抗HIV-1多肽及其用途技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一類多肽，特別是一類抗HIV-1或其它相關(guān)包膜類病毒的多肽，以及所述多肽在制備HIV融合抑制劑中的用途，在制備用于治療或預(yù)防HIV感染相關(guān)疾病尤其是艾滋病的藥物中的用途，以及在制備用于治療或預(yù)防其它相關(guān)包膜類病毒感染藥物中的用途。

背景技術(shù)：
Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)是艾滋病的病原體，現(xiàn)全球有超過(guò)3000萬(wàn)感染者，每年導(dǎo)致約200萬(wàn)人死亡，并且每年還有新增約200萬(wàn)感染者，是一種嚴(yán)重威脅人類健康的全球性感染疾病。HIV-1通過(guò)其包膜糖蛋白(Env)介導(dǎo)的病毒-細(xì)胞膜融合感染宿主細(xì)胞。Env包含表面亞基gp120和跨膜亞基gp41，三個(gè)Env形成非共價(jià)復(fù)合體鑲嵌在病毒表面。表面亞基gp120負(fù)責(zé)病毒感染細(xì)胞過(guò)程中的分子識(shí)別以找到和接近靶細(xì)胞，同時(shí)起著穩(wěn)定跨膜亞基gp41的功能，并在適當(dāng)時(shí)機(jī)釋放出gp41以啟動(dòng)融合；跨膜亞基gp41是病毒-細(xì)胞膜融合的直接功能分子。病毒細(xì)胞融合過(guò)程中有一由gp41N-端螺旋區(qū)和C-端螺旋區(qū)(NHR和CHR)形成的六螺旋結(jié)構(gòu)；該結(jié)構(gòu)的形成為病毒-細(xì)胞膜融合提供能量，對(duì)病毒-細(xì)胞融合至關(guān)重要。阻止六螺旋形成的藥物可有效抑制艾滋病毒-細(xì)胞膜融合，從而阻止病毒感染和體內(nèi)傳播，用于艾滋病治療，因此稱為融合抑制劑。晶體結(jié)構(gòu)顯示在六螺旋中，三個(gè)由NHR形成的螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成內(nèi)核，形成三個(gè)溝槽，三個(gè)CHR反平行結(jié)合在溝槽中。外源CHR多肽可結(jié)合在NHR靶點(diǎn)中形成無(wú)活性的六螺旋結(jié)構(gòu)，阻止內(nèi)源的活性六螺旋體生成，抑制病毒-細(xì)胞融合和病毒感染，從而用作融合抑制劑。典型的C-肽融合抑制劑包括C34(US6,150,088)及其改進(jìn)多肽、首個(gè)上市融合抑制劑T20(US5,464,933)、以及后來(lái)發(fā)現(xiàn)的CP32(CN1793170，CN1955190)。這些C-肽融合抑制劑通過(guò)與其對(duì)應(yīng)NHR靶點(diǎn)結(jié)合阻止病毒感染；典型的靶點(diǎn)包括N36(US6,150,088)和DP107(US5,656,480)，分別與C34和CP32結(jié)合形成六螺旋結(jié)構(gòu)，其中N36和DP107中含有一個(gè)共同的結(jié)合口袋，與CHR的WaaWaaaI(其中a為氨基酸)模板(又稱WWI模板)有關(guān)鍵相互作用，也是小分子融合抑制劑的熱門(mén)靶點(diǎn)。盡管有上市的融合抑制劑T20和其它臨床研究中的融合抑制劑如Sifuvirtide(CN1334122)，但由于抗藥病毒株的快速出現(xiàn)，使得針對(duì)抗性病毒的融合抑制劑研發(fā)成為當(dāng)務(wù)之急，尤其是序列來(lái)源與已有融合抑制劑明顯不同的融合抑制劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于以上原因，本發(fā)明人提出了從其它類似包膜病毒對(duì)應(yīng)包膜糖蛋白序列設(shè)計(jì)抗HIV-1活性肽的設(shè)計(jì)思想。我們根據(jù)包膜病毒融合機(jī)制的相似性，從其它包膜病毒包膜糖蛋白跨膜亞基的CHR序列連續(xù)截取約36個(gè)氨基酸的肽序列，設(shè)計(jì)出抗HIV-1多肽，測(cè)定其抗HIV介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合活性，同時(shí)研究其與HIV-1gp41NHR的結(jié)合，確定其作用靶點(diǎn)，探索研究HIV-1融合抑制劑設(shè)計(jì)的新思路。由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明的第一方面涉及選自式(1)～式(42)所示的多肽，式(1)：X-WIDISIELNKAKSDLEESKEWIERSNGKLDSIGNWH(SEQIDNO：1)-Z；式(2)：X-WIDWSIELNKAKSDLEESKEWIERSNGKLDSIGNWH(SEQIDNO：2)-Z；式(3)：X-PIDISIELNKAKSDLEESKEWIERSNGKLDSIGNWH(SEQIDNO：3)-Z；式(4)：X-WLDISQNLAAVNKSLSDALQHLAQSDTYLSAI(SEQIDNO：4)-Z；式(5)：X-WLDWSQNLAAVNKSLSDALQHLAQSDTYLSAI(SEQIDNO：5)-Z；式(6)：X-PLDISQNLAAVNKSLSDALQHLAQSDTYLSAI(SEQIDNO：6)-Z；式(7)：X-WSGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELG(SEQIDNO：7)-Z；式(8)：X-WSGWNASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELG(SEQIDNO：8)-Z；式(9)：X-ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELG(SEQIDNO：9)-Z；式(10)：X-WEKLNVTLLDLTYEMNRIQDAIKKLNESYINLKE(SEQIDNO：10)-Z；式(11)：X-WEKWNVTLLDLTYEMNRIQDAIKKLNESYINLKE(SEQIDNO：11)-Z；式(12)：X-FEKLNVTLLDLTYEMNRIQDAIKKLNESYINLKE(SEQIDNO：12)-Z；式(13)：X-WGNVNNSISNALNKLEESNRNLDKVNVKLTSTSALI(SEQIDNO：13)-Z；式(14)：X-WGNWNNSISNALNKLEESNRNLDKVNVKLTSTSALI(SEQIDNO：14)-Z；式(15)：X-LGNVNNSISNALNKLEESNRNLDKVNVKLTSTSALI(SEQIDNO：15)-Z；式(16)：X-VKEWEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSA(SEQIDNO：16)-Z；式(17)：X-WKEWEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSA(SEQIDNO：17)-Z；式(18)：X-VKFPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSA(SEQIDNO：18)-Z；式(19)：X-WDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGK(SEQIDNO：19)-Z；式(20)：X-WDEWDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGK(SEQIDNO：20)-Z；式(21)：X-SDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGK(SEQIDNO：21)-Z；式(22)：X-WYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTV(SEQIDNO：22)-Z；式(23)：X-WYTWKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTV(SEQIDNO：23)-Z；式(24)：X-VYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTV(SEQIDNO：24)-Z；式(25)：X-WFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTV(SEQIDNO：25)-Z；式(26)：X-WFTDWVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTV(SEQIDNO：26)-Z；式(27)：X-VFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTV(SEQIDNO：27)-Z；式(28)：X-WSLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDQILRSM(SEQIDNO：28)-Z；式(29)：X-WSLEWLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDQILRSM(SEQIDNO：29)-Z；式(30)：X-ISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDQILRSM(SEQIDNO：30)-Z；式(31)：X-WVDISLNLADATNFLQDSKAELEKARKILSEVGRWY(SEQIDNO：31)-Z；式(32)：X-WVDWSLNLADATNFLQDSKAELEKARKILSEVGRWY(SEQIDNO：32)-Z；式(33)：X-PVDISLNLADATNFLQDSKAELEKARKILSEVGRWY(SEQIDNO：33)-Z；式(34)：X-WDQFNVALDQVFESVEKSQNLIDQSNKILDSIEKGN(SEQIDNO：34)-Z；式(35)：X-WDQWNVALDQVFESVEKSQNLIDQSNKILDSIEKGN(SEQIDNO：35)-Z；式(36)：X-EDQFNVALDQVFESVEKSQNLIDQSNKILDSIEKGN(SEQIDNO：36)-Z；式(37)：X-WLNLTGEIDDLEFRSEKLHNTTVELAILIDNINNTL(SEQIDNO：37)-Z；式(38)：X-WLNWTGEIDDLEFRSEKLHNTTVELAILIDNINNTL(SEQIDNO：38)-Z；式(39)：X-YLNLTGEIDDLEFRSEKLHNTTVELAILIDNINNTL(SEQIDNO：39)-Z；式(40)：X-WLNLTSEISTLENKSAELNYTVQKLQTLIDNINSTL(SEQIDNO：40)-Z；式(41)：X-WLNWTSEISTLENKSAELNYTVQKLQTLIDNINSTL(SEQIDNO：41)-Z；式(42)：X-ILNLTSEISTLENKSAELNYTVQKLQTLIDNINSTL(SEQIDNO：42)-Z；或其衍生物、立體異構(gòu)體、無(wú)生理毒性的鹽；其中，X為乙?；⒐央男蛄?、親脂性基團(tuán)、聚乙二醇或缺失；在本發(fā)明的實(shí)施方案中，X為乙?；?CH3-CO-)；Z為酰胺基、寡肽序列、親脂性基團(tuán)、聚乙二醇或缺失；在本發(fā)明的實(shí)施方案中，Z為酰胺基(-CO-NH2)。其中，所述寡肽序列為1～10個(gè)氨基酸序列，例如可以為EEE、KKK、GKK、或GQAV。其中所述親脂性基團(tuán)為脂肪酸和甾醇，例如可以為正辛酸酯(C7H15-CO-O-)、月桂酸酯(C13H27-CO-O-)、棕櫚酸酯(C15H31-CO-O-)、或膽固醇(C27H46O)。