用于改變組織特異性和改善AAV9-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的組合物和方法關(guān)于聯(lián)邦贊助研究和開發(fā)的聲明本發(fā)明受美國政府支持在國家健康研究所資助的NHLBIP01#P01-HL-059407下做出。美國政府享有本發(fā)明中的某些權(quán)利。發(fā)明背景為基因治療所評價的首個腺聯(lián)病毒（AAV）載體基于血清型2（AAV2）并且示出在體內(nèi)遞送后轉(zhuǎn)導(dǎo)多種體細胞[Z.Wu（吳）等人，（2006）MolTher（分子治療）,14:316-327]。第一批臨床基因治療成功案例之一使用AAV2載體，以便在在患有遺傳性形式失明的患者中視網(wǎng)膜下注射后恢復(fù)某些方面的視力[A.Kern（克恩）等人，（2003）JVirol（病毒學雜志）,77:11072-11081；AMMaguire（馬奎爾）等人，（2008）NEnglJMed（新英格蘭醫(yī)學雜志）,358:2240-2248]。然而應(yīng)用AAV2載體用于治療其他疾病不那么成功，這歸因于低劣轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和不同免疫問題，例如針對衣殼的預(yù)存中和抗體和T細胞活化[Wu（吳）等人，上文援引]。已知AAV2利用硫酸類肝素（HS）蛋白聚糖作為主要受體用于細胞的識別[Kern（克恩）等人，上文援引]?；趤碜云渌F(xiàn)有血清型（例如AAV1）和其近親AAV6的AAV衣殼開發(fā)額外的載體，此二者均示出增強由唾液酸化糖蛋白介導(dǎo)的肌肉轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞結(jié)合作用[Z.Wu（（吳）等人，（2006）JVirol（病毒學雜志）,80:9093-9103；W.Xiao（肖）等人，（1999）JVirol（病毒學雜志）,73:3994-4003]?；贏AV5的載體也需要結(jié)合N聯(lián)唾液酸（SA），同時示出在腦中直接注射后增強CNS（中樞神經(jīng)系統(tǒng)）中的轉(zhuǎn)導(dǎo)[RWWalters（沃爾特斯）等人，（2001）JBiolChem（生物化學雜志）,276:20610-20616；BL Davidson（戴維森）等人，（2000）ProcNatlAcadSciUSA（美國國家科學院院刊）,97:3428-3432]。通過從人類和非人靈長類組織中的潛在基因組發(fā)現(xiàn)龐大且多樣的新穎衣殼家族，AAV載體用于人類基因治療的潛力擴大。這種擴大的AAV家族數(shù)目超過120種基因組，覆蓋6種抗原性進化枝[G.Gao（高）等人，（2003）ProcNatlAcadSciUSA（美國國家科學院院刊）,100:6081-6086；G.Gao（高）等人，（2004）JVirol（生物化學雜志）,78:6381-6388；GGao（高）等人，（2002）ProcNatl.AcadSciUSA（美國國家科學院院刊）,99:11854-11859]。已經(jīng)確定許多AAV衣殼的高分辨率X射線晶體結(jié)構(gòu)和低分辨率冷凍電子顯微術(shù)重構(gòu)圖像，顯示出高度保守的核心區(qū)，其具有總計9個表面暴露的高變區(qū)[HJNam（納姆）等人，（2007）JVirol（病毒學雜志）,81:12260-12271]。對基于這些新穎內(nèi)源衣殼的載體的評價已經(jīng)就實現(xiàn)大幅度更高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，同時減少免疫后遺癥方面而言顯得相當有前景[G.Gao（高）等人，（2002）ProcNatlAcad.Sci（美國國家科學院院刊），上文援引]?；谙俾?lián)病毒（AAV）血清型9的載體已經(jīng)出現(xiàn)，作為體內(nèi)向許多器官遞送基因的先導(dǎo)性候選物。AAV9已經(jīng)在靶向心臟用于治療心肌病[LTBish（比什）等人，（2008）HumGeneTher（人類基因治療）19:1359-1368]和靶向神經(jīng)元用于治療多種疾病，例如脊髓性肌萎縮[S.Duque（杜奇）等人，（2009）MolTher（分子治療）,17:1187-1196；KDFoust（福斯特）等人，（2009）NatBiotechnol（自然生物技術(shù)）,27:59-65]方面，示出明顯的前景。AAV9也在不激發(fā)體液反應(yīng)情況下非常有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)肺部肺泡上皮細胞，允許載體的有效反復(fù)給予[MPLimberis和JMWilson,(2006)ProcNatl.AcadSci.USA,103:12993-12998]。然而，介導(dǎo)這些嗜性的一種或多種受體仍待限定。需要的是用于宿主內(nèi)轉(zhuǎn)基因的靶向AAV介導(dǎo)遞送的安全、有效方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)希望的靶細胞上AAV9受體的可用性及用于改變載體功效的藥理學方法。這種方法因本發(fā)明的諸位發(fā)明人發(fā)現(xiàn)末端β-半乳糖是AAV9的主要受體而是可行的。另外，該方法預(yù)期適用于包含AAV9β-半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的其他AAV。在一個方面，本發(fā)明提供了一種改變腺聯(lián)病毒（AAV）病毒載體的靶向和/或細胞攝取效率的方法，所述腺聯(lián)病毒載體具有來自AAV9的衣殼。該方法包括向受試者遞送改變β-半乳糖細胞表面受體結(jié)合載體的可用性的組合物。在一個方面，宿主中靶細胞的細胞表面包含具有末端唾液酸殘基和倒數(shù)第二β-半乳糖殘基的聚糖，所述聚糖受本發(fā)明修飾以暴露β-半乳糖殘基。在一個實施例中，該方法包括向受試者遞送與一種神經(jīng)氨酸酶組合的AAV病毒載體，由此所述神經(jīng)氨酸酶切除聚糖上的末端唾液酸并且通過增加β-半乳糖的可用性而增加AAV由細胞攝取的效率。受試者可以用這種神經(jīng)氨酸酶預(yù)處理。在一個實施例中，這種神經(jīng)氨酸酶是外切神經(jīng)氨酸酶（即與內(nèi)部唾液酸相反，它靶向末端唾液酸用于切除）。在另一個實施例中，通過功能性消除具有AAV9受體的第一細胞亞群上暴露的細胞表面末端β-半乳糖殘基（例如，具有末端β-半乳糖殘基的細胞表面聚糖），將AAV9載體再指引偏離具有末端β-半乳糖的第一細胞亞群，并且由此使所述AAV重新靶向至受試者中具有末端β-半乳糖的第二細胞亞群和/或增加接觸第二細胞亞群的AAV的數(shù)目，由此增加被這些細胞攝取。在一個實施例中，將功能性消除第一細胞亞群的部分局部遞送至第一細胞亞群。在一個實施例中，在具有AAV9細胞表面受體的第一細胞亞群中，酶促移除β-半乳糖，由此減少或消除AAV由所述細胞亞群攝取，并使所述AAV重新靶向至所述受試者中具有AAV9受體（末端β-半乳糖）的第二細胞亞群。在一個實施例中，通過遞送與AAV9載體組合的半乳糖苷酶至第一細胞亞群，酶促地移除β-半乳糖。在另一個實施例中，將結(jié)合末端β-半乳糖殘基的凝集素遞送至受試者，這通過結(jié)合這些殘 基而封閉β-半乳糖。仍在另一個方面，本發(fā)明提供了一種通過向受試者遞送包括神經(jīng)氨酸酶和AAV9載體的組合，增加AAV9載體在具有表面聚糖的細胞中基因遞送的方法，該表面聚糖具有末端唾液酸和倒數(shù)第二β-半乳糖殘基，所述載體進一步包括具有AAV反向末端重復(fù)序列的微型基因和與指導(dǎo)其在宿主細胞中表達的調(diào)節(jié)序列可工作地連接的異源基因。在一個方面，該組合物進一步提供了突變AAV9載體，其中基本上減少或消除野生型（wt）AAV9轉(zhuǎn)導(dǎo)傳導(dǎo)氣道的天然能力，但是保留與wtAAV9相似的肝臟和心臟轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。在一個實施例中，突變AAV具有其中替換在位置470（Asn）處天然氨基酸的AAV9衣殼。在一個實例中，這種替換物是丙氨酸。在另一個實施例中，突變AAV具有其中替換在位置446（Tyr）處天然氨基酸的AAV9衣殼。在一個實例中，這種替換物是丙氨酸。仍在另一個實施例中，突變AAV具有其中替換在位置271（Asp）處天然氨基酸的AAV9衣殼。在一個實例中，該氨基酸替換為丙氨酸。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種通過以下方式使AAV9載體不靶向氣道上皮、同時保留其轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟和心臟的能力的方法：將一個或多個在位置271、446、和470處的氨基酸改變成丙氨酸或另一種氨基酸，即，優(yōu)選地具有小的、不帶電荷的側(cè)鏈氨基酸。在另一個實施例中，該氨基酸具有不影響結(jié)合位點構(gòu)象的帶甲基的小側(cè)鏈。在又一個方面，本發(fā)明提供具有經(jīng)工程化以包含AAV9半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的AAV衣殼的AAV載體。在一個實施例中，工程化的AAV衣殼包含在親本AAV9的相應(yīng)氨基酸位置內(nèi)插入的AAV9的Y446、N470、A472和V472和AAV9的D271、N272和W503。仍在另一個實施例中，本發(fā)明提供了一種用于分離具有AAV9衣殼的腺聯(lián)病毒（AAV）病毒載體的方法。這種方法涉及(a)使包括具有來自AAV9衣殼的 AAV病毒載體的樣品暴露，以接觸包括已經(jīng)連接固相支持物的β-半乳糖的分子，由此具有β-半乳糖結(jié)合位點的純化靶由該分子選擇性結(jié)合及；(b)洗滌固相支持物以從樣品中移除非特異性結(jié)合固相支持物的物質(zhì)；和(c)從固相支持物中分離病毒載體。仍在另一個實施例中，本發(fā)明提供包括以下組合的組合物：(a)神經(jīng)氨酸酶、(b)具有AAV9衣殼的腺聯(lián)病毒（AAV）載體和(c)藥學上可接受的運載體。所述載體進一步包括具有AAV反向末端重復(fù)序列的微型基因和與指導(dǎo)其在宿主細胞中表達的調(diào)節(jié)序列可工作地連接的異源基因。仍在另外實施例中，本發(fā)明提供了包括以下組合的組合物：(a)凝集素、(b)具有AAV9衣殼的腺聯(lián)病毒（AAV）載體和(c)藥學上可接受的運載體。本發(fā)明的這些和其他方面將會因本發(fā)明的以下詳細描述而輕易明晰。發(fā)明簡要說明圖1A-1C提供了研究AAV結(jié)合缺少唾液酸（SA）的聚糖的結(jié)果。圖1A是對每種細胞類型或酶處理，N聯(lián)和O聯(lián)聚糖的示意圖。圖1B示出通過用神經(jīng)氨酸酶（NA）處理，從Pro-5細胞表面移除SA并且施加載體至NA處理和未處理的細胞并評價結(jié)合作用時的結(jié)果?；谄骄鄬晒鈫卧ㄒ訰FU呈現(xiàn)），篩選空AAV9衣殼用于結(jié)合465種不同聚糖，并且鑒定到結(jié)合AAV9的最優(yōu)5種聚糖（未示出）。圖1C示出最優(yōu)5種聚糖的結(jié)構(gòu)及它們的代表性示圖。%CV：表示為百分比的變異系數(shù)（數(shù)據(jù)的標準偏差與平均數(shù)的比率）。圖2A-2F示出對結(jié)合并轉(zhuǎn)導(dǎo)CHO細胞，AAV9依賴半乳糖的研究結(jié)果。將表達ffLuc的AAVs2、6或9添加至Pro-5、Lec-2亦或Lec-8細胞并且在4℃孵育1hr，并且分離總DNA以通過qPCR（圖2A）確定結(jié)合的基因組副本，或?qū)⒓毎?7℃孵育48小時并分析ffLuc表達（圖2B）。在不同凝集素存在下，將AAV2和AAV9施加至NA處理的Pro-5細胞，以競爭AAV結(jié)合（圖2C）或轉(zhuǎn) 導(dǎo)（圖2D）。因RCA對細胞有毒，故它不用于轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中。將AAV2和AAV9添加至用NA或NA和β-半乳糖苷酶（NA及β-gal）處理過的Pro-5細胞，以評估AAV（圖2E）結(jié)合和（圖2F）轉(zhuǎn)導(dǎo)。ffLuc，螢火蟲螢光素酶；RLU，相對發(fā)光單位。圖3A和圖3B示出半乳糖結(jié)合作用所需的AAV9衣殼氨基酸的研究結(jié)果。圖3A.將AAV9獨有的包含帶電荷或極性側(cè)鏈的特定氨基酸突變成丙氨酸（A）,以鑒定負責半乳糖結(jié)合的那些氨基酸。構(gòu)建14種突變載體，并且根據(jù)天然氨基酸和其隨后是新氨基酸-丙氨酸，A的特定位置命名，。與AAV9相比，測試這些突變體與Pro-5、Lec-2和Lec-8細胞的結(jié)合。將載體添加（5×109個GC）至每個細胞系并在4℃孵育1小時。在洗滌后，分離總DNA以通過定量PCR確定結(jié)合的載體GC。確定N470是AAV9半乳糖結(jié)合作用必需的。圖3B.隨后，將緊鄰N470定位的19個氨基酸突變成丙氨酸，以檢驗對AAV9半乳糖結(jié)合作用的影響。此外，產(chǎn)生4種其他突變體，它們包含非極性氨基酸A472或V473至絲氨酸亦或天冬氨酸的突變。然后如上文所述評估這些突變載體的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)D271、N272、Y446和W503連同A472和V473對AAV9半乳糖結(jié)合是重要的。數(shù)據(jù)顯示為平均數(shù)+SD。圖4A和圖4B提供了突變載體的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。將喪失半乳糖結(jié)合能力的5種突變體（N470A、D271A、N272A、Y446A和W503A），連同保留半乳糖結(jié)合作用的2種突變體（S469A和E500A）和AAV9對照載體（它們均表達ffLuc）以109GC/孔（MOI=104）添加至（圖4A）Lec-2或（圖4B）Pro-5細胞，并且48小時后，測量ffLuc表達。數(shù)據(jù)顯示為平均數(shù)+SD。RLU，相對發(fā)光單位。圖5是曲線圖，示出在rAAV2/9滴注后，用神經(jīng)氨酸酶預(yù)處理對鼻中轉(zhuǎn)基因表達的影響的體內(nèi)研究結(jié)果。將結(jié)果示出為螢光素酶的總輻射通量（光子每秒（p/s）），如在第1、3、7、14、21和28天（感染后天數(shù)（時間））通過螢光素鼻內(nèi)成像。發(fā)明詳細說明描述了用于改變靶細胞上AAV9受體的可用性及用于改變載體功效的藥理學方法。這種方法因本發(fā)明的諸位發(fā)明人發(fā)現(xiàn)末端β-半乳糖是AAV9的主要受體而是可行的。為在整篇本說明書中便利，參考AAV9。然而，應(yīng)理解，對于細胞表面末端β-半乳糖，可以替換另一種包含AAV9衣殼結(jié)合結(jié)構(gòu)域的AAV或?qū)τ诩毎砻婺┒甩?半乳糖，可以替換包含另一種AAV衣殼結(jié)合結(jié)構(gòu)域的AAV，例如，來自進化枝F的另一種AAV。額外地，在此所述的方法和組合物對于是病毒顆粒（即，具有包裝于其中的基因組序列的AAV衣殼，該基因組序列在攝取病毒載體后遞送至宿主細胞）的載體連同對空AAV9衣殼（無序列包裝于其中的完整AAV衣殼）是有用的。另外，預(yù)計本發(fā)明可用于野生型衣殼和工程化衣殼二者。在一個實施例中，提供了具有經(jīng)工程化以包含AAV9半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的AAV衣殼的AAV載體，該AAV載體在面朝AAV衣殼的2重軸和5重軸的凸出物的外表面處包含小袋，該凸出物由可變區(qū)I形成。在一個實施例中，工程化的AAV衣殼包含在親本AAV9的相應(yīng)氨基酸位置內(nèi)插入的AAV9的Y446（緊鄰可變區(qū)（VR）IV之前的保守結(jié)構(gòu)域）、N470（VRIV）、A472（VRIV）和V473（VRIV）和AAV9的D271（VRI）、N272（VRI）及W503（VRV）。盡管親本AAV可以天然具有這些氨基酸中的一個或多個，但是它并不天然結(jié)合半乳糖或天然地包含全部這些氨基酸。例如，Y446、D271和N272在許多血清型之間保守；而N470則不是。因此，修飾的AAV衣殼可以僅需要工程化N470（基于AAV9的位置編號）。然而，這種AAV衣殼可能需要工程化以上氨基酸中的一個或多個，以便提供AAV9結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個實施例中，工程化的AAV9源自AAV，其中在其野生型時，所述AAV具有唾液酸結(jié)合作用，但是因半乳糖結(jié)構(gòu)域中工程化，現(xiàn)在因空間位阻而缺少唾液酸結(jié)合作用。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種通過以下方式使AAV9載體不靶向氣道 上皮、同時保留其轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟和心臟的能力的方法：將一個或多個在位置271、446、和470（可變區(qū)IV）處的氨基酸改變成丙氨酸或另一種氨基酸。在一個實施例中，替代野生型氨基酸的氨基酸是具有的小的、不帶電荷的、側(cè)鏈氨基酸。在另一個實施例中，該氨基酸具有帶甲基的小側(cè)鏈，例如Val、Ile和Leu。仍在另一個實施例中，選擇不以消除半乳糖結(jié)合功能的方式影響結(jié)合位點構(gòu)象的另一種合適氨基酸，例如Arg、His、Lys、Asp、Glu、Ser.Thr、Asp、Gln、Cys、Ala、Val、Isle、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp。在一個實施例中，該氨基酸選自除Pro之外的組。還提供的是具有不同于wtAAV9的靶向效率的突變AAV9載體，該wtAAV9靶向傳導(dǎo)氣道細胞、心臟和肝臟。