專利名稱：抗癌免疫療法的應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)總體上涉及癌癥治療領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及人癌的免疫療法。
背景技術(shù)：
人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，預(yù)先免疫近交繁殖的小鼠和大鼠，可以抵抗由同一遺傳背景的小鼠和大鼠而來(lái)的腫瘤。(Gross(1943)癌癥研究3323-326；Prehn等(1957)國(guó)家癌癥學(xué)會(huì)雜志18769-778；Klein等(1960)癌癥研究201561-1572；Old等(1962)紐約科學(xué)院年刊10180-106；綜述見(jiàn)Srivastava等(1988)現(xiàn)代免疫學(xué)978-83)。這些研究不僅指出接種沒(méi)有活性的癌細(xì)胞的小鼠可以對(duì)后續(xù)的活性癌細(xì)胞的攻擊產(chǎn)生免疫力，并且表明腫瘤特異性抗原的存在。
進(jìn)一步的研究揭示了這種預(yù)防性誘導(dǎo)免疫力的現(xiàn)象具有腫瘤特異性。盡管小鼠能對(duì)用來(lái)免疫它們的瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異的免疫力，它們對(duì)于其它無(wú)關(guān)的腫瘤的攻擊仍然敏感。(Basombrio(1970)癌癥研究302458-2462，Globerson等(1964)國(guó)家癌癥學(xué)會(huì)雜志321229-1243)。癌細(xì)胞免疫原性的證實(shí)引起了對(duì)能夠引發(fā)對(duì)腫瘤攻擊產(chǎn)生抗性的癌源分子的研究。一般的途徑是分級(jí)分離癌細(xì)胞來(lái)源的蛋白，然后分別檢測(cè)它們使小鼠對(duì)該級(jí)分由之制備的癌產(chǎn)生免疫的能力(Srivastava(1988)同上；Old(1981)癌癥研究41361-375)。利用這種方法已鑒定出一些蛋白，但是，這些蛋白中大部分與一類被稱作應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白或應(yīng)激蛋白的蛋白相關(guān)(Lindquist等(1988)遺傳學(xué)綜述年刊22631-677)。由于應(yīng)激蛋白在性質(zhì)上是最高度保守和最豐富的蛋白之一，因此，看來(lái)它們并不是腫瘤特異性抗原的候選物。隨后發(fā)現(xiàn)應(yīng)激蛋白以非共價(jià)形式與多種肽類結(jié)合，形成應(yīng)激蛋白--肽復(fù)合物。(Gething等(1992)自然35533-45；Lindquist等(1988)同上；Young(1990)免疫學(xué)綜述年刊8401-420；Flynn等(1991)自然353726-730)。
研究顯示，在用ATP進(jìn)行處理時(shí)應(yīng)激蛋白--肽復(fù)合物會(huì)失去其免疫原性。(Udono等(1993)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1781391-1396)。這種處理能把應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物解離成應(yīng)激蛋白和肽兩部分。考慮到從正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞得到的應(yīng)激蛋白的結(jié)構(gòu)沒(méi)有差別，并且應(yīng)激蛋白以ATP依賴方式與多種肽類相結(jié)合，這種應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物的抗原性似乎并不是應(yīng)激蛋白本身形成的，而是由與應(yīng)激蛋白結(jié)合的肽形成的。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是為治療性地抑制哺乳動(dòng)物腫瘤的增殖提供一種新的方法。這里所描述的方法不要求對(duì)特異性抗原決定簇進(jìn)行分離和表征，并且，可以為制備和利用對(duì)抑制哺乳動(dòng)物特異性的預(yù)定腫瘤增殖有效的免疫原性組合物提供一種更快的方法。
本發(fā)明的這一目的和其他的目的及特征在下面的說(shuō)明和權(quán)利要求中是顯而易見(jiàn)的。
發(fā)明概述應(yīng)激蛋白與分離出它們的細(xì)胞的抗原性肽相伴隨這一發(fā)現(xiàn)，為容易地分離預(yù)選腫瘤的抗原性肽提供了一種方法。一旦分離完畢，這種應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物又被回輸給分離出它的動(dòng)物，以引發(fā)對(duì)原有腫瘤的免疫應(yīng)答。因此，這種方法不必對(duì)腫瘤特異性抗原進(jìn)行分離和表征，可以使技術(shù)人員容易地制備出對(duì)抗預(yù)選腫瘤的有效的免疫原性組合物。
廣義地講，本發(fā)明為抑制哺乳動(dòng)物中預(yù)選腫瘤的增殖提供了一種方法。這種方法包括給治療中的哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物包含與應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物聯(lián)合應(yīng)用的藥用載體。這種復(fù)合物是從預(yù)先從哺乳動(dòng)物切下的腫瘤細(xì)胞中得到的，其特征為可以有效地啟動(dòng)哺乳動(dòng)物對(duì)分離出該復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。隨后將這種復(fù)合物以足夠的數(shù)量回輸給哺乳動(dòng)物，以引發(fā)哺乳動(dòng)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，由此，可以抑制哺乳動(dòng)物中任何仍然殘存的腫瘤細(xì)胞的增殖。