其中X與Z基團(tuán)用于改善多肽的水溶性、二級(jí)結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性、增強(qiáng)與細(xì)胞膜的結(jié)合使之更靠近靶點(diǎn)、或改善藥物的藥代性質(zhì)。以上式(1)～(42)的序列均來(lái)自于包膜類病毒的融合糖蛋白跨膜亞基的CHR序列，其中一些序列在多肽氨基末端的關(guān)鍵位點(diǎn)引入一個(gè)色氨酸(W)殘基，首選為1位，或者同時(shí)在4位。其中式(1)～(3)來(lái)自于人副流感病毒3型HPIV3，式(4)～(6)來(lái)自于猴副流感病毒SV5，式(7)～(9)來(lái)自于嚴(yán)重急性呼吸綜合征SARS病毒，式(10)～(12)來(lái)自于小鼠肝炎病毒MHV，式(13)～(15)來(lái)自于新城疫病毒NDV，式(16)～(18)來(lái)自于人偏肺病毒hMPV，式(19)～(21)來(lái)自于呼吸道合胞病毒RSV，式(22)～(24)來(lái)自于戊型肝炎病毒HeV,式(25)～(27)來(lái)自于尼帕病毒NiV，式(28)～(30)來(lái)自于麻疹病毒MeV，式(31)～(33)來(lái)自于仙臺(tái)病毒SeV，式(34)～(36)來(lái)自于禽肺病毒APV，式(37)～(39)來(lái)自于貓傳染性腹膜炎病毒FIPV，式(40)～(42)來(lái)自于人冠狀病毒229EHCoV-229E。以上病毒株均為具有晶體結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)株。根據(jù)本發(fā)明第一方面的多肽，其選自以下多肽：(1)SEQIDNO：1～42中的任一序列在N端和/或C端有1-10、1-5、1-2個(gè)氨基酸的截短；(2)SEQIDNO：1～42中的任一序列在N端和/或C端有1-10、1-5、1-2個(gè)氨基酸的延伸；優(yōu)選地，所述延伸是在該序列來(lái)源病毒的融合糖蛋白跨膜亞基的CHR序列基礎(chǔ)上的延伸；(3)SEQIDNO：1～42中的任一序列有1-10、1-5、1-2個(gè)氨基酸的替換，或上述(1)和(2)的序列中有1-10、1-5、1-2個(gè)氨基酸的替換；優(yōu)選地，所述替換是根據(jù)該序列來(lái)源病毒的不同病毒株之間由于融合糖蛋白跨膜亞基的CHR序列不同而進(jìn)行的替換；(4)SEQIDNO：1～42中的任一多肽經(jīng)過(guò)末端和/或側(cè)鏈化學(xué)修飾得到的多肽，或上述(1)～(3)的多肽經(jīng)過(guò)末端和/或側(cè)鏈化學(xué)修飾得到的多肽。(5)上述(1)～(4)的多肽，第一位氨基酸和/或第四位氨基酸用色氨酸殘基替換，和/或第八位氨基酸用疏水氨基酸殘基替換后得到的多肽。其中所述末端和/或側(cè)鏈化學(xué)修飾包括在氨基末端、羧基末端或側(cè)鏈修飾，修飾基團(tuán)包括寡肽、乙?；Ⅴ０坊?，親脂性基團(tuán)、親水性基團(tuán)等，其作用是提高多肽的穩(wěn)定性、改善藥代動(dòng)力學(xué)或提高與細(xì)胞膜的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明第一方面的多肽，其為選自本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)所述多肽中的一種或數(shù)種。在本發(fā)明中，所述多肽既包括直接由10-100個(gè)氨基酸分子脫水縮合而成的化合物，也包括在該化合物上經(jīng)過(guò)上述修飾后得到的含有修飾基團(tuán)的化合物。在本發(fā)明中，所述多肽的長(zhǎng)度優(yōu)選為含有30-40個(gè)氨基酸，例如為30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40。以上所述多肽在經(jīng)過(guò)截短、延伸、替換和/或修飾后仍具有抗HIV-1或其它包膜類病毒與靶細(xì)胞例如人體細(xì)胞融合的活性。在本發(fā)明中，所述疏水氨基酸殘基包括色氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸。本發(fā)明的多肽可以采用本領(lǐng)域公知的方法直接合成，也可以利用分子生物學(xué)手段通過(guò)將多肽所對(duì)應(yīng)的核苷酸序列克隆入重組載體中，在重組細(xì)胞中表達(dá)后得到。因此本發(fā)明還涉及核酸分子，其含有編碼本發(fā)明第一方面所述多肽的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及重組載體，其含有本發(fā)明所述的核酸分子；以及重組細(xì)胞，其含有本發(fā)明所述的重組載體。本發(fā)明的第四方面涉及包含本發(fā)明第一方面所述多肽或其衍生物、立體異構(gòu)體、無(wú)生理毒性的鹽的融合蛋白，或所述多肽或其衍生物、立體異構(gòu)體、無(wú)生理毒性的鹽與其他蛋白或毒素或脂類等載體(如大分子載體或重組載體)偶聯(lián)或融合而得到的復(fù)合物，或者展示上述多肽或其衍生物、立體異構(gòu)體、無(wú)生理毒性的鹽的類病毒顆粒。本發(fā)明多肽的給藥方式以針劑為主，可直接注射，或制成緩釋針劑；也可以通過(guò)提高代謝穩(wěn)定性，包括物理的、化學(xué)的修飾，使之成為可口服使用的藥物；也包括外用或粘膜給藥等。本發(fā)明的另一方面涉及組合物(例如藥物組合物)，其含有至少一種本發(fā)明第一方面所述的多肽或其衍生物、立體異構(gòu)體、無(wú)生理毒性的鹽，或者本發(fā)明第四方面所述的融合蛋白、復(fù)合物或類病毒顆粒，以及任選的藥學(xué)上可接受的載體或輔料。在本發(fā)明中，所述組合物中可以包含至少一種多肽或其衍生物、立體異構(gòu)體、無(wú)生理毒性的鹽，或者本發(fā)明第四方面所述的融合蛋白、復(fù)合物或類病毒顆粒，例如可以為兩種或兩種以上，以進(jìn)一步提高融合抑制效果；或者所述組合物中可以包含本發(fā)明的多肽或其衍生物、立體異構(gòu)體、無(wú)生理毒性的鹽、本發(fā)明所述的融合蛋白、復(fù)合物或類病毒顆粒，以及其它融合抑制劑，例如C34、T20或CP32。