在一個實例中，這種突變AAV9載體通過以下方式不靶向氣道上皮，同時保留其轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟和心臟的能力：將一個或多個在位置271、446、和470處的氨基酸改變成丙氨酸或另一種氨基酸。在一個實施例中，替代野生型氨基酸的氨基酸是具有小的、不帶電荷的、側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施例中，該氨基酸具有帶甲基的小側(cè)鏈，例如Val、Ile和Leu。仍在另一個實施例中，選擇不以消除半乳糖結(jié)合功能的方式影響結(jié)合位點構(gòu)象的另一種合適氨基酸，例如Arg、His、Lys、Asp、Glu、Ser.Thr、Asp、Gln、Cys、Ala、Val、Isle、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp。在一個實施例中，該氨基酸選自除Pro之外的組。在一個實施例中，本發(fā)明提供了突變AAV9載體，其中基本上減少或消除野生型（wt）AAV9轉(zhuǎn)導(dǎo)傳導(dǎo)氣道的天然能力，但是保留與wtAAV9相似的肝臟和心臟轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。在一個實施例中，突變AAV具有其中替換在位置470（Asn）處天然氨基酸的AAV9衣殼。在一個實例中，這種替換物是丙氨酸。在另一個實施例中，突變AAV具有其中替換在位置446（Tyr）處天然氨基酸的AAV9衣殼。在一個實例中，這種替換物是丙氨酸。仍在另一個實施例中，突變AAV具有其中替換在位置271（Asp）處天然氨基酸的AAV9衣殼。在一個實例中，該氨 基酸替換為丙氨酸。I.定義進化枝F是在系統(tǒng)進化上涉及AAV9、hu.14/AAV9[GenBank登錄號AY530579]，hu.31[AY530596]和hu.32[GenBank登錄號AY530597]的一組AAV，如基于AAVvp1氨基酸序列的比對，使用鄰接算法，由（至少1000個副本的）至少75%自助值和不多于0.05的泊松校正距離量值所確定。鄰接法算法已經(jīng)在文獻中廣泛描述。見，例如，M.Nei（內(nèi)）和S.Kumar（庫馬爾），MolecularEvolutionandPhylogenetics（分子進化與系統(tǒng)發(fā)育）(OxfordUniversityPress（牛津大學出版社）,紐約(2000)。可以用來執(zhí)行這種算法的計算機程序是可獲得的。例如，MEGAv2.1程序執(zhí)行改良的Nei-Gojobori方法。使用這些技術(shù)和計算機程序以及AAVvp1衣殼蛋白的序列，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以輕易地確定選擇的AAV是否含于在此鑒定的進化枝之一、含于另一個進化枝中、或位于這些進化枝外部。進化枝FAAV可以是天然存在的AAVvp1衣殼。然而，AAV不局限于天然存在的AAV。進化枝可以涵蓋非天然存在的AAV，包括而不局限于重組的、修飾的或改變的、工程化的、嵌合的、雜合的、合成的、人工的等AAV，所述AAV是系統(tǒng)進化相關(guān)的，如基于AAVvp1氨基酸序列的比對，使用鄰接算法，由（至少1000個副本的）至少75%自助值和不多于0.05的泊松校正距離量值所確定。在另一個實施例中，重組AAV可以來自除進化枝FAAV之外的進化枝，該進化枝具有已經(jīng)被工程化以包含與細胞表面末端β-半乳糖結(jié)合的AAV9結(jié)合結(jié)構(gòu)域的衣殼。在另一個實施例中，本發(fā)明中使用的AAV是一種AAV載體，其包括與AAV9vp3蛋白（SEQIDNO:1的氨基酸203至736）至少95%相同、與AAV9 vp2（SEQIDNO:1的約氨基酸138至736）至少95%相同和/或與全長AAV9vp1衣殼（SEQIDNO:1的氨基酸1至736或2至736）至少95%相同的衣殼。在另一個實施例中，AAV與野生型AAV9（SEQIDNO:1）的vp1、vp2和/或vp3約96%、約97%、約98%或約99%相同，并且包含AAV9細胞表面β-半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，由于vp3結(jié)構(gòu)域包含大部分可變區(qū)，所以對于AAV而言可能是與AAV9具有在AAV9的vp1范圍內(nèi)95%同一性，而與AAV9的vp3具有更高同一性。在一個實施例中，用于制備AAV載體的AAV具有100%與AAV9vp1、vp2和/或vp3相同的衣殼。仍在另一個實施例中，用來制備AAV載體的AAV具有AAV9衣殼，例外在于它包含如在此定義的一個或多個突變。在指氨基酸或其片段時，術(shù)語“基本上同源性”或“基本上相似性”表示在適當?shù)陌被岵迦牖蛉笔c另一種氨基酸（或其互補鏈）最佳比對時，存在至少約95%至99%的比對序列的氨基酸序列同一性。優(yōu)選地，同源性是在全長序列或其蛋白（例如cap蛋白、rep蛋白）或其長至少8個氨基酸或更希望地至少15個氨基酸的片段范圍內(nèi)。在此描述合適片段的實例。術(shù)語“高度保守”意指至少80%同一性，優(yōu)選地至少90%同一性，和更優(yōu)選地超過97%同一性。通過求助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的算法和計算機程序，同一性由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員輕易地確定。總體上，在指兩種不同腺聯(lián)病毒之間“同一性”，“同源性”，或“相似性”時，參考“比對的”序列確定“同一性”，“同源性”或“相似性”。“比對的”序列或“比對結(jié)果”指與參考序列相比，經(jīng)常包含丟失或額外堿基或氨基酸修正的多個核酸序列或蛋白（氨基酸）序列。在核酸序列的背景下，術(shù)語“序列同一性”“序列同一性百分比”或“百分比相同”指兩個序列中為最大對應(yīng)性進行比對時相同的殘基。序列同一性比較的長度可以是在全長基因組、全長基因編碼序列范圍內(nèi)，或希望至少約500至5000個核苷酸的片段。然而，也可以需要更 小片段之間的同一性，例如至少約9個核苷酸，通常至少約20至24核苷酸，至少約28至32核苷酸，至少約36或更多個核苷酸的片段。類似地，可以對氨基酸序列、全長蛋白范圍或其片段輕易地確定“序列同一性百分比”。合適地，片段是至少約8氨基酸長度，并且可以至多到約700個氨基酸。在此描述合適片段的實例。使用多種公開或可商業(yè)獲得的多重序列比對程序的任一種進行比對。這類程序的實例包括“ClustalW”、“CAPSequenceAssembly”、“MAP”和“MEME”，它們是通過互聯(lián)網(wǎng)上網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器可訪問的。這類程序的其他來源是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的?？商娲?，也使用VectorNTI應(yīng)用。也存在本領(lǐng)域已知的可以用來測量核苷酸序列同一性的多種算法，包括上述程序中所含的那些。作為另一個實例，可以使用FastaTM（GCG版本6.1中的程序）比較多核苷酸序列。FastaTM提供查詢對象和檢索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對結(jié)果和序列同一性百分比。例如，核酸序列之間的序列同一性百分比可以使用如通過引用方式結(jié)合在此的6.1版GCG中提供的FastaTM，采用其默認參數(shù)（字大小6和用于評分矩陣的NOPAM因子）來確定。用于氨基酸序列的多重序列比對程序也可獲得，例如，“ClustalX”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“LOCKMAKER”、“MEME”和“Match-Box”程序?？傮w上，這些程序的任一種何以默認設(shè)置使用，雖然本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以按需要改變這些設(shè)置?？商娲?，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以利用另一種算法或計算機程序，該另一種算法或計算機程序提供至少與參比的算法和程序提供的相同水平的同一性或比對結(jié)果。見，例如JDThomson（湯姆森）等人，（1999）Nucl.Acids.Res.（核酸研究），“Acomprehensivecomparisonofmultiplesequencealignments（多重序列比對的綜合比較）”，27(13):2682-2690。術(shù)語“血清型”是相對于具有血液學上與其他AAV血清型不同的衣殼的AAV的區(qū)別。與其他AAV相比，基于針對AAV的抗體之間缺少交叉反應(yīng)性確定血清學區(qū)分性。交叉反應(yīng)性典型地在中和抗體測定法中測量。對于這種測定 法，在兔或其他合適的動物模型中使用腺聯(lián)病毒生成針對特定AAV的多克隆血清。在這個測定法中，針對特定AAV生成的血清然后就其中和相同（同源）亦或異源AAV的能力進行測試。將實現(xiàn)50%中和的稀釋度視為中和抗體滴度。如果對于兩種AAV，異源滴度除以同源滴度的商以交互方式低于16，則將這兩個載體視為相同的血清型。相反，如果異源滴度對同源滴度的比率以交互方式是16或更大，則將兩個AAV視為不同的血清型。如在此使用，“末端β-半乳糖”是具有暴露的野生型結(jié)合位點的AAV9的細胞表面受體，使得它在空間上可用于或否則結(jié)合AAV9半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。除非另外說明，在用來修飾數(shù)字時，術(shù)語“約”意指±10%變異。如本說明書和權(quán)利要求書通篇使用，術(shù)語“包括（comprising）”和“包括（including）”是包括其他組分、元件、整數(shù)、步驟等。相反，術(shù)語“由……組成”及其變體排除其他組分、元件、整數(shù)、步驟等。II.治療方案在一個方面，本發(fā)明提供了一種改變具有AAV9衣殼的腺聯(lián)病毒（AAV）病毒載體的靶向和/或細胞攝取效率的方法。該方法包括向受試者遞送改變β-半乳糖細胞表面受體結(jié)合基于AAV9的遞送載具的可用性的組合物。在一個實施例中，希望的靶細胞表面包含具有末端唾液酸殘基和倒數(shù)第二β-半乳糖殘基的聚糖，該聚糖受本發(fā)明修飾以暴露β-半乳糖殘基。在一個實施例中，該方法包括向受試者遞送與一種神經(jīng)氨酸酶（NA）組合的AAV病毒載體，由此該神經(jīng)氨酸酶切除細胞表面上的末端唾液酸并且增加AAV由細胞攝取的效率。受試者可以用該神經(jīng)氨酸酶預(yù)處理。預(yù)處理意指將治療（例如，神經(jīng)氨酸酶）在AAV9介導(dǎo)的療法之前遞送至受試者。典型地，這涉給予AAV9-介導(dǎo)的療法之前給予預(yù)處理。然而，在某些實施例中，由AAV9載體編碼的轉(zhuǎn)基可以處在預(yù)處理后激活的調(diào)節(jié)型啟動子控制 下。在此類實施例中，AAV9載體可以在實施預(yù)處理之前或基本上與之同時給予，但是在預(yù)處理之后給予組成型啟動子的活化劑。神經(jīng)氨酸酶，也稱作唾液酸酶，特異性靶向唾液酸用于切除，并且可以商業(yè)購買或從多種來源獲得。在一個實施例中，神經(jīng)氨酸酶是外切神經(jīng)氨酸酶，即與內(nèi)部唾液酸相反，它特異性靶向末端唾液酸用于切除。在一個實施例中，在水解末端唾液酸殘基的α-(2→3)-，α-(2→6)-，α-(2→8)-糖苷鍵中，外切神經(jīng)氨酸酶發(fā)揮功能。在本發(fā)明中有用的神經(jīng)氨酸酶的實例包括例如細菌神經(jīng)氨酸酶、病毒和哺乳動物神經(jīng)氨酸酶。神經(jīng)氨酸酶（?；?神經(jīng)氨酰水解酶：EC3.2.1.18）可以來自任何來源，包括但不局限于產(chǎn)脲節(jié)桿菌（Arthrobacterureafaciens）、霍亂弧菌（Vibriocholerae）、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌（Clostridiumperfringens），或來自哺乳動物來源。在一個實施例中，神經(jīng)氨酸酶是細菌神經(jīng)氨酸酶，例如來自霍亂弧菌的III型神經(jīng)氨酸酶（Sigma）。然而，可以選擇其他神經(jīng)氨酸酶類型。在另一個實施例中，可以選擇病毒神經(jīng)氨酸酶，例如，流感神經(jīng)氨酸酶。仍在另一個實施例中，哺乳動物神經(jīng)氨酸酶可以選自例如人類、嚙齒類、類人猿或另一哺乳動物來源?？梢詫⑸窠?jīng)氨酸酶配制為液體，或它可以作為固體，例如，其中神經(jīng)氨酸酶與常規(guī)的藥物賦形劑混合，包括，例如，包埋或混合于生物可降解或生物可侵蝕基質(zhì)中。該基質(zhì)可以是延時釋放基質(zhì)。這些基質(zhì)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。神經(jīng)氨酸酶可以通過注射或通過舌下途徑施用。在一個實施例中，溶媒是容納于惰性容器內(nèi)部的水溶液（例如，鹽水，包括緩沖鹽水，或其他合適的液體運載體）。在另一個變例中，這種組合物為栓劑形式。液體形式的組合物可以借助標準方法給予，所述標準方法包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和皮下途徑、舌下或鼻內(nèi)途徑。在一個實施例中，運載體是0.9%氯化鈉（USP）中的0.1%至0.4%苯酚。神經(jīng)氨酸酶可以按例如約300U至約5000U神經(jīng)氨酸酶的劑量（即，等同于每劑量約15mg至250mg神經(jīng)氨酸酶）給予?？商娲?，可以使更低劑量，例 如處于約0.0001mg至0.01mg范圍內(nèi)?？商娲?，可以使用這兩個范圍之間的量，例如，從0.01mg至約250mg。在一個實施例中，本發(fā)明提供了AAV介導(dǎo)的基因遞送，其中向受試者基本上同時遞送AAV9病毒載體（或具有AAV9細胞（半乳糖）結(jié)合結(jié)構(gòu)域的進化枝F或載體）和神經(jīng)氨酸酶。神經(jīng)氨酸酶可以從AAV載體單獨配制和/或經(jīng)不同的途徑遞送，但是以基本上同時遞送。可替代地，將AAV病毒載體在進一步包括神經(jīng)氨酸酶的運載體中遞送至受試者。雖然預(yù)計身體將天然地清除酶，例如神經(jīng)氨酸酶，使得其作用僅是短暫的，但是在一個實施例中，可以遞送神經(jīng)氨酸酶抑制劑以中和任何延續(xù)的神經(jīng)氨酸酶作用。合適的神經(jīng)氨酸酶抑制劑是本領(lǐng)域已知的，并且可以包括可商購的抗病毒藥物，例如，奧司他韋（Tamiflu）、扎那米韋（Relenza）、Lanimavir（Inavir）和帕拉米韋。全身用神經(jīng)氨酸酶抑制劑，例如奧司他韋的典型劑量方案是口服約75mg，一天兩次，持續(xù)5天或如處方更長時間。然而，對于本發(fā)明中的使用，可能希望更短給藥方案，例如，1-2天，和/或更低或更高每天劑量?？商娲兀瑢τ诜蜗嚓P(guān)應(yīng)用，可能希望吸入型神經(jīng)氨酸酶抑制劑，例如扎那米韋。典型地，這種藥物的劑量是通過吸入10mg，每天二次，持續(xù)5天或如處方更長時間。然而，對于本發(fā)明中的使用，可能需要更短給藥方案，例如，1-2天，和/或更低或更高每天劑量?？商娲?，可以選擇另一種類型的神經(jīng)氨酸酶抑制劑。在另一個方面，通過功能性消除具有AAV9受體的第一細胞亞群上暴露的細胞表面β-半乳糖殘基（例如，具有末端β-半乳糖殘基的細胞表面聚糖），將AAV載體再指引偏離具有進化枝F受體的第一細胞亞群，并且由此使AAV重新靶向至受試者中具有進化枝F受體的第二細胞亞群和/或增加接觸第二細胞亞群的AAV的數(shù)目，由此增加被這些細胞攝取。在一個實施例中，酶促移除具有AAV細胞表面受體的第一細胞亞群中的β-半乳糖，由此減少或消除AAV由所述細胞亞群攝取，并使AAV重新靶向至所述受試者中具有AAV9受體的第二細胞亞 群。在一個實施例中，將功能性封閉第一細胞亞群的表面上結(jié)合結(jié)構(gòu)域的部分局部遞送至第一細胞亞群。典型地，這種封閉作用仍保持相對局限于靠近遞送部位定位的細胞。例如，局部遞送可以例如通過吸入、鼻內(nèi)滴注、直接注射至關(guān)節(jié)或直接遞送至眼部中，連同通過本領(lǐng)域已知的多種其他方法來實現(xiàn)?？梢赃f送化合物以消除半乳糖苷酶、凝集素或其他封閉部分的作用。例如，可以將抗β-半乳糖苷酶遞送至受試者。例如，可以利用化合物，例如GT-2558[US4,497,797]或苯基乙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷[PETG]?？商娲?，可以遞送另一種部分以加速β-半乳糖苷酶或凝集素的清除。然而，預(yù)計這種部分（例如，半乳糖苷酶酶）將由試者的身體輕易地清除。在一個實施例中，通過遞送與AAV載體組合的半乳糖苷酶至第一細胞亞群，酶促地移除β-半乳糖?？梢允褂枚喾Nβ-半乳糖苷酶。在一個實施例中，可以使用同工型1[GLB1，RefSeq:NM_000404；UniProtP16278。合適的β-半乳糖苷酶也是商業(yè)可獲得，例如來自NewEnglandBiolabs公司、RocheAppliedScienc公司和SigmaAldrich公司（來自大腸桿菌（E.Coli）來源）?？梢匀缟衔膶ι窠?jīng)氨酸酶所述配制并遞送這種酶?？梢岳梅秶鷱拿看谓o藥從約0.0001mg至約250mg或每次給藥約0.001mg至約100mg的β-半乳糖苷酶的劑量。這些劑量可以按需要或希望進行調(diào)節(jié)。通過切去半乳糖并顯著減少或基本上消除其中切除了半乳糖的那些細胞攝取AAV9，β-半乳糖苷酶發(fā)揮作用。以此方式，使AAV9載體重新靶向至保留細胞表面半乳糖的其他細胞。在另一個實施例中，將結(jié)合結(jié)合β-半乳糖殘基和特別是末端β-半乳糖殘基的凝集素與如在此所述的AAV載體組合遞送至受試者。在有用的凝集素當中，有鈣依賴性（C型）凝集素，例如人清道夫受體C型凝集素（SRCL）和人巨噬細胞鈣依賴性（C型）凝集素。