本發(fā)明屬于多肽藥物研發(fā)領(lǐng)域，特別涉及一種中藥東亞鉗蝎蝎毒中獲取蝎毒耐熱肽及在治療癲癇、阿爾茨海默病和帕金森病方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)的臨床癥狀的出現(xiàn)是由于中腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺(DA)神經(jīng)元損傷導(dǎo)致紋狀體DA神經(jīng)遞質(zhì)水平的嚴重降低所致。PD氧化應(yīng)激學說的提出，是由于DA氧化應(yīng)激-自由基學說是中腦黑質(zhì)致密部(NCs)DA神經(jīng)原損傷的重要機制,抗氧化治療是目前公認的有效的治療方案。

中藥東亞鉗蝎(ButhusmartensiiKarsch,BmK)，BmK亦稱之為馬氏鉗蝎,現(xiàn)代醫(yī)學研究證明由蝎尾毒囊腺排放的蝎毒(Scorpion Venom,SV)富含毒素。按其毒素作用機理可分為神經(jīng)毒素和細胞毒素。其神經(jīng)毒素被劃分為長鏈蝎毒素(含60-70個氨基酸殘基)和短鏈蝎毒素(含30-40個氨基酸殘基)。長鏈蝎毒素作用的靶位主要是在神經(jīng)可興奮膜上的電壓依賴性鈉離子通道(Voltage-dependent Na⁺channels)，短鏈蝎毒素能作用于Ca²⁺通道、K⁺通道或Cl^-通道。蝎毒素己被廣泛用于膜離子通道的工具藥和抗毒素的研制。全蝎是我國傳統(tǒng)中藥,迄今,我國已從BmK蝎毒中分離純化出具有抗腫瘤、抗痛、抗癲癇、抗栓、抗炎、抗風濕、抗菌等功能的蝎毒素。蝎毒的毒性僅次于蛇毒。國家發(fā)明專利CN1324621證實了天然藥物全蝎的藥用部位蝎尾節(jié)毒囊腺排放的毒液-蝎毒對難治性癲癇(Refractory Epilepsy,RE)的有效性及經(jīng)工藝處理后的安全性。國家發(fā)明專利申請(申請?zhí)?201310330290.1)公開了從BmK的SV中,去除不耐熱和耐熱的有毒成分,獲取一種更安全的蝎毒耐熱肽提取液。該多肽用于防治難治性癲癇(Refractory Epilepsy,RE)、帕金森病(Parkinsons Disease,PD)、阿爾茲海默病(Alzheimer’s Disease,AD)具有共同的作用靶點和各自的特殊藥效?？墒切灸蜔犭奶崛∫韩@肽率低，因此獲取化學合成的蝎毒耐熱肽是決定這一原創(chuàng)性研發(fā)成果能否進行轉(zhuǎn)化研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具有治療化學合成的蝎毒耐熱多肽及其用途。本申請內(nèi)容主要包括測定蝎毒耐熱肽的氨基酸序列、按此序列進行固相化學合成和對蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)的藥效活性、安全性檢測。

本發(fā)明的蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)的氨基酸序列如下:

(N端)Lys-Val-Leu-Asn-Gly-Pro-Glu-Glu-Glu-Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Glu(C端)

蝎毒耐熱合成肽為人工合成的活性多肽，包含15個氨基酸殘基，分子量為1524Da。

本發(fā)明的蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)先從傳統(tǒng)中藥BmK蝎毒中獲取蝎毒耐熱肽的氨基酸序列:主要包括經(jīng)動物實驗證實樣品(xiedu 20160112-peptide summary)對難治性癲癇、帕金森病、老年性癡呆有明顯防治作用；樣品再經(jīng)LaGM復(fù)合材料和反復(fù)快速磁分離后,進行納升反相色譜-電噴霧質(zhì)譜(nanoLC-ESI-MS)連用的質(zhì)譜平行實驗，檢出蝎毒耐熱肽的氨基酸序列；最后經(jīng)固相化學合成、色譜純化和質(zhì)譜鑒定獲取一種蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP),其氨基酸序列如SEQ ID No 1所示，這一序列保持了蝎毒耐熱肽的藥效活和安全性以及以及多種生物活性。

