專利名稱：一種從銀杏葉提取物中分離純化ga、gb和白果內(nèi)酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種銀杏內(nèi)酯A、B和白果內(nèi)酯的方法，具體為一種從銀杏葉提取物中分離純化GA、GB和白果內(nèi)酯的方法。
背景技術(shù)：
銀杏葉提取物在促進(jìn)循環(huán)系統(tǒng)的血小板活化、抗氧化作用、抗衰老功能、抗老年性癡呆和眼部視網(wǎng)膜病變等方面發(fā)揮了重要作用，被視為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心腦血管疾病的雙跨性藥物。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，至2010年8月，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局已頒發(fā)銀杏葉提取物藥物及復(fù)合制劑生產(chǎn)批文140多個(gè)，生產(chǎn)廠家有100多家。當(dāng)今世界市場(chǎng)上銀杏葉制品的年銷售額達(dá)60億美元以上，已成為植物藥的全球冠軍品種，銀杏葉制劑成為治療心腦血管疾病的領(lǐng)先品種。銀杏葉提取物中二萜內(nèi)酯有銀杏內(nèi)酯，主要有銀杏內(nèi)酯A、B、C、M、J和白果內(nèi)酯，簡(jiǎn)稱GA、GB、GC、GM、GJ和BB等。銀杏內(nèi)酯具有專屬性的抗血小板活化因子(plateletactivating factor. PAF)活性,是天然的PAF拮抗劑,其中尤以GB的活性最高。GB已引起了國(guó)際藥學(xué)界的廣泛關(guān)注，有望成為治療休克、燒傷、過(guò)敏性哮喘、中風(fēng)、移植排斥、血液透析等病癥的一類新藥，目前在法國(guó)、英國(guó)等國(guó)家已經(jīng)分別進(jìn)入II和III期臨床。白果內(nèi)酯(BB)用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如肌肉萎縮、肌攣、輕癱、表層和深部感覺(jué)障礙、頭痛、頭暈、視力、聽(tīng)力、記憶障礙等。文獻(xiàn)報(bào)道的銀杏內(nèi)酯單體分離純化方法主要有乙醇提取一乙酸乙酯萃取一柱色譜分離法、乙醇提取一乙酸乙酯萃取一反相色譜分離法、色譜分離一重結(jié)晶法、超臨界液體萃取法等。

GA、GB和BB分離純化方法直接相關(guān)的授權(quán)發(fā)明專利或申請(qǐng)專利主要有如下(I)中國(guó)專利(ZL00117758. 3) “由銀杏葉或銀杏葉浸膏制備藥物銀杏內(nèi)酯A、B的方法”，該發(fā)明涉及一種由銀杏葉或銀杏葉浸膏制備藥物銀杏內(nèi)酯A、B的方法，它是以銀杏葉或銀杏葉浸膏為原料，經(jīng)加入乙醇、或甲醇、或丙酮、或丁酮、或乙酸乙酯有機(jī)溶劑浸取，浸取液經(jīng)過(guò)濾、靜置分層，得到的有機(jī)相進(jìn)行去雜質(zhì)處理，再靜置分層得到的有機(jī)相經(jīng)濃縮、干燥得到富集銀杏內(nèi)酯A和B的濃縮物，采用制備液相色譜對(duì)含有銀杏內(nèi)酯A和B的濃縮物進(jìn)行分離后處理，得到GA和GB，其特征在于在加入浸取劑的同時(shí)加入氯化物鹽析劑；去雜質(zhì)過(guò)程是向浸取液的有機(jī)層液加入鉀鹽或鈉鹽；制備型液相色譜的分離柱的流動(dòng)相是采用乙酸乙酯和石油醚的混合液，固定相采用硅膠。該方法用制備型色譜分離GA和GB，生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量小，不適合規(guī)?；笊a(chǎn)等缺點(diǎn)。