其他有用的凝集素包括雞冠刺桐（ErythrinaCristagalli）凝集素（ECL）和巨噬細胞半乳糖凝集素（MGL）。另外，其他凝集 素可以包括凝集素、花生凝集素或麥胚凝集素。多種的這些凝集素已經(jīng)在文獻中描述和/或可以通過商業(yè)來源（例如，Vectorlabs公司）獲得。如在此所述，可以將凝集素配制在合適的液體運載體中，并且可以包括按以下范圍的凝集素：從200至10,000μg/ml，如從200至5000μg/ml，例如從200至3000μg/ml，如從200至2000μg/ml，例如從200至1500μg/ml。仍在另一個實施例中，可以將抗末端半乳糖抗體遞送至受試者。制備如在此所述的基于AAV9的載體和其他AAV載體的方法是已知的。見，例如US公布的專利申請?zhí)?007/0036760（2007年2月15日）將其通過引用結(jié)合在此。本發(fā)明不局限于使用AAV9或其他進化枝FAAV氨基酸序列，但是涵蓋通過本領(lǐng)域已知的其他方法（例如，通過化學合成、通過其他合成技術(shù)或通過其他方法）產(chǎn)生的包含末端β-半乳糖結(jié)合的肽和/或蛋白。可以使用多種技術(shù)輕易地產(chǎn)生在此提供的任何AAV衣殼的序列。合適的產(chǎn)生技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。見，例如Sambrook（薩姆布魯克）等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual（分子克隆實驗指南）,ColdSpringHarborPress（冷泉港出版社）(ColdSpringHarbor（冷泉港）,NY)。可替代地，肽也可以通過熟知的固相肽合成方法合成（Merrifield（梅里菲爾德）,(1962)J.Am.Chem.Soc.(美國化學會志),85:2149；Stewart(斯圖爾特)和Young（揚）,SolidPhasePeptideSynthesis（固相肽合成）（Freeman公司,SanFrancisco（圣弗朗斯科）,1969）第27-62頁）。這些和其他合適的產(chǎn)生方法處于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)，并且不是本發(fā)明的限制。產(chǎn)生如在此所述的重組腺聯(lián)病毒（AAV）（例如，具有β-半乳糖細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的AAV）的方法是已知的。此類方法涉及培養(yǎng)宿主細胞，該宿主細胞包含編碼AAV衣殼的核酸序列；功能性rep基因；最少由AAV反向末端重復(fù)序列（ITR）和轉(zhuǎn)基因組成的微型基因；和允許將所述微型基因包裝成AAV衣殼蛋白的足夠輔助子功能?？梢韵蛩拗骷毎词教峁┮谒拗骷毎信囵B(yǎng)所需要的組分，以使AAV微型基因包裝于AAV衣殼內(nèi)。可替代地，所需要的組分（例如，微型基因、rep序列、cap序列和/或輔助子功能）的任一種或多種可以由穩(wěn)定的宿主細胞提供，其中使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法，已經(jīng)工程化所述宿主細胞以便包含一種或多種所需要的組分。最合適地，這種穩(wěn)定的宿主細胞將包含在誘導(dǎo)型啟動子控制下的所需要的一種或多種組分。然而，所需要的一種或多種組分可處在組成型啟動子的控制下。在討論適合隨轉(zhuǎn)基因一起使用的調(diào)節(jié)元件時，在此提供了合適的誘導(dǎo)型啟動子和組成型啟動子的實例。仍在另一個替代方案中，選擇的穩(wěn)定宿主細胞可以包含在組成型啟動子控制下的一種或多種選定組分和在一個或多個誘導(dǎo)型啟動子控制下的其他一種或多種選定組分。例如，可以產(chǎn)生一種穩(wěn)定宿主細胞，該宿主細胞源自293細胞（其包含在組成型啟動子控制下的E1輔助子功能），但是包含在誘導(dǎo)型啟動子控制下的rep和/或cap蛋白?？梢杂杀绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員產(chǎn)生其他穩(wěn)定的宿主細胞。可以將用于產(chǎn)生本發(fā)明的rAAV所需要的微型基因、rep序列、cap序列和輔助子功能以轉(zhuǎn)移其上所攜帶序列的任何遺傳元件的形式遞送至包裝宿主細胞?？梢酝ㄟ^任何適合的方法（包括在此所述的那些方法）遞送選定的遺傳元件。用來構(gòu)建體本發(fā)明任何實施例的方法是核酸操作領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的，并且包括基因工程、重組工程和合成技術(shù)。參見，例如Sambrook（薩姆布魯克）等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual（分子克隆實驗指南）,ColdSpringHarborPress（冷泉港出版社）,ColdSpringHarbor（冷泉港）,NY。類似地，產(chǎn)生rAAV病毒粒的方法是熟知的并且對合適方法的選擇不限制本發(fā)明。參見，例如K.Fisher（費舍爾）等人，（1993）J.Virol.（病毒學雜志）,70:520-532和美國專利號5,478,745。除非另外說明，在此所述的AAVITR和其他選擇的AAV組分可以輕易地選自任何AAV之間。這些ITR或其他AAV組分可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可 獲得的技術(shù)從AAV序列輕易分離。這種AAV可以分離或從學術(shù)、商業(yè)或公共來源（例如，theAmericanTypeCultureCollection（美國典型培養(yǎng)物保藏中心），Manassas（馬納薩斯），弗吉尼亞州）獲得?？商娲兀梢酝ㄟ^參考已公開的序列，例如在文獻或數(shù)據(jù)庫（例如，GenBankPubMed等）中可獲得的序列，通過合成手段或其他合適手段獲得AAV序列。A.微型基因微型基因最少由轉(zhuǎn)基因及其調(diào)節(jié)序列和5′及3′AAV反向末端重復(fù)序列（ITR）組成。在一個實施例中，使用AAV血清型2的ITR。然而，可以選擇來自其他合適來源的ITR。正是將這種微型基因包裝在衣殼蛋白中并遞送至選擇的宿主細胞。1.轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因是與所述轉(zhuǎn)基因側(cè)翼的載體序列異源的核酸序列，編碼感興趣的多肽、蛋白或其他產(chǎn)物。核酸編碼序列以允許轉(zhuǎn)基因在宿主細胞中轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或表達的方式與調(diào)節(jié)組分有效連接。轉(zhuǎn)基因序列的組成將取決于所得載體將投入的用途。例如，一種類型的轉(zhuǎn)基因序列包括在表達時產(chǎn)生可檢測信號的報告序列。這些編碼序列，與驅(qū)動它們表達的調(diào)節(jié)元件連接時，提供通過常規(guī)手段可檢測的信號，所述常規(guī)手段包括酶測定法、射線照相測定法、比色測定法、熒光測定法或其他攝譜測定法、熒光活化細胞分選測定法和免疫學測定法（包括酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、放射免疫測定（RIA）和免疫組織化學）。然而，希望地，轉(zhuǎn)基因是一種非標記序列，其編碼在生物學和醫(yī)學中有用的產(chǎn)物，例如蛋白、肽、RNA、酶、顯性負性突變體或催化性RNA。希望的RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖體的RNA、催化性RNA、siRNA、小發(fā)夾RNA、反式剪接RNA和反義RNA。有用RNA序列的一個實例是抑制或取消靶定核酸序列在治療的受試者中表達的序列。典型地，合適的靶序列包括腫瘤學靶和病毒疾病。對這類靶的 舉例，參見下文在涉及免疫原的部分中所鑒定的腫瘤學靶和病毒。轉(zhuǎn)基因可以用來糾正或改善基因缺陷，可以包括其中正?；蛞缘陀谡Ｋ奖磉_的缺陷或其中不表達功能性基因產(chǎn)物的缺陷?？商娲兀D(zhuǎn)基因可以向細胞提供在細胞類型中或在宿主中不天然表達的產(chǎn)物。優(yōu)選類型的轉(zhuǎn)基因序列編碼在宿主細胞中表達的治療性蛋白或多肽。本發(fā)明進一步包括使用多個轉(zhuǎn)基因。在某些情況下，一個不同的轉(zhuǎn)基因可以用來編碼蛋白的每種亞基，或用來編碼不同的肽或蛋白。在編碼蛋白亞基（例如，免疫球蛋白、血小板衍生生長因子或肌養(yǎng)蛋白）的DNA的尺寸大時，這是合乎需要的。為了細胞產(chǎn)生多亞基蛋白，將細胞用包含每一個不同亞基的重組病毒感染。可替代地，蛋白的不同亞基可以由相同的轉(zhuǎn)基因編碼。在這種情況下，單一轉(zhuǎn)基因包括編碼每一個亞基的DNA，其中每個亞基的DNA由內(nèi)部核酶進入位點（IRES）隔開。在編碼每個亞基的DNA的尺寸小，（例如，編碼這些亞基和IRES的DNA的總尺寸小于5千堿基）時，這是合乎需要的。作為IRES的替代，DNA可以由編碼2A肽的序列分隔，所述2A肽在翻譯后事件中自我切割。見，例如MLDonnelly（唐納利）等人，（1997年1月）J.Gen.Virol.（普通病毒學雜志）,78(Pt1):13-21；S.Furler（富勒）,S等人，（2001年6月）GeneTher.（基因治療）,8(11):864-873；H.Klump（克倫普）等人，（2001年5月）GeneTher.（基因治療）,8(10):811-817。這種2A肽明顯小于IRES，使得它在空間成為限制性因素時特別適用。更經(jīng)常地，在轉(zhuǎn)基因龐大、由多個亞基組成或兩個轉(zhuǎn)基因共遞送時，將攜帶希望的一個或多個轉(zhuǎn)基因或亞基的rAAV共給予，以允許它們在體內(nèi)連環(huán)體化，形成單一載體基因組。在此類實施例中，第一AAV可以攜帶表達單一轉(zhuǎn)基因的表達盒，并且第二AAV可以攜帶表達不同轉(zhuǎn)基因的表達盒，用于在宿主細胞中共表達。然而，選擇的轉(zhuǎn)基因可以編碼任何生物活性產(chǎn)物或其他產(chǎn)物，例如，研究所需要的產(chǎn)物。合適的轉(zhuǎn)基因可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員輕易地選擇。 對轉(zhuǎn)基因的選擇不視為限制本發(fā)明。2.調(diào)節(jié)元件除上文對微型基因所鑒定的主要元件之外，載體還包括與轉(zhuǎn)基因以允許其在細胞中轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或表達的方式可工作地連接的常規(guī)控制元件，其中該細胞用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染或用本發(fā)明產(chǎn)生的病毒感染。如在此使用，“可工作地連接的”序列包括與感興趣的基因連續(xù)的表達控制序列和以反式方式發(fā)揮作用或在遠距離控制目的基因的表達控制序列。表達控制序列包括適當?shù)霓D(zhuǎn)錄起始序列、終止序列、啟動子和增強子序列；有效RNA加工信號如剪接和多聚腺苷化（polyA）信號；穩(wěn)定胞質(zhì)mRNA的序列；增強翻譯效率的序列（即，Kozak共有序列）；增強蛋白穩(wěn)定性的序列；和在需要時，增強編碼產(chǎn)物分泌的序列。許多表達控制序列，包括天然、組成型、誘導(dǎo)型和/或組織特異性啟動子，是本領(lǐng)域已知的并且可以利用。組成型啟動子的實例包括而不局限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒羅氏肉瘤病毒（RSV）LTR啟動子（任選地連同RSV增強子）、細胞巨化病毒（CMV）啟動子（任選地連同CMV增強子）[見，例如，Boshart（波沙特）等人，（1985）Cell（細胞）,41:521-530]，SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶（PGK）啟動子和EF1啟動子[Invitrogen公司]。誘導(dǎo)型啟動子允許調(diào)節(jié)基因表達并且可以受外來供應(yīng)的化合物、環(huán)境因素（例如溫度）、或存在特定生理狀態(tài)（例如，急性期）、細胞具體分化狀態(tài)調(diào)節(jié)或僅在復(fù)制型細胞中受調(diào)節(jié)。誘導(dǎo)型啟動子和誘導(dǎo)型系統(tǒng)從多種商業(yè)來源可獲得的，包括而不局限于Invitrogen公司、Clontech公司和Ariad公司。已經(jīng)描述了許多其他系統(tǒng)并且可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員輕易地選擇。受外源供應(yīng)的化合物調(diào)節(jié)的誘導(dǎo)型啟動子的實例包括鋅誘導(dǎo)型羊金屬硫蛋白（MT）啟動子、地塞米松（Dex）誘導(dǎo)型小鼠乳腺瘤病毒（MMTV）啟動、T7聚合酶啟動子系統(tǒng)[國際專利公開號WO98/10088]；蛻皮素昆蟲啟動子[No（諾）等人，（1996）Proc.Natl. Acad.Sci.USA（美國國家科學院院刊），93:3346-3351]、四環(huán)素阻遏型系統(tǒng)[Gossen（戈森）等人，（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（美國國家科學院院刊）,89:5547-5551]、四環(huán)素誘導(dǎo)型系統(tǒng)[Gossen（戈森）等人，（1995）Science（科學）,268:1766-1769，還見Harvey（哈維）等人，（1998）Curr.Opin.Chem.Biol.（化學生物學新見）,2:512-518]、RU486誘導(dǎo)型系統(tǒng)[Wang（王）等人，（1997）Nat.Biotech.（自然生物技術(shù)）,15:239-243和Wang（王）等人，（1997）GeneTher.（基因治療）,4:432-441]和雷帕霉素誘導(dǎo)型系統(tǒng)[Magari（馬加里）等人，（1997）J.Clin.Invest.（臨床研究雜志）,100:2865-2872]。可以在這種背景下有用的其他類型的誘導(dǎo)型啟動子是受特定生理狀態(tài)例如，急性期、溫度、細胞特定分化狀態(tài)調(diào)節(jié)或僅在復(fù)制型細胞中受調(diào)節(jié)的那些。在另一個實施例中，將使用轉(zhuǎn)基因的天然啟動子。當希望轉(zhuǎn)基因的表達應(yīng)當模擬天然表達時，天然啟動子可以是優(yōu)選的。當轉(zhuǎn)基因的表達必須按時間方式或發(fā)育方式或以組織特異性方式或響應(yīng)于特定轉(zhuǎn)錄刺激而調(diào)節(jié)時，可以使用天然啟動子。在另外實施例中，也可以使用其他天然表達控制元件，例如增強子元件、多聚腺苷化位點或Kozak共有序列來模擬天然表達。轉(zhuǎn)基因的另一個實施例包括與組織特異性啟動子可工作地連接的基因。例如，如果希望骨骼肌中表達，則應(yīng)當使用在肌肉中有活性的啟動子。這些包括來自編碼骨骼肌β-肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈2A、肌養(yǎng)蛋白、肌肉肌酸激酶的基因的啟動子，以及活性高于天然存在啟動子的合成性肌肉啟動子（見Li（李）等人，（1999）Nat.Biotech.（自然生物技術(shù)）,17:241-245）。具有組織特異性的啟動子的實例對肝臟而言是已知的（白蛋白，Miyatake（宮武）等人，（1997）J.Virol.（病毒學雜志）,71:5124-32；乙型肝炎病毒核心啟動子，Sandig（桑蒂格）等人，（1996）GeneTher.（基因治療）,3:1002-9；α-胎蛋白（AFP），Arbuthnot（阿巴思諾特）等人，（1996）Hum.GeneTher.（人類基因治療）,7:1503-14）、骨鈣素（Stein（斯坦因）等人，（1997）Mol.Biol.Rep. （分子生物學報告）,24:185-96）；骨涎蛋白（Chen（陳）等人，（1996）J.BoneMiner.Res.（骨與礦質(zhì)研究雜志）,11:654-64）、淋巴細胞（CD2，Hansal（韓賽爾）等人，（1998）J.Immunol.（免疫學雜志）,161:1063-8；免疫球蛋白重鏈；T細胞受體鏈)，神經(jīng)元啟動子如神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）啟動子（Andersen(安徒生)等人，（1993）Cell.Mol.Neurobiol.(細胞與分子神經(jīng)生物學),13:503-15）、神經(jīng)微絲輕鏈基因（Piccioli(皮奇奧利)等人，（1991）Proc.Natl.Acad.Sci（美國國家科學院院刊）.USA,88:5611-5），和神經(jīng)元特異性vgf基因（Piccioli(皮奇奧利)等人，（1995）Neuron(神經(jīng)元),15:373-84），連同其他。為在此簡化稱謂，將轉(zhuǎn)基因、啟動子/增強子和5′和3′AAVITR的組合稱作“微型基因”。提供了本發(fā)明教授內(nèi)容的情況下，可以通過求助于常規(guī)技術(shù)做出這種微型基因的設(shè)計。3.遞送微型基因至包裝宿主細胞可以在遞送至宿主細胞的任何適合的載體（例如，質(zhì)粒）上的攜帶微型基因?？梢詫⒂糜诒景l(fā)明中的質(zhì)粒工程化，使得它們適于在原核細胞、哺乳動物細胞或這兩者中復(fù)制并且任選地整合。這些質(zhì)粒（或攜帶5′AAVITR異源分子-3′AAVITR的其他載體）包含允許微型基因在真核生物和/或原核生物中復(fù)制的序列和用于這些系統(tǒng)的選擇標記。選擇標記或報告基因可以包括編碼遺傳霉素、潮霉素或嘌呤霉素（連同其他）抗性的序列。質(zhì)粒也可以包含某些可選擇報告基因或標記基因，它們可以用來發(fā)出載體在細菌細胞中存在的信號，例如氨芐青霉素抗性。