本發(fā)明的蝎毒耐熱肽提取方法如下：

1.蝎毒耐熱肽的氨基酸序列測定

(1)將BmK蝎毒的冷凍干粉復(fù)溶、離心，取上清液，100℃隔水加熱，取出，離心取上清液，即為蝎毒耐熱組分提取液，先后用截留分子量為50kDa和30kDa濾膜的離心超濾管，對蝎毒耐熱組分提取液進行離心超濾，取上槽液，得到蝎毒耐熱肽提取液。用Superdex Peptide10/300GL分子篩柱子(Optimum Separation range(peptides)M，100-7000Da)對樣品進行粗分(見圖1)，用HPLC對樣品進行細分(見圖2)，色譜條件為，色譜柱：Zorbax SB-C18 4.6*250 5μm(AgilentUSA)，流動相：A液：乙腈/水：2:98(含三氟乙酸0.1％)；B液：乙腈/水：98:2(含三氟乙酸0.08％)；0–40％B大約3-6個柱體積，40–100％B 0.5-1個柱體積，100％B 1-3個柱體積(CV)；流速：0.8ml/min；紫外檢測器，檢測波長為：280nm/258nm/214nm。

(2)凍干的多肽樣品重新溶解于Nano-RPLC Buffer A中，在線Nano-RPLC液相色譜在EksigentnanoLC-Ultra^TM 2D系統(tǒng)(AB SCIEX)進行，溶解后的樣品以2μL/min的流速上樣到C18預(yù)柱上(100μm×3cm，C18,3μm,)，保持流速沖洗脫鹽10min。質(zhì)譜采用TripleTOF5600系統(tǒng)(AB SCIEX)結(jié)合納升噴霧III離子源(AB SCIEX,USA)，質(zhì)譜采集到的原始wiff圖譜文件，采用Protein Pilot Software v.4.5(AB SCIEX,USA)軟件進行數(shù)據(jù)加工處理，得到蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)見序列表SEQ ID No.1。

2.用固相化學合成方法制備蝎毒耐熱合成肽

(1)多肽合成技術(shù)是按照蝎毒耐熱肽的氨基酸順序，通過定向形成酰胺鍵方法得到目標分子。固相合成是將原料藥一個氨基酸的羧基以共價鍵的形式與固相載體(Fmoc樹脂)相連,再以這一氨基酸的氨基為合成起點，使其與相鄰氨基酸(氨基保護)的羧基發(fā)生酰化反應(yīng)，形成肽鍵。然后讓包含有這兩個氨基酸的樹脂肽的氨基脫保護后與下一個氨基酸的羧基反應(yīng)，不斷重復(fù)這一過程,直至目標肽形成為止。

(2)高效液相色譜(HPLC)純化在多肽合成過程中會產(chǎn)生一些與目標肽結(jié)構(gòu)類似的雜肽(見圖6)，例如因氨基酸消旋化產(chǎn)生的非對映異構(gòu)體、因部分氨基酸未連接上產(chǎn)生的缺失 肽、因肽鍵斷裂產(chǎn)生的斷裂肽等，色譜條件如下：色譜柱：Inertsil ODS-SP 4.6mm*250mm，0.1％三氟乙酸乙腈-0.1％三氟乙酸水，紫外檢測器，檢測波長為214nm；

(3)用質(zhì)譜技術(shù)對合成多肽進行結(jié)構(gòu)確認，檢索分析，檢出蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)的氨基酸序列見序列表SEQ ID No.1。