預(yù)計(jì)這種方法可以和其它常規(guī)的癌癥治療方法(包括，例如，外科手術(shù)、放療、化療)聯(lián)合應(yīng)用。例如，技術(shù)人員可以在手術(shù)切除癌組織之后，用本文描述的方法，從切除的組織中分離應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物并把這種復(fù)合物回輸給哺乳動(dòng)物。這種復(fù)合物可隨后誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)在外科手術(shù)中沒(méi)有被切除的仍然存在的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。當(dāng)原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移到身體的不同部位時(shí)，這種方法對(duì)癌癥治療是適合的。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“腫瘤”，可以理解為細(xì)胞的任何一種異?；虿豢煽刂频纳L(zhǎng)，這種生長(zhǎng)可導(dǎo)致對(duì)正常組織的侵害?？梢灶A(yù)計(jì)這一術(shù)語(yǔ)也包括已轉(zhuǎn)移了的異常生長(zhǎng)或生長(zhǎng)失控的細(xì)胞，即已經(jīng)從身體原發(fā)部位(即原發(fā)腫瘤)擴(kuò)散到空間上與原發(fā)部位不同的繼發(fā)部位的異常細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“應(yīng)激蛋白”，可以理解為任何一種滿足下列條件的細(xì)胞蛋白當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激性刺激時(shí)，它在細(xì)胞內(nèi)的濃度升高，它能夠結(jié)合其它的蛋白或肽，在ATP存在或pH值低的情況下能夠釋放結(jié)合的蛋白或肽。應(yīng)激性刺激包括但不僅限于熱休克、營(yíng)養(yǎng)缺乏、代謝紊亂、氧基和細(xì)胞內(nèi)病原體的感染。
第一種要鑒定的應(yīng)激蛋白是熱休克蛋白(Hsp)。正如它的名字所暗示的，Hsp典型地是由對(duì)熱休克產(chǎn)生應(yīng)答的細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的。目前已經(jīng)鑒定出的哺乳動(dòng)物三個(gè)主要Hsp家族，包括Hsp60、Hsp70和Hsp90。數(shù)字反映了應(yīng)激蛋白以千道爾頓為單位的近似分子量。每個(gè)家族的成員都高度保守，見(jiàn)例如，Bardwell等(1984)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊81848-852；Hickey等，(1989)分子細(xì)胞生物學(xué)92615-2626；Jindal(1989)分子細(xì)胞生物學(xué)92279-2283，其公開內(nèi)容在此引入作為參考。到目前為止，鑒定出的哺乳動(dòng)物Hsp90家族成員包括胞液Hsp90(亦稱作Hsp83)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)應(yīng)物Hsp90(亦稱作Hsp83)、Hsp87、Grp94(亦稱作ERp99)和gp96。見(jiàn)例如(Gething等(1992)自然35533-45，其公開內(nèi)容在此引入作為參考。到目前為止，鑒定出的Hsp70家族成員包括胞液Hsp70(亦稱作p73)和Hsc70(亦稱作p72)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)應(yīng)物Bip(亦稱作Grp78)；線粒體對(duì)應(yīng)物Hsp70(亦稱作Grp75)，Gething等(1992)同上。到目前為止，哺乳動(dòng)物Hsp60的家族成員僅僅在線粒體中鑒定出。Getnhing等(1992)同上。
此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Hsp60、Hsp70和Hsp90家族由在氨基酸序列上與應(yīng)激蛋白相關(guān)(例如有大于35％的氨基酸序列一致)的蛋白組成，但是他們的表達(dá)水平并不因應(yīng)激性刺激而改變。因此，可以預(yù)計(jì)在這里所用的應(yīng)激蛋白的定義，包括其他蛋白，其突變蛋白，類似物和變異體，與這三個(gè)家族的成員最少具有35％-55％，優(yōu)選55％-75％，最優(yōu)選75％-85％的氨基酸序列一致性，這三個(gè)家族的成員在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平在對(duì)應(yīng)激性刺激應(yīng)答時(shí)受到激發(fā)。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“肽”，可理解為任何一種從哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞分離到的以應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物形式存在的氨基酸序列。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物”，可以理解為任何一種能夠從哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞分離并且包含與肽非共價(jià)結(jié)合的應(yīng)激蛋白的復(fù)合物。這種復(fù)合物又以有效地引發(fā)哺乳動(dòng)物對(duì)分離出它的腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答為特征。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”，可以理解為哺乳動(dòng)物在抗原刺激下產(chǎn)生的任何一種目的為從哺乳動(dòng)物中清除抗原的細(xì)胞過(guò)程。這種免疫應(yīng)答典型地由一種或多種性質(zhì)上屬于淋巴細(xì)胞和/或吞噬細(xì)胞的細(xì)胞群所介導(dǎo)。
在本發(fā)明更特殊的方面中，應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物中的應(yīng)激蛋白選自Hsp70、Hsp90和gp96。包含有Hsp70-肽、Hsp90-肽和gp96-肽復(fù)合物的應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物可同時(shí)從一批由哺乳動(dòng)物切割而來(lái)的腫瘤細(xì)胞中分離得到?？梢灶A(yù)計(jì)，在免疫治療的過(guò)程中可把一種或多種前面提到的復(fù)合物施用給哺乳動(dòng)物，以刺激機(jī)體對(duì)腫瘤產(chǎn)生最合適的免疫應(yīng)答。
預(yù)計(jì)，本文所描述的方法對(duì)人癌的治療特別有效。但是，可以預(yù)計(jì)，本文所描述的方法也對(duì)其它哺乳動(dòng)物癌癥的免疫療法有效，這些動(dòng)物例如農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(即牛、馬、山羊、綿羊和豬)和家庭寵物(即貓和狗)。
