專利名稱：用于蛋白質(zhì)表達(dá)的具有未修飾和修飾核苷酸的組合的rna的制作方法
用于蛋白質(zhì)表達(dá)的具有未修飾和修飾核苷酸的組合的RNA本發(fā)明涉及多核糖核苷酸，特別是信使RNA，其包含未修飾和修飾核苷酸的組合，用于蛋白質(zhì)表達(dá)和這種RNA用于治療疾病和診斷程序的應(yīng)用。信使RNA(mRNA)是聚合體，其由主要以腺苷、胞苷、尿苷和鳥(niǎo)苷作為核苷的磷酸核苷結(jié)構(gòu)単元而構(gòu)建，其作為中間載體將遺傳信息從細(xì)胞核中的DNA引入細(xì)胞質(zhì)中，在此其被翻譯為蛋白質(zhì)。因此其適于作為基因表達(dá)的替代物。細(xì)胞中生物化學(xué)過(guò)程的說(shuō)明和人類基因組的說(shuō)明已掲示缺陷型基因與疾病之間的聯(lián)系。因此通過(guò)基因治療治愈由缺陷型基因引起的疾病的愿望由來(lái)已久。預(yù)期很高，但對(duì)此的嘗試卻常常失敗。第一個(gè)基因治療方法包括將缺陷型或缺損型基因的完整DNA在載體中引入細(xì)胞核，從而實(shí)現(xiàn)完整基因的表達(dá)，因此提供缺失或缺損型蛋白質(zhì)。這些嘗試常常不成功，并且不太成功的嘗試伴有明顯的副作用，特別是腫瘤發(fā)生提高。 此外，存在由于蛋白質(zhì)缺少或蛋白質(zhì)缺陷引起的疾病，而其不可歸因于遺傳缺陷。在這種情況下，還對(duì)通過(guò)給予DNA在體內(nèi)生成相關(guān)蛋白質(zhì)給予考慮。在代謝中產(chǎn)生影響并由于病理學(xué)或非病理學(xué)原因被破壞或抑制的因子的提供也可被零或低副作用的核酸治療而影響。mRNA對(duì)于治療遺傳性疾病從而治療導(dǎo)致疾病的基因缺陷的應(yīng)用也已被提出。其中的優(yōu)勢(shì)是mRNA僅必須被引入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，而不必被插入細(xì)胞核中。插入細(xì)胞核非常困難和低效；此外，如果載體或其部分被整合到基因組中，則被改變的染色體DNA存在相當(dāng)?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)。同然，可顯示體外轉(zhuǎn)錄的信使RNA事實(shí)上可在哺乳動(dòng)物的組織中得到表達(dá)，但在利用mRNA治療疾病的嘗試中產(chǎn)生了進(jìn)ー步的障礙。mRNA穩(wěn)定性的缺乏具有哺乳動(dòng)物組織中所需蛋白質(zhì)不能被以足量利用的影響。進(jìn)ー步明顯的劣勢(shì)源于mRNA引起相當(dāng)?shù)拿庖邔W(xué)反應(yīng)的事實(shí)。假設(shè)這些強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)通過(guò)結(jié)合Toll型受體如TLR3、TLR7、TLR8和解旋酶RIG-I而產(chǎn)生。為防止免疫學(xué)反應(yīng)，WO 2007/024708提出利用其中四分之一的核糖核苷酸被修飾核苷酸取代的RNA。特別是，考察了在尿苷完全被假尿苷取代時(shí)mRNA如何行為。發(fā)現(xiàn)這種RNA分子具有明顯減少的免疫原性。但是，這些產(chǎn)物的生物學(xué)活性還不足以進(jìn)行成功的治療。此外，發(fā)現(xiàn)其中兩種或更多種類型的核苷酸完全被修飾替代的RNA序列很難制成或根本無(wú)法制成。為能夠?yàn)樯眢w提供必要的或有益的蛋白質(zhì)和/或提供核酸以治療由于缺失的或缺陷型蛋白質(zhì)引起的疾病，需要具有可轉(zhuǎn)染細(xì)胞的可利用的核酸，其在細(xì)胞中足夠長(zhǎng)時(shí)間地保持穩(wěn)定并提供足量的蛋白質(zhì)，從而避免過(guò)度頻繁的施藥。但是同時(shí)，這種核酸必須不導(dǎo)致明顯程度的免疫學(xué)反應(yīng)。因此本發(fā)明的目的是提供這樣的劑其適用于治療缺陷型或缺損型基因引起的疾病或缺失或缺損型蛋白質(zhì)引起的疾??