本發(fā)明的蝎毒耐熱合成肽采用Morris水迷宮實驗法檢測蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)對AD小鼠學習記憶的影響，結(jié)果表明蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)對AD小鼠空間學習記憶能力具有促進作用；采用線蟲趨化行為學實驗方法檢測Aβ神經(jīng)毒性，結(jié)果表明蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)能夠保護神經(jīng)元，對抗Aβ引起的毒性作用，改善由于神經(jīng)元Aβ表達引起的趨化行為異常；觀察了蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)對難治性癲癇匹羅卡品模型大鼠的防治作用，實驗結(jié)果表明蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)對鋰-匹羅卡品癲癇大鼠慢性模型癇性發(fā)作有顯著的控制效果,可顯著減少發(fā)作次數(shù)；觀察了蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)對原代培養(yǎng)神經(jīng)元鈉電流的抑制作用，實驗結(jié)果表明蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)能明顯抑制原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元體鈉通道電流；對NMDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷具有保護作用。觀察了蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)對II型星形膠質(zhì)細胞的影響，結(jié)果表明蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)能夠促進II型星形膠質(zhì)細胞重編程(逆分化)為腦內(nèi)內(nèi)源性神經(jīng)干細胞。通過測細胞內(nèi)ROS的方法來檢測SVHRP對6-OHDA導(dǎo)致的SH-SY5Y細胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧的清除的能力，結(jié)果顯示，SVHRSP，能夠明顯清除細胞內(nèi)ROS，具有抑制PD氧化應(yīng)激的作用。蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)的藥用安全性與藥效活性比大于2000/0.05＝40,000倍，昆明種小鼠腹腔注射途徑給藥劑量高至2000mg/kgBW仍末見任何毒性反應(yīng)，顯示出作為新型抗癲癇、阿爾茨海默病和帕金森病藥物的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1蝎毒耐熱肽提取液樣品的凝膠過濾層析色譜圖；

圖2蝎毒耐熱肽提取液樣品RP-HPLC色譜圖；

圖3 Morris水迷宮實驗檢測蝎毒耐熱肽提取液對老年性癡呆(AD)小鼠空間學習記憶能力的影響；

圖4 SVHRSP清除6-OHDA PD細胞模型ROS產(chǎn)生；

圖5蝎毒耐熱肽抑制海馬腦片癲癇樣放電；

圖6蝎毒耐熱合成肽的反相-高效液相色譜(RP-HPLC)結(jié)果；

圖7蝎毒耐熱合成肽的MS鑒定結(jié)果；

圖8蝎毒耐熱合成肽對鋰-匹羅卡品癲癇大鼠反復(fù)發(fā)作的抑制作用；

圖9蝎毒耐熱合成肽對AD的轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲CL2355趨化性行為的影響；

圖10蝎毒耐熱合成肽對原代培養(yǎng)神經(jīng)元鈉電流的抑制作用；

圖11蝎毒耐熱合成肽對NMDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷具有保護作用；

圖12蝎毒耐熱合成肽促進II型星形膠質(zhì)細胞重編程(逆分化)腦內(nèi)內(nèi)源性干細胞；

圖13蝎毒耐熱合成肽促進OPC細胞去分化為內(nèi)源性干細胞；

圖14蝎毒耐熱合成肽上調(diào)Nestin蛋白表達。

具體實施方式

以下實施例子進一步解釋本發(fā)明的內(nèi)容，但并不用以限制本發(fā)明。

實施例1

蝎毒耐熱肽的氨基酸序列測定

(1)用三蒸水將由河南宜昌的BmK蝎毒的冷凍干粉復(fù)溶、離心,取上清液即BmK蝎毒提取液；用帶蓋耐熱的塑料管分裝后,置于恒溫水浴槽中，100℃隔水加熱4h后取出,自然降溫至室溫后離心、高速離心取上清液，即為蝎毒耐熱組分提取液；先后用具有截留分子量為50kDa和30kDa濾膜的離心超濾管，對蝎毒耐熱組分提取液進行離心超濾，取上槽液，得到蝎毒耐熱多肽提取液。離心取上清液，即為蝎毒耐熱組分提取液，先后用截留分子量為50kDa和30kDa濾膜的離心超濾管，對蝎毒耐熱組分提取液進行離心超濾，取上槽液，得到蝎毒耐熱肽提取液。

