使用經(jīng)修飾的核苷酸和納米孔檢測(cè)的DNA邊合成邊測(cè)序本申請(qǐng)案主張2010年12月17日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/424,480號(hào)和2011年11月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/557,558號(hào)的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)案中的每一者的內(nèi)容特此以全文引用的方式并入。在本申請(qǐng)案中，參考了某些專利和出版物，后者按作者和出版年份作參考。緊鄰權(quán)利要求書(shū)之前可以發(fā)現(xiàn)這些出版物的完整引用。這些專利和出版物的全部公開(kāi)內(nèi)容特此以引用的方式并入本申請(qǐng)案中，以便更充分地描述本發(fā)明所涉及的現(xiàn)有技術(shù)。技術(shù)領(lǐng)域無(wú)

背景技術(shù)：
DNA測(cè)序是一種基本的生物學(xué)技術(shù)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了數(shù)種分析方法以在單分子水平上使用化學(xué)或物理微觀技術(shù)檢測(cè)DNA或RNA[珀金斯(Perkins)等人1994，里夫(Rief)等人1999，史密斯(Smith)等人1996，以及韋庫(kù)特(Vercoutere)等人2001]。在過(guò)去的幾年中，已經(jīng)探索了離子傳感技術(shù)，如離子通道，其依賴于在核苷酸通過(guò)聚合酶并入DNA的鏈中時(shí)所釋放的氫離子(H+)的檢測(cè)[羅思伯格(Rothberg)等人2011]，從而檢測(cè)個(gè)別DNA或RNA鏈[卡西亞諾維奇(Kasianowicz)2003和2004，錢(qián)德勒(Chandler)等人2004，迪默(Deamer)等人2002，博爾蘇科夫(Berzukov)等人2001，以及亨里克森(Henrickson)等人2000]。已經(jīng)展示了α-溶血素通道(一種由細(xì)菌分泌的外毒素)可以用于在單分子水平上檢測(cè)核酸[卡西亞諾維奇等人1996]。α-溶血素蛋白是一種單體多肽，其在脂質(zhì)雙層膜中自組裝形成七聚孔，所述孔具有2.6nm直徑的孔腔和1.5nm直徑的限制孔(孔的最窄點(diǎn))[麥勒(Meller)等人2000，阿克松(Akeson)等人1999，以及迪默等人2002]。納米孔的限制孔允許線性單鏈而非雙鏈的核酸分子(直徑約2.0nm)穿過(guò)。在離子鹽水溶液(KCl)中，當(dāng)將適當(dāng)電壓施加在膜兩端時(shí)，由α-溶血素通道形成的孔傳導(dǎo)足夠強(qiáng)大并且穩(wěn)定的離子電流。聚陰離子核酸由所施加的電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)通過(guò)所述孔，由此阻隔或減小離子電流，否則所述離子電流將不受阻礙。此通過(guò)的過(guò)程產(chǎn)生了電子信號(hào)(圖1)[韋庫(kù)特等人2001和迪默等人2002]。特定核酸分子在進(jìn)入和穿過(guò)納米孔時(shí)產(chǎn)生特征信號(hào)，所述特征信號(hào)將其與其它核酸分子區(qū)分開(kāi)來(lái)。所述阻隔的持續(xù)時(shí)間與核酸的長(zhǎng)度成正比，并 且信號(hào)強(qiáng)度與核苷酸的空間和電子性質(zhì)有關(guān)，即，與四種堿基(A、C、G和T)的身份有關(guān)。由此，獲得特定事件圖(其為易位時(shí)間相對(duì)于阻隔電流的曲線)，并且其用于通過(guò)單通道記錄技術(shù)基于圖中的特征參數(shù)(如易位電流、易位持續(xù)時(shí)間和其相應(yīng)的離差)來(lái)區(qū)分聚核苷酸的長(zhǎng)度和組成[麥勒等人2000]。還展示了具有以共價(jià)方式連接的接頭的蛋白納米孔可以在高精確度下精確地鑒別未經(jīng)標(biāo)記的5′-單磷酸核苷(dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)[克拉克(Clarke)等人2009]。舉例來(lái)說(shuō)，氨基環(huán)糊精接頭已經(jīng)以共價(jià)方式成功地連接在α-溶血素孔內(nèi)。當(dāng)dNMP被捕獲并且被驅(qū)動(dòng)通過(guò)脂質(zhì)雙層膜中的孔時(shí)，通過(guò)所述孔的離子電流減少到四種水平中的一種，每一種代表了四種dNMP中的一種(A、G、C或T)。此外，羅伯特森(Robertson)等人[2007]近來(lái)已展示了當(dāng)聚(乙二醇)(PEG)分子進(jìn)入單個(gè)α溶血素孔時(shí)，其引起獨(dú)特的質(zhì)量依賴性導(dǎo)電率狀態(tài)與特有的平均滯留時(shí)間?；趯?dǎo)電率的質(zhì)譜明確地解析了乙二醇的重復(fù)單元，并且滯留時(shí)間隨PEG的質(zhì)量增加。盡管當(dāng)前的納米孔方法展示了作為DNA檢測(cè)方法的前景，但精確的堿基到堿基測(cè)序的更高要求目標(biāo)尚未被實(shí)現(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
一種測(cè)定單鏈DNA的核苷酸序列的方法，其包含：(a)使所述單鏈DNA，其中所述單鏈DNA在電解質(zhì)溶液中與膜中的納米孔接觸并且其中所述單鏈DNA具有與其一部分雜交的引物，與DNA聚合酶和四種多磷酸脫氧核糖核苷酸(dNPP)類似物(其中至少一者可以與所測(cè)序的DNA中的A、T、G或C核苷酸中的每一者雜交)在允許所述DNA聚合酶催化所述dNPP類似物中的一者在其與所述單鏈DNA的核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)并入所述引物中的條件下接觸，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述引物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，由此形成DNA延伸產(chǎn)物，其中所述四種dNPP類似物中的每一者具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶或這些堿基中的一者或一者以上的衍生物，其中R1為OH，其中R2為H，其中X為O、NH、S或CH2，其中n為1、2、3或4，其中Z為O、S或BH3，并且其限制條件為(i)每種dNPP類似 物上的堿基類型與其它三種dNPP類似物中的每一者上的堿基類型不同，并且(ii)每種dNPP類似物的n值與其它三種dNPP類似物中的每一者的n值不同，或者所述四種dNPP類似物中的每一者的n值是相同的并且每種dNPP類似物上的標(biāo)簽類型與其它三種dNPP類似物中的每一者上的標(biāo)簽類型不同，其中所述dNPP類似物的并入促成具有與其連接的所述標(biāo)簽的多磷酸酯的釋放；以及(b)通過(guò)以下方式鑒別在步驟(a)中何種dNPP類似物已并入所述引物中從而形成DNA延伸產(chǎn)物：將電壓施加到所述膜的兩端，并且測(cè)量在所述納米孔的兩端由步驟(a)中產(chǎn)生的具有與其連接的所述標(biāo)簽的所述多磷酸酯通過(guò)所述納米孔易位而引起的電子變化，其中所述電子變化對(duì)于n的每個(gè)值或?qū)τ跇?biāo)簽的每種不同類型(以適用的為準(zhǔn))是不同的，從而允許鑒別所述單鏈DNA中與所述并入的dNPP類似物互補(bǔ)的所述核苷酸殘基；以及(c)針對(duì)所測(cè)序的所述單鏈DNA的每個(gè)核苷酸殘基重復(fù)地進(jìn)行步驟(b)，其中在步驟(b)的每次重復(fù)操作中，所述dNPP類似物在其與所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)被并入所述DNA延伸產(chǎn)物中，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述DNA延伸產(chǎn)物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，從而測(cè)定所述單鏈DNA的所述核苷酸序列。一種測(cè)定單鏈DNA的核苷酸序列的方法，其包含：(a)使所述單鏈DNA，其中所述單鏈DNA在電解質(zhì)溶液中與膜中的納米孔接觸并且其中所述單鏈DNA具有與其一部分雜交的引物，與DNA聚合酶和多磷酸脫氧核糖核苷酸(dNPP)類似物在允許所述DNA聚合酶催化所述dNPP類似物在其與所述單鏈DNA的核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)并入所述引物中的條件下接觸，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述引物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，由此形成DNA延伸產(chǎn)物，其中所述dNPP類似物具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶或其中每一者的衍生物，其中R1為-OH、-O-CH2N3或-O-2-硝基苯甲基，其中R2為H，其中X為O、NH、S或CH2，其中n為1、2、3或4，其中Z為O、S或BH3，并且其中如果所述dNPP類似物沒(méi)有被并入的話，那么反復(fù)地重復(fù)與不同dNPP類似物的所述接觸直到dNPP類似物被并入為止，其限制條件為(1)每種dNPP類似物上的堿基類型與其它dNPP類似物中的每一者上的堿基類型不同，并且(2)每種dNPP類似物的n值與其它三種dNPP類似物中的每一者的n值不同，或者所述四種dNPP類似物中的每一者的n值是相同的并且每種dNPP類似物上的標(biāo)簽類型與其它三種dNPP類似物中的每一者上的標(biāo)簽類型不同，其中dNPP類似物的并入促成具有與其連接的所述標(biāo)簽的多磷酸酯的釋放；(b)通過(guò)以下方式測(cè)定在步驟(a)中何種dNPP類似物已并入所述引物中從而形成DNA延伸產(chǎn)物：將電壓施加到所述膜的兩端，并且測(cè)量在所述納米孔的兩端由步驟(a)中產(chǎn)生的具有與其連接的所述標(biāo)簽的所述多磷酸酯通過(guò)所述納米孔易位而引起的電子變化，其中所述電子變化視情況而定對(duì)于n的每個(gè)值或?qū)τ跇?biāo)簽的每種不同類型是不同的，從而鑒別所述單鏈DNA中與所述并入的dNPP類似物互補(bǔ)的所述核苷酸殘基；(c)針對(duì)所測(cè)序的所述單鏈DNA的每個(gè)核苷酸殘基重復(fù)地進(jìn)行步驟(a)和(b)，其中在步驟(a)的每次重復(fù)操作中，所述dNPP類似物在其與所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)被并入所述DNA延伸產(chǎn)物中，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述DNA延伸產(chǎn)物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，從而測(cè)定所述單鏈DNA的所述核苷酸序列。一種測(cè)定單鏈DNA的核苷酸序列的方法，其包含：(a)使所述單鏈DNA，其中所述單鏈DNA在電解質(zhì)溶液中與膜中的納米孔接觸并且其中所述單鏈DNA具有與其一部分雜交的引物，與DNA聚合酶和至少四種多磷酸脫氧核糖核苷酸(dNPP)類似物在允許所述DNA聚合酶催化所述dNPP類似物中的一種在其與所述單鏈DNA的核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)并入所述引物中的條件下接觸，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述引物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，由此形成DNA延伸產(chǎn)物，其中所述四種dNPP類似物中的每一者具有選自以下的結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶或其中每一者的衍生物，其中Y為標(biāo)簽，其中R1在存在時(shí)為OH，其中R2在存在時(shí)為H，其中X為可裂解的連接基團(tuán)，其中Z為O、S或BH3，其中n為1、2、3或4，其中A為O、S、CH2、CHF、CFF或NH，并且其限制條件為(i)每種dNPP類似物上的堿基類型與其它三種dNPP類似物中的每一者上的堿基類型不同，并且(ii)每種dNPP類似物上的標(biāo)簽類型與其它三種dNPP類似物中的每一者上的標(biāo)簽類型不同；(b)使來(lái)自在步驟(a)中并入的所述dNPP類似物的所述標(biāo)簽裂解；以及(c)通過(guò)以下方式測(cè)定在步驟(a)中何種dNPP類似物被并入：將電壓施加到所述膜的兩端，并且測(cè)量在所述納米孔的兩端由步驟(b)中裂解掉的標(biāo)簽通過(guò)所述納米孔易位而引起的電子變化，其中所述電子變化對(duì)于標(biāo)簽的每種不同類型是不同的，從而鑒別所述單鏈DNA中與所述并入的dNPP類似物互補(bǔ)的所述核苷酸殘基；以及(d)針對(duì)所測(cè)序的所述單鏈DNA的每個(gè)核苷酸殘基重復(fù)地進(jìn)行步驟(a)、(b)和(c)，其中在步驟(a)的每次重復(fù)操作中，所述dNPP類似物在其與所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)被并入由步驟(a)的先前反復(fù)操作而產(chǎn)生的所述DNA延伸產(chǎn)物中，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述DNA延伸產(chǎn)物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，從而測(cè)定所述單鏈DNA的所述核苷酸序列。一種測(cè)定單鏈DNA的核苷酸序列的方法，其包含：(a)使所述單鏈DNA，其中所述單鏈DNA在電解質(zhì)溶液中與膜中的納米孔接觸，其中所述單鏈DNA具有與其一部分雜交的引物，與DNA聚合酶和多磷酸脫氧核糖核苷酸(dNPP)類似物在允許所述DNA聚合酶催化所述dNPP類似物在其與所述單鏈DNA的核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)并入所述引物中的條件下接觸，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述引物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，由此形成DNA延伸產(chǎn)物，其中所述dNPP類似物具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶或其中每一者的衍生物，其中Y為標(biāo)簽，并且其中R1在存在時(shí)為OH、-OCH2N3或-O-2-硝基苯甲基，R2在存在時(shí)為H，其中X為可裂解的連接基團(tuán)，其中Z為O、S或BH3，其中n為1、2、3或4，其中A為O、S、CH2、CHF、CFF或NH，并且如果所述dNPP類似物沒(méi)有被并入的話，那么反復(fù)地重復(fù)與不同dNPP類似物的所述接觸直到dNPP類似物被并入為止，其限制條件為(1)每種dNPP類似物上的堿 基類型與每種其它dNPP類似物上的堿基類型不同，并且(2)每種dNPP類似物上的標(biāo)簽類型與每種其它dNPP類似物上的標(biāo)簽類型不同，其中dNPP類似物的并入促成具有與其連接的所述標(biāo)簽的多磷酸酯的釋放；(b)使來(lái)自在步驟(a)中并入的所述dNPP類似物的所述標(biāo)簽裂解；以及(c)通過(guò)以下方式測(cè)定在步驟(a)中何種dNPP類似物被并入從而形成DNA延伸產(chǎn)物：將電壓施加到所述膜的兩端，并且測(cè)量在所述納米孔的兩端由步驟(b)中裂解掉的所述標(biāo)簽通過(guò)所述納米孔易位而引起的電子變化，其中所述電子變化對(duì)于標(biāo)簽的每種類型是不同的，從而鑒別所述單鏈DNA中與所述并入的dNPP類似物互補(bǔ)的所述核苷酸殘基；(d)針對(duì)所測(cè)序的所述單鏈DNA的每個(gè)核苷酸殘基反復(fù)地進(jìn)行步驟(a)到(c)，其中在步驟(a)的每次反復(fù)操作中，所述dNPP類似物在其與所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)被并入由步驟(a)的先前反復(fù)操作而產(chǎn)生的所述DNA延伸產(chǎn)物中，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述DNA延伸產(chǎn)物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，從而測(cè)定所述單鏈DNA的所述核苷酸序列。一種產(chǎn)生三磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述三磷酸核苷酸類似物因具有與其末端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與三磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與二環(huán)己基碳化二亞胺/二甲基甲酰胺在允許產(chǎn)生環(huán)狀三偏磷酸酯的條件下接觸；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與具有與其連接的羥基或氨基的標(biāo)簽在允許所述環(huán)狀三偏磷酸酯親核開(kāi)環(huán)的條件下接觸，由此使所述標(biāo)簽鍵結(jié)到末端磷酸酯上，從而形成所述三磷酸核苷酸類似物。一種產(chǎn)生三磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述三磷酸核苷酸類似物因具有與其末端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與三磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與二環(huán)己基碳化二亞胺/二甲基甲酰胺在允許產(chǎn)生環(huán)狀三偏磷酸酯的條件下接觸；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與親核試劑接觸，由此形成-OH或-NH2官能化的化合物；c)使步驟b)的所述產(chǎn)物與具有與其連接的-COR基團(tuán)的標(biāo)簽在允許所述標(biāo)簽間接鍵結(jié)到末端磷酸酯上的條件下反應(yīng)，從而形成所述三磷酸核苷酸類似物。一種產(chǎn)生四磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述四磷酸核苷酸類似物因具有與其末 端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與四磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與1，1′-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允許形成以下結(jié)構(gòu)的條件下接觸：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與具有與其連接的單磷酸酯基的標(biāo)簽在允許形成所述四磷酸核苷酸類似物的條件下接觸。一種產(chǎn)生四磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述四磷酸核苷酸類似物因具有與其末端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與四磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與1，1′-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允許形成以下結(jié)構(gòu)的條件下接觸：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與磷酸在允許形成四磷酸核苷酸的條件下接觸；c)使所述四磷酸核苷酸依次與1)羰基二咪唑/二甲基甲酰胺、2)親核試劑以及3)NH4OH接觸，由此形成-OH或-NH2官能化的化合物；d)使步驟c)的所述產(chǎn)物與具有與其連接的-COR基團(tuán)的標(biāo)簽在允許所述標(biāo)簽間接鍵結(jié)到末端磷酸酯上的條件下接觸，從而形成所述四磷酸核苷酸類似物。一種產(chǎn)生四磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述四磷酸核苷酸類似物因具有與其末端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與四磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與1，1′-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允許形成以下結(jié)構(gòu)的條件下接觸：b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與磷酸在允許形成四磷酸核苷酸的條件下接觸；c)使所述四磷酸核苷酸與羰基二咪唑/二甲基甲酰胺和具有與其連接的羥基或氨基的標(biāo)簽接觸，由此形成具有以下結(jié)構(gòu)的化合物：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶。一種產(chǎn)生五磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述五磷酸核苷酸類似物因具有與其末端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與五磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與1，1′-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允許形成以下結(jié)構(gòu)的條件下接觸：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與具有與其連接的焦磷酸酯基的標(biāo)簽在允許形成所述五磷酸核苷酸類似物的條件下接觸。