質(zhì)粒的其他組分可以包括復(fù)制起點和擴增子，例如使用愛潑斯坦－巴爾病毒核抗原的擴增子系統(tǒng)。這種擴增子系統(tǒng)或其他類似的擴增子組分允許細胞中的高拷貝數(shù)附加體復(fù)制。優(yōu)選地，將攜帶微型基因的分子轉(zhuǎn)染至細胞中，在那里它可以暫時存在?？商娲兀⑿突颍〝y帶5′AAVITR-異源分子-3′ITR）可以按染色體方式亦或作為附加體，穩(wěn)定整合入宿主細胞的基因組中。在某些實施例中，微型基因可以按多拷貝形式存在，任選地按頭對頭、頭對 尾或尾對尾連環(huán)體形式存在。合適的轉(zhuǎn)染技術(shù)是已知的，并且可以輕易地用于遞送微型基因至宿主細胞。通常，在通過轉(zhuǎn)染遞送包括微型基因的載體時，載體按相對于約1×104細胞至約1×1013細胞、或約1×105細胞從約5μg至約100μgDNA、約10μg至約50μgDNA的量遞送。然而，考慮這類因素如選擇的載體、遞送方法和選擇的宿主細胞，可以調(diào)節(jié)載體DNA對宿主細胞的相對量。B.包裝宿主細胞除微型基因外，宿主細胞還包含驅(qū)動本發(fā)明的新穎AAV衣殼蛋白（或包括其片段的衣殼蛋白）在宿主細胞中表達的序列，以及來源與微型基因中發(fā)現(xiàn)的AAVITR的來源或交叉互補來源相同的rep序列。包裝宿主細胞也需要輔助子功能，以便包裝本發(fā)明的rAAV。這類輔助子功能是本領(lǐng)域熟知的并且將不在此復(fù)制。類似地，用于產(chǎn)生具有AAV衣殼的合適載體的方法是已知的[見，例如美國公開專利申請?zhí)朥S2007/0036760]。因此，本發(fā)明進一步提供了使用本發(fā)明的新AAV的核酸序列和氨基酸序列產(chǎn)生的載體。這類載體可用于多種目的，包括用于遞送治療性分子和用于疫苗方案中。為遞送治療性分子，特別希望包含本發(fā)明新AAV的衣殼的重組AAV。包含本發(fā)明新穎AAV序列的這些載體或其他載體構(gòu)建體可以用于疫苗方案中，例如，用于共遞送細胞因子或用于遞送免疫原本身。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)可以產(chǎn)生具有rAAV進化枝F衣殼、AAV9衣殼的AAV和/或具有包括AAV9β-半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的AAV衣殼的載體。在一個實施例中，可以使用來自單一AAV的全長衣殼，例如，hu.14/AAV9[SEQIDNO:1]。在另一個實施例中，可以產(chǎn)生包含AAV9衣殼的一個或多個片段（例如，包含AAV9β-半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段）的全長衣殼，其中這些片段與來自另一個選擇的AAV或來自相同AAV的異源（即，不連續(xù)）部分的序列符合可讀框地融合。仍在另一個實施例中，使用相似技術(shù)，裝配 出具有突變AAV9衣殼的載體或經(jīng)工程化以包含AAV9半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的AAV?？梢愿鶕?jù)公布的方法，將上述重組載體遞送至宿主細胞。可以向人類或非人哺乳動物患者給予rAAV，其優(yōu)選地懸浮在生理相容性運載體中。鑒于轉(zhuǎn)移病毒導(dǎo)致的適應(yīng)癥，合適的運載體可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員輕易地選擇。例如，一種合適的運載體包括鹽水，其可以用多種緩沖溶液（例如，磷酸鹽緩沖鹽水）配制。其他示例性運載體包括無菌鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、葡聚糖、瓊脂、果膠、花生油、芝麻油、和水。對運載體的選擇不限制本發(fā)明。任選地，除rAAV和一種或多種運載體之外，本發(fā)明的組合物可以包含其他的常規(guī)藥用成分，例如防腐劑或化學穩(wěn)定劑。合適的示例性防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、硫二氧化物、沒食子酸丙酯、尼泊金酯、乙基香草醛、丙三醇、苯酚和對氯酚。合適的化學穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。將載體以足夠的量給予，以便轉(zhuǎn)染細胞并且提供足夠水平的基因轉(zhuǎn)移和表達，以便提供治療益處，而沒有過多副作用，或具有醫(yī)學可接受的生理作用，這可以由醫(yī)學領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。常規(guī)和可藥用的施用途徑包括但不局限于、直接遞送至希望的器官（例如，肺、心或腦）、口服、吸入、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、動脈內(nèi)、眼球內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)和其他腸胃外給予途徑。如果希望，可以組合給予途徑。病毒載體的劑量將主要取決于多種因素，例如正在治療的病狀、患者的年齡、重量和健康，并且可以因此在患者間變化。例如，病毒載體的治療有效的人用劑量總體上處于從約0.1mL至約100mL溶液的范圍內(nèi)，其中所述溶液包含從約1×109至1×1016個基因組濃度的病毒載體。用于遞送至大器官（例如，肺、骨骼肌、心臟或肺）或中樞神經(jīng)系統(tǒng)（例如，腦）的優(yōu)選人用劑量可以是以約1至100mL體積每1kg約5×1010至5×1013個AAV基因組。用于 遞送至眼部（例如，視網(wǎng)膜）的優(yōu)選劑量是以約0.1mL至1mL體積約5×109至5×1012個基因組副本。將調(diào)節(jié)劑量以平衡治療益處與任何副作用，并且這類劑量可以取決于采用重組載體的治療應(yīng)用而變化。可以監(jiān)測轉(zhuǎn)基因表達的水平以確定劑量的頻率，從而產(chǎn)生病毒載體、優(yōu)選地包含微型基因的AAV載體。如基于AAV9的載體的實例中所示，在酶促地移除末端SA時，細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)增加，提示相對于SA最常觀察的倒數(shù)第二單糖-半乳糖-介導(dǎo)AAV9轉(zhuǎn)導(dǎo)。這與多個其他AAV血清型相反，其中其他AAV血清型借助具有末端唾液酸（SA）的聚糖攝取，這是常見進入模式。在缺乏參與糖蛋白生物生成的酶的細胞和凝集素干擾研究中驗證了借助末端SA攝取基于AAV9的載體。在聚糖結(jié)合分析中展示AAV9與具有末端半乳糖的聚糖結(jié)合。通過以下方式展示這種途徑對于肺定向基因轉(zhuǎn)移的相關(guān)性：將AAV9載體與神經(jīng)氨酸酶一起共滴注至小鼠肺中，這導(dǎo)致末端半乳糖在傳導(dǎo)氣道上皮細胞的頂端表面上暴露和載體介導(dǎo)的這些細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)大幅度增加，所述細胞是用于囊性纖維化的基因治療的相關(guān)靶。下文提供用于由包含AAV的本發(fā)明載體遞送的治療性產(chǎn)物和免疫原性產(chǎn)物的實例。這些載體可以用于多種方案，如在此所述。額外地，這些載體可以在希望的方案中與一種或多種其他載體或活性成分組合遞送。例如，合適的轉(zhuǎn)基因可以包括偏好靶向肺（包括傳導(dǎo)氣道上皮細胞）的那些。這類轉(zhuǎn)基因可以包括可用于治療囊性纖維化的那些基因，例如包括囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白（CFTR）基因，包括，例如，一個或多個微型CFTR基因[L.Zhang（張）等人，（1998年8月18日）Proc.Natl.AcadSciUSA（美國國家科學院院刊）,95(17):10158-63]。類似地，可以使用治療其他肺部病狀的基因，包括例如，抗炎細胞因子或?qū)τ谥委烠OPD和其他肺部病癥有用的其他分子。在另一個實例中，可用于治療視網(wǎng)膜和/或眼部病癥的轉(zhuǎn)基因可以更一般地包括例如視網(wǎng)膜色素上皮特異性65kDa蛋白（RPE65）（用于治療 Leibers先天性黑矇（LCA）、bPDE和AIPL1色素上皮驅(qū)動因子（PEDF）（例如，用于治療黃斑變性和糖尿病性腎病）、抗血管生成性因子（包括例如抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）（例如，用于治療濕式年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD））以及與視網(wǎng)膜色素變性和LCA及視錐-視桿營養(yǎng)不良相關(guān)的其他基因。在仍另一個實例中，可以選擇可用于治療關(guān)節(jié)病癥（例如，類風濕性關(guān)節(jié)炎）的轉(zhuǎn)基因。這類轉(zhuǎn)基因可以例如是腫瘤壞死因子（TNF）α或白介素1（IL-1）阻滯劑例如像，抗TNFα單克隆抗體，可溶性TNFα受體、IL-1的II型可溶性受體、IL-1受體拮抗藥（IL-1Ra）、抗炎細胞因子（例如，IL-4、IL-10、IL1）。這類拮抗藥可以例如是抗體或Fab，或其功能性片段或另一個部分。仍其他基因可以包括對于治療與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的各種病狀（例如包括帕金森病、阿爾茨海默病和貯積?。┯杏玫哪切┗?；與先病天性心臟相關(guān)的治療性基因（例如，SERCA2a、血管生成素-1（Ang1）和Ang2）、與全身性溶酶體貯積病和肌肉消耗病癥（例如，肌營養(yǎng)不良蛋白、微型肌養(yǎng)蛋白）相關(guān)的基因等?？梢赃x擇由轉(zhuǎn)基因編碼的其他有用的治療性產(chǎn)物用于希望的適應(yīng)癥。這類轉(zhuǎn)基因包括激素和生長和分化因素包括而不局限于、胰島素、胰高血糖素、生長激素（GH）、甲狀旁腺激素（PTH）、生長激素釋放因子（GRF）、促卵泡激素（FSH）、促黃體激素（LH）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血管生成素、血管抑制素、粒細胞集落刺激因子（GCSF）、紅細胞生成素（EPO）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、酸性成纖維細胞生長因子（aFGF）、表皮生長因子（EGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）、胰島素生長因子I和II（IGF-I和IGF-II）、轉(zhuǎn)化生長因子或α超家族中的任一種，包括TGFα、活化素、抑制素或骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）BMP1-15中的任一種、調(diào)蛋白/神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白/ARIA/neu分化因子（NDF）生長因子家族中的任一種、神經(jīng)生長因子（NGF）、腦衍生神 經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)因子NT-3和NT-4/5、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（CNTF）、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、神經(jīng)秩蛋白、聚集蛋白、腦信號蛋白/腦衰蛋白家族中的任一種、神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子-1（Netrin-1）和神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子-2（Netrin-2）、肝細胞生長因子（HGF）、ephrin、noggin、音猬因子和酪氨酸羥化酶。其他有用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物包括調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的蛋白，包括而不局限于細胞因子和淋巴因子如促血小板生成素（TPO）、白介素（IL）IL-1至IL-25（例如包括IL-2、IL-4，IL-12和IL-18）、單核細胞趨化蛋白、白血病抑制性因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、Fas配體、腫瘤壞死因子α和β、干擾素α、β和γ、干細胞因子、flk-2/flt3配體。由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的基因產(chǎn)物也用于本發(fā)明中。這些包括而不局限于免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗體、單鏈抗體、T細胞受體、嵌合T細胞受體、單鏈T細胞受體、I類和II類MHC分子，以及工程化的免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因產(chǎn)物也包括補體調(diào)節(jié)蛋白如補體調(diào)節(jié)蛋白、膜輔因子蛋白(MCP)、衰變加速因子（DAF）、CR1、CF2和CD59。仍其他有用的基因產(chǎn)物包括激素、生長因子、細胞因子、淋巴因子、調(diào)節(jié)蛋白和免疫系統(tǒng)蛋白的多種受體的任一種。本發(fā)明包括用于膽固醇調(diào)節(jié)和/或脂質(zhì)調(diào)節(jié)的受體、包括低密度脂蛋白（LDL）受體、高密度脂蛋白（HDL）受體、極低密度脂蛋白（VLDL）受體和清道夫受體。本發(fā)明也涵蓋基因產(chǎn)物，例如類固醇激素受體超家族的成員，包括糖皮質(zhì)激素受體和雌激素受體、維生素D受體和其他核受體。此外、有用的基因產(chǎn)物包括轉(zhuǎn)錄因子如jun、fos、max、mad、血清應(yīng)答因子（SRF）、AP-1、AP2、myb、MyoD和肌形成蛋白、包含ETS框的蛋白、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT框結(jié)合蛋白、干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF-1）、Wilm腫瘤蛋白、ETS結(jié)合蛋白、STAT、GATA框結(jié)合蛋白，例如 GATA-3和叉頭翼狀螺旋蛋白家族。其他有用的基因產(chǎn)物包括氨基甲?；铣擅窱、鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶、精氨酸琥珀酸鹽合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羥化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、膽色素原脫氨酶、胱硫醚β-合酶、支鏈酮酸脫羧酶、白蛋白、異戊酰基-CoA脫氫酶、丙酰基CoA羧化酶、甲基丙二酸單酰CoA變位酶、戊二酰CoA脫氫酶、胰島素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧酸酯、肝的磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脫羧酶、H-蛋白、T-蛋白、囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)蛋白（CFTR）序列和肌營養(yǎng)不良蛋白基因產(chǎn)物[例如，微型或小型肌養(yǎng)蛋白]。仍其他有用的基因產(chǎn)物包括酶，如可以在酶替代療法中有用的酶，該酶替代療法在因缺乏酶活性所致的多種病狀中是有用的。例如，包含甘露糖-6-磷酸的酶可以用于溶酶體貯積疾病療法中（例如，合適的基因包括編碼β-葡糖醛酸糖苷酶（GUSB）的基因）。仍其他有用的基因產(chǎn)物包括用于治療血友病那些基因產(chǎn)物，包括血友病B（包括因子IX）和血友病A（包括因子VIII及其變體，例如異二聚體的輕鏈和重鏈和B缺失的結(jié)構(gòu)域；美國專利號6,200,560和美國專利號6,221,349）。因子VIII基因編碼2351個氨基酸，并且這種蛋白具有6個結(jié)構(gòu)域，從氨基至末端羧基端命名為A1-A2-B-A3-C1-C2[Wood（伍德）等人，（1984）Nature（自然），312:330；Vehar（費哈爾）等人，（1984）Nature（自然）312:337；和Toole(圖爾)等人，（1984）Nature（自然）,342:337]。人因子VIII在細胞內(nèi)部被加工，以產(chǎn)生異二聚體，其主要包括：包含A1、A2和B結(jié)構(gòu)域的重鏈和包含A3、C1和C2結(jié)構(gòu)域的輕鏈。這種單鏈多肽和異二聚體均在血漿中環(huán)化成無活性前體，直至由凝血酶在A2和B結(jié)構(gòu)域之間的切割激活，這釋放B結(jié)構(gòu)域并且產(chǎn)生由A1和A2結(jié)構(gòu)域組成的重鏈。B結(jié)構(gòu)域在蛋白的激活的促凝血形式中缺失。額外地，在天然蛋白中，在B結(jié)構(gòu)域側(cè)翼的兩條多肽鏈（“a”和“b”）與二價鈣陽離子結(jié)合。在一些實施例中，微型基因包括因子VIII重鏈的編碼10氨基酸信號序列的前57對堿基連同人生長激素（hGH）多聚腺苷化序列。在替代實施例中，微型基因進一步包含A1和A2結(jié)構(gòu)域，連同來自B結(jié)構(gòu)域N末端的5個氨基酸，和/或B結(jié)構(gòu)域C末端的85個氨基酸，以及A3、C1和C2結(jié)構(gòu)域。仍在其他實施例中，在單個微型基因中提供編碼因子VIII重鏈和輕鏈的核酸，該微型基因由編碼B結(jié)構(gòu)域14個氨基酸的42個核苷酸分隔[美國專利號6,200,560]。如在此使用，治療有效量是AAV載體的量，該量產(chǎn)生足夠量的因子VIII以縮減受試者血液凝血花費的時間。