；或可體內(nèi)產(chǎn)生必要的或有益的蛋白質(zhì)，其引起顯著減少的免疫應(yīng)答或不引起免疫應(yīng)答，在生理環(huán)境中穩(wěn)定，即在給予后不立即降解，并且總體上適于作為治療劑。進(jìn)一歩，本發(fā)明的目的是提供這樣的劑用于治療可被蛋白質(zhì)的體內(nèi)生成積極影響的疾病。該問(wèn)題由權(quán)利要求I限定的多核糖核苷酸解決。特別適合的是mRNA，其編碼蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，所述蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的缺陷或缺失不利于身體或其表達(dá)有利于身體。當(dāng)下文使用術(shù)語(yǔ)“多核糖核苷酸”或“ mRNA”時(shí)，除非上下文另外陳述，應(yīng)始終假定其為編碼與疾病或缺失有關(guān)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段——如上所述——或編碼有益或支持身體的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的多核糖核苷酸或mRNA。已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，如果應(yīng)用既包含未修飾核苷酸也包含修飾核苷酸的RNA，上述問(wèn)題可由核糖核酸或多核糖核苷酸(下文也一般被稱為RNA)解決，特別是由信使RNA(mRNA)解決，重要的是，預(yù)定含量的尿苷和胞苷核苷酸分別以修飾形式存在。進(jìn)ー步，已令人驚訝地觀察到，其中兩種類型的核苷酸分別部分被修飾核苷酸替代的RNA顯示高翻譯和轉(zhuǎn)染效力，即RNA比已知RNA所可能的轉(zhuǎn)染更多的細(xì)胞，并且每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生更多的編碼蛋白質(zhì)。此外，根據(jù)本發(fā)明修飾的RNA比由本領(lǐng)域狀態(tài)已知的RNA或未修飾的RNA的活性更長(zhǎng)。 根據(jù)本發(fā)明所述的RNA實(shí)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)未修飾和完全修飾的RNA均不可得到。已發(fā)現(xiàn)，如果mRNA中修飾尿苷和胞苷核苷酸的含量均被具體限定并且為至少5%和不高于50%，可實(shí)現(xiàn)免疫-原性減少以及穩(wěn)定性増加。如果應(yīng)用無(wú)修飾的mRNA，其極具免疫原性，而當(dāng)全部尿苷和胞苷核苷酸均以修飾形式存在吋，生物學(xué)活性對(duì)于以治療為目的的應(yīng)用過(guò)低，而不具備可能性。其中修飾核苷酸的含量極高的RNA可在非常艱難的條件下生成或根本不能生成。因此，已確定，僅包含替代尿苷的假尿苷和僅包含修飾胞嘧啶和/或修飾腺苷的核苷酸混合物不能生成任何RNA序列。但是令人驚訝地，根據(jù)本發(fā)明所述的方式修飾的RNA序列可被容易地生成，并具有合理的效カ。此外，已發(fā)現(xiàn)，修飾的性質(zhì)至關(guān)重要。根據(jù)本發(fā)明修飾的mRNA顯示低免疫原性，并具有長(zhǎng)壽命。已發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明所述的RNA的穩(wěn)定性與之前應(yīng)用的核酸相比得到顯著提高。因此，已確定，根據(jù)本發(fā)明所述的mRNA在轉(zhuǎn)染后10天可被檢測(cè)到比未修飾的RNA高10倍的量。増加的壽命以及高轉(zhuǎn)染率首先使根據(jù)本發(fā)明所述的mRNA能用于治療目的，因?yàn)楦叻€(wěn)定性和由此而來(lái)的長(zhǎng)壽命使其能夠在較長(zhǎng)的時(shí)間間隔下完成給藥，因此其也可被患者接受。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了用于治療目的的特別有利的劑。