(2)中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)?00710050245)“從銀杏葉中提取分離銀杏內(nèi)酯B的方法”，該發(fā)明涉及從銀杏葉中提取分離銀杏內(nèi)酯B的方法，其步驟如下1)取銀杏葉，用由高到低不同濃度的乙醇進(jìn)行提取，合并提取液，回收乙醇，得到濃縮后的提取液；2)向濃縮后的提取液中加入乙酸乙酯萃取，回收有機(jī)相后濃縮至浸膏；3)將步驟2)所得浸膏稀釋后上選擇性極性無(wú)孔吸附樹(shù)脂柱，用乙醇洗脫，所得洗脫液回收乙醇后，再用乙醇結(jié)晶得到銀杏內(nèi)酯類化合物；4)將銀杏內(nèi)酯類化合物結(jié)晶上硅膠柱，用正己烷和乙酸乙酯的混合液洗脫，收集洗脫液，得到富集銀杏內(nèi)酯B的洗脫液；5)回收步驟4)中收集的洗脫液中的溶劑，再用乙醇結(jié)晶，得到銀杏內(nèi)酯B。該方法用工藝路線醇提一萃取一樹(shù)脂純化一結(jié)晶一硅膠柱分離一結(jié)晶等步驟，工藝路線復(fù)雜，且只分離得到GB。(3)中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)?01010608847.X) “一種從銀杏內(nèi)酯混合物中分離銀杏內(nèi)酯B的方法”，該發(fā)明公開(kāi)了一種從銀杏內(nèi)酯混合物中分離銀杏內(nèi)酯B的方法，該方法以離子液體或者由離子液體水組成的二元混合溶劑為萃取劑，采用分餾萃取法高效地從含有銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C等銀杏內(nèi)酯同系物的混合物中分離銀杏內(nèi)酯B。該方法是以銀杏內(nèi)酯混合物為原料，采用分餾萃取法分離銀杏內(nèi)酯B。(4)中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)?00410061284.1) “銀杏葉中銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯的提取方法”，該發(fā)明公開(kāi)了一種銀杏葉中銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯的提取方法。將銀杏葉烘干、去雜、粉碎，用乙醇水溶液提取，上吸附柱去雜質(zhì)，然后用乙酸乙酯萃取出銀杏內(nèi)酯，上氧化鋁柱純化，分步結(jié)晶及重結(jié)晶，獲得較純的銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯。(5)中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)?00610014207. X)“銀杏內(nèi)酯的制備方法”，該發(fā)明公開(kāi)了一種銀杏內(nèi)酯的制備方法，按順序包括如下步驟(1)取銀杏葉粗提物，粉碎，加醋酸乙酯攪拌萃取，濾過(guò)，濾液回收醋酸乙酯至盡，干燥，得銀杏內(nèi)酯粗提物；(2)取銀杏內(nèi)酯粗提物，粉碎，用乙醇充分溶解，溶液上酸性氧化鋁柱，收集流出液，再用乙醇洗脫，收集洗脫液，合并流出液和洗脫液，減壓濃縮，結(jié)晶得銀杏內(nèi)酯晶體混合物；(3)將銀杏內(nèi)酯晶體混合物用少量乙醇洗滌，濾過(guò)，再重結(jié)晶，即得銀杏內(nèi)酯混合晶體。本發(fā)明方法的工藝路線合理，成品獲得率高，不會(huì)破壞有效成分，可獲得高純度的銀杏內(nèi)酯A和銀杏內(nèi)酯B混合晶體。(6)中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)?00710106040.4) “一種從銀杏葉或銀杏葉提取物中提取銀杏內(nèi)酯B的制備方法”，該發(fā)明涉及從銀杏葉或銀杏葉提取物中提取銀杏內(nèi)酯B的制備方法，包括下列步驟一、原料的選擇及處理(I)、銀杏浸膏(總黃酮24%、總內(nèi)酯6%，15-25婆美度)；(2)、銀杏提取物(粉末總黃酮24%、總內(nèi)酯6% )，用適量(1-2倍體積)純凈水溶解后，待用；(3)、新 鮮、干燥的銀杏綠葉，烘干，溫度控制在70°C，去雜、粉碎，過(guò)60目篩，用60%乙醇提取2次，每次60-90分鐘，合并提取液，減壓濃縮，回收乙醇；濃縮液加2倍的水，沉淀24小時(shí)，離心，取上清液上HP-20吸附柱，先用水沖洗，然后用80%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮。二、高速逆流萃取1)將銀杏浸膏或濃縮后的提取液導(dǎo)入萃取塔內(nèi)，從塔底均勻加入乙酸乙酯進(jìn)行對(duì)流溶劑萃取，乙酸乙酯用量一般為藥液的1. 5 2. 5倍，循環(huán)次數(shù)為4 5次，不同塔體，分開(kāi)收集；2)將萃取后的乙酸乙酯進(jìn)行回收，得到稠膏，濃縮至20-25婆美度，65-70°C真空干燥、粉碎到90-100目，得到銀杏內(nèi)酯產(chǎn)品；三、柱層析、重結(jié)晶1)將得到的銀杏內(nèi)酯，用75-85%乙醇溶解后，通過(guò)80-120目的聚酰胺柱，收集流出液；2)將流出液再通過(guò)型號(hào)為HP-20的大孔樹(shù)脂柱，然后，用去離子水清洗樹(shù)脂至流出液體為無(wú)色，再用濃度為75-85%的乙醇溶液洗脫，當(dāng)流出液顏色接近無(wú)色時(shí)，停止洗脫，收集洗脫液，濃縮至20-25婆美度的浸膏；3)將浸膏置于4°C以下環(huán)境冷藏，靜置后，逐漸有晶體析出，3小時(shí)后，收集結(jié)晶，抽濾，再用75-85 %乙醇溶解結(jié)晶，重結(jié)晶，重結(jié)晶兩次后，將白色沉淀真空烘干至恒重，得銀杏內(nèi)酯B產(chǎn)品，含量可達(dá)95 %以上。(7)中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)?00710050242.1) “從銀杏葉中提取分離銀杏內(nèi)酯A、B、C、J及白果內(nèi)酯單體的方法”，該發(fā)明將公開(kāi)一種從銀杏葉中提取分離銀杏內(nèi)酯A、B、C、J及白果內(nèi)酯單體的方法，其步驟為1)取銀杏葉，用由高到低不同濃度的乙醇進(jìn)行提取，合并提取液，回收乙醇，得到濃縮后的提取液；2)向濃縮后的提取液中加入乙酸乙酯萃取，回收有機(jī)相后濃縮至浸膏；3)將浸膏稀釋后上選擇性極性無(wú)孔吸附樹(shù)脂柱，用乙醇洗脫，所得洗脫液回收乙醇后，用乙醇結(jié)晶得銀杏內(nèi)酯類化合物；4)將銀杏內(nèi)酯類化合物結(jié)晶上硅膠柱，用正己烷和乙酸乙酯的混合液洗脫，分段收集洗脫液，依次分別得到白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C和銀杏內(nèi)酯J ;5)回收收集的洗脫液中的溶劑，再用乙醇結(jié)晶分別得到白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C和銀杏內(nèi)酯J單體。(8)中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)?00810024206.2) “一種銀杏內(nèi)酯B原料及其制備方法”，該發(fā)明公開(kāi)了一種銀杏內(nèi)酯B原料，其特征在于該銀杏內(nèi)酯B原料是通過(guò)以下方法制備得到的取銀杏葉或銀杏葉提取物，在鹽酸溶液中浸煮，浸煮液過(guò)濾后采用有機(jī)溶劑萃取，得到的萃取液濃縮后添加100 200目硅膠混合干燥，采用硅膠柱層析法收集富含銀杏內(nèi)酯B的洗脫液，經(jīng)結(jié)晶得到銀杏內(nèi)酯B原料；其中，銀杏內(nèi)酯B原料中銀杏內(nèi)酯B含量> 90%。(9)中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)?00910184916.6) “一種銀杏內(nèi)酯A、B單體的分離純化方法”，該發(fā)明以純度> 95%的銀杏總內(nèi)酯為起始原料，包括結(jié)晶分離、純化和干燥。所述的純化是用重結(jié)晶-超臨界C02萃取組合工藝進(jìn)行純化，首先對(duì)結(jié)晶分離得到的單體GA和GB分別用無(wú)水乙醇按1: 5 80的料液比重結(jié)晶至少三次，得到純度彡95%單體的GA和GB ;然后用超臨界C02萃取方法對(duì)純度> 95%的單體GA和GB分別萃取，萃取壓力10 lOOMpa，萃取溫度32 150°C。重復(fù)萃取一次，可制備純度彡99. 5%的單體GA和GB。