在本發(fā)明的另一方面中，預(yù)計(jì)免疫應(yīng)答受T細(xì)胞級(jí)聯(lián)方式的影響，更具體地說(shuō)，是受細(xì)胞毒T細(xì)胞級(jí)聯(lián)方式的影響。這里所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒T細(xì)胞”，可理解為任何一種表達(dá)細(xì)胞表面糖蛋白標(biāo)志CD8的T淋巴細(xì)胞，這種淋巴細(xì)胞能靶向和裂解細(xì)胞表面帶有I型組織相容性復(fù)合物的被細(xì)胞內(nèi)病原體感染的靶細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面中，這種應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物可以和一些治療有效量的細(xì)胞因子聯(lián)合施用給哺乳動(dòng)物。這里所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”指任何一種影響其它介導(dǎo)免疫應(yīng)答細(xì)胞的功能的分泌型多聚肽。因此，可以預(yù)計(jì)這種復(fù)合物可以和細(xì)胞因子一起施用以增強(qiáng)針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答。優(yōu)選的細(xì)胞因子包括，但不僅限于，白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-3(IL-3)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-5(IL-5)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-7(IL-7)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-9(IL-9)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-11(IL-11)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、干擾素α(IFN-α)、干擾素β(IFN-β)、干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、腫瘤壞死因子β(TNFβ)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)。
該復(fù)合物可利用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)與常規(guī)的藥用載體、佐劑或賦形劑相結(jié)合。應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物家族必要的施用劑量和方式依賴于不同的因素，比如生理?xiàng)l件下復(fù)合物的穩(wěn)定性、復(fù)合物在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答時(shí)的有效性、腫瘤的大小及分布、受治療哺乳動(dòng)物的年齡、性別和重量。
典型地，施用該復(fù)合物的量應(yīng)該足以誘發(fā)哺乳動(dòng)物對(duì)分離出該復(fù)合物的腫瘤產(chǎn)生免疫應(yīng)答和抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物的施用量的范圍優(yōu)選的是1-1000微克復(fù)合體/公斤哺乳動(dòng)物體重/次施用，最優(yōu)選的是大約100-250微克復(fù)合體/公斤哺乳動(dòng)物體重/次施用。預(yù)計(jì)一個(gè)大約75公斤體重的人的典型劑量范圍是大約5-20mg。此外，預(yù)計(jì)通過(guò)反復(fù)向個(gè)體施用這種復(fù)合物可以提高機(jī)體的免疫應(yīng)答強(qiáng)度。哺乳動(dòng)物優(yōu)選地至少每隔一周接受兩劑應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物。如果必要的話，可通過(guò)稍后施用這種復(fù)合物而在較晚的時(shí)間增強(qiáng)免疫應(yīng)答。預(yù)計(jì)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)可找到最適的劑量和免疫方案。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于如下觀察，即應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物與分離出它們的細(xì)胞的抗原性肽相伴隨。常規(guī)的癌癥治療基于對(duì)腫瘤特異性抗原進(jìn)行分離、表征，然后以此抗原作為特定治療方案的目標(biāo)。由于哺乳動(dòng)物癌癥的抗原差異性，所以，對(duì)每種特定腫瘤的特定腫瘤抗原進(jìn)行分離和表征是不現(xiàn)實(shí)的。本發(fā)明避免了對(duì)每種被治療的腫瘤的腫瘤特異性抗原進(jìn)行分離和表征，為癌癥的免疫治療提供了另外一種途徑。
本發(fā)明為抑制哺乳動(dòng)物預(yù)選腫瘤的增殖提供了一種方法。這種方法包括從接受治療的哺乳動(dòng)物分離或獲得腫瘤細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)采用本領(lǐng)域熟知的外科手術(shù)方法容易地完成。典型地，腫瘤細(xì)胞可從進(jìn)行常規(guī)腫瘤外科切除的哺乳動(dòng)物中獲得。此方法隨后涉及包括從切除的腫瘤細(xì)胞中分離應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物。這可以利用下面詳細(xì)描述的任何一種分離方案完成。這種應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物的特征在于，當(dāng)它們又回輸給哺乳動(dòng)物時(shí)，能起始機(jī)體對(duì)分離出它們的同一類型腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。最后，這種方法包括把應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物回輸給哺乳動(dòng)物，所用的量足以在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，由此抑制哺乳動(dòng)物中殘存的任何腫瘤細(xì)胞的增殖。
預(yù)計(jì)這種方法可以和一種或多種常規(guī)的癌癥治療方法(包括例如外科手術(shù)、放療和化療)聯(lián)合應(yīng)用。例如，技術(shù)人員可用這里所描述的方法在腫瘤組織切除以后，從中分離應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物，并把它回輸給該哺乳動(dòng)物。于是，該復(fù)合物可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物對(duì)手術(shù)中沒(méi)有去除的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。另外，本文所描述的方法為原發(fā)腫瘤已轉(zhuǎn)移到機(jī)體多個(gè)部位時(shí)的癌癥治療提供了一種新的方法。例如，在癌癥已轉(zhuǎn)移，不能實(shí)行外科手術(shù)的情況下，可單獨(dú)應(yīng)用這種應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物或與另一種癌癥治療中標(biāo)準(zhǔn)的化療藥劑聯(lián)合應(yīng)用。