根據(jù)本發(fā)明所述的RNA滿足如下需要被置于治療所用的產(chǎn)物上作為RNA其僅需被引入細(xì)胞質(zhì)，無(wú)需被引入細(xì)胞核以發(fā)揮其活性，整合到基因組中的危險(xiǎn)不存在，根據(jù)本發(fā)明所述的修飾類型很大程度地防止免疫反應(yīng)，此外修飾防止RNA迅速降解。因此用根據(jù)本發(fā)明所述的RNA能夠在組織中產(chǎn)生或重新產(chǎn)生生理學(xué)功能，例如恢復(fù)已經(jīng)由于缺陷型或缺損型基因而喪失的體內(nèi)功能，從而治療缺陷型或缺損型基因引起的疾病。進(jìn)一歩，已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明所述的多核糖核苷酸可有利地影響疾病，原因是蛋白質(zhì)在體內(nèi)生成，其可直接或間接對(duì)病程造成影響。因此，根據(jù)本發(fā)明，也可提供這樣的多核糖核苷酸其編碼在總體情況或具體情況下有益于和支持身體的因子，例如生長(zhǎng)因子、血管發(fā)生因子、刺激因子、誘導(dǎo)因子、酶或其他生物活性分子。以下描述和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。圖I顯示不同核苷酸修飾對(duì)不同mRNA的免疫原性和穩(wěn)定性的影響。圖IA是對(duì)給予具有不同修飾核苷酸的各種RNA后的TNF- α水平作圖的圖。未修飾和高達(dá)25%單修飾的RNA導(dǎo)致這種RNA的高炎性標(biāo)記水平，并顯示高免疫原性，而對(duì)于根據(jù)本發(fā)明雙修飾的RNA，炎性標(biāo)記以可耐受量存在。圖IB和IC顯示人類細(xì)胞和小鼠細(xì)胞中以多種方式修飾的mRNA的生物學(xué)活性(轉(zhuǎn)染效カ和表達(dá))，為紅色熒光蛋白質(zhì)(RFP)的陽(yáng)性細(xì)胞的百分率和每個(gè)細(xì)胞的RFP量。該圖顯示，未修飾、單修飾和完全修飾的RNA編碼的蛋白質(zhì)僅可被檢測(cè)到較低的百分含量，而根據(jù)本發(fā)明部分雙修飾的RNA由于其較高的穩(wěn)定性生成明顯較高的蛋白質(zhì)量。圖2顯示多修飾(multiply modified)mRNA較高的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的表達(dá)持續(xù)時(shí)間。圖2A和2B分別顯示對(duì)不同的修飾和未修飾mRNA的表達(dá)持續(xù)時(shí)間作圖的圖。圖2C顯示未修飾RNA、單修飾(singly modified) RNA和多修飾RNA的RNA免疫沉淀數(shù)據(jù)。圖2D顯示對(duì)體內(nèi)靜脈內(nèi)給藥后不同mRNA的免疫原性作圖的圖。數(shù)據(jù)顯示，根據(jù)本發(fā)明雙修飾的RNA呈現(xiàn)高穩(wěn)定性和低免疫原性的組合。圖3顯示SP-B條件性缺陷型小鼠的中的修飾SP-B mRNA的氣管內(nèi)氣溶膠應(yīng)用后得到的多個(gè)測(cè)試結(jié)果。圖3A顯示用未修飾RNA和多修飾RNA治療的小鼠的肺的生物發(fā)光 圖像。明顯可見(jiàn)的是，5天后僅根據(jù)本發(fā)明修飾的RNA仍表達(dá)足量的蛋白質(zhì)，而未修飾RNA的表達(dá)在3小時(shí)后就已經(jīng)很低。圖3B顯示將通量相對(duì)于轉(zhuǎn)染后時(shí)間作圖的圖。明顯可見(jiàn)，根據(jù)本發(fā)明所述的修飾延長(zhǎng)了表達(dá)持續(xù)時(shí)間。圖3C顯示SP-B mRNA的用藥計(jì)劃。圖3D顯示呈現(xiàn)將用修飾mRNA治療的小鼠與用對(duì)照mRNA治療的小鼠的存活率進(jìn)行比較的圖，用根據(jù)本發(fā)明所述的RNA治療的小鼠的存活率顯著更長(zhǎng)。圖3E顯示免疫染色，其中可見(jiàn)用根據(jù)本發(fā)明所述的編碼SP-B的RNA可重建SP-B缺陷型小鼠的SP-B。圖3F顯示，由半定量蛋白質(zhì)印跡分析得到的在無(wú)細(xì)胞BALF上清液中的蛋白質(zhì)分布。圖3G和H顯示根據(jù)3C治療的小鼠的肺組織學(xué)制備物和支氣管肺泡灌洗制備物的圖像。