的基因插入tRNA啟動子或U6啟動子的表達(dá)載體的下游。將每個載體導(dǎo)入MCF-7細(xì)胞中，導(dǎo)入96個小時后，應(yīng)用實施例4中描述的方法，回收基因組DNAs并分析在erbB2啟動子區(qū)域的甲基化。
結(jié)果顯示，pSV-BGI比tRNA啟動子和U6啟動子更有效并更廣泛地誘導(dǎo)甲基化(圖13)。
應(yīng)用特異性識別erbB2蛋白的抗體進行Western印跡。然后，相對于其內(nèi)部參照β-肌動蛋白，磷酸化的eIF2α的量應(yīng)用NIH圖像程序估計。作為上述的甲基化的結(jié)果，顯示出erbB2基因表達(dá)被明顯地抑制(圖14)。
也評價了由于每個載體導(dǎo)入產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。dsRNAs的細(xì)胞毒性能通過依賴于dsRNA的蛋白激酶(PKR)根據(jù)eIF2α磷酸化的程度進行評價。因此，應(yīng)用特異性識別磷酸化的eIF2α的抗體進行Western印跡，而相對于其內(nèi)部參照β-肌動蛋白，磷酸化的eIF2α的量應(yīng)用NIH圖像程序估計。
發(fā)現(xiàn)載體pSV-BGI無細(xì)胞毒性，而tRNA啟動子的表達(dá)載體和基于U6啟動子的表達(dá)載體都顯示出細(xì)胞毒性(圖15)。因此，該載體(pSV-BGI)，其中將編碼長dsRNA的基因插入其表達(dá)受PolII啟動子驅(qū)動的β球蛋白內(nèi)含子中，清楚有效地誘導(dǎo)廣泛的甲基化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄基因沉默。
工業(yè)實用性本發(fā)明者首次發(fā)現(xiàn)，合成的siRNAs和基于載體的siRNAs能夠以序列特異性的方式在人細(xì)胞中誘導(dǎo)依賴于DNMT1的RdDM(RMDM)。因此，這些siRNAs能夠序列特異性地在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因沉默。
根據(jù)本發(fā)明，哺乳動物細(xì)胞中具體基因的表達(dá)水平能夠被siRNA不僅通過關(guān)聯(lián)(cognate)mRNAs的裂解，而且通過轉(zhuǎn)錄的抑制來進行調(diào)控。本發(fā)明的tRNA-shRNAs可以作為有用的治療試劑。
序列表<110>獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)總合研究所(NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY)<120>哺乳動物細(xì)胞中dsRNA誘導(dǎo)CpG序列甲基化<130>TIR-A0301P<140>PCT/JP2004/002448<141>2004-02-27<150>US 60/449,860<151>2003-02-27<160>70<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>RNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的靶序列<400>1aggccgcucg agcgagagug cagug25<210>2<211>25<212>RNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的靶序列<400>2gccggugugg uggcacacgc cugua25<210>3<211>25
<212>RNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的靶序列<400>3ccggcaggcg gagguugcag ugagc25<210>4<211>25<212>RNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的靶序列<400>4acugccccug uccgccccga cuugu25<210>5<211>25<212>RNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的靶序列<400>5cggcggggcu gggauucgaa cccag25<210>6<211>25<212>RNA<213>人工的<220>
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<210>7<211>25<212>RNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的靶序列<400>7cgggugggcg ggccgucagc uccgc25<210>8<211>25<212>RNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的靶序列<400>8cgcccugggg agggguccgc gcugc 25<210>9<211>25<212>RNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的靶序列<400>9gcgguacggg gggcggugcu ccggg25<210>10<211>25<212>RNA<213>人工的<220>
<223>用于siRNA的人工合成的靶序列<400>10
cggugcuccg gggcucaccu ggcug25<210>11<211>30<212>RNA<213>人工的<220>
<223>用于tRNA-shRNA的人工合成的靶序列<400>11uuaucccgga cuccggggga gggggcagag 30<210>12<211>30<212>RNA<213>人工的<220>
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<223>用于tRNA-shRNA的人工合成的靶序列<400>13ccagcuuccc ggcgcuagga gggacgcacc 30<210>14<211>30<212>RNA<213>人工的<220>
