使用人胎盤灌洗液和人來自胎盤的中間體自然殺傷細胞的腫瘤抑制本申請是申請日為2008年09月29日、申請?zhí)枮?00880118399.6、名稱為“使用人胎盤灌洗液和人來自胎盤的中間體自然殺傷細胞的腫瘤抑制”的發(fā)明申請的分案。本申請要求于2008年9月28日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/995,763和于2008年8月21日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/090,555的優(yōu)選權，所述申請的全部內容通過參考納入本文。1.發(fā)明領域本發(fā)明提供了通過將腫瘤細胞與胎盤灌洗液、來自胎盤的細胞、來自胎盤(例如來自胎盤灌洗液)的自然殺傷細胞、和/或包含來自胎盤(例如來自胎盤灌洗液)的自然殺傷細胞和來自臍帶血的自然殺傷細胞的混合自然殺傷細胞接觸來抑制腫瘤細胞生長或增殖的方法。本發(fā)明還提供了從胎盤，例如從胎盤灌洗液(例如人胎盤灌洗液)，來制備獨特自然殺傷細胞群的方法。進一步地，本發(fā)明提供了使用胎盤灌洗液及其中的自然殺傷細胞抑制腫瘤細胞增殖的方法。2.

背景技術：
胎盤灌洗液包含通過下述方式獲得的胎盤細胞群：使灌洗溶液流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)，并從所述血管系統(tǒng)、從所述胎盤的母體面、或從兩者收集灌洗液體。灌洗哺乳動物胎盤的方法描述在例如美國專利號7,045,146和美國專利號7,255,879中。通過灌洗獲得的胎盤細胞群是異源性的，包含造血細胞(CD34+)、有核細胞例如粒細胞、單核細胞和巨噬細胞、小百分比(少于1%)的組織培養(yǎng)基質-粘附的胎盤干細胞和自然殺傷細胞。至今還無人描述胎盤灌洗液或來自灌洗液的胎盤細胞群在抑制腫瘤細胞增殖中的用途。自然殺傷(NK)細胞是構成先天免疫系統(tǒng)的主要組分的細胞毒性淋巴細胞。在人體中，NK細胞不表達T-細胞抗原受體(TCR)、CD3或表面免疫球蛋白(Ig)B細胞受體，但通常表達表面標記物CD16(FcγRIII)和CD56。NK細胞是細胞毒性的；其細胞質中的小顆粒包含特殊蛋白質如穿孔素和被稱為粒酶的蛋白酶。當在非常接近于待殺死的細胞周圍釋放時，穿孔素在靶細胞的細胞膜中形成孔，粒酶和相關分子可以通過所述孔進入，誘導細胞凋亡。一種粒酶，粒酶B(也被稱為粒酶2和細胞毒性T-淋巴細胞-結合的絲氨酸酯酶1)，是在細胞介導免疫應答中快速誘導靶細胞細胞凋亡的一種重要的絲氨酸蛋白酶。NK細胞響應干擾素或巨噬細胞-衍生的細胞因子而被活化?；罨腘K細胞被稱為淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞。NK細胞具有兩類表面受體，標記為“活化受體”和“抑制受體”，它們控制細胞的細胞毒活性。除了其它活性，NK細胞在宿主的腫瘤排異反應中起作用。因為癌細胞具有降低的或沒有I型MHC表達，它們可以成為NK細胞的靶點。大量臨床數(shù)據(jù)表明從PBMC或骨髓分離的人NK細胞的單倍體相合移植可介導強烈的抗白血病效應，而不會產(chǎn)生可檢測的移植物抗宿主病(GVHD)。參見Ruggeri等人，Science295:2097-2100(2002))。自然殺傷細胞可由缺乏或呈現(xiàn)低水平的主要組織相容性復合體(MHC)蛋白的細胞活化。活化的和擴增的NK細胞和LAK細胞已被用于對患有晚期癌癥的患者的離體治療和體內治療，并在骨髓相關疾病(例如白血病)、乳腺癌、和某些類型的淋巴瘤的治療中取得了一定的成功。LAK細胞治療要求患者首先接受IL-2，接著接受白細胞分離法，然后在IL-2的存在下，將收集的自體血細胞離體培育和培養(yǎng)幾天。LAK細胞必須與相對高劑量的IL-2一起重新輸注，以完成治療。該凈化治療(purgingtreatment)價格昂貴且可能引起嚴重的副作用。這些副作用包含體液潴留、肺水腫、血壓降低和高熱。盡管NK細胞在殺死腫瘤細胞和病毒感染的細胞中具有有利的性質，處理它們和將它們用于免疫治療仍然很難，主要原因在于在培養(yǎng)和擴增期間，很難保持它們的腫瘤靶向和殺死腫瘤的能力。因而，本領域存在對自然殺傷細胞的易用供給的需要。3.發(fā)明概述本發(fā)明提供了胎盤灌洗液；來自胎盤灌洗液的細胞，例如來自胎盤灌洗液的所有有核細胞；胎盤灌洗液細胞和臍帶血細胞的組合；和/或來自胎盤的自然殺傷細胞，例如來自胎盤灌洗液的自然殺傷細胞或通過消化胎盤組織獲得的自然殺傷細胞在抑制腫瘤細胞增殖中的用途。在一個方面，本發(fā)明提供一種抑制腫瘤細胞或腫瘤細胞群增殖的方法，該方法包括將所述腫瘤細胞或腫瘤細胞群與人胎盤灌洗液接觸。在該方法的具體實施方案中，所述腫瘤細胞為血癌細胞。在另一具體實施方案中，所述腫瘤細胞為多個血癌細胞。在另一具體實施方案中，所述腫瘤細胞為實體瘤細胞。在另一具體實施方案中，所述腫瘤細胞為多個實體瘤細胞。在另一實施方案中，所述腫瘤細胞為原發(fā)性導管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性髓細胞樣淋巴瘤(CML)細胞、急性髓性白血病細胞、慢性髓性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織細胞性淋巴瘤細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞、成視網(wǎng)膜細胞瘤細胞、結腸直腸癌細胞或結腸直腸腺癌細胞。在另一具體實施方案中，所述接觸在體外進行。在另一具體實施方案中，所述接觸在體內進行。在更具體的實施方案中，所述體內接觸在人體中進行。在另一具體實施方案中，所述胎盤灌洗液為已流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)(例如僅流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng))的灌洗液。在另一具體實施方案中，所述胎盤灌洗液已流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)，且是從胎盤的母體面收集的。在另一具體實施方案中，所述胎盤灌洗液中所有的或基本上所有的(例如大于90%、95%、98%或99%)的細胞是胎兒細胞。在另一具體實施方案中，所述胎盤灌洗液包含胎兒細胞和母體細胞。在更具體的實施方案中，所述胎盤灌洗液中的胎兒細胞包含少于約90%、80%、70%、60%或50%的所述灌洗液中的細胞。在另一具體實施方案中，所述灌洗液是通過用0.9%NaCl溶液流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)獲得的。在另一具體實施方案中，所述灌洗液包含培養(yǎng)基。在另一具體實施方案中，所述灌洗液已經(jīng)過處理除去了大量紅細胞。在另一方面，本發(fā)明提供了一種抑制腫瘤細胞或多個腫瘤細胞增殖的方法，該方法包括將所述腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞與眾多胎盤灌洗液細胞接觸。在另一具體實施方案中，所述眾多胎盤灌洗液細胞是或包含來自胎盤灌洗液的所有有核細胞。在另一具體實施方案中，所述胎盤灌洗液或胎盤灌洗液細胞(例如來自胎盤灌洗液的所有有核細胞)已經(jīng)過處理除去了至少一類細胞。在另一具體實施方案中，所述接觸在體外進行。在另一具體實施方案中，所述接觸在體內進行。在更具體的實施方案中，所述體內接觸在哺乳動物(例如人類)中進行。在另一具體實施方案中，所述胎盤灌洗液細胞已經(jīng)過處理從而富集了至少一類細胞，例如CD56+細胞。在另一具體實施方案中，所述胎盤灌洗液細胞為CD56+胎盤細胞。在更具體的實施方案中，所述CD56+細胞為CD56+CD16-自然殺傷細胞，例如胎盤中間體自然殺傷(PINK)細胞，所述細胞例如從胎盤灌洗液細胞獲得，或從通過機械破壞或酶破壞胎盤組織獲得的胎盤細胞中獲得。在另一具體實施方案中，所述CD56+細胞通過CD56-偶聯(lián)微珠選擇。在另一具體實施方案中，所述CD56+細胞包含的細胞與等量的CD56+CD16+自然殺傷細胞相比，顯示出可檢測的更低的NKG2D、NKp46或CD94的表達。在另一具體實施方案中，所述PINK細胞為CD3-。在更具體的實施方案中，在所述胎盤灌洗液細胞中的至少50%的細胞是所述CD56+細胞。在更具體的實施方案中，其中所述CD56+細胞為至少50%的所述胎盤灌洗液細胞，所述腫瘤細胞為原發(fā)性導管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性髓細胞樣淋巴(CML)細胞、急性髓性白血病細胞、慢性髓性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織細胞性淋巴瘤細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞、成視網(wǎng)膜細胞瘤細胞、結腸直腸癌細胞或結腸直腸腺癌細胞。在具體實施方案中，所述接觸為體外接觸。在另一實施方案中，所述接觸為體內接觸，例如在哺乳動物(例如人體)中。在另一個方面，本發(fā)明提供一種抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞增殖的方法，該方法包括將所述腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞與眾多來自胎盤的自然殺傷細胞(例如PINK細胞)接觸。在具體實施方案中，所述來自胎盤的自然殺傷細胞為從胎盤灌洗液獲得的自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，所述自然殺傷細胞為通過物理破壞和/或酶消化胎盤組織獲得的自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，所述自然殺傷細胞為CD56+CD16-自然殺傷細胞，例如PINK細胞。在另一具體實施方案中，所述自然殺傷細胞通過CD56-偶聯(lián)微珠從例如胎盤灌洗液細胞或通過物理破壞和/或酶消化胎盤組織獲得的細胞中選擇。在另一具體實施方案中，所述自然殺傷細胞為CD3-。在具體實施方案中，所述眾多自然殺傷細胞為包含該自然殺傷細胞的細胞群中的至少80%的細胞。在另一具體實施方案中，所述接觸在體外進行。在另一具體實施方案中，所述接觸在體內進行。在更具體的實施方案中，所述體內接觸在哺乳動物(例如人類)中進行。在所述方法的另一具體實施方案中，所述眾多自然殺傷細胞包含的細胞與等量的CD56+CD16+自然殺傷細胞相比，顯示出可檢測的更低的NKG2D、NKp46或CD94的表達。在另一具體實施方案中，與外周血液自然殺傷細胞相比，所述眾多自然殺傷細胞(例如PINK細胞)以可檢測的更高的水平表達以下一種或多種微小RNA：hsa-miR-100、hsa-miR-127、hsa-miR-211、hsa-miR-302c、hsa-miR-326、hsa-miR-337、hsa-miR-497、hsa-miR-512-3p、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-517b、hsa-miR-517c、hsa-miR-518a、hsa-miR-518e、hsa-miR-519d、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618和/或hsa-miR-99a。在另一具體實施方案中，將所述眾多自然殺傷細胞(例如PINK細胞)與一定量的免疫調節(jié)化合物接觸一段時間，所述量和所述時間足以使得所述眾多自然殺傷細胞與沒有接觸所述免疫調節(jié)化合物的等量的所述自然殺傷細胞相比，表達可檢測的更多的粒酶B。在更具體的實施方案中，所述免疫調節(jié)化合物為來那度胺或pomalidomide(3-氨基-N-(2,6-二氧代-3-哌啶基)鄰苯二甲酰亞胺)。在另一具體實施方案中，將所述眾多自然殺傷細胞(例如PINK細胞)與一定量的免疫調節(jié)化合物接觸一段時間，所述量和所述時間足以使得所述自然殺傷細胞與沒有接觸所述免疫調節(jié)化合物(例如來那度胺或pomalidomide)的等量的所述自然殺傷細胞相比，顯示出針對所述腫瘤細胞的可檢測的更高的細胞毒性。在另一具體實施方案中，與沒有接觸所述免疫調節(jié)化合物的等量的所述自然殺傷細胞相比，所述眾多自然殺傷細胞(例如PINK細胞)以更高水平表達BAX、CCL5、CCR5、CSF2、FAS、GUSB、IL2RA或TNFRSF18中的一種或多種。在另一具體實施方案中，與沒有接觸所述免疫調節(jié)化合物的等量的所述自然殺傷細胞相比，所述眾多自然殺傷細胞(例如PINK細胞)以更高水平表達ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL5、CCR5、CSF1、CSF2、ECE1、FAS、GNLY、GUSB、GZMB、IL1A、IL2RA、IL8、IL10、LTA、PRF1、PTGS2、SKI和TBX21中的一種或多種。在另一實施方案中，將來自胎盤的自然殺傷細胞與來自另一來源(例如胎盤血和/或臍帶血)的自然殺傷細胞混合，例如以形成混合的自然殺傷細胞。本文使用的短語“來自胎盤的自然殺傷細胞”不包含來自臍帶血或胎盤血的自然殺傷細胞。在更具體的實施方案中，來自胎盤的自然殺傷細胞與來自另一來源的自然殺傷細胞的混合比例為約100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等。在具體實施方案中，所述混合的自然殺傷細胞沒有進行培養(yǎng)，且其包含：與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3-CD56+CD16-自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更低數(shù)量的CD3-CD56+CD16+自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3-CD56+KIR2DL2/L3+自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更低數(shù)量的CD3-CD56+NKp46+自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3-CD56+NKp30+自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3-CD56+2B4+自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3-CD56+CD94+自然殺傷細胞。在其它具體實施方案中，所述混合的自然殺傷細胞沒有進行培養(yǎng)，且其包含：與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測更低數(shù)量的CD3-CD56+KIR2DL2/L3+自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3-CD56+NKp46+自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3-CD56+NKp44+自然殺傷細胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3-CD56+NKp30+自然殺傷細胞。在任一上述方法的具體實施方案中，所述腫瘤細胞為實體瘤細胞。在另一具體實施方案中，所述腫瘤細胞為液體腫瘤細胞，例如血液腫瘤細胞。在更具體的實施方案中，所述腫瘤細胞為原發(fā)性導管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性髓細胞樣淋巴瘤(CML)細胞、急性髓性白血病細胞、慢性髓性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織細胞性淋巴瘤細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞、成視網(wǎng)膜細胞瘤細胞、結腸直腸癌細胞或結腸直腸腺癌細胞。在另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含分離的胎盤CD56+、CD16-自然殺傷細胞(例如PINK細胞)。在一具體實施方案中，所述胎盤自然殺傷細胞是從胎盤灌洗液中分離的。在另一具體實施方案中，所述胎盤自然殺傷細胞是通過物理破壞和/或酶消化胎盤組織從胎盤中分離的。在另一具體實施方案中，所述自然殺傷細胞包含所述組合物中至少50%的細胞。在具體實施方案中，所述自然殺傷細胞包含所述組合物中至少80%的細胞。在另一具體實施方案中，所述組合物包含分離的CD56+、CD16+自然殺傷細胞。在更具體的實施方案中，所述CD56+、CD16+自然殺傷細胞來自與所述CD56+、CD16-自然殺傷細胞不同的個體。在另一具體實施方案中，所述分離的CD56+、CD16-自然殺傷細胞來自單個個體。在更具體的實施方案中，所述分離的CD56+、CD16-自然殺傷細胞包含來自至少兩個不同個體的自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，所述胎盤自然殺傷細胞(例如所述PINK細胞)被擴增。在更具體的實施方案中，所述組合物包含胎盤自然殺傷細胞和來自另一來源的自然殺傷細胞。在具體實施方案中，所述其它來源為臍帶血和/或臍帶血。在另一具體實施方案中，所述其它來源為外周血液。在更具體的實施方案中，來自胎盤的自然殺傷細胞與來自另一來源的自然殺傷細胞的混合比例為約100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等。在另一具體實施方案中，所述組合物包含分離的胎盤灌洗液。在更具體的實施方案中，所述胎盤灌洗液與所述自然殺傷細胞來自相同的個體。在另一更具體的實施方案中，所述胎盤灌洗液包含來自與所述自然殺傷細胞不同個體的胎盤灌洗液。在另一具體實施方案中，所述胎盤灌洗液中所有的或基本上所有的(例如大于90%、95%、98%或99%)的細胞為胎兒細胞。在另一具體實施方案中，所述胎盤灌洗液包含胎兒細胞和母體細胞。在更具體的實施方案中，所述胎盤灌洗液中的胎兒細胞包含少于約90%、80%、70%、60%或50%的所述灌洗液中的細胞。在另一具體實施方案中，所述灌洗液是通過用0.9%NaCl溶液流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)而獲得的。在另一具體實施方案中，所述灌洗液包含培養(yǎng)基。在另一具體實施方案中，所述灌洗液已經(jīng)處理除去了眾多紅細胞。在另一具體實施方案中，所述組合物包含胎盤灌洗液細胞。在更具體的實施方案中，所述胎盤灌洗液細胞與所述自然殺傷細胞來自相同的個體。在另一更具體實施方案中，所述胎盤灌洗液細胞與所述自然殺傷細胞來自不同的個體。在另一具體實施方案中，所述組合物包含分離的胎盤灌洗液和分離的胎盤灌洗液細胞，其中所述分離的灌洗液和所述分離的胎盤灌洗液細胞來自不同的個體。在任一上述包含胎盤灌洗液的實施方案中的另一更具體實施方案中，所述胎盤灌洗液包含來自至少兩個個體的胎盤灌洗液。在任一上述包含胎盤灌洗液細胞的實施方案中的另一更具體實施方案中，所述分離的胎盤灌洗液細胞來自至少兩個個體。所述組合物可另外包含分離的PINK細胞，其中所述PINK細胞與所述胎盤灌洗液或所述灌洗液細胞來自不同的個體。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離胎盤自然殺傷細胞的方法，該方法包括獲得眾多胎盤細胞，和從所述眾多胎盤細胞分離自然殺傷細胞。在具體實施方案中，所述胎盤細胞是或包含胎盤灌洗液細胞，例如來自胎盤灌洗液的所有有核細胞。在另一具體實施方案中，所述眾多胎盤細胞是或包含通過機械破壞和/或酶消化胎盤組織獲得的胎盤細胞。在另一實施方案中，所述分離是使用一種或多種抗體進行的。在更具體的實施方案中，所述一種或多種抗體包含一種或多種針對CD3、CD16或CD56的抗體。在更具體的實施方案中，所述分離包括在所述眾多胎盤細胞中將CD56+細胞與CD56-細胞分離。在更具體的實施方案中，所述分離包括將CD56+、CD16-胎盤細胞與CD56-或CD16+胎盤細胞分離。在更具體的實施方案中，所述分離包括將CD56+、CD16-、CD3-胎盤細胞與CD56-、CD16+或CD3+胎盤細胞分離。在另一實施方案中，所述分離胎盤自然殺傷細胞的方法產(chǎn)生的胎盤細胞群的至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或至少99%細胞是CD56+、CD16-自然殺傷細胞。在上述方法的某些實施方案中，所述胎盤灌洗液細胞已經(jīng)在培養(yǎng)基中擴增。在各種實施方案中，所述細胞擴增了至少、大約或不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。在具體實施方案中，所述胎盤灌洗液細胞已經(jīng)在滋養(yǎng)層的存在下和/或在至少一種細胞因子的存在下擴增。在更具體的實施方案中，所述滋養(yǎng)層包含K562細胞或外周血液單核細胞。在另一更具體實施方案中，所述至少一種細胞因子是白細胞介素-2。3.1.定義本文使用的“混合的自然殺傷細胞”是例如來自匹配的臍帶和人胎盤灌洗液的自然殺傷細胞，其中胎盤灌洗液與臍帶血獲自相同的胎盤。分別或同時分離來自兩者的自然殺傷細胞，并將其混合。本文使用的“PINK”和“PINK細胞”指胎盤中間體自然殺傷細胞，其是從人胎盤(例如人胎盤灌洗液或已被機械破壞和/或酶破壞的胎盤組織)獲得的。所述細胞為CD56+和CD16-，例如可通過流式細胞術，例如使用針對CD56和CD16的抗體熒光激活細胞分類術測定。PINK細胞不是從臍帶血或外周血液獲得的。本文使用的“胎盤灌洗液”指已流經(jīng)至少一部分胎盤(例如人胎盤)例如流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)的灌洗溶液，其包含灌洗溶液在流經(jīng)胎盤期間收集的眾多細胞。本文使用的“胎盤灌洗液細胞”指從胎盤灌洗液分離或可從其中分離的有核細胞(例如所有有核細胞)。本文使用的“腫瘤細胞抑制”、“腫瘤細胞增殖的抑制”等包括例如通過將腫瘤細胞群與PINK細胞、包含PINK細胞的細胞群、混合的自然殺傷細胞、包含混合的自然殺傷細胞的細胞群、人胎盤灌洗液等接觸，例如通過殺死所述腫瘤細胞群中的一個或多個腫瘤細胞，來減緩腫瘤細胞群的生長。4.附圖簡要說明圖1顯示了對于從人胎盤灌洗液(HPP)中通過CD56微珠選擇的細胞，使用抗-CD3抗體和抗-CD56抗體的流式細胞術結果。大部分的分離細胞是CD56+CD3-。圖2描述了在24小時培養(yǎng)期間，PINK細胞和/或腫瘤細胞的細胞因子的生成。圖2A描述了單獨或在KG-1a腫瘤細胞的存在下，來自胎盤灌洗液的中間體自然殺傷細胞(PINK)對干擾素γ(IFN)的分泌。PINK細胞和KG-1a細胞單獨或按1：1的比例混合培養(yǎng)。Y軸：培養(yǎng)物生成的IFNγ的皮克數(shù)。圖2B描述了PINK細胞單獨或在KG-1a腫瘤細胞的存在下對粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的分泌。PINK細胞和KG-1a細胞單獨或按1：1的比例混合培養(yǎng)。Y軸：培養(yǎng)物生成的GM-CSF的皮克數(shù)。圖3描述了在PINK細胞與腫瘤細胞以1：1、5：1、10：1或20：1的比例進行的24小時共同培養(yǎng)中，PINK細胞對KG-1a腫瘤細胞的細胞毒性。