專利名稱：生產(chǎn)高活性銀杏葉提取物的萃取劑及其提取與分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取技術(shù)領(lǐng)域，發(fā)明涉及一種以銀杏葉為原料生產(chǎn)銀杏葉提取物的萃取劑和水提取方法，并包括一種對銀杏酚酸含量進行定量分析的方法。
背景技術(shù)：
銀杏葉提取物在治療上已經(jīng)使用30余年了，目前在國內(nèi)外市場上有眾多以銀杏葉提取物為主要成份的藥品和保健食品，如天保寧、銀可絡(luò)、Tanakan、Tebonin、銀杏茶等，是預(yù)防和治療心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的有效植物藥。用于上述目的的銀杏葉提取物的特征在于其成份中含有22％-27％黃酮甙、5％-7％萜內(nèi)酯(銀杏內(nèi)酯A、B、C 2.8％-3.4％；白果內(nèi)酯2.6％-3.2％)、且銀杏酚酸在5mg/kg以下。
銀杏葉提取物的生產(chǎn)工藝有很多，國外多采用有機溶劑法，有代表性的工藝是德國Schwabe公司的一系列專利DE2117419、DE1767098、DE3940092；以及意大利Indena公司的專利工藝EP0360556，這些工藝的共同特點是生產(chǎn)過程中使用大量的有機溶劑，如丙酮、乙醇、四氯化碳、正己烷、甲乙酮、正丁醇等，工藝的優(yōu)點是產(chǎn)品質(zhì)量好且穩(wěn)定，缺點是生產(chǎn)成本極高，生產(chǎn)工藝安全性差、對環(huán)境影響大。
國內(nèi)生產(chǎn)銀杏葉提取物多采用溶劑(乙醇或甲醇、丙酮)提取，結(jié)合樹脂塔精制的工藝方法，如CN1116532A、CN1145320A，與國外工藝比較雖然大大減少了有機溶劑使用的種類，但由于在提取階段使用的溶劑量甚大，且回收率低，因此生產(chǎn)成本仍然較高，且存在產(chǎn)品中銀杏酚酸嚴重超標、水溶解性差的問題。
中國發(fā)明專利公開號CN1172669A和CN 1322723A的專利申請中分別涉及了用超臨界和亞臨界二氧化碳萃取法生產(chǎn)銀杏葉提取物的方法，由于高壓工藝上的限制，該方法多用于實驗性和小規(guī)模生產(chǎn)，難以實現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
銀杏酚酸是銀杏葉及其提取物中的致敏性有害成分，系一類碳數(shù)和飽和度不同的長鏈烴基酚酸，也是銀杏葉提取物及其藥物制劑引起臨床不良反應(yīng)的主要物質(zhì)。國際醫(yī)藥市場對其限量要求極為嚴格，是影響EGb產(chǎn)品質(zhì)量和出口外銷的最關(guān)鍵限量指標之一。
目前，國內(nèi)外對銀杏葉及其提取物質(zhì)量控制的研究僅集中在黃酮和萜內(nèi)酯等有效成分的分析上，而對于銀杏酚酸分析方法的研究報道極少。意大利報道了銀杏酚酸的超臨界流體萃取分離和毛細管氣相色譜/質(zhì)譜鑒定，該方法的優(yōu)點是干擾少，能對多種銀杏酚酸進行分離鑒定，但樣品前處理操作繁瑣、費時，不能用于微量樣品的定量分析。國內(nèi)報道了銀杏酸的超臨界流體萃取分離和高效液相色譜測定，同樣也存在上述問題，而且各銀杏酸之間不能很好分離。