以起始原料中單體量計(jì)，收率> 90%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷提供一種銀杏葉提取物中分離純化GA、GB和白果內(nèi)酯的方法。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，采用如下技術(shù)方案本發(fā)明從一種銀杏葉提取物中分離純化GA、GB和白果內(nèi)酯的方法，包括以下步驟I)乙酸乙酯萃取稱取銀杏葉提取物，加入銀杏葉提取物5 - 10倍量的水2(T50°C攪拌，然后加入銀杏葉提取物5 — 10倍量的乙酸乙酯萃取3 — 5次，合并乙酸乙酯萃取液，乙酸乙酯萃取液濃縮、干燥，所得乙酸乙酯萃取物進(jìn)行步驟2)，其中倍量指重量/體積比，下同；2)低碳醇一水混合溶劑浸提稱取乙酸乙酯萃取物，加入乙酸乙酯萃取物10 - 20倍量的低碳醇一水混合溶劑2(T50°C進(jìn)行浸提，過(guò)濾，所得不溶物(II)進(jìn)行步驟3)，所得醇浸提取液(I)進(jìn)行步驟4);3)硅膠柱層析分離純 化將不溶物(II)上硅膠柱，用石油醚或正己烷或環(huán)己烷與乙酸乙酯的混合溶劑進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，回收洗脫液中的溶劑，分別得到GA和GB ；4)白果內(nèi)酯結(jié)晶純化將醇浸提取液(I )濃縮至無(wú)醇、冷卻、過(guò)濾后得到母液，將母液濃縮至干后用3(Γ50%甲醇進(jìn)行結(jié)晶3飛次得白果內(nèi)酯。還包括步驟5):使用低碳醇一水混合溶劑對(duì)銀杏內(nèi)酯A和銀杏內(nèi)酯B分別進(jìn)行重結(jié)晶純化處理。
步驟2)低碳醇選自甲醇或乙醇。步驟2)低碳醇一水混合溶劑中，低碳醇含量為3(Γ70%。步驟3)石油醚的沸程為6(T90°C。步驟3)石油醚或正己烷或環(huán)己烷與乙酸乙酯的混合溶劑中，石油醚或正己烷或環(huán)己烷與乙酸乙酯的體積比為2 : 8 —4 : 6。步驟5)低碳醇選自甲醇或乙醇。步驟5)低碳醇一水混合溶劑中，低碳醇含量為3(Γ70%。本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明所分離純化銀杏內(nèi)酯Α、銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯的工藝路線簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。2.本發(fā)明分離純化所得銀杏內(nèi)酯Α、銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯的的純度大于98%。3.銀杏內(nèi)酯Α、銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯的轉(zhuǎn)移率大于80%，產(chǎn)品收率高，生產(chǎn)成本低。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明為從銀 杏葉提取物(黃酮含量> 24% ;內(nèi)酯含量> 6%)中分離純化銀杏內(nèi)酯Α、銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯，所得銀杏內(nèi)酯Α、銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯的純度> 98%。銀杏內(nèi)酯單體分離純化方法主要有乙酸乙酯萃取、大孔樹(shù)脂分離法、氧化鋁柱色譜柱、聚酰胺柱色譜法、硅膠柱色譜分離法、反相色譜分離法、重結(jié)晶法、超臨界液體萃取法等方法。本發(fā)明人多年對(duì)銀杏內(nèi)酯分離純化的研究積累，發(fā)現(xiàn)通過(guò)乙酸乙酯萃取、醇浸提、硅膠柱色譜法即可獲得高純度銀杏內(nèi)酯A和銀杏內(nèi)酯B，醇浸提液經(jīng)結(jié)晶和重結(jié)晶法可獲得白果內(nèi)酯。本發(fā)明的具體的技術(shù)方案為以銀杏葉提取物為原料通過(guò)以下工藝步驟分離純化GA、GB和白果內(nèi)酯1)乙酸乙酯萃??