X軸：PINK細胞與腫瘤細胞的比例。Y軸：相對于沒有PINK細胞的腫瘤細胞的腫瘤細胞死亡百分數(shù)。圖4描述了培養(yǎng)了21天的胎盤NK細胞和外周血液(PB)NK細胞對K562細胞的細胞毒性。誤差柱代表4個單位的培養(yǎng)的胎盤NK細胞或3個單位的培養(yǎng)的外周血液NK細胞的標準偏差。圖5描述了在HPP細胞與腫瘤細胞以1∶1、5∶1、10∶1或20∶1的比例進行的24小時共同培養(yǎng)中，從胎盤獲得的全部人胎盤灌洗液對KG-1a腫瘤細胞的細胞毒性。X軸：HPP細胞與腫瘤細胞的比例。Y軸：相對于沒有HPP細胞的腫瘤細胞的腫瘤細胞死亡百分數(shù)。圖6描述了在HPP細胞或UCB細胞與腫瘤細胞以100:1、50:1、25:1、12.5:1、6.25:1、3.12:1、1.56:1或0.78:1的系列稀釋進行的48小時共同培養(yǎng)中，從胎盤和臍帶血獲得的全部人胎盤灌洗液對KG-1a腫瘤細胞的細胞毒性。X軸：HPP細胞或臍帶細胞與腫瘤細胞的比例。Y軸：在48小時后相對于沒有HPP細胞或臍帶細胞的腫瘤細胞的腫瘤細胞死亡百分數(shù)。圖7描述了在HPP細胞與腫瘤細胞以100:1、50:1、25:1、12.5:1、6.25:1、3.12:1、1.57:1或0.78:1的系列稀釋進行的48小時共同培養(yǎng)中，從胎盤獲得的全部人胎盤灌洗液對KG-1a腫瘤細胞的細胞毒性。使用收集的灌洗液或經(jīng)100U/ml或1000U/ml白細胞介素-2(IL-2)刺激24小時的灌洗液。X軸：HPP細胞與腫瘤細胞的比例。Y軸：在48小時后相對于沒有HPP細胞的腫瘤細胞的腫瘤細胞死亡百分數(shù)。圖8描述了在HPP或UCB細胞與腫瘤細胞以50∶1的比例進行培養(yǎng)后，人胎盤灌洗液對一組腫瘤細胞系的細胞毒性作用。圖8A：共同培養(yǎng)24小時。圖8B：共同培養(yǎng)48小時。X軸：測試的腫瘤細胞系。Y軸：共同培養(yǎng)后相對于不存在腫瘤細胞的腫瘤細胞數(shù)的腫瘤細胞死亡百分數(shù)。圖9描述了HPP細胞與腫瘤細胞的按不同比例下，與KG-1a腫瘤細胞共同培養(yǎng)的HPP細胞的IFNγ生成。X軸：實驗條件，包括HPP細胞與腫瘤細胞的比例，Y軸：在24小時共培養(yǎng)后每毫升的IFNγ水平。圖10與一組腫瘤細胞共同培養(yǎng)的HPP或UCB細胞對IFNγ的生成。將HPP或UCB細胞與腫瘤細胞系按照50：1的比例共同培養(yǎng)24小時(圖10A)或48小時(圖10B)。通過Luminex試驗(HCYTO-60K-03，Millipore)測定IFNγ水平。X軸：測試的腫瘤細胞系。Y軸：與不存在腫瘤細胞下生成的IFNγ的皮克數(shù)相比，HPP或UCB細胞生成的IFNγ的皮克數(shù)。圖11描述了當向患有KG-1細胞腫瘤(體積約為332mm3)的小鼠施用2×107個人胎盤灌洗液(HPP)細胞時腫瘤尺寸的減小。瘤內——將HPP細胞直接注射到皮下腫瘤部位。IV——靜脈內施用HPP細胞。對照——僅施用運載體。腫瘤體積以mm3計。5.詳細說明本發(fā)明提供了從胎盤獲得的胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或胎盤灌洗液衍生的自然殺傷(“PINK”)細胞在抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞生長或增殖中的用途。特別地，本發(fā)明提供了從胎盤灌洗液(例如人胎盤灌洗液)分離的或從機械破壞和/或酶破壞的胎盤組織分離的自然殺傷(NK)細胞和NK細胞群、獲得NK細胞的方法、和使用所述細胞的方法。本發(fā)明還提供了包含自然殺傷細胞的細胞群，例如胎盤細胞群。獲得胎盤灌洗液和從胎盤灌洗液獲得細胞的方法描述在下述部分5.1中。來自胎盤灌洗液的自然殺傷細胞和獲得所述細胞的方法描述在下述部分5.2中。使用胎盤灌洗液、來自胎盤灌洗液的細胞來自或胎盤灌洗液的自然殺傷細胞(例如中間體自然殺傷細胞)抑制腫瘤細胞增殖的方法描述在下述部分5.3中。5.1.胎盤灌洗液5.1.1.細胞采集組合物本發(fā)明提供的胎盤灌洗液、灌洗液細胞和來自胎盤灌洗液的自然殺傷細胞可以通過使用胎盤細胞采集組合物灌洗哺乳動物例如人分娩后的胎盤來收集?？梢酝ㄟ^使用任何生理學可接受的溶液(例如鹽溶液、培養(yǎng)基或更復雜的細胞采集組合物)灌洗胎盤來從胎盤收集灌洗液。適于灌洗胎盤、和適于收集和保存灌洗液細胞(例如所有有核胎盤灌洗液細胞或PINK細胞)的細胞采集組合物詳細描述在相關美國申請公開號2007/0190042中，該申請的全部內容通過參考納入本文。所述細胞采集組合物可以包含適于收集和/或培養(yǎng)干細胞的任何生理學可接受的溶液，例如鹽溶液(例如磷酸鹽緩沖鹽水、Kreb’s溶液、改良的Kreb’s溶液、Eagles’s溶液、0.9%NaCl等)、培養(yǎng)基(例如DMEM、H.DMEM等)等。所述細胞采集組合物可以包含一種或多種易于保存胎盤細胞的組分，所述保存即自收集時至培養(yǎng)時，防止胎盤細胞死亡、或延遲胎盤細胞死亡、減少死亡的細胞群中胎盤細胞的數(shù)量等。這些組分可以是例如細胞凋亡抑制劑(例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑或JNK抑制劑)；血管擴張藥(例如硫酸鎂、抗高血壓藥、心房利鈉肽(ANP)、促腎上腺皮質激素、促腎上腺皮質激素釋放激素、硝普鈉、肼屈嗪、三磷腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸鎂、磷酸二酯酶抑制劑等)；壞死抑制劑(例如2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊基氨基-馬來酰亞胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯或氯硝西泮)；TNF-α抑制劑；和/或載氧全氟化碳(例如全氟辛基溴、全氟癸基溴等)。所述細胞采集組合物可以包含一種或多種組織降解酶，例如金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、透明質酸酶、RNase或DNase等。這些酶包括但不限于膠原酶(例如膠原酶I、II、III或IV，來自溶組織梭菌(Clostridiumhistolyticum)的膠原酶等)；分散酶；嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、胰蛋白酶、LIBERASE、透明質酸酶等。所述細胞采集組合物可以包含殺菌或抑菌有效量的抗生素。在某些非限制性實施方案中，所述抗生素是大環(huán)內酯類(例如妥布霉素)、頭孢菌素類(例如頭孢氨芐、頭孢霉定、頭孢呋辛、頭孢丙烯、頭孢克洛、頭孢克肟或頭孢羥氨芐)、克拉霉素、紅霉素、青霉素(例如青霉素V)或喹諾酮類(例如氧氟沙星、環(huán)丙沙星或諾氟沙星)、四環(huán)素、鏈霉素等。在特別實施方案中，所述抗生素具有抗革蘭氏陽性(+)和/或革蘭氏陰性(-)細菌(例如綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等)的活性。所述細胞采集組合物還可包含一種或多種下述化合物：腺苷(約1mM至約50mM)；D-葡萄糖(約20mM至約100mM)；鎂離子(約1mM至約50mM)；分子量大于20,000道爾頓的大分子，在一實施方案中，其以足夠保持內皮完整性和細胞生存力的量存在(例如，合成的或天然存在的膠體、多糖例如葡聚糖或聚乙二醇，以約25g/l至約100g/l、或約40g/l至約60g/l存在)；抗氧化劑(例如丁羥茴醚、丁羥甲苯、谷胱甘肽、維生素C或維生素E，以約25μM至約100μM存在)；還原劑(例如N-乙酰半胱氨酸，以約0.1mM至約5mM存在)；防止鈣進入細胞的試劑(例如維拉帕米，以約2μM至約25μM存在)；硝化甘油(例如，約0.05g/l至約0.2g/l)；抗凝血藥，在一個實施方案中，以足以幫助防止殘余血液凝固的量存在(例如肝素或水蛭素，以約1000單位/l至約100,000單位/l的濃度存在)；或包含阿米洛利的化合物(例如阿米洛利、乙基異丙基阿米洛利、環(huán)六亞甲基阿米洛利、二甲基阿米洛利或異丁基阿米洛利，以約1.0μM至約5μM存在)。5.1.2.胎盤的收集和處理通常，在出生后胎盤娩出后立即回收人胎盤。在優(yōu)選實施方案中，在患者簽署知情同意書以及在獲取患者的全部病史并將其與所述胎盤關聯(lián)后，回收患者的胎盤。優(yōu)選地，在產(chǎn)后繼續(xù)跟蹤病史。這樣的病史可用于調整所述胎盤或從其中獲得的細胞的后續(xù)使用。例如，根據(jù)病史，人胎盤細胞可用于對與所述胎盤相關的嬰兒、或該嬰兒的父母、同胞或其它親屬的個性化用藥。在回收灌洗液之前，除去臍帶血和胎盤血。在某些實施方案中，在產(chǎn)后，回收胎盤中的臍帶血?？蓪λ鎏ケP進行常規(guī)的臍帶血回收處理。典型地，使用針或插管，借助于重力來給胎盤排血(參見，例如Anderson，美國專利號5,372,581；Hessel等人，美國專利號5,415,665)。通常將所述針或插管置于臍靜脈中，可以輕輕按摩胎盤以幫助將臍帶血排出胎盤。這樣的臍帶血回收可以商業(yè)化進行，例如LifeBankInc.，CedarKnolls，N.J.,ViaCord，CordBloodRegistryandCryoCell。優(yōu)選地，所述胎盤依靠重力排空而無需進一步處理，由此在回收臍帶血期間對組織破壞最小化。典型地，將胎盤從產(chǎn)房或分娩房轉運到另外的地點(例如實驗室)以回收臍帶血和收集灌洗液。胎盤優(yōu)選地在無菌隔熱的轉運裝置(將胎盤溫度保持在20-28℃之間)中轉運，例如將夾住近端臍帶的胎盤置于無菌自封塑料袋中，然后將其放置到絕熱容器中。在另一實施方案中，將胎盤在基本上如美國專利號7,147,626所述的臍帶血收集試劑盒中轉運。優(yōu)選地，在產(chǎn)后四至二十四小時將胎盤遞送到實驗室。在某些實施方案中，在臍帶血回收之前，夾住近端臍帶，優(yōu)選地在插入到胎盤盤的4-5cm(厘米)以內處夾住近端臍帶。在其它實施方案中，在回收臍帶血之后但在進一步處理胎盤之前，夾住近端臍帶。在收集灌洗液之前，可以將胎盤貯存在無菌條件和在室溫或5至25℃(攝氏溫度)下。胎盤可被貯存超過四十八個小時，優(yōu)選地貯存四至二十四小時，之后灌洗胎盤以除去任何殘留臍帶血。胎盤優(yōu)選地貯存在5℃至25℃(攝氏溫度)的抗凝血溶液中。合適的抗凝血溶液是本領域所熟知的。例如，可以使用肝素或華法林鈉的溶液。在優(yōu)選實施方案中，所述抗凝血溶液包含肝素溶液(例如，在1:1000溶液中1%w/w)。在收集胎盤灌洗液之前，無血胎盤優(yōu)選地貯存不超過36小時。5.1.3.胎盤的灌洗灌洗哺乳動物胎盤的方法公開在例如Hariri的美國專利號7,045,148和7.255,879、以及題為“ImprovedCompositionforCollectingandPreservingOrgans(采集和保存器官的改進的組合物)”的和美國申請公開號2007/0190042中，所述專利和專利申請的全部內容通過參考納入本文。可以通過使灌洗溶液(例如鹽溶液、培養(yǎng)基或上述的細胞采集組合物)流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)來獲得灌洗液。在一個實施方案中，通過使灌洗溶液流經(jīng)臍動脈和臍靜脈中的任意一個或兩者來灌洗哺乳動物的胎盤?？梢岳美缦蛱ケP內的重力流來實現(xiàn)灌洗溶液經(jīng)過胎盤的流動。優(yōu)選地，使用泵例如蠕動泵迫使灌洗溶液經(jīng)過胎盤?？梢杂门c無菌連接裝置(例如無菌管)連接的插管(例如TEFLON或塑料插管)對臍靜脈插管。所述無菌連接裝置連接灌洗歧管。在準備灌洗時，優(yōu)選地以臍動脈和臍靜脈位于胎盤最高點的方式來定位胎盤?？梢酝ㄟ^使灌洗溶液流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)，或者流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)和周圍組織來灌洗胎盤。在一個實施方案中，臍動脈和臍靜脈同時連接移液器，該移液器經(jīng)由彈性連接體連接到灌洗溶液儲庫。灌洗溶液流入臍靜脈和臍動脈。所述灌洗溶液從血管流出和/或穿過血管壁進入胎盤的周圍組織，并從妊娠期間連接母親子宮的胎盤表面將其收集到合適的開放器皿中。也可以通過臍帶開口引入灌洗溶液，并允許其從與母體子宮壁相連的胎盤壁中的開口流出或滲濾出。在另一實施方案中，灌洗溶液流經(jīng)臍靜脈并從臍動脈收集，或其流經(jīng)臍動脈而從臍靜脈收集，即，灌洗溶液只流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)(胎兒組織)。在一個實施方案中，例如，臍動脈和臍靜脈同時連接例如移液器，該移液器經(jīng)由彈性連接體連接到灌洗溶液儲庫。灌洗溶液流入臍靜脈和臍動脈。所述灌洗溶液從血管流出和/或穿過血管壁進入胎盤的周圍組織，并從妊娠期間連接母親子宮的胎盤表面將其收集到合適的開口器皿中。也可以通過臍帶開口引入灌洗溶液，并允許其從與母體子宮壁相連的胎盤壁中的開口流出或滲濾出。用該方法(其可以稱為“鍋”法)收集的胎盤細胞典型地是胎兒細胞和母體細胞的混合物。在另一實施方案中，灌洗溶液流經(jīng)臍靜脈并從臍動脈收集，或流經(jīng)臍動脈并從臍靜脈收集。用該方法(其可以稱為“閉路”法)收集的胎盤細胞典型地幾乎僅僅是胎兒細胞。在一個實施方案中，所述閉路灌洗法可以如下進行。在分娩后約48小時之內獲得分娩后的胎盤。夾住臍帶，并在夾鉗上方切下臍帶?？梢詠G棄臍帶，或者可以處理臍帶以回收例如臍帶干細胞，和/或處理臍帶膜以制備生物材料。在灌洗期間，可以保留羊膜，或者例如使用手指鈍剝離將羊膜與絨毛膜分離。如果羊膜與絨毛膜在灌洗前分離，例如可以棄去羊膜，或處理羊膜以獲得干細胞(例如通過酶消化)、或制備例如羊膜生物材料(例如在美國申請公開號2004/0048796中描述的生物材料)。在例如使用消毒紗布清洗胎盤的所有可見血塊和殘余血液后，暴露出臍帶血管，例如通過部分切開臍帶膜以暴露臍帶的橫截面。例如，通過推進封閉的鱷魚夾進入各血管的切口末端，識別和打開血管。然后，將連接灌洗裝置或蠕動泵的裝置(例如塑料管)插入到每個胎盤動脈中。所述泵可以是適用于所述目的的任何泵，例如蠕動泵。然后，將連接收集儲庫(例如血袋，例如250mL的收集袋)的塑料管插入到胎盤靜脈中?；蛘撸瑢⑦B接泵的管插入到胎盤靜脈中，并且將連接儲庫的管插入到胎盤的一個或兩個動脈中。然后，用一定體積的灌洗溶液(例如約750ml灌洗溶液)灌洗胎盤。接著，例如通過離心收集灌洗液中的細胞。在一個實施方案中，在灌洗期間夾住近端臍帶，更優(yōu)選地，在臍帶插入到胎盤盤體的4-5cm(厘米)之內夾住臍帶。通常，在排血過程中，哺乳動物胎盤灌洗流體的第一批采集物被臍帶血和/或胎盤血的殘留紅細胞著色。隨著灌洗的進行以及胎盤的殘留臍帶血細胞被洗凈，所述灌洗流體進一步變成無色。通常，30至100mL的灌洗流體足以初步?jīng)_洗胎盤中的血液，但可以根據(jù)觀察結果，使用更多或更少的灌洗流體。用于灌洗胎盤的灌洗液體的體積可以根據(jù)待收集的胎盤細胞數(shù)量、胎盤尺寸、由單個胎盤形成的采集物的數(shù)量等變化。在各種實施方案中，灌洗液體的體積可以為50mL至5000mL、50mL至4000mL、50mL至3000mL、100mL至2000mL、250mL至2000mL、500mL至2000mL、或750mL至2000mL。典型地，在排血后，用700-800mL的灌洗液體灌洗胎盤?？梢栽趲讉€小時或幾天期間，多次灌洗胎盤。當灌洗胎盤多次時，可將胎盤置于容器或其它合適的器皿中，在無菌條件下保持或培養(yǎng)，并用細胞采集組合物或標準灌洗溶液灌洗(例如，生理鹽水溶液例如磷酸鹽緩沖鹽水(“PBS”)，其含有或不含抗凝血劑(例如肝素、華法林鈉、香豆素、雙香豆素)，和/或含有或不含抗微生物劑(例如β-巰基乙醇(0.1mM)；抗生素例如鏈霉素(例如40-100μg/ml)、青霉素(例如40U/ml)、兩性霉素B(例如0.5μg/ml))。在一個實施方案中，將分離的胎盤保持或培養(yǎng)一段時間而不收集灌洗液，因此在灌洗和收集灌洗液之前，保持或培養(yǎng)胎盤1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時、或2或3或更多天?？梢砸淮位蚋啻蔚乇３纸?jīng)灌洗的胎盤例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多個小時，并用例如700-800mL的灌洗液體再次灌洗?？梢怨嘞刺ケP1、2、3、4、5或更多次，例如每1、2、3、4、5或6個小時一次。在優(yōu)選的實施方案中，重復灌洗胎盤和收集灌洗溶液(例如胎盤細胞采集組合物)，直到回收的有核細胞數(shù)量低于100個細胞/ml?？梢赃M一步分別處理不同時間點的灌洗液，以回收時間依賴性細胞群，例如所有有核細胞。也可以匯總不同時間點的灌洗液。5.1.4.胎盤灌洗液和胎盤灌洗液細胞胎盤灌洗液保包含細胞的異源采集物。典型地，在使用之前，去除胎盤灌洗液中的紅細胞。這樣的去除可以通過分離紅細胞與有核血細胞的已知方法進行。在某些實施方案中，冷凍保存灌洗液或灌洗液細胞。在某些其它實施方案中，胎盤灌洗液或灌洗液細胞僅包含胎兒細胞或包含胎兒細胞和母體細胞的組合。典型地，來自單次胎盤灌洗的胎盤灌洗液包含約1億至約5億個有核細胞。在某些實施方案中，所述胎盤灌洗液或灌洗液細胞包含CD34+細胞，例如造血干細胞或祖細胞。在更具體的實施方案中，這些細胞可以包含CD34+CD45-干細胞或祖細胞、CD34+CD45+干細胞或祖細胞、骨髓祖細胞、淋巴祖細胞和/或紅系祖細胞。在其它的實施方案中，胎盤灌洗液和胎盤灌洗液細胞包含粘附性胎盤干細胞，例如CD34-干細胞。在其它實施方案中，所述胎盤灌洗液和胎盤灌洗液細胞包含例如內皮祖細胞、骨祖細胞和自然殺傷細胞。在某些實施方案中，從胎盤收集并去除紅細胞的胎盤灌洗液，或從這樣的灌洗液分離的灌洗液細胞，包含約6-7%的自然殺傷細胞(CD3-、CD56+)；約21-22%的T細胞(CD3+)；約6-7%的B細胞(CD19+)；約1-2%的內皮祖細胞(CD34+、CD31+)；約2-3%的神經(jīng)祖細胞(巢蛋白+)；約2-5%的造血祖細胞(CD34+)；和約0.5-1.5%的粘附性胎盤干細胞(例如CD34-、CD117-、CD105+和CD44+)，如通過流式細胞術，例如通過FACS分析所測定的。5.2.破壞和消化胎盤組織以獲得PINK細胞胎盤自然殺傷細胞(例如PINK細胞)可以從已經(jīng)機械破壞和/或酶破壞的胎盤組織獲得?？梢允褂靡环N或多種組織降解酶(例如金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、RNase或DNase等)破壞胎盤組織。這樣的酶包括但不限于膠原酶(例如膠原酶I、II、III或IV，來自溶組織梭菌的膠原酶等)、分散酶、嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、胰蛋白酶、LIBERASE、透明質酸酶等。典型地，在消化后，使消化的組織穿過濾網(wǎng)或濾器以除去部分消化的細胞簇，留下基本上單細胞的懸浮液。在獲得胎盤細胞的懸浮液后，可以使用例如針對CD3和CD56的抗體分離自然殺傷細胞。在具體實施方案中，通過如下方法分離胎盤自然殺傷細胞：選擇CD56+細胞以形成第一細胞群；將所述第一細胞群與CD3和/或CD16特異性抗體接觸；從所述第一細胞群中除去CD3+或CD56+細胞，由此形成第二細胞群，其基本上是CD56+和CD3-，CD56+和CD16-，或CD56+、CD3-和CD16-細胞。在一個實施方案中，使用磁珠從胎盤細胞的懸浮液中分離胎盤自然殺傷細胞。所述細胞可以使用例如磁性激活細胞分類(MACS)技術來分離，該技術是基于顆粒結合磁珠(例如約0.5-100μm直徑)的能力分離顆粒的方法，所述磁珠包含一種或多種特定抗體，例如抗-CD56抗體。對所述磁性微球可以進行多種有用的修飾，包括共價添加特異性識別特定的細胞表面分子或半抗原的抗體。然后，將所述珠與細胞混合以允許結合。然后，使細胞經(jīng)過磁場以分離出具有特定細胞表面標記物的細胞。在一個實施方案中，隨后可以分離這些細胞，并將其與偶聯(lián)了針對另一種細胞表面標記物的抗體的磁珠再混合。將所述細胞再次經(jīng)過磁場，分離同時結合兩種抗體的細胞。隨后，可以將這些細胞稀釋到單獨的皿中，例如用于克隆分離的微量滴定皿。5.3.胎盤自然殺傷細胞在一方面，本發(fā)明提供了可從胎盤(例如從胎盤灌洗液、和/或經(jīng)機械破壞和/或酶破壞的胎盤組織)獲得的自然殺傷細胞以及包含這樣的自然殺傷細胞的組合物的分離、表征和用途。在具體實施方案中，所述胎盤自然殺傷細胞為“胎盤中間體自然殺傷細胞”或“PINK”細胞，其被表征為CD56+CD16-，即呈現(xiàn)CD56細胞標記物且缺乏CD16細胞標記物，例如，如上所述通過流式細胞術，例如使用抗CD16和CD56的抗體的熒光激活細胞分類術所測定的。因而，本發(fā)明提供了分離的PINK細胞和分離的眾多PINK細胞。本發(fā)明還提供了分離的眾多細胞，其包含CD56+CD16-PINK細胞與CD56+CD16+自然殺傷細胞的組合。在更具體實施方案中，所述CD56+CD16+自然殺傷細胞可以從胎盤、或另一來源(例如外周血液、臍帶血、骨髓等)中分離。因而，在各種其它實施方案中，PINK細胞可以與CD56+CD16+自然殺傷細胞例如以約1:10、2:9、3:8、4:7:、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或約9:1的比例混合。本文使用的“分離的”指所述細胞以從其正常環(huán)境例如胎盤中移出。在某些實施方案中，所述PINK細胞是CD3-。在其它實施方案中，所述PINK細胞不呈現(xiàn)完全成熟的自然殺傷細胞所呈現(xiàn)的一種或多種細胞標記物(例如CD16)，或者相對于完全成熟的自然殺傷細胞以可檢測的更低的水平呈現(xiàn)這樣的一種或多種標記物，或者呈現(xiàn)出與自然殺傷細胞前體相關但與完全成熟的自然殺傷細胞無關的一種或多種細胞標記物。在具體實施方案中，與完全成熟的NK細胞相比，本文提供的PINK細胞以可檢測的更低的水平表達NKG2D、CD94和/或NKp46。在另一具體實施方案中，本文提供的眾多PINK細胞與等量的完全成熟的NK細胞相比以可檢測的更低的水平表達全部NKG2D、CD94和/或NKp46。在某些實施方案中，與外周血液自然殺傷細胞相比，PINK細胞以可檢測的更高的水平表達以下一種或多種微小RNA：hsa-miR-100、hsa-miR-127、hsa-miR-211、hsa-miR-302c、hsa-miR-326、hsa-miR-337、hsa-miR-497、hsa-miR-512-3p、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-517b、hsa-miR-517c、hsa-miR-518a、hsa-miR-518e、hsa-miR-519d、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618和/或hsa-miR-99a。在某些實施方案中，所述胎盤自然殺傷細胞(例如PINK細胞)已在培養(yǎng)基中擴增。在某些其它實施方案中，所述胎盤灌洗液細胞已在培養(yǎng)基中擴增。在具體實施方案中，所述胎盤灌洗液細胞已在滋養(yǎng)層的存在下和/或在至少一種細胞因子的存在下擴增。在更具體的實施方案中，所述滋養(yǎng)層包含K562細胞或外周血液單核細胞。在另一更具體的實施方案中，所述至少一種細胞因子為白細胞介素-2。