一種產(chǎn)生五磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述五磷酸核苷酸類似物因具有與其末端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與五磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與1，1′-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允許形成以下結(jié)構(gòu)的條件下接觸：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與焦磷酸酯基在允許形成五磷酸核苷酸的條件下接觸；c)使所述五磷酸核苷酸與羰基二咪唑/二甲基甲酰胺和具有與其連接的羥基或氨基的標(biāo)簽接觸，由此形成所述五磷酸核苷酸類似物。一種產(chǎn)生六磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述六磷酸核苷酸類似物因具有與其末端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與六磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與1，1′-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允許形成以下結(jié)構(gòu)的條件下接觸：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與具有與其連接的三磷酸酯基的標(biāo)簽在允許形成所述六磷酸核苷酸類似物的條件下接觸。一種產(chǎn)生六磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述六磷酸核苷酸類似物因具有與其末端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與六磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與1，1′-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允許形成以下結(jié)構(gòu)的條件下接觸：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與三磷酸酯基在允許形成六磷酸核苷酸的條件下接觸；c)使所述六磷酸核苷酸與羰基二咪唑/二甲基甲酰胺和具有與其連接的羥基或氨基的標(biāo)簽接觸，由此形成所述六磷酸核苷酸類似物。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述標(biāo)簽為乙二醇、氨基酸、碳水化合物、染料、單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸或六核苷酸，其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中X為O、NH、S或CH2，其中Z為O、S或BH3，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶，并且其中n為1、2、3或4。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中在每個(gè)結(jié)構(gòu)中，n獨(dú)立地為1、2、3或4，并且m獨(dú)立地為0到100的整數(shù)，并且其中當(dāng)m為0時(shí)，dNPP的末端磷酸酯直接鍵結(jié)到所述結(jié)構(gòu)的左手邊所示的核苷的 3′O原子上，其中R1為-OH或-O-CH2N3，并且R2為H或OH。一種組合物，其包含至少四種多磷酸脫氧核苷酸(dNPP)類似物，所述類似物各自具有選自根據(jù)權(quán)利要求74和75所述的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)，其中所述四種dNPP類似物中的每一者包含與其它三種dNPP類似物的堿基類型不同的堿基類型。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中m為0到100的整數(shù)，并且其中所述化合物包含單一類型的堿基，并且其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶或其中每一者的衍生物。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶，并且R為經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烴基，至多3000道爾頓(dalton)。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶，并且m為1到50的整數(shù)。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中n為1或2，并且所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中R1為-OH或-O-CH2N3，并且R2為H或OH。一種測(cè)定單鏈RNA的核苷酸序列的方法，其包含：(a)使所述單鏈RNA，其中所述單鏈RNA在電解質(zhì)溶液中與膜中的納米孔接觸，其中所述單鏈RNA具有與其一部分雜交的引物，與RNA聚合酶和至少四種多磷酸核糖核苷酸(rNPP)類似物在允許所述RNA聚合酶催化所述rNPP類似物中的一者在其與所述單鏈RNA的核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)并入所述引物中的條件下接觸，所述單鏈RNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述引物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈RNA的核苷酸殘基的5′，由此形成RNA延伸產(chǎn)物，其中所述四種rNPP類似物中的每一種具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶或其中每一者的衍生物，其中R1為OH，其中R2為OH，其中X為O、NH、S或CH2，其中n為1、2、3或4，其中Z為O、S或BH3，并且其限制條件為(i)每種rNPP類似物上的堿基類型 與其它三種rNPP類似物中的每一者上的堿基類型不同，并且(ii)每種rNPP類似物的n值與其它三種rNPP類似物中的每一者的n值不同，或者所述四種rNPP類似物中的每一者的n值是相同的并且每種rNPP類似物上的標(biāo)簽類型與其它三種rNPP類似物中的每一者上的標(biāo)簽類型不同，其中所述rNPP類似物的并入促成具有與其連接的所述標(biāo)簽的多磷酸酯的釋放；以及(b)通過(guò)以下方式測(cè)定在步驟(a)中何種rNPP類似物已并入所述引物中從而形成RNA延伸產(chǎn)物：將電壓施加到所述膜的兩端，并且測(cè)量在所述納米孔的兩端由步驟(a)中產(chǎn)生的具有與其連接的所述標(biāo)簽的所述多磷酸酯通過(guò)所述納米孔易位而引起的電子變化，其中所述電子變化視情況而定對(duì)于n的每個(gè)值或?qū)τ跇?biāo)簽的每種不同類型是不同的，從而鑒別所述單鏈RNA中與所述并入的rNPP類似物互補(bǔ)的所述核苷酸殘基；以及(c)針對(duì)所測(cè)序的所述單鏈RNA的每個(gè)核苷酸殘基反復(fù)地進(jìn)行步驟(a)和(b)，其中在步驟(a)的每次反復(fù)操作中，所述rNPP類似物在其與所述單鏈RNA的所述核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)被并入由步驟(a)的先前反復(fù)操作而產(chǎn)生的所述RNA延伸產(chǎn)物中，所述單鏈RNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述RNA延伸產(chǎn)物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈RNA的核苷酸殘基的5′，從而測(cè)定所述單鏈RNA的所述核苷酸序列。一種測(cè)定單鏈RNA的核苷酸序列的方法，其包含：(a)使所述單鏈RNA，其中所述單鏈RNA在電解質(zhì)溶液中與膜中的納米孔接觸并且其中所述單鏈RNA具有與其一部分雜交的引物，與RNA聚合酶和多磷酸核糖核苷酸(rNPP)類似物在允許所述RNA聚合酶催化所述rNPP類似物在其與所述單鏈RNA的核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)并入所述引物中的條件下接觸，所述單鏈RNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述引物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈RNA的核苷酸殘基的5′，由此形成RNA延伸產(chǎn)物，其中所述rNPP類似物具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶，其中R1為OH、-O-CH2N3或-O-2-硝基苯甲基，其中R2為-OH，其中X為O、NH、S或CH2，其中n為 1、2、3或4，其中Z為O、S或BH3，并且其中如果所述rNPP類似物沒(méi)有被并入的話，那么反復(fù)地重復(fù)與不同rNPP類似物的所述接觸直到rNPP類似物被并入為止，其限制條件為(1)每種rNPP類似物上的堿基類型與其它rNPP類似物中的每一者上的堿基類型不同，并且(2)每種rNPP類似物的n值與其它三種rNPP類似物中的每一者的n值不同，或者所述四種rNPP類似物中的每一者的n值是相同的并且每種rNPP類似物上的標(biāo)簽類型與其它三種rNPP類似物中的每一者上的標(biāo)簽類型不同，其中rNPP類似物的并入促成具有與其連接的所述標(biāo)簽的多磷酸酯的釋放；(b)通過(guò)以下方式測(cè)定在步驟(a)中何種rNPP類似物已并入所述引物中從而形成RNA延伸產(chǎn)物：將電壓施加到所述膜的兩端，并且測(cè)量在所述納米孔的兩端由步驟(a)中產(chǎn)生的具有與其連接的所述標(biāo)簽的所述多磷酸酯通過(guò)所述納米孔易位而引起的電子變化，其中所述電子變化視情況而定對(duì)于n的每個(gè)值是不同的或?qū)τ跇?biāo)簽的每種類型是不同的，從而鑒別所述單鏈RNA中與所述并入的rNPP類似物互補(bǔ)的所述核苷酸殘基；(c)針對(duì)所測(cè)序的所述單鏈RNA的每個(gè)核苷酸殘基反復(fù)地進(jìn)行步驟(a)和(b)，其中在步驟(a)的每次反復(fù)操作中，所述rNPP類似物在其與所述單鏈RNA的所述核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)被并入由步驟(a)的先前反復(fù)操作而產(chǎn)生的所述RNA延伸產(chǎn)物中，所述單鏈RNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述RNA延伸產(chǎn)物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈RNA的核苷酸殘基的5′，從而測(cè)定所述單鏈RNA的所述核苷酸序列。附圖說(shuō)明圖1.α-溶血素蛋白在脂質(zhì)雙層中自組裝形成離子通道并且核酸鏈段穿過(guò)其(上圖)，產(chǎn)生相應(yīng)的電子信號(hào)(下圖)[韋庫(kù)特等人2001和迪默等人2002]。圖2.核苷酸三磷酸腺苷脫氧核糖核苷酸、三磷酸鳥(niǎo)苷脫氧核糖核苷酸、三磷酸胞苷脫氧核糖核苷酸以及三磷酸胸苷脫氧核糖核苷酸的結(jié)構(gòu)。圖3.引物延伸和用于檢測(cè)的加標(biāo)簽的多磷酸酯的釋放的機(jī)制。圖4.四種磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-多磷酸酯的結(jié)構(gòu)。圖5.磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-三磷酸酯的合成。圖6.磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-四磷酸酯的合成。圖7.末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-五磷酸酯的合成。圖8.a)寡聚物-3′到5′-磷酸酯連接，b)寡聚物-5′到5′-磷酸酯連接，c)聚合酶反應(yīng) 之后的可檢測(cè)部分。圖9(A).堿基修飾的核苷-5′-三磷酸酯的合成。圖9(B).堿基修飾的核苷-5′-三磷酸酯的裂解和使用TCEP的裂解。圖10.3′-O-修飾的核苷-5′-三磷酸酯的合成。A.3′-O-2-硝基苯甲基連接的dNTP；B.3′-O-疊氮基甲基連接的dNTP；C.聚合酶延伸和TCEP裂解之后的可檢測(cè)部分；以及D.聚合酶延伸和UV裂解之后的可檢測(cè)部分。圖11.使用磷酸酯修飾的核苷酸類似物的DNA延伸反應(yīng)。圖12.使用堿基加標(biāo)簽的核苷酸類似物的DNA延伸反應(yīng)。圖13.使用2′-OH或3′-OH標(biāo)記的核苷酸類似物的DNA延伸反應(yīng)。圖14.使用經(jīng)修飾的核苷酸通過(guò)納米孔的DNA測(cè)序的示意圖，其尤其適用于涉及同時(shí)加入所有4種核苷酸和聚合酶以接觸單模板分子的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序。圖15.具有可能的連接基團(tuán)和標(biāo)簽的磷酸酯、堿基、2′和3′修飾的磷酸核苷堿基＝腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、5-甲基C、7-脫氮-A、7-脫氮-G或其衍生物；R1和R2＝H、OH、F、NH2、N3或OR′；n＝1到5；A＝O、S、CH2、CHF、CFF、NH；Z＝O、S、BH3；X＝連接基團(tuán)，其將磷酸酯或2′-O或3′-O或堿基連接到可檢測(cè)部分上并且可以含有O、N或S、P原子。(連接基團(tuán)也可以是可檢測(cè)部分(直接或間接地)，如氨基酸、肽、蛋白、碳水化合物、不同長(zhǎng)度和分子量的PEG、有機(jī)或無(wú)機(jī)染料、熒光和熒光發(fā)生染料、藥物、寡核苷酸、質(zhì)量標(biāo)簽、化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽并且可以含有正或負(fù)電荷。)；Y＝標(biāo)簽或可檢測(cè)部分，如具有一個(gè)或一個(gè)以上環(huán)的脂肪族或有機(jī)芳香族化合物、染料、蛋白、碳水化合物、不同長(zhǎng)度和分子量的PEG、藥物、寡核苷酸、質(zhì)量標(biāo)簽、熒光標(biāo)簽、化學(xué)發(fā)光標(biāo)簽并且可以含有正或負(fù)電荷。圖16.PEG-磷酸酯標(biāo)記的核苷酸的結(jié)構(gòu)以及具有與官能團(tuán)反應(yīng)的不同反應(yīng)性基團(tuán)的可能的PEG的實(shí)例。圖17.末端磷酸酯上的反應(yīng)性基團(tuán)(其也可以在適當(dāng)變化的情況下連接到核苷堿基部分上)以及與所述基團(tuán)可以反應(yīng)形成標(biāo)簽的基團(tuán)的非限制性的特定實(shí)例。圖18.用于大規(guī)模平行DNA邊合成邊測(cè)序的納米孔陣列的示意圖。圖19.PEG-磷酸酯標(biāo)記的核苷酸的合成。圖20.通過(guò)并入PEG-磷酸酯標(biāo)記的核苷酸類似物(dG4P-PEG)而產(chǎn)生的DNA延伸產(chǎn)物的MALDI-TOF質(zhì)譜。光譜中所示出的單一產(chǎn)物指示dG4P-PEG24和dG4P-PEG37以接近100％的效率并入。圖21.在+40mV外加電勢(shì)下在含有49、37、24或16個(gè)環(huán)氧乙烷單體的PEG存在下α-溶血素納米孔的相對(duì)阻隔深度分布。所述四種物質(zhì)容易被鑒別。圖22.(A)混合的聚(乙二醇)(PEG)單元通過(guò)單個(gè)納米孔的分離和質(zhì)量分布；和(B)在基線分離的情況下選擇4種獨(dú)特的PEG單元作為用于4種堿基A、C、G和T的標(biāo)簽。還示出了線性和分支PEG的結(jié)構(gòu)。圖23.帶電荷的PEG-三磷酸酯的合成(電荷可以按要求作調(diào)整)。圖24.磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-三磷酸酯的合成。圖25.磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-四磷酸酯的合成。圖26.末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-五磷酸酯的合成。圖27.集成CMOS的納米孔測(cè)量平臺(tái)：(A)八通道CMOS前置放大器芯片的顯微圖與具有集成的順式側(cè)電極的一個(gè)放大器通道的圖像；(B)示出具有固態(tài)納米孔的雙芯片集成的圖；(C)示出在單芯片實(shí)施中芯片的橫截面以及納米孔如何直接蝕刻到芯片中的圖；包裝在順式側(cè)上的獨(dú)立阱的情況下發(fā)生；以及3.5nm直徑的納米孔的TEM圖像。圖28.集成CMOS的納米孔電子器件的電氣性能(A)針對(duì)CF＝0.15pF、1MHz4極貝塞耳濾波器(Besselfilter)、fs＝4MS/s的輸入?yún)⒖蓟€電流噪聲譜。還示出了在β＝1，100kHz4極貝塞耳濾波器，fs＝250kS/s的情況下全細(xì)胞模式中Axopatch200B的測(cè)量的開(kāi)放頭場(chǎng)。(B)由Axopatch200B測(cè)量的與相同納米孔相比的連接有納米孔的新放大器的噪底。圖29.納米孔附近的聚合酶的栓系。阱有助于限制擴(kuò)散。L表示因擴(kuò)散和電泳所引起的分子運(yùn)動(dòng)同等的情況下距孔開(kāi)口的臨界距離。圖30.標(biāo)簽標(biāo)記的核苷-5′-多磷酸酯的合成。圖31.3′-O-阻隔的PEG-核苷酸的合成。圖32.使用PEG-核苷酸和納米孔檢測(cè)進(jìn)行邊合成邊測(cè)序(相同DNA分子的許多拷貝被固定在珠粒上并且一次加入一個(gè)PEG-核苷酸)。使用相同PEG連接到所有四種核苷酸上。一次加入一個(gè)PEG-核苷酸，如果并入正確的核苷酸的話，那么每個(gè)循環(huán)讀取至少一個(gè)堿基。圖33.使用3′-O-阻隔的PEG-核苷酸和納米孔檢測(cè)進(jìn)行邊合成邊測(cè)序(相同DNA分子的許多拷貝被固定在珠粒上并且加入所有四種3′-O-阻隔的PEG-核苷酸)。一起加入 所有四種3′-阻隔的不同大小的PEG連接的核苷酸(3′-阻隔的dNTP-PEG)?；卺尫诺腜EG的阻隔信號(hào)檢測(cè)并入的核苷酸。通過(guò)TECP處理去除3′-阻隔基團(tuán)，并且繼續(xù)循環(huán)以正確測(cè)序包括均聚區(qū)的模板。圖34.進(jìn)行生化過(guò)程的微米阱的大規(guī)模平行方式高密度陣列的示意圖。每個(gè)阱可以容納不同DNA模板和納米孔裝置。具體實(shí)施方式一種測(cè)定單鏈DNA的核苷酸序列的方法，其包含：(a)使所述單鏈DNA，其中所述單鏈DNA在電解質(zhì)溶液中與膜中的納米孔接觸并且其中所述單鏈DNA具有與其一部分雜交的引物，與DNA聚合酶和至少四種多磷酸脫氧核糖核苷酸(dNPP)類似物在允許所述DNA聚合酶催化所述dNPP類似物中的一者在其與所述單鏈DNA的核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)并入所述引物中的條件下接觸，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述引物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，由此形成DNA延伸產(chǎn)物，其中所述四種dNPP類似物中的每一者具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶或其中每一者的衍生物，其中R1為OH，其中R2為H，其中X為O、NH、S或CH2，其中n為1、2、3或4，其中Z為O、S或BH3，并且其限制條件為(i)每種dNPP類似物上的堿基類型與其它三種dNPP類似物中的每一者上的堿基類型不同，并且(ii)每種dNPP類似物的n值與其它三種dNPP類似物中的每一者的n值不同，或者所述四種dNPP類似物中的每一者的n值是相同的并且每種dNPP類似物上的標(biāo)簽類型與其它三種dNPP類似物中的每一者上的標(biāo)簽類型不同，其中所述dNPP類似物的并入促成具有與其連接的所述標(biāo)簽的多磷酸酯的釋放；以及(b)通過(guò)以下方式測(cè)定在步驟(a)中何種dNPP類似物已并入所述引物中從而形成DNA延伸產(chǎn)物：將電壓施加到所述膜的兩端，并且測(cè)量在所述納米孔的兩端由步驟(a)中產(chǎn)生的具有與其連接的所述標(biāo)簽的所述多磷酸酯通過(guò)所述納米孔易位而引起的電子 變化，其中所述電子變化視情況而定對(duì)于n的每個(gè)值或?qū)τ跇?biāo)簽的每種不同類型是不同的，從而鑒別所述單鏈DNA中與所述并入的dNPP類似物互補(bǔ)的所述核苷酸殘基；以及(c)針對(duì)所測(cè)序的所述單鏈DNA的每個(gè)核苷酸殘基反復(fù)地進(jìn)行步驟(a)和(b)，其中在步驟(a)的每次反復(fù)操作中，所述dNPP類似物在其與所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)被并入由步驟(a)的先前反復(fù)操作而產(chǎn)生的所述DNA延伸產(chǎn)物中，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述DNA延伸產(chǎn)物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，從而測(cè)定所述單鏈DNA的所述核苷酸序列。