蝎毒耐熱肽提取液用Superdex Peptide 10/300GL分子篩柱子(Optimum Separation range(peptides)M,100-7000Da)進行粗分(見圖1)，用HPLC對樣品進行細分(見圖2)，色譜條件為，色譜柱：Zorbax SB-C18 4.6*250 5um(Agilent.USA)，，流動相：A液：乙腈/水：2:98(含三氟乙酸0.1％)；B液：乙腈/水：98:2(含三氟乙酸0.08％)；0–40％B大約3-6個柱體積，40–100％B 0.5-1個柱體積，100％B 1-3個柱體積(CV)；流速：0.8ml/min；檢測波長為：280nm/258nm/214nm進行細分。得到蝎毒耐熱多肽提取純化物。

(2)取1.5ml蝎毒耐熱多肽提取純化物，10000rpm離心10min后取上清液；按照上清液:30mg/mL-LaGM復(fù)合材料＝50：1的比例,將30mg/mL-LaGM復(fù)合材料加入上清液，充分渦旋2min后1000r室溫振蕩10min；10000r離心5min磁分離，去掉上清，在沉淀中加入500ul水，充分渦旋1min，室溫振蕩5min，10000r離心5min磁分離，去掉上清，重復(fù)2次。在沉淀中加入20ul 80％+1％TFA的洗脫液，渦旋1min，室溫振蕩5min，10000r離心5min，磁分離，收集上清，重復(fù)1次；冷凍干燥。將磁性材料分離后凍干的多肽樣品重新溶解于Nano-RPLC Buffer A中，在線Nano‐RPLC液相色譜在EksigentnanoLC‐Ultra^TM 2D系統(tǒng)(AB SCIEX)進行，溶解后的樣品以2μL/min的流速上樣到C18預(yù)柱上(100μm×3cm，C18,3μm, )，然后保持流速沖洗脫鹽10min。分析柱是C18反相色譜柱(75μm x 15cm C18-3 μmChromXPEksigent)，實驗所用梯度為70min內(nèi)流動相B由5％升高至80％。質(zhì)譜采用Triple TOF 5600系統(tǒng)(AB SCIEX)結(jié)合納升噴霧III離子源(AB SCIEX,USA)，噴霧電壓為2.4kV，氣簾氣壓為30Psi，霧化氣壓為5Psi，加熱溫度為150℃，一級TOF‐MS單張圖譜掃描時間為250ms，每次IDA循環(huán)下最多采集35個電荷為2+到8+且單秒計數(shù)大于100的二級圖譜，每張二級圖譜的累積時間為80ms。每次循環(huán)時間固定為2.5秒，碰撞室能量設(shè)定適用于所有前體離子碰撞誘導(dǎo)解離(CID)，動態(tài)排除設(shè)置為11秒。

(3)數(shù)據(jù)分析條件

質(zhì)譜采集到的原始wiff圖譜文件，采用Protein Pilot Software v.4.5(AB SCIEX,USA)軟件進行數(shù)據(jù)加工處理和檢索分析，數(shù)據(jù)庫為uniprot庫中的蝎子，檢索方式為徹底分析，假陽性率控制為1％FDR。得到蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)，其氨基酸序列見序列表SEQ ID No.1；

檢索結(jié)果如表1.表1.nanoLC-ESI-MS連用的質(zhì)譜平行實驗,檢出蝎毒耐熱肽的氨基酸序列

樣品Lot No:xiedu 20160112-peptide summary.Txt Microsoft Excel

蝎毒耐熱肽提取液(SVHRSP)經(jīng)LaGM復(fù)合材料和反復(fù)快速磁分離后，冷凍干燥。凍干的多肽樣品重新溶解于Nano-RPLC Buffer A中，在線Nano-RPLC液相色譜在EksigentnanoLC-Ultra^TM 2D系統(tǒng)(AB SCIEX)進行，保持流速沖洗脫鹽10min。質(zhì)譜采用TripleTOF 5600系統(tǒng)(AB SCIEX)結(jié)合納升噴霧III離子源(AB SCIEX,USA)，質(zhì)譜采集到的原始wiff圖譜文件，采用Protein Pilot Software v.4.5(AB SCIEX,USA)軟件進行數(shù)據(jù)加工處理和檢索分析，檢出蝎毒耐熱多肽的氨基酸序列。

