專利名稱：蝎抗心律失常肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蝎抗心律失常肽，以及產(chǎn)生蝎抗心律失常肽的方法。具體地說，本發(fā)明涉及一種高效生物活性的蝎抗心律失常肽，采用基因工程和生物化學(xué)手段產(chǎn)生蝎抗心律失常肽的方法，產(chǎn)生的蝎抗心律失常肽在制備抗心律失常藥中的應(yīng)用。
本發(fā)明的還有一個目的在于提供一種蝎抗心律失常肽在抗心律失常藥中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個目的在于提供一種用基因工程方法產(chǎn)生的蝎抗心律失常肽在抗心律失常藥中的應(yīng)用。
一種蝎抗心律失常肽，其特征是，該活性肽的氨基酸序列如下DGYIRGSNGCLWGNEGCNKECKGFGYCWTWGLACWCEGLTWKSESNTCG。
本發(fā)明提供的蝎抗心律失常肽與從蝎抗心律失常肽cDNA推導(dǎo)的成熟氨基酸序列一至，并且不含有影響生物活性的額外組氨酸片段和其它氨基酸序列。蝎抗心律失常肽呈可溶狀態(tài)，不形成包含體，圓二色譜顯示其二級結(jié)構(gòu)與其它天然蝎毒多肽相似，即這種肽能真實反應(yīng)蝎抗心律失?；虻墓δ?。本發(fā)明提供的重組肽不僅有抗癲癇的作用而且有明顯的抗心律失常作用。
一種生產(chǎn)蝎抗心律失常肽的方法，包括設(shè)計PCR引物，用PCR從東亞鉗蝎蝎毒cDNA庫中擴(kuò)增蝎抗心律失常肽基因片段，并通過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá)。其特征是設(shè)計的PCR引物含小腸激酶酶切位點，用PCR擴(kuò)增的蝎抗心律失常肽基因片段克隆到pGEX-5x-1表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中獲得重組大腸桿菌BL21(pGEX/BmKIM)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，用小腸激酶酶切表達(dá)的融合蛋白，再經(jīng)過脫鹽而獲得可溶的蝎抗心律失常肽。
從構(gòu)建的蝎毒腺cDNA文庫(Xian-chun Zeng，Wen-Xin Li，Shun-Yi Zhu，F(xiàn)ang Peng，Toxicon 2000 38893-899)中篩選到與抗神經(jīng)興奮肽基因相似的cDNA序列，在推導(dǎo)的氨基酸序列中，其信號肽區(qū)有三個氨基酸的差異，其它區(qū)域相同，稱此cDNA序列為蝎抗心律失常肽基因 上述為蝎抗心律失常肽的cDNA序列，下劃線的部分為信號肽區(qū)，陰影部分是蝎毒多肽在體內(nèi)加工成熟的過程中按照貫例會被切除的部分，加點的區(qū)域為引物設(shè)計區(qū)，加黑字母表示與蝎抗神經(jīng)興奮肽不同的氨基酸。根據(jù)蝎抗心律失常肽基因序列設(shè)計上游、下游引物，將蝎抗心律失常肽基因扦入表達(dá)載體pGEX-5x-1質(zhì)粒，構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得重組大腸桿菌BL21(pGEX/BmKIM)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-蝎抗心律失常肽融合蛋白，經(jīng)谷胱甘肽親和層析柱純化后用小腸激酶酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)過SephadexG-50純化和脫鹽，得到可溶的且有活性的重組蝎抗心律失常肽。
一種優(yōu)化的生產(chǎn)蝎抗心律失常肽的方法，其特征是PCR上游引物A1，5’-GCCGGATCCCCGATGACGATGACAAGGATGGATATATAAGA-3’，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶酶切位點和小腸激酶酶切位點；PCR下游引物A2，5’-GCCCTCGAGTCAACCGCATGTATTACTTTCAG-3’該引物含有XohI限制性內(nèi)切酶酶切位點。
用此引物經(jīng)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物經(jīng)BamHI和XohI酶切后克隆到pGEX-5x-1，經(jīng)轉(zhuǎn)化得到重組大腸桿菌BL21(pGEX/BmKIM)。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用小腸激酶對表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行酶切，獲得可溶性的蝎抗心律失常肽。