一種測(cè)定單鏈DNA的核苷酸序列的方法，其包含：(a)使所述單鏈DNA，其中所述單鏈DNA在電解質(zhì)溶液中與膜中的納米孔接觸并且其中所述單鏈DNA具有與其一部分雜交的引物，與DNA聚合酶和多磷酸脫氧核糖核苷酸(dNPP)類似物在允許所述DNA聚合酶催化所述dNPP類似物在其與所述單鏈DNA的核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)并入所述引物中的條件下接觸，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述引物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，由此形成DNA延伸產(chǎn)物，其中所述dNPP類似物具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶或其中每一者的衍生物，其中R1為-OH、-O-CH2N3或-O-2-硝基苯甲基，其中R2為H，其中X為O、NH、S或CH2，其中n為1、2、3或4，其中Z為O、S或BH3，并且其中如果所述dNPP類似物沒(méi)有被并入的話，那么反復(fù)地重復(fù)與不同dNPP類似物的所述接觸直到dNPP類似物被并入為止，其限制條件為(1)每種dNPP類似物上的堿基類型與其它dNPP類似物中的每一者上的堿基類型不同，并且(2)每種dNPP類似物的n值與其它三種dNPP類似物中的每一者的n值不同，或者所述四種dNPP類似物中的每一者的n值是相同的并且每種dNPP類似物上的標(biāo)簽類型與其它三種dNPP類似物中的每一者上的標(biāo)簽類型不同，其中dNPP類似物的并入促成具有與其連接的所述標(biāo)簽的多磷酸酯的釋放；(b)通過(guò)以下方式測(cè)定在步驟(a)中何種dNPP類似物已并入所述引物中從而形成DNA延伸產(chǎn)物：將電壓施加到所述膜的兩端，并且測(cè)量在所述納米孔的兩端由步驟(a)中產(chǎn)生的具有與其連接的所述標(biāo)簽的所述多磷酸酯通過(guò)所述納米孔易位而引起的電子變化，其中所述電子變化視情況而定對(duì)于n的每個(gè)值或?qū)τ跇?biāo)簽的每種不同類型是不同的，從而鑒別所述單鏈DNA中與所述并入的dNPP類似物互補(bǔ)的所述核苷酸殘基；(c)針對(duì)所測(cè)序的所述單鏈DNA的每個(gè)核苷酸殘基反復(fù)地進(jìn)行步驟(a)和(b)，其中在步驟(a)的每次反復(fù)操作中，所述dNPP類似物在其與所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)被并入由步驟(a)的先前反復(fù)操作而產(chǎn)生的所述DNA延伸產(chǎn)物中，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述DNA延伸產(chǎn)物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，從而測(cè)定所述單鏈DNA的所述核苷酸序列。一種測(cè)定單鏈DNA的核苷酸序列的方法，其包含：(a)使所述單鏈DNA，其中所述單鏈DNA在電解質(zhì)溶液中與膜中的納米孔接觸并且其中所述單鏈DNA具有與其一部分雜交的引物，與DNA聚合酶和至少四種多磷酸脫氧核糖核苷酸(dNPP)類似物在允許所述DNA聚合酶催化所述dNPP類似物中的一者在其與所述單鏈DNA的核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)并入所述引物中的條件下接觸，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述引物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，由此形成DNA延伸產(chǎn)物，其中所述四種dNPP類似物中的每一者具有選自以下的結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶或其中每一者的衍生物，其中Y為標(biāo)簽，其中R1在存在時(shí)為OH，其中R2在存在時(shí)為H，其中X為可裂解的連接基團(tuán)，其中Z為O、S或BH3，其中n為1、2、3或4，其中A為O、S、CH2、CHF、CFF或NH，并且其限制條件為(i)每種dNPP類似物上的堿基類型與其它三種dNPP類似物中的每一者上的堿基類型不同，并且(ii)每種dNPP類似物上的標(biāo)簽類型與其它三種dNPP類似物中的每一者上的標(biāo)簽類型不同；(b)使來(lái)自在步驟(a)中并入的所述dNPP類似物的所述標(biāo)簽裂解；以及(c)通過(guò)以下方式測(cè)定在步驟(a)中何種dNPP類似物被并入：將電壓施加到所述膜的兩端，并且測(cè)量在所述納米孔的兩端由步驟(b)中裂解掉的標(biāo)簽通過(guò)所述納米孔易位而引起的電子變化，其中所述電子變化對(duì)于標(biāo)簽的每種不同類型是不同的，從而鑒別所述單鏈DNA中與所述并入的dNPP類似物互補(bǔ)的所述核苷酸殘基；以及(d)針對(duì)所測(cè)序的所述單鏈DNA的每個(gè)核苷酸殘基反復(fù)地進(jìn)行步驟(a)、(b)和(c)，其中在步驟(a)的每次反復(fù)操作中，所述dNPP類似物在其與所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)被并入由步驟(a)的先前反復(fù)操作而產(chǎn)生的所述DNA延伸產(chǎn)物中，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述DNA延伸產(chǎn)物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，從而測(cè)定所述單鏈DNA的所述核苷酸序列。一種測(cè)定單鏈DNA的核苷酸序列的方法，其包含：(a)使所述單鏈DNA，其中所述單鏈DNA在電解質(zhì)溶液中與膜中的納米孔接觸，其中所述單鏈DNA具有與其一部分雜交的引物，與DNA聚合酶和多磷酸脫氧核糖核苷酸(dNPP)類似物在允許所述DNA聚合酶催化所述dNPP類似物在其與所述單鏈DNA的核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)并入所述引物中的條件下接觸，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述引物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，由此形成DNA延伸產(chǎn)物，其中所述dNPP類似物具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶或其中每一者的衍生物，其中Y為標(biāo)簽，并且其中R1在存在時(shí)為OH、-OCH2N3或-O-2-硝基苯甲基，R2在存在時(shí)為H，其中X為可裂解的連接基團(tuán)，其中Z為O、S或BH3，其中n為1、2、3或4，其中A為O、S、CH2、CHF、CFF或NH，并且如果所述dNPP類似物沒(méi)有被并入的話，那么反復(fù)地重復(fù)與不同dNPP類似物 的所述接觸直到dNPP類似物被并入為止，其限制條件為(1)每種dNPP類似物上的堿基類型與每種其它dNPP類似物上的堿基類型不同，并且(2)每種dNPP類似物上的標(biāo)簽類型與每種其它dNPP類似物上的標(biāo)簽類型不同，其中dNPP類似物的并入促成具有與其連接的所述標(biāo)簽的多磷酸酯的釋放；(b)使來(lái)自在步驟(a)中并入的所述dNPP類似物的所述標(biāo)簽裂解；以及(c)通過(guò)以下方式測(cè)定在步驟(a)中何種dNPP類似物被并入從而形成DNA延伸產(chǎn)物：將電壓施加到所述膜的兩端，并且測(cè)量在所述納米孔的兩端由步驟(b)中裂解掉的所述標(biāo)簽通過(guò)所述納米孔易位而引起的電子變化，其中所述電子變化對(duì)于標(biāo)簽的每種類型是不同的，從而鑒別所述單鏈DNA中與所述并入的dNPP類似物互補(bǔ)的所述核苷酸殘基；(d)針對(duì)所測(cè)序的所述單鏈DNA的每個(gè)核苷酸殘基反復(fù)地進(jìn)行步驟(a)到(c)，其中在步驟(a)的每次反復(fù)操作中，所述dNPP類似物在其與所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)被并入由步驟(a)的先前反復(fù)操作而產(chǎn)生的所述DNA延伸產(chǎn)物中，所述單鏈DNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述DNA延伸產(chǎn)物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基的5′，從而測(cè)定所述單鏈DNA的所述核苷酸序列。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)簽為乙二醇；氨基酸；碳水化合物；染料；單核苷酸；二核苷酸；三核苷酸；四核苷酸；五核苷酸或六核苷酸；熒光染料；化學(xué)發(fā)光化合物；氨基酸；肽；碳水化合物；單磷酸核苷酸；二磷酸核苷酸；未經(jīng)取代或經(jīng)一個(gè)或一個(gè)以上鹵素、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、疊氮基取代的脂肪族酸或芳香族酸或醇或硫醇。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，堿基是選自由以下組成的群組：腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮腺嘌呤或5-甲基胞嘧啶。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含在步驟(b)的每次反復(fù)操作之后的洗滌步驟以去除未并入的dNPP類似物避免與單鏈DNA接觸。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含在步驟(c)的每次反復(fù)操作之后的洗滌步驟以去除未并入的dNPP類似物避免與單鏈DNA接觸。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含其中單鏈DNA、電解質(zhì)溶液以及膜中的納米孔定位于單個(gè)容器內(nèi)。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，其中R1為-O-CH2N3，所述方法任選地進(jìn)一步包含處理并入的dNPP類似物以去除-CH2N3并且使得OH基團(tuán)連接到3′位置上，從而允許另一 種dNPP類似物的并入。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，其中R1為-O-2-硝基苯甲基，所述方法任選地進(jìn)一步包含處理并入的核苷酸類似物以去除-2-硝基苯甲基并且使得OH基團(tuán)連接到3′位置上，從而允許另一種dNPP類似物的并入。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，dNPP類似物具有以下結(jié)構(gòu)：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中Z為O、S或BH3，并且其中堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)簽為單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸或六核苷酸，并且其中所述單核苷酸、所述二核苷酸、所述三核苷酸、所述四核苷酸、所述五核苷酸或所述六核苷酸的堿基是與dNPP類似物的堿基相同類型的堿基。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)簽選自以下：其中在每個(gè)結(jié)構(gòu)中，n獨(dú)立地為1、2、3或4，并且m獨(dú)立地為0到100的整數(shù)，并且其中當(dāng)m為0時(shí)，dNPP的末端磷酸酯直接鍵結(jié)到所述結(jié)構(gòu)的左手邊所示的核苷的3′O原子上，并且其中n值對(duì)于每種類型的堿基是不同的。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，m為0到50的整數(shù)。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，m為0到10的整數(shù)。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，所述dNPP類似物具有以下結(jié)構(gòu)：其中R為經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烴基，至多3000道爾頓，并且其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，dNPP類似物具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，dNPP類似物具有以下結(jié)構(gòu)：在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，dNPP類似物具有以下結(jié)構(gòu)：其中m為1到50的整數(shù)，并且其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，電子變化是電流幅度的變化。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，電子變化是納米孔的導(dǎo)電率的變化。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，納米孔是生物的。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，納米孔是蛋白質(zhì)的。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，納米孔包含α溶血素。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，納米孔是石墨烯。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，納米孔是固態(tài)納米孔。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，納米孔是在固態(tài)膜中。在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，單鏈DNA、引物或DNA聚合酶連接到固體表面上。在所述方法的另一個(gè)實(shí)施例中，納米孔是納米孔陣列的一部分。一種產(chǎn)生三磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述三磷酸核苷酸類似物因具有與其末端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與三磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與二環(huán)己基碳化二亞胺/二甲基甲酰胺在允許產(chǎn)生環(huán)狀三偏磷酸酯的條件下接觸；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與具有與其連接的羥基或氨基的標(biāo)簽在允許所述環(huán)狀三偏磷酸酯親核開(kāi)環(huán)的條件下接觸，由此使所述標(biāo)簽鍵結(jié)到末端磷酸酯上，從而形成所述三磷酸核苷酸類似物。一種產(chǎn)生三磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述三磷酸核苷酸類似物因具有與其末端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與三磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與二環(huán)己基碳化二亞胺/二甲基甲酰胺在允許產(chǎn)生環(huán)狀三偏磷酸酯的條件下接觸；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與親核試劑接觸，由此形成-OH或-NH2官能化的化合物；c)使步驟b)的所述產(chǎn)物與具有與其連接的-COR基團(tuán)的標(biāo)簽在允許所述標(biāo)簽間接鍵結(jié)到末端磷酸酯上的條件下反應(yīng)，從而形成所述三磷酸核苷酸類似物。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施例中，親核試劑是H2N-R-OH、H2N-R-NH2、R′S-R-OH、R′S-R-NH2或在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明方法包含在步驟b)中，使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物依次與具有結(jié)構(gòu)：的化合物和NH4OH接觸，由此形成具有以下結(jié)構(gòu)的化合物：并且使步驟b)的所述產(chǎn)物與具有與其連接的-COR基團(tuán)的標(biāo)簽在允許所述標(biāo)簽間接鍵結(jié)到末端磷酸酯上的條件下反應(yīng)，從而形成具有以下結(jié)構(gòu)的三磷酸核苷酸類似物：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶。一種產(chǎn)生四磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述四磷酸核苷酸類似物因具有與其末端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與四磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與1，1′-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允許形成以下結(jié)構(gòu)的條件下接觸：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與具有與其連接的單磷酸酯基的標(biāo)簽在允許形成所述四磷酸核苷酸類似物的條件下接觸。一種產(chǎn)生四磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述四磷酸核苷酸類似物因具有與其末端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與四磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與1，1′-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允許形成以下結(jié)構(gòu)的條件下接觸：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與磷酸在允許形成四磷酸核苷酸的條件下接觸；c)使所述四磷酸核苷酸依次與1)羰基二咪唑/二甲基甲酰胺、2)親核試劑以及3)NH4OH接觸，由此形成-OH或-NH2官能化的化合物；d)使步驟c)的所述產(chǎn)物與具有與其連接的-COR基團(tuán)的標(biāo)簽在允許所述標(biāo)簽間接鍵結(jié)到末端磷酸酯上的條件下接觸，從而形成所述四磷酸核苷酸類似物。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施例中，親核試劑是H2N-R-OH、H2N-R-NH2、R′S-R-OH、R′S-R-NH2或在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明方法包含在步驟b)中，使四磷酸核苷酸依次與1)羰基二咪唑/二甲基甲酰胺；2)具有結(jié)構(gòu)：的化合物以及3)NH4OH接觸，由此形成具有以下結(jié)構(gòu)的化合物：并且使步驟b)的所述產(chǎn)物與具有與其連接的-COR基團(tuán)的標(biāo)簽在允許所述標(biāo)簽間接鍵結(jié)到末端磷酸酯上的條件下接觸，從而形成具有以下結(jié)構(gòu)的三磷酸核苷酸類似物：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶。一種產(chǎn)生四磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述四磷酸核苷酸類似物因具有與其末 端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與四磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與1，1′-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允許形成以下結(jié)構(gòu)的條件下接觸：b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與磷酸在允許形成四磷酸核苷酸的條件下接觸；c)使所述四磷酸核苷酸與羰基二咪唑/二甲基甲酰胺和具有與其連接的羥基或氨基的標(biāo)簽接觸，由此形成具有以下結(jié)構(gòu)的化合物：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶。一種產(chǎn)生五磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述五磷酸核苷酸類似物因具有與其末端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與五磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與1，1′-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允許形成以下結(jié)構(gòu)的條件下接觸：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與具有與其連接的焦磷酸酯基的標(biāo)簽在允許形成所述五磷酸核苷酸類似物的條件下接觸。一種產(chǎn)生五磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述五磷酸核苷酸類似物因具有與其末 端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與五磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與1，1′-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允許形成以下結(jié)構(gòu)的條件下接觸：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與焦磷酸酯基在允許形成五磷酸核苷酸的條件下接觸；c)使所述五磷酸核苷酸與羰基二咪唑/二甲基甲酰胺和具有與其連接的羥基或氨基的標(biāo)簽接觸，由此形成所述五磷酸核苷酸類似物。