本發(fā)明涉及人白血病HL-60細(xì)胞耐藥細(xì)胞株HL-60/RS細(xì)胞及其制備方法。

背景技術(shù)：
白血病是危害青壯年的最主要惡性腫瘤之一，化學(xué)治療目前仍然是白血病的最主要治療方法，但化療中抗癌藥物誘導(dǎo)的藥物耐受性，特別是獲得性多藥耐藥（multidrugresistance，MDR）現(xiàn)象是阻礙白血病治療效果的主要障礙，也是目前尚未解決的難題。三氧化二砷是中藥砒霜的有效成分，已在各型白血病和實(shí)體腫瘤的治療中得到廣泛應(yīng)用，取得了良好的臨床療效。研究證實(shí)三氧化二砷不是耐藥蛋白P-gp的底物且抑制P-gp表達(dá)，不與常規(guī)化療藥物發(fā)生交叉耐藥性，故單用或與常規(guī)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用在耐藥性、復(fù)發(fā)性及難治性白血病的治療中取得良好療效。臨床應(yīng)用三氧化二砷治療白血病/腫瘤過程中發(fā)現(xiàn)部分白血病/腫瘤細(xì)胞也會(huì)逐漸產(chǎn)生對(duì)三氧化二砷的耐受性，即獲得抗砷性，發(fā)生機(jī)制以及與MDR的關(guān)系不明。當(dāng)前常用的采用阿霉素誘導(dǎo)的、超表達(dá)P-gp的白血病多藥耐藥細(xì)胞系（如K562/ADM等）照樣對(duì)三氧化二砷敏感、沒有抗砷性。因此，研究化療藥物誘導(dǎo)的MDR的機(jī)制及與抗砷性的關(guān)系，以及預(yù)防抗砷性的產(chǎn)生，探討耐藥性白血病細(xì)胞對(duì)其敏感抑或耐受的細(xì)胞分子機(jī)制，可為解決含砷化療藥物耐藥問題以及臨床是否選擇As2O3作為耐藥性白血病的治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)或探尋新的治療靶點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，為分析白血病細(xì)胞化療耐藥后的生物學(xué)性狀的變化，篩選及判斷化療藥物的敏感性，分析白血病細(xì)胞多藥耐藥及抗砷性機(jī)制，研究多藥耐藥性與抗砷性的關(guān)系，預(yù)防白血病化療過程中MDR和/或抗砷性的產(chǎn)生，體外篩選耐藥調(diào)整劑，提供了一種可與三氧化二砷交叉耐藥的白血病多藥耐藥細(xì)胞系HL-60/RS。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：人白血病HL-60細(xì)胞耐藥細(xì)胞株HL-60/RS細(xì)胞，所述細(xì)胞株HL-60/RS的保藏編號(hào)為CCTCCNO：C201430，保藏時(shí)間為2014年4月16日，保藏地點(diǎn)為中國典型培養(yǎng)物保藏中心（地址為中國.武漢.武漢大學(xué)）。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了上述的人白血病HL-60細(xì)胞耐藥細(xì)胞株HL-60/RS細(xì)胞的制備方法，是以人類白血病HL-60細(xì)胞系為親本細(xì)胞，采用阿霉素模擬體內(nèi)化療過程，逐步提高藥物濃度、長(zhǎng)期、間歇性反復(fù)沖擊加持續(xù)誘導(dǎo)的方法，誘導(dǎo)建立獲得性白血病多藥耐藥細(xì)胞系HL-60/RS。其特點(diǎn)為對(duì)三氧化二砷具有高耐藥性，并高表達(dá)MRP1、MRP2和ASNA1等砷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白。進(jìn)一步的，上述的人白血病HL-60細(xì)胞耐藥細(xì)胞株HL-60/RS細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人類白血病HL-60細(xì)胞接種在含有以體積百分比計(jì)為15%的新生牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)，得到細(xì)胞培養(yǎng)體系；2）在步驟1）得到的細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入阿霉素，起始沖擊濃度為0.1mg/L，待細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)時(shí)，再加以同濃度藥物誘導(dǎo)，如此重復(fù)，直至細(xì)胞能在該濃度下正常存活和增殖時(shí)，再提高沖擊藥物濃度，進(jìn)行第二輪沖擊誘導(dǎo)，藥物濃度增加的幅度為0.1mg/L；按上述方式反復(fù)間歇性沖擊誘導(dǎo)，并隨著沖擊誘導(dǎo)次數(shù)及耐藥性的增高，每輪藥物濃度增加的幅度逐漸提高，初期幅度小，后期幅度加大，每輪沖擊誘導(dǎo)藥物濃度增加的幅度為0.1mg/L，0.2mg/L，0.3mg/L，0.5mg/L，0.6mg/L，0.8mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L，2.0mg/L，2.5mg/L，3.0mg/L，3.5mg/L，4.0mg/L，5.0mg/L，每輪中同幅度增加沖擊濃度的次數(shù)根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)及耐藥穩(wěn)定性決定，一般1-3次，沖擊誘導(dǎo)時(shí)間為20個(gè)月，至最終人類白血病HL-60細(xì)胞能夠在含有40.0mg/L阿霉素的細(xì)胞培養(yǎng)體系中維持存活和增殖；撤離誘導(dǎo)藥物置于無藥體系中培養(yǎng)，耐藥性保持穩(wěn)定，得到具有耐藥性的HL-60/RS細(xì)胞。