在另一實施方案中，本文提供了分離的眾多PINK細胞(例如細胞群)。在另一具體實施方案中，通過從胎盤灌洗液中用CD56-微珠分離細胞生成分離的細胞群。在各種具體實施方案中，所述群包含至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或至少約99%的PINK細胞。在另一實施方案中，眾多PINK細胞包含沒有經(jīng)過擴增的PINK細胞，或由其組成；例如，從胎盤灌洗液收集的。在另一實施方案中，眾多PINK細胞包含經(jīng)過擴增的PINK細胞，或由其組成。擴增自然殺傷細胞的方法描述在例如Ohno等人的美國專利申請公開號2003/0157713中；也可參見Yssel等人，J.Immunol.Methods72(1):219-227(1984)和Litwin等人，J.Exp.Med.178(4)：1321-1326(1993)，以及在下述實施例1中對自然殺傷細胞擴增的描述。在其它實施方案中，所述分離的眾多PINK細胞不呈現(xiàn)完全成熟的自然殺傷細胞所呈現(xiàn)的一種或多種細胞標記物(例如CD16)，或者相對于完全成熟的自然殺傷細胞以可檢測的更低的水平呈現(xiàn)這樣的一種或多種標記物，或者呈現(xiàn)出與自然殺傷細胞前體相關但與完全成熟的自然殺傷細胞無關的一種或多種細胞標記物。在具體實施方案中，與完全成熟的NK細胞相比，本文提供的PINK細胞以可檢測的更低的水平表達NKG2D、CD94和/或NKp46。在另一具體實施方案中，本文提供的眾多PINK細胞與等量的完全成熟的NK細胞相比以可檢測的更低的水平表達全部NKG2D、CD94和/或NKp46。在某些實施方案中，與外周血液自然殺傷細胞相比，PINK細胞群以可檢測的更高的水平表達以下一種或多種微小RNA：hsa-miR-100、hsa-miR-127、hsa-miR-211、hsa-miR-302c、hsa-miR-326、hsa-miR-337、hsa-miR-497、hsa-miR-512-3p、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-517b、hsa-miR-517c、hsa-miR-518a、hsa-miR-518e、hsa-miR-519d、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618和/或hsa-miR-99a。在另一具體實施方案中，與等量的外周血液自然殺傷細胞相比，PINK細胞群表達可檢測的更高量的粒酶B。在其它實施方案中，本文提供的PINK細胞已在培養(yǎng)基中擴增。在具體實施方案中，PINK細胞已經(jīng)過培養(yǎng)(例如在培養(yǎng)基中擴增)至少、大約、或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天。在具體實施方案中，所述PINK細胞培養(yǎng)了約21天。在另一實施方案中，本文提供了一種包含PINK細胞的分離的細胞群，例如胎盤細胞群。在具體實施方案中，所述分離的細胞群為來自胎盤灌洗液的所有有核細胞(例如胎盤灌洗液細胞)，其包含自體的、分離的PINK細胞。在另一具體實施方案中，所述細胞群是通過從胎盤灌洗液中使用CD56-微珠分離細胞而生成的分離的細胞群。在各種具體實施方案中，所述群包含至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或至少約99%的PINK細胞。因為分娩后的胎盤包含來自胎兒和來自母親的組織和細胞，根據(jù)收集的方法，胎盤灌洗液可以僅包含胎兒細胞，或基本上主要包含胎兒細胞(例如大于約90%、95%、98%或99%)，或者可以包含胎兒細胞和母體細胞的混合物(例如，胎兒細胞包含少于約90%、80%、70%、60%、或50%的灌洗液的所有有核細胞)。在一個實施方案中，所述PINK細胞僅源自胎兒胎盤細胞，例如閉路灌洗胎盤獲得的細胞(見上)，其中所述灌洗產(chǎn)生包含基本上大多數(shù)或僅包含胎兒胎盤細胞的灌洗液。在另一實施方案中，所述PINK細胞源于胎兒細胞和母體細胞，例如通過所述鍋法(見上)灌洗獲得的細胞，其中所述灌洗產(chǎn)生包含胎兒和母體胎盤細胞混合物的灌洗液。因而，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了來自胎盤的中間體自然殺傷細胞群，其中基本上大多數(shù)具有胎兒基因型。在另一實施方案中，本文提供了來自胎盤的中間體自然殺傷細胞群，其包含具有胎兒基因型的自然殺傷細胞和具有母親表型的自然殺傷細胞。本文還提供了來自胎盤的中間體自然殺傷細胞群，其包含來自非胎盤來源的自然殺傷細胞。例如，在一個實施方案中，本文提供了PINK細胞群，其還包含來自臍帶血、外周血液、骨髓或前述兩種或多種組合的自然殺傷細胞。包含PINK細胞和來自非胎盤來源的自然殺傷細胞的自然殺傷細胞群可以包含例如如下比例的細胞：約1:10、2:9、3:8、4:7:、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、10:1、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1：15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95或約1:100等。本發(fā)明進一步提供了臍帶血和分離的PINK細胞的組合。在各種實施方案中，臍帶血與PINK細胞的混合比例為每毫升臍帶血約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、或5×108或更多個PINK細胞。本發(fā)明還提供分離PINK細胞的方法。在一個實施方案中，通過如下方法收集PINK細胞：獲得胎盤灌洗液，然后將所述胎盤灌洗液與特異性結合CD56+細胞的組分例如抗CD56的抗體接觸，之后基于所述結合分離CD56+細胞，形成CD56+細胞群。所述CD56+細胞群包含分離的自然殺傷細胞群。在具體實施方案中，將CD56+細胞與特異性結合CD16+細胞的組分例如抗CD16的抗體，并從CD56+細胞群中排除CD16+細胞。在另一具體實施方案中，還從所述CD56+細胞群中排除了CD3+細胞。在一個實施方案中，從胎盤灌洗液如下獲得PINK細胞。將分娩后的人胎盤排血，并例如用約200-800mL的灌洗溶液僅灌洗流過胎盤血管系統(tǒng)。在具體實施方案中，在所述灌洗之前，去除所述胎盤的臍帶血，并例如用灌洗溶液沖洗胎盤血管系統(tǒng)除去殘余血液。收集灌洗液，并且處理除去任何殘留的紅細胞。在灌洗液的所有有核細胞中的自然殺傷細胞可以基于CD56和CD16的表達來分離。在某些實施方案中，PINK細胞的分離包括使用針對CD56的抗體分離，其中分離的細胞為CD56+。在另一實施方案中，PINK細胞的分離包括使用針對CD16的抗體分離，其中分離的細胞為CD16-。在另一實施方案中，PINK細胞的分離包括使用針對CD56的抗體分離，并且使用針對CD16的抗體排除眾多非-PINK細胞，其中分離的細胞包含CD56+、CD16-細胞。細胞分離可以通過本領域已知的任何方法來實現(xiàn)，例如熒光激活細胞分類術(FACS)，或者優(yōu)選地使用偶聯(lián)特定抗體的微珠的磁性細胞分類術。可以使用例如AUTOMACSTMSeparator(Miltenyi)進行磁性細胞分離和并實現(xiàn)自動化。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離胎盤自然殺傷細胞的方法，該方法包括獲得眾多胎盤細胞，從所述眾多胎盤細胞中分離自然殺傷細胞。在具體實施方案中，所述胎盤細胞是或包含胎盤灌洗液細胞，例如來自胎盤灌洗液的所有有核細胞。在另一具體實施方案中，所述眾多胎盤細胞是或包含通過機械消化和/或酶消化胎盤組織獲得的胎盤細胞。在另一實施方案中，使用一種或多種抗體進行所述分離。在更具體的實施方案中，所述一種或多種抗體包含一種或多種針對CD3、CD16或CD56的抗體。在更具體的實施方案中，所述分離包括在所述眾多胎盤細胞中將CD56+細胞與CD56-細胞分離。在更具體的實施方案中，所述分離包括將CD56+、CD16-胎盤細胞，例如胎盤自然殺傷細胞(例如PINK細胞)，與CD56-或CD16+胎盤細胞分離。在更具體的實施方案中，所述分離包括將CD56+、CD16-、CD3-胎盤細胞與CD56+、CD16+或CD3+胎盤細胞分離。在另一實施方案中，所述分離胎盤自然殺傷細胞的方法生成的胎盤細胞群中至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或至少99%的細胞是CD56+、CD16-自然殺傷細胞。5.4.來自匹配的灌洗液和臍帶血的胎盤自然殺傷細胞本發(fā)明進一步提供了從匹配單元的胎盤灌洗液和臍帶血的組合獲得的和可獲得的自然殺傷細胞，本文稱為混合的自然殺傷細胞。本文使用的“匹配單元”表示，NK細胞從胎盤灌洗液細胞和臍帶血細胞獲得，其中所述臍帶血細胞從胎盤的臍帶血獲得，所述胎盤灌洗液也獲自所述胎盤，即所述胎盤灌洗液細胞和臍帶血細胞以及從其中各自得到的自然殺傷細胞都來自相同的個體。在某些實施方案中，混合的胎盤殺傷細胞僅包含、或基本上僅包含CD56+和CD16-的自然殺傷細胞。在某些其它實施方案中，混合的胎盤殺傷細胞包含CD56+和CD16-的NK細胞以及CD56+和CD16+的NK細胞。在某些具體實施方案中，所述混合的胎盤殺傷細胞包含至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的CD56+CD16-自然殺傷細胞(PINK細胞)。在一個實施方案中，所述混合的自然殺傷細胞未經(jīng)培養(yǎng)。在具體實施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的更高數(shù)量的CD3-CD56+CD16-自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的更低數(shù)量的CD3-CD56+CD16-自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的更高數(shù)量的CD3-CD56+KIR2DL2/L3+自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的更低數(shù)量的CD3-CD56+NKp46+自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的更低數(shù)量的CD3-CD56+NKp30+自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的更低數(shù)量的CD3-CD56+2B4+自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的更低數(shù)量的CD3-CD56+CD94+自然殺傷細胞。在另一實施方案中，所述混合的自然殺傷細胞已經(jīng)培養(yǎng)例如21天。在具體實施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的更低數(shù)量的CD3-CD56+KIR2DL2/L3+自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，所述混合的自然殺傷細胞未經(jīng)培養(yǎng)。在另一具體實施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的更高數(shù)量的CD3-CD56+NKp44+自然殺傷細胞。在具體實施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞包含可檢測的更高數(shù)量的CD3-CD56+NKp30+自然殺傷細胞。在另一實施方案中，與等量的外周血液自然殺傷細胞相比，所述混合的自然殺傷細胞表達可檢測的更高量的粒酶B。本發(fā)明進一步提供了臍帶血和混合的自然殺傷細胞的組合。在各種實施方案中，臍帶血與混合的自然殺傷細胞的混合比例為每毫升臍帶血約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108個混合的自然殺傷細胞。5.5.灌洗液/細胞組合除了胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和胎盤自然殺傷細胞(例如胎盤中間體自然殺傷細胞)之外，本發(fā)明還提供了包含所述灌洗液或細胞的組合物，其用于抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的增殖。5.5.1.胎盤灌洗液、灌洗液細胞和來自胎盤的中間體自然殺傷細胞的組合本發(fā)明進一步提供了組合物，其包含在以上5.1、5.3或5.4部分中描述的胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、胎盤中間體自然殺傷細胞和/或混合的自然殺傷細胞的組合。在一個實施方案中，例如，本發(fā)明提供了一定體積的胎盤灌洗液，其中補充了眾多胎盤灌洗液細胞和/或眾多胎盤自然殺傷細胞，例如從胎盤灌洗液細胞、或經(jīng)機械破壞或酶破壞的胎盤組織獲得的胎盤中間體自然殺傷細胞。在具體實施方案中，例如每毫升胎盤灌洗液補充了約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多個胎盤灌洗液細胞、胎盤中間體自然殺傷細胞和/或混合的自然殺傷細胞。在另一實施方案中，眾多胎盤灌洗液細胞補充了胎盤灌洗液、胎盤中間體自然殺傷細胞和/或混合的自然殺傷細胞。在另一實施方案中，眾多胎盤中間體自然殺傷細胞補充了胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或混合的自然殺傷細胞。在某些實施方案中，當灌洗液被用于補充時，灌洗液的體積是、大于或少于細胞(溶液中)加灌洗液總體積的約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%或1%。在某些其它實施方案中，當胎盤灌洗液細胞與眾多PINK細胞和/或混合的自然殺傷細胞混合時，所述胎盤灌洗液細胞通常包含大約、大于約或小于約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%或1%的細胞總數(shù)。在某些其它實施方案中，當PINK細胞與眾多胎盤灌洗液細胞和/或混合的自然殺傷細胞混合時，所述PINK細胞通常包含大約、大于約或小于約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%或1%的細胞總數(shù)。在某些其它實施方案中，當混合的自然殺傷細胞與PINK細胞和/或胎盤灌洗液細胞混合時，所述混合的自然殺傷細胞通常包含大約、大于約或小于約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%或1%的細胞總數(shù)。在某些其它實施方案中，當PINK細胞、混合的自然殺傷細胞或胎盤灌洗液細胞被用于補充胎盤灌洗液時，其中懸浮了細胞的溶液(例如鹽溶液、培養(yǎng)基等)的體積包含灌洗液加細胞總體積的大約、大于約、或小于約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%或1%，其中在補充前，PINK細胞以每毫升約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多個細胞懸浮。在其它實施方案中，任一上述組合都隨后與臍帶血或來自臍帶血的有核細胞混合。本發(fā)明進一步提供了匯總的胎盤灌洗液，其從兩種或多種來源(例如兩個或多個胎盤)獲得，并混合(例如匯總)。這樣的匯總的灌洗液可以包含大約等體積的來自各來源的灌洗液，或可以包含不同體積的來自各來源的灌洗液。來自各來源的相對體積可以隨機地選擇，或可基于例如一種或多種細胞因素(例如細胞因子、生長因子、激素等)的濃度或數(shù)量、來自各來源的灌洗液中胎盤細胞的數(shù)量、或來自各來源的灌洗液的其它特征選擇。來自相同胎盤的多次灌洗的灌洗液可以類似地匯總。類似地，本發(fā)明提供了胎盤灌洗液細胞和來自胎盤的中間體自然殺傷細胞，其從兩個或多個來源(例如兩個或多個胎盤)獲得并匯總。這樣的匯總的細胞可以包含大約等量的來自兩個或多個來源的細胞，或不同數(shù)量的來自一個或多個匯總來源的細胞。來自各來源的細胞的相對量可以基于例如待匯總的細胞中一種或多種特定細胞類型的數(shù)量，例如CD34+細胞的數(shù)量、CD56+細胞的數(shù)量等來選擇。匯總庫(Pool)可包含例如補充了胎盤灌洗液細胞的胎盤灌洗液；補充了來自胎盤的中間體自然殺傷(PINK)細胞的胎盤灌洗液；同時補充了胎盤灌洗液細胞和PINK細胞的胎盤灌洗液；補充了胎盤灌洗液的胎盤灌洗液細胞；補充了PINK細胞的胎盤灌洗液細胞；同時補充了胎盤灌洗液和PINK細胞的胎盤灌洗液細胞；補充了胎盤灌洗液的PINK細胞；補充了胎盤灌洗液細胞的PINK細胞；或同時補充了胎盤灌洗液細胞和胎盤灌洗液的PINK細胞。本發(fā)明進一步提供了胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和胎盤中間體自然殺傷細胞，及其匯總庫或其組合，已經(jīng)對其進行了測試以確定從例如給定量的胎盤灌洗液或PINK細胞或給定體積的灌洗液預期可產(chǎn)生的腫瘤抑制(即效力)的程度或量。例如，在所述腫瘤細胞將增殖的條件下，將已知數(shù)量的腫瘤細胞與等分試樣或樣本量的細胞接觸，并且將胎盤灌洗液、灌洗液細胞、胎盤自然殺傷細胞或其組合存在時腫瘤細胞隨時間(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周，或更長時間)的增殖速率與在不存在灌洗液、灌洗液細胞、胎盤自然殺傷細胞或其組合時等量腫瘤細胞的增殖速率進行比較。胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或PINK細胞，或其組合或匯總庫的效力可以表示為例如以約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%等抑制腫瘤細胞生長所需的細胞數(shù)量或溶液體積。在某些實施方案中，胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和PINK細胞作為藥物級可施用單位提供。這樣的單位可以以離散的體積提供，例如100mL、150mL、200mL、250mL、300mL、350mL、400mL、450mL、500mL等。也可以提供這樣的單位使得其包含規(guī)定量的例如胎盤灌洗液細胞、胎盤中間體自然殺傷細胞或兩者，例如1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多個細胞/毫升，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多個細胞/單位?？梢蕴峁┻@樣的單位以包含規(guī)定量的胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或PINK細胞中的任何兩種或所有三種。在胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或PINK細胞的上述組合中，胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或PINK細胞中的任一種、任兩種或所有三種可以是接受者自體的(即，從接受者獲得)、或與接受者同源的(即，從除所述接受者之外的至少一個其它個體獲得)。PINK細胞、胎盤灌洗液細胞和/或胎盤灌洗液的任何上述組合或匯總庫可以包含來自例如胎盤灌洗液、外周血液、臍帶血、骨髓等的CD56+CD16+自然殺傷細胞。在具體實施方案中，所述組合包含大約、至少約、或至多約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多個這樣的自然殺傷細胞/毫升，或者1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多個細胞/單位?？梢允褂脧淖匀粊碓捶蛛x的所述CD56+CD16+自然殺傷細胞，或者可以在擴增所述CD56+CD16+自然殺傷細胞之后將其包含在一種上述組合或匯總庫中。所述CD56+CD16+NK細胞可以是自體的(即，從與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或PINK細胞相同的個體獲得的；或者從接受者獲得的)或同源的(即，來源于與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或PINK細胞不同的個體；或者來源于非接受者的個體)。優(yōu)選地，標記每個單位以說明細胞體積、數(shù)量，細胞類型，該單位是否已富集了特定類型的細胞，和/或該單位中給定數(shù)量的細胞的效力，或對特定類型的腫瘤細胞的增殖產(chǎn)生可測量抑制的所述單位的給定毫升數(shù)。本發(fā)明還提供了僅包含胎盤中間體自然殺傷細胞、或包含胎盤中間體自然殺傷細胞與胎盤灌洗液細胞和/或胎盤灌洗液組合的組合物。因而，在另一方面，本發(fā)明提供了包含分離的CD56+、CD16-自然殺傷細胞的組合物，其中所述自然殺傷細胞從胎盤灌洗液分離，且其中所述自然殺傷細胞包含至少50%的所述組合物中的細胞。在具體實施方案中，所述自然殺傷細胞包含至少80%的所述組合物中的細胞。在另一具體實施方案中，所述組合物包含分離的CD56+、CD16+自然殺傷細胞。在更具體的實施方案中，所述CD56+、CD16+自然殺傷細胞與所述CD56+、CD16-自然殺傷細胞來自不同的個體。在另一具體實施方案中，所述自然殺傷細胞來自單個單體。在更具體的實施方案中，所述分離的自然殺傷細胞包含來自至少兩個不同個體的自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，所述組合物包含分離的胎盤灌洗液。在更具體的實施方案中，所述胎盤灌洗液與所述自然殺傷細胞來自相同的個體。在另一更具體的實施方案中，所述胎盤灌洗液包含的胎盤灌洗液與所述自然殺傷細胞來自不同個體。在另一具體實施方案中，所述組合物包含胎盤灌洗液細胞。在更具體的實施方案中，所述胎盤灌洗液細胞與所述自然殺傷細胞來自相同的個體。在另一更具體的實施方案中，所述胎盤灌洗液細胞與所述自然殺傷細胞來自不同的個體。在另一具體實施方案中，所述組合物還包含分離的胎盤灌洗液和分離的胎盤灌洗液細胞，其中所述分離的灌洗液和所述分離的胎盤灌洗液細胞來自不同的個體。在包含胎盤灌洗液的任一上述實施方案的另一更具體的實施方案中，所述胎盤灌洗液包含來自至少兩個個體的胎盤灌洗液。在包含胎盤灌洗液細胞的任一上述實施方案的另一更具體的實施方案中，所述分離的胎盤灌洗液細胞來自至少兩個個體。5.5.2.包含粘附性胎盤干細胞的組合物在其它實施方案中，所述胎盤灌洗液、眾多胎盤灌洗液細胞和/或眾多PINK細胞或任意前述的組合或匯總庫補充了粘附性胎盤干細胞。這樣的干細胞描述在例如Hariri的美國專利號7,045,148和7,255,879中。粘附性胎盤干細胞不是滋養(yǎng)細胞。所述胎盤灌洗液、眾多胎盤灌洗液細胞和/或眾多PINK細胞、或任意前述的組合或匯總庫可以補充例如1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多個細胞/毫升，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或更多個粘附性胎盤細胞。