一種產(chǎn)生六磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述六磷酸核苷酸類似物因具有與其末端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與六磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與1，1′-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允許形成以下結(jié)構(gòu)的條件下接觸：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與具有與其連接的三磷酸酯基的標(biāo)簽在允許形成所述六磷酸核苷酸類似物的條件下接觸。一種產(chǎn)生六磷酸核苷酸類似物的方法，其中所述六磷酸核苷酸類似物因具有與其末端磷酸酯連接的標(biāo)簽而與六磷酸核苷酸不同，所述方法包含：a)使三磷酸核苷酸與1，1′-羰基二咪唑/二甲基甲酰胺在允許形成以下結(jié)構(gòu)的條件下接觸：其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶；b)使由步驟a)產(chǎn)生的所述產(chǎn)物與三磷酸酯基在允許形成六磷酸核苷酸的條件下接觸；c)使所述六磷酸核苷酸與羰基二咪唑/二甲基甲酰胺和具有與其連接的羥基或氨基的標(biāo)簽接觸，由此形成所述六磷酸核苷酸類似物。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述標(biāo)簽為乙二醇、氨基酸、碳水化合物、染料、單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸或六核苷酸，其中R1為OH，其中R2為H或OH，其中X為O、NH、S或CH2，其中Z為O、S或BH3，其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶，并且其中n為1、2、3或4。在一個(gè)實(shí)施例中，R2為H。在一個(gè)實(shí)施例中，R2為OH。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中在每個(gè)結(jié)構(gòu)中，n獨(dú)立地為1、2、3或4，并且m獨(dú)立地為0到100的整數(shù)，并且其中當(dāng)m為0時(shí)，dNTP的末端磷酸酯直接鍵結(jié)到所述結(jié)構(gòu)的左手邊所示的核苷的3′O原子上，其中R1為-OH或-O-CH2N3，并且R2為H或OH。在一個(gè)實(shí)施例中，m為0到50。在一個(gè)實(shí)施例中，m為0到10。在一個(gè)實(shí)施例中，R1為-OH。在一個(gè)實(shí)施例中，R2為-H。在一個(gè)實(shí)施例中，R2為-OH。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中m為0到100的整數(shù)，并且其中所述化合物包含單一類型的堿基，并且其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶或其中每一者的衍生物。在一個(gè)實(shí)施例中，m為0到50。在一個(gè)實(shí)施例中，m為0到10。在一個(gè)實(shí)施例中，所述化合物具有以下結(jié)構(gòu)：其中m為0到100的整數(shù)。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶，并且R為經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烴基，至多3000道爾頓。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶，并且m為1到50的整數(shù)。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中n為1或2，并且所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶。一種化合物，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中R1為-OH或-O-CH2N3，并且R2為H或OH。一種測(cè)定單鏈RNA的核苷酸序列的方法，其包含：(a)使所述單鏈RNA，其中所述單鏈RNA在電解質(zhì)溶液中與膜中的納米孔接觸，其中所述單鏈RNA具有與其一部分雜交的引物，與RNA聚合酶和至少四種多磷酸核糖核苷酸(rNPP)類似物在允許所述RNA聚合酶催化所述rNPP類似物中的一者在其與所述單鏈RNA的核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)并入所述引物中的條件下接觸，所述單鏈RNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述引物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈RNA的核苷酸殘基的5′，由此形成RNA延伸產(chǎn)物，其中所述四種rNPP類似物中的每一者具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶或其中每一者的衍生物，其中R1為OH，其中R2為OH，其中X為O、NH、S或CH2，其中n為1、2、3或4，其中Z為O、S或BH3，并且其限制條件為(i)每種rNPP類似物上的堿基類型 與其它三種rNPP類似物中的每一者上的堿基類型不同，并且(ii)每種rNPP類似物的n值與其它三種rNPP類似物中的每一者的n值不同，或者所述四種rNPP類似物中的每一者的n值是相同的并且每種rNPP類似物上的標(biāo)簽類型與其它三種rNPP類似物中的每一者上的標(biāo)簽類型不同，其中所述rNPP類似物的并入促成具有與其連接的所述標(biāo)簽的多磷酸酯的釋放；以及(b)通過(guò)以下方式測(cè)定在步驟(a)中何種rNPP類似物已并入所述引物中從而形成RNA延伸產(chǎn)物：將電壓施加到所述膜的兩端，并且測(cè)量在所述納米孔的兩端由步驟(a)中產(chǎn)生的具有與其連接的所述標(biāo)簽的所述多磷酸酯通過(guò)所述納米孔易位而引起的電子變化，其中所述電子變化視情況而定對(duì)于n的每個(gè)值或?qū)τ跇?biāo)簽的每種不同類型是不同的，從而鑒別所述單鏈RNA中與所述并入的rNPP類似物互補(bǔ)的所述核苷酸殘基；以及(c)針對(duì)所測(cè)序的所述單鏈RNA的每個(gè)核苷酸殘基反復(fù)地進(jìn)行步驟(a)和(b)，其中在步驟(a)的每次反復(fù)操作中，所述rNPP類似物在其與所述單鏈RNA的所述核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)被并入由步驟(a)的先前反復(fù)操作而產(chǎn)生的所述RNA延伸產(chǎn)物中，所述單鏈RNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述RNA延伸產(chǎn)物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈RNA的核苷酸殘基的5′，從而測(cè)定所述單鏈RNA的所述核苷酸序列。一種測(cè)定單鏈RNA的核苷酸序列的方法，其包含：(a)使所述單鏈RNA，其中所述單鏈RNA在電解質(zhì)溶液中與膜中的納米孔接觸并且其中所述單鏈RNA具有與其一部分雜交的引物，與RNA聚合酶和多磷酸核糖核苷酸(rNPP)類似物在允許所述RNA聚合酶催化所述rNPP類似物在其與所述單鏈RNA的核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)并入所述引物中的條件下接觸，所述單鏈RNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述引物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈RNA的核苷酸殘基的5′，由此形成RNA延伸產(chǎn)物，其中所述rNPP類似物具有以下結(jié)構(gòu)：其中所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶，其中R1為-OH、-O-CH2N3或-O-2-硝基苯甲基，其中R2為-OH，其中X為O、NH、S或CH2，其中n為 1、2、3或4，其中Z為O、S或BH3，并且其中如果所述rNPP類似物沒(méi)有被并入的話，那么反復(fù)地重復(fù)與不同rNPP類似物的所述接觸直到rNPP類似物被并入為止，其限制條件為(1)每種rNPP類似物上的堿基類型與其它rNPP類似物中的每一者上的堿基類型不同，并且(2)每種rNPP類似物的n值與其它三種rNPP類似物中的每一者的n值不同，或者所述四種rNPP類似物中的每一者的n值是相同的并且每種rNPP類似物上的標(biāo)簽類型與其它三種rNPP類似物中的每一者上的標(biāo)簽類型不同，其中rNPP類似物的并入促成具有與其連接的所述標(biāo)簽的多磷酸酯的釋放；(b)通過(guò)以下方式測(cè)定在步驟(a)中何種rNPP類似物已并入所述引物中從而形成RNA延伸產(chǎn)物：將電壓施加到所述膜的兩端，并且測(cè)量在所述納米孔的兩端由步驟(a)中產(chǎn)生的具有與其連接的所述標(biāo)簽的所述多磷酸酯通過(guò)所述納米孔易位而引起的電子變化，其中所述電子變化視情況而定對(duì)于n的每個(gè)值是不同的或?qū)τ跇?biāo)簽的每種類型是不同的，從而鑒別所述單鏈RNA中與所述并入的rNPP類似物互補(bǔ)的所述核苷酸殘基；(c)針對(duì)所測(cè)序的所述單鏈RNA的每個(gè)核苷酸殘基反復(fù)地進(jìn)行步驟(a)和(b)，其中在步驟(a)的每次反復(fù)操作中，所述rNPP類似物在其與所述單鏈RNA的所述核苷酸殘基互補(bǔ)時(shí)被并入由步驟(a)的先前反復(fù)操作而產(chǎn)生的所述RNA延伸產(chǎn)物中，所述單鏈RNA的所述核苷酸殘基緊鄰與所述RNA延伸產(chǎn)物的3′末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈RNA的核苷酸殘基的5′，從而測(cè)定所述單鏈RNA的所述核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施例中，dNPP類似物具有以下結(jié)構(gòu)：其中n為1或2，并且所述堿基為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、7-脫氮嘌呤或5-甲基嘧啶。在一個(gè)實(shí)施例中，生物納米孔與CMOS電子器件集成。在另一個(gè)實(shí)施例中，固態(tài)納米孔與CMOS電子器件集成。在一個(gè)實(shí)施例中，與固體表面的連接是通過(guò)生物素-抗生蛋白鏈菌素鍵聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施例中，DNA聚合酶通過(guò)用經(jīng)氨基官能化的烷硫醇自組裝單層修飾的金表面連接到固 體表面上，其中所述氨基被修飾成NHS酯以用于連接到DNA聚合酶上的氨基上。在一個(gè)實(shí)施例中，dNPP類似物是末端磷酸酯加標(biāo)簽的多磷酸核苷。在另一個(gè)實(shí)施例中，每種類型的dNPP類似物具有聚乙二醇標(biāo)簽，所述聚乙二醇標(biāo)簽與其它三種類型的dNPP類似物中的每一者的聚乙二醇標(biāo)簽的大小不同。在一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)簽具有如下結(jié)構(gòu)：其中W為0與100之間的整數(shù)。在另一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)簽具有如下結(jié)構(gòu)：其中R為NH2、OH、COOH、CHO、SH或N3，并且W為0到100的整數(shù)。一種組合物，其包含至少四種多磷酸脫氧核苷酸(dNPP)類似物，所述類似物各自具有選自根據(jù)權(quán)利要求74和75所述的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)，其中所述四種dNPP類似物中的每一者包含與其它三種dNPP類似物的堿基類型不同的堿基類型。在一個(gè)實(shí)施例中，四種dNPP類似物中的每一者具有聚乙二醇標(biāo)簽，所述聚乙二醇標(biāo)簽與其它三種dNPP類似物中的每一者的聚乙二醇標(biāo)簽的大小不同。在一個(gè)實(shí)施例中，加標(biāo)簽的多磷酸核苷上的凈電荷為中性的。在另一個(gè)實(shí)施例中，釋放的標(biāo)簽具有正電荷。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包含在步驟b)之后用堿性磷酸酶處理的步驟，其中所述堿性磷酸酶使釋放的標(biāo)簽-焦磷酸酯上的游離磷酸酯基水解。在一個(gè)實(shí)施例中，單鏈DNA的多個(gè)拷貝被固定在珠粒上。腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶的“衍生物”包括7-脫氮-嘌呤和5-甲基嘧啶。實(shí)例包括7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮-鳥(niǎo)嘌呤和5-甲基-胞嘧啶。本發(fā)明還提供了一種化合物，其具有本申請(qǐng)案的圖式和/或流程中所闡述的任何化合物的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還提供了一種dNPP類似物，其包含具有本申請(qǐng)案的圖式和/或流程中所闡述 的任何標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)的標(biāo)簽。在一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)簽為經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烴基，如烷基、烯基、炔基，并且具有3000道爾頓或更小的質(zhì)量。如本文所用，“烷基”包括支鏈和直鏈飽和脂肪族烴基，其具有指定數(shù)目的碳原子并且可以未經(jīng)取代或經(jīng)取代。因此，如“C1-Cn烷基”中的C1-Cn被定義為包括在直鏈或支鏈排列中具有1、2、......、n-1或n個(gè)碳的基團(tuán)。舉例來(lái)說(shuō)，“C1-C5烷基”被定義為包括在直鏈或支鏈排列中具有1、2、3、4或5個(gè)碳的基團(tuán)，并且具體地包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基和戊基。如本文所用，“烯基”是指直鏈或支鏈非芳香族烴基，其含有至少1個(gè)碳-碳雙鍵并且可以存在至多最大可能數(shù)目的非芳香族碳-碳雙鍵，并且可以是未經(jīng)取代或經(jīng)取代的。舉例來(lái)說(shuō)，“C2-C5”烯基意指具有2、3、4或5個(gè)碳原子并且分別具有至多1、2、3或4個(gè)碳-碳雙鍵的烯基。烯基包括乙烯基、丙烯基和丁烯基。術(shù)語(yǔ)“炔基”是指直鏈或支鏈烴基，其含有至少1個(gè)碳-碳三鍵并且可以存在至多最大可能數(shù)目的非芳香族碳-碳三鍵，并且可以是未經(jīng)取代或經(jīng)取代的。因此，“C2-C5炔基”意指具有2或3個(gè)碳原子和1個(gè)碳-碳三鍵、或具有4或5個(gè)碳原子和至多2個(gè)碳-碳三鍵的炔基。炔基包括乙炔基、丙炔基和丁炔基。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)取代”是指如上文所描述的官能團(tuán)(如烷基或烴基)，在所述官能團(tuán)中，連接其中所含氫原子的至少一個(gè)鍵經(jīng)連接非氫或非碳原子的鍵置換，其限制條件為維持正常價(jià)數(shù)并且所述取代產(chǎn)生穩(wěn)定化合物。經(jīng)取代的基團(tuán)還包括其中連接碳或氫原子的一個(gè)或一個(gè)以上鍵經(jīng)連接雜原子的一個(gè)或一個(gè)以上鍵(包括雙鍵或三鍵)置換的基團(tuán)。取代基的非限制性實(shí)例包括上文所描述的官能團(tuán)，并且例如為N，例如由此形成-CN。應(yīng)了解，本發(fā)明化合物上的取代基和取代模式可以由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員選擇，從而提供化學(xué)上穩(wěn)定并且可以通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)以及下文所闡述的那些方法從可易獲得的起始物質(zhì)容易地合成的化合物。如果取代基自身經(jīng)一個(gè)以上基團(tuán)取代的話，那么應(yīng)了解，這多個(gè)基團(tuán)可以在同一碳上或不同碳上，只要產(chǎn)生穩(wěn)定結(jié)構(gòu)即可。在選擇本發(fā)明的化合物時(shí)，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到多種取代基(即，R1、R2等)應(yīng)依照化學(xué)結(jié)構(gòu)連接性的眾所周知的原理來(lái)選擇。在本文所描述的化合物結(jié)構(gòu)中，一般未示出氫原子，核糖和脫氧核糖上的氫原子除外。然而，應(yīng)了解，足夠的氫原子存在于所顯示的碳原子上以滿足八隅規(guī)則。如本文所用并且除非另有說(shuō)明，否則以下術(shù)語(yǔ)中的每一者應(yīng)具有以下所闡述的定義。除非另有說(shuō)明，否則“核酸”應(yīng)意指任何核酸分子，包括(但不限于)DNA、RNA和其雜合體。在一個(gè)實(shí)施例中，形成核酸分子的核酸堿基可以是堿基A、C、G、T和U，以及其衍生物。這些堿基的衍生物在所屬領(lǐng)域中是眾所周知的，并且例示于PCR系統(tǒng)、試劑和消耗品(PCRSystems，ReagentsandConsumables)(珀金埃爾默目錄1996-1997(PerkinElmerCatalogue1996-1997)，美國(guó)新澤西州布蘭奇伯格的羅氏分子系統(tǒng)公司(RocheMolecularSystems，Inc.，Branchburg，NewJersey，USA))中。多磷酸核苷酸(如多磷酸脫氧核糖核苷酸(“dNPP”)或多磷酸核糖核苷酸(“rNPP”))是包含以線性方式鍵結(jié)到其5′糖碳原子上的多個(gè)(即，三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或更多個(gè))磷酸酯的核苷酸。多磷酸核苷酸類似物是如本文所定義的這類多磷酸脫氧核糖核苷酸或這類多磷酸核糖核苷酸的類似物，所述類似物因在指定位置處具有與其連接的標(biāo)簽而與所述核糖核苷酸不同。所述類似物可以通過(guò)在所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的適當(dāng)核酸聚合條件下與適當(dāng)核酸聚合酶接觸而并入引物或核酸延伸鏈(如DNA延伸鏈)中。在一個(gè)實(shí)施例中，dNPP是三磷酸脫氧核苷酸。如本文所用，四核苷酸、五核苷酸或六核苷酸分別包涵通過(guò)磷酸二酯鍵連接的4、5或6個(gè)核酸單體殘基，其中游離末端殘基可以是核苷酸或核苷。在一個(gè)實(shí)施例中，游離末端殘基是核苷并且其它殘基是核苷酸?！肮腆w襯底”應(yīng)意指核酸可以附著的以固相形式存在的任何適合的介質(zhì)。非限制性實(shí)例包括芯片、阱、珠粒、納米孔結(jié)構(gòu)和柱。在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，固體襯底可以存在于溶液(包括電解質(zhì)水溶液)中?！半s交”應(yīng)意指基于充分了解的序列互補(bǔ)原理，一個(gè)單鏈核酸粘結(jié)到另一個(gè)核酸(如引物)上。在一個(gè)實(shí)施例中，另一個(gè)核酸是單鏈核酸。核酸之間雜交的傾向視其環(huán) 境的溫度和離子強(qiáng)度、核酸的長(zhǎng)度以及互補(bǔ)程度而定。這些參數(shù)對(duì)雜交的影響在所屬領(lǐng)域中是眾所周知的(參見(jiàn)薩姆布魯克J(SambrookJ)，弗里奇EF(FritschEF)，馬尼亞提斯T(ManiatisT).1989.分子克?。簩?shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecularcloning：alaboratorymanual).紐約的冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork))。如本文所用，引物序列或DNA延伸產(chǎn)物與另一個(gè)核酸的雜交應(yīng)意指粘結(jié)充分以使得所述引物或DNA延伸產(chǎn)物分別可以通過(guò)與能夠與其形成磷酸二酯鍵的可獲得的核苷酸或核苷酸類似物產(chǎn)生磷酸二酯鍵來(lái)延伸。如本文所用，除非另有說(shuō)明，否則“不同于”另一個(gè)堿基或所述堿基清單的堿基應(yīng)意指具有與其它堿基不同的結(jié)構(gòu)的堿基。舉例來(lái)說(shuō)，“不同于”腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的堿基將包括鳥(niǎo)嘌呤堿基或尿嘧啶堿基。如本文所用的“引物”(引物序列)是具有適當(dāng)長(zhǎng)度(例如約18到24個(gè)堿基)的短的通常以化學(xué)方式合成的寡核苷酸，其足以與標(biāo)靶DNA(例如單鏈DNA)雜交并且允許在所屬領(lǐng)域中眾所周知的適合條件下向其中加入核苷酸殘基或由其合成寡核苷酸或聚核苷酸。在一個(gè)實(shí)施例中，引物是DNA引物，即由脫氧核糖核苷酸殘基組成或主要由脫氧核糖核苷酸殘基組成的引物。引物被設(shè)計(jì)成具有作為與所述引物雜交的模板/標(biāo)靶DNA的區(qū)域的反向互補(bǔ)序列的序列。核苷酸殘基通過(guò)形成磷酸二酯鍵而加入到引物的3′末端產(chǎn)生了DNA延伸產(chǎn)物。