預(yù)計(jì)，本發(fā)明在人癌的免疫治療方面有特別的應(yīng)用，但是，這里所描述的方法也適于例如農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(即牛、馬、綿羊、山羊和豬)和家庭寵物(即貓和狗)的癌癥治療中。
本方法相對(duì)于常規(guī)方法的主要優(yōu)點(diǎn)在于不必對(duì)每一種腫瘤的腫瘤特異性抗原進(jìn)行分離、表征。一旦分離出應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物，就可不用進(jìn)一步表征、而簡(jiǎn)單地回輸給哺乳動(dòng)物。由于分離免疫原性復(fù)合物的方法是本領(lǐng)域常規(guī)而已知的，所以技術(shù)人員可快速地、常規(guī)地為每個(gè)接受治療的個(gè)體制備出“定做的”特異免疫原性組合物。
這種方法優(yōu)于常規(guī)方法的另一優(yōu)點(diǎn)在于把這種純化的應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物回輸給分離出它們的個(gè)體，可以消除給治療中的哺乳動(dòng)物注射潛在轉(zhuǎn)化劑(即轉(zhuǎn)化DNA)和/或免疫抑制劑的危險(xiǎn)，當(dāng)復(fù)合物存在于生化性質(zhì)尚未明確的腫瘤或腫瘤提取物中時(shí)，它們的應(yīng)用就會(huì)成為問(wèn)題。此外，應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物在無(wú)佐劑時(shí)就可誘導(dǎo)明顯的腫瘤免疫。因此，盡管佐劑能進(jìn)一步提高復(fù)合物的免疫治療特性，但是它們的存在在誘導(dǎo)明顯的免疫應(yīng)答時(shí)并不是先決條件。
預(yù)計(jì)，這種方法可用于不同腫瘤的治療，例如，間質(zhì)組織來(lái)源的腫瘤(肉瘤)即，纖維肉瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；軟骨肉瘤；成骨肉瘤；血管肉瘤；內(nèi)皮肉瘤；淋巴管肉瘤；滑膜肉瘤；間皮肉瘤；Ewing’s瘤；骨髓白血病；單核細(xì)胞白血??；惡性淋巴瘤；淋巴細(xì)胞白血病；漿細(xì)胞瘤；平滑肌肉瘤和橫紋肌肉瘤。
此外，預(yù)計(jì)這種方法可用于上皮組織來(lái)源的腫瘤(癌)的治療即，鱗狀細(xì)胞或表皮癌；基細(xì)胞癌；汗腺癌；皮脂腺癌；腺癌；乳狀癌；乳腺癌；囊腺癌；骨髓癌；未分化癌(單成份癌)；支氣管癌；鰓裂癌；黑色素癌；腎細(xì)胞癌；肝細(xì)胞癌；膽管癌；乳頭狀癌；過(guò)渡型細(xì)胞癌；鱗狀細(xì)胞癌；絨毛膜癌；精原細(xì)胞瘤；胚胎癌；惡性畸胎瘤和畸胎癌。下面將詳細(xì)論述制備這種有效地誘導(dǎo)對(duì)這些腫瘤產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物的一般方法。
盡管不希望被理論所束縛，預(yù)計(jì)這種應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物通過(guò)T細(xì)胞級(jí)聯(lián)刺激機(jī)體對(duì)分離出它們的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。先前的實(shí)驗(yàn)證明，用始發(fā)于同系大鼠或小鼠的腫瘤分離出的應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物預(yù)先免疫小鼠，小鼠可針對(duì)分離出這種復(fù)合物的腫瘤產(chǎn)生免疫性抵抗。但是，不能針對(duì)抗原性不同的腫瘤產(chǎn)生免疫力。而且，從正常組織中分離到的應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物不能誘導(dǎo)小鼠對(duì)任何受試腫瘤的抵抗。見(jiàn)例如，Srivastava等(1984)國(guó)際癌癥雜志33417；Srivastava等(1986)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊833407；Palladino等(1987)癌癥研究475074；Feldweg等(1993)細(xì)胞生化雜志.增刊17D108(摘要)；Udono(1993)細(xì)胞生化雜志.增刊17D113；Udono(1993)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1781391-1396。這些內(nèi)容在此引入作為參考。最近已經(jīng)確定預(yù)防免疫以T細(xì)胞級(jí)聯(lián)方式被介導(dǎo)，更具體地說(shuō)，由細(xì)胞毒T細(xì)胞級(jí)聯(lián)介導(dǎo)。見(jiàn)例如，Blachere等(1993)免疫療法雜志14352-356，這些內(nèi)容在此引入作為參考。由此，可預(yù)計(jì)應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物也許由同樣的機(jī)制介導(dǎo)它們有效的治療作用；具體地說(shuō)，通過(guò)細(xì)胞毒T細(xì)胞級(jí)聯(lián)。
預(yù)計(jì)，這種應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物典型地可以從治療中哺乳動(dòng)物切除的腫瘤組織中直接分離。但是，在某些情況下，用于分離復(fù)合物的腫瘤組織的數(shù)量有限，因此，預(yù)計(jì)在分離應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物之前，可通過(guò)運(yùn)用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)使切除的腫瘤組織增殖。例如，切除的腫瘤組織可在體內(nèi)增殖，例如，將腫瘤組織的標(biāo)本轉(zhuǎn)染給裸鼠，或在體外，例如可對(duì)培養(yǎng)中的腫瘤組織進(jìn)行連續(xù)傳代，隨后，可收獲這些增殖的瘤組織，并作為分離應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物的初始物。
在本發(fā)明實(shí)踐中有效的應(yīng)激蛋白可定義為任何一種滿足下列條件的細(xì)胞蛋白當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激性刺激時(shí)，該蛋白的細(xì)胞內(nèi)的濃度升高；可以結(jié)合其它的蛋白或肽；在ATP存在或pH值低時(shí)，可釋放結(jié)合的蛋白或肽。