；2)低碳醇一水混合溶劑浸提，得醇浸提液(I )和不溶物(11);3)不溶物(II)硅膠柱層析分離得GA和GB ；4)醇浸提液(I )濃縮至無(wú)醇、冷卻，過(guò)濾，母液濃縮至干后用3(Γ50%甲醇進(jìn)行結(jié)晶3飛次可得白果內(nèi)酯，其具體工藝步驟如下I)乙酸乙酯萃取稱取銀杏葉提取物，加入5 — 10倍量(重量/體積比)水2(T50°C攪拌，然后加入5 - 10倍量(重量/體積比)乙酸乙酯萃取，萃取3 - 5次，合并乙酸乙酯萃取液，乙酸乙酯萃取液濃縮、干燥，所得乙酸乙酯萃取物進(jìn)行步驟2)；2)低碳醇一水混合溶劑浸提稱取乙酸乙酯萃取物，加入10 - 20倍量低碳醇一水混合溶劑2(T50°C進(jìn)行浸提，過(guò)濾，所得不溶物進(jìn)行步驟3)，所得醇浸提取液進(jìn)行步驟4)；3)硅膠柱層析分離純化將不溶物(II)上硅膠柱，用石油醚或正己烷或環(huán)己烷與乙酸乙酯的混合溶劑進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，回收洗脫液中的溶劑，分別得到GA和GB。4)白果內(nèi)酯結(jié)晶純化將醇浸提液(I )濃縮至無(wú)醇、冷卻，過(guò)濾，母液濃縮至干后用3(Γ50%甲醇進(jìn)行結(jié)晶3飛次得白果內(nèi)酯，其中步驟2)低碳醇選自甲醇或乙醇。其中步驟2)低碳醇一水混合溶劑中，低碳醇含量為3(Γ70%。其中步驟3)石油醚的沸程為6(T90°C。其中步驟3)石油醚或正己烷或環(huán)己烷與乙酸乙酯的混合溶劑中，石油醚或正己烷或環(huán)己烷與乙酸乙酯的體積比為2 : 8 — 4 : 6。在一個(gè)實(shí)施方案中，還包括步驟5):使用低碳醇一水混合溶劑對(duì)銀杏內(nèi)酯A和銀杏內(nèi)酯B分別進(jìn)行重結(jié)晶純化處理。其中步驟5)低碳醇選自甲醇或乙醇。其中步驟5)低碳醇一水混合溶劑中，低碳醇含量為3(Γ70%。實(shí)施例1 :取銀杏葉提取物IOOg (GA含量2. 1%，GB含量1. 2%, ΒΒ2. 5%)，加入500mL水50°C攪拌30min，然后加入500mL乙酸乙酯萃取，萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，乙酸乙酯萃取液濃縮、干燥，得乙酸乙酯萃取物15. 5g ;加入155mL70%乙醇50°C浸提I小時(shí)，過(guò)濾，濾餅干燥得不溶物4. 4g和醇浸提液150mL ;將不溶物用20mL乙酸乙酯溶解后用5gl00 — 200目硅膠拌樣，然后用200g200-300目的硅膠柱色譜分離，用石油醚一乙酸乙酯的混合溶劑8 2進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，回收洗脫液中的溶劑，分別得到GAl. 8g (純度98. 2%)，GBl. Og(純度98. 5%)。醇浸提液150mL6(TC減壓濃縮至40mL，冷卻至25°C，過(guò)濾，母液70°C減壓濃縮至干后，用30%甲醇反復(fù)結(jié)晶5次，得白果內(nèi)酯2. 3g (純度98. 2%)。實(shí)施例2 取銀杏葉提取物IOOg (GA含量2. 1%，GB含量1. 2%, BB2. 5%)，加入700mL水30°C攪拌30min，然后加入IOOOmL乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，乙酸乙酯萃取液濃縮、干燥，得乙酸乙酯萃取物16. 5g ;加入330mL70%乙醇20°C浸提I小時(shí)，過(guò)濾，濾餅干燥得不溶物4. 6g和醇浸提液310mL ;將不溶物用20mL乙酸乙酯溶解后用5gl00 — 200目硅膠拌樣，然后用200g200-300目的硅膠柱色譜分離，用石油醚一乙酸乙酯的混合溶劑3 7進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，回收洗脫液中的溶劑，分別得到GAl. 7g (純度98. 1%)，GB0. 98g(純度98. 3%)。