通常，與非血友病患者的約10分鐘相比，具有小于1%正常水平的因子VIII的嚴重血友病患者具有大于60分鐘的全血凝固時間。本發(fā)明不局限于任何特定的因子VIII序列。已經(jīng)分離和產(chǎn)生許多天然和重組形式的因子VIII。天然存在的和重組形式的因子VII的實例可以在專利和科學文獻中找到，所述專利和科學文獻包括美國專利號5,563,045、美國專利號5,451,521、美國專利號5,422,260、美國專利號5,004,803、美國專利號4,757,006、美國專利號5,661,008、美國專利號5,789,203、美國專利號5,681,746、美國專利號5,595,886、美國專利號5,045,455、美國專利號5,668,108、美國專利號5,633,150、美國專利號5,693,499、美國專利號5,587,310、美國專利號5,171,844、美國專利號5,149,637、美國專利號5,112,950、美國專利號4,886,876；國際專利公開號WO94/11503、WO87/07144、WO92/16557、WO91/09122、WO97/03195、WO96/21035，和WO91/07490；歐洲專利申請?zhí)朎P0672138、EP0270618、EP0182448、EP0162067、EP0786474、EP0533862、EP0506757、EP0874057、EP0795021、EP0670332、EP0500734、EP0232112和EP0160457；Sanberg（圣伯格）等人，（1992）XXthInt.CongressoftheWorldFed.OfHemophilia（世界血友病聯(lián)合會第二十屆國際大會）和Lind（林德）等人，（1995）Eur.J.Biochem.（歐洲生物化學雜志）, 232:19?？梢允褂弥亟M方法或通過從已知包括因子VIII的載體衍生序列，獲得編碼上述因子VIII的核酸序列。此外，希望的序列可以使用標準技術(shù)，例如苯酚提取法和cDNA或基因組DNA的PCR，從包含因子VIII的細胞和組織直接分離[見，例如Sambrook（薩姆布魯克）等人]。也可以合成地產(chǎn)生而非克隆核苷酸序列。完整序列可以從重疊寡核苷酸裝配出來，所述重疊寡核苷酸由標準方法制備并且裝配成完整編碼序列[見，例如Edge（艾奇），（1981）Nature（自然）292:757；Nambari（南巴里）等人，（1984）Science（科學）,223:1299和Jay（杰）等人，（1984)）J.Biol.Chem（生物化學雜志）.259:6311。另外，本發(fā)明不局限于人因子VIII。實際上，本發(fā)明意在包括來自除人之外的動物的因子VIII，所述動物包括但不局限于伴侶動物（例如犬、貓和馬）、家畜（例如牛、山羊和羊）、實驗室動物、海洋哺乳動物、大型貓科動物（largecat）等。AAV載體可以包含編碼因子VIII片段的核酸，所述因子VIII片段本身無生物活性，然而在給予至受試者時改善或恢復(fù)凝血時間。例如，如上文討論，因子VIII蛋白包括兩條多肽鏈：由加工期間被切去的B-結(jié)構(gòu)域分隔的重鏈和輕鏈。如本發(fā)明所展示，用因子VIII重鏈和輕鏈共轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細胞導(dǎo)致生物活性因子VIII的表達。因為大部分血友病患者僅在一條鏈（例如，重鏈或輕鏈）包含突變或缺失，故而可能僅給予患者中缺陷的鏈以補足另一條鏈。其他有用的基因產(chǎn)物包括非天然存在的多肽，例如具有非天然存在的氨基酸序列的嵌合或雜合多肽，所述非天然存在的氨基酸序列包含插入、缺失或氨基酸置換。例如，單鏈工程化的免疫球蛋白可能在某些免疫受損的患者中有用。其他類型非天然存在的基因序列包括可以用來減少靶的過表達的反義分子和催化性核酸，例如核酶。為治療以細胞過度增生為特征的過度增生性病狀，如癌癥和銀 屑病，特別希望減少和/或調(diào)節(jié)基因的表達。靶多肽包括與正常細胞相比，僅在過度增生性細胞中產(chǎn)生或以更高水平產(chǎn)生的那些多肽。靶抗原包括由癌基因，例如myb、myc、fyn和易位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF編碼的多肽。除癌基因產(chǎn)物作為靶抗原之外，用于抗癌治療和保護性方案的靶多肽包括由B細胞淋巴瘤產(chǎn)生的抗體可變區(qū)和T細胞淋巴瘤的T細胞受體可變區(qū)，在一些實施例中，也使用所述可變區(qū)作為自身免疫性疾病的靶抗原?？梢允褂闷渌[瘤相關(guān)多肽作為靶多肽，例如在腫瘤細胞中以更高水平發(fā)現(xiàn)的多肽，包括由單克隆抗體17-1A識別的多肽和葉酸結(jié)合多肽。其他合適的治療性多肽和蛋白包括可以對于治療患有自身免疫疾病和病癥的個體有用的那些多肽和蛋白，所述自身免疫疾病和病癥因針對與自身免疫性相關(guān)的靶賦予寬泛基礎(chǔ)性性保護免疫反應(yīng)所致，所述靶包括細胞受體和產(chǎn)生“自我”指向抗體的細胞。T細胞介導(dǎo)的自身免疫疾病包括類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、多發(fā)性硬化（MS）、綜合征、肉瘤樣病、胰島素依賴性糖尿病（IDDM）、自身免疫性甲狀腺炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、硬皮病、多發(fā)性肌炎、皮肌炎、銀屑病、血管炎、韋格納肉芽腫、Crohn病和潰瘍性結(jié)腸炎。這些疾病的每一種均特征在于：結(jié)合內(nèi)源抗原并且啟動與自身免疫疾病相關(guān)的炎癥級聯(lián)的T細胞受體（TCR）。用于遞送靶細胞的仍其他產(chǎn)物是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。III.分離和純化的方法本發(fā)明提供了一種用于通過使用與固相支持物附接的β-半乳糖，分離和檢測AAV9的方法。本發(fā)明也可以輕易地適用于純化具有β-半乳糖結(jié)合位點的另一種進化枝FAAV或適用于包含β-半乳糖結(jié)合位點的所謂“空AAV9衣殼”（其中無包裝的基因組序列的完整衣殼蛋白）。例如，應(yīng)理解，可以根據(jù)本發(fā)明檢測、分出和分離包含嵌合AAV衣殼的AAV載體，例如，包含AAV9的部分或具 有β-半乳糖結(jié)合位點的其他進化枝F衣殼蛋白的那些AAV載體。為了本說明書中自始至終方便，將這些病毒載體和具有如在此所述的β-半乳糖特異性結(jié)合位點的其他蛋白稱作“純化靶”。如之前所述，應(yīng)理解，在這個部分中對AAV9的稱謂用于速記目的并且不排除具有β-半乳糖結(jié)合位點的其他AAV衣殼。使用在此所述的方法，通過用高鹽溶液洗脫或孵育移除特異性結(jié)合的病毒（或“空衣殼蛋白”），有效回收純度比CsCl2沉降法所達到純度更合乎需要的AAV9。此外，這種技術(shù)快速，不需要專用設(shè)備并且可以容易地放大。本發(fā)明進一步提供了使用在此所述的方法（所述方法利用單步驟親和柱用于純化并檢測病毒載體）和任選地可視檢測標記系---------AAV9衣殼（無論是包裝的病毒顆?；颉翱铡币職ぃ┯杏玫脑噭┖?。在一個實施例中，該方法提供了一種用于分離純化靶的方法。這種方法涉及：暴露包括純化靶的一種樣品，接觸包括已經(jīng)與固相支持物連接的β-半乳糖的分子，由此具有β-半乳糖結(jié)合位點的純化靶由該分子選擇性結(jié)合。此后，洗滌固相支持物以從樣品中移除與固相支持物非特異性結(jié)合的物質(zhì)。純化靶然后可以從固相支持物分離。任選地，為進一步使用，濃縮從固相支持物分離的純化靶。在一個實施例中，將固相支持物裝填在親和層析柱中。本發(fā)明充分適合分隔和分離具有下述衣殼的病毒載體，所述衣殼來自進化枝FAAV或具有AAV9細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的AAV。這些AAV可以因其衣殼特異性結(jié)合β-半乳糖的能力，從產(chǎn)生這些病毒的培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的材料分離。本發(fā)明的方法在從輔助子依賴性生產(chǎn)培養(yǎng)物中用于分隔和分離進化枝FAAV或具有AAV9細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的AAV的方法中有用，因為腺病毒、AAV1和在這類培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的其他病毒或細胞物質(zhì)并不特異性結(jié)合β-半乳糖。為了用于本發(fā)明，一個或多個β-半乳糖分子可以直接或間接地（例如，經(jīng)由合適接頭）與固相支持物結(jié)合，如在此定義。可替代地，β-半乳糖可以發(fā)現(xiàn)于多種分子中，包括蛋白、糖和化學部分，它們可以（直接或間接）與固相支持物 結(jié)合。為了有效結(jié)合包含AAV9細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的AAV9、其他進化枝F或嵌合AAV，這類分子包含末端（外部）半乳糖。包含β-半乳糖的分子的實例是具有末端β-半乳糖的聚糖。這類分子可以從商業(yè)來源獲得或根據(jù)多種天然、合成、重組或其他合適方法制備。β-半乳糖的化學合成是本領(lǐng)域已知的，例如α-氨基的TBOC或FMOC保護法。（參見，Coligan（克里岡）等人，CurrentProtocolsinImmunology（免疫學實驗指南）,WileyInterscience公司,1991，單元9）?？商娲?，肽也可以通過熟知的固相肽合成方法合成（Merrifield（梅里菲爾德）,J.Am.Chem.Soc.（美國化學會志）,85:2149（1962）；Stewart（斯圖爾特）和Young（揚）,SolidPhasePeptideSynthesis（固相肽合成）（Freeman公司,SanFrancisco（圣弗朗斯科）,1969）第27-62頁）?？商娲兀梢岳冒粋€或多個β-半乳糖部分的化學分子，使得化學分子與固相支持物附接。仍在另一個替代方案中，用于純化的固相支持物可以化學地或以其他方式改性以包含一個和優(yōu)選地多于一個β-半乳糖部分。這類β-半乳糖部分可以與固相支持物直接連接，例如，通過經(jīng)受住β-半乳糖與純化靶結(jié)合并移除非特異性結(jié)合物質(zhì)的共價鍵或其他合適鍵連接?？商娲?，β-半乳糖部分可以與固相支持物間接連接，例如，通過促進β-半乳糖與支持物結(jié)合的部分連接。這種部分可以是蛋白、化學部分或另一種合適連接物。用于連接β-半乳糖或包含末端β-半乳糖的部分的合適方法是本領(lǐng)域已知的，并且也從固相支持物制造商可獲得。如在此使用，術(shù)語“固相支持物”指任何物質(zhì)，包括凝膠、樹脂、珠、粉末和其他固體，其中β-半乳糖或包含末端β-半乳糖的分子可以與任何物質(zhì)結(jié)合，使得與固相支持物結(jié)合的β-半乳糖分子經(jīng)受住β-半乳糖與純化靶結(jié)合和非特異性結(jié)合物質(zhì)的移除。合適的固相支持物的實例包括由瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖、混合型瓊脂糖或聚丙烯酰胺組成的樹脂；珠（包括微珠）；硅；玻璃；微量比色池；微膠囊；微量滴定平板；和生物芯片。有用的支持物包括在1999年6 月3日公布的國際專利公布WO99/27351；1999年6月3日公布的國際專利公布WO99/27140；美國專利號6,096,273；2000年3月16日公布的國際專利公布WO00/14197，連同其他專利中描述的那些。已知多種微珠，包括在美國專利號6,074,884；5,945,293和5,658,741中描述的氨基葡聚糖珠。也可以采用磁性鐵氧體的氨基葡聚糖涂覆的單分散膠態(tài)分散體[美國專利號5,240,640]；金屬[美國專利號5,248,772]；聚苯乙烯[美國專利號5,466,609；美國專利號5,707,877；美國專利號5,639,620；美國專利號5,776,706]，和聚苯乙烯-金屬[美國專利號5,552,086；美國專利號5,527,713]粒子作為根據(jù)本發(fā)明的固相支持物。另一種類型的固相支持物可以包含上述涂覆的基質(zhì)，連同一層膠體大小的覆蓋氨基葡聚糖涂層的金屬固體。已經(jīng)描述了金/銀膠態(tài)涂覆的聚苯乙烯-氨基葡聚糖珠、它們的制備、表征和在分析全血中白細胞亞群中的用途。見，例如美國專利號5,248,772；美國專利號5,552,086；美國專利號5,945,293；O.Siiman和A.Burshteyn,J.Phys.Chem.,104:9795-9810（2000）；和O.Siiman（西曼）等人，Cytometry（細胞計數(shù)）,41:298-307（2000）。這種涂覆基質(zhì)的替代品采用羧基官能化聚苯乙烯粒子作為核芯基質(zhì)，所述聚苯乙烯粒子通過EDAC偶聯(lián)用氨基葡聚糖涂覆，如美國專利號5,639,620中所述。這些和其他固相支持物是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的并且從多個商業(yè)來源可獲得，包括而不局限于AmershamPharmacia公司(Uppsula（烏普薩拉）,瑞典)；Pierce公司；Biorad公司(Richmond（里士滿）,弗吉尼亞州)和BeckmanCoulter公司，連同其他。在一個實施例中，固相支持物由活化的瓊脂糖凝膠組成。CnBr活化的瓊脂糖凝膠可以從AmershamPharmacia公司購買。然而，瓊脂糖凝膠和活化的瓊脂糖凝膠的其他來源是已知的，如活化方法和活化化合物。合適的活化瓊脂糖凝膠的實例包括CnBr活化的、羰基二咪唑活化的、戊二醛活化的、羥基琥珀酰亞胺活化的和甲苯磺酰氯的瓊脂糖凝膠。使β-半乳糖或包含β-半乳糖的分子與固相支持物結(jié)合的方法可以選自已知的方法。這類方法也由固相支持物制造商提供。在一個實施例中，β-半乳糖連接的固相支持物裝填在靶分隔、分離和/或純化的親和層析柱中。在這個實施例中，允許包含純化靶（例如，來自AAV生產(chǎn)培養(yǎng)的裂解物）的樣品流經(jīng)該柱，使得純化靶與β-半乳糖連接的固相支持物特異性結(jié)合。此后，洗滌該柱以移除非特異性結(jié)合的物質(zhì)，同時保留特異性結(jié)合的純化靶。希望地，洗滌試劑是鹽水，或另一種緩沖至生理pH（例如，磷酸鹽緩沖鹽水）的合適試劑。然后該柱移除純化靶的條件下經(jīng)歷進一步的洗滌步驟。適合地，洗脫試劑是包含高濃度鹽的溶液。一個合適實例是以至少約0.1M濃度包含NaCl的磷酸鹽緩沖鹽水溶液。另一個合適的溶液包含磷酸鹽緩沖鹽水和至少約0.4MNaCl。鑒于這種信息，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以輕易地選擇將實現(xiàn)相似效果的替代性鹽溶液?？商娲兀疵撛噭┛梢允侨魏芜m合的酸性試劑或其鹽（例如，具有范圍約1至約5的低pH的試劑）。這類試劑的實例包括乙酸（例如，1mM）及其鹽例如乙酸鈉，和0.1M甘氨酸（pH3），連同本領(lǐng)域普通技術(shù)人員輕易明白的其他試劑。在洗脫純化靶（例如，具有AAV9細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域）后，AAV可以借助常規(guī)技術(shù)經(jīng)歷濃縮。在另一個實施例中，β-半乳糖連接的固相支持物可以與包含純化靶的樣品一起孵育。在這種實施例中，樣品可以是包含裂解物的溶液，該裂解物來自其中產(chǎn)生待分離蛋白的細胞培養(yǎng)物?？商娲兀瑯悠房梢允莵碜允茉囌叩纳飿悠?，或受試者的與合適稀釋劑混合的生物樣品。本發(fā)明的“來自受試者的生物樣品”可以包括任何樣品，連同其他流體，其包括全血、血漿或血清，其中所形成的主體是細胞、特別是血細胞。這類樣品可以通過用于處置這種類型其他樣品的常規(guī)方法純化，例如通過離心等分離。這些“來自受試者的生物樣品”可以與標記化合物混合和/或任選地與緩沖劑液或稀釋劑混合，以調(diào)節(jié)樣品濃度，或否則制備樣品用于分析。仍在另一個替代方案中，生物樣品可以是組織樣品，并且β-半乳糖連接的固相支持物可以與合適的緩沖液或其他稀釋劑混合，用于與組織樣品一起 孵育。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了用于分離純化靶的試劑盒。這種試劑盒特別適用于產(chǎn)生病毒載體（例如，在其衣殼中包含AAV9-細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的進化枝F或AAV載體）。典型地，這種試劑盒包含固相支持物，該固相支持物具有β-半乳糖或包含與之連接的分子的β-半乳糖。這類固相支持物可以選自上文描述的那些。在一個想要的實施例中，固相支持物是用于與樣品一起孵育的珠或凝膠。在另一個想要的實施例中，固相支持物裝填在親和柱（例如液相色譜柱）中，并且使樣品通過該柱。此外，本發(fā)明的試劑盒也可以包含希望的試劑，包括洗滌試劑、洗脫試劑和濃縮試劑。這類試劑可以輕易地選自在此所述的試劑，并選自常規(guī)濃縮試劑。在一個想要的實施例中，洗滌試劑是已經(jīng)緩沖至生理pH的等滲鹽水溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）；洗脫試劑是包含0.4MNaCl和濃縮試劑的PBS，及裝置。例如，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認識到，試劑（例如聚乙二醇（PEG）或NH4SO4）或這類裝置（例如濾器裝置）可以是有用的。例如，具有100K膜的濾器裝置將濃縮rAAV。這些試劑盒可以額外地包含維持或保護樣品所必需的試劑。更重要地，該試劑盒包含用于進行競爭性測定和制備對照的說明書。還可以在試劑盒中提供針對樣品的合適稀釋劑和緩沖液、用于比較信號的指示圖、一次性手套、凈化說明書、敷藥棒或容器、和樣品制備杯。如需要，試劑盒優(yōu)選地也包含必需的緩沖物質(zhì)或培養(yǎng)基。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以用就任何特定受體和靶細胞而言對患者進行所述方法必需的信息和組分裝配任何數(shù)目的試劑盒，并且將結(jié)果與這種結(jié)合位點的標準進行比較。