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，研制一種萃取劑和以水浸提法代替現(xiàn)有溶劑法生產(chǎn)銀杏葉提取物的方法，本發(fā)明的萃取劑及其工藝具有提取工藝簡便、提取率高、產(chǎn)品中活性成分含量高而銀杏酚酸含量低、能耗低、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品質(zhì)量好、對環(huán)境影響小的優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種用于生產(chǎn)高活性銀杏葉提取物的萃取劑按w/w的成份和配比為亞硫酸鹽或亞硫酸氫鹽 0.001-0.5水補充至100pH值 2.0-5.5經(jīng)優(yōu)化的萃取劑按w/w的成份和配比為亞硫酸鹽或亞硫酸氫鹽 0.04-0.2水補充至100pH值 3.5-5.5所述的萃取劑從亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉中選擇。
一種生產(chǎn)高活性銀杏葉提取物的工藝，所述的工藝包括以下步驟(1)在待處理的銀杏葉中加入所述的萃取劑，該萃取劑從亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉中選擇，添加量按w/w比例為0.001-0.5，并補充水至100。
(2)按w/w，將干凈的銀杏葉按原料與萃取劑之比為1∶5-20，投料浸提萃取，浸提溫度30-100℃，處理30分鐘-20小時，浸提過程中間歇攪拌原料，控制降溫速度1-10℃/小時，然后留取料液，再加入5-20倍于銀杏葉的萃取劑進行第二次提取，合并兩次料液；(3)將步驟(2)得到的料液過濾，去200目以下的雜質(zhì)，料液冷卻至30℃以下；(4)將步驟(3)得到的料液流經(jīng)樹脂吸附柱精制純化，用水洗滌去除雜質(zhì)后，再用30％-95％的低級醇沖洗樹脂柱，得到洗脫液；(5)將步驟(4)所述的洗脫液在溫度50℃以下真空濃縮，回收溶劑，得到濃縮液；(6)將步驟(5)得到的濃縮液干燥，和(7)將步驟(6)得到的產(chǎn)品采用反相高效液相色譜法定量分析銀杏黃酮、萜內(nèi)酯和銀杏酚酸。
所述的步驟(1)中的的萃取劑從亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉中選擇，其添加量按w/w比例為0.04-0.2，并補充水至100。
所述的生產(chǎn)原料可以是銀杏鮮葉或經(jīng)干燥的銀杏葉，所述的葉不需要經(jīng)過粉碎。
所述的工藝還包括從步驟(1)到步驟(6)均在密閉容器內(nèi)進行。
所述的工藝還包括(1)步驟(4)中的精制柱為大孔樹脂柱；(2)步驟(4)中的低級醇為乙醇或甲醇，和
(3)將步驟(5)得到的醇洗脫液在真空條件下濃縮。
所述的生產(chǎn)工藝采用冷凍干燥或噴霧干燥或真空干燥將步驟(6)得到的濃縮液進行干燥。
所述的銀杏酚酸液相色譜法的流動相按v/v組成為甲醇或乙晴或四氫呋喃70-90水 30-10添加銀離子至0.005-0.05 mol.L-1pH調(diào)整為3.5更詳細的技術(shù)方案如下所述一、浸提將干凈的銀杏葉按原料與萃取劑之比為1∶5-20(w/w)投料置提取罐中，浸提溫度30-100℃，提取時間30分鐘-20小時，浸提過程中，每小時間歇攪拌原料2-3次，每次0.5-5分鐘，提取過程結(jié)束時，料液溫度控制在45℃以下，濾出料液。向殘余銀杏葉中加入5-15倍的萃取劑進行第二次提取，過程同上，合并兩次料液，待溫度降到40℃以下后，精濾，去除200目以下的雜質(zhì)；二、精制將步驟一得到的料液泵入已再生好的大孔樹脂吸附柱上，用20-40倍柱體積的自來水洗滌去除雜質(zhì)后，用2-5倍的去離子水過柱，再用30％-95％的低級醇溶液沖洗樹脂吸附柱，收集醇洗脫液；三、濃縮醇洗脫液在50℃以下真空濃縮，回收溶劑，得到銀杏葉提取物的濃縮液；四、干燥將步驟三得到的銀杏葉提取物的濃縮液干燥。