第一種要鑒定的應(yīng)激蛋白為Hsp，這是在對(duì)熱休克產(chǎn)生應(yīng)答的細(xì)胞內(nèi)合成的。目前為止，已鑒定出哺乳動(dòng)物Hsp的三個(gè)主要家族，包括Hsp60、Hsp70和Hsp90，這里的數(shù)字反映了應(yīng)激蛋白以千道爾頓為單位的分子量。以后又發(fā)現(xiàn)在對(duì)其它應(yīng)激性刺激，包括但不僅限于，營(yíng)養(yǎng)缺乏、代謝紊亂、氧基和細(xì)胞內(nèi)病原體的感染等產(chǎn)生應(yīng)答時(shí)也可誘導(dǎo)出這些家族的許多成員。見(jiàn)例如Welch(1993年5月)科學(xué)美國(guó)人56-64；Young(1990)同上；Craig(1993)科學(xué)2601902-1903；Gething等，同上；Lindquist等(1988)同上，這些內(nèi)容在此引入作為參考。預(yù)計(jì)，所有屬于這三個(gè)家族的哺乳動(dòng)物應(yīng)激蛋白在本發(fā)明的實(shí)踐中是有效的。
主要的應(yīng)激蛋白在應(yīng)激的細(xì)胞中積累到非常高的水平，在沒(méi)有受到應(yīng)激的細(xì)胞里則低到中等水平。例如，具有高度可誘導(dǎo)性的哺乳動(dòng)物的Hsp70在常溫下難以檢測(cè)，但在受到熱休克的細(xì)胞中則成為最活躍地合成的蛋白之一。(Welch等(1985)細(xì)胞生物雜志1011198-1211)。不同的是，大部分，但不是全部哺乳動(dòng)物細(xì)胞的Hsp90、Hsp60蛋白在常溫下含量豐富，可由熱進(jìn)一步誘導(dǎo)。(Lai等(1984)分子細(xì)胞生物學(xué)42802-10；van Bergen en Henegouwen等(1987)，基因進(jìn)展1525-31)。
到目前為止，已鑒定出的哺乳動(dòng)物Hsp90家族成員包括胞液中的Hsp90(亦稱作Hsp83)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)應(yīng)物Hsp90(亦稱作Hsp83)，Hsp87，Grp94(亦稱作ERp99)和gp96(Gething等(1992)同上)。這些內(nèi)容在此引入作為參考。鑒定出的Hsp70家族成員包括胞液Hsp70(亦稱作p73)和Hsc70(亦稱作p72)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)應(yīng)物Bip(亦稱作Grp78)；線粒體對(duì)應(yīng)物Hsp70(亦稱作Grp75)，Gething等(1992)同上。目前，哺乳動(dòng)物Hsp60的家族成員僅僅在線粒體中鑒定出，Gething等(1992)同上。
應(yīng)激蛋白是現(xiàn)存的最高度保守的蛋白之一。例如，DnaK，E.coli的Hsp70有大約50％的氨基酸序列與真核細(xì)胞的Hsp70蛋白一致。(Bardwell等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(1984)81848-852)。相似地，Hsp60和Hsp90家族均具有高度的家族內(nèi)保守性(Hickey等(1989)分子細(xì)胞生物學(xué)92615-2626；Jindal分子細(xì)胞生物學(xué)92279-2283)。此外，已發(fā)現(xiàn)Hsp60、Hsp70、Hsp90的家族由在序列上與應(yīng)激蛋白相關(guān)的蛋白組成，例如，有大于35％的氨基酸序列一致，但是在應(yīng)激狀態(tài)下其表達(dá)水平并不改變。因此，預(yù)計(jì)這里所用的應(yīng)激蛋白的定義包括其它的蛋白，其突變的蛋白、類似物和變異體，這些蛋白的氨基酸序列至少有35％-55％，優(yōu)選55％-75％，最優(yōu)選75％-85％與這三個(gè)家族成員的一致，在對(duì)應(yīng)激性刺激應(yīng)答的過(guò)程中，這三個(gè)家族成員的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平增高。
本發(fā)明的免疫原性應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物包括任何一種含有以非共價(jià)形式結(jié)合的應(yīng)激蛋白和肽的復(fù)合物，所述肽能在哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。優(yōu)選的復(fù)合物包括但不僅限于，Hsp70-肽、Hsp90-肽和gp96-肽復(fù)合物。例如，在本發(fā)明的實(shí)踐中，可應(yīng)用哺乳動(dòng)物的應(yīng)激蛋白gp96，它是胞液Hsp90的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相對(duì)物。
以下將詳細(xì)論述分離本發(fā)明實(shí)踐中所用的應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物的典型方法。
Hsp70-肽復(fù)合物的純化以前已經(jīng)描述過(guò)Hsp70-肽復(fù)合物的純化方法，見(jiàn)例如，Udono等(1993)同上。
首先，將腫瘤細(xì)胞懸浮在3體積的由5mM磷酸鈉緩沖液(PH7)、150mM NaCl，2mM CaCl2，2mM MgCl2和1mM苯甲磺酰氟(PMSF)組成的1×裂解緩沖液中。接著，在冰浴中對(duì)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行超聲處理，直到顯微鏡下檢測(cè)99％以上的細(xì)胞裂解。作為超聲處理的替代方法，可用機(jī)械剪切對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，在這種方法中，細(xì)胞常重懸于30mM碳酸氫鈉pH7.5、1mM PMSF的溶液中，冰浴中培養(yǎng)20分鐘，然后在dounce勻漿器中勻漿，直到95％以上的細(xì)胞裂解。
然后，將裂解物離心1000g×10min，以去除未破裂的細(xì)胞、核和其它細(xì)胞碎片。得到的上清液再離心100,000g×90min，收集上清，與被含有2mM Ca2+和2mM Mg2+的磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡過(guò)的ConA瓊脂糖混合。當(dāng)細(xì)胞被機(jī)械剪切裂解時(shí)，可先用等體積的2×裂解緩沖液稀釋，然后再與ConA瓊脂糖混合。上清液可在4℃和ConA瓊脂糖混合2-3h，收集未結(jié)合的物質(zhì)，用10mM Tris乙酸鹽pH7.5、0.1mM EDTA、10mM NaCl、1mM PMSF透析36小時(shí)(三次，每次100體積)。然后，將透析液離心17000rpm×20min(Sorvall SS34轉(zhuǎn)頭)。所得的上清液被收集，上Mono Q FPLC柱，該柱用20mM Tris乙酸鹽pH7.5、20mMNaCl、0.1mM EDTA和15mM 2-巰基乙醇平衡液平衡。接著用20mM-500mM的NaCl梯度進(jìn)行展開，洗脫級(jí)分由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，使用合適的抗Hsp70抗體，用免疫印跡法進(jìn)行表征。
合并與抗Hsp70抗體進(jìn)行強(qiáng)烈免疫反應(yīng)的級(jí)分，用硫酸銨沉淀Hsp70-肽復(fù)合物，具體地說(shuō)，用50％-70％的硫酸銨分離。生成的沉淀通過(guò)17000rpm(SS Sorvall轉(zhuǎn)頭)離心獲得，并用70％的硫酸銨洗滌。溶解洗滌的沉淀物，任何殘存的硫酸銨可通過(guò)交聯(lián)葡聚糖RG25(Pharmacia)柱進(jìn)行凝膠過(guò)濾而被清除。