根據(jù)蝎抗心律失常肽基因的成熟肽段，即不包括信號肽段和在體內(nèi)加工時會被切去的最后三個氨基酸的基因片段設(shè)計引物，即蝎抗心律失常肽cDNA 64-79nt處設(shè)計PCR上游引物A1，5’-GCCGGATCCCCGATGACGATGACAAGGATGGATATATAAGA-3’含有BamHI限制性內(nèi)切酶酶切位點和小腸激酶酶切位點；根據(jù)蝎抗心律失常肽cDNA 226-246nt處設(shè)計下游引物A2，5’-GCCCTCGAGTCAACCGCATGTATTACTTTCAG-3’含有XohI限制性內(nèi)切酶酶切位點。由于PCR上游引物中含有小腸激酶酶切位點基因序列，這使得重組大腸桿菌表達(dá)獲得的融合蛋白谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-蝎抗心律失常肽中含有了小腸激酶酶切位點，從而通過小腸激酶酶切就可以分開谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和蝎抗心律失常肽，以獲得不含有額外氨基酸的蝎抗心律失常肽。
一種優(yōu)化的生產(chǎn)蝎抗心律失常肽的方法還包括1.用谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶親和層析柱對表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。
重組大腸桿菌BL21(pGEX/BmKIM)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-蝎抗心律失常肽，利用谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶親和層析柱進(jìn)行純化，可以有效地將融合蛋白與其它雜蛋白分離，融合蛋白掛在柱子上。
2.小腸激酶酶切融合蛋白得到具有抗心律失?；钚缘男剐穆墒Сｋ?。
被掛在柱子上的融合蛋白直接經(jīng)小腸激酶酶切，可以使融合蛋白中的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶與蝎抗心律失常肽分開，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶留在柱子上，蝎抗心律失常肽從親和層析柱中流出。最后，酶切產(chǎn)物通過Sephadex G-50脫鹽得到具有生物活性的蝎抗心律失常肽。
蝎抗心律失常肽在制備抗心律失常藥中的應(yīng)用。
利用基因工程方法生產(chǎn)的蝎抗心律失常肽在制備抗心律失常藥中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的蝎抗心律失常肽以及通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的蝎抗心律失常肽可以用于制備抗心律失常藥物。這種蝎抗心律失常肽可與藥學(xué)上可接受的載體，例如；賦形劑如葡萄糖、乳糖、甘露醇、甘氨酸、水等；填充劑如淀粉、蔗糖等；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、聚乙二醇等；吸收促進(jìn)劑如脫氧膽酸鈉、牛磺甘膽酸鹽、N-甲基吡咯烷酮、EDTA、Tween-80、SDS、Brij-78等；增粘劑如甲基纖維素、聚丙烯酰胺、玻璃酸鈉等或與其它治療抗心律失常藥物混合使用。本發(fā)明生產(chǎn)的蝎抗心律失常肽可以組合物的形式通過注射、眼結(jié)膜吸收、鼻吸入、皮膚吸收、直腸內(nèi)給藥的方式以水劑、固定劑或其它劑型使用。本發(fā)明生產(chǎn)的蝎抗心律失常肽可以與一種或多種載體混合，然后按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法將其制成所需的劑型。這種藥物組合物含有重量比可以為0.2％-97％的活性成分。
由于不同生產(chǎn)方法所得到的不同重組肽在功能上也必然有所差異。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法，所得到的重組蛋白質(zhì)有以下優(yōu)點和效果A、重組肽中不含由多個His氨基酸或其它氨基酸組成的額外片段，與由cDNA推測的成熟肽一至。B、所得到的重組肽是可溶的，非包涵體狀態(tài)而且產(chǎn)量高，產(chǎn)量為2mg蝎抗心律失常肽/L培養(yǎng)物。C、通過大白鼠癲癇模型證明所得到的重組肽無論在大白鼠表觀上、腦電圖上、還是腦的電鏡照片上都有十分有效的抗癲癇(神經(jīng)興奮)作用，可以延長癲癇發(fā)作時間47％。D、本發(fā)明所得到的重組肽不僅有抗癲癇(神經(jīng)興奮)作用而且具有十分明顯的抗心律失常的作用，可以增加誘發(fā)心律失常所需烏頭堿的用量50％-100％。


圖1為SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳圖。第一列為沒有誘導(dǎo)的重組大腸桿菌的總蛋白，第二列為IPTG誘導(dǎo)了的重組大腸桿菌的總蛋白，第三列為蛋白質(zhì)標(biāo)記，分別是31，20，16，14，6.3，3.5KDα，第四列為通過谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶親和層析柱純化得到的融合蛋白谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-蝎抗心律失常肽，第五列為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，第六列為小腸激酶酶切后的融合蛋白，第七列為純化的蝎抗心律失常肽。