當(dāng)已接受對(duì)照RNA的小鼠的肺和灌洗制備物顯示SP-B缺陷常見(jiàn)的肺損傷時(shí)，用根據(jù)本發(fā)明所述的RNA治療的小鼠的制備物無(wú)病理。圖31顯示關(guān)于肺隨時(shí)間的耐受性的圖。在根據(jù)本發(fā)明所述的RNA的治療下，肺功能保持較長(zhǎng)的時(shí)間，而在用對(duì)照RNA治療的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)肺損傷。圖4顯示將未修飾和不同修飾的mRNA產(chǎn)生的RFP的熒光強(qiáng)度相對(duì)于時(shí)間作圖的圖。與未修飾mRNA相比，修飾mRNA較晚被翻譯并且強(qiáng)度較弱。圖5顯示對(duì)用不同mRNA治療的小鼠的炎性標(biāo)記作圖的三個(gè)圖。明顯可見(jiàn),根據(jù)本發(fā)明修飾的RNA不導(dǎo)致炎性反應(yīng)，而未修飾RNA導(dǎo)致強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。圖6顯示對(duì)用根據(jù)本發(fā)明所述的不同mRNA治療的小鼠的不同典型肺參數(shù)作圖的圖。該參數(shù)為組織弾性(HL)、組織阻尼(GL)、組織慣性、呼吸道阻力(Rn)和肺組織組成Eta(GL/HL)。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明所述的RNA，沒(méi)有參數(shù)比陽(yáng)性對(duì)照組更差。圖7在圖中顯示不同修飾mRNA的表達(dá)能力，在該圖中對(duì)具有不同含量的修飾核苷酸的mRNA的RFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分含量作圖。比較顯示，僅根據(jù)本發(fā)明修飾的mRNA在人類細(xì)胞以及及同樣在小鼠細(xì)胞中均導(dǎo)致持久表達(dá)，而非根據(jù)本發(fā)明修飾的mRNA以較低的程度表達(dá)。圖8在圖中顯示不同修飾mRNA的表達(dá)能力，在該圖中對(duì)具有不同修飾核苷酸的mRNA的RFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分含量作圖。比較顯示，僅根據(jù)本發(fā)明修飾的mRNA在人類細(xì)胞以及同樣在小鼠細(xì)胞中均導(dǎo)致持久表達(dá)，而非根據(jù)本發(fā)明修飾的mRNA以較低的程度表達(dá)。
圖9顯示凍干的根據(jù)本發(fā)明所述的RNA的穩(wěn)定性。圖IOA顯示對(duì)不同修飾核苷酸的轉(zhuǎn)染效力作圖的圖。明顯可見(jiàn)，其中10%尿苷核苷酸和10%胞苷核苷酸以及任選地5%進(jìn)ー步核苷酸被修飾的RNA實(shí)現(xiàn)最高的轉(zhuǎn)染效力。圖IOB顯示對(duì)具有不同修飾核苷酸的RNA的TNF-α生成——作為免疫學(xué)反應(yīng)標(biāo)記——作圖的圖。這些是各自用SygmRNA轉(zhuǎn)染的人類PBMC的ELISA結(jié)果。除非另外說(shuō)明，修飾率各自為10%。明顯可見(jiàn)，其中5至50%之間的尿苷核苷酸和胞苷核苷酸修飾的RNA與未修飾的RNA相比具有明顯降低的免疫原性。

圖11顯示多個(gè)測(cè)試的結(jié)果，由其測(cè)定根據(jù)本發(fā)明修飾的編碼EPO的mRNA的穩(wěn)定性和免疫原性。圖11 (a)顯示在給予以不同方式修飾的編碼EPO的mRNA后14天可檢測(cè)到的促紅細(xì)胞生成素含量。明顯可見(jiàn)，14天后注入根據(jù)本發(fā)明修飾的mRNA的小鼠中的EPO含 量比未治療的小鼠高4. 8倍，但也比用未修飾的RNA治療的小鼠高4. 8倍，并且仍比用單修飾的RNA治療的小鼠高2. 5倍。 圖11 (b)顯示在給予具有不同修飾的編碼EPO的mRNA后14天和28天的紅細(xì)胞壓積值。該圖清楚顯示，用根據(jù)本發(fā)明修飾的mRNA治療的小鼠具有的明顯較高的紅細(xì)胞壓積值。