用這種方法能把Hsp70-肽復(fù)合物純化得很均一。典型地，從1克細(xì)胞或組織能純化到1mg Hsp70-肽復(fù)合物。
Hsp90-肽復(fù)合物的純化首先，將腫瘤細(xì)胞懸浮在3體積的由5mM磷酸鈉緩沖液(PH7)、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM Mgcl2和1mM苯甲磺酰氟(PMSF)組成的1×裂解緩沖液中。接著，在冰浴中對(duì)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行超聲處理，直到顯微鏡下檢測(cè)99％以上的細(xì)胞裂解。作為超聲處理的替代方法，可用機(jī)械剪切對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，在這種方法中，細(xì)胞常重懸于30mM碳酸氫鈉pH7.5、1mM PMSF的溶液中，冰浴中培養(yǎng)20分鐘，然后在dounce勻漿器中勻漿，直到95％以上的細(xì)胞裂解。
然后，將裂解物離心1000g×10min，以去除未破裂的細(xì)胞、核和其它細(xì)胞碎片。得到的上清液再離心100,000g×90min，收集上清，與被1含有2mM Ca2+和2mM Mg2+的磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡過(guò)的ConA瓊脂糖混合。當(dāng)細(xì)胞被機(jī)械剪切裂解時(shí)，可先用等體積的2x裂解緩沖液稀釋，然后再與ConA瓊脂糖混合。上清液可在4℃下和ConA瓊脂糖混合2-3小時(shí)，收集未結(jié)合的物質(zhì)，用10mM Tris乙酸鹽pH7.5、0.1mMEDTA、10mM NaCl、1mM PMSF透析36小時(shí)(三次，每次100體積)。然后，將滲析液離心17000rpm×20min(Sorvall SS34轉(zhuǎn)頭)。所得的上清液被收集，上Mono Q FPLC柱，該柱用裂解緩沖液平衡。用200mM-600mM的NaCl梯度洗脫蛋白。
洗脫的級(jí)分由SDS-PAGE分離，使用象3G3(Affinity Bioreagent)這樣的抗Hsp90抗體，用免疫印跡法對(duì)含有Hsp90-肽復(fù)合物的級(jí)分進(jìn)行鑒定。用這種方法能把Hsp90-肽復(fù)合物純化得很均一。典型地，從1克細(xì)胞或組織能純化到150-200μg Hsp90-肽復(fù)合物。
gp96-肽復(fù)合物的純化首先，將腫瘤細(xì)胞懸浮在3體積的由5mM磷酸鈉緩沖液(PH7)、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2和1mM苯甲磺酰氟(PMSF)組成的1×裂解緩沖液中。接著，在冰浴中對(duì)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行超聲處理，直到顯微鏡下檢測(cè)99％以上的細(xì)胞裂解。作為超聲處理的替代方法，可用機(jī)械剪切對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，在這種方法中，細(xì)胞常重懸于30mM碳酸氫鈉pH 7.5、1mM PMSF的溶液中，冰浴中培養(yǎng)20分鐘，然后在dounce勻漿器中勻漿，直到95％以上的細(xì)胞裂解。
然后，將裂解物離心1000g×10min，以去除未破裂的細(xì)胞、核和其它細(xì)胞碎片。將得到的上清液再離心100,000g×90min，收集上清，與被含有2mM Ca2+和2mM Mg2+的磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡過(guò)的ConA瓊脂糖混合。當(dāng)細(xì)胞被機(jī)械剪切裂解時(shí)，可先用等體積的2x裂解緩沖液稀釋，然后再與ConA瓊脂糖混合。上清液可在4℃下和ConA瓊脂糖混合2-3小時(shí)。將漿液上柱，用1×裂解緩沖液洗滌，直到OD280降到基線。用1/2柱床體積的10％α-甲基甘露糖苷(α-MM)洗柱，用薄膜封柱，在37℃溫育15分。接著把柱冷卻到室溫，從柱底移去薄膜，用5倍柱體積的α-MM洗柱。然后分離洗提物，用SDS-PAGE表征。通常，生成的gp96-肽復(fù)合物的純度依細(xì)胞類型和組織對(duì)裂解液的裂解率不同而大約為60％-95％。
如果需要進(jìn)一步純化，可把樣品加到用含有5mM磷酸鹽的pH7緩沖液平衡的Mono Q FPLC柱。用0-1M的NaCl梯度從柱上洗脫蛋白。gp96級(jí)分的洗脫物在400-500mM NaCl之間。
作為可選方案，從100,000g細(xì)胞團(tuán)分離來(lái)的gp96級(jí)分，可重懸于5體積含有1％脫氧膽酸鈉(無(wú)鈣離子和鎂離子)的PBS液中，在冰浴中培養(yǎng)1小時(shí)，將所得上清液離心20,000g×30min，收集所得的上清液，在更換幾次的PBS液(無(wú)鈣離子和鎂離子)中透析，以洗去去污劑。所得透析液離心100,000g×90min，將上清液進(jìn)一步純化。然后把鈣和鎂加到上清液，終濃度為2mM。接著把樣品加到用含有5mM磷酸鹽的pH7緩沖液平衡的Mono Q FPLC柱。用0-1M的NaCl梯度從柱上洗脫蛋白。gp96級(jí)分的洗脫物在400-550mM NaCl之間。
用這種方法能把gp96-肽復(fù)合物純化得很均一。典型地，從1克細(xì)胞或組織能純化到10-20μg gp96-肽復(fù)合物。
復(fù)合物的制劑和施用一旦將應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物從切除的腫瘤中純化出來(lái)，它們就可回輸給接受治療的哺乳動(dòng)物中，以刺激哺乳動(dòng)物產(chǎn)生對(duì)分離出它們的腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。通過(guò)與生理可接受載體、賦形劑和穩(wěn)定劑混合可對(duì)本發(fā)明的應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物進(jìn)行儲(chǔ)存或準(zhǔn)備施用。這些物質(zhì)在所用劑量和濃度范圍內(nèi)應(yīng)對(duì)接受者無(wú)毒性。
當(dāng)這種復(fù)合物是水溶性時(shí)，它可在合適的緩沖液中配制，例如，PBS(5mM磷酸鹽、150mM NaCl，pH7.1)或其它生理可接受溶液?？蛇x地，如果所得復(fù)合物在水溶液中的溶解度低，可用象吐溫、聚乙二醇這樣的非離子表面活性劑配制。
口服或胃腸外施用時(shí)所用的溶液可通過(guò)任何一種藥物學(xué)領(lǐng)域熟知的方法制備，例如，在Remington氏藥物科學(xué)(Gennaro，A.，ed.)，Mack出版社，1990中所描述的。這些制劑包括，例如，象聚乙二醇這樣的聚亞烷基二醇、植物油、氫化萘等。直接應(yīng)用的制劑，具體地說(shuō)，可包括甘油和其它高粘度的組合物。生物相容的，優(yōu)選生物可再吸收的聚合物，包括例如，透明質(zhì)酸、膠原、磷酸三鈣、聚丁酸酯、聚交酯、聚乙交酯和交酯/乙交酯的共聚物，它們也許是有效控制應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物在體內(nèi)釋放的賦形劑。