所用藥劑來源：新生牛血清：蘭州榮曄生物科技公司產(chǎn)品，批號(hào)20100925；青霉素：華北制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)1105403；鏈霉素：華北制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)1112106；RPMI1640培養(yǎng)液：美國GibcoBRL公司產(chǎn)品，批號(hào)870532；阿霉素：深圳萬樂藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)1103E1。本發(fā)明的原理為，以人類白血病HL-60細(xì)胞系為親本細(xì)胞，采用阿霉素（Adriamycin,ADM）模擬體內(nèi)化療過程，逐步提高藥物濃度、長(zhǎng)期、間歇性反復(fù)沖擊加持續(xù)誘導(dǎo)的方式方法誘導(dǎo)建立獲得性白血病多藥耐藥細(xì)胞系HL-60/RS，并觀察生物學(xué)特性及對(duì)三氧化二砷的敏感性。具體實(shí)施技術(shù)如下：①對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60細(xì)胞接種在含15%新生牛血清、100U/mL青霉素、100mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入阿霉素，起始沖擊濃度為0.1mg/L，待細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)時(shí)，再加以同濃度藥物誘導(dǎo)，如此重復(fù)，直至細(xì)胞能在該濃度下正常存活和增殖時(shí)，再提高沖擊藥物濃度，進(jìn)行第二輪沖擊誘導(dǎo)，藥物濃度增加的幅度為0.1mg/L。如此反復(fù)間歇性沖擊誘導(dǎo)，并隨著沖擊誘導(dǎo)次數(shù)及耐藥性的增高，每輪藥物濃度增加的幅度亦逐漸提高，初期幅度較小，而后期幅度加大，每輪沖擊誘導(dǎo)藥物濃度增加的幅度為0.1，0.2，0.3，0.5，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0mg/L，歷時(shí)20個(gè)月，最終HL-60細(xì)胞能夠在含40.0mg/L阿霉素的培養(yǎng)體系中維持存活和增殖。撤除誘導(dǎo)藥物后在無藥體系中培養(yǎng)，HL-60細(xì)胞長(zhǎng)期穩(wěn)定維持耐藥性。誘導(dǎo)后的耐藥細(xì)胞在液氮中凍存3個(gè)月后復(fù)蘇，細(xì)胞耐藥性維持穩(wěn)定。最終獲得的具有耐藥性的HL-60/RS細(xì)胞。對(duì)以上述方式，采用“逐步提高濃度沖擊+持續(xù)誘導(dǎo)”建立的具有多藥耐藥性的HL-60/RS細(xì)胞系，進(jìn)行生物學(xué)特性檢測(cè)：2.1耐藥譜：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HL-60細(xì)胞和HL-60/RS細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)對(duì)阿霉素以及順鉑、長(zhǎng)春新堿、依托泊苷、阿糖胞苷和5-氟尿嘧啶的敏感性，即細(xì)胞按1×105/ml接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入相應(yīng)濃度的藥物，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h和72h，培養(yǎng)終止前4h每孔加入10μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)，每孔加入10%含0.01mol/LHCl的SDS溶液終止反應(yīng)，并置37℃過夜，自動(dòng)酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度（A）值，并計(jì)算相應(yīng)藥物的抑制率和半數(shù)抑制量（IC50）值以及耐藥倍數(shù)。HL-60/RS細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐受性及耐藥譜如圖1所示，以IC50比較，HL-60/RS細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐受性為其親本HL-60細(xì)胞的85.68倍。HL-60/RS細(xì)胞對(duì)順鉑、長(zhǎng)春新堿、依托泊苷和阿糖胞苷具有不同程度的交叉耐受性，但對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性無明顯改變。