在圖11(c)的圖中，對(duì)免疫學(xué)反應(yīng)的一般性因子的生成作圖。發(fā)現(xiàn)在給予未修飾mRNA下所有四種炎性標(biāo)記全部提高，而在給予根據(jù)本發(fā)明修飾的RNA下免疫學(xué)反應(yīng)幾乎不可檢測(cè)到。圖11 (d)的圖顯示IFN-α和IL-12的相應(yīng)值，其也是炎性標(biāo)記。在此同樣發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明修飾的mRNA實(shí)際上不引起免疫學(xué)反應(yīng)，與未修飾mRNA形成對(duì)比。圖12顯示對(duì)在一周兩次給予根據(jù)本發(fā)明修飾的SP-B mRNA (B)或在28天一周兩次給予根據(jù)本發(fā)明修飾的SP-B mRNA (C)或在對(duì)照組給予修飾EGFPLucmRNA (A)的三組小鼠的存活率作圖的圖。發(fā)現(xiàn)只有小鼠被給予SP-B mRNA(BX)才能存活。不提供SP-B mRNA,則小鼠死亡(A)。圖13顯示給予未修飾的SP-B mRNA、根據(jù)本發(fā)明修飾的SP-B mRNA或SP-B質(zhì)粒DNA后8小時(shí)小鼠支氣管肺泡灌洗的細(xì)胞因子水平。結(jié)果顯示，與氣管內(nèi)給予未修飾的mRNA或質(zhì)粒DNA——各自導(dǎo)致炎性標(biāo)記IFN Y和IL-12顯著增加——相反，在給予根據(jù)本發(fā)明修飾的SP-B mRNA下，炎性標(biāo)記與未治療的組或全氟碳治療組相比實(shí)際上沒(méi)有増加。圖14顯示在重復(fù)給予根據(jù)本發(fā)明修飾的mEPO mRNA后得到的紅細(xì)胞壓積值。結(jié)果顯示，重復(fù)給予根據(jù)本發(fā)明修飾的mEPO mRNA被良好地耐受，并且造成紅細(xì)胞壓積持久升聞。圖15顯示與鈦植入體溫育的細(xì)胞的熒光素酶表達(dá)，該鈦植入體被提供有包含不同形式的根據(jù)本發(fā)明修飾的RNA的涂層。發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明修飾的RNA——其被包含在已施加于鈦板上的延遲釋放的聚合物涂層中并且逐漸自其釋放——沒(méi)有喪失其活性。圖16顯示施加于鈦植入體上、包含修飾mRNA的涂層的熒光素酶表達(dá)。發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明修飾的mRNA的蛋白質(zhì)表達(dá)與未處理的RNA相比大幅提高，但也高于質(zhì)粒DNA。圖17A和17B分別顯示具有微RNA 142_3p的微RNA結(jié)合位點(diǎn)的mRNA的RFP-陽(yáng)性細(xì)胞的相對(duì)含量和相對(duì)RFP表達(dá)。發(fā)現(xiàn)具有微RNA結(jié)合位點(diǎn)的RNARFP-陽(yáng)性細(xì)胞的含量較低，并且包含相應(yīng)微RNA 142-3p的細(xì)胞中的編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯較低。圖18顯示通過(guò)并入編碼RFP的微RNA結(jié)合位點(diǎn)修飾的RNA的序列。以灰色背景顯示RFP序列。帶有間隔序列(無(wú)背景)的微RNA 142-3p的微RNA結(jié)合位點(diǎn)的四倍串聯(lián)重復(fù)(淺灰色背景)具有下劃線。根據(jù)本發(fā)明，提供了具有部分多修飾核苷酸、部分多修飾mRNA、IVT mRNA的多核糖核苷酸分子和該RNA分子用于生成治療由于缺陷型或缺損型基因引起的疾病或治療通過(guò) 體內(nèi)提供蛋白質(zhì)如因子、刺激因子、誘導(dǎo)因子或酶緩解或治愈的疾病的藥物的應(yīng)用。在進(jìn)ー步的實(shí)施方式中，將根據(jù)本發(fā)明所述的mRNA與靶結(jié)合位點(diǎn)、靶向序列和/或與微RNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而使所需mRNA的活性僅存在于相關(guān)的細(xì)胞中。