核苷酸殘基通過(guò)形成磷酸二酯鍵而加入到DNA延伸產(chǎn)物的3′末端產(chǎn)生了另一種DNA延伸產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施例中，單鏈DNA、RNA、引物或探針通過(guò)1，3-偶極疊氮化物-炔烴環(huán)加成化學(xué)過(guò)程結(jié)合到固體襯底上。在一個(gè)實(shí)施例中，DNA、RNA、引物或探針通過(guò)聚乙二醇分子結(jié)合到固體襯底上。在一個(gè)實(shí)施例中，DNA、RNA、引物或探針是炔烴標(biāo)記的。在一個(gè)實(shí)施例中，DNA、RNA、引物或探針通過(guò)聚乙二醇分子結(jié)合到固體襯底上，并且固體襯底是經(jīng)疊氮化物官能化的。在一個(gè)實(shí)施例中，DNA、RNA、引物或探針通過(guò)疊氮基鍵聯(lián)、炔基鍵聯(lián)或生物素-抗生蛋白鏈菌素相互作用固定在固體襯底上。核酸的固定描述于芯片上DNA的固定II(ImmobilizationofDNAonChipsII)，克里斯廷威特曼(ChristineWittmann)編(2005)，柏林的施普林格出版社(SpringerVerlag，Berlin)中，其特此以引用的方式并入。在一個(gè)實(shí)施例中，DNA是單鏈DNA。在一個(gè)實(shí)施例中，RNA是單鏈RNA。在一個(gè)實(shí)施例中，固體襯底呈以下形式：芯片、珠粒、阱、毛細(xì)管、載玻片、晶片、過(guò)濾器、纖維、多孔介質(zhì)、多孔納米管、或柱。本發(fā)明還提供了本發(fā)明方法，其中固體襯底是金屬、金、銀、石英、二氧化硅、塑料、聚丙烯、玻璃或鉆石。本發(fā)明還提供了 本發(fā)明方法，其中固體襯底是連接或浸漬金屬或金屬組合的多孔非金屬物質(zhì)。固體表面可以呈不同形式，非限制性實(shí)例包括芯片、珠粒、管、基質(zhì)、納米管。固體表面可以由DNA微陣列的常用材料制成，非限制性實(shí)例包括玻璃或尼龍(nylon)。固體表面(例如珠粒/微型珠粒)又可以固定到另一個(gè)固體表面(如芯片)上。在一個(gè)實(shí)施例中，核酸樣品、DNA、RNA、引物或探針被隔離在分立的區(qū)室、阱或表面上的凹陷處或容器中。本發(fā)明還提供了本發(fā)明方法，其中核酸樣品、DNA、RNA、引物或探針的約1000個(gè)或更少的拷貝結(jié)合到固體表面上。本發(fā)明還提供了如下本發(fā)明，其中核酸樣品、DNA、RNA、引物或探針的2×107、1×107、1×106或1×104個(gè)或更少的拷貝結(jié)合到固體表面上。在一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)固定的核酸樣品、DNA、RNA、引物或探針以高密度固定。本發(fā)明還提供了如下本發(fā)明，其中核酸樣品、DNA、RNA、引物或探針的超過(guò)或至多1×107、1×108、1×109個(gè)拷貝結(jié)合到固體襯底上。在一個(gè)實(shí)施例中，DNA聚合酶是9°N聚合酶或其變異體、大腸桿菌(E.Coli)DNA聚合酶I、噬菌體T4DNA聚合酶、測(cè)序酶(Sequenase)、TaqDNA聚合酶或9°N聚合酶(沒(méi)有外切酶活性(exo-))A485L/Y409V。在本文所描述的方法或組合物的一個(gè)實(shí)施例中，DNA是單鏈。在本文所描述的方法或組合物的一個(gè)實(shí)施例中，RNA是單鏈、Phi29或其變異體。在針對(duì)RNA測(cè)序所描述的方法的一個(gè)實(shí)施例中，聚合酶是RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶或如所屬領(lǐng)域中已知的用于RNA聚合的適當(dāng)聚合酶。連接基團(tuán)可以是光可裂解的。在一個(gè)實(shí)施例中，UV光用于以光化學(xué)方式裂解光化學(xué)可裂解的連接基團(tuán)和部分。在一個(gè)實(shí)施例中，光可裂解的連接基團(tuán)是2-硝基苯甲基部分。-CH2N3基團(tuán)可以用TCEP(三(2-羧基乙基)膦)處理，以將其從dNPP類似物或rNPP類似物的3′O原子中去除，從而產(chǎn)生3′OH基團(tuán)。產(chǎn)生可裂解加帽和/或可裂解連接的核苷酸類似物的方法公開(kāi)于美國(guó)專利第6,664,079號(hào)中，其特此以引用的方式并入?！昂塑账釟埢笔翘幱谄洳⑷刖酆塑账嶂胁⑶覐亩兂删酆塑账岬膯误w之后存在的狀態(tài)的單一核苷酸。因此，核苷酸殘基是聚核苷酸(例如DNA)的核苷酸單體，其通過(guò)在其糖的3′位置處的磷酸二酯鍵結(jié)合到所述聚核苷酸的鄰近核苷酸單體上，并且通過(guò)其磷酸酯基結(jié)合到第二鄰近核苷酸單體上，其中例外的是(i)3′末端核苷酸殘基通過(guò)來(lái)自其磷酸酯基的磷酸二酯鍵僅結(jié)合到所述聚核苷酸的一個(gè)鄰近核苷酸單體上，和(ii) 5′末端核苷酸殘基通過(guò)來(lái)自其糖的3′位置的磷酸二酯鍵僅結(jié)合到所述聚核苷酸的一個(gè)鄰近核苷酸單體上。由于充分了解堿基配對(duì)規(guī)則，通過(guò)測(cè)量標(biāo)簽通過(guò)納米孔易位的獨(dú)特的電信號(hào)來(lái)測(cè)定并入引物或DNA延伸產(chǎn)物(或RNA延伸產(chǎn)物)中的dNPP類似物(或rNPP類似物)的(堿基的)身份，并且從而測(cè)定并入的dNPP類似物(或rNPP類似物)的身份，這允許鑒別引物或DNA延伸產(chǎn)物(或RNA延伸產(chǎn)物)所雜交的單鏈聚核苷酸中的互補(bǔ)核苷酸殘基。因此，如果所并入的dNPP類似物包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤的話，那么單鏈DNA中的互補(bǔ)核苷酸殘基被分別鑒別為胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤或胞嘧啶。嘌呤腺嘌呤(A)與嘧啶胸腺嘧啶(T)配對(duì)。嘧啶胞嘧啶(C)與嘌呤鳥(niǎo)嘌呤(G)配對(duì)。類似地，關(guān)于RNA，如果所并入的rNPP類似物包含腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤的話，那么單鏈RNA中的互補(bǔ)核苷酸殘基被分別鑒別為尿嘧啶、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤或胞嘧啶。dNPP或rNPP類似物并入寡核苷酸或聚核苷酸(如引物或DNA延伸鏈)中意指在聚核苷酸的3′末端核苷酸殘基的3′碳原子分別與dNPP類似物或rNPP類似物的5′碳原子之間形成磷酸二酯鍵。如本文所用，除非另有說(shuō)明，否則與參考分子(例如另一種多磷酸核苷酸類似物)的堿基類型不同的堿基(例如一種多磷酸核苷酸類似物的堿基)意指所述堿基具有與其它/參考?jí)A基不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。舉例來(lái)說(shuō)，與腺嘌呤不同的堿基將包括鳥(niǎo)嘌呤堿基、尿嘧啶堿基、胞嘧啶堿基和胸腺嘧啶堿基。舉例來(lái)說(shuō)，與腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶不同的堿基將包括鳥(niǎo)嘌呤堿基和尿嘧啶堿基。如本文所用，除非另有說(shuō)明，否則與參考分子(例如另一種多磷酸核苷酸類似物)的標(biāo)簽類型不同的標(biāo)簽(例如一種多磷酸核苷酸類似物的標(biāo)簽)意指所述標(biāo)簽具有與其它/參考標(biāo)簽的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。“納米孔”包括例如包含以下的結(jié)構(gòu)：(a)由實(shí)體障壁隔離的第一和第二區(qū)室，所述障壁具有至少一個(gè)孔，所述孔的直徑為例如約1nm到10nm，和(b)在障壁兩端施加電場(chǎng)以使帶電荷的分子(如DNA、核苷酸、核苷酸類似物或標(biāo)簽)可以通過(guò)所述孔從第一區(qū)室傳到第二區(qū)室的構(gòu)件。納米孔理想地進(jìn)一步包含用于測(cè)量穿過(guò)其障壁的分子的電子信號(hào)的構(gòu)件。納米孔障壁可以是合成的或部分天然存在的。障壁可以包括例如其中具有α-溶血素、寡聚蛋白通道(如孔蛋白)以及合成肽等的脂質(zhì)雙層。障壁也可以包括具有適合大小的一個(gè)或一個(gè)以上孔洞的無(wú)機(jī)板。在本文中，納米孔障壁中的“納米孔”、“納米孔障壁”和“孔”有時(shí)等效地使用。納米孔裝置在所屬領(lǐng)域中是已知的，并且納米孔和其使用方法公開(kāi)于美國(guó)專利第7,005,264B2號(hào)、第7,846,738號(hào)、第6,617,113號(hào)、第6,746,594號(hào)、第6,673,615號(hào)、第6,627,067號(hào)、第6,464,842號(hào)、第6,362,002號(hào)、第6,267,872號(hào)、第6,015,714號(hào)、第5,795,782號(hào)以及美國(guó)公開(kāi)案第2004/0121525號(hào)、第2003/0104428號(hào)和第2003/0104428號(hào)中，其中每一者特此以全文引用的方式并入。在本文所公開(kāi)的分子和方法的一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)簽通過(guò)可分裂的化學(xué)連接基團(tuán)連接到分子的其余部分上。在一個(gè)實(shí)施例中，納米孔在固態(tài)膜中。在一個(gè)實(shí)施例中，膜是氮化硅膜。在一個(gè)實(shí)施例中，納米孔是生物孔(biopore)。在一個(gè)實(shí)施例中，孔是蛋白質(zhì)的。在一個(gè)實(shí)施例中，孔是α-溶血素孔。在一個(gè)實(shí)施例中，孔是石墨烯孔。在一個(gè)實(shí)施例中，DNA、RNA或單鏈核酸定位于納米孔所位于的膜的一側(cè)上，并且所述膜定位于導(dǎo)電的電解質(zhì)溶液中。除非上下文另外清楚地指示，否則當(dāng)提供值的范圍時(shí)，應(yīng)了解，除非上下文另外清楚地指示，否則本發(fā)明中包涵在所述范圍的上下限和所述范圍內(nèi)的任何其它所述或居中值之間的值的每個(gè)居中整數(shù)，和值的每個(gè)居中整數(shù)的每個(gè)十等分?jǐn)?shù)。這些較小范圍的上下限可以獨(dú)立地包括于較小范圍內(nèi)，并且也包涵在本發(fā)明內(nèi)，服從所述范圍內(nèi)的任何特定排除的界限。當(dāng)所述范圍包括一個(gè)或兩個(gè)界限時(shí)，排除(i)一個(gè)或(ii)兩個(gè)所包括的界限的范圍也包括在本發(fā)明中。本文所描述的各種要素的所有組合都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文所描述的各種要素的所有子組合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通過(guò)參考后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)將更好地理解本發(fā)明，但所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易了解詳細(xì)描述的特定實(shí)驗(yàn)僅說(shuō)明如更充分地描述于隨附權(quán)利要求書(shū)中的發(fā)明內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和討論本文所公開(kāi)的發(fā)明內(nèi)容涉及用于使用納米孔的DNA(或RNA，加以必要的變更)的單分子分析的經(jīng)修飾的核苷酸。可以在核苷酸的多個(gè)位置(即，末端磷酸酯、堿基和/或2′-OH或3′-OH)處進(jìn)行修飾，從而形成核苷酸類似物。在模板-引物復(fù)合物上進(jìn)行聚合酶延伸反應(yīng)之后，所釋放的連接標(biāo)簽的焦磷酸酯穿過(guò)納米孔，并且監(jiān)測(cè)所產(chǎn)生的電流阻隔以測(cè)定所加入的核苷酸堿基。如果修飾或標(biāo)簽是在堿基部分、或核苷酸的糖部分的2′-OH/3′-OH處的話，那么在通過(guò)DNA/RNA聚合酶并入之后，連接基團(tuán)-標(biāo)簽通過(guò)化學(xué)或光化學(xué)手段從堿基/糖中裂解，并且所釋放的連接基團(tuán)-標(biāo)簽穿過(guò)納米孔，從而鑒別所加入的核苷酸。設(shè)計(jì)并合成核苷-5′-多磷酸酯，所述核苷-5′-多磷酸酯攜帶不同數(shù)目的磷酸酯基作為連接基團(tuán)并且經(jīng)連接到核苷酸的末端磷酸酯上的標(biāo)簽修飾。在模板-引物延伸反應(yīng)中通過(guò)DNA/RNA聚合酶并入之后，所釋放的連接標(biāo)簽的多磷酸酯(二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯等)可以使用納米孔檢測(cè)以產(chǎn)生序列數(shù)據(jù)。任選地，所釋放的標(biāo)簽-多磷酸酯也可以用堿性磷酸酶處理以提供游離標(biāo)簽。使用對(duì)每個(gè)核苷酸堿基來(lái)說(shuō)獨(dú)特的并且具有特異性的四種不同標(biāo)簽，可以測(cè)定模板DNA或RNA的序列。提供了攜帶用于合成經(jīng)修飾的核苷酸(其為聚合酶反應(yīng)中的有效底物)的不同數(shù)目的磷酸酯基或標(biāo)簽的核苷酸。使用納米孔檢測(cè)所釋放的連接標(biāo)簽的多磷酸酯以測(cè)定用于設(shè)計(jì)和修飾核苷酸從而獲得獨(dú)特的阻隔信號(hào)的條件。還提供了攜帶連接在核苷酸堿基部分和/或糖部分的2′-OH/3′-OH處的連接基團(tuán)-標(biāo)簽的核苷酸，其用于DNA聚合酶反應(yīng)以產(chǎn)生連接基團(tuán)-標(biāo)簽標(biāo)記的單堿基DNA延伸產(chǎn)物。這些核苷酸是常用的DNA/RNA聚合酶的良好底物。連接在延伸的DNA產(chǎn)物處的連接基團(tuán)-標(biāo)簽通過(guò)化學(xué)或光化學(xué)手段裂解，從而產(chǎn)生準(zhǔn)備用于使用經(jīng)修飾的核苷酸進(jìn)行進(jìn)一步延伸的引物。所釋放的連接基團(tuán)-標(biāo)簽穿過(guò)納米孔，并且基于在大小、形狀和標(biāo)簽上的電荷方面的差異加以鑒別，從而產(chǎn)生序列數(shù)據(jù)。如本文所公開(kāi)，這些分子工具有助于在單堿基分辨率下使用納米孔的單分子測(cè)序。此處公開(kāi)了對(duì)納米孔方法的數(shù)種改進(jìn)：1)以實(shí)現(xiàn)構(gòu)成核酸分子的四種堿基(A、C、G和T)的精確和明顯的辨別；2)以增強(qiáng)并區(qū)分檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度；3)以開(kāi)發(fā)辨別和處理所產(chǎn)生的電子阻隔信號(hào)的有效方法；4)以控制核酸通過(guò)孔的易位速率，如減慢標(biāo)簽的移動(dòng)以提高堿基到堿基辨別的能力；以及5)以設(shè)計(jì)并制造新的并且更有效的合成納米孔以用于區(qū)分DNA中的四種不同核苷酸。圖2中示出了四種核苷酸的結(jié)構(gòu)。A和G是嘌呤，而C和T是嘧啶。A和G的總體分子大小極其相似，而C和T的大小相似。納米孔已展示了能夠?qū)⑧堰逝c嘧啶區(qū)分開(kāi)來(lái)[阿克松等人1999和麥勒等人2000]，而不能將個(gè)別嘌呤A與G或個(gè)別嘧啶C與T區(qū)分開(kāi)來(lái)。先前研究已展示了核苷-5′-三磷酸酯的修飾，包括引入更多磷酸酯基以產(chǎn)生四磷酸酯、五磷酸酯或六磷酸酯，將染料直接引入末端磷酸酯，或在末端磷酸酯與染料之間連接連接基團(tuán)[庫(kù)馬爾(Kumar)等人，2006和2008]。四磷酸酯和五磷酸酯是更好的DNA聚合酶底物，并且已經(jīng)開(kāi)發(fā)了染料標(biāo)記的六磷酸核苷酸[庫(kù)馬爾等人2005；蘇德(Sood)等人2005；艾德(Eid)等人2009]。本文公開(kāi)了核苷酸類似物，其被設(shè)計(jì)成通過(guò)在末端磷酸酯部分處的核苷酸修飾來(lái)增 強(qiáng)每個(gè)核苷酸的辨別。合成了核苷-5′-多磷酸酯，并且將不同標(biāo)簽(如不同長(zhǎng)度/質(zhì)量的聚(乙二醇)(PEG)、氨基酸、碳水化合物、寡核苷酸、染料或有機(jī)/無(wú)機(jī)分子)連接到末端磷酸酯基上。在聚合酶延伸反應(yīng)之后，產(chǎn)生連接標(biāo)簽的多磷酸酯部分(圖3)，并且在連接標(biāo)簽的多磷酸酯部分穿過(guò)納米孔時(shí)產(chǎn)生了對(duì)每個(gè)堿基具有特異性的不同信號(hào)。這些修飾放大了通過(guò)納米孔辨別堿基，這歸因于在四種核苷酸(A、G、C和T)之間所釋放的加標(biāo)簽的多磷酸酯單元的大小、質(zhì)量或電荷差異的增大。通過(guò)納米孔的DNA易位速率因所釋放的連接標(biāo)簽的多磷酸酯的龐大性而降低，不過(guò)通過(guò)納米孔的標(biāo)簽的易位速率不需要降低，只要標(biāo)簽可以被區(qū)分即可。因此，堿基到堿基測(cè)序所需要的準(zhǔn)確性和可靠性變得可實(shí)現(xiàn)。優(yōu)化納米孔測(cè)序中的其它分析參數(shù)，如聚核苷酸的濃度、所施加電壓的量值、溶液的溫度和pH值，以獲得最精確和可靠的結(jié)果用于DNA鏈的檢測(cè)和分析。測(cè)序的單分子方法允許獲得用于基因研究的單體型的可能性并且允許mRNA的直接測(cè)序。在用于對(duì)DNA或RNA分子的序列進(jìn)行解碼的潛在單分子方法中使用生物或合成納米孔作為個(gè)別DNA堿基的檢測(cè)器?，F(xiàn)有的邊合成邊測(cè)序(SBS)方法使用了可裂解的熒光核苷酸可逆終止子(CF-NRT)[郭(Guo)等人2010]。SBS方法是基于在聚合酶反應(yīng)期間在每個(gè)核苷酸加入之后暫停的能力，并且使用了特異性熒光團(tuán)以在4種堿基當(dāng)中加以區(qū)分。然而，用于單分子測(cè)序的SBS的主要限制是對(duì)昂貴熒光檢測(cè)器和快速成像軟件的需要。本文所公開(kāi)的方法和工藝?yán)昧薙BS的優(yōu)勢(shì)(尤其是其高精確度)與作為離子電流阻抗檢測(cè)器的納米孔的速度和靈敏性。雖然更多的研究已探究穿引DNA通過(guò)納米孔，希望在每個(gè)堿基穿過(guò)時(shí)因其對(duì)離子電流的可變影響而區(qū)分每個(gè)堿基，但這很難實(shí)現(xiàn)，都是歸因于可以促使其自身對(duì)穿過(guò)孔的離子和抗衡離子造成影響的周?chē)鷫A基的傳遞速度和影響[緹木(Timp)等人2010]。蛋白孔的管腔中的環(huán)糊精或其它環(huán)形結(jié)構(gòu)的使用有助于提供一種棘輪機(jī)構(gòu)以減緩傳送時(shí)間[阿斯捷(Astier)等人2006]，但在每個(gè)堿基通過(guò)時(shí)完全識(shí)別每個(gè)堿基以用于測(cè)序的能力仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。使用核酸外切酶以允許一次一個(gè)核苷酸橫穿孔的替代性策略已實(shí)現(xiàn)單堿基辨別[克拉克等人2009]。然而，使用這種方法，在控制核酸外切酶對(duì)不同長(zhǎng)度的DNA和核苷酸的反應(yīng)時(shí)間和所釋放的離子到達(dá)孔的速度方面仍然存在困難。聚合酶反應(yīng)自身展示了堿基并入的高持續(xù)性和穩(wěn)定速率。實(shí)際上，聚合酶反應(yīng)已用于控制DNA鏈通過(guò)納米孔的移動(dòng)以達(dá)成直接堿基辨別[本納(Benner)等人2007，科克羅夫特(Cockroft)等人2008，赫特(Hurt)等人2009]。在聚合酶反應(yīng)期間，存在 焦磷酸酯(PPi)部分的釋放。因此，如果針對(duì)四種核苷酸中的每一者將不同標(biāo)簽連接到三磷酸酯上的話，那么這些核苷酸可以在其釋放并且穿過(guò)適當(dāng)納米孔時(shí)被區(qū)分以達(dá)成DNA序列測(cè)定。這些相對(duì)較小的焦磷酸酯類似物、或具有額外帶正電荷基團(tuán)的等效分子可以極其快速地到達(dá)孔。核苷酸通過(guò)聚合酶并入的速率為約1000個(gè)核苷酸/秒，即1毫秒/堿基加入，而通過(guò)納米孔的轉(zhuǎn)運(yùn)速率為1個(gè)分子/微秒。因此，在適當(dāng)射流技術(shù)和工程化的情況下，對(duì)于使用我們的方法的對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序既不存在移相問(wèn)題，也不存在解碼均聚物鏈段的困難。已展示了可以通過(guò)聚乙二醇對(duì)阻隔納米孔中電流的作用在僅僅因一個(gè)或兩個(gè)碳單元而不同的一系列聚乙二醇當(dāng)中加以辯別[賴納(Reiner)等人2010，羅伯特森等人2007]，分辨率基本上等同于通過(guò)質(zhì)譜儀獲得的分辨率。因此，如下文所描述，將不同長(zhǎng)度的PEG鏈連接到dATP、dCTP、dGTP和dTTP的末端磷酸酯上。當(dāng)在聚合酶反應(yīng)期間并入每個(gè)核苷酸時(shí)，加特異性標(biāo)簽的磷酸酯基被釋放到納米孔中，產(chǎn)生獨(dú)特的電流阻隔信號(hào)，從而指示何種核苷酸被并入。測(cè)序的速度極其快速，僅受聚合酶反應(yīng)的速率所限制。作為對(duì)核苷酸加標(biāo)簽的替代性方法，我們還利用了不同的磷酸酯鏈長(zhǎng)(例如三磷酸酯、四磷酸酯和五磷酸酯)。另外，我們還使用了固態(tài)納米孔，其在對(duì)制造的較好控制和制造靈活性方面具有優(yōu)勢(shì)，由此確保朝向和通過(guò)納米孔或納米通道的加標(biāo)簽的多磷酸酯而非核苷酸前體或DNA的快速矢量轉(zhuǎn)運(yùn)。為了實(shí)現(xiàn)此舉，結(jié)合了兩個(gè)重要的設(shè)計(jì)特征。第一，前體(加標(biāo)簽的多磷酸核苷酸)經(jīng)合成而具有總體中性電荷，而裂解的加標(biāo)簽的磷酸酯具有總體正電荷。通過(guò)利用吸引正離子的電流，納米孔僅需要辯別四種替代性釋放的加標(biāo)簽的分子。前體和產(chǎn)物上的有差別的電荷通過(guò)將精確平衡磷酸酯數(shù)目(帶負(fù)電荷)的一定數(shù)目的賴氨酸或精氨酸(帶正電荷)并入標(biāo)簽中來(lái)實(shí)現(xiàn)。