五、質(zhì)檢依照國際公認的檢驗方法和標準進行，其中銀杏酚酸的檢驗(尚無公認方法)方法如下準確稱取0.5-2.0g左右的銀杏葉提取物，分次加入體積分數(shù)小于10％的酸性甲醇溶液10-15ml溶解，隨后加入5-8ml正己烷、石油醚或苯萃取三次，分別收集上層有機相，合并，濃縮后的殘留物以氯仿或乙醇溶解后供高效液相色譜分析。該方法平均回收率97.3％，精密度RSD為1.6％，最低檢測限26ng(S/N＝3)。各銀杏酚酸之間的分離因子均大于1.3，分離度均大于1.5(色譜圖見附圖2及圖3)。各種銀杏酚酸的定性通過SIMS、LC/(-)ESI-MS鑒定(見附圖4、圖5)。
色譜柱為中國科學院大連化學物理研究所KF-C18 ODS(250mm×4.6mm，7μm)或Waters C18 ODS(150mm×2.1mm，5μm)，流動相組成為甲醇或乙晴或四氫呋喃70-90水 30-10添加銀離子至濃度為 0.005-0.05 mol.L-1pH調(diào)整為3.5柱溫25-40℃
檢測波長310nm流速0.8-1.0ml.min-1在上述工藝中，原料銀杏葉可以是鮮葉，也可用經(jīng)干燥處理的銀杏葉，與其它工藝不同的是，銀杏葉不需要經(jīng)過粉碎。
在上述工藝中，原料浸提至醇洗脫液濃縮，均在密閉的陶瓷或不銹鋼容器內(nèi)進行。
在上述工藝中，精制純化所使用的吸附柱為對銀杏黃酮和萜內(nèi)酯有選擇性吸附的大孔樹脂柱，如D101、SH-03、NKA-9、ADS-17等。洗脫用的低級醇可以是乙醇或甲醇，推薦使用70％的乙醇。
在上述工藝中，可以采用冷凍干燥或噴霧干燥或真空干燥對銀杏葉提取物的濃縮液進行干燥。為了使產(chǎn)品有更好的內(nèi)在質(zhì)量和外觀，建議采用冷凍干燥。
經(jīng)過長期工業(yè)化生產(chǎn)總結(jié)，采用本發(fā)明的工藝方法生產(chǎn)銀杏葉提取物，產(chǎn)品收得率為2.8％-4.2％(與原料銀杏葉的質(zhì)量相關(guān))，生產(chǎn)周期為40-50小時，每生產(chǎn)1公斤銀杏葉提取物，乙醇消耗量低于5公斤。
采用本發(fā)明工藝方法生產(chǎn)的銀杏葉提取物，產(chǎn)品的主要質(zhì)量指標能穩(wěn)定地達到如下標準總黃酮甙≥24.0％(高效液相色譜法)；總萜內(nèi)酯≥6.0％(高效液相色譜法，其中白果內(nèi)酯≥2.4％)；原花青素≥8％；銀杏酚酸≤5ppm(銀化高效液相色譜法)；無萃取劑和醇殘留；水中溶解度≥5％。
研究證明本發(fā)明所使用的萃取劑能明顯提高銀杏葉中黃酮甙和萜內(nèi)酯溶出率，同時抑制銀杏酚酸等雜質(zhì)溶出的功能(見附圖2和圖3測定結(jié)果)，而且提取料液只需經(jīng)過過濾便可直接上樹脂吸附柱精制純化，比有機溶劑提取法減少了回收溶劑和原料粉粹的過程，因此大大降低了能源和溶劑的消耗，生產(chǎn)成本也隨之大幅度下降。
通過實驗證明，本發(fā)明的萃取劑中的水若被含水甲醇、含水乙醇、含水丙酮替代，也有同樣好的效果，但生產(chǎn)成本又將上升。
以下結(jié)合實例，對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但并不說明本發(fā)明僅限于此范圍。


圖1本發(fā)明的銀杏葉提取物中銀杏酚酸(Ginkgolic acids，GA)的結(jié)構(gòu)；圖2本發(fā)明實施例1生產(chǎn)的銀杏葉提取物中銀杏酚酸(Ginkgolic acids，GA)色譜中1代表GA151，2代表G A130，3代表GA171，銀杏酚酸總含量3.7ppm；圖3對比技術(shù)(醇提法)生產(chǎn)的銀杏葉提取物中銀杏酚酸(Ginkgolic acids，GA)色譜圖；圖中1代表GA151，2代表G A130，3代表GA171，4代表GA150，銀杏酚酸總含量313.7ppm；圖4銀杏酚酸的選擇離子LC/(-)ESI-MS圖；圖5銀杏酚酸的Negative SIMS圖。