醇浸提液31 0mL60°C減壓濃縮至IOOmL,冷卻至25°C，過(guò)濾，母液70°C減壓濃縮至干后，用40%甲醇反復(fù)結(jié)晶4次，得白果內(nèi)酯2. 2g (純度98. 4%)。實(shí)施例3:取銀杏葉提取物IOOg (GA 含量 2. 1%, GB 含量1. 2%, BB2. 5%)，加入 IOOOmL 水 20°C攪拌30min，然后加入IOOOmL乙酸乙酯萃取，萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，乙酸乙酯萃取液濃縮、干燥，得乙酸乙酯萃取物16. Og ;加入320mL30%乙醇50°C浸提I小時(shí)，過(guò)濾，濾餅干燥得不溶物4. 8g和醇浸提液300mL ;將不溶物用20mL乙酸乙酯溶解后用5gl00 — 200目硅膠拌樣，然后用200g200-300目的硅膠柱色譜分離，用石油醚一乙酸乙酯的混合溶劑4 6進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，回收洗脫液中的溶劑，分別得到GAl. 75g(純度98. 0%)，GB1. 05g(純度98. 1%)。醇浸提液300mL60°C減壓濃縮至70mL，冷卻至25°C，過(guò)濾，母液70°C減壓濃縮至干后，用40%甲醇反復(fù)結(jié)晶5次，得白果內(nèi)酯2. 2g (純度98. 1%)。實(shí)施例4 取銀杏葉提取物IOOg (GA含量2. 1%，GB含量1. 2%, BB2. 5%)，加入500mL水50°C攪拌30min，然后加入500mL乙酸乙酯萃取，萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，乙酸乙酯萃取液濃縮、干燥，得乙酸乙酯萃取物15. 5g ;加入155mL70%甲醇50°C浸提I小時(shí)，過(guò)濾，濾餅干燥得不溶物4. 4g和醇浸提液150mL ;將不溶物用20mL乙酸乙酯溶解后用5gl00 — 200目硅膠拌樣，然后用200g200-300目的硅膠柱色譜分離，用正己烷一乙酸乙酯的混合溶劑8 2進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，回收洗脫液中的溶劑，分別得到GAl. 83g(純度98. 4%), GBl. 02g(純度98. 1%)。醇浸提液150mL60°C減壓濃縮至45mL，冷卻至25°C，過(guò)濾，母液70°C減壓濃縮至干后，用40%甲醇反復(fù)結(jié)晶4次，得白果內(nèi)酯2. 3g (純度98. 0%)。實(shí)施例5 取銀杏葉提取物IOOg (GA含量2. 1%，GB含量1. 2%, BB2. 5%)，加入700mL水30°C攪拌30min，然后加入IOOOmL乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，乙酸乙酯萃取液濃縮、干燥，得乙酸乙酯萃取物16. 5g ;加入330mL70%甲醇20°C浸提I小時(shí)，過(guò)濾，濾餅干燥得不溶物4. 6g和醇浸提液320mL ;將不溶物用20mL乙酸乙酯溶解后用5gl00 — 200目硅膠拌樣，然后用200g200-300目的硅膠柱色譜分離，用環(huán)己烷一乙酸乙酯的混合溶劑4 6進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，回收洗脫液中的溶劑，分別得到GAl. 78g(純度98. 6%), GBO. 95g(純度98. 6%)。醇浸提液320mL60°C減壓濃縮至85mL，冷卻至25°C，過(guò)濾，母液70°C減壓濃縮至干后，用30%甲醇反復(fù)結(jié)晶4次，得白果內(nèi)酯2. 2g (純度98. 4%)。實(shí)施例6 取銀杏葉提取物IOOg (GA 含量 2. 1%, GB 含量1. 2%, BB2. 5%)，加入 IOOOmL 水 30°C攪拌30min，然后加入IOOOmL乙酸乙酯萃取，萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，乙酸乙酯萃取液濃縮、干燥，得乙酸乙酯萃取物16. Og ;加入320mL30%甲醇50°C浸提I小時(shí)，過(guò)濾，濾餅干燥得不溶物4. 