在所述組合中的粘附性胎盤干細胞可以是例如已經(jīng)培養(yǎng)發(fā)生例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次群體倍增或更多的粘附性胎盤干細胞。當在原始培養(yǎng)中或在細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)時，粘附性胎盤干細胞粘附組織培養(yǎng)基質，例如組織培養(yǎng)容器表面(例如組織培養(yǎng)塑料)。培養(yǎng)中的粘附性胎盤干細胞通常具有成纖維樣、星形外觀，具有從中央細胞體延伸出的若干胞質突。然而，在相同條件下，粘附性胎盤干細胞與培養(yǎng)的成纖維細胞在形態(tài)學上是可區(qū)分的，因為胎盤干細胞比成纖維細胞顯示出更多數(shù)量的此類突起。在形態(tài)學上，胎盤干細胞也可和造血干細胞相區(qū)分，培養(yǎng)中的造血干細胞通常呈現(xiàn)更圓或卵圓的形態(tài)學?？捎糜诒疚奶峁┑慕M合物和方法的粘附性胎盤干細胞和胎盤干細胞群表達眾多標記物，這些標記物可被用于鑒別和/或分離所述干細胞或包含所述干細胞的細胞群?？捎糜诒疚奶峁┑慕M合物和方法中的粘附性胎盤干細胞和粘附性干細胞群包括干細胞和直接從胎盤或其任何部分(例如，羊膜、絨毛膜、羊膜-絨毛膜板、胎盤母面絨毛小葉、臍帶等)獲得的含有干細胞的細胞群。在一個實施方案中，所述粘附性胎盤干細胞群是在培養(yǎng)中的粘附性胎盤干細胞群，例如在容器(例如袋)中的細胞群。粘附性胎盤干細胞通常表達標記物CD73、CD105、CD200、HLA-G和/或OCT-4，而不表達CD34、CD38或CD45。粘附性胎盤干細胞也可以表達HLA-ABC(MHC-1)和HLA-DR。這些標記物可用于鑒別粘附性胎盤干細胞，和將胎盤干細胞與其它干細胞類型相區(qū)分。因為胎盤干細胞可以表達CD73和CD105，它們可以具有間充質干細胞樣特征。然而，因為所述粘附性胎盤干細胞可以表達CD200和HLA-G(一種胎兒特異性標記物)，它們可以與既不表達CD200也不表達HLA-G的間充質干細胞(例如來自骨髓的間充質干細胞)相區(qū)分。同樣地，CD34、CD38和/或CD45表達的缺乏確定所述粘附性胎盤干細胞不是造血干細胞。在一個實施方案中，所述粘附性胎盤干細胞是CD200+、HLA-G+的，其中所述干細胞可檢測地抑制癌細胞增殖或腫瘤生長。在具體實施方案中，所述粘附性干細胞也是CD73+和CD105+的。在另一具體實施方案中，所述粘附性干細胞也是CD34-、CD38-或CD45-的。在更具體的實施方案中，所述粘附性干細胞也是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+和CD105+的。在另一實施方案中，當在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時，所述粘附性干細胞生成一個或多個胚樣體。在另一實施方案中，所述粘附性胎盤干細胞是CD73+、CD105+、CD200+的，其中所述干細胞可檢測地抑制癌細胞增殖或腫瘤生長。在所述群的具體實施方案中，所述粘附性干細胞是HLA-G+的。在另一具體實施方案中，所述粘附性干細胞是CD34-、CD38-或CD45-的。在另一具體實施方案中，所述粘附性干細胞是CD34-、CD38-和CD45-的。在更具體的實施方案中，所述粘附性干細胞是CD34-、CD38-、CD45-和HLA-G+的。在另一具體實施方案中，當在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時，所述粘附性胎盤干細胞生成一個或多個胚樣體。在另一實施方案中，所述粘附性胎盤干細胞是CD200+、OCT-4+的，其中所述干細胞可檢測地抑制癌細胞增殖或腫瘤生長。在具體實施方案中，所述粘附性干細胞是CD73+和CD105+的。在另一具體實施方案中，所述粘附性干細胞是HLA-G+的。在另一具體實施方案中，所述粘附性干細胞是CD34-、CD38-和CD45-的。在另一具體實施方案中，所述粘附性干細胞是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+和HLA-G+的。在另一具體實施方案中，當在允許胚樣體的形成條件下培養(yǎng)時，所述粘附性胎盤干細胞生成一個或多個胚樣體。在另一實施方案中，所述粘附性胎盤干細胞是CD73+、CD105+和HLA-G+的，其中所述粘附性干細胞可檢測地抑制癌細胞增殖或腫瘤生長。在上述多個方案的具體實施方案中，所述粘附性干細胞也是CD34-、CD38-或CD45-的。在另一具體實施方案中，所述粘附性干細胞也是CD34-、CD38-和CD45-的。在另一具體實施方案中，所述粘附性干細胞也是OCT-4+的。在另一具體實施方案中，所述粘附性干細胞也是CD200+的。在更具體的實施方案中，所述粘附性干細胞也是CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+和CD200+的。在另一實施方案中，所述粘附性胎盤干細胞是CD73+、CD105+干細胞，其中當在允許胚樣體形成的條件下時，所述干細胞生成一個或多個胚樣體，并且其中所述粘附性干細胞可檢測地抑制癌細胞增殖或腫瘤生長。在具體實施方案中，所述粘附性干細胞也是CD34-、CD38-或CD45-的。在另一具體實施方案中，所述粘附性干細胞也是CD34-、CD38-和CD45-的。在具體實施方案中，所述粘附性干細胞也是OCT-4+的。在更具體的實施方案中，所述粘附性干細胞也是OCT-4+、CD34-、CD38-和CD45-的。在另一實施方案中，所述粘附性胎盤干細胞是OCT-4+干細胞，其中當在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時，所述干細胞生成一個或多個胚樣體，并且其中所述干細胞已經(jīng)被證實可檢測地抑制癌細胞增殖或腫瘤生長。在各種實施方案中，至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的所述分離的胎盤細胞是OCT4+干細胞。在上述群的具體實施方案中，所述干細胞是CD73+和CD105+的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD34-、CD38-或CD45-的。在另一具體實施方案中，所述干細胞是CD200+的。在更具體的實施方案中，所述粘附性干細胞也是CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-和CD45-的。在另一具體實施方案中，所述群已經(jīng)過擴增，例如已傳代至少一次、至少三次、至少五次、至少10次、至少15次或至少20次。在任意上述實施方案的更具體的實施方案中，所述粘附性胎盤細胞表達ABC-p(一種胎盤-特異性ABC轉運蛋白；參見，例如Allikmets等人，CancerRes.58(23):5337-9(1998))。在另一實施方案中，所述粘附性胎盤干細胞是CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、CD200+、CD34-和CD133-的。在另一實施方案中，所述粘附性胎盤干細胞、胎盤干細胞組成性分泌IL-6、IL-8和單核細胞趨化蛋白(MCP-1)。每種上述提及的胎盤干細胞可以包含從哺乳動物胎盤直接獲得和分離的胎盤干細胞，或已經(jīng)過培養(yǎng)和傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30或更多次的胎盤干細胞，或其組合。腫瘤細胞抑制性的大量上述粘附性胎盤干細胞可以包含大約、至少或不超過1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多個粘附性胎盤干細胞。5.5.3.包含胎盤干細胞條件培養(yǎng)基的組合物本發(fā)明還提供了包含PINK細胞、胎盤灌洗液和/或胎盤灌洗液以及另外的條件培養(yǎng)基的腫瘤-抑制性組合物的用途。粘附性胎盤干細胞、胎盤灌洗液細胞和/或胎盤中間體自然殺傷細胞可用于生成腫瘤細胞抑制性的條件培養(yǎng)基，即包含干細胞分泌或排出的一種或多種生物分子的培養(yǎng)基，其對眾多的一種或多種類型的免疫細胞具有可檢測的腫瘤細胞抑制作用。在各種實施方案中，所述條件培養(yǎng)基包含胎盤細胞(例如干細胞、胎盤灌洗液細胞、PINK細胞)已在其中生長了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天的培養(yǎng)基。在其它實施方案中，所述條件培養(yǎng)基包含胎盤細胞已在其中生長至至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%匯合或直至100%匯合的培養(yǎng)基。這樣的條件培養(yǎng)基可用于支持獨立的胎盤細胞群或另一類型的細胞群的培養(yǎng)。在另一實施方案中，本文提供的條件培養(yǎng)基包含粘附性胎盤干細胞和非胎盤干細胞已在其中經(jīng)過培養(yǎng)的培養(yǎng)基。這樣的條件培養(yǎng)基可以與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或胎盤中間體自然殺傷細胞中的任一種或任意組合混合以形成腫瘤細胞抑制性組合物。在某些實施方案中，所述組合物包含小于一半體積的條件培養(yǎng)基，例如大約或小于約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%體積。因而，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種包含來自胎盤干細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其中所述胎盤干細胞(a)粘附于基質；(b)表達CD200和HLA-G，或表達CD73、CD105和CD200，或表達CD200和OCT-4，或表達CD73、CD105和HLA-G，或表達CD73和CD105且當在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)包含所述胎盤干細胞的胎盤細胞群時促進所述群中形成一個或多個胚樣體，或者表達OCT-4且當在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)包含所述胎盤干細胞的胎盤細胞群時促進所述群中形成一個或多個胚樣體；和(c)可檢測地抑制腫瘤細胞或腫瘤細胞群的生長或增殖。在具體實施方案中，所述組合物進一步包含眾多所述胎盤干細胞。在另一具體實施方案中，所述組合物包含眾多非胎盤細胞。在更具體的實施方案中，所述非胎盤細胞包含CD34+細胞，例如造血祖細胞(例如外周血液造血祖細胞、臍帶血造血祖細胞或胎盤血造血祖細胞)。所述非胎盤細胞也可以包含其它干細胞，例如間充質干細胞(例如來自骨髓的間充質干細胞)。所述非胎盤細胞也可以是一種或多種類型成年細胞或細胞系。在另一具體實施方案中，所述組合物包含抗增殖試劑，例如抗-MIP-1α或抗-MIP-1β抗體。在具體實施方案中，胎盤細胞-條件化的培養(yǎng)基或上清液是從與眾多腫瘤細胞共培養(yǎng)的眾多胎盤干細胞得到的，所述胎盤干細胞與腫瘤細胞的比例為約1:1、約2:1、約3:1、約4:1或約5:1。例如，所述條件化的培養(yǎng)基或上清液可以從包含約1×105個胎盤干細胞、約1×106個胎盤干細胞、約1×107個胎盤干細胞或約1×108個胎盤干細胞或更多個胎盤干細胞的培養(yǎng)物中得到的。在另一具體實施方案中，所述條件化的培養(yǎng)基或上清液是從包含如下細胞的共同培養(yǎng)物中得到的：約1×105至約5×105個胎盤干細胞和約1×105個腫瘤細胞；約1×106至約5×106個胎盤干細胞和約1×106個腫瘤細胞；約1×107至約5×107個胎盤干細胞和約1×107個腫瘤細胞；或約1×108至約5×108個胎盤干細胞和約1×108個腫瘤細胞。在具體實施方案中，適于施用至70kg個體的條件培養(yǎng)基包含的上清液是被約200mL培養(yǎng)基中的約7千萬個胎盤干細胞條件化的?？梢詽饪s條件培養(yǎng)基以制備可施用的藥物級產(chǎn)品。例如，通過除去水(例如通過蒸發(fā)、冷凍干燥等)，可將培養(yǎng)基濃縮至約90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或更少。在具體實施方案中，例如，來自約7千萬胎盤干細胞的200mL條件培養(yǎng)基可被濃縮至約180mL、160mL、140mL、120mL、100mL、80mL、60mL、40mL、20mL或更少的體積。所述條件培養(yǎng)基也可以例如通過蒸發(fā)、冷凍干燥等手段基本上干燥成例如粉末。5.6.灌洗液和胎盤細胞的保存胎盤灌洗液或胎盤細胞，例如灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和PINK細胞可以保存，即放置在允許長期儲存的條件下，或放置在抑制細胞死亡(例如因凋亡或壞死而死亡)的條件下。胎盤灌洗液可以通過使胎盤細胞組合物流經(jīng)至少一部分胎盤(例如流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng))而生成。所述胎盤細胞采集組合物包含一種或多種能夠保存包含在灌洗液內的細胞的化合物。這樣的胎盤細胞采集組合物在上述部分5.1中描述，例如包含細胞凋亡抑制劑、壞死抑制劑和/或載氧全氟化碳的組合物，如在2006年12月28日提交的題為“ImprovedCompositionforCollectingandPreservingPlacentalStemCellsandMethodsofUsingtheComposition(采集和保存胎盤干細胞的改進組合物和使用該組合物的方法)”的相關美國申請?zhí)?1/648,812中所述。在一個實施方案中，流經(jīng)胎盤或胎盤組織的胎盤細胞采集組合物是可用于下述部分5.4中描述的方法的胎盤灌洗液。在一個實施方案中，通過將細胞與包含細胞凋亡抑制劑和載氧全氟化碳的胎盤細胞采集組合物接觸，從哺乳動物(例如人)分娩后的胎盤收集胎盤灌洗液和/或胎盤細胞，其中和沒有與細胞凋亡抑制劑接觸的干細胞群相比，所述細胞凋亡抑制劑存在的量和時間足以減少或預防干細胞群的細胞凋亡。例如，可以用胎盤細胞采集組合物灌洗所述胎盤并從中分離胎盤細胞(例如所有有核胎盤細胞)。在具體實施方案中，細胞凋亡抑制劑是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑。在另一具體實施方案中，所述細胞凋亡抑制劑為JNK抑制劑。在更具體的實施方案中，所述JNK抑制劑不能調節(jié)所述干細胞的分化或增殖。在另一實施方案中，所述胎盤細胞采集組合物在分離相中包含所述細胞凋亡抑制劑和所述載氧全氟化碳。在另一實施方案中，所述胎盤細胞采集組合物在乳液中包含的所述細胞凋亡抑制劑和所述載氧全氟化碳。在另一實施方案中，所述胎盤細胞采集組合物還包含乳化劑，例如卵磷脂。在另一實施方案中，在接觸胎盤細胞時,所述細胞凋亡抑制劑和所述全氟化碳為約0℃至約25℃之間。在另一更具體的實施方案中，在接觸胎盤細胞時，所述細胞凋亡抑制劑和所述全氟化碳在約2℃至10℃之間、或約2℃至約5℃之間。在另一更具體的實施方案中，所述接觸在轉運所述干細胞群期間進行。在另一更具體的實施方案中，所述接觸在冷凍和解凍所述干細胞群期間進行。在另一實施方案中，可以通過將所述灌洗液和/或細胞與細胞凋亡抑制劑和器官-保存化合物接觸來收集和保存胎盤灌洗液和/或胎盤細胞，其中與沒有和所述細胞凋亡抑制劑接觸的灌洗液或胎盤細胞相比，所述細胞凋亡抑制劑存在的量和時間足以減少或預防所述細胞的凋亡。在具體實施方案中，所述器官-保存化合物為UW溶液(描述在美國專利號4,798,824中；也稱為VIASPANTM；也可參見Southard等人，Transplantation49(2):251-257(1990)或描述在Stern等人，美國專利號5,552,267中的溶液。在另一實施方案中，所述器官-保存組合物為羥乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖或其組合。在另一實施方案中，所述胎盤細胞采集組合物還在兩相中或作為乳液包含載氧全氟化碳。在所述方法的另一實施方案中，在灌洗期間，將胎盤灌洗液和/或胎盤細胞與包含細胞凋亡抑制劑和載氧全氟化碳、器官-保存化合物、或其組合的胎盤細胞采集組合物接觸。在另一實施方案中，在通過灌洗進行收集之后，將胎盤細胞與所述干細胞采集組合物接觸。典型地，在胎盤細胞收集、富集和分離期間，優(yōu)選地減少或消除由于缺氧和機械應力引起的細胞應激。因此，在所述方法的另一實施方案中，在所述保存期間，在收集、富集或分離期間，胎盤灌洗液、胎盤細胞或胎盤細胞群暴露于缺氧狀態(tài)下少于六小時，其中缺氧狀態(tài)為氧濃度低于正常血氧濃度。在更具體的實施方案中，在所述保存期間，所述胎盤細胞群暴露于所述缺氧狀態(tài)下少于兩小時。在另一更具體的實施方案中，在收集、富集或分離期間，將所述胎盤細胞群暴露于所述缺氧狀態(tài)少于一小時、或少于三十分鐘、或不暴露于缺氧狀態(tài)下。在另一具體實施方案中，在收集、富集或分離期間，所述胎盤細胞群不暴露于剪切應力下。本文提供的胎盤細胞可以冷凍保存在例如在小容器(例如安瓿)中的冷凍保存培養(yǎng)基中。合適的冷凍保存培養(yǎng)基包括但不限于培養(yǎng)基，包括例如生長培養(yǎng)基或細胞冷凍培養(yǎng)基，例如市售的細胞冷凍培養(yǎng)基，例如C2695、C2639或C6039(Sigma)。冷凍保存培養(yǎng)基優(yōu)選地包含濃度為例如約10%(v/v)的DMSO(二甲亞砜)。冷凍保存培養(yǎng)基可以包含另外的試劑，例如甲基纖維素和/或甘油。在冷凍保存期間，優(yōu)選地將胎盤細胞以約1℃/分鐘冷卻。優(yōu)選的冷凍保存溫度為約-80℃至約-180℃，優(yōu)選地約-125℃至約-140℃。在解凍使用之間，可以將冷凍保存的胎盤細胞轉移到液氮中。在某些實施方案中，例如，一旦安瓿達到約-90℃，將其轉移到液氮貯存區(qū)。冷凍保存的細胞優(yōu)選地在約25℃至約40℃的溫度下解凍，優(yōu)選地在約37℃的溫度解凍。5.7.胎盤灌洗液、PINK細胞和混合的胎盤自然殺傷細胞抑制腫瘤細胞生長的用途本發(fā)明還提供了使用胎盤灌洗液、從胎盤灌洗液分離的細胞、分離的混合自然殺傷細胞或分離的胎盤自然殺傷細胞(例如來自胎盤的中間體自然殺傷細胞)抑制腫瘤細胞生長(例如增殖)的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞增殖的方法，該方法包括將腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、分離的混合自然殺傷細胞和/或PINK細胞接觸，使得與沒有和胎盤灌洗液、灌洗液細胞、分離的混合自然殺傷細胞和/或PINK細胞接觸的同樣類型腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞相比，所述腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的增殖可檢測地減少了。在一個實施方案中，本文使用的“接觸”包含在胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、胎盤自然殺傷細胞(例如胎盤中間體自然殺傷細胞)和/或分離的混合自然殺傷細胞以及腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞之間的直接物理接觸，例如細胞-細胞接觸。在另一實施方案中，“接觸”包含存在于相同的物理空間中，例如將胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、胎盤自然殺傷細胞(例如胎盤中間體自然殺傷細胞)和/或分離的混合自然殺傷細胞與腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞置于相同的容器中，例如培養(yǎng)皿(多孔板)中。在另一實施方案中，將胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、混合自然殺傷細胞或胎盤中間體自然殺傷細胞與腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞“接觸”是通過例如將所述胎盤灌洗液或細胞(例如胎盤灌洗液細胞)、混合的自然殺傷細胞或胎盤中間體自然殺傷細胞注射或輸注到個體中完成的，所述個體例如包含腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的人，例如癌癥患者。在某些實施方案中，將胎盤灌洗液以能對包含腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的個體(例如癌癥患者)產(chǎn)生可檢測的治療益處的任何量使用。在某些其它實施方案中，將胎盤灌洗液細胞、胎盤中間體自然殺傷細胞和/或混合的自然殺傷細胞以能對包含腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的個體(例如癌癥患者)產(chǎn)生可檢測的治療益處的任何量使用。因而，在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞增殖的方法，該方法包括在個體內將腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或來自胎盤的中間體自然殺傷細胞或眾多PINK細胞接觸，使得所述接觸對所述個體有可檢測的或可證實的治療益處。本文使用的“治療益處”包括但不限于例如減小腫瘤的尺寸；減輕或終止腫瘤的擴張；減少每單位體積的組織樣品例如血樣中的癌細胞數(shù)量；臨床上改善所述個體患有的具體癌癥的任何癥狀，減輕或終止所述個體患有的具體癌癥的任何癥狀的惡化等。實現(xiàn)任一或多項這樣的治療益處的胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或PINK細胞的接觸被稱作是治療有益的。在某些實施方案中中，將胎盤灌洗液細胞，例如來自胎盤灌洗液的有核細胞、混合的自然殺傷細胞和/或胎盤中間體自然殺傷細胞以能對包含腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的個體(例如癌癥患者)產(chǎn)生可檢測的治療益處的任何量或數(shù)量使用?？梢詫⑻ケP灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和/或胎盤自然殺傷細胞(例如胎盤中間體自然殺傷細胞)以一定的細胞數(shù)量施用至這樣的個體，例如可以向所述個體施用大約、至少約或至多約1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010或5×1010個胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和/或自然殺傷細胞。在其它實施方案中，可以將胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和/或來自胎盤的中間體自然殺傷細胞以一定的細胞數(shù)量施用至這樣的個體，例如可以向所述個體施用大約、至少約或至多約1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010或5×1010個胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和/或自然殺傷細胞/每千克個體?？