仍在另一個實施例中，本發(fā)明提供了對于檢測純化靶（例如，AAV9）在樣品中存在有用的試劑盒。除包含上文描述的組分之外，這種試劑盒還可以包含允 許目視檢測純化靶與所述分子結(jié)合的標記試劑。這種試劑盒特別適用于檢測來自受試者的生物樣品（例如，血液）中的純化靶。除包含上文描述的β-半乳糖連接的支持物和試劑之外，這種類型的試劑盒還可以另外包括目視可檢測的標記。術(shù)語“標記”總體上指分子，優(yōu)選地蛋白分子，還指小化學分子，優(yōu)選地目視可檢測的那些。在一個實例中，通過被激光激發(fā)時發(fā)射具體波長的可檢測信號，這些標記使能夠檢測。藻膽蛋白、串聯(lián)染料、某些熒光蛋白，小化學分子，和由其他手段可檢測的某些分子均可以視為用于這些分析的標記。見，例如HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals（熒光探針和研究化學品手冊），第6版，R.P.Haugland（格蘭德）,MolecularProbes,Inc.公司,Eugene（尤金）,俄勒岡州（1996）中列出的標記。在本發(fā)明中有用的藻膽蛋白的實例是藻青蛋白、別藻藍蛋白（APC）、別藻藍蛋白B、藻紅蛋白（PE）并且優(yōu)選地是R-藻紅蛋白。PE屬于目前可用的最明亮熒光染料。與抗體綴合，PE已經(jīng)用來在熒光平板測定法中和在（MCCuster（卡斯特）和MTLotze（洛策）,(1990)J.Immunol.Meth.（免疫法雜志）,128,109-117）中檢測白介素-4，并且被發(fā)現(xiàn)是產(chǎn)生足夠信號的唯一測試過的熒光團。串聯(lián)染料是可以由藻膽蛋白和另一種染料形成的非天然存在分子。參見例如，美國專利號4,542,104和美國專利號5,272,257。在本發(fā)明中有用的串聯(lián)染料的實例是藻紅花青甙或PC5（PE-Cy5、藻紅蛋白-花青苷5.1；激發(fā)，486-580nm，發(fā)射，660-680nm）[A.S.Waggoner（瓦格納）等人，（1993）Ann.N.Y.Acad.Sci.（紐約科學院年報）,677:185-193和美國專利號5,171,846]和ECD（藻紅蛋白-得克薩斯紅；激發(fā)，486-575nm，發(fā)射，610-635nm）[美國專利號4,542,104和美國專利號5,272,257]。其他已知的串聯(lián)染料是PE-Cy7、APC-Cy5和APC-Cy7[M.Roederer（羅德雷）等人，（1996）Cytometry（細胞計數(shù)）,24:191-197]。已經(jīng)通過涉及染料的亞氨基硫烷活化的若干種方法，使串聯(lián)染料PC5和ECD成功地與單克隆抗體直接綴合?？梢耘c配體直接綴合并且在本發(fā)明中與藻膽蛋白或串聯(lián)染 料一起用來向所述方法增加額外數(shù)目的標記（標記的配體）的仍其他標記包括激發(fā)時發(fā)射小于500nm的波長的小分子。這類分子不與藻膽蛋白的發(fā)射重疊。這種標記的一個實例是異硫氰酸熒光素（FITC）。其他標記在上文援引的手冊中列出。可以在這種方法中用來提供額外顏色的仍其他標記是稱作綠色熒光蛋白和藍色熒光蛋白的蛋白；也有用的可以是受紫外光激發(fā)時發(fā)射的標記。膽蛋白和串聯(lián)染料是從不同來源可商業(yè)獲得的，這些來源包括CoulterInternationalCorporation公司,Miami公司,FL公司、MolecularProbes,Inc.公司,Eugene（尤金）,俄勒岡州和Prozyme,Inc.公司,SanLeandro（圣萊安德羅）,加利福尼亞州。上文討論的其他標記或標記物可以從已知來源商業(yè)地獲得。利用這些標記的方法將是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員輕易明白的，并且可以涉及在接觸β-半乳糖連接的固相支持物之前，在標記存在的情況下孵育樣品?？商娲?，標記可以與固相支持物結(jié)合。仍在另一個替代方案中，標記可以在洗滌步驟在包含純化靶的洗脫物中孵育，這從固相支持物移除特異性結(jié)合的純化靶。對標記和檢測系統(tǒng)的選擇不限制本發(fā)明。由本發(fā)明提供的試劑盒對于進行在此所述的方法是有用的。以下實例僅是說明性的并且不意在限制本發(fā)明的范圍。IV.實例實例1-細胞結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)測定法A.結(jié)合測定法對于結(jié)合測定法，將細胞從150cm2燒瓶刮下并以5×105個細胞/孔在100μl冷無血清（SF）培養(yǎng)基中接種到96孔板上。如先前所描述，AAV載體由Penn載體（http://www.med.upenn.edu/gtp/-vector_core.shtml）產(chǎn)生并且以5×109個基因組副本（GC）/孔在100μl冷SF培養(yǎng)基中添加并且在4℃孵育1hr。將細胞用SF培養(yǎng)基洗滌3次并重懸于200μlPBS中。使用QIAampDNAMini試 劑盒（QIAGEN公司），提取總DNA。通過實時PCR定量細胞GC。所用引物和探針與載體基因組的SV40多聚腺苷化序列互補。F引物：AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA[SEQIDNO:2]；R引物：CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT[SEQIDNO:3]；TaqMan探針：6FAM-AGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC[SEQIDNO:4]-TAMRA。對于細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)測定法，將細胞以105個細胞/孔在黑色壁、透明底96孔板中接種過夜。然后將平板置于4℃持續(xù)15min，并且將109GC的表達ffLuc的AAV載體在100μl冷SF培養(yǎng)基中添加，并且在4℃孵育1hr。然后將細胞用SF培養(yǎng)基洗滌3次。補充含血清溫熱培養(yǎng)基，并且將細胞在37℃孵育48hr。通過添加每孔150μg/mlD-螢光素底物，并使用光度計測量相對發(fā)光單位/秒（RLU/s），監(jiān)測ffLuc表達。B.細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)測定法對于細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)測定法，將細胞從150cm2燒瓶刮下并且以5×105個細胞/孔在黑色壁、透明底96孔板中接種過夜。然后將平板置于4℃持續(xù)15min，并且將109GC的表達ffLuc的AAV載體在100μl冷SF培養(yǎng)基中添加，并且在4℃孵育1hr。然后將細胞用SF培養(yǎng)基洗滌3次。補充含血清溫熱培養(yǎng)基，并且將細胞在37℃孵育48hr。通過添加每孔150μg/mlD-螢光素底物，并使用光度計測量相對發(fā)光單位/秒（RLU/s），監(jiān)測ffLuc表達。C.體內(nèi)實驗50μlPBS中具有或不具有100mUNA的AAV。在載體滴注之前1hr亦或同時給予NA。給予后21天，通過先前描述的方法檢驗肺中nLacZ基因表達[Bell（貝爾）等人，HistochemCellBiol（組織化學和細胞生物學）,124(6):2427-35(2005)]。以100x和200x放大率檢驗肺切片。通過計數(shù)每個200x放大率視野的陽性細胞，定量傳導(dǎo)氣道中的LacZ陽性細胞。小鼠用氯胺酮/賽拉嗪麻醉并給予鼻內(nèi)滴注30μlPBS中的100mUNA或作為對照的單獨PBS。通過先前描述的方法（Bell（貝爾），2005，上文援引），1hr后收獲肺，并且將切片在冷（-20℃）丙酮中 固定5min。然后將肺切片用無CarboTM封閉液（Vectorlaboratories公司）封閉，并且在室溫與15μg/ml羅丹明標記的蓖麻（RicinusCommunis）凝集素I（RCAI）和7.5μg/ml熒光素標記的西澤接骨木（SambucusNigra）凝集素（SNA）一起孵育30min。然后將載玻片在PBS中洗滌2次并且用DAPI（Vectorlaboratories）封裝在Vectashield中。通過廣域（200x）及共聚焦顯微術(shù)（ZeissLSM510共聚焦顯微鏡）拍攝圖像。對于肌肉，心、肝和腦的RCA染色，從未處理的小鼠取出器官并且切片如上述染色。對于腦的CD31染色，將載玻片48與大鼠抗CD31第一抗體（BDPharmingen公司）孵育，隨后與熒光素標記的抗大鼠第二抗體（Vectorlaboratories公司）和羅丹明標記的RCA孵育。對于肺的α-微管蛋白染色，如上述處理載玻片，不同之處在于，將切片在4%多聚甲醛中固定，并且用小鼠抗α-微管蛋白第一抗體（Sigma）染色，隨后熒光素標記的馬抗小鼠第二抗體（Vectorlaboratories公司）和羅丹明標記的RCA染色。圖像以400x放大率拍攝。使用雙尾t檢驗確定統(tǒng)計顯著性。小于0.001的P值視為顯著。數(shù)據(jù)表述為平均數(shù)±SD。實例2-糖苷酶處理和凝集素競爭。將Pro-5細胞在37℃，用100μlSF培養(yǎng)基中的、50mU/ml的、來自霍亂弧菌的NA型III（Sigma公司）處理2hr，或?qū)φ占毎?7℃用培養(yǎng)基單獨處理2hr。然后將一些細胞額外地在37℃，用50μL反應(yīng)緩沖液（Sigma）中的60mU/mlβ-(1,4)-半乳糖苷酶處理3hr，或?qū)φ占毎?7℃用培養(yǎng)基單獨處理3hr。然后在結(jié)合研究和轉(zhuǎn)導(dǎo)研究之前，將細胞如上文所述洗滌三次。對于凝集素競爭研究，首先將Pro-5細胞用NA處理以除去唾液酸。將細胞用冷SF培養(yǎng)基洗滌，并且將凝集素以50μg/ml添加在100μlSF培養(yǎng)基中，或作為對照的單獨培養(yǎng)基中，并在4℃孵育15min。然后移除凝集素溶液，并且添加AAV載體（對于結(jié)合測定法，5×109GC，和對于結(jié)合測定法，109GC）和50μg/ml凝集素或作為對照的單獨載體的混合物，并且在4℃孵育1hr。然后洗滌細胞并且如如上文所述分析AAV結(jié)合或轉(zhuǎn) 導(dǎo)。本研究中所用的凝集素包括結(jié)合半乳糖基(β-1,4)N-乙酰葡糖胺的雞冠刺桐凝集素（ECL）、結(jié)合末端半乳糖殘基的蓖麻凝集素I（RCAI）、結(jié)合N-乙酰葡糖胺并且還通過唾液酸相互作用的麥胚凝集素(WGA)、結(jié)合（α-1,3）和（α-1,6）甘露糖的雜交朱頂紅（HippeastrumHybrid）凝集素（HHL）、結(jié)合α-半乳糖的加納谷物（GriffoniaSimplicifolia）凝集素I同工凝集素B4（GSLB4）和結(jié)合α連接的巖藻糖（Vectorlaboratories）的翅莢百脈根（LotusTetragonolobus）凝集素（LTL）。實例3-篩選AAV9的聚糖結(jié)合特異性對于聚糖微陣列（GMA）結(jié)合研究，如先前所述，使用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)/Sf9表達系統(tǒng)制備AAV9的病毒樣顆粒（VLP）[Mitchell（米切爾）等人，2004,PLoSBio(PLoS生物學)l2(8):E234]并且在功能性糖組功能糖組學聯(lián)盟的核芯D和H開發(fā)的高通量聚糖微陣列中進行篩選（CFG；NIHNationalInstituteofGeneralMedicineScienceInitiative（NIH國家全科醫(yī)學科學研究所倡議））。印刷陣列（哺乳動物印刷陣列[PA]V4.1，http://www.functional-glycomics.org/static/consortium/resources/resourcecoreh14.shtml）由465種不同的天然和合成哺乳動物聚糖組成，所述聚糖包括具有不同鍵和修飾的唾液酸化糖，其中使用胺偶聯(lián)法以使胺聚糖或聚糖綴合物與胺反應(yīng)性N-羥琥珀酰亞胺活化的玻璃載片共價連接，生成所述唾液酸化糖。將包含每種聚糖或糖綴合物6個重復(fù)的印刷載玻片與AAV9VLP以200μg/ml孵育，然后將ADK9（一種衣殼單克隆抗體（JurgenKleinschmidt（尤爾根克萊舒密特）提供，GermanCancerResearchCentre(德國癌癥研究中心)，海德爾堡，德國））覆蓋在結(jié)合的衣殼上，隨后覆蓋FITC-標記的第二抗體（5μg/ml），用于檢測。使用ScanArray5000共聚焦掃描儀（PerkinElmerInc.）檢測熒光強度。使用IMAGENE圖像分析軟件（BioDiscovery公司，ElSegundo（埃爾塞貢多），加利福尼亞州）分析圖像。每種聚糖的相對 結(jié)合作用表述為6個重復(fù)中4個重復(fù)的平均相對熒光單位（RFU），在不使用最高值和最低值的情況下計算。使用兩種選擇標準分析結(jié)合數(shù)據(jù)：(I)處于具有最高RFU值的聚糖的平均數(shù)的3個標準偏差內(nèi)的和(II)具有用來計算平均RFU值的4個重復(fù)的RFU之間<20%的變異系數(shù)（%CV）的聚糖（其中%CV=變異系數(shù)，定義為數(shù)據(jù)的標準偏差相對于平均數(shù)的比率，表示為百分比）。在開放獲取網(wǎng)址上的以下URL/訪問位置處可獲得關(guān)于生成聚糖陣列數(shù)據(jù)的信息：http://www.functionalglycomics.org/glycomics/HServlet?operation=view&sideMenu=no&psId=primscreen_3528。這種數(shù)據(jù)集中包括原始數(shù)據(jù)、歸一化數(shù)據(jù)、樣品注釋、實驗設(shè)計、聚糖陣列注釋和實驗方案（登錄號idprimscreen_3528）。結(jié)果如在此所述，在用或不用外切-β-唾液酸酶（神經(jīng)氨酸酶，NA）處理的情況下，篩選了若干先前描述的AAV（血清型1、2、5和6）和新穎AAV血清型7、8、9和rh32.33與用來研究糖基化的遺傳學和生物化學的CHO細胞系Pro-5的結(jié)合作用。用第一代AAV時的結(jié)果如預(yù)期那樣，其中NA預(yù)處理（圖1A）不影響AAV2的結(jié)合，并且對AAV1、AAV5和AAV6的結(jié)合削弱至少兩個對數(shù)（圖1B）。用新AAV的研究未能示出NA處理影響對AAV7、8和rh32.33的結(jié)合，而AAV9示出結(jié)合作用出乎意料地增加2.5個對數(shù)（圖1B）。本發(fā)明的諸位發(fā)明人推測，末端SA在低聚糖上的存在抑制與AAV9結(jié)合亦或SA的移除暴露了增強結(jié)合作用的分子。認為最可能的候選物將是β-1,3或β-1,4半乳糖，它們是大多數(shù)富含SA的聚糖上的倒數(shù)第二單糖（圖1A）。最初，使用親本CHO細胞系Pro-5的體細胞突變體，探索這些假設(shè)，這些體細胞突變體由于凝集素抗性而缺乏參與糖基化的不同酶[SKPatnaik（帕特奈克）和P.Stanley（斯坦利）(2006)MethodsEnzymol（酶學方法）416:159-182]。Lec-2在CMP-SA高爾基轉(zhuǎn)運體中缺乏并且應(yīng)當具有失去末端SA的N-聚糖和O-聚糖的完全互補物（圖1A）。Lec-8在UDP-Gal高爾基轉(zhuǎn)運體中缺乏，所述UDP-Gal高爾基轉(zhuǎn) 運體應(yīng)當產(chǎn)生同時失去SA和半乳糖類的N-和O-聚糖（圖1A）。將基于表達螢火蟲螢光素酶（ffLuc）的AAV2、6和9的載體與Pro-5、Lec-2和Lec-8細胞孵育，并且分析其結(jié)合作用和轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖2A、B）。AAV2的結(jié)合作用和轉(zhuǎn)導(dǎo)在全部3個細胞系中相同，并且在用AAV6時在Lec-2和Lec-8細胞中相對于Pro-5細胞下降，這基于先前研究而預(yù)計到，所述先前研究展示SA在促進AAV6進入方面的重要性。對于AAV9，結(jié)合作用和轉(zhuǎn)導(dǎo)在Lec-2中大幅度增加，但是在Lec-8細胞中下降至基線水平，這與以下假設(shè)更一致：與末端β-半乳糖結(jié)合促進攝取，而非SA抑制攝取。結(jié)合與轉(zhuǎn)導(dǎo)的同時出現(xiàn)提示，與末端半乳糖結(jié)合是AAV9轉(zhuǎn)導(dǎo)中的限速步驟。消除唾液酸對結(jié)合的影響大于對轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，提示進入后步驟也可能限制轉(zhuǎn)導(dǎo)。在Pro-5細胞中進一步研究末端半乳糖在AAV9結(jié)合中的作用，Pro-5細胞用NA預(yù)處理并且然后與具有不同特異性的凝集素共培養(yǎng)（圖2C，結(jié)合作用；圖2D，轉(zhuǎn)導(dǎo)）。阻斷結(jié)合AAV9的僅有凝集素是識別β-半乳糖的雞冠刺桐凝集素（ECL）和識別若干類型β-半乳糖鍵同時對β-1,4半乳糖示出最高親和力的蓖麻凝集素I（RCAI）；二者均不影響對AAV2的結(jié)合。識別α-半乳糖[加納谷物凝集素I同工凝集素B4(GSLB4)]、α-1,3和α-1,6甘露糖[雜交朱頂紅凝集素（HHL）]和α-巖藻糖[翅莢百脈根凝集素（LTL）]的凝集素不干擾對AAV2或AAV9的結(jié)合。麥胚凝集素（WGA）輕微影響AAV9結(jié)合作用，這可能歸因于其與通常結(jié)合于半乳糖的N-乙酰葡糖胺相互作用。凝集素抑制AAV2和AAV9轉(zhuǎn)導(dǎo)驗證了結(jié)合結(jié)果，例外是RCA，因為它毒害細胞，故不提供信息。在Pro-5細胞中最終證實AAV9攝取的聚糖特異性，其中Pro-5細胞用切去末端SA或NA的NA和將同時移除NA和β-半乳糖類的β-半乳糖苷酶(β-gal)預(yù)處理（圖1A）。