將α-磷酸酯并入生長(zhǎng)引物中之后，與所釋放的產(chǎn)物中的磷酸酯相比存在再多一個(gè)賴氨酸。任選地，堿性磷酸酶可以用于將所有磷酸酯裂解掉以產(chǎn)生具有較強(qiáng)正電荷的PEG標(biāo)簽。第二，為了確保所釋放的磷酸酯即刻移動(dòng)通過(guò)最接近的孔，將DNA聚合酶例如通過(guò)生物素-抗生蛋白鏈菌素鍵聯(lián)固定到孔的入口上。當(dāng)DNA鏈穿引通過(guò)聚合酶時(shí)，所釋放的加標(biāo)簽的產(chǎn)物僅須擴(kuò)散相同的短距離以到達(dá)納米孔。同樣重要的是認(rèn)識(shí)到生物電子傳導(dǎo)機(jī)制優(yōu)于光學(xué)方法的優(yōu)勢(shì)。對(duì)于單分子光學(xué)傳導(dǎo)技術(shù)，在高短噪聲水平上來(lái)自單一熒光團(tuán)的信號(hào)通常＜2500個(gè)光子/秒(對(duì)應(yīng)于約為50fA的檢測(cè)電流水平)，需要復(fù)雜的光學(xué)裝置來(lái)試圖收集所發(fā)射的每個(gè)光子，使得平臺(tái)按比例擴(kuò)大到較高密度很困難。合成反應(yīng)必須減緩到1Hz以允許用于這些微弱的嘈雜光信號(hào)的充分集成時(shí)間。光學(xué)技術(shù)的挑戰(zhàn)已開(kāi)辟了生物電子檢測(cè)方法的可能性，所述生物電 子檢測(cè)方法具有明顯較高的信號(hào)水平(通常高過(guò)三個(gè)數(shù)量級(jí))，允許使用轉(zhuǎn)換器、檢測(cè)器和放大器的適當(dāng)共同設(shè)計(jì)用于高帶寬檢測(cè)的可能性。針對(duì)納米孔的信號(hào)水平可以高達(dá)100pA(來(lái)自α-溶血素)[卡西亞諾維奇等人1996]、300pA(針對(duì)MspA)[德林頓(Derrington)等人2010]和4nA以上(來(lái)自固態(tài)納米孔)[瓦努努(Wanunu)等人2010]。相當(dāng)大的努力已致力于開(kāi)發(fā)納米孔技術(shù)作為生物電子傳導(dǎo)機(jī)制[本納等人2007，迪默等人2002，卡西亞諾維奇等人1996，布蘭登(Branton)2008，布蘭登等人2008，陳(Chen)2004，格肖(Gershow)等人2007，尼利(Nealy)2007，馬蒂夏克(Matysiak)等人2006]。這種電子傳感器的兩個(gè)基本屬性賦予其單分子靈敏性。第一屬性是孔自身中具有電荷靈敏性的極其局限的(納米級(jí))幾何形狀。孔的直徑可以是2nm到3nm，并且由于電解質(zhì)電荷篩選，測(cè)量的電流對(duì)來(lái)自孔的超過(guò)幾納米的電荷來(lái)源高度不靈敏。第二，納米孔傳感器通過(guò)相當(dāng)緩慢移動(dòng)的帶電荷的生物聚合物對(duì)較高遷移率鹽離子的鄰近濃度的影響提供了增益。然而，納米孔極其受到生物分子在孔的電荷靈敏區(qū)中所耗費(fèi)的相對(duì)較短時(shí)間所限制。這個(gè)問(wèn)題通過(guò)標(biāo)簽的使用直接得到解決，所述標(biāo)簽可以經(jīng)優(yōu)化以產(chǎn)生高信號(hào)水平和較長(zhǎng)易位事件。同時(shí)，這些孔的CMOS共集成用于顯著改善噪聲限制的帶寬以用于納米孔裝置中的檢測(cè)。固態(tài)和生物孔都由這個(gè)平臺(tái)支持。這種固態(tài)集成以及相關(guān)的微射流技術(shù)還獨(dú)特地能夠?qū)崿F(xiàn)這種設(shè)計(jì)的按比例放大到使用集成電子器件的大型陣列用于檢測(cè)。實(shí)例1I.經(jīng)修飾的核苷酸的設(shè)計(jì)和合成使用多種磷酸酯連接的核苷酸測(cè)定加標(biāo)簽的多磷酸酯的龐大性對(duì)由納米孔產(chǎn)生的電子阻隔信號(hào)的影響，所述磷酸酯連接的核苷酸具有連接到核苷酸的末端磷酸酯上的不同大小的標(biāo)簽或基團(tuán)。四種磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-多磷酸酯的結(jié)構(gòu)示于圖4中。首先，合成一系列的核苷-5′-三磷酸酯、核苷-5′-四磷酸酯、核苷-5′-五磷酸酯和核苷-5′-六磷酸酯。在這些核苷酸中，末端磷酸酯連接有連接基團(tuán)，通過(guò)所述連接基團(tuán)連接了不同標(biāo)簽，例如增加所釋放的多磷酸酯的龐大性或電荷的不同長(zhǎng)度和質(zhì)量的乙二醇或其它分子。這些核苷酸用納米孔測(cè)試以測(cè)定連接到末端磷酸酯上的何種標(biāo)簽或龐大基團(tuán)與不同堿基之間的電子阻隔信號(hào)的較顯著差異相關(guān)聯(lián)。1)末端磷酸酯修飾的核苷-多磷酸酯a.末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-三磷酸酯如圖5中所示，末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-三磷酸酯可以通過(guò)以下方式合成：使相應(yīng)的dNTP與DCC/DMF反應(yīng)得到環(huán)狀三偏磷酸酯，所述環(huán)狀三偏磷酸酯可以用適當(dāng)親 核試劑開(kāi)環(huán)以得到標(biāo)簽或連接基團(tuán)連接的核苷-5′-三磷酸酯。這種核苷-5′-三磷酸酯可以用于模板-引物延伸反應(yīng)中，并且所釋放的連接標(biāo)簽的焦磷酸酯可以使用納米孔讀取?；蛘?，連接到磷酸酯上的連接基團(tuán)可以與標(biāo)簽-NHS酯反應(yīng)，得到替代性的連接標(biāo)簽的核苷-5′-三磷酸酯。b.末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-四磷酸酯為了合成末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-四磷酸酯，使相應(yīng)的三磷酸酯首先與含CDI的DMF反應(yīng)以激活末端磷酸酯基，所述末端磷酸酯基接著與磷酸或標(biāo)簽-單磷酸酯反應(yīng)，得到四磷酸酯(圖6)。四磷酸酯上的末端磷酸酯可以用CDI進(jìn)一步激活，隨后與適當(dāng)親核試劑反應(yīng)，得到連接基團(tuán)連接的四磷酸酯，其可以進(jìn)一步用于連接不同質(zhì)量、長(zhǎng)度或體積的標(biāo)簽(如m-dPEG-NHS酯)，同樣示于圖6中。c.末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-五磷酸酯和核苷-5′-六磷酸酯末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-五磷酸酯和核苷-5′-六磷酸酯的合成遵循如圖7中所示的相同原理。其可以從激活的三磷酸酯或四磷酸酯通過(guò)與磷酸、焦磷酸酯或連接標(biāo)簽的磷酸酯反應(yīng)而制備?；蛘?，連接基團(tuán)可以連接到五磷酸酯或六磷酸酯上，隨后與激活的NHS酯反應(yīng)。d.寡聚物-標(biāo)簽連接的核苷-多磷酸酯納米孔測(cè)序的當(dāng)前方法存在許多問(wèn)題，如堿基在其穿過(guò)納米孔時(shí)的識(shí)別以及允許登記核堿基識(shí)別的速度或轉(zhuǎn)運(yùn)速率。DNA以1μs到5μs的速率穿過(guò)α-溶血素納米孔，所述速率過(guò)快以致無(wú)法記錄以用于單分子測(cè)序?qū)嶒?yàn)。通過(guò)多種蛋白工程化策略，包括分子制動(dòng)器(短的以共價(jià)方式連接的寡核苷酸)的使用，已取得了克服這些問(wèn)題的一些進(jìn)展[貝利H.(Bayley，H.)2006]。如本文所公開(kāi)，短的寡核苷酸可以通過(guò)激活的末端磷酸酯與寡核苷酸的3′-OH或5′-OH反應(yīng)而連接到多磷酸核苷的末端磷酸酯上?；蛘?，寡核苷酸的3′-磷酸酯或5′-磷酸酯可以用CDI或咪唑/DCC激活并且與核苷-5′-多磷酸酯反應(yīng)。寡聚物連接的磷酸核苷(寡聚物-3′到5′-磷酸酯；寡聚物-5′到5′-磷酸酯)的結(jié)構(gòu)分別示于圖8(a)和圖8(b)中。通過(guò)穿過(guò)納米孔而監(jiān)測(cè)的聚合酶反應(yīng)副產(chǎn)物示于圖8(c)中。聚合酶反應(yīng)副產(chǎn)物通過(guò)納米孔的遷移速率可以通過(guò)將不同長(zhǎng)度的寡核苷酸連接到不同核苷-5′-多磷酸酯上來(lái)控制。舉例來(lái)說(shuō)，如果核苷dA連接有1或2個(gè)寡聚物-dA單元的話，那么dT可以具有3個(gè)寡聚物-dT單元，dC可以具有4個(gè)寡聚物-dC單元，并且dG可以具有5個(gè)寡聚物-dG單元。用于每個(gè)核苷酸的寡聚物的數(shù)目的不同組合可以用于控制納米孔中的轉(zhuǎn)運(yùn)和滯留時(shí)間。納米孔中的轉(zhuǎn)運(yùn)和滯留時(shí)間也可以通過(guò)向核苷酸中加入不同數(shù)目的磷酸酯基來(lái)控制。由此，對(duì)于每個(gè)多磷酸核苷酸，電荷和質(zhì)量可能不同。連接基團(tuán)標(biāo)簽結(jié)構(gòu)的實(shí)例末端磷酸酯或核苷堿基部分上的反應(yīng)性基團(tuán)以及可以與所述基團(tuán)反應(yīng)的基團(tuán)的特定實(shí)例提供于表1中?？梢耘c其反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)可以存在于連接基團(tuán)上或標(biāo)簽上。表1可以通過(guò)納米孔檢測(cè)的標(biāo)簽隨同包括在內(nèi)，但其決不限于化合物的這些基團(tuán)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以改變官能團(tuán)以找到適合的標(biāo)簽。標(biāo)簽包括具有一個(gè)或一個(gè)以上4到8員環(huán)的脂肪族、芳香族、芳基、雜芳基化合物，并且可以任選地經(jīng)以下取代：鹵基、羥基、氨基、硝基、烷氧基、氰基、烷基、芳基、雜芳基、酸、醛、疊氮基、烯基、炔基或其它基團(tuán)。這些標(biāo)簽包括聚乙二醇(PEG)、碳水化合物、氨基酸、肽、熒光染料、熒光發(fā)生染料(非熒光的，但在去除保護(hù)基之后變成熒光的)、生色染料(無(wú)色的，但在去除保護(hù)基之后變成有色的)、化學(xué)發(fā)光化合物、核苷、核苷-單磷酸酯、核苷-二磷酸酯或核苷-多磷酸酯、寡核苷酸、芳基、雜芳基或脂肪族化合物。一些實(shí)例在圖16中給出。PEG-磷酸酯標(biāo)記的核苷酸的結(jié)構(gòu)以及具有不同反應(yīng)性基團(tuán)以與官能團(tuán)反應(yīng)的可能的PEG的一些實(shí)例例示于圖17中。此處提供了可以用于連接到核苷酸的末端磷酸酯或堿基部分上的染料或化合物的一些其它實(shí)例。這些化合物決不是可以使用的唯一化合物。這些化合物作為實(shí)例列于此處，并且所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地找到可以連接到核苷酸上并且通過(guò)納米孔檢測(cè) 的適合的連接基團(tuán)-標(biāo)簽。適合的標(biāo)簽的其它實(shí)例有：熒光染料：黃嘌呤染料、氟硼熒染料(Bodipydye)、花青染料?；瘜W(xué)發(fā)光化合物：1，2-二氧雜丁烷化合物(馬薩諸塞州貝德福德的特洛皮克斯公司(TropixInc.，Bedford，MA))。氨基酸和肽：天然存在的或經(jīng)修飾的氨基酸和其聚合物。碳水化合物：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖等。NMP和NDP：核苷-單磷酸酯、核苷-二磷酸酯。經(jīng)鹵素、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、疊氮基或其它這類基團(tuán)取代的脂肪族或芳香族酸、醇、硫醇。2)堿基修飾的核苷-5′-三磷酸酯合成用于DNA邊合成邊測(cè)序(SBS)的多種核苷酸可逆終止子(NRT)，其中可裂解的連接基團(tuán)將熒光染料連接到核苷酸堿基上，并且核苷酸的3′-OH用小型可逆終止基團(tuán)阻隔[居(Ju)等人2006，郭等人2008和2010]。使用這些NRT，在每個(gè)位置處可逆地停止DNA合成。在記錄來(lái)自并入的堿基的熒光信號(hào)之后，將并入的核苷酸的可裂解部分去除并且重復(fù)所述循環(huán)。相同類型的核苷酸也可以用于納米孔DNA測(cè)序。如圖9(A)中所示，可以合成通過(guò)可裂解的連接基團(tuán)連接的3′-OH處的小型阻隔基和堿基處連接的標(biāo)簽。在聚合酶延伸反應(yīng)之后，3′-O-阻隔基和來(lái)自堿基的標(biāo)簽都被裂解，并且所釋放的標(biāo)簽可以用于穿過(guò)納米孔，并且監(jiān)測(cè)阻隔信號(hào)?？梢允褂盟姆N不同標(biāo)簽(例如不同長(zhǎng)度和分子量的聚乙二醇(PEG)，如圖9(A)中所示)，四種堿基中的每一者使用一種，由此區(qū)分阻隔信號(hào)。或者，不使用3′-O-阻隔基，因?yàn)橐颜故君嫶蠡鶊F(tuán)或核苷酸堿基可以防止DNA聚合酶一次加入一個(gè)以上核苷酸[哈里斯(Harris)等人2008]。如圖9(B)中所示，龐大dNMP通過(guò)可裂解的連接基團(tuán)引入。由此，不同dNMP根據(jù)原始dNTP通過(guò)連接基團(tuán)引入。舉例來(lái)說(shuō)，在dTTP核苷酸的情況下，引入dTMP(針對(duì)dATP，引入dAMP；針對(duì)dGTP，引入dGMP；以及針對(duì)dCTP，引入dCMP)。在聚合酶并入并且用TCEP裂解之后，產(chǎn)生經(jīng)修飾的dNMP，其穿過(guò)納米孔通道并且通過(guò)適當(dāng)方法檢測(cè)。3)2′-OH或3′-OH修飾的核苷-5′-三磷酸酯可以進(jìn)行所有四種3′-修飾的核苷-5′-三磷酸酯的合成[郭等人2008，李(Li)等人2003，塞歐(Seo)等人2004]。3′-O-2-硝基苯甲基和3′-O-疊氮基甲基連接的dNTP(分別為圖10A和圖10B)是DNA聚合酶的良好底物。在測(cè)序反應(yīng)中通過(guò)DNA/RNA聚合酶并入之后，這些3′-O-加標(biāo)簽的核苷酸在單堿基延伸之后由于3′-OH處的阻隔基而使合成終止。進(jìn)一步延伸只有在來(lái)自3′-O位置的阻隔基裂解之后才有可能。3′-O-2-硝基苯甲 基可以通過(guò)用TCEP處理由UV光以及2′-O-疊氮基甲基有效地裂解，從而產(chǎn)生游離的OH基團(tuán)以用于進(jìn)一步延伸。從反應(yīng)裂解的產(chǎn)物(圖10C或圖10D)通過(guò)穿過(guò)納米孔并且記錄信號(hào)而針對(duì)電子阻隔進(jìn)行監(jiān)測(cè)。合成四種不同的經(jīng)取代的被硝基苯甲基保護(hù)的dNTP和四種不同的經(jīng)疊氮基甲基取代的dNTP(DNA的四種堿基中的每一者使用一種)。II.使用經(jīng)修飾的核苷酸的DNA延伸1)磷酸酯加標(biāo)簽的核苷酸在聚合酶反應(yīng)中使用以上描述的末端磷酸酯加標(biāo)簽的多磷酸核苷以產(chǎn)生延伸產(chǎn)物。如圖11中所示，在聚合酶反應(yīng)之后，獲得磷酸酯加標(biāo)簽的核苷酸的釋放的副產(chǎn)物標(biāo)簽-多磷酸酯，并且延伸的DNA不含任何修飾。接著，所釋放的標(biāo)簽-多磷酸酯通過(guò)單通道記錄技術(shù)用于工程化的納米孔中以供測(cè)序分析。所釋放的標(biāo)簽-多磷酸酯也可以用堿性磷酸酶處理，得到也可以被檢測(cè)的游離標(biāo)簽。使用針對(duì)四種核苷酸(A、T、G和C)的四種不同標(biāo)簽以產(chǎn)生因質(zhì)量、電荷或體積而不同的四種不同的加標(biāo)簽的多磷酸酯，可以測(cè)定DNA的序列。2)具有可裂解的連接基團(tuán)的堿基加標(biāo)簽的核苷酸合成用于DNA邊合成邊測(cè)序(SBS)和單分子測(cè)序的堿基加標(biāo)簽的三磷酸核苷酸[郭等人2008和2010]。嘧啶(C和T)的5位以及7-脫氮嘌呤(G和A)的7位處的大型龐大基團(tuán)的加入可以在DNA聚合酶反應(yīng)中阻斷一個(gè)以上核苷酸的加入。合成可裂解的連接基團(tuán)、龐大基團(tuán)和不同電荷連接到核苷酸堿基上的經(jīng)修飾的核苷酸。經(jīng)修飾的核苷酸還可以在核苷酸的3′-OH處具有小型阻隔基。這些經(jīng)修飾的核苷酸用于聚合酶延伸反應(yīng)。如圖12中所示，在用適當(dāng)核苷酸延伸之后，來(lái)自核苷酸堿基和來(lái)自糖3′-O的連接基團(tuán)和標(biāo)簽如果被阻隔的話，那么就通過(guò)化學(xué)或光化學(xué)手段裂解，并且所釋放的連接基團(tuán)-標(biāo)簽通過(guò)單通道記錄技術(shù)用于工程化的納米孔中以供測(cè)序分析。3)具有可裂解的連接基團(tuán)的2′-或3′-加標(biāo)簽的核苷酸連接基團(tuán)和標(biāo)簽也可以連接到核苷酸的2′-OH或3′-OH上。在聚合酶延伸反應(yīng)之后，連接基團(tuán)-標(biāo)簽通過(guò)化學(xué)、光化學(xué)或酶促反應(yīng)從延伸的產(chǎn)物裂解，從而釋放游離的3′-OH以用于進(jìn)一步延伸。如圖13中所示，所釋放的連接基團(tuán)-標(biāo)簽接著通過(guò)單通道記錄技術(shù)用于工程化的納米孔中以供測(cè)序分析。III.使用納米孔的DNA測(cè)序研究遵循圖11到圖13中所示的策略，評(píng)估使用納米孔的DNA測(cè)序中的不同核苷酸的辨別。為了驗(yàn)證納米孔區(qū)分DNA中四種不同連接基團(tuán)-標(biāo)簽的能力，進(jìn)行如圖14中所示的一系列實(shí)驗(yàn)?？梢允笵NA/RNA聚合酶結(jié)合到納米孔上，并且將待測(cè)序的模板與引 物一起加入。DNA模板或引物也可以固定在納米孔的頂部上，然后在加入DNA聚合酶之后形成模板-引物復(fù)合物。向此模板-引物復(fù)合物中同時(shí)或依序加入四種不同加標(biāo)簽的核苷酸。在聚合酶催化正確核苷酸并入之后，所加入的核苷酸釋放連接標(biāo)簽的多磷酸酯(在末端磷酸酯標(biāo)記的核苷酸的情況下)，所述連接標(biāo)簽的多磷酸酯接著穿過(guò)納米孔以產(chǎn)生待記錄的電信號(hào)并且用于鑒別所加入的堿基。任選地，所釋放的標(biāo)簽-多磷酸酯也可以用堿性磷酸酶處理，得到也可以通過(guò)穿過(guò)納米孔來(lái)檢測(cè)的游離標(biāo)簽。每個(gè)標(biāo)簽因在大小、質(zhì)量或電荷方面的差異而產(chǎn)生不同的電子阻隔信號(hào)。在堿基修飾的或2′/3′修飾的核苷酸的情況下，在DNA/RNA聚合酶延伸之后，來(lái)自延伸的引物的標(biāo)簽通過(guò)化學(xué)、光化學(xué)或酶促手段裂解，并且監(jiān)測(cè)所釋放的標(biāo)簽的電子信號(hào)。標(biāo)簽的形狀、大小、質(zhì)量、電荷或其它性質(zhì)可以根據(jù)要求作調(diào)整。如本文所公開(kāi)，區(qū)分并表征來(lái)自每個(gè)核苷酸的信號(hào)(圖15)和不同身份的核苷酸之間的轉(zhuǎn)變。分析事件圖上的阻隔信號(hào)的幅度和持續(xù)時(shí)間并且與已知圖作比較。由此，在DNA的構(gòu)筑嵌段的這些合理的化學(xué)設(shè)計(jì)和修飾的情況下，優(yōu)化納米孔的使用以在單分子水平上以單堿基分辨率解譯DNA序列。為了實(shí)施這種新穎的策略以用于DNA測(cè)序，可以在平坦表面上構(gòu)筑納米孔陣列以進(jìn)行如圖18中所示的大規(guī)模平行DNA測(cè)序。納米孔的陣列也可以構(gòu)筑在硅芯片或其它這類表面上。納米孔可以用脂質(zhì)雙層或其它這類層從蛋白來(lái)構(gòu)筑(α-溶血素孔、恥垢分枝桿菌孔蛋白A(MycobacteriumsmegnatisporinA，MspA))[德林頓等人2010]，或其可以是在氮化硅、氧化硅或金屬氧化物中制造的合成固態(tài)納米孔[斯托姆(Storm)等人2005；瓦努努等人2008]或固態(tài)孔與α-溶血素之間的雜合體[霍爾(Hall)等人2010]。圖18示出了用于大規(guī)模平行DNA邊合成邊測(cè)序的納米孔陣列的示意圖。納米孔可以在每一DNA/RNA聚合酶催化的核苷酸加入副產(chǎn)物(連接到磷酸酯或堿基和/或糖部分的2′-OH、3′-OH上的標(biāo)簽)穿過(guò)納米孔時(shí)感測(cè)到所述副產(chǎn)物。不同標(biāo)簽的電性質(zhì)將基于其在納米孔中的阻隔性質(zhì)來(lái)區(qū)分堿基。圖18中所示的納米孔的陣列可以各自讀取相同序列或不同序列。增加每個(gè)序列的讀取次數(shù)將使得所得序列數(shù)據(jù)的質(zhì)量較好。實(shí)例2I.合成PEG標(biāo)記的脫氧鳥(niǎo)苷-5′-四磷酸酯(dG4P-PEG)：根據(jù)圖19合成PEG標(biāo)記的脫氧鳥(niǎo)苷-5′-四磷酸酯(dG4P-PEG)。首先，使2′-三磷酸脫氧鳥(niǎo)苷(dGTP)與含CDI的DMF反應(yīng)以激活末端磷酸酯基，所述末端磷酸酯基接著與磷酸二丁基銨反應(yīng)，得到四磷酸酯。這種四磷酸酯上的末端磷酸酯用含EDAC的0.1M咪唑緩沖液進(jìn)一步激活，隨后與二氨基庚烷反應(yīng)，得到氨基連接的四磷酸酯，其進(jìn)一 步與mPEG-NHS酯反應(yīng)，得到所需的四種PEG-dG4P。在聚合酶并入之后，所釋放的PEG上的凈電荷是-3(PEG-NH-三磷酸酯)。II.單堿基延伸反應(yīng)中經(jīng)修飾的核苷酸的測(cè)試dG4P-PEG通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜法表征，如表II中所示。dG4P-PEG是引物延伸中DNA聚合酶的極佳底物。DNA延伸產(chǎn)物的MALDI-TOF質(zhì)譜示于圖20中。實(shí)例3-用于標(biāo)記核苷酸的Peg的通過(guò)納米孔的單分子檢測(cè)聚(乙二醇)是一種非電解質(zhì)聚合物，其微弱地結(jié)合陽(yáng)離子(例如其在Kd為約2M下結(jié)合K+離子)。因此，聚合物上的凈電荷視可移動(dòng)的陽(yáng)離子濃度和以化學(xué)方式與其連接的其它部分的存在而定。已展示單一α-溶血素納米孔可以容易地以優(yōu)于單體分辨率(即，優(yōu)于44g/mol)區(qū)分不同大小的PEG聚合物[賴納等人2010；羅伯特森等人2007]?？