梢愿鶕?jù)胎盤灌洗液細胞和/或胎盤自然殺傷細胞(例如胎盤中間體自然殺傷細胞)與所述個體中腫瘤細胞的近似比例向這樣的個體施用胎盤灌洗液細胞和/或來自胎盤的中間體自然殺傷細胞。例如，可以將胎盤灌洗液細胞和/或胎盤自然殺傷細胞(例如胎盤中間體自然殺傷細胞)與個體的腫瘤細胞數(shù)以大約、至少約或至多約1:1、1:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1的比例施用至所述個體。在這樣的個體中的腫瘤細胞的數(shù)量可以例如通過對來自所述個體的組織樣品(例如血樣、活組織檢查等)中的腫瘤細胞計數(shù)來估計。在具體實施方案中，例如，對于實體瘤，所述計數(shù)與對所述腫瘤成像以獲得近似腫瘤體積結合進行。本發(fā)明進一步提供一種使用胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和/或來自胎盤的中間體自然殺傷細胞的組合抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞增殖的方法。在各種實施方案中，本發(fā)明提供了一種抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞增殖的方法，該方法包括將所述腫瘤細胞與如下物質接觸：補充了眾多胎盤灌洗液細胞或PINK細胞的胎盤灌洗液；補充了胎盤灌洗液或眾多PINK細胞的胎盤灌洗液細胞；補充了胎盤灌洗液和胎盤灌洗液細胞的PINK細胞；眾多PINK細胞和眾多混合的自然殺傷細胞；眾多混合的自然殺傷細胞和眾多胎盤灌洗液細胞；補充了混合的自然殺傷細胞的胎盤灌洗液；或胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和PINK細胞全部的組合。在一個具體實施方案中，例如，腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的增殖被補充了眾多胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和/或眾多胎盤中間體自然殺傷細胞的胎盤灌洗液所抑制。在具體實施方案中，例如每毫升的胎盤灌洗液補充了約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106或更多個胎盤灌洗液細胞或胎盤中間體自然殺傷細胞。在其它具體實施方案中，胎盤灌洗液，例如一單元(即，來自單個胎盤的收集物)或約100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000mL的灌洗液補充了約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多個PINK細胞、混合的自然殺傷細胞和/或胎盤灌洗液細胞/毫升，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多個PINK細胞、混合的自然殺傷細胞和/或胎盤灌洗液細胞。在另一具體實施方案中，腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的增殖被補充了胎盤灌洗液、混合的自然殺傷細胞和/或眾多胎盤中間體自然殺傷細胞的眾多胎盤灌洗液細胞所抑制。在更具體實施方案中，約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多個胎盤灌洗液細胞/毫升，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多個胎盤灌洗液細胞補充了大約、或至少約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多個PINK細胞和/或混合的自然殺傷細胞/毫升，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011>更多個PINK細胞。在其它更具體實施方案中，約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多個胎盤灌洗液細胞、PINK細胞和/或混合的自然殺傷細胞/毫升，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多個胎盤灌洗液細胞補充了大約、或至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000mL的灌洗液或約1單元的灌洗液。在另一具體實施方案中，腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的增殖被補充了胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞和/或混合的自然殺傷細胞的眾多胎盤中間體自然殺傷細胞所抑制。在更具體實施方案中，約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多個胎盤中間體自然殺傷細胞，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多個PINK細胞補充了約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多個胎盤灌洗液細胞和/或混合的自然殺傷細胞/毫升，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多個胎盤灌洗液細胞和/或混合的自然殺傷細胞。在其它更具體實施方案中，約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多個胎盤灌洗液細胞和/或混合的自然殺傷細胞/毫升，或1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多個胎盤中間體自然殺傷細胞和/或混合的自然殺傷細胞補充了大約、或至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000mL的灌洗液或約1單元的灌洗液。在另一具體實施方案中，通過將腫瘤細胞與補充了粘附性胎盤干細胞的胎盤灌洗液、灌洗液細胞、PINK細胞和/或混合的自然殺傷細胞接觸來抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的增殖。在具體實施方案中，所述胎盤灌洗液、灌洗液細胞或PINK細胞補充了約1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108或更多個粘附性胎盤干細胞/毫升，或者1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011或更多個粘附性胎盤干細胞。在另一實施方案中，通過將腫瘤細胞與補充了粘附性胎盤干細胞-條件培養(yǎng)基的胎盤灌洗液、灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和/或PINK細胞接觸來抑制腫瘤細胞或眾多腫瘤細胞的增殖，例如每單位灌洗液、灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞和/或PINK細胞，或每104、105、106、107、108、109或1010個細胞補充了0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.1、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mL的干細胞條件化培養(yǎng)基。在其它實施方案中，所述胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、胎盤自然殺傷細胞(例如PINK細胞)、混合的自然殺傷細胞，及包含它們的組合和匯總庫按其最初獲得的形式使用，即灌洗液是灌洗期間獲得的，胎盤灌洗液細胞是從這樣的灌洗液分離的，混合的自然殺傷細胞是從這樣的灌洗液和匹配的臍帶血得到的，或PINK細胞是從這樣的灌洗液或這樣的胎盤灌洗液細胞分離的。在其它實施方案中，所述胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、PINK細胞及它們的組合和匯總庫在使用前經(jīng)過處理。例如，胎盤灌洗液可以以其從胎盤收集的原始的、未經(jīng)處理的形式被使用。胎盤灌洗液也可以在使用前被處理，例如通過陰性選擇一種或多種類型的細胞，通過脫水減小體積；凍干和再水合等方式進行處理。類似地，灌洗液細胞群可以以其最初從胎盤灌洗液分離的形式(如從胎盤灌洗液分離的所有有核細胞)被使用，或者可以經(jīng)過處理以例如除去一種或多種細胞類型(例如紅細胞)。PINK細胞可以以其最初從胎盤灌洗液分離(例如使用CD56微珠分離)的形式被使用，或者可以經(jīng)過處理例如以除去一種或多種非殺傷細胞類型。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種抑制腫瘤細胞增殖的方法，該方法包括將用腫瘤細胞與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、PINK細胞、混合的自然殺傷細胞或包含它們的匯總庫或組合接觸，其中在所述接觸之前，所述胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細胞、PINK細胞、混合的自然殺傷細胞或包含它們的匯總庫或組合已經(jīng)與白細胞介素-2(IL-2)接觸了一段時間。在某些實施方案中，在所述接觸之前，所述一段時間為大約、至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46或48小時。可以在抗癌治療療程中，向患有癌癥的個體、或具有腫瘤細胞的個體施用一次所述灌洗液、灌洗液細胞、PINK細胞、混合的自然殺傷細胞或它們的匯總庫和/或組合，或者可以施用多次，例如在治療期間，每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小時施用一次，或每1、2、3、4、5、6或7天施用一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周施用一次。可以施用所述灌洗液、灌洗液細胞、PINK細胞、包含它們的匯總庫和/或組合，而不用考慮在過去是否曾向患有癌癥或具有腫瘤細胞的人施用過所述灌洗液、灌洗液細胞、PINK細胞、包含它們的匯總庫和/或組合。因而，本文提供的方法包括向患有癌癥或具有腫瘤細胞的人施用胎盤灌洗液、灌洗液細胞、PINK細胞、包含它們的匯總庫和/或組合的任一種組合。在具體實施方案中，所述腫瘤細胞為血癌細胞。在各種具體實施方案中，所述腫瘤細胞為原發(fā)性導管癌細胞、白血病細胞、急性T細胞白血病細胞、慢性髓細胞樣淋巴瘤(CML)細胞、急性髓性白血病細胞、慢性髓性白血病(CML)細胞、肺癌細胞、結腸腺癌細胞、組織細胞性淋巴瘤細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞、成視網(wǎng)膜細胞瘤細胞、結腸直腸癌細胞或結腸直腸腺癌細胞。所述胎盤灌洗液、灌洗液細胞、PINK細胞、混合的自然殺傷細胞、包含它們的匯總庫和/或組合可以屬于包括一種或多種其它抗癌劑的抗癌治療方案的一部分。這些抗癌劑是本領域熟知的。除了所述灌洗液、灌洗液細胞、PINK細胞、包含它們的匯總庫和/或組合之外，可以向患有癌癥的個體施用的具體抗癌劑包括但不限于：阿西維辛；阿柔比星；阿考達唑鹽酸鹽；阿克羅寧；阿多來新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；阿美蒽醌乙酸鹽；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；門冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴馬司他；苯佐替派；比卡魯胺；比生群鹽酸鹽；二甲磺酸雙奈法德；比折來新；硫酸博來霉素；布喹那鈉；溴匹立明；白消安；放線菌素C；卡普睪酮；卡醋胺；卡貝替姆；卡鉑；卡氮芥；鹽酸卡柔比星；卡折來新；西地芬戈；塞來考昔(COX-2抑制劑)；苯丁酸氮芥；西羅霉素；順鉑；克拉屈濱；甲磺酸克立那托；環(huán)磷酰胺；阿糖胞苷；達卡巴嗪；更生霉素；鹽酸柔紅霉素；地西他濱；右奧馬鉑；地扎呱寧；甲磺酸地扎呱寧；地吖醌；多西他賽；多柔比星；鹽酸多柔比星；屈洛昔芬；檸檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；達佐霉素；依達曲沙；鹽酸依氟鳥氨酸；依沙蘆星；恩洛鉑；恩普氨酯；依匹哌啶；鹽酸表柔比星；厄布洛唑；鹽酸依索比星；雌莫司??；雌莫司汀磷酸鈉；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；鹽酸法倔唑；法扎拉濱；芬維A胺；氟尿苷；磷酸氟達拉濱；氟尿嘧啶；氟西他濱；磷喹酮；福司曲星鈉；吉西他濱；鹽酸吉西他濱；羥基脲；伊達比星鹽酸鹽；異環(huán)磷酰胺；伊莫福新；異丙鉑；依立替康；鹽酸依立替康；乙酸蘭瑞肽；來曲唑；醋酸亮丙瑞林；鹽酸利阿唑；洛美曲索鈉；環(huán)己亞硝脲；鹽酸洛索蒽醌；馬索羅酚；美登素；鹽酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美侖孕酮；美法侖；美諾立爾；巰嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤鈉；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；絲裂紅素；米托潔林；米托馬星；絲裂霉素；米托司培；米托坦；鹽酸米托蒽醌；麥考酚酸；諾考達唑；諾拉霉素；奧馬鉑；奧昔舒侖；紫杉醇；培門冬酶；佩里霉素；戊氮芥；培洛霉素硫酸鹽；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡羅蒽醌鹽酸鹽；普卡霉素；普洛美坦；卟菲爾鈉；泊非霉素；潑尼莫司??；鹽酸甲基芐肼；嘌呤霉素；鹽酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；沙芬戈；沙芬戈鹽酸鹽；司莫司??；二甲二苯四氮烯；sparfosate鈉；司帕霉素；鹽酸鍺螺胺；螺莫司?。宦葶K；鏈黑菌素；鏈佐星；磺氯苯脲；他利霉素；tecogalan鈉；泰索帝；替加氟；鹽酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替羅昔隆；睪內酯；硫咪嘌呤；硫鳥嘌呤；噻替派；噻唑呋林；替拉扎明；檸檬酸托瑞米芬；乙酸曲托龍；磷酸曲西立濱；三甲曲沙；葡糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；妥布氯唑鹽酸鹽；尿嘧啶氮芥；尿烷亞胺；伐普肽；維替泊芬；硫酸長春堿；硫酸長春新堿；長春地辛；硫酸長春地辛；硫酸長春匹定；硫酸長春甘酯；硫酸長春羅辛；酒石酸長春瑞濱；硫酸長春羅定；硫酸長春利定；伏氯唑；折尼鉑；凈司他?。缓望}酸佐柔比星。其它抗癌藥物包括但不限于：20-表-1,25-二羥維生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龍；阿柔比星；?；幌?；腺環(huán)戊醇；阿多來新；阿地白介素；ALL-TK拮抗劑；六甲蜜胺；氨莫司汀；2,4-二氯苯氧乙酸；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心蓮內酯；血管生成抑制劑；拮抗劑D；拮抗劑G；安雷利克斯；抗背側發(fā)育形態(tài)發(fā)生蛋白-1；抗雄激素藥，前列腺癌；抗雌激素藥；抗瘤酮；反義寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；細胞凋亡基因調節(jié)劑；細胞凋亡調節(jié)劑；無嘌呤酸；阿糖-CDP-DL-PTBA；精氨酸脫氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin1；axinastatin2；axinastatin3；阿扎司瓊；阿扎毒素；重氮酪氨酸；漿果赤霉素III衍生物；balanol；巴馬司他；BCR/ABL拮抗劑；苯并二氫卟吩；苯甲酰星孢素；β內酰胺衍生物；β-alethine；亞阿克拉霉素B；白樺脂酸；bFGF抑制劑；比卡魯胺；比生群；雙氮丙啶基精胺；雙奈法德；bistrateneA；比折來新；breflate；溴匹立明；布度鈦；丁硫氨酸亞砜胺；卡泊三醇；抑激酶素C；喜樹堿衍生物；卡培他濱；甲酰胺-氨基-三唑；羧基酰胺基三唑；CaRestM3；CARN700；軟骨衍生的抑制劑；卡折來新；酪蛋白激酶抑制劑(ICOS)；澳粟精胺；殺菌肽B；西曲瑞克；chlorlns；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；順卟啉；克拉屈濱；克羅米芬類似物；克霉唑；collismycinA；collismycinB；考布他汀A4；考布他汀類似物；conagenin；crambescidin816；克立那托；縮酚酸肽8；縮酚酸肽A衍生物；curacinA；cyclopentanthraquinones；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷十八烷基磷酸鈉；細胞溶解因子；cytostatin；達昔單抗；地西他濱；脫氫膜海鞘素B(dehydrodidemninB)；地洛瑞林；地塞米松；右異環(huán)磷酰胺；右雷佐生；右維拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B；didox；二乙基去甲精胺(diethylnorspermine)；二氫-5-氮胞苷；二氫紫杉醇，9-；dioxamycin；二苯基螺莫司??；多西他賽；二十二烷醇；多拉司瓊；去氧氟尿苷；多柔比星；屈洛昔芬；屈大麻酚；倍癌霉素SA；依布硒啉；依考莫司?。灰赖馗Ｐ?；依決可單抗；依氟鳥氨酸；欖香烯；乙嘧替氟；表柔比星；依立雄胺；雌莫司汀類似物；雌激素激動劑；雌激素拮抗劑；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉濱；芬維A胺；非格司亭；非那司提；黃酮類抗腫瘤藥；氟卓斯汀；fluasterone；氟達拉濱；鹽酸fluorodaunorunicin；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司??；釓替沙林；硝酸鎵；加洛他濱；加尼瑞克；明膠酶抑制劑；吉西他濱；谷胱甘肽抑制劑；hepsulfam；heregulin；六亞甲基雙乙酸胺；金絲桃素；伊班膦酸；伊達比星；艾多昔芬；伊決孟酮；伊莫福新；伊洛馬司他；伊馬替尼(例如)；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰島素樣生長因子-1受體抑制劑；干擾素激動劑；干擾素；白細胞介素；碘芐胍；碘阿霉素；甘薯苦醇，4-；伊羅普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrinB；伊他司瓊；jasplakinolide；kahalalideF；三醋酸片螺素-N；蘭瑞肽；leinamycin；來格司亭；硫酸蘑菇多糖；leptolstatin；來曲唑；白血病抑制因子；白細胞α干擾素；亮丙瑞林+雌激素+黃體酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；線性聚胺類似物；親脂性二糖肽；親脂性鉑類化合物；lissoclinamide7；洛鉑；胍乙基磷酸絲氨酸；洛美曲索；氯尼達明；洛索蒽醌；洛索立賓；勒托替康；德卟啉镥(lutetiumtexaphyrin)；lysofylline；裂解肽；美坦辛；制苷糖酶素A；馬立馬司他；馬索羅酚；乳腺絲抑蛋白(maspin)；基質溶解素抑制劑；基質金屬蛋白酶抑制劑；美諾立爾；美巴龍；美替瑞林；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制劑；米非司酮；米替福新；米立司亭；米托胍腙；二溴衛(wèi)矛醇；絲裂霉素類似物；米托萘胺；mitotoxin成纖維細胞生長因子-皂草素蛋白；米托蒽醌；莫法羅??；莫拉司亭；愛必妥，人絨毛膜促性腺激素；單磷酰脂質A+分支桿菌細胞壁sk；莫哌達醇；芥子類抗癌劑；印度洋海綿(mycaperoxide)B；分支桿菌細胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰基地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；那瑞替噴；納洛酮+噴他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈達鉑；奈莫柔比星；奈立膦酸；尼魯米特；nisamycin；一氧化氮調節(jié)劑；硝基氧抗氧化劑；nitrullyn；奧利默森O6-芐基鳥嘌呤；奧曲肽；okicenone；寡核苷酸；奧那司酮；奧坦西?。话旱に经?；oracin；口服細胞因子誘導物；奧馬鉑；奧沙特??；奧沙利鉑；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇類似物；紫杉醇衍生物；palauamine；棕櫚酰根霉素；帕米磷酸；人參三醇；帕諾米芬；菌鐵素；帕折普?。慌嚅T冬酶；培得星；戊聚糖多硫酸鈉；噴司他?。籶entrozole；全氟溴烷；培磷酰胺；紫蘇子醇；苯連氮霉素；乙酸苯酯；磷酸酶抑制劑；溶血性鏈球菌制劑；鹽酸毛果蕓香堿；吡柔比星；吡曲克辛；placetinA；placetinB；纖溶酶原活化因子抑制劑；鉑絡合物；鉑化合物；鉑-三胺絡合物；卟菲爾鈉；泊非霉素；潑尼松；丙基二吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶體抑制劑；基于蛋白A的免疫調節(jié)劑；蛋白激酶C抑制劑；微藻蛋白激酶C抑制劑；蛋白質酪氨酸磷酸酶抑制劑；嘌呤核苷磷酸化酶抑制劑；紫紅素；吡唑啉吖啶；吡多酸化血紅蛋白聚乙二醇偶聯(lián)物；raf拮抗劑；雷替曲塞；雷莫司瓊；ras-法呢基蛋白轉移酶抑制劑；ras抑制劑；ras-GAP抑制劑；脫甲基瑞替普??；依替磷酸錸Re186；根霉素；核酶；RII維甲酰胺；rohitukine；羅莫肽；羅喹美克；rubiginoneB1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；肉芝軟珊瑚醇(sarcophytol)A；沙格司亭；Sdi1模擬物；司莫司??；衰老衍生抑制劑1；有義寡核苷酸；信號轉導抑制劑；西佐喃；索布佐生；硼卡鈉；苯基乙酸鈉；solverol；生長調節(jié)素結合蛋白；索納明；膦門冬酸；穗霉素D；螺莫司??；脾臟五肽；海綿抑制素1；角鯊胺；stipiamide；溶基質蛋白酶抑制劑；sulfinosine；超活性血管活性腸肽拮抗劑；suradista；蘇拉明；八氫吲嗪三醇；他莫司??；他莫昔芬甲碘化物；?；悄就?；他扎羅??