實施例2

合成蝎毒耐熱多肽高效液相色譜(HPLC)純化

在多肽合成過程中會產(chǎn)生一些與目標肽結(jié)構(gòu)類似的雜肽，例如因氨基酸消旋化產(chǎn)生的非對映異構(gòu)體、因部分氨基酸未連接上產(chǎn)生的缺失肽、因肽鍵斷裂產(chǎn)生的斷裂肽等。因此用RP-HPLC進行純化:

樣品純化條件:

結(jié)構(gòu):KE-15

序號:0200046

批號:P160418-CQ455216

柱子:4.6mm*250mm,Inertsil ODS-SP

溶液A:含0.1％三氟乙酸乙腈

溶液B:含0.1％三氟乙酸水

流速:1.0ml/min

波長:214nm

進樣體積:10μl

實施例3

用Morris水迷宮實驗檢測SVHRP對AD小鼠學習記憶的影響

水迷宮檢測行為學改變,定位航行實驗歷時5d，每天訓練4次，記錄小鼠找到平臺(平臺放置在第1象限)的時間，即逃避潛伏期，并讓小鼠在平臺上停留20s；如果小鼠60s內(nèi)未找到平臺，逃避潛伏期記為60s?？臻g搜索實驗在定位航行試驗第5d的4次訓練之后，撤除平臺，然后在第3象限入水點將小鼠放入池中，開始測試。計算小鼠在目標象限(第1象限)內(nèi)游泳距離和游泳時間百分比，總時長60s。檢測小鼠穿越隱匿平臺次數(shù)。

Morris水迷宮實驗研究發(fā)現(xiàn)SVHRP對AD小鼠空間學習記憶能力具有促進作用，水迷宮的隱藏平臺獲得實驗測試日(第5天)AD模型給藥組小鼠的逃避潛伏期(第5d，12±2次)明顯短于AD模型組(第5天，22±2次)的逃避潛伏期**p<0.01,其游泳距離由模型組的第5d的500cm降低為g給藥組300cm，通過平臺次由模型組的5次上升為給藥組8次。

實施例4

線蟲趨化行為學實驗方法

同期化的轉(zhuǎn)基因線蟲CL2355及其對照株CL2122分別給予不同濃度SVHRP(2，20，40μg/ml)及等量的三蒸水，從蟲卵時開始給藥，每天將線蟲轉(zhuǎn)移到新的含有藥物的NGM培養(yǎng)皿中。所有的線蟲在16℃培養(yǎng)36小時后，升高培養(yǎng)箱溫度到23℃，再進行36小時的培養(yǎng)。將以上線蟲收集起來，用M9緩沖液清洗3次。進行趨化實驗所用培養(yǎng)皿用100mm大皿。固體培養(yǎng)基含1.9％瓊脂，1mM CaCl₂，1mM MgSO4，and 25mM磷酸鹽緩沖液，pH 6.0微波混勻后，倒入皿中，冷卻即可。在培養(yǎng)皿底部經(jīng)過中心位置用馬克筆畫兩條互相垂直的直線，將整個皿均分為四個象限。每組約60條線蟲放到趨化培養(yǎng)皿的中心位置，將1μl苯甲醛(濃 度為0.1％，無水乙醇稀釋)和1μ0.25M疊氮鈉滴到1、3象限的中心位置，1μl無水乙醇和1μl 0.25M疊氮鈉滴到2、4象限，該點距離中心點的距離應(yīng)大于2厘米。將趨化培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到23℃培養(yǎng)箱中，一個小時后，計數(shù)趨化指數(shù)。苯甲醛是一種高濃度氣味的化學物質(zhì)，線蟲被苯甲醛的氣味吸引會向其區(qū)域移動，接觸到疊氮鈉就會被麻痹在原地。趨化指數(shù)的計算方法為計數(shù)在1、3象限(吸引物所在象限)的線蟲數(shù)量-在2、4象限線蟲數(shù)量再除以線蟲總數(shù)量。

蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)能夠劑量依賴性的提高CL2355的CI，40μg/ml的SVHRSP對神經(jīng)元的保護作用最為明顯，幾乎完全逆轉(zhuǎn)了Aβ表達所致的趨化性行為損傷。由對照組(39.45±6.2)的變?yōu)榻o藥組(7±5.66)，二者相比p<0.01這表明SVHRSP能夠保護神經(jīng)元，對抗Aβ引起的毒性作用，改善由于神經(jīng)元Aβ表達引起的趨化行為異常，見表2。

表2線蟲趨化行為學結(jié)果

實施例5

SVHRP對6-OHDA致SH-SY5Y氧化應(yīng)激的影響

熒光探針DCFH-DA檢測ROS觀察SVHRP對6-OHDA致SH-SY5Y氧化應(yīng)激的影響，實驗分為正常對照組，ROSup陽性對照組，6-OHDA模型組及不同濃度(2μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml)SVHRP藥物組。取處于指數(shù)生長期的SH-SY5H細胞，棄去培養(yǎng)液，用滅菌后PBS洗一次，再加入0.25％胰酶進行消化，吹打成單個細胞。用細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，以1.5×10⁴個/ml接種于96孔板，待細胞沉于板底，放到5％CO₂,37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24h。加入濃度為20μg/ml SVHRP藥物組進行干預(yù)1h后，然后加入6-OHDA，繼續(xù)放入5％CO₂,37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24h。按照1：500的稀釋比例用培養(yǎng)基稀釋ROSup，每孔加入100μl，培養(yǎng)27分鐘培養(yǎng)27min后，按照1:2000稀釋比例用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使終濃度為5μmol/L棄去培養(yǎng)基，每孔加入50μl稀釋好DCFH-DA溶液，輕輕搖勻，放入5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min。棄去上清，用PBS洗3次，在熒光酶標儀中測用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長進行熒光檢測。測OD值，進行比較。

通過測細胞內(nèi)ROS的方法來檢測SVHRP對6-OHDA導(dǎo)致的SH-SY5Y細胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧的清除的能力。給予SVHRP(20μg/ml)預(yù)先處理1h，再給予6-OHDA(100μM)損傷24h，利用熒光酶標儀，在激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為525nm，檢測細胞內(nèi)ROS的表達情 況，實驗結(jié)果顯示，6-OHDA能使細胞內(nèi)的ROS明顯升高，并且具有統(tǒng)計學意義(control 1±0.2vs6-OHDA 3.4±0.4p<0.01)，但是當加入SVHRP時，能夠明顯清除細胞內(nèi)ROS，而且也具有統(tǒng)計學意義(control 3.4±0.4vs 1.5±0.4p<0.05)。

實施例6

蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)對難治性癲癇匹羅卡品模型大鼠的防治作用

1)動物選擇與分組…選取體重為180g健康雄性SD大鼠,鋰-匹羅卡品ip 300mg/kg誘發(fā)顳葉癲癇發(fā)作；癲癇急性發(fā)作后15天,將癲癇大鼠隨機分為模型組和模型給藥組；癲癇模型組動物被給予腹腔注射生理鹽水(NS),連續(xù)15天；癲癇模型給藥組大鼠又被分成3個模型給藥組,分別給予SVHRP提取液50ug/kg/d、ip；SVHRSP 50ug/kg/d、ip和陽性對照藥物-丙戊酸鈉：即匹羅卡品癲癇模型+NS；鋰-匹羅卡品癲癇模型+SVHRP；鋰-匹羅卡品癲癇模型+SVHRSP；鋰-匹羅卡品癲癇模型+丙戊酸鈉。觀察并記錄癲癇級別,按Racine,s分級作為評價標準:

表3.癲癇發(fā)作級別

結(jié)果分析:

(1)SVHRSP對鋰-匹羅卡品癲癇大鼠慢性模型癇性發(fā)作有顯著的控制效果,可顯著減少發(fā)作次數(shù)；

(2)SVHRSP在降低鋰-匹羅卡品癲癇大鼠慢性模型的發(fā)作級別與減少發(fā)作次數(shù)上均強于陽性對照組丙戊酸

實施例7

蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)對原代培養(yǎng)神經(jīng)元鈉電流的抑制作用