<223>用于tRNA-shRNA的人工合成的靶序列<400>14caggccugcg cgaagagagg gagaaaguga 30<210>15<211>30<212>RNA<213>人工的<220>
<223>用于tRNA-shRNA的人工合成的靶序列<400>15ggagggggcg agcugggagc gcgcuugcuc 30<210>16<211>30<212>RNA<213>人工的<220>
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<210>22<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
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atggctcgcg ccaaaacagt catga25<210>26<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
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<220>
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<223>人工合成的引物序列<400>57cgaggaaaag tgtgagaacg gc 22<210>58<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>人工合成的引物序列<400>59gagggacgca cccaggcctg 20
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<221>misc_feature<222>(21)..(22)<223>n代表dT<400>66
ggagaacggu gcucaugcuu nn 22<210>67<211>22<212>RNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的siRNA序列<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(22)<223>n代表dT<400>67aagcuugugc agcguugucc nn 22<210>68<211>22<212>RNA<213>人工的<220>
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<223>人工合成的siRNA序列<400>70tttacaagat aatattccat a2權(quán)利要求
1.DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，包括靶向哺乳動物細(xì)胞的DNA中包含CpG或CpNG(其中N為A、T、C或G中的任意一個)位點的dsRNA。
2.包含表達(dá)載體的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，所述的表達(dá)載體包含編碼靶向哺乳動物細(xì)胞的DNA中包含CpG或CpNG(其中N為A、T、C或G中的任意一個)位點的dsRNA的DNA。
3.權(quán)利要求1或2的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的dsRNA含有30個或30個以下的核苷酸。
4.權(quán)利要求1或2的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的dsRNA含有30個至5,000個核苷酸。
5.權(quán)利要求1至4之一的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的dsRNA含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
6.權(quán)利要求2的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的載體進一步編碼Dicer。
7.權(quán)利要求2的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中外顯子-內(nèi)含子-外顯子盒可操作地連接在啟動子的下游且編碼dsRNA的DNA插入內(nèi)含子中。
8.權(quán)利要求7的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的外顯子-內(nèi)含子-外顯子盒源于免疫球蛋白基因。
9.權(quán)利要求2至7之一的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中編碼dsRNA的DNA可操作地連接到表達(dá)載體中的PolI或PolII啟動子。
10.權(quán)利要求9的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的PolIII啟動子是tRNA啟動子、U6啟動子或H1啟動子中的任意一個。
11.權(quán)利要求10的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的PolII啟動子是SV40啟動子、CMV啟動子或SRα啟動子中的任意一個。
12.權(quán)利要求2至11之一的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的表達(dá)載體是一種病毒表達(dá)載體。
13.權(quán)利要求2至12之一的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中所述的病毒表達(dá)載體是任意一個逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和慢病毒。