；替可加蘭鈉；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制劑；替莫泊芬；替尼泊苷；十氧化四氯(tetrachlorodecaoxide)；tetrazomine；thaliblastine；噻可拉林；血小板生成素；血小板生成素模擬物；胸腺法新；胸腺生成素受體激動劑；噻可拉林；促甲狀腺激素；錫乙基初紫紅素；替拉扎明；二氯二茂鈦；topsentin；托瑞米芬；翻譯抑制劑；維甲酸；三乙酰尿苷；曲西立濱；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司瓊；妥羅雄脲；酪氨酸激酶抑制劑；酪氨酸磷酸化抑制劑；UBC抑制劑；烏苯美司；來自泌尿生殖竇的生長抑制因子；尿激酶受體拮抗劑；伐普肽；variolinB；維拉雷瑣；藜蘆胺；verdins；維替泊芬；長春瑞濱；vinxaltine；牡荊堿；伏氯唑；扎諾特??；亞芐維C和凈司他丁斯酯。5.8.用免疫調節(jié)化合物處理自然殺傷細胞本文其它部分所述的分離的自然殺傷細胞(例如PINK細胞或混合的自然殺傷細胞)可以用免疫調節(jié)化合物處理，例如與免疫調節(jié)化合物接觸，以增強所述細胞的抗腫瘤活性。因此，本發(fā)明提供了一種增強自然殺傷細胞對腫瘤細胞的細胞毒性的方法，該方法包括將所述自然殺傷細胞與一定濃度的免疫調節(jié)化合物接觸一段時間，與沒有與所述免疫調節(jié)化合物接觸的自然殺傷細胞相比，所述濃度和時間足以使所述自然殺傷細胞表現(xiàn)出對腫瘤細胞增強的細胞毒性。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種增加自然殺傷細胞中粒酶B表達的方法，該方法包括將所述自然殺傷細胞與一定濃度的免疫調節(jié)化合物接觸一段時間，與沒有與所述免疫調節(jié)化合物接觸的自然殺傷細胞相比，所述濃度和時間足以使所述自然殺傷細胞表現(xiàn)出增加的粒酶B的表達。所述免疫調節(jié)化合物可以是如下所述的任一種化合物，例如來那度胺或pomalidomide。本發(fā)明還提供了一種增強自然殺傷細胞群(例如PINK細胞群或混合的自然殺傷細胞群)對眾多腫瘤細胞的細胞毒性的方法，該方法包括將所述自然殺傷細胞群與一定濃度的免疫調節(jié)化合物接觸一段時間，與沒有與所述免疫調節(jié)化合物接觸的等量自然殺傷細胞群相比，所述濃度和時間足以使所述自然殺傷細胞群表現(xiàn)出對所述眾多腫瘤細胞可檢測的增強的細胞毒性。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種增加自然殺傷細胞群中粒酶B表達的方法，該方法包括將所述自然殺傷細胞群與一定濃度的免疫調節(jié)化合物接觸一段時間，與沒有與所述免疫調節(jié)化合物接觸的等量自然殺傷細胞群相比，所述濃度和時間足以使所述自然殺傷細胞群表達可檢測的增多量的粒酶B。在具體實施方案中，所述自然殺傷細胞群包含在胎盤灌洗液細胞(例如來自胎盤灌洗液的所有有核細胞)內。在上述實施方案的具體實施方案中，所述自然殺傷細胞是CD56+、CD16-胎盤中間體自然殺傷細胞(PINK細胞)。在上述實施方案的另一具體實施方案中，所述自然殺傷細胞為混合的自然殺傷細胞，即來自匹配的胎盤灌洗液和臍帶血的自然殺傷細胞。在另一具體實施方案中，與沒有與所述免疫調節(jié)化合物接觸的等量所述自然殺傷細胞相比，與所述免疫調節(jié)化合物接觸的所述眾多自然殺傷細胞(例如PINK細胞或混合的自然殺傷細胞)以更高水平表達BAX、CCL5、CCR5、CSF2、FAS、GUSB、IL2RA或TNFRSF18中的一種或多種。在另一具體實施方案中，與沒有和所述免疫調節(jié)化合物接觸的等量所述自然殺傷細胞相比，與所述免疫調節(jié)化合物接觸的所述眾多自然殺傷細胞(例如PINK細胞)以更高水平表達ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL5、CCR5、CSF1、CSF2、ECE1、FAS、GNLY、GUSB、GZMB、ILIA、IL2RA、IL8、IL10、LTA、PRF1、PTGS2、SKI和TBX21中的一種或多種。本發(fā)明還提供了一種增強人胎盤灌洗液細胞群(例如來自胎盤灌洗液的所有有核細胞群)對眾多腫瘤細胞的細胞毒性的方法，該方法包括將所述胎盤灌洗液細胞與一定濃度的免疫調節(jié)化合物接觸一段時間，與沒有和所述免疫調節(jié)化合物接觸的等量胎盤灌洗液細胞相比，所述濃度和時間足以使所述胎盤灌洗液細胞表現(xiàn)出對所述眾多腫瘤細胞的可檢測的增強的細胞毒性。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種增加胎盤灌洗液細胞群中粒酶B表達的方法，該方法包括將所述胎盤灌洗液細胞群與一定濃度的免疫調節(jié)化合物接觸一段時間，與沒有與所述免疫調節(jié)化合物接觸的等量胎盤灌洗液細胞相比，所述濃度和時間足以使所述胎盤灌洗液細胞群表達可檢測的增多量的粒酶B。免疫調節(jié)化合物可以是商業(yè)上購買的或根據(jù)本文提及的專利或專利公開物中描述的方法制備的，所有這些專利或專利公開物通過參考納入本文。進一步地，可以不對稱合成或者使用已知拆分試劑或手性柱以及其它標準合成有機化學技術拆分得到光學純的組分。免疫調節(jié)化合物可以是外消旋的、立體異構富集的或立體異構純的，并且可以包含其藥學可接受的鹽、溶劑化物及前藥。除非另有說明，本文使用的術語“免疫調節(jié)化合物”包含顯著地抑制TNFα、LPS誘導的單核細胞IL-IB和IL-12，且部分地抑制IL-6生成的有機小分子。在具體實例中，所述免疫調節(jié)化合物為來那度胺、pomalidomide或沙立度胺。免疫調節(jié)化合物的具體實例包括但不限于：取代的苯乙烯的氰基和羧基衍生物，例如在美國專利號5,929,117中公開的那些；1-氧代-2-(2,6-二氧代-3-氟哌啶-3-基)異二氫吲哚和1,3-二氧代-2-(2,6二氧代-3-氟哌啶-3-基)異二氫吲哚，例如在美國專利號5,874,448和5,955,476中公開的那些；在美國專利號5,798,368中描述的四取代的2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代異二氫吲哚；1-氧代和1,3-二氧代-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)異二氫吲哚(例如，沙立度胺的4-甲基衍生物)，包括但不限于在美國專利號5,635,517、6,476,052、6,555,554和6,403,613中公開的那些；在美國專利號6,380,239中描述的在二氫吲哚環(huán)的4-或5-位發(fā)生取代的1-氧代和1,3-二氧代異二氫吲哚(例如，4-(4-氨基-1,3-二氧代異二氫吲哚-2-基)-4-氨基甲酰基丁酸)；在美國專利號6,458,810中描述的在2-位用2,6-二氧代-3-羥基哌啶-5-基取代的異二氫吲哚-1-酮和異二氫吲哚-1,3-二酮(例如，2-(2,6-二氧代-3-羥基-5-氟代哌啶-5-基)-4-氨基異二氫吲哚-1-酮)；在美國專利號5,698,579和5,877,200中公開的一類非多肽環(huán)酰胺；氨基沙立度胺及氨基沙立度胺的類似物、水解產(chǎn)物、代謝產(chǎn)物、衍生物和前體，和取代的2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)鄰苯二甲酰亞胺和取代的2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧異吲哚，例如在美國專利號6,281,230和6,316,471中描述的那些；以及異吲哚-酰亞胺化合物，例如在美國專利公開號2003/0045552A1、美國專利號7,091,353和WO02/059106中描述的那些。本文提及的每個專利和專利申請的全部內容通過參考納入本文。免疫調節(jié)化合物不包含沙立度胺。在某些實施方案中，所述免疫調節(jié)化合物是在苯環(huán)上發(fā)生氨基取代的1-氧代-和1,3-二氧代-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)異二氫吲哚，如在美國專利號5,635,517中所描述的，該專利的全部內容通過參考納入本文。這些化合物具有結構I∶其中X和Y之一是C=O，X和Y中的另一個為C=O或CH2，且R2是氫或低級烷基，特別是甲基。具體的免疫調節(jié)化合物包括但不限于：1-氧代-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基異二氫吲哚；1-氧代-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基異二氫吲哚；1-氧代-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-6-氨基異二氫吲哚；1-氧代-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-7-氨基異二氫吲哚；1,3-二氧代-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基異二氫吲哚；1,3-二氧代-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基異二氫吲哚；其它具體免疫調節(jié)化合物屬于一類取代的2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)鄰苯二甲酰亞胺和取代的2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代異吲哚，例如在美國專利號6,281,230、6,316,471、6,335,349、和6,476,052，以及WO98/03502中描述的那些，每專利和專利公開物均通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式：其中：X和Y之一是C=O，且X和Y中的另一個是C=O或CH2；(i)各R1、R2、R3和R4彼此獨立地是鹵素、1至4個碳原子的烷基、或1至4個碳原子的烷氧基，或(ii)R1、R2、R3和R4中的一個是-NHR5，且R1、R2、R3和R4中其余的是氫；R5是氫、或1至8個碳原子的烷基；R6是氫、1至8個碳原子的烷基、芐基或鹵素；條件是如果X和Y是C=O，且(i)各R1、R2、R3和R4是氟或(ii)R1、R2、R3或R4中的一個是氨基，則R6不為氫。這類的代表性化合物具有下式：其中R1是氫或甲基。在單獨的實施方案中，包含了這些化合物的對映體純的形式(例如光學純的(R)或(S)對映異構體)的用途。其它具體免疫調節(jié)化合物屬于公開在美國專利申請公開號US2003/0096841和US2003/0045552和WO02/059106中的一類異吲哚-酰亞胺，各專利和專利公開物通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式II：及其藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、對映異構體、非對映異構體、外消旋體和立體異構體的混合物，其中：X和Y中的一個是C=O，且X和Y中的另一個是CH2或C=O；R1是H、(C1-C8)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、C(O)R3、C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3′、C(S)NR3R3′、或(C1-C8)烷基-O(CO)R5；R2是H、F、芐基、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、或(C2-C8)炔基；R3和R3′獨立地是(C1-C8)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、(C0-C8)烷基-N(R6)2、(C-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、(C1-C8)烷基-O(CO)R5、或C(O)OR5；R4是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C4)烷基-OR5、芐基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基、或(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基；R5是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、或(C2-C5)雜芳基；R6每次出現(xiàn)時獨立地是H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、(C2-C5)雜芳基、或(C0-C8)烷基-C(O)O-R5，或多個R6基團可以連接形成雜環(huán)烷基基團；n是0或1；和*代表手性-碳中心。在式II的具體化合物中，當n是0時，則R1是(C3-C7)環(huán)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、C(O)R3、C(O)OR4、(C1-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、C(S)NHR3、或(C1-C8)烷基-O(CO)R5；R2是H、或(C1-C8)烷基；且R3是(C1-C8)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、(C5-C8)烷基-N(R6)2；(C0-C8)烷基-NH-C(O)O-R5；(C1-C8)烷基-OR5，(C1-C8)烷基-C(O)OR5、(C1-C8)烷基-O(CO)R5或-C(O)OR5；且其它變量具有相同的定義。在式II的其它具體化合物中，R2是H、或(C1-C4)烷基。在式II的其它具體化合物中，R1是(C1-C8)烷基、或芐基。在式II的其它具體化合物中，R1是H、(C1-C8)烷基、芐基、CH2OCH3、CH2CH2OCH3、或在式II化合物的另一實施方案中，R1是其中Q是O或S，R7每次出現(xiàn)時獨立地是H、(C1-C8)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、鹵素、(C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、(C0-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、(C1-C8)烷基-O(CO)R5、或C(O)OR5，或相鄰出現(xiàn)的R7可以結合在一起形成雙環(huán)烷基或芳環(huán)。在式II的其它具體化合物中，R1是C(O)R3。在式II的其它具體化合物中，R3是(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、(C1-C8)烷基、芳基、或(C0-C4)烷基-OR5。在式II的其它具體化合物中，雜芳基是吡啶基、呋喃基、或噻吩基。在式II的其它具體化合物中，R1是C(O)OR4。在式II的其它具體化合物中，C(O)NHC(O)的H可以被(C1-C4)烷基、芳基、或芐基代替。該類型中的化合物的進一步實例包括但不限于：[2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-異吲哚-4-基甲基]-酰胺；(2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-異吲哚-4-基甲基)-氨基甲酸叔丁酯；4-(氨基甲基)-2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-異二氫吲哚-1,3-二酮；N-(2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-異吲哚-4-基甲基)-乙酰胺；N-{(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基)-1,3-二氧代異二氫吲-4-基)甲基}環(huán)丙基-甲酰胺；2-氯-N-{(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代異二氫吲-4-基)甲基}乙酰胺；N-(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代異二氫吲-4-基)-3-吡啶基甲酰胺；3-{1-氧代-4-(芐基氨基)異二氫吲哚-2-基}哌啶-2,6-二酮；2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-4-(芐基氨基)異二氫吲哚-1,3-二酮；N-{(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代異二氫吲哚-4-基)甲基}丙酰胺；N-{(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代異二氫吲哚-4-基)甲基}-3-吡啶基甲酰胺；N-{(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代異二氫吲-4-基)甲基}庚酰胺；N-{(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代異二氫吲哚-4-基)甲基}-2-呋喃基甲酰胺；{N-(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代異二氫吲-4-基)氨基甲?；鶀乙酸甲酯；N-(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代異二氫吲哚-4-基)戊酰胺；N-(2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代異二氫吲哚-4-基)-2-噻吩基甲酰胺；N-{[2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代異二氫吲哚-4-基]甲基}(丁基氨基)甲酰胺；N-{[2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代異二氫吲哚-4-基]甲基}(辛基氨基)甲酰胺；和N-{[2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-1,3-二氧代異二氫吲哚-4-基]甲基}(芐基氨基)甲酰胺。其它具體免疫調節(jié)化合物屬于在美國專利申請公開號2002/0045643、國際公開號WO98/54170和美國專利號6,395,7546中公開的一類異吲哚-酰亞胺，各專利和專利公開物均通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式III：及其藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、對映異構體、非對映異構體、外消旋體和立體異構體的混合物，其中∶X和Y中的一個是C=O，且X和Y中的另一個是CH2或C=O；R是H、或CH2OCOR’；(i)各R1、R2、R3和R4彼此獨立地是鹵素、1至4個碳原子的烷基，或1至4個碳原子的烷氧基，或(ii)R1、R2、R3或R4中一個是硝基或-NHR5，且R1、R2、R3或R4中其余的是氫；R5是氫、或1至8個碳原子的烷基；R6是氫、1至8個碳原子的烷基、苯基、氯、或氟；R’是R7-CHR10-N(R8R9)；R7是間-亞苯基、或對-亞苯基、或-(CnH2n)-，其中n具有0至4的值；各R8和R9彼此獨立地是氫、或1至8個碳原子的烷基，或R8和R9結合在一起是四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中X1是-O-、-S-或-NH-；R10是氫、1至8個碳原子的烷基、或苯基；且*代表手性碳中心。其它代表性的化合物具有下式：其中∶X和Y中的一個是C=O，且X和Y中的另一個是C=O或CH2；(i)各R1、R2、R3或R4彼此獨立地是鹵素、1至4個碳原子的烷基、或1至4個碳原子的烷氧基，或(ii)R1、R2、R3和R4中的一個是-NHR5，且R1、R2、R3和R4中其余的是氫；R5是氫、或1至8個碳原子的烷基；R6是氫、1至8個碳原子的烷基、苯基、氯、或氟；R7是間-亞苯基、或對-亞苯基、或-(CnH2n)-，其中n具有0至4的值；各R8和R9彼此獨立地是氫、或1至8個碳原子的烷基，或R8和R9結合在一起是四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中X1是-O-、-S-、或-NH-；R10是氫、1至8個碳原子的烷基、或苯基。其它代表性的化合物具有下式：其中：X和Y中的一個是C=O，且X和Y中的另一個是C=O或CH2；(i)各R1、R2、R3和R4彼此獨立地是鹵素、1至4個碳原子的烷基、或1至4個碳原子的烷氧基，或(ii)R1、R2、R3和R4中的一個是硝基或被保護的氨基，且R1、R2、R3和R4中其余的是氫；且R6是氫、1至8個碳原子的烷基、苯基、氯、或氟；其它代表性的化合物具有下式：其中：X和Y中的一個是C=O，且X和Y中的另一個是C=O或CH2；(i)各R1、R2、R3和R4彼此獨立地是鹵素、1至4個碳原子的烷基、或1至4個碳原子的烷氧基，或(ii)R1、R2、R3和R4中的一個是-NHR5，且R1、R2、R3和R4中其余的是氫；R5是氫、1至8個碳原子的烷基、或CO-R7-CH(R10)NR8R9，其中每個R7、R8、R9和R10如本文所定義；且R6是1至8個碳原子的烷基、苯基、氯、或氟。所述化合物的具體實例具有下式：其中：X和Y中的一個是C=O，且X和Y中的另一個是C=O或CH2；R6是氫、1至8個碳原子的烷基、芐基、氯或氟；R7是間-亞苯基、對-亞苯基、或-(CnH2n)-，其中n具有0至4的值；各R8和R9彼此獨立地是氫、或1至8個碳原子的烷基，或R8和R9結合在一起是四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中X1是-O-、-S-、或-NH-；且R10是氫、1至8個碳原子的烷基、或苯基。最優(yōu)選的免疫調節(jié)化合物是4-(氨基)-2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-異二氫吲哚-1,3-二酮和3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮。所述化合物可以經(jīng)由標準的合成方法(參見例如美國專利號5,635,517，通過參考納入本文)獲得。所述化合物可從CelgeneCorporation，Warren，NJ獲得。4-(氨基)-2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-異二氫吲哚-1,3-二酮具有如下化學結構：化合物3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮具有如下化學結構：在另一實施方案中，具體免疫調節(jié)化合物包含3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮的多晶型，例如晶型A、B、C、D、E、F、G和H，其公開在美國公開號US2005/0096351A1中，該申請通過參考納入本文。例如，3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮的晶型A是可從非水溶劑系統(tǒng)獲得的非溶劑化的結晶材料。晶型A的X射線粉末衍射圖包含在約8、14.5、16、17.5、20.5、24和26度2θ處的顯著峰，和具有約270℃的差示掃描量熱法熔融溫度峰值。