在進(jìn)ー步的實(shí)施方式中，將根據(jù)本發(fā)明所述的RNA與微RNA或shRNA下游的3，聚A尾部結(jié)合。在進(jìn)ー步的實(shí)施方式中，提供了其作用持續(xù)時(shí)間已通過(guò)進(jìn)ー步特定修飾被調(diào)節(jié)或延長(zhǎng)的RNA。因此，本發(fā)明的主題是穩(wěn)定性提高并且免疫原性降低的RNA。根據(jù)本發(fā)明所述的RNA可以本身已知的方式制成。通常，其通過(guò)轉(zhuǎn)錄編碼完整或所需的可對(duì)疾病或其中的引發(fā)疾病的缺失或缺陷形式產(chǎn)生影響的蛋白質(zhì)的DNA而制成。在本發(fā)明的上下文中，應(yīng)理解RNA意為如下任何多核糖核苷酸分子如果其進(jìn)入細(xì)胞，則適于蛋白質(zhì)或其片段表達(dá)；或可被翻譯為蛋白質(zhì)或其片段。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”在此包括任何種類的氨基酸序列——即各自通過(guò)肽鍵連接的兩種或更多種氨基酸的鏈，也包括肽和融合蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明所述的RNA包含編碼如下蛋白質(zhì)或其片段的核糖核苷酸序列所述蛋白質(zhì)或其片段在細(xì)胞中或細(xì)胞周圍的功能是需要或有益的，例如這樣的蛋白質(zhì)，其缺失或缺損型形式引起疾病或病癥、其的提供可緩解或預(yù)防疾病或病癥或其可在細(xì)胞中或細(xì)胞周圍促進(jìn)有益于身體的過(guò)程。通常，根據(jù)本發(fā)明所述的RNA包含完整蛋白質(zhì)或其功能性變體的序列。進(jìn)ー步，核糖核苷酸序列可編碼充當(dāng)因子，誘導(dǎo)因子、調(diào)節(jié)因子、刺激因子或酶的蛋白質(zhì)或其功能性片段，其中該蛋白質(zhì)是其功能為治療疾病——特別是代謝疾病——或?yàn)閱?dòng)體內(nèi)過(guò)程如新血管、組織等的形成所必需的蛋白質(zhì)。在此，功能性變體被理解意為在細(xì)胞中可承擔(dān)如下蛋白質(zhì)的功能的片段其在細(xì)胞中的功能是被需要的或其缺失或缺損型形式是致病的。此外，根據(jù)本發(fā)明所述的RNA還可具有進(jìn)ー步的功能區(qū)和/或3’或5’非編碼區(qū)。3’和/或5’非編碼區(qū)可以是天然地在編碼蛋白質(zhì)或其他有助于RNA穩(wěn)定的人造序列的側(cè)翼的區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)可發(fā)現(xiàn)在各種情況下對(duì)此適合的序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，RNA包含m7GpppG帽、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和/或3’末端的多A尾部，特別是從而提高翻譯。RNA可具有促進(jìn)翻譯的進(jìn)ー步區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明所述的RNA的關(guān)鍵是其修飾核苷酸的含量。根據(jù)本發(fā)明所述的穩(wěn)定性提高和免疫原性降低的RNA通過(guò)將其中修飾胞苷核苷酸和修飾尿苷核苷酸的含量被設(shè)定的核苷酸混合物用于其生產(chǎn)而得到。根據(jù)本發(fā)明所述的RNA優(yōu)選地用包含未修飾以及修飾核苷酸的核苷酸混合物生產(chǎn)，其中5至50%的胞苷核苷酸和5至50%的尿苷核苷酸被修飾。包含腺苷和鳥(niǎo)苷的核苷酸可未被修飾。也可應(yīng)用其中ATP和/或GTP中的一些也被修飾的核苷酸混合物，其中其含量應(yīng)不超過(guò)20%，并且其中其含量——如存在——應(yīng)優(yōu)選在O. 5至10%的范圍內(nèi)。