2.2形態(tài)學(xué)改變：收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HL-60細(xì)胞和HL-60/RS細(xì)胞，Wright-Gimsa染色、光鏡觀察，同時(shí)在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞器與細(xì)胞核的改變、掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞表面形貌變化，HL-60細(xì)胞和HL-60/RS細(xì)胞的光鏡及電鏡形態(tài)學(xué)特點(diǎn)如圖2所示。與對(duì)照HL-60細(xì)胞比較，HL-60/RS細(xì)胞形態(tài)未見明顯差異，胞核呈較均一的圓形或橢圓形、直徑增大，核/漿比例顯著增加，無類分葉核或類桿狀核。在掃描電鏡下HL-60/RS細(xì)胞則表面較光滑、缺少微絨毛；超微結(jié)構(gòu)上胞質(zhì)較致密，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)致密、異染色質(zhì)增多。從形態(tài)學(xué)上觀察顯示，經(jīng)ADM誘發(fā)耐藥的HL-60/RS細(xì)胞表型更為原始和幼稚，分化程度更低。2.3耐藥蛋白表達(dá)：收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HL-60細(xì)胞和耐受不同濃度ADM的HL-60/RS細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)至106個(gè)/ml，檢測(cè)P-gp時(shí)加入鼠抗人P-gp單抗MRK-16作為一抗，室溫避光孵育20min，PBS洗滌后重懸，再加入羊抗鼠PE-IgG2a作為二抗，室溫避光孵育20min，PBS洗滌。檢測(cè)BCRP時(shí)加入FITC標(biāo)記的鼠抗人BCRP抗體。流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)P-gp和BCRP的表達(dá)陽性率。HL-60細(xì)胞和HL-60/RS細(xì)胞耐藥蛋白的表達(dá)變化如圖3所示，結(jié)果表明，P-gp和BCRP的表達(dá)隨HL-60細(xì)胞耐受ADM濃度的增高而增高，當(dāng)HL-60細(xì)胞耐受ADM的劑量達(dá)到5mg/L時(shí)，存活細(xì)胞就已幾乎100%表達(dá)P-gp，BCRP陽性率為6.2%。達(dá)到最高耐受濃度（40mg/L）時(shí)，P-gp+和BCRP+細(xì)胞分別為100%和24.2%，分別為HL-60細(xì)胞的78.7倍和25.0倍。2.4藥物外排功能（細(xì)胞內(nèi)ADM含量）：HL-60和HL-60/RS細(xì)胞懸于PBS中，加入終濃度30mg/L的ADM，37℃避光孵育30min，冷PBS洗滌2次后，將細(xì)胞分為兩部分：一部分細(xì)胞重懸于1ml冷PBS中，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ADM蓄積量（熒光強(qiáng)度）。另一部分細(xì)胞置于37℃繼續(xù)避光孵育60min，冷PBS洗滌2次，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)存留的ADM量（熒光強(qiáng)度），計(jì)算外排出量。HL-60細(xì)胞和HL-60/RS細(xì)胞藥物外排功能（細(xì)胞內(nèi)ADM含量）變化如圖4所示，HL-60/RS細(xì)胞內(nèi)ADM的含量（熒光強(qiáng)度）僅為HL-60細(xì)胞的59%；繼續(xù)無藥孵育60min，僅63%的HL-60/RS耐藥細(xì)胞內(nèi)可測(cè)到ADM，且可測(cè)到的ADM含量?jī)H為HL-60細(xì)胞的25.7%，約有66.5%的ADM被排出細(xì)胞外，而對(duì)照HL-60細(xì)胞僅排出22.6%。上述結(jié)果證明HL-60/RS細(xì)胞高表達(dá)的P-gp和BCRP的藥物外排活性是其耐藥性的主要機(jī)制之一。2.5三氧化二砷敏感性：收集HL-60細(xì)胞和HL-60/RS細(xì)胞，并選擇同為ADM誘導(dǎo)的經(jīng)典多藥耐藥白血病K562/ADM細(xì)胞及其親本敏感K562細(xì)胞為對(duì)照，按1.0×105個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板，加入不同濃度的As2O3，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24-72h，離培養(yǎng)終點(diǎn)4h，加入10μLMTT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入10%SDS，37℃靜置過夜。全自動(dòng)酶標(biāo)儀于570nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度(A值)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。