晶型A為弱吸濕性的或非吸濕性的，且似乎是迄今為止發(fā)現(xiàn)的3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮的熱力學最穩(wěn)定的無水晶型。3-(4-氨基-1-氧代-l,3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮的晶型B是半水合的結晶材料，其可以從各種溶劑系統(tǒng)中獲得，所述溶劑系統(tǒng)包括但不限于己烷、甲苯和水。晶型B的X射線粉末衍射圖包含在約16、18、22和27度2θ處的顯著峰，且其DSC曲線在約146℃和268℃吸熱，所述約146℃和268℃溫度通過熱臺顯微鏡試驗鑒定為脫水和熔融溫度?；プ冄芯匡@示晶型B在水性溶劑系統(tǒng)中轉變成晶型E，且在丙酮及其它無水體系中轉變成其它形式。3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮的晶型C是半溶劑化的結晶材料，其可以從多種溶劑(例如但不限于丙酮)中獲得。晶型C的X射線粉末衍射圖包含在約15.5和25度2θ處的顯著峰,和具有約269℃的差示掃描量熱法熔融溫度峰值。晶型C在低于約85%的RH時是非吸濕性的，但可以在較高相對濕度下可轉變成晶型B。3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮的晶型D是從乙腈和水的混合物中制備的結晶的、溶劑化的多晶型物。晶型D的X射線粉末衍射圖包含在約27和28度2θ處的顯著峰，且具有約270℃的差示掃描量熱法熔融溫度峰值。晶型D為弱吸濕性的或非吸濕性的，但是當在較高相對濕度下，其通常將轉變成晶型B。3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮的晶型E是二水合的結晶材料，其可以通過將3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮在水中制漿并在具有約9:1比例的丙酮:水的溶劑系統(tǒng)中緩慢蒸發(fā)3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮而獲得。晶型E的X射線粉末衍射圖包含在約20、24.5和29度2θ處的顯著峰，和具有約269℃的差示掃描量熱法熔融溫度峰值。晶型E可以在丙酮溶劑系統(tǒng)中轉變成晶型C，且可在THF溶劑系統(tǒng)中轉變成晶型G。在水性溶劑系統(tǒng)中，晶型E似乎是最穩(wěn)定的形式。對晶型E進行的去溶劑化試驗表明，當在約125℃加熱約五分鐘后，晶型E可以轉變成晶型B。當在175℃加熱約五分鐘后，晶型B可以轉變成晶型F。3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮的晶型F是非溶劑化的結晶物質，其可以通過使晶型E脫水獲得。晶型F的X射線粉末衍射圖包含在約19、19.5和25度2θ處的顯著峰，且具有約269℃的差示掃描量熱法熔融溫度峰值。3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮的晶型G是非溶劑化的結晶物質，其可以通過將晶型B和E在溶劑中制漿而獲得，所述溶劑例如但不限于四氫呋喃(THF)。晶型G的X射線粉末衍射圖包含在約21、23和24.5度2θ處的顯著峰，且具有約267℃的差示掃描量熱法熔融溫度峰值。3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮的晶型H是部分水合的(約0.25摩爾)結晶材料，其可以通過將晶型E暴露于0%相對濕度而獲得。晶型H的X射線粉末衍射圖包含在約15、26和31度2θ處的顯著峰，且具有約269℃的差示掃描量熱法熔融溫度峰值?？捎糜诒景l(fā)明提供的方法的其它具體免疫調節(jié)化合物包括但不限于1-氧代-2-(2,6-二氧代-3-氟哌啶-3-基)異二氫吲哚和1,3-二氧代-2-(2,6-二氧代-3-氟哌啶-3-基)異二氫吲哚，例如在美國專利號5,874,448和5,955,476中描述的那些，各專利通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式：其中Y為氧或H2，且各R1、R2、R3和R4彼此獨立地為氫、鹵素、1至4個碳原子的烷基、1至4個碳原子的烷氧基，或氨基?？捎糜诒景l(fā)明提供的方法的其它具體免疫調節(jié)化合物包括但不限于在美國專利號5,798,368中描述的四取代的2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-1-氧代異二氫吲哚，該專利通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式：其中各R1、R2、R3和R4彼此獨立地為鹵素、1至4個碳原子的烷基、或1至4個碳原子的烷氧基。可用于本發(fā)明提供的方法的其它具體免疫調節(jié)化合物包括但不限于在美國專利號6,403,613中描述的1-氧代和1,3-二氧代-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)異二氫吲哚，該專利通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式：其中：Y為氧或H2，R1和R2中的第一個為鹵素、烷基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、氰基、或氨基甲酰基，R1和R2中的第二個(獨立于第一個)是氫、鹵素、烷基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、氰基、或氨基甲?；襌3為氫、烷基、或芐基。所述化合物的具體實例具有下式：其中R1和R2中的第一個為鹵素、1至4個碳原子的烷基、1至4個碳原子的烷氧基、其中各烷基具有1至4個碳原子的二烷基氨基、氰基、或氨基甲?；?，R1和R2中的第二個(獨立于第一個)是氫、鹵素、1至4個碳原子的烷基、1至4個碳原子的烷氧基、其中烷基具有1至4個碳原子的烷基氨基、其中各烷基具有1至4個碳原子的二烷基氨基、氰基、或氨基甲?；?，且R3為氫、1至4個碳原子的烷基、或芐基。具體實例包括但不限于1-氧代-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-甲基異二氫吲哚?？捎糜谠诒景l(fā)明提供的方法的其它化合物具有下式：其中R1和R2中的第一個為鹵素、1至4個碳原子的烷基、1至4個碳原子的烷氧基、其中各烷基具有1至4個碳原子的二烷基氨基、氰基、或氨基甲?；?，R1和R2中的第二個(獨立于第一個)是氫、鹵素、1至4個碳原子的烷基、1至4個碳原子的烷氧基、其中烷基具有1至4個碳原子的烷基氨基、其中各烷基具有1至4個碳原子的二烷基氨基、氰基、或氨基甲?；襌3為氫、1至4個碳原子的烷基、或芐基?？捎糜诒景l(fā)明提供的方法的其它具體免疫調節(jié)化合物包括但不限于在美國專利號6,380,239和美國申請公開號2006/0084815中描述的在二氫吲哚環(huán)的4-或5-位發(fā)生取代的1-氧代和1,3-二氧代異二氫吲哚，所述專利和專利公開物通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式：其中，指明為C*的碳原子構成手性中心(當n不為零且R1與R2不同時)；X1和X2中的一個為氨基、硝基、一至六個碳的烷基、或NH-Z，且X1或X2中的另一個為氫；各R1和R2彼此獨立地是羥基或NH-Z；R3是氫、一至六個碳的烷基、鹵素、或鹵代烷基；Z為氫、芳基、一至六個碳的烷基、甲?；?、或一至六個碳的?；磺襫具有為0、1或2的值；條件是如果X1是氨基，且n是1或2，則R1和R2不同時是羥基；及其鹽?？捎糜诒景l(fā)明提供的方法的進一步的化合物具有下式：其中，當n不是零且R1與R2不同時，指明為C*的碳原子構成手性中心；X1和X2中的一個是氨基、硝基、一至六個碳的烷基、或NH-Z，且X1或X2中的另一個是氫；各R1和R2彼此獨立地是羥基、或NH-Z；R3是一至六個碳的烷基、鹵素、或氫；Z是氫、芳基、或一至六個碳的烷基或?；磺襫具有0、1或2的值?？捎糜诒景l(fā)明提供的方法的化合物的具體實例包括但不限于分別具有如下結構的2-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-4-氨基甲酰基丁酸和4-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基)-4-氨基甲?；?丁酸，及其藥學上可接受的鹽、溶劑化物、前藥和立體異構體:其它代表性的化合物具有下式：其中，當n不是零且R1與R2不同時，指明為C*的碳原子構成手性中心；X1和X2中的一個是氨基、硝基、一至六個碳的烷基、或NH-Z，且X1或X2中的另一個是氫；各R1和R2彼此獨立地是羥基、或NH-Z；R3是一至六個碳的烷基、鹵素、或氫；Z是氫、芳基、或一至六個碳的烷基或?；磺襫具有0、1或2的值；及其鹽。具體實例包括但不限于分別具有如下結構的4-氨基甲?；?4-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基}-丁酸、4-氨基甲酰基-2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基}-丁酸、2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基}-4-苯肌氨基甲酰基-丁酸、和2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1,3-二氧代-1,3-二氫-異吲哚-2-基}-戊二酸，及其藥學上可接受的鹽、溶劑化物、前藥和立體異構體：所述化合物的其它具體實例具有下式：其中X1和X2中的一個是硝基、或NH-Z，且X1或X2中的另一個是氫；各R1和R2彼此獨立地是羥基、或NH-Z；R3是一至六個碳的烷基、鹵素、或氫；Z是氫、苯基、一至六個碳的?；?、或一至六個碳的烷基；且n具有0、1或2的值；條件是如果X1和X2中的一個是硝基，且n是1或2，則R1和R2不是羥基；和如果-COR2和-(CH2)n-COR1不同，指明為C*的碳原子構成手性中心。其它代表性的化合物具有下式：其中X1和X2中的一個是一至六個碳的烷基；各R1和R2彼此獨立地是羥基、或NH-Z；R3是一至六個碳原子的烷基、鹵素、或氫；Z是氫、苯基、一至六個碳的?；?、或一至六個碳的烷基；且n具有0、1或2的值；且如果-COR2和-(CH2)n-COR1不同，指明為C*的碳原子構成手性中心。其它具體免疫調節(jié)化合物包括但不限于在美國專利號6,458,810中描述的在2-位用2,6-二氧代-3-羥基哌啶-5-基取代的異二氫吲哚-1-酮和異二氫吲哚-1,3-二酮，該專利通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式：其中：指明為*的碳原子構成手性中心；X是-C(O)-、或-CH2-；R1是1至8個碳原子的烷基、或-NHR3；R2是氫、1至8個碳原子的烷基、或鹵素；且R3是：氫，1至8個碳原子的烷基，未取代，或被1至8個碳原子的烷氧基、鹵素、氨基、或1至4個碳原子的烷基氨基取代，3至18個碳原子的環(huán)烷基，苯基，未取代，或被1至8個碳原子的烷基、1至8個碳原子的烷氧基、鹵素、氨基、或1至4個碳原子的烷基氨基取代，芐基，未取代，或被1至8個碳原子的烷基、1至8個碳原子的烷氧基、鹵素、氨基、或1至4個碳原子的烷基氨基、或-COR4取代，其中：R4是：氫，1至8個碳原子的烷基，未取代，或被1至8個碳原子的烷氧基、鹵素、氨基、或1至4個碳原子的烷基氨基取代，3至18個碳原子的環(huán)烷基，苯基，未取代，或被1至8個碳原子的烷基、1至8個碳原子的烷氧基、鹵素、氨基、或1至4個碳原子的烷基氨基取代，或芐基，未取代，或被1至8個碳原子的烷基、1至8個碳原子的烷氧基、鹵素、氨基、或1至4個碳原子的烷基氨基取代。本發(fā)明提供的化合物可以是商業(yè)購買的或根據(jù)在本文公開的專利或專利公開物中描述的方法制備。進一步地，可以不對稱合成或者使用已知的拆分試劑或手形柱以及其它標準合成有機化學技術拆分獲得光學純的化合物。各種免疫調節(jié)化合物包含一個或多個手性中心，且可以作為對映異構體的外消旋混合物或非對映異構體的混合物存在。本發(fā)明涵蓋這些化合物的立體異構純形式的用途，以及這些形式的混合物的用途。例如，在本發(fā)明提供的方法和組合物中可以使用包含等量或不等量特定免疫調節(jié)化合物的對映異構體的混合物。這些異構體可以是不對稱合成的或者使用標準技術例如手性柱或手性拆分劑拆分的。參見，例如Jacques，J.,等人，Enantiomers，RacematesandResolutions(Wiley-Interscience，NewYork，1981)；Wilen，S.H.等人，Tetrahedron33:2725(1977)；Eliel，E.L.，StereochemistryofCarbonCompounds(McGraw-Hill，NY，1962)；和Wilen，S.H.，TablesofResolvingAgentsandOpticalResolutionsp.268(E.L.Eliel，Ed.，Univ.ofNotreDamePress，NotreDame，IN，1972)。應當注意，如果圖示的結構和給予該結構的名稱之間存在差異，以圖示的結構為重。另外，如果結構或一部分結構的立體化學沒有用例如加粗線或虛線表示，則該結構或部分結構應當解釋為包含其所有立體異構體。5.9.PINK細胞、人胎盤灌洗液或混合的自然殺傷細胞的施用可以通過本領域已知適于施用活細胞的任何醫(yī)學可接受的途徑，將PINK細胞、人胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞、包含這些細胞的細胞群、或其組合施用至個體，例如具有腫瘤細胞的個體，例如癌癥患者。在各種實施方案中，本發(fā)明提供的細胞可以通過外科手術植入、注射、輸注(例如經(jīng)由導管或注射器)、或以其它方式，直接或間接施用至需要修復或加強的部位。在一個實施方案中，將所述細胞靜脈內施用至個體。在另一實施方案中，將所述細胞施用至個體的腫瘤(例如實體瘤)部位。在其中個體在超過一個部位具有腫瘤的具體實施方案中，將所述細胞施用至至少兩個或所有的腫瘤部位。在某些其它實施方案中，本發(fā)明提供的細胞或包含這些細胞的組合物被口服、鼻腔、動脈內、腸胃外、眼內、肌內、皮下、腹膜內、腦內、心室內、腦室內、鞘內、腦池內、脊椎內和/或脊椎旁施用。在某些具體實施方案中，所述細胞經(jīng)由帶有或者沒有泵裝置的顱內或脊柱內針和/或導管遞送。所述PINK細胞、人胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞、或其組合，或包含這些細胞的細胞群可以作為組合物(例如包含所述細胞的基質、水凝膠、支架等)施用至個體。在一個實施方案中，將本發(fā)明提供的細胞接種在天然基質(例如胎盤生物材料例如羊膜材料)上。這樣的羊膜材料可以是例如直接從哺乳動物胎盤解剖出的羊膜；經(jīng)固定或熱處理的羊膜、基本上干燥(即<20%H2O)的羊膜、絨毛膜、基本上干燥的絨毛膜、基本上干燥的羊膜和絨毛膜等?？梢栽谄渖辖臃N胎盤干細胞的優(yōu)選的胎盤生物材料描述在Hariri的美國申請公開號2004/0048796中，該專利申請的全部公開內容通過參考納入本文。在另一實施方案中，將所述PINK細胞、人胎盤灌洗液細胞、混合的自然殺傷細胞、或其組合，或包含這些細胞的細胞群懸浮在適于例如注射的水凝膠溶液中。用于這些組合物的合適的水凝膠包含自組裝肽，例如RAD16。在一個實施方案中，可允許包含所述細胞的水凝膠溶液硬化，例如在模中硬化，以形成用于植入的、具有細胞分散在其中的基質。也可以培養(yǎng)這些基質中的細胞，使得所述細胞在植入前有絲分裂擴增。所述水凝膠可以是例如有機聚合物(天然的或合成的)，其通過共價鍵、離子鍵、或氫鍵交聯(lián)以形成三維開放-晶格結構，其俘獲水分子形成凝膠。形成水凝膠的材料包含多糖，例如海藻酸及其鹽、肽、聚磷嗪和聚丙烯酸酯，其通過離子交聯(lián)；或嵌段聚合物，例如聚氧化乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物，其分別通過溫度或pH交聯(lián)。在某些實施方案中，本發(fā)明的水凝膠或基質是可生物降解的。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述制劑包含原位可聚合的凝膠(參見，例如美國專利申請公布2002/0022676；Anseth等人，J.ControlRelease，78(1-3)：199-209(2002)；Wang等人，Biomaterials，24(22):3969-80(2003))。在某些實施方案中，所述聚合物至少部分地可溶于水性溶液(例如水、緩沖鹽溶液或水性醇溶液)中，所述聚合物具有帶電側基或其一價離子鹽。具有可以與陽離子反應的酸性側基的聚合物的實例為聚(磷腈)(poly(phosphazenes))、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(乙酸乙烯酯)、和磺化聚合物例如磺化聚苯乙烯。也可以使用通過丙烯酸或甲基丙烯酸和乙烯醚單體或聚合物反應形成的具有酸性側基的共聚物。酸性基團的實例是羧酸基、磺酸基、鹵化(優(yōu)選氟化)醇基、酚OH基和酸性OH基。本發(fā)明的胎盤干細胞或其共同培養(yǎng)物可以被接種在三維框架(framework)或支架上，或植入體內。這樣的框架可以與刺激組織形成或以其它方式加強或改善本發(fā)明實施的任何一種或多種生長因子、細胞、藥物或其它組分聯(lián)合植入?？捎糜诒景l(fā)明的支架的實例包括無紡墊、多孔泡沫、或自組裝肽。無紡墊可以使用由合成的易吸收的乙醇酸和乳酸的共聚物(例如PGA/PLA)(VICRYL，Ethicon，Inc.，Somerville，N.J.)制成的纖維形成。也可以使用通過例如冷凍干燥或凍干等方法形成的由例如聚(ε-己內酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物組成的泡沫(參見，例如美國專利號6,355,699)作為支架。本發(fā)明的胎盤干細胞也可被接種在生理學可接受的陶瓷材料上或與其接觸，所述生理學可接受的陶瓷材料包括但不限于磷酸一鈣、磷酸二鈣、磷酸三鈣、α-磷酸三鈣、β-磷酸三鈣、和磷酸四鈣、羥基磷灰石、氟磷灰石、硫酸鈣、氟化鈣、氧化鈣、碳酸鈣、磷酸鈣鎂、生物學活性玻璃例如及其混合物。目前市售的多孔生物相容性陶瓷材料包括(CanMedicaCorp.，Canada)、(MerckBiomaterialFrance，F(xiàn)rance)、(Mathys，AG，Bettlach，Switzerland)、和礦化的膠原骨移植產(chǎn)品例如HEALOS(TM)(DePuy，Inc.，Raynham，MA)和RHAKOSSTM及(Orthovita，Malvern，Pa.)。所述框架可以是天然和/或合成材料的混合物、摻合物或復合物。在另一實施方案中，胎盤干細胞可被接種在氈上或與其接觸，所述氈可以是例如由生物可吸收材料(例如PGA、PLA、PCL共聚物或摻合物，或透明質酸)制成的復絲組成。在另一實施方案中，本發(fā)明的胎盤干細胞可被接種在泡沫支架上，所述泡沫支架可以是復合結構?？梢詫⑦@樣的泡沫支架模壓成有用的形狀，例如待修復、替代或增強的一部分體內特定結構的形狀。在某些實施方案中，例如用0.1M乙酸處理所述框架，接著在聚賴氨酸、PBS和/或膠原中培養(yǎng)，之后接種本發(fā)明的細胞以增強細胞粘附。可以通過如下方法修飾基質的外表面以改善細胞粘附或生長和組織分化，例如血漿-包涂基質，或加入一種或多種蛋白(例如膠原、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如硫酸肝素、軟骨素-4-硫酸鹽、軟骨素-6-硫酸鹽、硫酸皮膚素、硫酸角蛋白等)、細胞基質和/或其它材料(例如但不限于明膠、海藻酸鹽、瓊脂、瓊脂糖和植物膠等)。在某些實施方案中，所述支架包含使其不形成血栓的材料，或經(jīng)所述材料處理。這些處理和材料也可以促進和維持內皮生長、遷移和細胞外基質沉積。這些材料和處理的實例包括但不限于天然材料，例如基底膜蛋白(例如層粘連蛋白和IV型膠原)、合成材料(例如EPTFE)、和分段的聚氨酯脲硅酮(例如PURSPANTM(ThePolymerTechnologyGroup，Inc.，Berkeley，Calif.))。所述支架也可以包含抗血栓形成劑，例如肝素；也可以在用胎盤干細胞接種前，處理所述支架以改變表面電荷(例如用血漿包涂)。6.實施例6.1.實施例1：來自胎盤灌洗液和臍帶血的胎盤中間體自然殺傷細胞的表征本實施例說明了來自人胎盤灌洗液的自然殺傷細胞的分離和培養(yǎng)。胎盤自然殺傷細胞的分離。使用CD56-偶聯(lián)的微珠，從8個單元的人胎盤灌洗液(HPP)和4個單元的臍帶血(UCB)中分離自然殺傷細胞。通過磁珠選擇(MiltenyiBiotec)進行PINK細胞的分離。將分娩后的胎盤排血，并用約200至約750mL的灌洗溶液(0.9%NaCl注射溶液，USP級(目錄號68200-804，VWR))灌洗。收集未處理的灌洗液，并處理以除去紅細胞。用熒光激活細胞分類(FACS)緩沖液(RPMI1640,不含酚紅，加入5%FBS)洗滌來自HPP或UCB的單核細胞一次，然后以1500rpm離心6分鐘。計數(shù)細胞數(shù)量，將細胞沉淀以107個總細胞/80μL緩沖液重懸，并加入20μL的CD3Microbeads(目錄號130-050-101，Miltenyi)。均勻混合所述系統(tǒng)，并在4-8℃下培養(yǎng)15分鐘。向每107個總細胞加入1-2mL緩沖液，然后以300g離心該混合物10分鐘。完全吸除上清液。將細胞沉淀重懸為108個細胞/500μL緩沖液，并準備進行磁分離。將LS柱(MiltenyiBiotec)置于MIDIMACSTM細胞分離器(MiltenyiBiotec)的磁場中，用3mL的緩沖液洗滌所述柱，并將細胞/微珠懸浮液加樣至所述柱。使用2×3mL的洗滌緩沖液，收集流過所述柱且包含自然殺傷細胞的未標記的CD3-細胞。計數(shù)CD3-細胞，洗滌一次，然后用CD56微珠(目錄號：130-050-401，Miltenyi)染色，并使用與上述CD3微珠分離相同的方案分離所述細胞。由此收集了CD56+CD3-群并用于進一步分析。HPP中的自然殺傷細胞的百分比范圍為3.52至11.6(中值6.04，平均5.22)，UCB中的自然殺傷細胞的百分比范圍為1.06至8.44(中值∶3.42，平均∶4.2)。對來自HPP的自然殺傷細胞的CD56微珠選擇產(chǎn)生約80%純的群。參見圖1。在整個CD56+、CD3-自然殺傷細胞群中，來自HPP的CD56+、CD16-自然殺傷細胞(即PINK細胞)的百分比范圍為56.6至87.2(中值74.2，平均65.5)，來自UCB的CD56+、CD16-自然殺傷細胞(即PINK細胞)的百分比范圍為53.7至96.6(中值72.8)。來自HPP的CD56+，CD16+自然殺傷細胞的百分比范圍為12.8至43.3(中值25.8，平均34.5)，來自UCB的CD56+，CD16+自然殺傷細胞的百分比范圍為3.4至46.3(中值27.3，平均33.4)。在其它試驗中，使用靶向人血細胞的細胞表面抗原(CD3、CD4、CD14、CD19、CD20、CD36、CD66b、CD123、HLA-DR、血型糖蛋白A)的磁性陰性選擇試劑盒分離自然殺傷細胞。