(1)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。出生24h SD大鼠用75％酒精滅菌，冰上斷頭，解剖顯微鏡下快速完整剝離雙側(cè)海馬，于解剖液中分成體積為1mm3小塊，放入終濃度為0.125％的胰酶消化液中，置于37℃、10％CO2孵箱中消化30min。取出消化好的組織，在種植液中終止消化，機械吹打、懸浮、篩網(wǎng)過濾，制成密度為1×105/ml的細胞懸液，接種于事先用多聚賴氨酸(0.1mg/ml)包被的培養(yǎng)板中，放入37℃、10％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。第2d將種植液全部換為培養(yǎng)液，第4d在培養(yǎng)液中加入阿糖胞苷(3μg/ml)，抑制非神經(jīng)細胞的過度增殖。以后每隔3d更換50％新鮮培養(yǎng)液，體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元在培養(yǎng)到第9-12d為成熟神經(jīng)元，本實驗采用培養(yǎng)10d以后的神經(jīng)元。

(2)全細胞膜片鉗記錄原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元培養(yǎng)10d后進行全細胞膜片鉗記錄。記錄玻璃微電極外徑1.5mm，內(nèi)徑0.6-0.8mm，長8cm，用PP-830型微電極拉制儀經(jīng)雙步垂直拉制而成。拉制后電極口徑約為1μm，充灌電極內(nèi)液后，電極阻抗為3-5MΩ。參考電極為Ag-AgCl,電極。全細胞膜片鉗記錄電極與細胞膜之間形成穩(wěn)定的高阻封接后，進行快電容補償(C-fast)，稍加負壓破膜，形成全細胞構(gòu)型，再進行慢電容補償(C-slow)，慢電容補償率為80％-85％。通過漏電流法減去漏電流(Leak Substraction)。在設(shè)定的刺激電壓下觀察電流的激活情況。全細胞膜片鉗記錄所用儀器的設(shè)置為EPC-10雙通道膜片鉗放大器實驗參數(shù)、數(shù)據(jù)的采集和刺激的施加均通過Pulse軟件來控制，Bessel濾波1的頻率10KHz，Bessel濾波2的頻率2.9KHz。實驗過程中，所用藥物都通過BPS-8灌流裝置進行加藥，排管每管直徑為0.2mm，管口距所記錄細胞大約100μm。在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元體系進行膜片鉗記錄鈉通道電流，對同一細胞加蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)前后電流進行比較。

全細胞膜片鉗記錄，對同一細胞加蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)前后電流進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2μg/ml的SVHRSP能明顯抑制原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元體鈉通道電流，抑制率達90％以 上(n＝6)(p<0.0001)，給予細胞外液沖洗后電流可恢復(fù)。

實施例8

SH-SY5Y細胞衍生于人的神經(jīng)母細胞瘤細胞系。NMDA模型：NMDA 20mM+Gly10μM.

實驗流程：實驗前，按實驗?zāi)康姆纸M。SH-SY5Y種于96孔板(0.8×10⁴/孔)，24h后加入SVHRP和peptide預(yù)孵育24h，然后根據(jù)分組加入NMDA 20mM+Gly10μM培養(yǎng)24h后，用MTT試劑盒檢測各種細胞存活率，見圖11。結(jié)果表明，SVHRPSP對NMDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷具有保護作用。其中，S20:SVHRP濃度20μg/ml；P20:蝎毒耐熱合成肽SVHRSP濃度20μg/ml；S2:SVHRP 2μg/ml；P2:SVHRSP 2μg/ml；NMDA:20mM+Gly10μM，p<0.05(n＝3)。