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供了具有5至50%修飾胞苷核苷酸和5至50%尿苷核苷酸和50至95 %未修飾胞苷核苷酸和50至95 %未修飾尿苷核苷酸的mRNA，并且腺苷和鳥(niǎo)苷核苷酸可以是未修飾的或部分修飾的，并且它們優(yōu)選以未修飾形式存在。優(yōu)選10至35%的胞苷和尿苷核苷酸是修飾的，特別優(yōu)選修飾胞苷核苷酸的含量在7. 5至25%的范圍內(nèi)并且修飾尿苷核苷酸的含量在7. 5至25%的范圍內(nèi)。已發(fā)現(xiàn)，事實(shí)上，相對(duì)低的含量，例如分別僅10 %的修飾胞苷和尿苷核苷酸，在其為根據(jù)本發(fā)明所述的修飾的先決條件下可實(shí)現(xiàn)所需性質(zhì)。核苷修飾的本質(zhì)對(duì)mRNA的穩(wěn)定性從而壽命和生物學(xué)活性具有影響。適當(dāng)?shù)男揎?br> 在下表中顯不
權(quán)利要求
1.具有編碼蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的序列的多核糖核苷酸，其中所述多核糖核苷酸包含未修飾和修飾核苷酸的組合，其中5至50%的尿苷核苷酸和5至50%的胞苷核苷酸分別為修飾的尿苷核苷酸和修飾的胞苷核苷酸。
2.具有編碼蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的序列的多核糖核苷酸，其可得自核苷酸ATP、GTP、CTP和UTP的核苷酸混合物，其中5至50%的胞苷核苷酸和5至50%的尿苷核苷酸被修飾。
3.權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的多核糖核苷酸，其特征在于所述多核糖核苷酸是mRNAo
4.權(quán)利要求3所述的多核糖核苷酸，其特征在于所述mRNA是體外轉(zhuǎn)錄的mRNA(IVTmRNA)。
5.前述權(quán)利要求中的一項(xiàng)所述的多核糖核苷酸，其特征在于所述RNA編碼蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，所述蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的缺陷或缺失可引起疾病，所述蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段可緩解、預(yù)防或治愈疾病或可有助于有益的或必要的功能。
6.前述權(quán)利要求中的一項(xiàng)所述的多核糖核苷酸，其特征在于15至30%，優(yōu)選地7. 5至.25%的尿苷核苷和15至30%，優(yōu)選地7. 5至25%的胞苷核苷被修飾。
7.前述權(quán)利要求中的一項(xiàng)所述的多核糖核苷酸，其特征在于其包含至少兩種類型的修飾尿苷核苷和/或至少兩種類型的修飾胞苷核苷。
8.權(quán)利要求7所述的多核糖核苷酸,其特征在于至少一種類型的修飾尿苷核苷和/或胞苷核苷具有用于連接一個(gè)或多個(gè)功能載體的官能團(tuán)，作為修飾。
9.前述權(quán)利要求中的一項(xiàng)所述的多核糖核苷酸，其特征在于修飾尿苷選自2-硫尿苷、.5-甲基尿苷、假尿苷、5-甲基尿苷5’ -三磷酸(m5U)、5_碘尿苷5’ -三磷酸(I5U)、4-硫尿苷5’ -三磷酸(S4U)、5_溴尿苷5’ -三磷酸(Br5U)、2’ -甲基-2’ -脫氧尿苷5’ -三磷酸(U2，m)、2’ -氛基-2’ -脫氧尿昔5’ - 二憐酸(U2，NH2)、2’ -疊氣基-2’ -脫氧尿昔5’ - 二磷酸(U2，N3)和2’ -氟-2，-脫氧尿苷5，-三磷酸(U2，F(xiàn))。
10.前述權(quán)利要求中的一項(xiàng)所述的多核糖核苷酸，其特征在于修飾胞苷選自5-甲基胞苷、3-甲基胞苷、2-硫代-胞苷、2’ -甲基_2’ -脫氧胞苷5’ -三磷酸(C2’ m)、2’ -氨基-2’ -脫氧胞苷5’ -三磷酸(C2，NH2)、2’ -氟-2’ -脫氧胞苷5’ -三磷酸(C2，F(xiàn))、5_碘胞苷5’-三磷酸(I5U)、5-溴胞苷5’-三磷酸(Br5U)和2’-疊氮基-2’-脫氧胞苷5’-三磷酸(C2，N3)。
11.前述權(quán)利要求中的一項(xiàng)所述的多核糖核苷酸，其特征在于其在5’末端具有m7GpppG帽和/或至少一個(gè)IRES和/或多A尾部。