14.權(quán)利要求2至13之一的DNA甲基化誘導(dǎo)試劑，其中編碼dsRNA的DNA可操作地連接到表達(dá)載體中包含四環(huán)素操作子(TetO)序列的啟動子。
15.DNA甲基化方法，包括將權(quán)利要求1-14之一的甲基化誘導(dǎo)試劑導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的步驟。
16.權(quán)利要求15的DNA甲基化方法，其中所述的哺乳動物是人。
17.基因表達(dá)-抑制劑，包括靶向哺乳動物細(xì)胞的基因啟動子中包含CpG或CpNG(其中N為A、T、C或G中的任意一個)位點的dsRNA。
18.包含表達(dá)載體的基因表達(dá)-抑制劑，所述的表達(dá)載體編碼靶向哺乳動物細(xì)胞的基因啟動子中包含CpG或CpNG(其中N為A、T、C或G中的任意一個)位點的dsRNA。
19.權(quán)利要求17或18的基因表達(dá)-抑制劑，其中dsRNA的類型不相同并且每個dsRNAs靶向包含CpG或CpNG(其中N為A、T、C或G中的任意一個)的不同的位點。
20.權(quán)利要求17至19之一的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的dsRNA含有30個或30個以下的核苷酸。
21.權(quán)利要求17至19之一的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的dsRNA含有30個至5,000個核苷酸。
22.權(quán)利要求17至21之一的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的dsRNA含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
23.權(quán)利要求18的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的載體進一步編碼Dicer。
24.權(quán)利要求18的基因表達(dá)-抑制劑，其中外顯子-內(nèi)含子-外顯子盒可操作地連接到啟動子的下游且編碼dsRNA的DNA插入該內(nèi)含子中。
25.權(quán)利要求18的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的外顯子-內(nèi)含子-外顯子盒是源于免疫球蛋白基因。
26.權(quán)利要求18至25之一的基因表達(dá)-抑制劑，其中編碼dsRNA的DNA可操作地連接到表達(dá)載體中的PolI或PolII啟動子。
27.權(quán)利要求26的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的PolIII啟動子是tRNA啟動子、U6啟動子或Hl啟動子中的任意一個。
28.權(quán)利要求26的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的PolII啟動子是SV40啟動子、CMV啟動子或SRα啟動子中的任意一個。
29.權(quán)利要求18至28之一的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的表達(dá)載體是一種病毒表達(dá)載體。
30.權(quán)利要求29的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的病毒表達(dá)載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和慢病毒中的任意一個。
31.權(quán)利要求18至30之一的基因表達(dá)-抑制劑，其中編碼dsRNA的DNA可操作地連接到表達(dá)載體中包含四環(huán)素操作子(TetO)序列的啟動子。
32.權(quán)利要求17至31的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述的基因是與疾病相關(guān)的基因，其表達(dá)涉及疾病。
33.權(quán)利要求32的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述疾病為腫瘤。
34.權(quán)利要求33的基因表達(dá)-抑制劑，其中所述基因為erbB2。
35.細(xì)胞增殖-抑制劑，包括權(quán)利要求34的基因表達(dá)-抑制劑作為活性成分。
36.基因表達(dá)-抑制方法，包括將權(quán)利要求18至34之一的基因表達(dá)-抑制劑導(dǎo)入細(xì)胞的步驟。
37.權(quán)利要求36的基因表達(dá)-抑制方法，進一步包括將靶向基因編碼區(qū)的dsRNAs導(dǎo)入細(xì)胞的步驟。
38.權(quán)利要求36或37的基因表達(dá)-抑制方法，其中所述的哺乳動物細(xì)胞源自人。
全文摘要
本發(fā)明闡明基因啟動子上靶向含有CpG島的結(jié)構(gòu)域的合成的短干擾RNA(siRNA)，特異性地誘導(dǎo)人細(xì)胞的目標(biāo)區(qū)域或其鄰域中CpG的甲基化。啟動子的甲基化在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控由其下游編碼的基因的表達(dá)。因此，本發(fā)明旨在提供應(yīng)用siRNA誘導(dǎo)DNA甲基化的方法和通過用siRNA將啟動子甲基化來調(diào)控基因表達(dá)的方法。本發(fā)明還旨在提供含有上述siRNA或表達(dá)該siRNA或dsRNA的載體的DNA甲基化誘導(dǎo)劑或基因表達(dá)調(diào)控劑。
文檔編號C12N5/10GK1780913SQ200480011320
公開日2006年5月31日 申請日期2004年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月27日
發(fā)明者多比良和誠, 川崎廣明 申請人:獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)總合研究所