本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明第一方面所述的多肽或其衍生物、立體異構(gòu)體、無(wú)生理毒性的鹽、第四方面所述的融合蛋白、復(fù)合物或類病毒顆粒在制備HIV融合抑制劑中的用途。在本發(fā)明中，所述融合抑制劑是指可以阻止HIV-1自身的活性六螺旋結(jié)構(gòu)的形成進(jìn)而抑制病毒-細(xì)胞膜融合的化合物或組合物，即是指通過(guò)形成無(wú)活性的六螺旋結(jié)構(gòu)阻止病毒-細(xì)胞膜融合的化合物或組合物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述融合抑制劑是指多肽或經(jīng)過(guò)修飾的多肽，或者包含多肽或經(jīng)過(guò)修飾的多肽的組合物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明第一方面所述的多肽或其衍生物、立體異構(gòu)體、無(wú)生理毒性的鹽、第四方面所述的融合蛋白、復(fù)合物或類病毒顆粒在制備用于治療或預(yù)防HIV感染相關(guān)疾病例如艾滋病的藥物或者其它包膜類病毒感染引起的疾病中的用途。在本發(fā)明中，所述HIV包括HIV-1和HIV-2型病毒，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述HIV為HIV-1型病毒。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述其它包膜類病毒是指利用第一類融合蛋白作為融合工具的病毒，包括但不限于人副流感病毒3型HPIV3，猴副流感病毒SV5，嚴(yán)重急性呼吸綜合征SARS病毒，小鼠肝炎病毒MHV，新城疫病毒NDV，人偏肺病毒hMPV，呼吸道合胞病毒RSV,戊型肝炎病毒HeV,尼帕病毒NiV，麻疹病毒MeV，仙臺(tái)病毒SeV，禽肺病毒APV，貓傳染性腹膜炎病毒FIPV或人冠狀病毒229EHCoV-229E。本發(fā)明還涉及一種預(yù)防或治療HIV感染相關(guān)疾病例如艾滋病或者其它包膜類病毒感染引起的疾病的方法，所述方法包括給有需要的受試者以預(yù)防或治療有效量的本發(fā)明第一方面所述的多肽或其衍生物、立體異構(gòu)體、無(wú)生理毒性的鹽、第四方面所述的融合蛋白、復(fù)合物或類病毒顆粒的步驟。根據(jù)融合機(jī)理，HIV用第一類融合蛋白(ClassIfusionProtein)作為病毒-細(xì)胞膜融合的工具分子，利用這類融合蛋白的還有其它多種病毒，包括一些嚴(yán)重威脅人類健康的病毒。第一類融合蛋白有下列共性：都含有跨膜亞基和表面亞基，其中跨膜亞基直接參與融合；跨膜亞基細(xì)胞膜外部分一般含有融合肽、NHR和CHR等功能區(qū)；融合過(guò)程中NHR三聚形成內(nèi)核，CHR反平行折疊到NHR形成的溝槽中，形成六螺旋結(jié)構(gòu)，形成過(guò)程中放出的能量促使病毒和細(xì)胞膜融合使病毒完成感染[1]。根據(jù)這些原理，發(fā)明人針對(duì)利用第一類融合蛋白作為融合工具的病毒，根據(jù)其融合糖蛋白跨膜亞基的CHR，設(shè)計(jì)HIV融合抑制劑。這類病毒的包膜糖蛋白的氨基酸序列已知，功能區(qū)也得到了確定，發(fā)明人從其中CHR序列中截取適當(dāng)?shù)亩嚯钠?，根?jù)融合機(jī)理的相似性，預(yù)測(cè)這些多肽片段可以反平行折疊到NHR形成的溝槽中，形成無(wú)活性的六螺旋結(jié)構(gòu)，并用融合抑制活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。因此本發(fā)明還涉及一種獲得抑制HIV與靶細(xì)胞融合的融合抑制劑的方法，該方法包括從除HIV以外的病毒的CHR功能區(qū)序列上截取適當(dāng)長(zhǎng)度的多肽片段，所述多肽片段能夠和NHR功能區(qū)結(jié)合形成無(wú)活性的六螺旋結(jié)構(gòu)。需要加以說(shuō)明的是，由于CHR一般的長(zhǎng)度約為40個(gè)氨基酸殘基，因此截取30-40個(gè)殘基片段用作HIV融合抑制劑相當(dāng)直觀，無(wú)需特別地技術(shù)，但不排除進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬以求得最好截取效果。另外，根據(jù)直觀的邏輯，將這些截取片段用于HIV以外的與所截取病毒相同或不同病毒的融合抑制劑也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。其中所述除HIV以外的病毒是指利用第一類融合蛋白作為融合工具的病毒，例如為包膜類病毒；在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒為人副流感病毒3型HPIV3[2]，猴副流感病毒SV5[3]，嚴(yán)重急性呼吸綜合征SARS病毒[4]，小鼠肝炎病毒MHV[4]，新城疫病毒NDV[5]，人偏肺病毒hMPV[6]，呼吸道合胞病毒RSV[3]，戊型肝炎病毒HeV[2],尼帕病毒NiV[7]，麻疹病毒MeV[7]，仙臺(tái)病毒SeV[7]，禽肺病毒APV[8]，貓傳染性腹膜炎病毒FIPV[9]或人冠狀病毒229EHCoV-229E[9]。其中所述適當(dāng)長(zhǎng)度是指包含30-40個(gè)氨基酸，例如為30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明所述的上述方法獲得的抑制HIV與靶細(xì)胞融合的融合抑制劑。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述融合抑制劑選自上述式(1)～(42)所示的多肽。