12.前述權(quán)利要求中的一項(xiàng)所述的多核糖核苷酸，其用于轉(zhuǎn)錄體替代治療。
13.前述權(quán)利要求中的一項(xiàng)所述的多核糖核苷酸，其特征在于其包含mRNA序列，所述mRNA序列編碼至少一種總體上或在特定情況下有益于和支持身體的因子。
14.前述權(quán)利要求中的一項(xiàng)所述的多核糖核苷酸，其特征在于其包含RNA序列，所述RNA序列編碼生長(zhǎng)因子、血管發(fā)生因子、刺激因子、誘導(dǎo)因子、酶或其他生物活性分子。
15.前述權(quán)利要求中的一項(xiàng)所述的多核糖核苷酸，其特征在于其包含mRNA序列，所述RNA序列編碼表面活性蛋白B (SP-B)、EPO、ABCA3、BMP-2或其片段。
16.權(quán)利要求13所述的多核糖核苷酸，其包含編碼SP-B的序列，用于治療新生兒呼吸窘迫綜合征。
17.權(quán)利要求13所述的多核糖核苷酸，其包含編碼EPO的序列，用于治療EPO缺陷。
18.權(quán)利要求13所述的多核糖核苷酸，其包含至少一種編碼生長(zhǎng)因子、血管發(fā)生因子、刺激因子、誘導(dǎo)因子或酶的序列，用于植入體的涂層。
19.前述權(quán)利要求中的一項(xiàng)所述的多核糖核苷酸，進(jìn)一步包含至少一個(gè)靶序列或在靶細(xì)胞中不表達(dá)的內(nèi)源微RNA的靶定序列。
20.權(quán)利要求8所述的多核糖核苷酸，其特征在于所述功能載體是靶序列、PEG基團(tuán)和/或靶向配體。
21.藥物組合物，包含至少一種前述權(quán)利要求中的一項(xiàng)所述的RNA和藥學(xué)可接受的添加劑。
22.權(quán)利要求21所述的藥物組合物，其是氣管內(nèi)和/或肺部給予的形式，或是施用于植入體上的層的形式。
23.權(quán)利要求22所述的藥物組合物，其另外包含用于在給予包含RNA的組合物前或期間給予的至少一種全氟碳。
24.權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其包含全氟碳和S2U(a25)m5C(a25)SP-BmRNA。
25.植入體，其具有權(quán)利要求I至20中的一項(xiàng)所述的修飾RNA的涂層，所述修飾RNA在作為載體的延遲釋放的聚合物中。
26.權(quán)利要求25所述的植入體，其是牙齒植入體、髖內(nèi)用假體，膝內(nèi)用假體或脊椎融合體。
27.權(quán)利要求25或26所述的植入體，其中所述載體聚合物包含至少一種類型的修飾RNA。
28.權(quán)利要求25至27中的一項(xiàng)所述的的植入體，其中所述載體聚合物包含編碼至少一種對(duì)植入有益的蛋白質(zhì)的RNA。
29.權(quán)利要求25至28中的一項(xiàng)所述的的植入體，其中所述載體聚合物包含編碼一種或多種生長(zhǎng)因子和一種或多種血管發(fā)生因子的RNA。
30.篩選核苷酸序列從而測(cè)試免疫原性和表達(dá)性質(zhì)的方法，其中使RNA序列接觸至少一種選自TLR3、TLR3、TLR8和解旋酶RIG-I的受體，并且測(cè)定結(jié)合能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有編碼蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的序列的多核糖核苷酸，其中該多核糖核苷酸包含未修飾和修飾核苷酸的組合，其中5至50％的尿苷核苷酸和5至50％的胞苷核苷酸為修飾的尿苷核苷酸和修飾的胞苷核苷酸。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102695525SQ201080045543
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2010年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者C·魯?shù)婪? M·柯?tīng)柭?申請(qǐng)人:埃澤瑞斯公司