圖中m/z 319.2281代表GA130，m/z 275.2379代表與GA130對應(yīng)的銀杏酚，m/z 345.2433代表GA151，m/z 301.2537代表與GA151對應(yīng)的銀杏酚，m/z347.2596代表GA150，m/z 303.2693代表與GA150對應(yīng)的銀杏酚，m/z 373.2756代表GA171。
具體實施例方式
實施例1萃取劑的成分及配比(按份量計算)亞硫酸氫鈉10kg；自來水8000kg；pH5.0。
將干燥的銀杏葉300kg清潔干凈，濾水，投入提取罐，加入94℃的萃取劑5000kg，加蓋密閉，升高提取罐內(nèi)溫度使之達到97℃，并保持1個大氣壓，每半小時攪拌1分鐘，控制罐內(nèi)溫度每小時下降2.5℃，浸提16小時后，濾出料液4400kg。再向提取罐中加入3000kg萃取劑溶液，進行第二次浸提，10小時后濾出料液3100kg，合并兩次料液用離心過濾機粗濾出20目以下雜質(zhì)，砂濾機精濾出200目以下雜質(zhì)，并將料液冷卻到30℃。
將料液以1500kg/小時流量流過NKA-9樹脂吸附柱，然后用水洗下不被吸附或吸附較小的雜質(zhì)，換2倍柱體積去離子水洗滌，再用70％的乙醇沖洗樹脂吸附柱，收得乙醇洗脫液1500kg，在43℃溫度下采用三效濃縮塔濃縮乙醇洗脫液20倍，濃縮液采用冷凍干燥，得到產(chǎn)品9.8kg。
檢驗結(jié)果總黃酮甙28.1％，總萜內(nèi)酯9.4％，原花青素10.6％，銀杏酚酸3.7ppm(見附圖2)，水中溶解度7.7％實施例2萃取劑的組成及配比(按份量計算)亞硫酸鈉5kg；水6000kg；pH為5.5。
取干燥的銀杏葉(湖北安陸)300kg清潔干凈，濾水，投入提取罐，加入93℃萃取劑4000kg，加蓋密閉，每半小時攪拌3分鐘，浸提10小時后，罐內(nèi)溫度降至60℃，濾出料液，加入2000kg萃取劑作第二次提取，6小時后過濾，合并兩次提取液共5600kg，料液用離心過濾機粗濾，砂濾機精濾，并冷卻至35℃；仍采用實施例1中的樹脂柱精制，收集乙醇洗脫液1300kg，濃縮至40kg后，采用噴霧干燥得9.02kg淡黃色銀杏葉提取物。
檢驗結(jié)果總黃酮甙27.6％，總萜內(nèi)酯8.1％，原花青素9.6％，銀杏酚酸4.8ppm，水中溶解度5.7％實施例3萃取劑組成成份及配比(按份量計算)亞硫酸氫鈉9kg；自來水4500kg；pH4.8。
取剛采摘的銀杏鮮葉600kg(含水量72％)、萃取劑3000kg一并投入提取罐，控制溫度70℃，每小時間歇攪拌10分鐘，浸提20小時后，濾出料液，以1500kg萃取劑再作20小時的第二次提取，兩次提取液合并后過濾，濾液4400kg三小時流過ADS-17樹脂吸附柱，依此用6000kg自來水，1000kg去離子水洗柱后，以70％乙醇洗脫，乙醇洗脫液濃縮至20kg后，采用冷凍干燥，可得產(chǎn)品4.81kg。
檢驗結(jié)果總黃酮甙36.0％，總萜內(nèi)酯12.8％，原花青素12.5％，銀杏酚酸2.6ppm，水中溶解度8.1％。
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)高活性銀杏葉提取物的萃取劑，其特征在于所述的萃取劑按w/w的成份和配比為亞硫酸鹽或亞硫酸氫鹽0.001-0.5水 補充至100pH值 2.0-5.5
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的萃取劑，其特征在于所述的萃取劑按w/w的成份和配比為亞硫酸鹽或亞硫酸氫鹽 0.04-0.2水補充至100pH值 3.5-5.5
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的萃取劑，其特征在于所述的萃取劑從亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉中選擇。