梢宰鞒鏊鏊降谋鎰e，因?yàn)榫酆衔镆蝮w積排斥(孔導(dǎo)電率隨聚合物大小增加而降低)以及通過(guò)結(jié)合可移動(dòng)的陽(yáng)離子(其否則將自由流動(dòng)通過(guò)孔)而降低孔的導(dǎo)電率[賴納等人2010]。此外，聚合物在孔中的滯留時(shí)間對(duì)聚合物的電荷高度靈敏，其對(duì)于PEG來(lái)說(shuō)，與聚合物長(zhǎng)度成比例增大。納米孔應(yīng)能夠區(qū)分以化學(xué)方式連接到其它部分上的不同大小的PEG。用于標(biāo)記核苷酸的PEG(PEG16、24、37和49)在納米孔上測(cè)試，并且在單分子水平上產(chǎn)生獨(dú)特的電子阻隔信號(hào)，如圖21中所示。為了研究不同加標(biāo)簽的多磷酸酯的龐大性對(duì)納米孔中產(chǎn)生的電子阻隔信號(hào)的影響，合成具有連接到核苷酸的末端磷酸酯上的不同大小的聚乙二醇(PEG)標(biāo)簽的多種磷酸酯連接的核苷酸。首先，如圖4中所示，我們合成了具有通過(guò)連接基團(tuán)連接的末端磷酸酯的一系列的核苷-5′-三磷酸酯、核苷-5′-四磷酸酯和核苷-5′-五磷酸酯，不同標(biāo)簽(例如增加所釋放的多磷酸酯的分子大小或改變其電荷的不同長(zhǎng)度和質(zhì)量的PEG或其它分子)可以連接到所述連接基團(tuán)上。我們接著在與通過(guò)納米孔檢測(cè)相結(jié)合的聚合酶反應(yīng)中測(cè)試這些核苷酸，從而查看何種連接到末端磷酸酯上的標(biāo)簽或龐大基團(tuán)在不同堿基中在電子阻隔信號(hào)方面產(chǎn)生較明顯的差異。I.篩選并選擇具有獨(dú)特納米孔阻隔信號(hào)的4種PEG標(biāo)簽近來(lái)，已展示當(dāng)聚乙二醇(PEG)分子進(jìn)入單一α-溶血素孔時(shí)，其引發(fā)獨(dú)特的質(zhì)量依賴性導(dǎo)電率狀態(tài)與特有的平均滯留時(shí)間[羅伯特森等人2007]。圖22A示出了基于導(dǎo)電率的質(zhì)譜明確地解析了乙二醇的重復(fù)單元，并且滯留時(shí)間隨PEG的質(zhì)量增加。I.a針對(duì)納米孔阻隔信號(hào)測(cè)試PEG選擇不同長(zhǎng)度和分子量的PEG(可購(gòu)自量子生物設(shè)計(jì)有限公司(QuantaBiodesignLtd)或其它供應(yīng)商)，并且監(jiān)測(cè)納米孔阻隔信號(hào)，如實(shí)例2中所描述。如圖22A中所示，通過(guò)納米孔明確地區(qū)分28到48個(gè)乙二醇單元的PEG。因此，將展示極其獨(dú)特的納米孔阻隔信號(hào)的具有廣泛范圍的乙二醇單元的PEG選為用來(lái)標(biāo)記核苷酸A、C、G和T的標(biāo)簽。實(shí)例示于圖22B中。也評(píng)估作為標(biāo)簽的分支PEG，因?yàn)檫@些PEG可以按較直接的方式用正電荷修飾。一些線性和分支PEG的結(jié)構(gòu)展示在圖22的下圖。I.b在I.a中選擇的磷酸酯標(biāo)記的PEG的設(shè)計(jì)和合成在納米孔測(cè)序中，納米孔中的電流阻隔信號(hào)由在聚合酶反應(yīng)期間所釋放PEG-磷酸酯產(chǎn)生。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了具有帶正電荷的連接基團(tuán)的磷酸酯標(biāo)記的PEG，并且用有機(jī)(例如α-溶血素)和合成(固相)納米孔測(cè)試這些分子以評(píng)估其電流阻隔信號(hào)。將所選擇的PEG轉(zhuǎn)化成其三磷酸酯，如圖23中所示。舉例來(lái)說(shuō)，經(jīng)Fmoc保護(hù)的氨基-丁醇可以通過(guò)在一鍋式反應(yīng)中首先與氯化氧磷反應(yīng)，隨后與焦磷酸三丁基銨反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的三磷酸酯。在純化后，三磷酸酯用DCC/DMF或CDI/DMF激活，得到激活的三磷酸酯，所述激活的三磷酸酯與PEG的OH基團(tuán)反應(yīng)，產(chǎn)生PEG-三磷酸酯。相同的流程適用于線性PEG以及分支PEG。在納米孔中測(cè)試這些PEG磷酸酯以優(yōu)化用于產(chǎn)生獨(dú)特的電流阻隔信號(hào)的條件。聚氨基酸(聚賴氨酸、聚精氨酸、間雜的聚賴氨酸)連接基團(tuán)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)肽合成策略合成；如果嵌有連接多磷酸酯鏈的酯鍵的話，那么使用堿性磷酸酶將其裂解應(yīng)該是可能的，從而產(chǎn)生較強(qiáng)正性標(biāo)簽以用于納米孔詢問(wèn)。正電荷還可以并入PEG鏈中。I.c末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-三磷酸酯的文庫(kù)的設(shè)計(jì)和合成設(shè)計(jì)并合成末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-三磷酸酯、核苷-5′-四磷酸酯和核苷-5′-五磷酸酯。在聚合酶反應(yīng)中測(cè)試這些分子，并且選擇最佳的一種用于納米孔檢測(cè)。具有多種標(biāo)簽(包括小型或大型聚賴氨酸、氨基酸、多種帶負(fù)電荷或帶正電荷的染料(如能量轉(zhuǎn)移染料)和乙二醇單元)的末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-三磷酸酯、核苷-5′-四磷酸酯和核苷-5′-五磷酸酯已展示被DNA聚合酶接受作為用于引物延伸的極佳底物[庫(kù)馬爾等人2006和2008；蘇德等人2005；和艾德等人2009]。I.c.1末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-三磷酸酯的設(shè)計(jì)和合成如圖24中所示，末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-三磷酸酯通過(guò)以下方式合成：使相應(yīng)的dNTP與DCC/DMF反應(yīng)，得到環(huán)狀三偏磷酸酯，所述環(huán)狀三偏磷酸酯可以用親核試劑開(kāi)環(huán)以產(chǎn)生標(biāo)簽或連接基團(tuán)連接的核苷-5′-三磷酸酯。此外，連接到磷酸酯上的連接基團(tuán)可以與PEG-NHS酯反應(yīng)，得到替代性的PEG連接的核苷-5′-三磷酸酯。所得末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-三磷酸酯用于模板-引物延伸反應(yīng)中，并且檢測(cè)所釋放的連接標(biāo)簽的焦磷酸酯，并且通過(guò)其特定納米孔電流阻隔參數(shù)加以區(qū)分。I.c.2末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-四磷酸酯的設(shè)計(jì)和合成為了合成末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-四磷酸酯，使相應(yīng)的三磷酸酯首先與含CDI的DMF反應(yīng)以激活末端磷酸酯基，所述末端磷酸酯基接著與磷酸或標(biāo)簽-單磷酸酯反應(yīng)，得到四磷酸酯，如圖25中所示。四磷酸酯上的末端磷酸酯可以用含EDAC的0.1M咪唑緩沖液進(jìn)一步激活，隨后與適當(dāng)親核試劑反應(yīng)，得到連接基團(tuán)連接的四磷酸酯，所述連接基團(tuán)連接的四磷酸酯可以用于連接不同質(zhì)量、長(zhǎng)度或電荷的標(biāo)簽(如m-PEG-NHS酯)。在這種情況下，使用四種三甲基賴氨酸來(lái)中和四種磷酸酯的電荷。在聚合酶并入之后，所釋放的PEG上的凈電荷是+1或(如果用堿性磷酸酶處理的話)+4，其可以通過(guò)納米孔檢測(cè)。I.c.3末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-五磷酸酯的設(shè)計(jì)和合成末端磷酸酯加標(biāo)簽的核苷-5′-五磷酸酯的合成遵循如圖26中所示的相同原理。其可以通過(guò)與磷酸、焦磷酸酯或連接標(biāo)簽的磷酸酯反應(yīng)而從激活的三磷酸酯或四磷酸酯制備?；蛘?，連接基團(tuán)可以連接到五磷酸酯上，隨后與激活的NHS酯反應(yīng)。以上描述的末端磷酸酯加標(biāo)簽的多磷酸核苷用于聚合酶反應(yīng)中以產(chǎn)生延伸產(chǎn)物。遵循圖11中所示的流程，評(píng)估末端磷酸酯加標(biāo)簽的多磷酸核苷在聚合酶延伸中的表現(xiàn)。我們首先進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，并且通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜法表征DNA延伸產(chǎn)物以評(píng)估并入效率。在確立優(yōu)化的反應(yīng)條件之后，我們將模板固定在磁性珠粒上并且重復(fù)單堿基延伸反應(yīng)，此后，從溶液中分離所釋放的多磷酸酯-標(biāo)簽以用于使用單一納米孔檢測(cè)。連續(xù)進(jìn)行這種反應(yīng)以評(píng)估所有4種核苷酸(A、C、G和T)，并且通過(guò)納米孔檢測(cè)其相應(yīng)所釋放的標(biāo)簽。與多磷酸酯-標(biāo)簽核苷酸的連續(xù)聚合酶反應(yīng)以及所釋放的多磷酸酯-標(biāo)簽通過(guò)納米孔的明確區(qū)分確立了所述方法的可行性。如圖11中所示，在聚合酶反應(yīng)之后，獲得磷酸酯加標(biāo)簽的核苷酸(標(biāo)簽-多磷酸酯)的釋放的副產(chǎn)物，并且延伸的DNA鏈不含任何修飾。這是有利的，因?yàn)樯L(zhǎng)的DNA鏈上殘留的任何疤(scar)可能都會(huì)影響其在增加核苷酸加入的情況下由聚合酶識(shí)別的能力，最終終止進(jìn)一步DNA合成。在納米孔中分析所釋放的連接標(biāo)簽的多磷酸酯以評(píng)估 測(cè)序靈敏性和準(zhǔn)確性。在最初的實(shí)驗(yàn)中，我們針對(duì)標(biāo)簽的阻隔信號(hào)測(cè)試標(biāo)簽，隨后運(yùn)作SBS反應(yīng)。如果針對(duì)四種核苷酸使用不同標(biāo)簽以產(chǎn)生因質(zhì)量、電荷或體積而不同的四種不同的加標(biāo)簽的多磷酸酯并且產(chǎn)生4種獨(dú)特的阻隔信號(hào)的話，那么就可以測(cè)定DNA序列。II.通過(guò)蛋白納米孔檢測(cè)所釋放的加標(biāo)簽的磷酸酯在核苷酸/核糖部分已通過(guò)DNA聚合酶反應(yīng)裂解之后，我們使用單一α-溶血素納米孔來(lái)檢測(cè)連接到通過(guò)多重磷酸酯連接基團(tuán)連接的核苷酸上的PEG和相同聚合物。四種不同DNA堿基中的每一者連接到具有獨(dú)特長(zhǎng)度的PEG聚合物上。由此，鑒別通過(guò)聚合酶從PEG中去除的每個(gè)堿基。因?yàn)槲捶磻?yīng)的核苷酸無(wú)法與所釋放的加標(biāo)簽的多磷酸酯分離，尤其在實(shí)時(shí)情形下，所以我們運(yùn)用所述方法對(duì)分子電荷的極端靈敏性來(lái)區(qū)分所釋放的反應(yīng)產(chǎn)物與起始物質(zhì)。我們使用圓錐形玻璃支撐物測(cè)量單一α-溶血素導(dǎo)電率[懷特(White)等人，2006和2007]，所述圓錐形玻璃支撐物允許在100kHZ和約4pARMS噪聲下收集數(shù)據(jù)。我們測(cè)量了加標(biāo)簽的核苷酸和加標(biāo)簽的產(chǎn)物在廣泛范圍的跨膜電位內(nèi)的阻隔深度和滯留時(shí)間分布，從而測(cè)定用于核苷酸辨別的最佳條件，并且將我們對(duì)PEG-納米孔相互作用的當(dāng)前理論理解[羅伯特森等人2007]擴(kuò)展到具有固定電荷的分子。表征和理論理解允許清楚鑒別通過(guò)聚合酶并入聚核苷酸中的核苷酸。由此，在DNA的構(gòu)筑嵌段的這些合理的化學(xué)設(shè)計(jì)和修飾的情況下，我們優(yōu)化了納米孔的使用以在單分子水平上以單堿基分辨率在蛋白或合成納米孔中解譯DNA。實(shí)例4-用于單分子測(cè)序的單一固態(tài)納米孔的制造從蛋白納米孔到固態(tài)納米孔的轉(zhuǎn)變使得高密度納米孔陣列的制造(獲得高通量單分子電子DNA測(cè)序儀的一個(gè)關(guān)鍵步驟)成為可能。此處，開(kāi)發(fā)了集成的單一固態(tài)納米孔平臺(tái)以基于從蛋白納米孔得到的知識(shí)來(lái)表征聚合酶反應(yīng)中加標(biāo)簽的核苷酸。集成的納米孔平臺(tái)我們開(kāi)發(fā)了專用的集成的低噪聲CMOS電子器件，所述電子器件在與固態(tài)納米孔集成時(shí)，傳達(dá)出優(yōu)于采用外部電生理學(xué)放大器(如Axopatch200B)的“標(biāo)準(zhǔn)”測(cè)量技術(shù)的明顯性能優(yōu)勢(shì)。這些優(yōu)勢(shì)來(lái)自在定制集成放大器設(shè)計(jì)中利用電容性(而非電阻性)反饋。在DC伺服回路中用低噪聲電流源操作來(lái)去除DC電流(其為這種生物電子介面和其它生物電子介面的特征)。與共集成相關(guān)的降低的放大器輸入電容和降低的寄生電容改進(jìn)了在高頻率下的噪聲性能，對(duì)于固態(tài)孔來(lái)說(shuō)能夠?qū)崿F(xiàn)接近1MHz的帶寬。所述高時(shí)間分辨率在與所開(kāi)發(fā)的標(biāo)簽組合時(shí)將提供用于調(diào)整這個(gè)平臺(tái)的高靈活性以達(dá)成高靈敏性和實(shí)時(shí)性能。這種集成CMOS的納米孔(CNP)的使用在雙芯片或單芯片配置中集成了電路，如圖27中所示。在前一種情況下，孔與CNP包裝在一起，如圖27B中所示。在后一種情況下，孔用射流技術(shù)在芯片的任一側(cè)上直接制造于CNP中，如圖27C中所示。在兩種情況下，連接放大器的輸入電路的順式電極直接集成在CNP的表面上。單芯片配置具有可易于規(guī)模放大到多路平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)，以額外的制造復(fù)雜性為代價(jià)。工藝后制造CMOS小片(其在一側(cè)上不大于5mm)的能力是在近五年內(nèi)確立的一種獨(dú)特的能力[黃(Huang)等人2011，雷(Lei)等人2008和萊文(Levine)等人2009]。這種方法完全利用了現(xiàn)有鑄造工藝流程而不需要開(kāi)發(fā)新的工藝。單芯片制造方法通過(guò)調(diào)適標(biāo)準(zhǔn)固態(tài)納米孔制造技術(shù)來(lái)進(jìn)行[羅森斯坦等人2011]。在為傳感器所保留的芯片塊區(qū)域，所有金屬都已經(jīng)被阻隔，留下交替的玻璃填充和氮化硅覆蓋層的厚堆疊。大部分的電介質(zhì)堆疊使用電感耦合的CHF3等離子體蝕刻。使PECVDSi3N4蝕刻掩模沉積在芯片塊的背面并且圖案化之后，使用各向異性的氫氧化鉀蝕刻劑制造硅襯底中的局部開(kāi)口。接著，使用在緩沖氫氟酸中的短暫浸漬將氮化硅的單一50nm層以懸浮膜的形式從原始電介質(zhì)堆疊中分離。最后，用高分辨率透射電子顯微鏡通過(guò)這些氮化物膜鉆出納米孔。這個(gè)系統(tǒng)的測(cè)量噪聲與針對(duì)Axopatch200B的可比的配置的基線噪聲的測(cè)量值一起示于圖28A中。對(duì)于由Axopatch(B＝100kHz)支持的最高帶寬，與Axopatch的9pARMS相比，集成放大器具有3.2pARMS的噪底。在針對(duì)集成放大器表征的最高帶寬(B＝1MHz)下，與通過(guò)將Axopatch反應(yīng)外推超過(guò)其支持的范圍而模擬的247pARMS對(duì)比，噪聲水平是27pARMS(噪聲降低約十倍)。作為一個(gè)比較點(diǎn)，對(duì)于1nA信號(hào)，在1μs中僅有約6250個(gè)離子通過(guò)孔轉(zhuǎn)運(yùn)。集成放大器的21pAVRMS的輸入?yún)⒖荚肼曀皆试S在這種時(shí)間間隔下少到150個(gè)離子的分辨率。同樣重要的是注意到，這種優(yōu)異的電氣性能用集成放大器獲得，所述集成放大器與安裝在機(jī)架上的Axopatch放大器相比占用CMOS芯片上僅0.2mm2的面積，展示出創(chuàng)新電子器件的重要性。當(dāng)納米孔連接到放大器輸入電路時(shí)，1/f噪聲和膜電容的引入使噪聲譜升高超過(guò)開(kāi)放頭場(chǎng)基線。圖28b示出了在這種情況下的典型噪聲譜，分別展示了對(duì)于100kHz和1MHz帶寬的僅10pARMS和163pARMS的噪底。在針對(duì)相同納米孔至多100kHz的Axopatch的情況下展示了所測(cè)量的比較結(jié)果。在100kHz下，針對(duì)CNP的輸入?yún)⒖荚肼暪β蚀嬖诔^(guò)兩倍的減小。如果Axopatch可以在較高帶寬下測(cè)量的話，那么在1MHz下將存在六倍噪聲功率差異。這個(gè)平臺(tái)也允許生物納米孔的集成，提供了甚至更多的靈活性。生物納米孔在脂膜 (通常是1，2-二油?；?sn-甘油基3-磷酸膽堿(DOPC))中形成，所述脂膜在兩個(gè)流體單元之間的特富龍(teflon)膜中的孔洞內(nèi)形成。表面必須對(duì)膜具有足夠的親水性以從單層囊泡形成。監(jiān)測(cè)單元的兩個(gè)腔室之間的導(dǎo)電率，同時(shí)將膜蛋白加入所述單元中的一者中，一旦檢測(cè)到并入即將其沖洗。用于制造納米孔的膜也可以用作脂質(zhì)雙層的固體支撐物，其中將較大的孔洞鉆進(jìn)膜中，在所述膜內(nèi)形成脂質(zhì)雙層[克拉克等人2009；本納等人，2007；霍(Hou)等人，2009；和王(Wang)等人2011]。平坦雙層脂膜(BLM)已用具有納米圖案化孔洞(直徑約100nm)的圖案化的固體支撐物上的不同蛋白通道工程化，以及通過(guò)自組裝單層組件將其直接栓系在金上[阿克塞爾羅德(Axelrod)等人，1976，布耳特曼(Bultmann)等人1991，杜塔(Dutta)等人2010，詹金斯(Jenkins)等人2001，納姆(Nam)等人2006，裴爾格羅德芒熱(Palegrosdemange)等人1991，沈(Shen)等人2009，斯里尼瓦桑(Srinivasan)等人2001，楊(Yang)等人2003，殷(Yin)等人2005]。此外，已展示具有4μm2/s擴(kuò)散系數(shù)的連續(xù)BLM在納米圖案化襯底上形成；SAM-金組件上形成的BLM產(chǎn)生了0.8μm2/s的系數(shù)。兩者都處于代表良好形成的BLM的0.1μm2/s到10μm2/s的理想擴(kuò)散范圍內(nèi)[阿克塞爾羅德等人1976，布耳特曼等人1991]。這些BLM的電氣表征指示了具有1.4GW-mm2電阻的高阻抗膜，使其可用于膜中形成的生物納米孔的進(jìn)一步電分析[奧利佛(Oliver)等人1994，史(Shi)等人2000，維爾曼(Wiehelman)1988]。將聚合酶固定到納米孔負(fù)載表面上聚合酶的大小為約5nm×5nm。接近每個(gè)納米孔的入口安置一個(gè)聚合酶。為了針對(duì)固態(tài)納米孔實(shí)現(xiàn)此，有必要(1)表面上的獨(dú)特位置在CMOS制造期間用官能團(tuán)修飾以結(jié)合聚合酶；(2)位點(diǎn)足夠小使得只可以結(jié)合一個(gè)聚合酶分子；(3)其相隔足夠遠(yuǎn)，使得所釋放的加標(biāo)簽的多磷酸酯擴(kuò)散到鄰近通道幾乎不可能；以及(4)交聯(lián)劑足夠柔韌使得酶在功能上是完整的。聚合酶栓系通過(guò)在孵育期間借助于適當(dāng)濃度的聚合酶溶液組合圖案化的連接點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)，使得連接至多一個(gè)酶分子。用于聚合酶的適當(dāng)栓系點(diǎn)的建立通過(guò)利用用于固態(tài)納米孔的現(xiàn)有制造方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。通常，為了使傳導(dǎo)信號(hào)達(dá)到最大，這些孔通過(guò)使用電子束光刻法使支持的Si3N4膜變薄而形成，從而界定一個(gè)窗口，所述窗口隨后用等離子體蝕刻劑(例如SF6)薄化。接著，在薄化的區(qū)域中使用電子束切除術(shù)鉆出納米孔。由這個(gè)窗口形成的阱(圖29)形成了栓系聚合酶的天然場(chǎng)所，保證了緊密接近于納米孔入口。在蝕刻薄化的窗口之前，原始膜可以用連接材料的包埋外延層擴(kuò)大。一旦窗口被蝕刻，這個(gè)膜即可以變成用于聚合酶連接的選擇性側(cè)壁區(qū)。連接材料包括二氧化硅或金。然而，在二氧化硅的情況下可能存在 有限的選擇性，因?yàn)檠趸镆部梢栽谶m當(dāng)條件下形成于氮化硅表面上。原則上，在二氧化硅表面的情況下，可以使用生物素-抗生蛋白鏈菌素鍵聯(lián)[科爾拉奇(Korlach)等人2008和2010]，利用二氧化硅貼片上的生物素標(biāo)記的PEG分子并且在抗生蛋白鏈菌素存在下孵育生物素末端標(biāo)記的聚合酶。表面的其余部分用聚乙烯基磷酸鈍化。由于以上所引起的問(wèn)題，優(yōu)選的是代替地用經(jīng)氨基官能化的烷硫醇自組裝單層(SAM)修飾金表面[拉芙(Love)等人2005]。這些氨基可以容易地修飾成NHS酯以用于連接聚合酶上的氨基。所述層的厚度和均質(zhì)性通過(guò)橢圓光度法或原子力顯微鏡來(lái)測(cè)定。具有帶正電荷的連接基團(tuán)的5′經(jīng)修飾的核苷酸的開(kāi)發(fā)產(chǎn)生一種系統(tǒng)，其用于使所釋放的標(biāo)簽朝向孔快速擴(kuò)散，而前體核苷酸和DNA被孔排斥。將加標(biāo)簽的核苷酸工程化以便在并入DNA之后，從核苷釋放的標(biāo)簽具有累積的正電荷，而完整標(biāo)簽-核苷酸保持中性。如果根據(jù)已知方法[瓦努努等人2007]使通道帶負(fù)電荷的話，那么這就允許積極地門(mén)控所釋放的標(biāo)簽特異性地通過(guò)檢測(cè)通道。由于除標(biāo)簽以外，存在于反應(yīng)混合物(引物、未反應(yīng)的核苷酸、模板)中的所有其它自由分子都帶負(fù)電荷，故只有攜帶正電荷的所釋放的標(biāo)簽被吸引到通道中，增加了檢測(cè)的特異性并且減小了噪聲。視特定核苷酸堿基而定，在不同標(biāo)簽上可以使用不同數(shù)目的帶電荷的基團(tuán)。因此，標(biāo)簽的累積電荷以及其大小可以用于堿基辨別。在標(biāo)簽并入和釋放之后，如果多磷酸酯被認(rèn)為遮蔽正電荷的話，那么其可以使用二級(jí)反應(yīng)(例如，固定在孔中的第二下游位點(diǎn)處的堿性磷酸酶)去除。