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述融合抑制劑是指多肽或經(jīng)過(guò)修飾的多肽，或者包含多肽或經(jīng)過(guò)修飾的多肽的組合物。在本發(fā)明中，X為乙?；?、Z為酰胺基的式(1)～式(42)所示的多肽也分別稱為多肽1～42。發(fā)明的有益效果本發(fā)明的多肽顯示出明顯的抗HIV活性，靶點(diǎn)作用實(shí)驗(yàn)顯示，所述多肽作用于gp41NHR區(qū)，通過(guò)與NHR形成無(wú)活性的六螺旋結(jié)構(gòu)，破壞HIVNHR結(jié)構(gòu)，抑制HIV與靶細(xì)胞的融合。同時(shí)，活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明多肽的作用機(jī)制與含有WWI結(jié)構(gòu)模板口袋結(jié)合區(qū)的已知多肽融合抑制劑不同。說(shuō)明書(shū)附圖圖1顯示了本發(fā)明多肽與N46的相互作用其中橫坐標(biāo)wave為掃描波長(zhǎng)，單位為nm；縱坐標(biāo)為CD信號(hào)，單位為mdeg。每個(gè)小圖中有四條曲線，例如seq1、N46分別為多肽1，N46單獨(dú)的CD譜，Seq1/N46為多肽1和N46混合后測(cè)得的CD譜，Seq1+N46為二者單獨(dú)CD譜的疊加，用于和Seq1/N46比較以確定二者是否有相互作用。其它小圖標(biāo)注的含義以此類推；其中A為多肽1，B為多肽4，C為多肽7，D為多肽10，E為多肽13，F(xiàn)為多肽16，G為多肽19，H為多肽22。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。在本發(fā)明中使用的縮寫(xiě)具有下面的意義：AIDS(AcquiredImmureDeficiencySyndrome)艾滋病，獲得性免疫缺陷綜合癥。Ala(Alanine，A)丙氨酸Arg(Arginine，R)精氨酸Asn(Asparagine，N)天冬酰胺Asp(Asparticacid，D)天冬氨酸DCM(Dichloromethane)二氯甲烷DMF(N,N-Dimethylmalonate)二甲基甲酰胺Env(Envelopeglycoprotein)包膜糖蛋白ESI-MS(Electronicsprayionmassspectroscopy)電噴質(zhì)譜Fmoc(Fluorenylmethoxycarbonyl)芴甲氧羰基Gly(Glycine，G)甘氨酸Gln(Glutamine，Q)谷酰胺Glu(Glutamicacid，E)谷氨酸6-HB(six-helixbundle)六螺旋體HBTU2-(1H-1-羥基苯并三唑)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸His(Histidine，H)組氨酸HoBt(1-Hydroxylbenzotiazoleanhydrous)1-羥基苯并三氮唑NHR(N-terminalheptadrepeat)N-端七聯(lián)重復(fù)序列CHR(C-terminalheptadrepeat)C-端七聯(lián)重復(fù)序列HIV(Humanimmunodeficiencyvirus)人免疫缺陷病毒HIV-11型人免疫缺陷病毒HPLC(highperformanceliquidchromatography)高效液相色譜Ile(Isoleucine，I)異亮氨酸Leu(Leucine，L)亮氨酸Met(Methionine，M)甲硫氨酸Nal正亮氨酸Lys(Lysine，K)賴氨酸Phe(Phenylalanine，F(xiàn))苯丙氨酸Ser(Serine，S)絲氨酸TFA(Trifluoroaceticacid)三氟乙酸Thr(Threonie，T)蘇氨酸Tyr(Tyrosine，Y)酪氨酸Val(Valine，V)纈氨酸W為色氨酸、N為天冬酰胺、A為丙氨酸、S為絲氨酸、K為賴氨酸、L為亮氨酸、E為谷氨酸、Q為谷氨酰胺、I為異亮氨酸、H為組氨酸、M為甲硫氨酸、T為蘇氨酸、D為天冬氨酸、R為精氨酸、Y為酪氨酸、F為苯丙氨酸，V為纈氨酸，P為脯氨酸，G為甘氨酸。實(shí)施例所用固相合成載體Rink酰胺樹(shù)脂為天津南開(kāi)合成責(zé)任有限公司產(chǎn)品；HBTU、HOBt、DIEA及Fmoc保護(hù)的天然氨基酸和D型的非天然氨基酸為上海吉爾生化公司及成都諾新技術(shù)責(zé)任公司產(chǎn)品。N-甲基吡咯烷酮(NMP)為ACROS公司產(chǎn)品；TFA為北京博邁科技有限公司產(chǎn)品；DMF、DCM為韓國(guó)三星公司產(chǎn)品；色譜純乙腈為Fisher公司產(chǎn)品。其它試劑如無(wú)說(shuō)明均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。實(shí)施例1抗HIV-1多肽1-42的設(shè)計(jì)發(fā)明人系統(tǒng)考察了包膜類病毒的融合原理及其抑制特性，從多個(gè)包膜類病毒(人副流感病毒3型HPIV3[2]，猴副流感病毒SV5[3]，嚴(yán)重急性呼吸綜合征SARS病毒[4]，小鼠肝炎病毒MHV[4]，新城疫病毒NDV[5]，人偏肺病毒hMPV[6]，呼吸道合胞病毒RSV[3]，戊型肝炎病毒HeV[2],尼帕病毒NiV[7]，麻疹病毒MeV[7]，仙臺(tái)病毒SeV[7]，禽肺病毒APV[8]，貓傳染性腹膜炎病毒FIPV[9]和人冠狀病毒229EHCoV-229E[9])的融合糖蛋白跨膜亞基的CHR序列中，截取對(duì)應(yīng)的長(zhǎng)度約為36個(gè)氨基酸的多肽。設(shè)計(jì)的多肽序列SEQIDNO：1-42見(jiàn)表1，同時(shí)標(biāo)明了其來(lái)源病毒。