4.一種生產(chǎn)高活性銀杏葉提取物的工藝，其特征在于所述的工藝包括以下步驟(1)在待處理的銀杏葉中加入所述的萃取劑，該萃取劑從亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉中選擇，添加量按w/w比例為0.001-0.5，并補充水至100。(2)按w/w，將干凈的銀杏葉按原料與萃取劑之比為1∶5-20，投料浸提萃取，浸提溫度30-100℃，處理30分鐘-20小時，浸提過程中間歇攪拌原料，控制降溫速度1-10℃/小時，然后留取料液，再加入5-20倍于銀杏葉的萃取劑進行第二次提取，合并兩次料液；(3)將步驟(2)得到的料液過濾，去200目以下的雜質(zhì)，料液冷卻至30℃以下；(4)將步驟(3)得到的料液流經(jīng)樹脂吸附柱精制純化，用水洗滌去除雜質(zhì)后，再用30％-95％的低級醇沖洗樹脂柱，得到洗脫液；(5)將步驟(4)所述的洗脫液在溫度50℃以下真空濃縮，回收溶劑，得到濃縮液；(6)將步驟(5)得到的濃縮液干燥，和(7)將步驟(6)得到的產(chǎn)品采用反相高效液相色譜法定量分析銀杏黃酮、萜內(nèi)酯、原花青素和銀杏酚酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的步驟(1)中的的萃取劑從亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉中選擇，其添加量按w/w比例為0.04-0.2，并補充水至100。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的生產(chǎn)原料可以是銀杏鮮葉或經(jīng)干燥的銀杏葉，所述的葉不需要經(jīng)過粉碎。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的工藝還包括從步驟(1)到步驟(6)均在密閉容器內(nèi)進行。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的工藝還包括(1)步驟(4)中的精制柱為大孔樹脂柱；(2)步驟(4)中的低級醇為乙醇或甲醇，和(3)將步驟(5)得到的醇洗脫液在真空條件下濃縮。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于，采用冷凍干燥或噴霧干燥或真空干燥將步驟(6)得到的濃縮液進行干燥。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的銀杏酚酸液相色譜法的流動相按v/v組成為甲醇或乙晴或四氫呋喃70-90水 30-10添加銀離子至0.005-0.05mol.L-1pH調(diào)整為3.全文摘要
本發(fā)明具體涉及從銀杏葉中提取銀杏葉提取物的萃取劑、提取工藝及測試方法。發(fā)明的關(guān)鍵是創(chuàng)制一種新的萃取劑，采用水提法提取銀杏黃酮和EGb，工藝中無需增加去除銀杏酚酸的步驟。還包括一種利用次級化學平衡定量分析銀杏酚酸的高效液相色譜法。產(chǎn)品總黃酮甙24％－32％，總萜內(nèi)酯6％－13％，原花青素8－14％，銀杏酚酸含量小于5毫克/千克，得率為2.8％－3.6％。萃取劑成本低，用量小，無殘留?？擅黠@提高銀杏葉中黃酮類和萜內(nèi)酯及原花青素類化合物的溶出率并抑制銀杏酚酸的溶出。
文檔編號C07H17/00GK1436784SQ0211553
公開日2003年8月20日 申請日期2002年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月7日
發(fā)明者胡慰望, 謝筆鈞, 楊爾寧, 何靜仁 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學