用AAV2的結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)不受酶預(yù)處理影響，同時如前述，NA增強AAV9的轉(zhuǎn)導(dǎo)，一種由后續(xù)β-gal處理逆轉(zhuǎn)的效果（圖2E，F(xiàn)）。使用由465種不同的天然及合成哺乳動物聚糖組成的聚糖微陣列，進一步探 查AAV9的聚糖-衣殼相互作用，所述聚糖微陣列包含每種聚糖6個重復(fù)。一項相似的策略用來驗證AAV1與唾液酸化聚糖的結(jié)合，如通過生物化學和分子方法所確定（Wu（吳）等人，2006,JVirol（病毒學雜志）,80:9093-9103）。在我們的分析中，評價每種聚糖的結(jié)合作用，如根據(jù)陣列內(nèi)部4個重復(fù)的平均數(shù)±1SD（消除6個重復(fù)的最高和最低結(jié)合作用），通過相對熒光的單位（RFU）測量。將4個重復(fù)內(nèi)部的變異性評估為%CV，如果它小于20，則認為低。選擇具有AAV9衣殼特異性結(jié)合親和力的聚糖以兩項獨立標準為基礎(chǔ)：如RFU所測量的高整體總結(jié)合作用和由%CV評估的4個重復(fù)之間的低變異性。將最高結(jié)合性聚糖主觀地定義為平均RFU值落在最高結(jié)合性聚糖415的3個S.D.內(nèi)部的那些。滿足高結(jié)合親和力標準的4種4聚糖當中，3種顯示高特異性，如通過%CV小于20所測量。這三種聚糖415、297和399展示出被視為AAV9結(jié)合作用潛在受體的足夠親和力和特異性?；诳偨Y(jié)合作用和結(jié)合作用特異性，因與AAV9特異性結(jié)合而選擇的三種聚糖均示出具有含β-1,4鍵（415和399）或β-1,3鍵（297）的末端半乳糖(Gal)。每種聚糖在它們的結(jié)構(gòu)中相對于GalNAc包含Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc連接的β1-3或β1-6，提示缺乏唾液酸的聚糖用于與AAV9結(jié)合的結(jié)構(gòu)性背景。使結(jié)合數(shù)據(jù)與基于細胞的結(jié)合/轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗一致，證實末端β-半乳糖鍵在AAV9嗜性中的作用。如在此所述，在小鼠中進行研究，以確定是否可以通過用包含NA的制劑預(yù)處理小鼠氣道增強AAV9轉(zhuǎn)導(dǎo)傳導(dǎo)氣道。與給予AAV6的小鼠相比，AAV6在先前研究中示出使傳導(dǎo)氣道有效體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)[MPLimberis（里博瑞斯）等人，（2009）MolTher（分子治療）17:294-301]，其中基于用細胞系的體外研究，這可能依賴于與SA結(jié)合[Z.Wu（吳）等人，（2006）JVirol（病毒學雜志）80:9093-9103]。在NA不存在的情況下肺遞送AAV9展示出預(yù)期的肺泡受限轉(zhuǎn)導(dǎo)樣式；在給予AAV9之前1小時或與之同時給予NA至肺中，產(chǎn)生了非常不同的樣式，其中在肺泡細胞和傳導(dǎo)氣道上皮細胞中均存在高水平轉(zhuǎn)導(dǎo)。當動物用NA處理時，完全消除用AAV6獲得的傳導(dǎo)氣道高水平轉(zhuǎn)導(dǎo)，證實體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)對結(jié)合SA的依賴性。通過用 熒光標記的結(jié)合末端半乳糖殘基（RCA）或末端SA殘基（SNA）的凝集素染色肺切片，直接研究氣道遞送NA對聚糖結(jié)構(gòu)的豐度和分布的影響。在NA處理之前，RCA染色限于肺泡細胞和傳導(dǎo)氣道的基底外側(cè)區(qū)域。用SNA觀察到相似的樣式，雖然傳導(dǎo)氣道的頂端表面也染色。用NA處理具有對傳導(dǎo)氣道上皮細胞染色的最突出結(jié)果，這相對于RCA大幅度增加并且相對于SNA適度減少。進行更高分辨率顯微研究以確定RCA結(jié)合作用是否定位至質(zhì)膜或覆蓋性粘液層。對來自NA預(yù)處理的動物的肺切片評價RCA染色與α-微管蛋白免疫定位的共定位，這勾勒出來自氣道上皮細胞頂端表面的纖毛。這些研究展示，RCA與NA預(yù)處理的肺的傳導(dǎo)氣道中上皮細胞的細胞表面結(jié)合。血管內(nèi)（IV）給予AAV載體后轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要障礙是微循環(huán)的連續(xù)內(nèi)皮和基底層的物理屏障。一個例外是包含穿孔內(nèi)皮的肝臟，穿孔內(nèi)皮允許血液中的載體直接抵達肝細胞。AAV9的獨特性在于它部分地克服這種屏障，允許靶向骨骼肌和心肌，和更低程度地靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞（Inagaki（稻垣）,K.,S.等人，（2006）,MolTher（分子治療）14(1):45-53.；Duque（杜奇）等人，（2009）MolTher（分子治療）17:1187-1196；K.D.Foust（福斯特）等人，（2009），NatBiotechnol（自然生物技術(shù)）27:59-65)。在AAV9載體以1011和1012個基因組副本(GC)/小鼠的劑量IV給予后，分析lacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過用RCA染色，這與末端β-半乳糖的存在相關(guān)。如已經(jīng)描述，以十分低劑量的載體有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟[Vandendriessche（范登德里舍）等人，2007,JThrombHaemost（血栓形成與止血法雜志）5(1):16-24)]；可能按更高載體劑量有效轉(zhuǎn)導(dǎo)心肌和骨骼肌[Inagaki（稻垣）,2006，上文援引]。來自骨骼組織和心臟組織的肌纖維表面展示高水平的末端β-半乳糖，如通過RCA結(jié)合所佐證。肝細胞展示更低水平的RCA結(jié)合，雖然肝血管的內(nèi)皮表面染色鮮明。腦組織的凝集素結(jié)合研究因RCA與內(nèi)皮細胞大量結(jié)合而SNA不與內(nèi)皮細胞大量結(jié)合而值得注意。這是令人好奇的，因為AAV9具有靜脈內(nèi)注射后靶向CNS 細胞的獨特性能，雖然在直接注射入腦時，用AAV9和AAV5均實現(xiàn)有效轉(zhuǎn)導(dǎo)[B.L.Davidson（戴維森）等人，（2000）ProcNatlAcadSciUSA（美國國家科學院院刊）97:3428-3432;S.]。全身性給予后向CNS遞送治療劑的主要障礙是從唯一緊密的內(nèi)皮細胞網(wǎng)絡(luò)形成的血腦屏障。已經(jīng)利用受體和吸收介導(dǎo)的跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)胞吞途徑來克服這種屏障。腦部微循環(huán)中存在的高水平AAV9受體可以在其通過轉(zhuǎn)胞吞途徑靶向CNS的能力中發(fā)揮作用。聚糖在介導(dǎo)AAV9轉(zhuǎn)導(dǎo)中的潛在作用是本研究的焦點，因為它們經(jīng)常充當病毒感染的受體，相對于組分單糖通常具有極端特異性。已經(jīng)對許多病毒（包括若干其他AAV血清型）描述了與包含末端唾液酸的聚糖的特異性相互作用。我們發(fā)現(xiàn)：AAV9的結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)由末端β-半乳糖鍵發(fā)生，還沒有對任何其他病毒（包括已知的AAV）描述過，雖然諾如病毒與具有α-半乳糖鍵的聚糖結(jié)合（Zakhour（扎克霍爾）,M.,（2009）。（組織血型抗原家族的αGal表位是牛諾如病毒Newbury2的預(yù)期阻止跨物種傳播的配體），PLoSPathog（PLoS病原學）5(7):e1000504.)。聚糖陣列研究展示AAV9至3種聚糖的特異性結(jié)合，所述3種聚糖均包含末端β-半乳糖鍵，證實這種糖在轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要性，如使用三種獨立方法（即，糖苷酶預(yù)處理、凝集素競爭和體細胞突變體在多個細胞系中描述）。這些聚糖均在它們的結(jié)構(gòu)中相對于GalNAc包含Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc連接的β1-3或β1-6，并且經(jīng)由蘇氨酸通過GalNAc連接，表明包含O聯(lián)半乳糖的聚糖能夠與AAV9結(jié)合，雖然不能排除與其他類型鍵連接的聚糖的功能性相互作用（Marth（馬爾斯）,J.D.1999.O-Glycans（O-聚糖）.EssentialsofGlycobiology（糖生物學要點）.A.Varki（瓦爾基）,R.Cummings（卡明斯）,J.Esko（埃斯克）等人.ColdSpringHarbor（冷泉港）,NY,ColdSpringHarborLaboratoryPress（冷泉港實驗室出版社）:第101-113頁）。關(guān)于結(jié)合數(shù)據(jù)的重要提醒是，就介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)的糖基化受體而言，結(jié)合親和力并不必然地與功能意義相關(guān)。重要基因治療載體的受體已經(jīng)在體外充分表征，但是幾乎沒有驗證過這些受體對體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的意義。體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間不一 致性的一個實例是人腺病毒5（Ad5）?；隗w外研究和嘗試，以利用消除CAR結(jié)合作用的Ad5進行體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移后證實CAR重要性，將柯薩奇病毒和腺病毒受體（CAR）作為Ad5的受體分離。在靜脈內(nèi)給予后，消除CAR結(jié)合作用的Ad5的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平和肝選擇譜與Ad5相似，提示體內(nèi)潛在冗余性攝取途徑。對體內(nèi)Ad5轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究確定，凝血因子的存在可能通過CAR非依賴性途徑介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)。相比之下，與NA組合進行肺基因轉(zhuǎn)移后，我們采用AAV9載體的研究直接證實β-半乳糖鍵在借助AAV9轉(zhuǎn)導(dǎo)傳導(dǎo)氣道上皮細胞中的重要性。評價β-半乳糖鍵在體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移后轉(zhuǎn)導(dǎo)除肺之外組織的細胞中的作用是更復(fù)雜的，原因在于遞送屏障，該遞送屏障在將載體遞送入氣道內(nèi)，允許直接抵達上皮細胞時不存在。IV給予AAV9后的轉(zhuǎn)導(dǎo)（其是在許多基因治療臨床應(yīng)用中正在考慮的給予途徑）顯示這一點。IV輸注基于大多數(shù)AAV血清型的載體導(dǎo)致主要限于肝細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，因為肝血竇小孔消除血管屏障。在我們的研究中，AAV9有效轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞，盡管β-半乳糖水平有限。更高劑量的AAV9可以克服血管屏障并有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)的確包含高水平細胞表面β-半乳糖聚糖的心肌纖維和骨骼肌纖維。如若干組所示，AAV9獨特穿越甚至更強化的血腦屏障以允許有限的神經(jīng)元轉(zhuǎn)導(dǎo)。推測帶有β-半乳糖鍵的聚糖在一些血管結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮細胞表面上的存在，如我們在腦中示出，可能參與可能通過轉(zhuǎn)胞吞過程促進這種外出。經(jīng)展示的AAV9與結(jié)構(gòu)多樣的O聯(lián)聚糖的結(jié)合提示，例如在血液中或在粘膜表面中與無細胞介導(dǎo)的糖蛋白的相互作用可以調(diào)節(jié)載體的生物分布和轉(zhuǎn)導(dǎo)譜。鑒定AAV9的主要受體也在開發(fā)用于增強其轉(zhuǎn)導(dǎo)肺部傳導(dǎo)氣道的的藥理學方法中是有用的。預(yù)期將對AAV9的其他靶實現(xiàn)這種效果，特別是當NA配制的載體可以直接給予至組織（例如視網(wǎng)膜）中或施用至封閉空間（例如關(guān)節(jié)）時。實例5-鑒定AAV9衣殼的半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域在這項研究中，我們旨在鑒定AAV9衣殼中結(jié)合半乳糖所必需的特定氨基 酸。通過位點定向誘變和細胞結(jié)合測定法，加上配體對接計算研究，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)合半乳糖所需要的5個氨基酸，所述氨基酸在二十面體3重對稱軸周圍在凸出物基部形成口袋。這些氨基酸的重要性也通過小鼠肺中的體內(nèi)研究進行驗證。鑒定AAV9與半乳糖結(jié)合所必需的相互作用可以導(dǎo)致推進載體工程化。在這項研究中，我們力圖鑒定AAV9衣殼上的半乳糖結(jié)合基序。我們產(chǎn)生一系列丙氨酸突變體以確定特定氨基酸對于體外和體內(nèi)半乳糖結(jié)合的必要性。這導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)在圍繞AAV9衣殼的3重對稱軸的凸出物的基部處的半乳糖結(jié)合袋，這個發(fā)現(xiàn)也由分子對接研究驗證。A.材料與方法1.細胞系。全部細胞系均從AmericanTypeCultureCollection（美國典型培養(yǎng)物保藏中心）（ATCC）獲得。在結(jié)合實驗和轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗中使用三種不同的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞系，包括親本細胞系Pro-5、唾液酸缺陷細胞系Lec-2和半乳糖缺陷細胞系Lec-8。將這些細胞培養(yǎng)在補充有核糖核苷和脫氧核糖核苷（Invitrogen公司）連同10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/鏈霉素的α-最少基本培養(yǎng)基（α-MEM）中。2.動物。雄性C57BL/6小鼠（6-8周齡）從CharlesRiver實驗室購買并且在賓夕法尼亞大學轉(zhuǎn)化研究實驗室的動物設(shè)施中飼養(yǎng)。全部動物程序由賓夕法尼亞大學的研究機構(gòu)動物護理和使用委員會批準。3.AAV9誘變和小規(guī)模載體制備。選擇AAV9衣殼序列的特定帶電荷或極性氨基酸以便突變成非極性丙氨酸，如圖3A-3B中指示。使用來自AgilentTechnologiess公司的QuikChangeLightning位點定向誘變試劑盒進行誘變。為后續(xù)小規(guī)模生產(chǎn)用于中體外結(jié)合測定法和轉(zhuǎn)導(dǎo)測定法的突變載體，使用表達AAV2rep基因和突變AAV9cap 基因的質(zhì)粒，以及表達ffLuc轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒和腺病毒輔助子質(zhì)粒（pAdΔF6）在6孔板（9.6cm2）進行HEK293細胞的三重轉(zhuǎn)染，其中所述ffLuc轉(zhuǎn)基因從側(cè)翼分布有AAV2反向末端重復(fù)序列的細胞巨化病毒（CMV）啟動子表達。在72小時后，將細胞和上清液以總計2ml培養(yǎng)基收獲并且經(jīng)歷三次凍/融循環(huán)并且然后在3500xg離心30min以除去細胞碎片。通過定量PCR測定載體的滴度（GC/ml）。4.用于體內(nèi)研究的載體生產(chǎn)和純化。產(chǎn)生體內(nèi)使用的AAV載體并由PennVector純化，如以下網(wǎng)址所述：http://www.med.upenn.edu/gtp/vector_core/production.shtml。通過用編碼AAV2rep基因和AAV9或突變cap基因的質(zhì)粒，和腺病毒輔助子質(zhì)粒（pAdΔF6）三重轉(zhuǎn)染HEK293細胞，包裝來自雞β-肌動蛋白啟動子并且側(cè)翼分布有AAV2反向末端重復(fù)序列的nLacZ的質(zhì)粒。通過碘克沙醇梯度離心純化載體并且通過定量PCR測定滴度。5.細胞結(jié)合測定法和轉(zhuǎn)導(dǎo)測定法。對于結(jié)合測定法，將Pro-5、Lec-2和Lec-8細胞從150cm2燒瓶刮下并以5×105個細胞/孔在100μl冷無血清α-MEM中接種于96孔板內(nèi)。將載體以5×109GC/孔添加在100μL冷α-MEM中并且在4℃孵育1小時。然后，將細胞用200μLα-MEM洗滌3次并重懸于200μlPBS中。使用QIAampDNAMini試劑盒（QIAGEN公司）提取總DNA，并且通過定量PCR測定細胞結(jié)合的載體GC。對于轉(zhuǎn)導(dǎo)測定法，在黑色壁、透明底96孔板中接種105個細胞/孔過夜。在移去培養(yǎng)基后，將表達ffLuc（109GC）的AAV載體添加至100μL完全培養(yǎng)基中的細胞并且在37℃孵育48小時。隨后通過添加100μLα-MEM中的每孔150μg/mlD-螢光素底物并使用光度計測量相對發(fā)光單位/秒（RLU/s）確定ffLuc表達。