8g和醇浸提液300mL ;將不溶物用20mL乙酸乙酯溶解后用5gl00 — 200目硅膠拌樣，然后用200g200-300目的硅膠柱色譜分離，用正己烷一乙酸乙酯的混合溶劑4 6進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，回收洗脫液中的溶劑，分別得到GAl. 82g(純度98. 3%), GBO. 95g(純度98. 4%)。醇浸提液300mL60°C減壓濃縮至80mL，冷卻至25°C，過(guò)濾，母液70°C減壓濃縮至干后，用50%甲醇反復(fù)結(jié)晶3次，得白果內(nèi)酯2.1g (純度98. 4%)。實(shí)施例7

取銀杏葉提取物1000g(GA含量 2. 1%，GB 含量1. 2%, BB2. 5%)，加入 60000mL水 30°C攪拌30min，然后加入60000mL乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，乙酸乙酯萃取液濃縮、干燥，得乙酸乙酯萃取物156. Og ;加入3000mL50%甲醇30°C浸提I小時(shí)，過(guò)濾，濾餅干燥得不溶物51. 3g和醇浸提液2850mL ;將不溶物用200mL乙酸乙酯溶解后用60gl00 —200目硅膠拌樣，然后用3000g200-300目的硅膠柱色譜分離，用正己烷一乙酸乙酯的混合溶劑2 8進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，回收洗脫液中的溶劑，分別得到GA和GB。GA用50%甲醇進(jìn)一步結(jié)晶得晶體18. 5g (純度99. 2%), GB用30%乙醇進(jìn)一步結(jié)晶得晶體9. 5g (純度99. 3%)。醇浸提液2850mL60°C減壓濃縮至IOOOmL,冷卻至25°C，過(guò)濾，母液70°C減壓濃縮至干后，用50%甲醇反復(fù)結(jié)晶3次，得白果內(nèi)酯22. 3g (純度98. 5%)。實(shí)施例8:取銀杏葉提取物IOOOg (GA含量2. 1%，GB含量1. 2%, BB2. 5%),加入60000mL水30°C攪拌30min，然后加入60000mL乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，乙酸乙酯萃取液濃縮、干燥，得乙酸乙酯萃取物146. Og ;加入2500mL50%乙醇30°C浸提I小時(shí)，過(guò)濾，濾餅干燥得不溶物48. 5g和醇浸提液2400mL ;將不溶物用200mL乙酸乙酯溶解后用60gl00 - 200目硅膠拌樣，然后用3000g200-300目的硅膠柱色譜分離，用石油醚一乙酸乙酯的混合溶劑2 8進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，回收洗脫液中的溶劑，分別得到GA和GB。GA用50%乙醇進(jìn)一步結(jié)晶得晶體18. Og (純度99. 5%)，GB用50%甲醇進(jìn)一步結(jié)晶得晶體9. 8g(純度99. 4%)。醇浸提液2400mL60°C減壓濃縮至800mL，冷卻至25°C，過(guò)濾，母液70°C減壓濃縮至干后，用30%甲醇反復(fù)結(jié)晶3次，得白果內(nèi)酯23. 3g (純度98. 1%)。 如前所述，根據(jù)前面所公開(kāi)的內(nèi)容，本領(lǐng)域的專業(yè)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明旨 在提供一種從銀杏葉提取物中分離純化銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯的方法。