HL-60細(xì)胞和HL-60/RS細(xì)胞對(duì)三氧化二砷的敏感性（與K562/ADM細(xì)胞和K562細(xì)胞比較）如圖5所示，結(jié)果表明，K562/ADM細(xì)胞較K562細(xì)胞對(duì)As2O3更敏感，其24、48和72小時(shí)的IC50值分別為K562細(xì)胞的0.75，0.82和0.80倍；而但與之相反，HL-60/RS細(xì)胞則遠(yuǎn)較HL-60細(xì)胞對(duì)As2O3耐受，IC50值則分別為HL-60細(xì)胞的7.39、10.87和12.89倍。HL-60/RS耐藥細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性遠(yuǎn)低于K562/ADM耐藥細(xì)胞，其IC50值分別為K562/ADM細(xì)胞的9.51、9.78和10.89倍，但它們的親本細(xì)胞HL-60和K562細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性相近。結(jié)果揭示出，盡管HL-60/RS細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞均為阿霉素誘導(dǎo)選擇的、mdr1/P-gp高表達(dá)的MDR細(xì)胞，但對(duì)As2O3的敏感性卻完全相反。2.6砷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)：分別收集HL-60細(xì)胞、HL-60/R細(xì)胞、K562細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞，提取RNA和蛋白質(zhì)，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法和Westernblot法檢測(cè)與砷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白ABCCl（MRPl）、ABCC2（MRP2）和砷激活的ATP酶（arsenite-stimulatedATPase,ASNA1）的表達(dá)水平。①定量RT-PCR：TRIZOL法抽提細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,定量PCR總體系25μl，包括2×SYBRGreenbuffer12.5μl上游引物1μl，下游引物1μl，cDNA2μl，PCR引物序列如表1所示。表1。反應(yīng)條件：95℃、10sec，然后95℃5sec，60℃30sec共40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行融解曲線分析產(chǎn)物的特異性?；虮磉_(dá)定量采用比較域值法進(jìn)行分析。②收集細(xì)胞PBS洗滌，RIPA裂解液抽提總蛋白，BCA法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量后，加入5×上樣緩沖液，混勻，100℃煮沸5min使蛋白質(zhì)變性，每個(gè)樣分別取50μg進(jìn)行上樣，8-10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h或者4℃過夜后分別加入抗-MRP1抗體、抗-MRP2抗體、抗-ASNA1抗體和抗β-actin抗體，4℃過夜或室溫孵育1-2h，用PBS-T洗滌3×5min，分別加入IRDye700DX標(biāo)記的羊抗兔和IRDye800CW標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫孵育2h,PBS-T洗滌5×10min后，PBS洗滌10-30min，Odyssey紅外激光掃描儀進(jìn)行掃描并分析。HL-60細(xì)胞和HL-60/RS細(xì)胞MRPl、MRP2和ASNA1的表達(dá)水平，并與K562/ADM細(xì)胞和K562細(xì)胞比較如圖6所示，結(jié)果表明，耐藥的K562/ADM細(xì)胞和HL-60/RS細(xì)胞MRP（MRP1和MRP2）的表達(dá)均高于其親本敏感細(xì)胞，且HL-60/RS細(xì)胞高于K562/ADM細(xì)胞；HL-60/RS細(xì)胞中ASNA1的表達(dá)遠(yuǎn)高于K562/ADM細(xì)胞、HL-60細(xì)胞和K562細(xì)胞，分別為K562/ADM細(xì)胞的7.34倍、HL-60細(xì)胞的2.45倍、K562細(xì)胞的6.16倍。而K562/ADM細(xì)胞的表達(dá)量是K562細(xì)胞的0.83倍。兩對(duì)細(xì)胞MRP1、MRP2和ASNA1的表達(dá)與其對(duì)三氧化二砷的敏感性基本一致。表明HL-60/RS細(xì)胞對(duì)三氧化二砷耐受性緣于砷相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的MRP1和MRP2，特別是ASNA1的表達(dá)相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明誘導(dǎo)建立的白血病多藥耐藥HL-60/RS細(xì)胞系，是采用“逐步提高濃度沖擊+持續(xù)誘導(dǎo)”的誘導(dǎo)方法，有別于目前腫瘤耐藥研究多采用濃度梯度遞增法和大劑量間歇短時(shí)沖擊方式，建立的耐藥細(xì)胞株具有耐藥譜廣和耐藥性穩(wěn)定等特點(diǎn)；HL-60/RS細(xì)胞的多藥耐藥性與目前最經(jīng)典的K562/ADM細(xì)胞類似，且高表達(dá)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp、MRP和BCRP；與K562/ADM等耐藥白血病細(xì)胞比較，除具有廣譜的耐藥性外，還對(duì)三氧化二砷具有高耐藥性，且高表達(dá)MRP1、MRP2和ASNA1等砷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白。