實施例9

II型星形膠質(zhì)細胞通過逆分化形成具有增殖及分化能力的多潛能神經(jīng)干細胞

實驗操作:新生24小時SD大鼠，無菌分離出大腦皮層，制成細胞懸液，在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進行混合膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)。培養(yǎng)7-9d后，首先用L-亮氨酸甲酯鹽酸鹽(L-leucine methyl ester hydrochloride)處理1h，更換新鮮無菌的細胞培養(yǎng)液，于37℃恒溫搖床180r/min震蕩18小時后取上清液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，將上清液植于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的6孔中獲得相對純化的OPC。讓細胞在孵箱中自然沉降，2h后觀察細胞是否貼壁，貼壁后將上清液棄掉更換成II型星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)液(20％DMEM)，繼續(xù)培養(yǎng)4-5d后，即可獲得相對純化的II型星形膠質(zhì)細胞。5d后，將II型星形膠質(zhì)細胞消化下來植于超低粘附6孔板中，更換培養(yǎng)液為干細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12d后，可見干細胞球。12d后將超低粘附6孔板中細胞球吸出植于鋪有經(jīng)多聚賴氨酸處理細胞爬片的24孔板中，24h后將爬片取出，用4％多聚甲醛固定，行免疫熒光染色，用Nestin(green)鑒定細胞球是否為干細胞。Nestin是神經(jīng)干細胞的特異性標記物蝎毒耐熱合成肽(SVHRP)影響II型星形膠質(zhì)細胞逆分化形成神經(jīng)干細胞標志物Nestin。

實例10

蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)的急性毒性試驗

1)主要觀察指標:

①最大耐受量(Maximal tolerancedose,MTD,即最高非致死劑量,指不引起受試動物死亡的最高劑量；

②最小致死劑量(Minimal lethal dose,MLD)：引起個別受試動物出現(xiàn)死亡的劑量；

③最大無毒性反應(yīng)劑量(最高無毒):即未見毒性反應(yīng)的最高劑量(No observed adverse effect level,NOAEL),即動物在一定時間內(nèi),未發(fā)現(xiàn)損害作用的最高劑量；

④最小毒性反應(yīng)劑量：動物出現(xiàn)毒性反應(yīng)的最小劑量:剛剛引起毒性反應(yīng)的劑量即動物出現(xiàn)毒 性反應(yīng)的最低劑量。

2)注明:

①受試動物:昆明種小鼠雌、雄各半(健康成年,體重19-20g；

②受試物:SVHRSP:a.來源:河南宜昌鑫鑫養(yǎng)蝎廠(2012-05-28)購入BmK蝎毒提取液；

b.Lot No:P160418-CQ455216；

c.含量(或規(guī)格):10mg/支；d.保存條件及配制方法:長期保存-20℃,7-10d保存在4℃,使用時用millipore water復(fù)溶。

③給藥途徑:分別為ip(小鼠ip途徑給藥常用-最大容積為0.1-1.0ml/20gBW)

按給藥途徑選擇該種屬動物的最佳給藥容量(劑量不同,但給藥容量相同),本次實驗ip給藥途徑均采用0.2ml/20gBW。

④選擇采用方法

按近似致死劑量法,列出可能序列表:

按照從前蝎毒耐熱多肽對昆明種小鼠的急性毒性試驗結(jié)果,估計出蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)可能的最大耐受劑量和最小致死劑量,然后按50％遞增法，設(shè)計出含數(shù)個劑量的劑量序列表:

可能的最大耐受劑量(Maximal tolerance dose,MTD)：76.8、51.2、34.1mg/kg

可能的最小致死劑量(Minimal lethal dose,MLD)：115.2、76.8、51.2mg/kg

由估計的劑量序列表中找出可能的致死劑量范圍(115.2、76.8、51.2、34.1mg/kg，在此范圍內(nèi)，每一個劑量給一只動物，測出最小致死劑量和最大耐受劑量，然后用二者之間的劑量給一只動物。如果該劑量下動物未發(fā)生死亡，則該劑量與最小致死劑量之間的范圍為近似致死劑量范圍；如果該劑量下動物死亡，則該劑量與最大耐受劑量間的范圍為近似致死劑量范圍。

表4.腹途徑給藥檢測蝎毒耐熱合成肽的安全性(最大耐受和最小致死劑量)

結(jié)果表明:本發(fā)明的蝎毒耐熱合成肽(SVHRSP)的藥用安全性與藥效活性比大于2000/0.05＝40,000倍昆明種小鼠腹腔注射途徑給藥劑量高至2000mg/kgBW仍末見任何毒性反應(yīng)。尚未達到最大無毒性反應(yīng)劑量(最高無毒):即未見毒性反應(yīng)的最大劑量。