用于吸入的制劑可包含賦形劑，例如，乳糖。水溶液可包含，例如，聚氧乙烯-9-十二烷基醚、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽。油性溶液在滴鼻劑中也許有用。凝膠可以應(yīng)用于鼻內(nèi)局部施用。
通過(guò)與藥用非毒性賦形劑和載體混合，本發(fā)明提供的復(fù)合物可配制成藥物組合物。此外，制劑可優(yōu)選地包含一種或多種佐劑。優(yōu)選的佐劑包括但不限于，環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷的3嵌段共聚物、胞壁酰二肽和它的衍生物、減毒內(nèi)毒素、皂角苷和它的衍生物如QS-21和脂質(zhì)體。本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)想緩釋劑型，在這種劑型中復(fù)合物可在一段延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)釋放。
按照本發(fā)明制備的應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物家族的施用方式必須依賴于生理?xiàng)l件下復(fù)合物的穩(wěn)定性和接受治療的哺乳動(dòng)物中的腫瘤的大小和分布。施用的復(fù)合物的優(yōu)選劑量似乎也依賴于腫瘤的大小和分布、接受者的年齡、性別和體重、特定接受者的整體健康狀況、復(fù)合物的相對(duì)生物效能、復(fù)合物的劑型、制劑中賦形劑的存在及其類型和施用的途徑等不同因素。
通常，本發(fā)明的化合物可溶于水性生理緩沖液中，溶液中含有大約0.001-0.1％(w/v)的化合物，用于胃腸外施用。優(yōu)選的劑量范圍是大約1-1000微克復(fù)合物/公斤接受者體重/次施用，最優(yōu)選的施用范圍是大約100-250微克復(fù)合物/公斤接受者體重/次施用。具體地說(shuō)，一個(gè)大約75公斤體重的人的典型劑量范圍是5-20mg。但是，這些量要依照與復(fù)合物一起施用的佐劑而變化。
這種復(fù)合物優(yōu)選地包含用標(biāo)準(zhǔn)方法可以施用的部分水溶液，所述方法例如，靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、眶內(nèi)、眼內(nèi)、心室內(nèi)、顱內(nèi)、中央囊內(nèi)、脊柱內(nèi)、腦池內(nèi)、腹腔內(nèi)、口腔、直腸、陰道、鼻內(nèi)或噴霧施用。水溶液優(yōu)選生理可接受的，這樣除了給哺乳動(dòng)物輸送所需的復(fù)合物之外，溶液不會(huì)影響機(jī)體的電解質(zhì)和/或容積的平衡。這樣，復(fù)合物的水介質(zhì)可包括通常的生理鹽水(0.9％NaCl，0.15M)，pH7-7.4或它的其他藥用鹽。
優(yōu)選地，接受者應(yīng)每隔兩周接種三次疫苗。如果有必要，可通過(guò)隨后施用這種復(fù)合物在較晚的時(shí)間內(nèi)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。預(yù)計(jì)，通過(guò)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)可經(jīng)驗(yàn)性地為每一種應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物制定出最合適的劑量和接種方案。
不同的細(xì)胞因子、抗生素和其它的生物活性劑也可和這種應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物一起施用。例如，各種已知的細(xì)胞因子，即，白細(xì)胞介素-1α(IL-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-3(IL-3)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-5(IL-5)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-7(IL-7)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-9(IL-9)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-11(IL-11)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、干擾素α(IFN-α)、干擾素β(IFN-β)、干擾素γ(IFN-γ)，腫瘤壞死因子α(TNFα)、腫瘤壞死因子β(TNFβ)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)也可和復(fù)合物一起施用，以使生理應(yīng)答最大化。然而，可以預(yù)料，其他的但尚未被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子對(duì)本發(fā)明也可能是有效的。此外，常規(guī)的抗生素也可和這種應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物一起施用。但是，對(duì)合適的抗生素的選擇尚依賴于所要治療的疾病。
實(shí)施例1在本實(shí)施例中，小鼠C57BL/6和C3H的體重大約100克，購(gòu)自Jackson實(shí)驗(yàn)室，Bar Harbor，Me.。在小鼠皮下注射惡性腫瘤細(xì)胞，以誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性腫瘤。具體地說(shuō)，將惡性紡錘形細(xì)胞癌6139細(xì)胞注射到C3H小鼠的皮下，將小鼠的惡性Lewis肺癌細(xì)胞注射到C57BL/6小鼠的皮下，將小鼠的惡性B16黑色素瘤細(xì)胞注射到C57BL/6小鼠的皮下。
當(dāng)腫瘤長(zhǎng)到既能看到又能摸到大小的時(shí)候，切下腫瘤組織作樣品。作為對(duì)照，也從荷瘤小鼠切下非惡性的正常組織。
然后，用以上描述的方法從切除的正常組織和腫瘤組織分離gp96-肽、Hsp90-肽和Hsp70-肽復(fù)合物。一旦分離，則把這種復(fù)合物和PBS一起回輸給分離出復(fù)合物的小鼠中。通常每次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)6只小鼠。實(shí)驗(yàn)按下述方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 回輸給小鼠的組合物1 gp96-肽2 Hsp70-肽3 Hsp90-肽4 gp96-肽和Hsp70-肽5 gp96-肽和Hsp90-肽6 Hsp70-肽和Hsp90-肽7 Hsp70-肽、Hsp90-肽和gp96-肽8 只用緩沖液在一組實(shí)驗(yàn)中復(fù)合物從腫瘤細(xì)胞分離，而在另一組實(shí)驗(yàn)中復(fù)合物從正常細(xì)胞分離。用預(yù)選的復(fù)合物20mg(全重)每隔一周給小鼠接種3次。治療過(guò)程中，每天測(cè)量每個(gè)腫瘤的大小。4周以后處死小鼠，并對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)情況進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)。此外，還檢測(cè)處死的小鼠有無(wú)轉(zhuǎn)移。