HL-60/RS細(xì)胞系的特點(diǎn)是多藥耐藥且與三氧化二砷交叉耐受和高表達(dá)ASNA1基因，可用于研究腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性、耐藥性及抗砷性的機(jī)制，以及篩選具有可靠性的耐藥逆轉(zhuǎn)劑；臨床ASNA1基因的檢測(cè)可預(yù)測(cè)對(duì)砷劑類藥物的敏感性，特別是復(fù)發(fā)性、難治性和耐藥性白血病能否換用砷劑類藥物治療。附圖說明圖1為本發(fā)明提供的HL-60/RS細(xì)胞系對(duì)阿霉素的耐受性及耐藥譜，其中，A：不同誘導(dǎo)條件下的耐藥性；B：耐藥譜。圖2為HL-60細(xì)胞和HL-60/RS細(xì)胞的光鏡及電鏡形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。圖3為HL-60細(xì)胞和HL-60/RS細(xì)胞耐藥蛋白的表達(dá)變化，其中，A：Westernblot所測(cè)P-gp、MRP和BCRP的表達(dá)水平；B：誘導(dǎo)過程中P-gp和BCRP的動(dòng)態(tài)變化。圖4為HL-60細(xì)胞和HL-60/RS細(xì)胞藥物外排功能（細(xì)胞內(nèi)ADM含量）變化。圖5為HL-60細(xì)胞和HL-60/RS細(xì)胞對(duì)三氧化二砷的敏感性，是與K562/ADM細(xì)胞和K562細(xì)胞比較得到的結(jié)果。圖6為HL-60細(xì)胞和HL-60/RS細(xì)胞MRPl、MRP2和ASNA1的表達(dá)水平，并與K562/ADM細(xì)胞和K562細(xì)胞比較（A：定量RT-PCR所測(cè)mRNA的表達(dá)水平；B：Westernblot所測(cè)蛋白表達(dá)水平）。附圖中的英文標(biāo)識(shí)的中文翻譯如下所示：ADM（阿霉素）；TolerantADMconc.（耐受阿霉素濃度）；50%inhibitoryconcentration（IC50，半數(shù)抑制濃度）；Cisplatin（順鉑）；5-Fluorourid（5-氟尿嘧啶）；Daunorubicin（柔紅霉素）；Cytrarabine（阿糖胞苷）；Vincristine（長(zhǎng)春新堿）；Etoposide（依托泊苷）；Relativeexpression（相對(duì)表達(dá)量）；Positiverate（陽性率）；MFI（平均熒光強(qiáng)度）；P-gp（P-糖蛋白）；BCRP（乳腺癌耐藥蛋白）；MRP1（多藥耐藥相關(guān)蛋白1）；MRP2（多藥耐藥相關(guān)蛋白2）；ASNA1（砷激活的ATP酶）。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：以阿霉素為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞建立多藥耐藥細(xì)胞系。①HL-60接種在含15%新生牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入阿霉素，起始沖擊濃度為0.1mg/L，待存活細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)時(shí)，再加以同濃度藥物誘導(dǎo)，如此重復(fù)，直至細(xì)胞能在該濃度下正常存活和增殖時(shí)，再提高沖擊藥物濃度，進(jìn)行第二輪沖擊誘導(dǎo)，藥物濃度增加的幅度為0.1mg/L。如此反復(fù)間歇性沖擊誘導(dǎo)，并隨著沖擊誘導(dǎo)次數(shù)及耐藥性的增高，每輪沖擊藥物濃度增加的幅度亦逐漸提高，初期幅度較小，而后期幅度加大，每輪沖擊誘導(dǎo)藥物濃度增加的幅度依次為0.1，0.2，0.3，0.5，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0mg/L，歷時(shí)20個(gè)月、最終HL-60細(xì)胞能夠在含40.0mg/L阿霉素的培養(yǎng)體系中維持存活和增殖，建成白血病多藥耐藥細(xì)胞系HL-60/RS細(xì)胞。③HL-60/RS細(xì)胞在無阿霉素培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，HL-60細(xì)胞長(zhǎng)期穩(wěn)定維持耐藥性。液氮中凍存3個(gè)月后復(fù)蘇，細(xì)胞耐藥性維持穩(wěn)定。誘導(dǎo)建立的HL-60/RS細(xì)胞的耐藥指數(shù)為85.68，對(duì)順鉑、長(zhǎng)春新堿、依托泊苷和阿糖胞苷具有交叉耐受性；高表達(dá)耐藥蛋白P-gp和BCRP。實(shí)施例2：HL-60/RS細(xì)胞的誘導(dǎo)建立方式與實(shí)施例1相同。HL-60/RS細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)后1個(gè)月后進(jìn)行對(duì)三氧化二砷敏感性的測(cè)定。