為方便濃度測(cè)定，我們首先在多肽氨基末端關(guān)鍵位點(diǎn)引入一個(gè)色氨酸(W)殘基，首選為1位，或者4位。然后我們根據(jù)HIV-1gp41CHR多肽序列，在1、4位點(diǎn)再引入一個(gè)色氨酸，形成WaaWaaaX(其中a為氨基酸)模板，其中X為疏水氨基酸殘基，使其具有和gp41CHR相同的結(jié)合區(qū)模板，考察活性。在Seq16，Seq17中4位引入W時(shí)，我們同時(shí)將3位F突變?yōu)镋，以保證該段序列的整體疏水性保持不變?；钚则?yàn)證結(jié)果參見(jiàn)實(shí)施例3。實(shí)施例2抗HIV-1多肽1-42的制備采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相多肽合成方法。將實(shí)施例1設(shè)計(jì)的抗HIV-1多肽序列SEQIDNO：1-42的C-端酰胺化，N-端乙?；?，得到多肽1-42。選用RinkAmide樹(shù)脂，肽類由C-端向N-端延長(zhǎng)?？s合劑為HBTU/HOBt/DIEA。脫保護(hù)劑為哌啶/DMF溶液。裂解劑為T(mén)FA，粗肽水溶解后凍干保存。用中壓液相色譜法或HPLC進(jìn)行分離純化，純肽含量>95％?；|(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)確定多肽分子量。具體微波多肽合成條件如下：氨基酸：0.2M的DMF溶液；活化劑：0.45MHBTU/HOBt的DMF溶液；活化堿：2MDIEA的NMP溶液；脫保護(hù)劑：20％v/v哌啶的DMF溶液；封閉試劑：20％v/v乙酸酐的DMF溶液。稱取RinkAmide樹(shù)脂0.5g(0.25mmol)置入CEM微波多肽合成儀的反應(yīng)器中，然后將氨基酸、活化劑、活化堿、脫保護(hù)試劑、封閉試劑按上述條件配好后，用CEM微波全自動(dòng)多肽合成儀進(jìn)行合成。完成后肽樹(shù)脂用DMF洗滌3遍后用無(wú)水甲醇收縮，室溫真空干燥，得肽樹(shù)脂2.05g。肽樹(shù)脂的裂解：將上述合成好的肽樹(shù)脂稱量后放入250ml茄形瓶中，冰浴，電磁攪拌。按1g肽樹(shù)脂加入10ml的量配置裂解液(體積比：三氟乙酸：乙二硫醇：間苯酚：水＝82.8:10:5:2.5)。TFA需預(yù)先冰浴降溫30min或者預(yù)先放于冰箱中使用。將配制好的裂解液加入到冰浴條件下的肽樹(shù)脂中，電磁攪拌，樹(shù)脂變橙紅色，冰浴條件下反應(yīng)30min，然后撤冰浴，室溫下再繼續(xù)反應(yīng)90min使反應(yīng)完成。劇烈攪拌下向反應(yīng)器中加入冷乙醚200ml，析出白色沉淀，繼續(xù)攪拌30min；用G4的砂芯抽濾漏斗濾出析出物，用冷乙醚反復(fù)洗滌3遍，晾干。加入雙蒸水50ml，乙腈5ml使固體充分溶解，抽濾，濾液凍干得粗肽1.03g。所得粗肽用中壓或高壓色譜進(jìn)行純化。色譜柱為C18柱，洗脫液為乙腈，水及少量乙酸。具體操作步驟：稱取粗肽1g，加水20ml，乙腈5ml溶解，3000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10min，取上清液上樣。色譜柱預(yù)先用15％乙腈/水/0.1％冰乙酸溶液200ml平衡，上樣后繼續(xù)用200ml同樣洗脫液平衡，高效液相檢測(cè)洗脫液成分。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果逐步升高乙腈含量，直至所純化的多肽峰被洗脫出來(lái)。合并同組分洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分溶劑，凍干得純肽，HPLC檢測(cè)含量>90％。純肽經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜確定其分子量。采用以上方法分別合成多肽1-42(見(jiàn)表1)。表1：多肽序列、來(lái)源及分子量實(shí)施例3：多肽的抗HIV-1融合活性檢測(cè)。我們用HIV-1Env介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合模型對(duì)實(shí)施例2制備的多肽1-42進(jìn)行活性測(cè)定。靶細(xì)胞為T(mén)ZM-bl細(xì)胞(美國(guó)NIH艾滋病試劑和參照物項(xiàng)目提供，目錄號(hào)為8129)，其表面表達(dá)CD4T-細(xì)胞受體和趨化因子輔助受體CCR5和CXCR4，可被HIV-1Env識(shí)別，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)還轉(zhuǎn)錄熒光素酶報(bào)告基因，但不含該基因的啟動(dòng)子，因此單獨(dú)細(xì)胞的熒光素酶背景表達(dá)量很低。效應(yīng)細(xì)胞為HL2/3細(xì)胞(美國(guó)NIH艾滋病試劑和參照物項(xiàng)目提供，目錄號(hào)為1294)，其表面表達(dá)HIV-1Env，由Env進(jìn)攻靶細(xì)胞，完成細(xì)胞融合，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)還轉(zhuǎn)錄熒光素酶報(bào)告基因的啟動(dòng)子。兩種細(xì)胞先在含有氨芐/鏈霉素雙抗的含10％胎牛血清的DMEM中，37℃下在含有5％CO2的培養(yǎng)箱中單獨(dú)培養(yǎng)。兩種細(xì)胞均為貼壁細(xì)胞，細(xì)胞胰酶/EDTA消化后收獲傳代。細(xì)胞用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將TZM-bl靶細(xì)胞用培養(yǎng)基調(diào)整到濃度為75萬(wàn)/ml，以每孔50μl加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(3.75萬(wàn)/孔)，5％CO2，37度下培養(yǎng)24小時(shí)。