預(yù)期的結(jié)果是，用從正常組織得到的復(fù)合物治療的小鼠的腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)并且轉(zhuǎn)移。相反，用從腫瘤組織得到的復(fù)合物治療的小鼠腫瘤比對(duì)照動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)慢，在某些情況下，治療過(guò)程中的瘤塊可能變小，腫瘤消退。其它的實(shí)施方案本發(fā)明也可在不違背其精神或本質(zhì)特征的情況下以其它特殊方式實(shí)施。因此，本實(shí)施方案從所有方面考慮是一種實(shí)例性的而不是限制性的，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求而不是上述說(shuō)明書指出，因此權(quán)利要求的等價(jià)的含義和范圍內(nèi)的全部改變也將包括在內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)腫瘤增殖的方法，該方法包括給荷瘤哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物包含(a)從腫瘤細(xì)胞分離出的免疫原性應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物，該復(fù)合物可以有效地在哺乳動(dòng)物體內(nèi)起始對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，和(b)藥用載體，所用的量足以在哺乳動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，由此抑制腫瘤的增殖。
2.權(quán)利要求1的方法，其中復(fù)合物中的應(yīng)激蛋白是Hsp70、Hsp90或gp96。
3.權(quán)利要求1的方法，其中復(fù)合物中的肽與應(yīng)激蛋白非共價(jià)結(jié)合。
4.權(quán)利要求1的方法，其中施用復(fù)合物起始T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
5.權(quán)利要求4的方法，其中施用復(fù)合物起始細(xì)胞毒T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
6.權(quán)利要求1的方法，其中施用給哺乳動(dòng)物的復(fù)合物的劑量范圍是大約1-1000微克復(fù)合物/公斤哺乳動(dòng)物體重/次施用。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所說(shuō)的劑量范圍是大約100-250微克復(fù)合物/公斤哺乳動(dòng)物體重/次施用。
8.權(quán)利要求1的方法，其中復(fù)合物被重復(fù)地施用給哺乳動(dòng)物。
9.權(quán)利要求1的方法，其中組合物與細(xì)胞因子一起施用給哺乳動(dòng)物。
10.一種抑制哺乳動(dòng)物腫瘤增殖的方法，該方法包括以下步驟(a)提供從哺乳動(dòng)物切割下來(lái)的腫瘤細(xì)胞；(b)從細(xì)胞中分離一種免疫原性應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物，它可以有效地在哺乳動(dòng)物中起始對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答；(c)給哺乳動(dòng)物施用分離的應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物，其用量足以在哺乳動(dòng)物中引發(fā)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，由此抑制哺乳動(dòng)物中殘存的任何腫瘤細(xì)胞的增殖。
11.權(quán)利要求10的方法，其中復(fù)合物中的應(yīng)激蛋白是Hsp70、Hsp90或gp96。
12.權(quán)利要求10的方法，其中復(fù)合物中的肽與應(yīng)激蛋白非共價(jià)結(jié)合。
13.權(quán)利要求10的方法，其中施用復(fù)合物起始T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
14.權(quán)利要求13的方法，其中施用復(fù)合物起始細(xì)胞毒T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
15.權(quán)利要求10的方法，其中施用給哺乳動(dòng)物的復(fù)合物的劑量范圍是大約1-1000微克復(fù)合物/公斤哺乳動(dòng)物體重/次施用。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所說(shuō)的劑量范圍是大約100-250微克復(fù)合物/公斤哺乳動(dòng)物體重/次施用。
17.權(quán)利要求10的方法，其中復(fù)合物被重復(fù)施用給哺乳動(dòng)物。
18.權(quán)利要求10的方法，其中復(fù)合物與細(xì)胞因子一起施用給哺乳動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明公開的是一種抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)腫瘤增殖的方法。該方法包括以下步驟(a)從預(yù)先從哺乳動(dòng)物中得到的腫瘤細(xì)胞中分離應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物，(b)將分離的應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物回輸給哺乳動(dòng)物，以刺激哺乳動(dòng)物對(duì)分離出該復(fù)合物的腫瘤的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明實(shí)踐中具有特殊應(yīng)用的應(yīng)激蛋白-肽復(fù)合物包括Hsp70-肽、Hsp90-肽和gp-96肽復(fù)合物。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1167440SQ95196515
公開日1997年12月10日 申請(qǐng)日期1995年4月6日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月30日
發(fā)明者P·K·斯里瓦斯塔瓦 申請(qǐng)人:紐約城市大學(xué)辛乃山醫(yī)科學(xué)校