HL-60/RS細(xì)胞（選擇HL-60敏感細(xì)胞、K562/ADM多藥耐藥細(xì)胞及其親本K562細(xì)胞為對(duì)照），按1.0×105個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板，加入0.1-5.0mg/L的As2O3，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24-72h，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制和IC50。HL-60/RS細(xì)胞對(duì)三氧化二砷高度耐受，耐受性是親本HL-60細(xì)胞的12.89倍、是K562/ADM耐藥細(xì)胞的10.89倍。實(shí)施例3：HL-60/RS細(xì)胞的誘導(dǎo)建立方式與實(shí)施例1相同。HL-60/RS細(xì)胞以及對(duì)照HL-60細(xì)胞、K562細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞，采用TRIZOL法抽提細(xì)胞總RNA和RIPA裂解液抽提總蛋白，分別用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法和Westernblot法檢測(cè)與砷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白MRPl、MRP2和ASNA1的表達(dá)。HL-60/RS細(xì)胞MRP（MRP1和MRP2）的表達(dá)明顯高于HL-60細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞；HL-60/RS細(xì)胞ASNA1的表達(dá)顯著高于HL-60細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞，分別為K562/ADM細(xì)胞的7.34倍和HL-60細(xì)胞的2.45倍。K562/ADM細(xì)胞的表達(dá)量是K562細(xì)胞的0.83倍。MRP和ASNA1的表達(dá)水平與三氧化二砷的敏感性一致。最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表<110>蘭州大學(xué)<120>白血病多藥耐藥細(xì)胞系HL-60/RS及其制備方法<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1tgcagaaggcggggagaacctc22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2gtcgtccgtttccaggtccacg22<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3agacgcagtccaggaatcatgctgg25<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4gtctgcctccggactgtccagg22<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5gccggcttatgcagatcaaga21<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6gttcgctgactgagcggatg20<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>7tgctcctcctgagcgcaagta21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>8ccacatctgctggaaggtgga21序列表<110>蘭州大學(xué)<120>白血病多藥耐藥細(xì)胞系HL-60/RS及其制備方法<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1tgcagaaggcggggagaacctc22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2gtcgtccgtttccaggtccacg22<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3agacgcagtccaggaatcatgctgg25<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4gtctgcctccggactgtccagg22<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5gccggcttatgcagatcaaga21<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6gttcgctgactgagcggatg20<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>7tgctcctcctgagcgcaagta21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>8ccacatctgctggaaggtgga21