帶正電荷的標(biāo)簽可以門(mén)控到帶負(fù)電荷的通道中以用于檢測(cè)和識(shí)別。擴(kuò)散和漂移這個(gè)測(cè)序系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵方面在于鄰近納米孔對(duì)每個(gè)核苷酸的釋放的標(biāo)簽的可靠和適時(shí)的捕獲。條件必須經(jīng)工程化以使得標(biāo)簽快速并且以正確的順序被捕獲。另外，應(yīng)使未并入的標(biāo)簽的捕獲率降到最低，并且來(lái)自鄰近通道的干擾應(yīng)可忽略。在孔的入口處產(chǎn)生阱(如圖29中所示)促進(jìn)此過(guò)程，這也取決于聚合酶與納米孔開(kāi)口的緊密接近程度。納米孔捕獲過(guò)程的分析一般被視為圍繞孔的徑向?qū)ΨQ過(guò)程。幾何形狀決定在電場(chǎng)不存在的情況下，分子傾向于擴(kuò)散離孔較遠(yuǎn)，從而對(duì)抗靜電吸引。在電壓梯度的情況下，存在臨界距離L，在所述臨界距離處，因擴(kuò)散和電泳引起的分子運(yùn)動(dòng)是同等的[格肖等人2007]。這個(gè)臨界距離是離子電流(I)和電解質(zhì)導(dǎo)電率(σ)以及分析物分子的擴(kuò)散常數(shù)(D)和遷移率(μ)的函數(shù)捕獲是一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)過(guò)程，但在距離L處捕獲約50％ 的分子。對(duì)于較短距離，這種可能性增加，并且對(duì)于d＜L/3超過(guò)90％。在這個(gè)過(guò)程中，分子通常在約的時(shí)段內(nèi)被捕獲。通過(guò)將聚合酶置放在納米孔的L/3內(nèi)，幾乎所有分子都被捕獲。也確保了t捕獲與聚合酶并入速率相比明顯較快，從而以正確的順序捕獲堿基。25個(gè)單元的PEG分子在水中的擴(kuò)散系數(shù)的近似值是D＝3e-10m2/s[島田(Shimada)等人2005]，其與相似長(zhǎng)度的ssDNA片段處于相同數(shù)量級(jí)[恩科杜(Nkodo)等人2001]。假設(shè)能斯脫-愛(ài)因斯坦關(guān)系(Nernst-Einsteinrelation)的有效性(盡管這個(gè)關(guān)系對(duì)于聚合物并不總是保持正確)，可以估算隨擴(kuò)散常數(shù)和凈電荷(Q)而變的遷移率接著，針對(duì)這些估算值，在I＝5nA下在1MKC1中--參見(jiàn)下表。+1e+4e50％捕獲2.1nm5.8nm90％捕獲0.7nm1.9nmt捕獲7.1ns114ns實(shí)例5-制造固態(tài)納米孔的陣列除了改進(jìn)的性能以外，只有在集成電子器件的情況下，才有可能制造大規(guī)模平行納米孔陣列。這涉及到圖27C中所示的單芯片拓?fù)洌渲屑{米孔用射流技術(shù)在芯片的任一側(cè)上直接集成到CMOS芯片塊中。用于集成多個(gè)孔的方法也示于圖27C中。在這種情況下，SU-8光刻膠的阱用于使個(gè)別納米孔彼此分離。這是一種與羅思伯格等人2011的方法類似的方法。然而，在羅思伯格等人中，所述阱仍然可以通過(guò)芯片上方的溶液貯器保持“連接”。在本發(fā)明的情況下，由于電絕緣在順式貯器之間是必需的，故PDMS封蓋用來(lái)密封阱以用于在試劑引入之后進(jìn)行測(cè)量，如圖27C中所示。將64個(gè)固態(tài)納米孔集成在相同的5mm×5mm芯片塊上。當(dāng)前集成放大器設(shè)計(jì)(其將必須在每個(gè)孔位點(diǎn)處重復(fù))僅有250μm×150μm，但必須留下額外的空間以用于制造孔本身。由于制造技術(shù)經(jīng)過(guò)進(jìn)一步發(fā)展以減小芯片面積，這可以容易地規(guī)模放大到16×16個(gè)電極的陣列。實(shí)例6-使用磷酸酯加標(biāo)簽的核苷酸和納米孔檢測(cè)的焦磷酸測(cè)序焦磷酸測(cè)序是邊合成邊測(cè)序(SBS)方法，其依賴于檢測(cè)在核苷酸在聚合酶反應(yīng)中并入生長(zhǎng)的DNA鏈時(shí)所釋放的焦磷酸酯[羅納吉(Ronaghi)等人1988]。在這個(gè)方法中，四種dNTP中的每一者與酶混合液、底物以及常用的聚合酶反應(yīng)組分依序加入。如果所加入的核苷酸與模板上第一個(gè)可獲得的堿基互補(bǔ)的話，那么所述核苷酸將被并入并且將 釋放焦磷酸酯。通過(guò)酶級(jí)聯(lián)，所釋放的焦磷酸酯轉(zhuǎn)化成ATP，然后通過(guò)螢火蟲(chóng)螢光素酶轉(zhuǎn)變成可見(jiàn)光信號(hào)。另一方面，如果所加入的核苷酸不被并入的話，那么將不產(chǎn)生光，并且所述核苷酸將僅僅通過(guò)腺苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase)降解。焦磷酸測(cè)序已成功地應(yīng)用于單一核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè)和DNA測(cè)序。開(kāi)發(fā)了一種商業(yè)測(cè)序平臺(tái)，其在個(gè)別微珠粒上組合了焦磷酸測(cè)序和DNA模板擴(kuò)增以達(dá)成高通量DNA測(cè)序[馬古利斯(Margulies)等人2005]。然而，在焦磷酸測(cè)序中，對(duì)于在模板的均聚區(qū)域(例如一串連續(xù)的數(shù)個(gè)T)中測(cè)定并入的核苷酸數(shù)目方面存在固有的困難。除此之外，焦磷酸測(cè)序的其它方面仍然需要改進(jìn)。舉例來(lái)說(shuō)，四種核苷酸中的每一者必須被分別地加入和檢測(cè)。未降解的核苷酸和其它組分的累積也可能會(huì)降低所述方法在對(duì)長(zhǎng)DNA模板進(jìn)行測(cè)序時(shí)的準(zhǔn)確性。這是一種經(jīng)修改的焦磷酸測(cè)序方法，其依賴于檢測(cè)在聚合酶反應(yīng)期間所釋放的標(biāo)簽或標(biāo)簽-磷酸酯。在這個(gè)方法中，磷酸酯加標(biāo)簽的核苷酸用于模板-引物復(fù)合物上聚合酶催化的反應(yīng)中。在加標(biāo)簽的核苷酸并入時(shí)，磷酸酯-標(biāo)簽部分被釋放，其可以通過(guò)穿過(guò)納米孔而檢測(cè)。每個(gè)核苷酸上可以使用相同標(biāo)簽，或者可以使用不同分子量和長(zhǎng)度的標(biāo)簽(如PEG)。已展示不同長(zhǎng)度和質(zhì)量的聚乙二醇(PEG)可以在穿過(guò)溶血素納米孔時(shí)以單分子靈敏性解析[羅伯特森等人2009]。α-溶血素通道可以用于在單分子水平上檢測(cè)核酸[卡西亞諾維奇等人1996]。所述單體多肽在脂質(zhì)雙層中自組裝以形成七聚孔，其具有1.5nm直徑的限制孔。在離子鹽水溶液中，當(dāng)將適當(dāng)電壓施加在膜兩端時(shí)，由α-溶血素通道形成的孔傳導(dǎo)強(qiáng)大并且穩(wěn)定的離子電流。納米孔的限制孔允許線性單鏈而非雙鏈核酸分子(直徑約2.0nm)穿過(guò)。聚陰離子核酸由所施加的電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)通過(guò)所述孔，這阻隔或減小了離子電流。此通過(guò)產(chǎn)生了獨(dú)特的電子信號(hào)。由此，將獲得特定事件圖(其為易位時(shí)間相對(duì)于阻隔電流的曲線)，并且其用于區(qū)分通過(guò)單通道記錄技術(shù)基于圖中的特征參數(shù)(如易位電流、易位持續(xù)時(shí)間和其相應(yīng)的離差)來(lái)區(qū)分聚核苷酸的長(zhǎng)度和組成。已展示在納米孔中產(chǎn)生獨(dú)特的電流阻隔信號(hào)的四種PEG標(biāo)簽經(jīng)選擇與四種核苷酸(A、C、G、T)在末端磷酸酯處偶合。這些新穎核苷酸類似物用于聚合酶反應(yīng)，并且使用納米孔檢測(cè)所釋放的標(biāo)簽以對(duì)所并入的堿基進(jìn)行解碼，如圖14中所示。這個(gè)方法存在幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：1)避免使用許多不同的酶(節(jié)省成本并且降低復(fù)雜性)。2)依序加入單一連接標(biāo)簽的多磷酸核苷或具有連接到每個(gè)核苷酸上的不同標(biāo)簽的所有四種核苷酸。3)使用PEG作為標(biāo)簽，其可以通過(guò)納米孔以單一單元分辨率檢測(cè)。4)當(dāng)標(biāo)簽穿過(guò)納米孔時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)單分子檢測(cè)測(cè)序。5)大規(guī)模平行測(cè)序、低成本和高通量。如圖14中所示，DNA聚合酶被固定到納米孔上，并且將模板-引物與PEG加標(biāo)簽的核苷酸一起加入。在并入正確的PEG加標(biāo)簽的核苷酸時(shí)，所釋放的PEG-磷酸酯穿過(guò)納米孔并且測(cè)量電子阻隔信號(hào)。不同長(zhǎng)度的PEG具有不同阻隔信號(hào)，因此，4種不同的PEG可以用于4種不同核苷酸。核苷酸可以一次加入一個(gè)，如果加入正確核苷酸的話，那么其給出獨(dú)特的阻隔信號(hào)。然而，如果核苷酸與模板核酸堿基不互補(bǔ)的話，那么其不會(huì)被并入并且因此檢測(cè)不到信號(hào)?？梢园创笠?guī)模平行方式構(gòu)筑進(jìn)行所述生化過(guò)程的微米/納米阱的高密度陣列。每個(gè)微米/納米阱容納不同DNA模板和納米孔裝置。所釋放的PEG以單分子靈敏性檢測(cè)。合成標(biāo)簽標(biāo)記的核苷-5′-多磷酸酯的一般方法示于圖30中。末端磷酸酯標(biāo)記的核苷-5′-三磷酸酯、核苷-5′-四磷酸酯、核苷-5′-五磷酸酯或核苷-5′-六磷酸酯可以由相應(yīng)的核苷-5′-三磷酸酯(NTP)起始來(lái)合成。因此，三磷酸酯首先用DCC/DMF激活，其可以與標(biāo)簽-親核試劑直接反應(yīng)，得到連接標(biāo)簽的NTP，或者其可以與連接基團(tuán)親核試劑反應(yīng)，標(biāo)簽-NHS或適當(dāng)激活的標(biāo)簽可以與所述連接基團(tuán)親核試劑反應(yīng)，得到標(biāo)簽-連接基團(tuán)連接的NTP。為了合成連接標(biāo)簽的四磷酸核苷(N4P)或五磷酸核苷(N5P)，所激活的三磷酸酯首先分別與磷酸或焦磷酸酯反應(yīng)，得到四磷酸酯和五磷酸酯，所述四磷酸酯和五磷酸酯可以與連接基團(tuán)親核試劑反應(yīng)，隨后與適當(dāng)激活的標(biāo)簽反應(yīng)。上文在實(shí)例2和實(shí)例3中論述了PEG標(biāo)記的核苷酸的合成。PEG標(biāo)記的核苷酸基于三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯或六磷酸酯的使用具有-3、-4、-5或-6電荷。在聚合酶催化的引物延伸反應(yīng)之后，所釋放的PEG-標(biāo)簽上的凈電荷與起始PEG-核苷酸相比將少一個(gè)(-1)，這足以通過(guò)納米孔離子阻隔信號(hào)加以區(qū)分(未反應(yīng)的PEG-核苷酸與所釋放的PEG-磷酸酯相比也更龐大，因此離子阻隔信號(hào)不同)?；蛘?，如果堿性磷酸酶存在于反應(yīng)混合物中的話，那么所釋放的PEG將是中性的(游離磷酸酯基通過(guò)堿性磷酸酶水解)。所釋放的PEG-標(biāo)簽也可以帶正電荷，如下文所示，以使其可以通過(guò)納米孔容易地檢測(cè)。類似地，其也可以帶高度負(fù)電荷。帶正電荷的連接標(biāo)簽的核苷-多磷酸酯的合成：帶正電荷的連接標(biāo)簽的核苷-多磷酸酯如圖25中所示而合成。首先，使帶正電荷的三甲基-(賴氨酸)n-甘氨酸氨基酸(K[(Me)3]n-Gly)與PEG-NHS酯反應(yīng)，然后被激活，形成PEG-K[(Me)3]n-Gly-NHS酯。這種激活的酯與氨基封端的核苷-多磷酸酯反應(yīng)，如圖 19和圖25中所示。核苷-四磷酸酯上的凈電荷是中性的，但在聚合酶并入之后，所釋放的PEG具有+1正電荷，并且如果向反應(yīng)混合液中加入堿性磷酸酶的話，那么所釋放的PEG上的凈電荷是+4。因此，所釋放的標(biāo)簽可以通過(guò)穿過(guò)納米孔而容易地分離和鑒別。用于使用納米孔檢測(cè)進(jìn)行邊合成邊測(cè)序的3′阻隔的PEG連接的核苷-多磷酸酯的合成除了起始核苷-5′-三磷酸酯是3′-O-阻隔的dNTP以外，3′阻隔的核苷-多磷酸酯的合成基本上遵循與針對(duì)連接標(biāo)簽的核苷-多磷酸酯所展示相同的途徑。如圖31中所示，3′-O-疊氮基甲基-dNTP(6)首先與CDI或DCC/DMF反應(yīng)，隨后與磷酸(四磷酸酯)或焦磷酸酯(五磷酸酯)反應(yīng)。這種物質(zhì)在純化后與適當(dāng)親核試劑反應(yīng)，得到氨基封端的磷酸酯，所述氨基封端的磷酸酯接著與適當(dāng)PEG-NHS酯(中性、帶正電荷或帶負(fù)電荷)反應(yīng)，得到所需的3′-O-阻隔的PEG連接的核苷-多磷酸酯。使用PEG-核苷酸和納米孔檢測(cè)的測(cè)序流程(DNA分子的許多拷貝被固定在珠粒上并且一次依序加入一個(gè)PEG-核苷酸)如圖32中所示，DNA分子被固定在珠粒上。因此，每個(gè)珠粒具有相同DNA分子的許多拷貝。將珠粒加入連接到納米孔上的微米/納米阱中。DNA與DNA聚合酶形成復(fù)合物，所述DNA聚合酶連接到納米孔上或與PEG連接的核苷酸一起加入微米/納米阱中。核苷酸可以一次加入一個(gè)，如果加入正確核苷酸的話，那么其被并入并且釋放PEG-標(biāo)簽，所述PEG-標(biāo)簽在穿過(guò)納米孔時(shí)給出獨(dú)特的阻隔信號(hào)。然而，如果核苷酸與模板核酸堿基不互補(bǔ)的話，那么其不會(huì)被并入并且因此檢測(cè)不到信號(hào)。在這種情況下，可以在所有四種核苷酸上使用相同長(zhǎng)度和分子量的PEG，或必要時(shí)，也可以使用四種不同PEG。因此，核酸堿基的加入可以通過(guò)納米孔阻隔信號(hào)以單分子靈敏性容易地檢測(cè)。使用3′-O-阻隔的PEG-核苷酸和納米孔檢測(cè)進(jìn)行邊合成邊測(cè)序(DNA分子的許多拷貝被固定在珠粒上并且同時(shí)加入所有四種3′-O-阻隔的PEG-核苷酸)DNA的均聚區(qū)域可以使用這個(gè)方法正確測(cè)序。因此，如果核苷酸的3′-OH基團(tuán)由可逆部分阻隔的話，那么在加入僅一個(gè)核苷酸之后DNA合成將停止。所述合成可以在去除阻隔基從而產(chǎn)生游離的3′-OH基團(tuán)之后繼續(xù)。如圖33中所示，所有四種不同大小的PEG連接的3′-O-疊氮基甲基-核苷酸可以加入反應(yīng)微米/納米阱中，并且每當(dāng)正確的核苷酸被并入時(shí)，所釋放的PEG-標(biāo)簽通過(guò)穿過(guò)納米孔而被讀取并且檢測(cè)離子信號(hào)。因?yàn)?′-OH基團(tuán)被阻隔，所以一次僅加入一個(gè)核苷酸。3′-O-阻隔的基團(tuán)可以通過(guò)TECP處理而裂解，并且由此游離的OH基團(tuán)準(zhǔn)備用于進(jìn)一步核苷酸并入。通過(guò)重復(fù)進(jìn)行核苷酸加入和裂解，均聚區(qū)域可以正確并且容易地測(cè)序。使用納米孔的大規(guī)模平行焦磷酸測(cè)序：如圖34中所示，可以按大規(guī)模平行方式構(gòu)筑進(jìn)行所述生化過(guò)程的微米阱的高密度陣列。每個(gè)微米/納米阱容納不同DNA模板和納米孔裝置。所釋放的PEG以單分子靈敏性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)的概述：1)在聚合酶并入之后可以通過(guò)納米孔檢測(cè)的連接到核苷酸的末端磷酸酯上的不同大小、長(zhǎng)度、分子量、電荷的任何標(biāo)簽。2)連接到三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯、六磷酸酯上的標(biāo)簽。3)電子檢測(cè)。4)連接到珠?；蚬腆w表面上的DNA分子的基團(tuán)和單分子檢測(cè)靈敏性(高密度和高靈敏性)。5)通過(guò)使用連接標(biāo)簽的3′-O-阻隔的核苷酸而容易測(cè)序的均聚區(qū)域。6)每個(gè)循環(huán)加入一個(gè)標(biāo)簽-核苷酸。7)共同加入所有四種可逆加標(biāo)簽的核苷酸以對(duì)均聚區(qū)域進(jìn)行測(cè)序。8)高靈敏性、準(zhǔn)確性和速度。9)大規(guī)模平行測(cè)序。參考文獻(xiàn)：1.阿克松M.(Akeson，M.)，布蘭登D.(Branton，D.)，卡西亞諾維奇J.J.(Kasianowicz，J.J.)，布蘭丁E.(Brandin，E.)和迪默D.W.(Deamer，D.W.)單一RNA分子內(nèi)的聚胞苷酸與聚腺苷酸區(qū)段之間的微秒時(shí)間級(jí)辨別(Microsecondtime-scalediscriminationbetweenpolycytidylicacidandpolyadenylicacidsegmentswithinsingleRNAmolecules).生物物理學(xué)雜志(Biophys.J.)1999，77，3227-3233。2.阿克薩緬托夫A.(Aksimentiev，A.)等人，DNA通過(guò)合成納米孔易位的微觀動(dòng)力學(xué)(MicroscopicKineticsofDNATranslocationthroughSyntheticNanopores).生物物理學(xué)雜志(BiophysicalJournal)200487，2086-2097。3.阿斯捷Y.(Astier，Y.)，布拉哈O.(Braha，O.)和貝利H.(Bayley，H.)關(guān)于單分子DNA測(cè)序：通過(guò)使用裝備有分子接頭的工程化蛋白納米孔來(lái)直接鑒別5′-單磷酸核糖核苷和5′-單磷酸脫氧核糖核苷(TowardsinglemoleculeDNAsequencing：directidentificationofribonucleosideanddeoxyribonucleoside5′-monophosphatesbyusinganengineeredproteinnanoporeequippedwithamolecularadapter).美國(guó)化學(xué)會(huì)志(JAmChemSoc)128，1705-10(2006)。4.阿克塞爾羅德D.(Axelrod，D.)，科佩爾D.E.(Koppel，D.E.)，施萊辛格J.(Schlessinger，J.)，艾爾森E.(Elson，E.)和韋布W.W.(Webb，W.W.)通過(guò)熒光漂白恢復(fù)動(dòng)力學(xué)的分析的遷移率測(cè)量(Mobilitymeasurementbyanalysisoffluorescencephotobleachingrecoverykinetics).生物物理學(xué)雜志16，1055-1069(1976)。5.貝利H.測(cè)序DNA單分子(SequencingsinglemoleculesofDNA).化學(xué)生物學(xué)新見(jiàn)(Curr.OpinionChemBiol.)2006，10，628-637。6.本納S.(Benner，S.)等人使用納米孔實(shí)時(shí)序列特異性檢測(cè)個(gè)別DNA聚合酶復(fù)合物(Sequence-specificdetectionofindividualDNApolymerasecomplexesinrealtimeusingananopore).自然·納米技術(shù)(NatNanotechnol)2，718-24(2007)。7.別茲魯科夫S.M.(Bezrukov，S.M.)和卡西亞諾維奇J.J.丙甲菌素和α-溶血素的納米孔中的中性聚合物(Neutralpolymersinthenanoporeofalamethicinandalphα-hemolysin).生物化學(xué)膜(BiologicheskieMembrany)2001，18，453-457。8.博哈里S.H.(Bokhari，S.H.)和索爾J.R.(Sauer，J.R.)，用于用納米孔進(jìn)行DNA測(cè)序的平行圖形分解算法(AParallelGraphDecompositionAlgorithmforDNASequencingwithNanopores).生物信息學(xué)(Bioinformatics)200521(7)，889-896。9.布蘭登D.納米孔測(cè)序(Nanoporesequencing).自然·生物技術(shù)(Nat.Biotechnol.)26，1146-1153(2008)。10.布蘭登D.等人納米孔測(cè)序的潛力和挑戰(zhàn)(Thepotentialandchallengesofnanoporesequencing).自然·生物技術(shù)26，1146-53(2008)。11.布耳特曼T.(Bultmann，T.)，瓦斯W.L.(Vaz，W.L.)，麥羅E.C.(Melo，E.C.)，西斯克R.B.(Sisk，R.B.)和湯普森T.E.(Thompson，T.E.)低共熔的兩組分兩相磷脂酰膽堿雙層中的流體相連接性和翻譯擴(kuò)散(Fluid-phaseconnectivityandtranslationaldiffusioninaeutectic，two-component，two-phasephosphatidylcholinebilayer).生物化學(xué)(Biochemistry)30，5573-9(1991)。12.錢(qián)德勒E.L.(Chandler，E.L.)，史密斯A.L.(Smith，A.L.)，伯登L.M.(Burden，L.M.)，卡西亞諾維奇和伯登D.L.(Burden，D.L.)由同時(shí)單分子光學(xué)和同時(shí)電記錄揭露的穿引DNA的納米孔的膜表面動(dòng)力學(xué)(MembraneSurfaceDynamicsofDNA-ThreadedNanoporesRevealedbySimultaneousSingle-MoleculeOpticalandEnsembleElectricalRecording).蘭茂爾(Langmuir)2004，20，898-905。13.陳P.(Chen，P.)使用制造的納米孔探查單一DNA分子轉(zhuǎn)運(yùn)(ProbingsingleDNAmoleculetransportusingfabricatednanopores).納米快報(bào)(NanoLett.)4，2293-2298 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