下面的實(shí)施例可以幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種從銀杏葉提取物中分離純化GA、GB和白果內(nèi)酯的方法，其特征在于包括以下步驟1)乙酸乙酯萃取稱取銀杏葉提取物，加入銀杏葉提取物5- 10倍量的水2(T50°C攪拌，然后加入銀杏葉提取物5 - 10倍量的乙酸乙酯萃取3 - 5次，合并乙酸乙酯萃取液，乙酸乙酯萃取液濃縮、干燥，所得乙酸乙酯萃取物進(jìn)行步驟2)，其中倍量指重量/體積比，下同；2)低碳醇一水混合溶劑浸提稱取乙酸乙酯萃取物，加入乙酸乙酯萃取物10- 20倍量的低碳醇一水混合溶劑2(T50°C進(jìn)行浸提，過(guò)濾，所得不溶物(II)進(jìn)行步驟3)，所得醇浸提取液(I)進(jìn)行步驟4);3)硅膠柱層析分離純化將不溶物(II)上硅膠柱，用石油醚或正己烷或環(huán)己烷與乙酸乙酯的混合溶劑進(jìn)行洗脫，分段收集洗脫液，回收洗脫液中的溶劑，分別得到GA和GB ；4)白果內(nèi)酯結(jié)晶純化將醇浸提取液(I)濃縮至無(wú)醇、冷卻、過(guò)濾后得到母液，將母液濃縮至干后用3(Γ50%甲醇進(jìn)行結(jié)晶3飛次得白果內(nèi)酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括步驟5):使用低碳醇一水混合溶劑對(duì)銀杏內(nèi)酯 A和銀杏內(nèi)酯B分別進(jìn)行重結(jié)晶純化處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中步驟2)低碳醇選自甲醇或乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求f3任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟2)低碳醇一水混合溶劑中，低碳醇含量為30 70%。
5.根據(jù)權(quán)利要求Γ4任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟3)石油醚的沸程為6(T90°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1飛任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟3)石油醚或正己烷或環(huán)己烷與乙酸乙酯的混合溶劑中，石油醚或正己烷或環(huán)己烷與乙酸乙酯的體積比為2 : 8 — 4 : 6。
7.根據(jù)權(quán)利要求2飛任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟5)低碳醇選自甲醇或乙醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求2 7任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟5)低碳醇一水混合溶劑中，低碳醇含量為30 70%。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種從銀杏葉提取物中分離純化GA、GB和白果內(nèi)酯的方法，包括以下步驟1)乙酸乙酯萃取；2)低碳醇－水混合溶劑浸提，得醇浸提取液和不溶物；3)不溶物硅膠柱層析分離得GA和GB；4)醇浸提取液濃縮至無(wú)醇、冷卻，過(guò)濾，母液濃縮至干后用30~50%甲醇進(jìn)行結(jié)晶3~5次可得白果內(nèi)酯。本發(fā)明所分離純化銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯的工藝路線簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。分離純化所得銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯的純度大于98%。銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯的轉(zhuǎn)移率大于80%，產(chǎn)品收率高，生產(chǎn)成本低。
文檔編號(hào)C07D493/20GK103044442SQ20131000051
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月3日
發(fā)明者欒連軍, 劉雪松, 談滿良, 荊海英, 吳永江, 陳勇, 王龍虎 申請(qǐng)人:蘇州澤達(dá)興邦醫(yī)藥科技有限公司