圖2為重組蝎抗心律失常肽與其它兩種蝎毒多肽的圓二色譜圖。BmKIM為蝎抗心律失常肽，AaHIT2為一種α型蝎毒多肽，CssII為一種β型蝎毒多肽。
圖3為全細(xì)胞電壓膜片鉗記錄的鈉通道電流圖。A為對照，B為加入重組蝎抗心律失常肽后的心室細(xì)胞鈉通道電流。
圖4為重組肽作用癲癇大鼠的腦電圖。A圖為腦內(nèi)注射重組肽后再注射至癲劑的腦電圖；B圖為腦內(nèi)注射生理鹽水后再注射至癲劑的腦電5為重組肽作用癲癇大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)電鏡圖。A圖為腦內(nèi)注射重組肽后再注射至癲劑的大鼠腦海馬超微結(jié)構(gòu)電鏡圖；B圖為腦內(nèi)注射生理鹽水后再注射至癲劑的大鼠腦電圖。
NaCl 9mg制備方法將活性成分和氯化鈉溶解于1升注射水中，過濾所得溶液，在無菌條件下裝入安瓿瓶中。
權(quán)利要求
1.一種蝎抗心律失常肽，其特征是，該活性肽的氨基酸序列如下DGYIRGSNGCLWGNEGCNKECKGFGYCWTWGLACWCEGLTWKSESNTCG。
2.一種實現(xiàn)權(quán)利要求1的蝎抗心律失常肽的制備方法，包括下列步驟設(shè)計PCR引物，用PCR從東亞鉗蝎蝎毒cDNA庫中擴(kuò)增抗心律失常肽基因片段，并通過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá)，設(shè)計的PCR上游引物含小腸激酶酶切位點，用PCR擴(kuò)增的抗心律失常肽基因片段經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切，克隆到pGEX-5x-1表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中獲得重組大腸桿菌BL21(pGEX/BmKIM)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶親和層析柱純化，用小腸激酶酶切表達(dá)所得的融合蛋白，并脫鹽而得到可溶的抗心律失常肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蝎抗心律失常肽的制備方法，其特征是PCR上游引物A1，5’-GCCGGATCCCCGATGACGATGACAAGGATGGATATATAAGA-3’，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶酶切位點和小腸激酶酶切位點；PCR下游引物A2，5’-GCCCTCGAGTCAACCGCATGTATTACTTTCAG-3’該引物含有XohI限制性內(nèi)切酶酶切位點；用PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物經(jīng)BamHI和XohI酶切后克隆到pGEX-5x-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組大腸桿菌BL21(pGEX/BmKIM)、用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶親和層析柱純化，用小腸激酶對融合蛋白進(jìn)行酶切獲得可溶性的抗心律失常肽。
4.權(quán)利要求1所述的蝎抗心律失常肽在制備抗心律失常藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蝎抗心律失常肽及其制備方法和應(yīng)用,該活性肽的氨基酸序列為GYIRGSNGCLWGNEGCNKECKGFGYCWTWGLACWCEGLTWKSESNTCG。制備蝎抗心律失常肽包括設(shè)計PCR引物,用PCR從東亞鉗蝎蝎毒cDNA庫中擴(kuò)增抗心律失常肽基因片段,并通過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá),其特征是:設(shè)計的PCR上游引物含小腸激酶酶切位點,用PCR擴(kuò)增的抗心律失常肽基因片段經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切,克隆到pGEX－5x－1表達(dá)載體中,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中獲得重組大腸桿菌BL21(pGEX/BmKIM),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,經(jīng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶親和層析柱純化,用小腸激酶酶切表達(dá)所得的融合蛋白,并脫鹽而得到可溶的抗心律失常肽。本發(fā)明具有高效抗心律失?；钚?所得到的重組肽是可溶性的,而且產(chǎn)量高,可在制備抗心律失常肽藥中廣泛應(yīng)用。
文檔編號C07K14/435GK1379042SQ0211548
公開日2002年11月13日 申請日期2002年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月30日
發(fā)明者李文鑫, 彭方, 曾憲春, 何小華, 朱順義 申請人:武漢大學(xué)