將多肽1-42或陽(yáng)性對(duì)照樣品T20溶于磷酸緩沖溶液生理鹽水(PBS)中，或加入適量DMSO使充分溶解，用紫外光譜儀在280nm處測(cè)定多肽濃度。然后將多肽溶液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛?，?6孔酶標(biāo)板(Corning)中等比稀釋(濃度為1200、300、75、19、5、1.25μM)。配制150萬(wàn)/ml的HL2/3效應(yīng)細(xì)胞。將20μl/孔的等比稀釋的多肽1-42加入前一天培養(yǎng)的TZM-bl細(xì)胞中，然后加入50μl/孔的配制好的HL2/3效應(yīng)細(xì)胞；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的其中一排用PBS替代抑制劑用于測(cè)定飽和融合信號(hào)，另一排用DMEM培養(yǎng)基替代HL2/3細(xì)胞用于測(cè)定背景信號(hào)。5％CO2，37℃下培養(yǎng)6-8小時(shí)使之充分融合。將熒光素酶報(bào)告基因的試劑盒(Promega)從冰箱中取出，將5x細(xì)胞裂解液根據(jù)用量用雙蒸水稀釋至1x裂解液，室溫下放置；用底物緩沖液溶解底物，室溫下放置；同時(shí)將酶標(biāo)儀(MolcularDevicesM5多功能酶標(biāo)儀)檢測(cè)條件設(shè)置好備用。將融合好的細(xì)胞取出，棄去培養(yǎng)基，用200μl/孔PBS洗兩次，盡量去除清洗液；然后以50μl/孔加入平衡到室溫的裂解液，輕輕震動(dòng)下反應(yīng)5min使細(xì)胞充分裂解；將裂解液以40μl/孔加入96孔化學(xué)發(fā)光檢測(cè)用酶標(biāo)板板(Corning)中，加樣時(shí)盡量避免引入氣泡；避光下將底物以40μl/孔迅速加入化學(xué)發(fā)光用酶標(biāo)板中，立即在酶標(biāo)儀上測(cè)定化學(xué)發(fā)光。根據(jù)飽和融合信號(hào)和背景信號(hào)的比值確定靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的有效融合，比值>5表明有效融合。根據(jù)樣品的濃度-化學(xué)發(fā)光信號(hào)曲線確定其半抑制劑濃度(IC50)，陽(yáng)性對(duì)照樣品的IC50值應(yīng)穩(wěn)定在一定范圍；理想的抑制曲線中高濃度抑制劑下信號(hào)應(yīng)接近背景信號(hào)，最低濃度抑制劑下信號(hào)應(yīng)接近飽和融合信號(hào)。多肽1-42的細(xì)胞融合抑制活性列于表2，陽(yáng)性對(duì)照T20的IC50為2±0.5nM，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[10]。表2：多肽1-42的細(xì)胞融合抑制活性根據(jù)表2的活性檢測(cè)結(jié)果，多肽1-42除3、15、21、42外均顯示出明顯抗HIV活性，半抑制濃度IC50從1到數(shù)十μM不等，而所有研究的病毒中都含有活性多肽序列，且活性都有改進(jìn)空間，符合藥物先導(dǎo)化合物的活性標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)還可看出，活性與我們引入的色氨酸殘基有些關(guān)系，但沒(méi)有明顯的規(guī)律，因此其作用機(jī)制與含有WWI結(jié)構(gòu)模板口袋結(jié)合區(qū)的已知多肽融合抑制劑不同。但以上結(jié)果表明我們可以通過(guò)改變氨基酸殘基進(jìn)行活性改進(jìn)。例如化合物21僅通過(guò)引入一個(gè)色氨酸殘基，活性得到約7倍提高。實(shí)施例4：多肽的實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)病毒株HIV-1IIIB感染抑制實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)病毒株HIV-1IIIB、MT-2細(xì)胞(通過(guò)美國(guó)國(guó)立健康研究院(NIH)艾滋病研究參考試劑計(jì)劃獲得)。2.實(shí)驗(yàn)方法用實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)病毒株HIV-1IIIB感染抑制實(shí)驗(yàn)考察了部分活性較好多肽的活性。在200ul的RPMI1640培養(yǎng)基中，用100TCID50(50％組織培養(yǎng)感染量)的HIVIIIB毒株去感染104/mlMT-2細(xì)胞，同時(shí)加入呈濃度梯度的不同抑制劑，過(guò)夜培養(yǎng)之后棄去培養(yǎng)上清液，換上新鮮的培養(yǎng)基。感染后第四天，從每個(gè)孔中取出100ul培養(yǎng)上清液，加入等體積的5％TritonX-100，用ELISA方法定量檢測(cè)p24抗原。具體實(shí)驗(yàn)方法亦可參考Jiang,S.,etal.,AntimicrobialAgentandChemotherapy,2004.48(11):p.4349-4359.3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下面的表3所示。表3：多肽的HIV病毒感染抑制活性我們選擇細(xì)胞融合活性中活性較好的多肽，測(cè)定其抗病毒感染活性。結(jié)果顯示，這些測(cè)試多肽顯示與細(xì)胞融合活性相似的IC50值，可以用作先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)新型融合抑制劑。