圖4A和圖4B中示出突變載體的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。6.小鼠肺的轉(zhuǎn)導(dǎo)。如實例3中所述，小鼠用氯胺酮/賽拉嗪麻醉并給予鼻內(nèi)滴注30 μlPBS中的100mUNA。1小時后，將1011個表達nLacZ的AAV9或突變載體的GC在50μlPBS中鼻內(nèi)遞送。給予21天后，通過先前描述的方法檢驗肺中的β-gal表達（Bell（貝爾）,2005，上文援引）。以100x放大率檢查肺切片。7.通過分子對接研究預(yù)測AAV9衣殼上的半乳糖結(jié)合位點。使用分子對接網(wǎng)路服務(wù)器PatchDock（http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/PatchDock/index.html）（Schneidman（施耐德曼）-Duhovny（杜楚尼）等人，NucleicAcidsRes（核酸研究）33(WebServerissue):W363-72005），進行分子對接以預(yù)測AAV9衣殼上的半乳糖結(jié)合位點。利用人半乳糖凝集素-3結(jié)合的半乳糖的X射線晶體結(jié)構(gòu)（PDB登錄號1A3K）以提供半乳糖的坐標（Seetharaman（西薩拉曼）等人,JBiolChem（生物化學雜志）,273(21):13047-52（1998）。將AAV9X射線晶體結(jié)構(gòu)的坐標（未公開數(shù)據(jù)）用來使用VIPERdbOligomer發(fā)生器（http://viperdb.scripps.edu/oligomer_multi.php）（Carrillo-Tripp,NucleicAcidsRes,37（數(shù)據(jù)庫?？?D436-42（2009）建立三聚體。將AAV9三聚體的輸出PDB文件截短以包括具有表面可及性并維持病毒衣殼表面環(huán)的結(jié)構(gòu)完整性的氨基酸。在截短AAV9三聚體PDB文件中作為分子對接的輸入文件所包括的氨基酸是N262-Y277、L435-G475和F501-M559。分子對接以非定向方式進行，以評價在AAV9衣殼上可能與半乳糖相互作用的位點。還使用截短的AAV9三聚體和唾液酸進行對接。利用與其唾液酸受體復(fù)合物中的馬鼻炎A病毒的X射線晶體結(jié)構(gòu)（PDB登錄號2XBO），以提供唾液酸的坐標（Fry（弗萊）等人，JGenVirol（普通病毒學雜志）,91(Pt8):1971-7（2010）。B.結(jié)果1.N470是AAV9半乳糖結(jié)合作用必需的。為鑒定AAV9衣殼的可以參與半乳糖結(jié)合的潛在氨基酸，將AAV9的衣殼氨基酸序列與不結(jié)合半乳糖的其他血清型（例如AAV1、2、6、7和8）的衣殼氨基酸序列比對，以確定AAV9獨有的氨基酸。基于這種比對結(jié)果，選 擇具有極性或帶電荷側(cè)鏈的14個氨基酸以便突變成非極性丙氨酸，以檢驗對AAV9結(jié)合的影響（圖3A）。這些突變衣殼構(gòu)建體用來通過小規(guī)模制備方法制造載體，并且它們產(chǎn)生與野生型AAV9相比相似的滴度。然后將突變載體添加至三種不同的CHO細胞系以評估它們的結(jié)合能力。這些實驗中使用親本CHO細胞系Pro-5連同這個細胞系的體細胞糖基化突變體Lec-2和Lec-8。Lec-2細胞在胞苷單磷酸-唾液酸高爾基轉(zhuǎn)運體方面缺陷，并且因此在它們的表面聚糖上缺少唾液酸殘基，這造成最常見的倒數(shù)第二糖-半乳糖暴露。Lec-8細胞在尿苷二磷酸-半乳糖高爾基轉(zhuǎn)運體方面缺陷，并且因此在它們的表面聚糖結(jié)構(gòu)上缺少半乳糖類。當檢驗載體與這些CHO細胞系結(jié)合時，觀察到對AAV9預(yù)期的結(jié)果。在Pro-5細胞上觀察到低水平結(jié)合作用，但是示出結(jié)合作用在具有自由用于AAV9結(jié)合的末端半乳糖殘基的Lec-2細胞上增加100倍。與Lec-8細胞的結(jié)合降低返回至基線水平，由于它們?nèi)鄙偌毎砻姘肴樘恰Ｊ膫€突變載體中有十三個展示出這種在Lec-2細胞上結(jié)合作用增加的趨勢，提示它們保留結(jié)合半乳糖的能力。然而，位置470處的天冬酰胺殘基至丙氨酸的突變（N470A）將Lec-2細胞結(jié)合作用降低至Pro-5和Lec-8細胞上所觀察到的水平。這表明，AAV9與半乳糖結(jié)合需要N470。2.AAV9半乳糖結(jié)合作用需要緊鄰N470定位的額外氨基酸產(chǎn)生額外的AAV9突變體以確定結(jié)構(gòu)上圍繞N470的任何氨基酸是否也有助于半乳糖結(jié)合。第二組突變體靶向遍及衣殼的多個已確定可變區(qū)（VR）（包括VRI、IV、V和VII）各處的氨基酸，這些可變區(qū)在病毒粒的裝配的二十面體結(jié)構(gòu)中彼此密切接觸。選擇N470附近的十九個氨基酸用于突變成丙氨酸（圖3B），并且載體由小規(guī)模方法產(chǎn)生。如前文，全部突變體均產(chǎn)生與AAV9對照相似的高滴度載體，提示這些突變均沒有負面影響衣殼裝配。隨后對這些突變載體測試其結(jié)合Pro-5、Lec-2和Lec-8細胞的能力（圖3B）。再次，與Pro-5和Lec-8細胞相比，AAV9示出與Lec-2細胞結(jié)合增加100倍的預(yù)期結(jié)果。盡管大部分測試 的突變體也顯示這種表型，但是四種突變體展示不能與Lec-2細胞結(jié)合。對D271、N272、Y446或W503的突變均取消AAV9結(jié)合半乳糖的能力。連同這十九個丙氨酸突變體，進行其他4個AAV9位點定向突變。非極性氨基酸A472和V473正好相鄰N470定位并且可以潛在地在半乳糖結(jié)合中發(fā)揮作用。為測試這種設(shè)想，將A472和V473均突變成極性氨基酸-絲氨酸或帶電荷氨基酸-天冬氨酸。通過小規(guī)模方法構(gòu)建這些載體是成功的，并且實現(xiàn)與野生型AAV9相似的滴度。當檢驗這些載體與CHO細胞的結(jié)合時，觀察到全部這四種突變體（A472S、A472D、V473S和V473D）均喪失結(jié)合Lec-2細胞的能力。這提示這些非極性殘基是形成半乳糖結(jié)合區(qū)必需的，因為向這個區(qū)域添加極性或電荷破壞與半乳糖的相互作用。3.AAV9突變體的半乳糖結(jié)合指示體外轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為體外評估AAV9突變體的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，將表達螢火蟲螢光素酶（ffLuc）的載體添加至Pro-5和Lec-2細胞。將喪失半乳糖結(jié)合作用的五種突變體（N470A、D271A、N272A、Y446A和W503A），連同保留半乳糖結(jié)合作用的兩種突變體（S469A和E500A）和AAV9對照載體添加至細胞（MOI=104），并且48小時后，評價ffLuc表達。如預(yù)期，與AAV9、S469A和E500A相比，缺少半乳糖結(jié)合能力的突變體在轉(zhuǎn)導(dǎo)Lec-2細胞方面展示3倍或更大的下降。W503A和N272A示出最低轉(zhuǎn)導(dǎo)水平，僅高于背景。在Pro-5細胞上，總體轉(zhuǎn)導(dǎo)作用是2倍至5倍更低，因為這些細胞缺少用于結(jié)合的豐富末端半乳糖殘基。然而，如對Lec-2細胞所確定，仍然觀察到轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的相似趨勢。在半乳糖結(jié)合方面缺陷的突變體示出最低轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且保留半乳糖結(jié)合作用的兩種突變體（S469A和E500A），連同AAV9對照載體，展示更高水平的轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，E500A在Pro-5細胞上示出比AAV9高約2倍的表達，提示這種載體可能具備有利的胞內(nèi)相互作用。4.在半乳糖結(jié)合方面缺陷的突變載體不轉(zhuǎn)導(dǎo)傳導(dǎo)氣道上皮在鼻內(nèi)給予AAV9載體之前鼻內(nèi)遞送神經(jīng)氨酸酶（NA）至小鼠 允許AAV9有效轉(zhuǎn)導(dǎo)肺的傳導(dǎo)氣道上皮。這因以下而發(fā)生：NA從氣道細胞的表面聚糖切去末端唾液酸殘基，這暴露位于下面的半乳糖殘基并且允許AAV9結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究了半乳糖結(jié)合作用缺陷的突變載體是否可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)傳導(dǎo)氣道上皮。將表達靶向核的LacZ（nLacZ）的載體（1011個GC）在滴注100mUNA后1小時鼻內(nèi)遞送至小鼠，并且二十一天后移除肺并對β-gal表達染色。AAV9對照載體展示出有效的傳導(dǎo)氣道轉(zhuǎn)導(dǎo)，如基于我們先前的結(jié)果所預(yù)期。喪失半乳糖結(jié)合能力的五種突變體（N470A、D271A、N272A、Y446A和W503A）不能轉(zhuǎn)導(dǎo)傳導(dǎo)氣道上皮，這進一步證明它們不能在體內(nèi)結(jié)合半乳糖。保留半乳糖結(jié)合作用的S469A和E500A突變體顯示與AAV9相似的有效傳導(dǎo)氣道轉(zhuǎn)導(dǎo)。5.結(jié)合作用必需的氨基酸AAV9衣殼上形成支持與半乳糖相互作用的口袋使用AAV9結(jié)構(gòu)的知識，確定衣殼表面上對半乳糖結(jié)合重要的氨基酸的位置。利用分子對接方法來鑒定AAV9VP三聚體上的半乳糖結(jié)合位點。評價前100個對接結(jié)果并且拋棄將半乳糖安置在衣殼內(nèi)表面上的對接方案。剩余的13個方案均將使半乳糖與N470密切接觸對接，13個方案中有12個使半乳糖在N470和W503之間對接。N470、D271、N272、Y446和W503在圍繞3重對稱軸的凸出物的基部處形成口袋。這個口袋由面朝2重軸及5重軸的凸出物的外表面和在2重軸及5重軸之間由VRI形成的小表面凸出物形成。AAV9包含其中進一步說明半乳糖殘基怎樣裝進這個區(qū)域內(nèi)的結(jié)合袋。發(fā)現(xiàn)對于半乳糖結(jié)合作用重要的非極性A472和V473氨基酸位于結(jié)合袋基部，并且因此可能允許半乳糖的成功插入。半乳糖結(jié)合位點的一個有趣特征是，已經(jīng)示出對結(jié)合作用重要的氨基酸來自兩個不同單體，其中Y446、N470、A472和V473構(gòu)成結(jié)合袋的底部，并且構(gòu)成結(jié)合袋頂部的氨基酸D271、N272和W503來自另一個起作用的單體。這可以提供一種機構(gòu)以確保僅正確裝配的衣殼可以與受體結(jié)合。有意義地，在鑒定半乳糖結(jié)合袋后，將唾液酸分子對接至相同衣殼區(qū)域的嘗試示出這種聚糖因空間位阻不能容納于這個口袋 內(nèi)。這種觀察結(jié)果與AAV9缺少唾液酸結(jié)合作用一致。C.討論研究AAV9的細胞表面聚糖相互作用的先前實驗展示，這種載體使用半乳糖作為細胞受體。分析AAV9對多個細胞系（包括Pro-5、HEK293和Huh-7細胞）的結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)，揭示了使用NA從細胞表面聚糖酶促移除末端唾液酸殘基導(dǎo)致AAV9結(jié)合作用的顯著增加。這種增加歸因于下方半乳糖的暴露，這促進AAV9結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)。使用CHO糖基化突變體細胞系Lec-2和Lec-8連同凝集素競爭測定法的另外研究驗證了半乳糖的這種作用。額外地，鼻內(nèi)遞送至小鼠的NA導(dǎo)致氣道細胞表面上末端半乳糖殘基的增加，并且因此導(dǎo)致AAV9轉(zhuǎn)導(dǎo)的增加。這項研究的目的是鑒定半乳糖結(jié)合作用所需的AAV9衣殼氨基酸，我們確定這些氨基酸包括N470、D271、N272、Y446和W503。將AAV9的乳糖結(jié)合位點與其他半乳糖結(jié)合蛋白的乳糖結(jié)合位點比較，發(fā)現(xiàn)氨基酸組成方面的相似性。糖與芳族殘基相互作用是糖結(jié)合蛋白的結(jié)合位點中常見的，并且已經(jīng)對半乳糖特異性蛋白觀察到（Elgavish（艾爾蓋維什）等人，1997,TrendsBiochemSci（生物化學趨勢）22(12):462-7.；Sujatha（素加塔）等人，2005,Biochemistry（生物化學）44(23):8554-62）。這些殘基與糖形成疏水相互作用并且也參與區(qū)分半乳糖與其他糖，例如葡萄糖（Elgavish（艾爾蓋維什）,1997；Sujatha（素加塔），2005）。這與我們對AAV9定位的結(jié)合位點一致，這些結(jié)合位點包含兩個芳族殘基Y446和W503。額外地，許多半乳糖結(jié)合蛋白包含極性和帶電荷氨基酸，包括天冬酰胺、天冬氨酸和谷氨酰胺，這些氨基酸已經(jīng)示出通過與糖的羥基形成氫鍵而有助于半乳糖結(jié)合（Montfort（蒙特福特）等人，1987,JBiolChem（生物化學雜志）262(11):5398-403；Elgavish（艾爾蓋維什）,1997）。可能的是AAV9衣殼的N470、D271和N272與半乳糖形成相似的相互作用。也已經(jīng)確定其他AAV血清型的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的位置。AAV2的HS結(jié)合位點定位至五個氨基酸：R484、R487、R585、R588和K532（Kern（克恩）,2003JVirol（病毒學雜 志）77(20):11072-81.；Opie（奧佩）,2003,JVirol（病毒學雜志）77(12):6995-7006）。這些氨基酸在每個3重對稱性相關(guān)衣殼凸出物的內(nèi)側(cè)面上形成基礎(chǔ)小片。也已經(jīng)示出與HS結(jié)合的AAV6在類似位置中包含如對AAV2觀察到的相似基部氨基酸片段，這些氨基酸包括R485、R488、K528和K533（Ng等人，2010,JVirol（病毒學雜志）84(24):12945-57）。此外，通過誘變研究，K493、K459、R576和K531均已經(jīng)示出是AAV6HS結(jié)合作用必需的并且位于相鄰位置內(nèi)。AAV9的半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域，位于圍繞3重軸的凸出物的基部處，與位于面朝3重軸的內(nèi)表面上的AAV2HS結(jié)合區(qū)相比處在這個結(jié)構(gòu)的對側(cè)面上。AAV6HS結(jié)合殘基也位于該凸出物外側(cè)壁的上，但是與AAV9半乳糖結(jié)合殘基相比位于更靠近VRIII和二十面體2重軸的對側(cè)壁上。這些觀察結(jié)果進一說明，裝配成圍繞3重軸的凸出物的氨基酸和結(jié)構(gòu)以及毗鄰于這個區(qū)域的殘基在受體識別不同AAV血清型中的重要性。它還支持一項提議：AAV衣殼，特別是表面暴露的凸出物的常見結(jié)構(gòu)變異性已經(jīng)演化成使能夠利用不同表面分子成功感染，這是它們相應(yīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)表型的重要決定因素。AAV9示出了可以通過受體相互作用而可以解釋的獨特特征。例如，在靜脈內(nèi)注射后，AAV9可以穿越血腦屏障并轉(zhuǎn)導(dǎo)成年和新生小鼠和貓的脊髓中的運動神經(jīng)元，連同新生小鼠腦中的神經(jīng)元和成年小鼠腦中的星形細胞。而且，在非人靈長類中測試時，AAV9轉(zhuǎn)導(dǎo)脊髓中的運動神經(jīng)元并主要轉(zhuǎn)導(dǎo)腦中的神經(jīng)膠質(zhì)細胞。通過熒光凝集素染色，我們先前已經(jīng)在小鼠腦中血管的表面上觀察到豐富的半乳糖表達。AAV9會可能使用半乳糖來促進跨血管系統(tǒng)的轉(zhuǎn)胞吞作用，允許進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。將半乳糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域工程化到其他AAV血清型的衣殼上，可以允許轉(zhuǎn)移AAV9的有吸引力的表型及開發(fā)用于基因治療的新穎載體。實例-NA預(yù)處理改善小鼠鼻氣道中AAV介導(dǎo)的ffLuc表達C57BL6小鼠（6-8周齡，20-25g體重，雄性）用氯胺酮/賽拉嗪的混合物麻 醉。隨后在每個鼻孔中向小鼠給予5μl的來自霍亂弧菌的神經(jīng)氨酸酶（NA）（Sigma公司，N7885）（總計80-100mUNA）。在NA預(yù)處理10分鐘內(nèi)，將AAV9載體（總劑量1011GC）作為PBS中稀釋的兩份15μl等分試樣（每鼻孔15μl）滴入，其中所述AAV9載體在雞β-肌動蛋白啟動子轉(zhuǎn)錄性控制下表達螢火蟲螢光素酶（ffLuc）。允許小鼠恢復(fù)，并且載體接種后早至24小時監(jiān)測轉(zhuǎn)基因表達（ffLuc）。在發(fā)光成像時，將小鼠麻醉并給予螢光素[兩個鼻孔中每個鼻孔15μl15mg/mlD-螢光素溶液（CaliperLifeSciences公司,Hopkinton（霍普金頓）,馬薩諸塞州）]，并在施加螢光素5分鐘內(nèi)對表達進行成像。為了后續(xù)在第3、7、14、21和28天的成像過程，允許小鼠恢復(fù)。這些結(jié)果在圖5的條形圖說明。這些數(shù)據(jù)示出，在用神經(jīng)氨酸酶預(yù)處理后，鼻氣道中螢火蟲螢光素酶基因表達改善約2倍。在兩種獨立情況下觀察到這種差異。另外，添加神經(jīng)氨酸酶導(dǎo)致基因表達快速開始，其中在AAV9載體滴注24小時內(nèi)觀察到最高基因表達，其在1周內(nèi)減弱至穩(wěn)態(tài)水平。在本說明書中援引的全部出版物、專利文獻和GenBank序列通過引用方式結(jié)合在此。盡管已參照特別優(yōu)選的實施例描述了本發(fā)明，但是將理解，可以做出修改而不偏離本發(fā)明的精神。