實(shí)施例5：抗HIV-1多肽1-42與NHR靶點(diǎn)的作用我們用圓二色譜(CD)研究實(shí)施例2制備的多肽1、4、7、10、13、16、19、22與gp41NHR靶點(diǎn)的相互作用，我們選用N46(序列：Ac-TLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-CONH2)作為gp41NHR靶點(diǎn)，其中序列TLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL為SEQIDNO：43。圓二色譜儀為BiologicMOS450譜儀。將待測(cè)定CHR多肽1、4、7、10、13、16、19、22分別溶于PBS中，N46溶于雙蒸水中，根據(jù)280nm下紫外吸收確定濃度；然后配制20μM的多肽PBS溶液。配制要檢測(cè)的多肽樣品：將N46和多肽1、4、7、10、13、16、19、22分別以1：1體積比混合得二者混合樣品；如果是單獨(dú)多肽樣品，將20μM的樣品與緩沖溶液以1:1混合。樣品在37℃下放置30min使充分反應(yīng)。上述實(shí)驗(yàn)步驟可確保樣品中的多肽濃度保持一致。將配制好的樣品在圓二色譜儀上測(cè)定，儀器掃描波長(zhǎng)范圍為190-260nm，波長(zhǎng)間隔為1nm，掃描速度為100nm/min，掃描4次進(jìn)行平均。先用緩沖溶液掃描得到空白，然后掃描樣品信號(hào)，將空白信號(hào)從樣品信號(hào)中扣除得到CD信號(hào)。通過(guò)比較待測(cè)多肽和N46多肽混合前和混合后的CD信號(hào)變化來(lái)確定二者的相互作用。CD信號(hào)變化表明兩者具有相互作用。多肽1、4、7、10、13、16、19、22分別與N46混合后都出現(xiàn)CD信號(hào)變化，表明它們均作用于gp41NHR，通過(guò)與NHR形成無(wú)活性的六螺旋結(jié)構(gòu)抑制HIV與人體細(xì)胞的融合(圖1)。盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開(kāi)的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。參考文獻(xiàn)1.Schibli,D.J.andW.Weissenhorn,ClassIandclassIIviralfusionproteinstructuresrevealsimilarprinciplesinmembranefusion(Review).MolecularMembraneBiology,2004.21(6):p.361-371.2.Porotto,M.,etal.,InhibitionofHendraVirusFusion.JVirol,2006.80(19):p.9837-9849.3.Mathews,J.M.,etal.,Thecoreoftherespiratorysyncytialvirusfusionproteinisatrimericcoiledcoil.JournalofVirology,2000.74(13):p.5911-5920.4.Bosch,B.J.,etal.,Severeacuterespiratorysyndromecoroavirus(SARS-CoV)infectioninhibitionusingspikeproteinheptadrepeat-derivedpeptides.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2004.101(22):p.8455-8460.5.Young,J.K.,etal.,InteractionofpeptideswithsequencesfromtheNewcastlediseasevirusfusionproteinheptadrepeatregions.JournalofVirology,1999.73(7):p.5945-5956.6.Miller,S.A.,etal.,Examinationofafusogenichexamericcorefromhumanmetapneumovirusandidentificationofapotentsyntheticpeptideinhibitorfromtheheptadrepeat1region.JournalofVirology,2007.81(1):p.141-149.7.Lamb,R.A.,R.G.Paterson,andT.S.Jardetzky,Paramyxovirusmembranefusion:LessonsfromtheFandHNatomicstructures.Virology,2006.344(1):p.30-37.8.Zhu,J.Q.,etal.,BiochemicalandbiophysicalanalysisofheptadrepeatregionsfromthefusionproteinofMenanglevirus,anewlyemergentparamyxovirus.ArchivesofVirology,2003.148(7):p.1301-1316.9.Xu,Y.H.,etal.,Crystalstructureofsevereacuterespiratorysyndromecoronavirusspikeproteinfusioncore.JournalofBiologicalChemistry,2004.279(47):p.49414-49419.10.Wild,C.T.,etal.,Peptidescorrespondingtoapredictivealpha-helicaldomainofhuman-immunodeficiency-virustype-1gp41arepotentinhibitorsofvirus-infection.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1994.91(21):p.9770-9774.