將HPP和UCB低溫保存單元解凍，并按與解凍培養(yǎng)基(RPMIMedia1640(目錄號22400，Gibco)和20%的熱滅活的胎牛血清(目錄號SH30070.03，Hyclone))1:1的比例稀釋，并以1500rpm離心8分鐘。去除上清液，并用氯化銨處理以進一步去除紅細胞；將各單元重懸在約30mL冰冷的FACS緩沖液(RPMI1640,不含酚紅，加入5%FBS)中，接著加入60mL冰冷的氯化銨(目錄號07850，StemCell)，渦旋所述溶液，然后在冰上培育5分鐘。然后，用FACS緩沖液洗滌單核細胞3次，接著以1500rpm離心8分鐘。計數(shù)細胞數(shù)，將細胞沉淀以5×107個活細胞/ml重懸在RoboSep緩沖液中(目錄號20104，StemCell)中，并向細胞懸浮液中加入0.1mg/mL的DNA酶I溶液(目錄號07900，StemCell)，用移液器輕輕地混合，并在室溫下培育15分鐘，之后分離。通過用40μm目尼龍濾網(wǎng)(目錄號352340，BDFalcon)過濾，從所述細胞懸浮液中除去細胞團，之后進行分離。使用包括EasySep陰性選擇人NK細胞富集雞尾酒和EasySep磁微粒子的人NK細胞富集試劑盒(目錄號19055，StemCell)，用裝置Robosep(目錄號20000，StemCell)和程序“HumanNKNegativeSelection19055andhighrecovery”(加入50μL/mL混合物，加入100μL/mL微粒子，培育10分鐘和5分鐘，進行1×2.5分鐘的分離)進行自動分離。由此收集CD56+CD3-群并用于進一步分析。自然殺傷細胞的擴增。通常，如下擴增自然殺傷細胞?；赮ssel等人，J.Immunol.Methods72(1):219-227(1984)和Litwin等人，J.Exp.Med.178(4):1321-1326(1993)中描述的方案的改進，制備用于自然殺傷細胞培養(yǎng)的初始培養(yǎng)基。簡而言之，初始培養(yǎng)基包含具有10%FCS(Hyclone)的IMDM(Invitrogen)，其包含以下終濃度的試劑：35μg/ml轉鐵蛋白(Sigma-Aldrich)、5μg/ml胰島素(Sigma-Aldrich)、2×10-5M乙醇胺(Sigma-Aldrich)、1μg/ml油酸(Sigma-Aldrich)、1μg/ml亞油酸(Sigma-Aldrich)、0.2μg/ml棕櫚酸(Sigma-Aldrich)、2.5μg/mlBSA(Sigma-Aldrich)和0.1μg/ml植物凝集素(PHA-P，Sigma-Aldrich)。將CD56+CD3-NK細胞以2.5×105個活細胞/mL初始培養(yǎng)基(加入200iu/mL的IL-2(R&DSystems))重懸在細胞培養(yǎng)物處理的24孔板或T燒瓶中。將絲裂霉素C-處理的異體PBMC和K562細胞(慢性粒性白血病細胞系)作為滋養(yǎng)細胞加入到初始培養(yǎng)基中，最終濃度為1×106/mL。在5%CO2中，于37℃下，培養(yǎng)NK細胞5-6天。在5-6天后，每3-4天向所述培養(yǎng)物中加入等體積的維持培養(yǎng)基(含有10%FCS、2%HumanAB血清、抗生素、L-谷氨酰胺和400單位IL-2/mL的IMDM)。在第21天，收集NK細胞。來自胎盤的中間體自然殺傷細胞的表征。將供體匹配的HPP和CB解凍，用FACS緩沖液(含有5%FBS的RPMI-1640)洗滌所述細胞。然后，按照制造商的說明，使用磁分離系統(tǒng)(StemCellTechnologies)用CD56微珠富集自然殺傷細胞。用下述抗體(BDBioscience，如果沒有另外說明的話)對CD56富集的自然殺傷細胞群進行染色以進行免疫表型的表征：偶聯(lián)PE-Cy-7的抗-CD56、抗-CD3APCCy7、抗-CD16FITC、抗-NKG2DAPC、抗-NKp46APC、抗-CD94PE(R&D)、抗-NKB1PE、和抗-KIR-NKAT2PE。在NK祖細胞中，NKG2D和NKp46為不存在的標記物，或顯示出表達減少，但在完全分化的NK細胞中存在NKG2D和NKp46。參見Freud等人，“EvidenceforDiscreteStatesofHumanNaturalKillerCellDifferentiationInVivo”，J.Exp.Med203(4)：1033-1043(2006)；Eagle&Trowsdale，“PromiscuityandtheSingleReceptor：NKG2D”，NatureReviewsImmunologyPublishedonline，2007年8月3日；Walzer等人，“NaturalKillerCells：FromCD3-NKp46+toPost-GenomicsMeta-Analyses”，Curr.OpinionImmunol.19:365-372(2007)。如表1所示，在來自HPP的富集的CD56+細胞群和來自臍帶血(CB)的HLA-匹配的CD56+細胞群之間，KIR3DL1、KIR2DL2/L3、NKG2D、NKp46和CD94的表達沒有顯著地不同。表1.具有某些標記物組合的NK細胞的百分數(shù)。3個樣品的平均值。6.2.實施例2：來自混合的胎盤灌洗液和臍帶血的胎盤中間體自然殺傷細胞的表征混合臍帶血和胎盤灌洗液的供體匹配的單核細胞(混合體)，并用FACS緩沖液(含有5%FBS的RPMI-1640)洗滌一次，并使用表2中列出的抗體，在BDFACSCanto(BDBiosciences)上進行免疫表型表征。用FlowJo軟件(TreeStar)分析數(shù)據(jù)。表2：在免疫表型表征中使用的抗體列表項目銷售商目錄號FITC抗-人CD3BDBioscience555332FITC抗-人CD3Miltenyi130-080-401APC—Cy7抗-人CD3BDBioscience557832FITC抗-人CD16BDBioscience555406PE-Cy5抗-人CD16BDBioscience555408PE抗-人CD56BDBioscience555516PE抗-人CD56Miltenyi130-090-755PE-CY5抗-人CD56BDBioscience555517PE-Cy7抗-人CD56BDBioscience557747PE抗-人CD94R&DFAB-1058PPE抗-人KIR-NKAT2(2DL2/L3)BDBioscience556071PE抗-人NKB1(3DL1)BDBioscience555967APC抗-人NKG2DBDBioscience558071APC抗-人NKp46BDBioscience558051PE抗-人CD226BDBioscience559789PE抗-人NKp44BDBioscience558563PE抗-人NKp30BDBioscience558407PE抗-人2B4BDBioscience550816同型FITC小鼠IgG1BDBjoscience340755同型FITC小鼠IgG2bBDBioscience556577同型PE小鼠IgG1BDBioscience340761同型PE小鼠IgG2bBDBioscience555743同型PerCP小鼠IgG1BDBioscience340762同型PE-Cy5小鼠IgG2bBDBioscience555744同型APC小鼠IgG1BDBioscience340754同型APC小鼠IgG2aBDBioscience555576同型APC-Cy7小鼠IgG1BDBioscience348802同型PE-Cy7小鼠IgG1BDBioscience348798胎盤NK細胞和外周血液(PB)NK細胞的免疫表型的表征。將NK細胞分成兩個主要的組：CD56＋CDl6＋NK細胞和CD56＋CDl6-細胞。CD56＋CDl6＋NK細胞具有大量溶細胞顆粒且高度表達CDl6，因此，能夠激發(fā)抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。相反，CD56十CDl6-NK細胞具有非常少的溶細胞顆粒，低水平表達或不表達CDl6，但在活化時能夠生成細胞因子和趨化因子。每種NK細胞顯示出活化和抑制受體的不同組合，所述受體包括殺傷免疫球蛋白樣受體(KIR，例如KIR3DLl和KIR2DL2／3)、自然細胞毒性受體NCR(例如NKp30、NKp44和NKp46)、殺傷細胞凝集素樣受體(KLR；例如CD94、NKG2D)、2B4和CD226。使用針對特定NK受體的熒光偶聯(lián)的單克隆抗體對胎盤NK和外周血液NK細胞進行FACS分析。在表征的11個NK亞組中，在胎盤NK和外周血液NK細胞之間，11個NK亞組的七個亞組(CD3-CD56+CD16-、CD3-CD56+CD16+、CD3-CD56+KIR2DL2/3+、CD3-CD56+NKp46+、CD3-CD56+NKp30+、CD3-CD56+2B4+、和CD3-CD56+CD94+)中的細胞數(shù)顯示出顯著性差異(p＜0.05)(相當于64%的差異)(表3A；也可參見表3B和3C)。表3A.在16個單元的混合的供體-匹配的臍帶血和人胎盤灌洗液(混合體)和13個單元的外周血液(PB)中CD3-CD56+NK細胞的表型表征。使用雙樣本t-檢驗來確定胎盤和外周血液單位中的群均值是否相等?；旌象w(16個單位)PB(13個單位)表面標記物平均值%平均值%P值CD3-CD56+2.22.40.728CD3-CD56+CD16-60.921.40.000CD3-CD56+CD16+39.178.60.000CD3-CD56+KIR3DL112.37.10.099CD3-CD56+KIR2DL2/L321.99.50.004CD3-CD56+NKG2D42.129.90.126CD3-CD56+NKp467.018.90.011CD3-CD56+CD22616.026.70.135CD3-CD56+NKp449.54.90.073CD3-CD56+NKp3039.119.00.006CD3-CD56+2B411.14.50.019CD3-CD56+CD9471.326.20.000表3B和3C顯示了獨立的試驗中，在16個單元的混合的供體-匹配的臍帶血和人胎盤灌洗液(混合體)和13個單位的外周血液(PB)中的CD3-CD56+D16-和CD3-CD56+D16+NK細胞的表型表征。表3B混合體PB表面標記物平均值%平均值%P值CD3-CD56+CD16-62.314.10.000CD3-CD56+CD16-KIR3DL17.81.50.004CD3-CD56+CD16-NKG2D43.542.70.941CD3-CD56+CD16-KIR2DL2/L313.62.40.000CD3-CD56+CD16-NKp466.743.60.001CD3-CD56+CD16-CD9469.848.50.057CD3-CD56+CD16-CD2267.64.90.068CD3-CD56+CD16-NKp443.40.60.076CD3-CD56+CD16-NKp3046.722.00.000CD3-CD56+CD16-2B43.70.50.078表3C混合體PB表面標記物平均值%平均值%P值CD3-CD56+CD16+37.785.90.000CD3-CD56+CD16+KIR3DL121.58.90.014CD3-CD56+CD16+NKG2D42.128.50.066CD3-CD56+CD16+KIR2DL2/L334.512.10.000CD3-CD56+CD16+NKp4610.414.50.242CD3-CD56+CD16+CD9472.923.80.000CD3-CD56+CD16+CD22635.532.60.347CD3-CD56+CD16+NKp4422.66.40.016CD3-CD56+CD16+NKp3045.719.70.000CD3-CD56+CD16+2B431.26.10.00860.9%的胎盤NK細胞是CD56+CD16-(來自胎盤的中間體自然殺傷(PINK)細胞)，而僅僅21.4%的外周血液NK細胞是CD56+CD16-的。在培養(yǎng)21天后，在胎盤和外周血液NK細胞之間，11個NK亞組中的四個亞組(CD3-CD56+KIR2DL2/3+、CD3-CD56+NKp46+、CD3-CD56+NKp44+和CD3-CD56+NKp30+)的百分比顯示出顯著性差異(p＜0.05)(表4)。表4來源于12個單元的混合的供體-匹配的臍帶血和人胎盤灌洗液(混合體)和9個單元的外周血液(PB)的21天培養(yǎng)的NK細胞的表型表征。使用雙樣本t-檢驗來確定組合和外周血液單位中的群均值是否相等。混合體(16個單位)PB(13個單位)表面標記物平均值%平均值%P值CD3-CD56+2.22.40.728CD3-CD56+CD16-60.921.40.000CD3-CD56+CD16+39.178.60.000CD3-CD56+KIR3DL112.37.10.099CD3-CD56+KIR2DL2/L321.99.50.004CD3-CD56+NKG2D42.129.90.126CD3-CD56+NKp467.018.90.011CD3-CD56+CD22616.026.70.135CD3-CD56+NKp449.54.90.073CD3-CD56+NKp3039.119.00.006CD3-CD56+2B411.14.50.019CD3-CD56+CD9471.326.20.000另外，在獨立試驗中確定，在培養(yǎng)21天后，胎盤和外周血液NK細胞表現(xiàn)出獨特的細胞因子特征，特別是對于IL-8，如通過Luminex所測定(表5)。表5細胞因子PB(pg/mL)混合體(pg/mL)IL-131.261.89IL-86.6115.77IL-101.262.23TNFα0.280.34Mcp-110.4911.32胎盤NK細胞和外周血液NK細胞的微小RNA表征。使用MIRVANATMmiRNA分離試劑盒(Ambion，目錄號1560)從分離的或擴增的NK細胞制備微小RNA(miRNA)。NK細胞(0.5至1.5×106個細胞)在變性的裂解緩沖液中裂解。接著，對樣品進行酸-苯酚+氯仿抽提以分離高度富集小RNA的RNA。加入100％的乙醇以使樣品含有25％的乙醇。當該裂解產(chǎn)物／乙醇混合物穿過玻璃纖維濾器時，大的RNA無法移動，而小RNA被收集在濾液中。然后，將濾液的乙醇濃度增加至55％。使該混合物穿過第二個玻璃纖維濾器，在此，小RNA變得無法移動。洗滌該RNA若干次，用低離子強度溶液洗脫。通過測量其在260和280nm的吸光度來測定回收的小RNA的濃度和純度。表6中顯示了被發(fā)現(xiàn)是PINK細胞所特有的miRNA。發(fā)現(xiàn)一種miRNA(命名為hsa-miR-199b)是外周血液NK細胞所特有的。表6.經(jīng)由qRT-PCR對piNK細胞和PBNK細胞的miRNA表征miRNAIDSanger錄入號序列hsa-miR-1OOMIMAT0000098aacccguagauccgaacuugughsa-miR-127MIMAT0000446ucggauccgucugagcuuggcuhsa-miR-211MIMAT0000268uucccuuugucauccuucgccuhsa-miR-302cMIMAT0000717uaagugcuuccauguuucagugghsa-miR-326MIMAT0000756ccucugggcccuuccuccaghsa-miR-337MIMAT0000754uccagcuccuauaugaugccuuuhsa-miR-497MIMAT0002820cagcagcscacugugguuuguhsa-miR-512-3pMIMAT0002823aagugcugucauagcugagguchsa-miR-515-5pMIMAT0002826uucuccaaaagaaagcacuuucughsa-miR-517bMIMAT0002857ucgugcaucccuuuagaguguuhsa-miR-517cMIMAT0002866aucgugcauccuuuuagaguguhsa-miR-518aMIMAT0002863aaagcgcuucccuuugcuggahsa-miR-518eMIMAT0002861aaagcgeuucccuucagagughsa-miR-519dMIMAT0002853caaagugccucccuuuagagughsa-miR-520gMIMAT0002858acaaagugcuucccuuuagaguguhsa-miR-520hMIMAT0002867acaaagugcuucccuuuagaguhsa-miR-564MIMAT0003228aggcacggugucagcaggchsa-miR-566MIMAT0003230gggcgccugugaucccaachsa-miR-618MIMAT0003287aaacucuacuuguccuucugaguhsa-miR-99aMIMAT0000097aacccguagauccgaucuuqug經(jīng)培養(yǎng)的胎盤NK細胞和未培養(yǎng)的NK細胞的免疫表型的表征。通過大量免疫表型研究和細胞毒性試驗來評價經(jīng)培養(yǎng)的PINK細胞的整體性質。為了測定擴增的NK細胞的表型，分析了NK受體(NKR)例如KIR、NKG2D、NKp46、NKp44、和284的表達。通過用PKH26標記腫瘤細胞(K562細胞)，然后將其與PINK細胞共同培養(yǎng)4小時來進行細胞毒性試驗。從第O天至第21天，NKG2D的表達從60.9％±4.8％增加至86％±17.4％(p值為O.024)；NKp46的表達從10．5％±5．4％增加至82．8％±9．O％(p值為O．00002)；NKp44的表達從9.6％±6.5％增加至51.6％±27.5％(p值為O.022)；且284的表達從13.O％±7.1％減少至0.65%±0.5%(p值為0.009%)(表7)。在這些培養(yǎng)條件下，在21天的擴增期間，抑制性KIR，包括KIR3DL1(殺傷細胞免疫球蛋白樣受體，三個結構域，長胞質尾1，抑制性受體)和KIR2DL2/L3(殺傷細胞免疫球蛋白樣受體，兩個結構域，長胞質尾2和長胞質尾3；抑制性受體)保持不受影響。NKR表達的變化進一步與針對K562細胞的溶細胞活性在第21天相比于第14天的顯著增加相關(63%±15%對45%±4%，p值為0.0004)。這些發(fā)現(xiàn)帶來了對NK細胞中與NK細胞的細胞毒活性密切相關的推定標記物的鑒別。表7.在21天培養(yǎng)前后piNK細胞的表型表征。計算了5個供體的群均值的標準偏差(Stdev)。用基于脂質的蛋白固定技術和線性離子俘獲LC/MS對經(jīng)培養(yǎng)的胎盤NK細胞和經(jīng)培養(yǎng)的外周血液NK細胞的膜蛋白組學進行表征。膜蛋白純化：在細胞裂解之前，將培養(yǎng)21天的來自混合的胎盤灌洗液和臍帶血細胞的胎盤自然殺傷細胞及PB的NK細胞與蛋白酶抑制劑混合物溶液(P8340，SigmaAldrich，St.Louis，MO；包含4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(AEBSF)、胃酶抑素A、E-64、抑氨肽酶素b、亮肽素和抑酶肽，不含金屬螯合劑)培育15分鐘。然后，通過加入10mMHCl溶液而不加入去污劑，裂解所述細胞，并且以400g離心10分鐘至沉淀，并除去細胞核。將去核后的上清液轉移到超離心管中，并且以100,000g在具有T-1270轉子的WX80超離心機(ThermoFisherScientific，Asheville，NC)上離心150分鐘，產(chǎn)生膜蛋白沉淀。蛋白脂質體的生成、固定和消化：使用NANOXIS緩沖液(10mMTris，300mMNaCl，pH8)洗滌所述膜蛋白沉淀若干次。將膜蛋白沉淀懸浮在1.5mLNANOXIS緩沖液中，并在冰上使用VIBRA-CELL(TM)VC505超聲處理器(Sonics&Materials，Inc.，Newtown，CT)尖端超聲20分鐘。通過用FM1-43染料染色(Invitrogen，Carlsbad，CA)和用熒光顯微鏡觀察來測定所述蛋白脂防體的大小。通過BCA試驗(ThermoScientific)來確定所述蛋白脂質體懸浮液的蛋白濃度。然后，使用標準移液器吸頭將該蛋白脂質體注射至LPI(TM)FlowCell(NanoxisAB，Gothenburg，Sweden)上，使其無法移動1小時。在無法移動后，進行一系列洗滌步驟，將胰蛋白酶(PrincetonSeparations，Adelphi，NJ)以5μg/ml直接注射至LPI(TM)FlowCell上。在37℃下，培養(yǎng)小片過夜。之后，從該小片洗脫胰蛋白酶消化后的肽，然后使用Sep-Pak柱(WatersCorporation，Milford，MA)脫鹽。強陽離子交換(SCX)分餾：將胰蛋白酶消化后的肽重新配制在0.1%的甲酸/水溶液中，并加樣至強陽離子交換(SCX)TOP-TIPTM柱(PolyLC，Columbia，MD)上，用30μm的polysufoETHYLaspartamideSCX填充材料裝填移液器吸頭。使用甲酸銨緩沖液，pH2.8(10mM-500mM)的階躍梯度從SCXTOPTIPTM洗脫肽。使用speed-vac系統(tǒng)干燥各SCX餾分，并用5%的乙腈、0.1%的甲酸重配以準備用于下游LC/MS分析。LTQ線性離子俘獲LC/MS/MS分析：使用180分鐘的梯度(緩沖液A∶水，0.1%甲酸；緩沖液B：乙腈，0.1%甲酸)，在0.2mm×150mm3μm的MAGICC18柱(MichromBioresources，Inc.，Auburn，CA)上分離各SCX餾分，所述柱直接連接到軸向去溶劑化真空輔助納米毛細電噴霧電離(ADVANCE)源(MichromBioresources，Inc.)。所述ADVANCE源達到了與常規(guī)納米ESI相當?shù)撵`敏度，但其以相對較高的流速3μL/分鐘運行。在LTQ線性離子阱質譜儀(ThermoFisherScientific，SanJose，CA)上分析洗脫的肽，所述質譜儀在每次全掃描質譜后進行十次數(shù)據(jù)依賴性的MS/MS掃瞄。生物信息學：在SORCERERTMSOLOTM工作站(Sage-NResearch，SanJose，CA)上使用SEQUEST算法工具，在IPI人類數(shù)據(jù)庫中對六個原始文件(對應于從各腫瘤細胞系(AML，CML)收集的6種鹽餾分)進行單次檢索。規(guī)定肽質量允差為1.2amu，規(guī)定甲硫氨酸的氧化為差異修飾(differentialmodification)，且規(guī)定氨基甲酰基甲基化為靜態(tài)修飾(staticmodification)。使用Trans-ProteomicPipeline(TPP)的Scaffold軟件工具來整理和解析膜蛋白質組學數(shù)據(jù)。如果蛋白被確定為95%肽概率、95%蛋白概率和1個特有的肽，則進行蛋白分析。使用公司內部研發(fā)的常規(guī)Perl程序進行膜蛋白質組學數(shù)據(jù)集之間的比較。分析顯示，相對于從外周血液NK細胞鑒定出的膜蛋白，從經(jīng)培養(yǎng)的胎盤NK細胞鑒定出的8個膜蛋白是特有的。參見表8。進一步，相對于經(jīng)培養(yǎng)的胎盤NK細胞，從外周血液NK細胞鑒定出特有的8個膜蛋白。參見表8。發(fā)現(xiàn)僅有10個鑒定出的膜蛋白是經(jīng)培養(yǎng)的胎盤NK細胞和外周血液NK細胞共有的。表8胎盤NK細胞的特異性蛋白PBNK細胞的特異性蛋白氨肽酶N成纖維細胞生長因子受體4前體載脂蛋白E免疫-相關的核苷酸4-樣1蛋白Atrophin-1相互作用蛋白1整聯(lián)蛋白α-L前體Innexininx-3整聯(lián)蛋白β-2前體整聯(lián)蛋白α-2前體整聯(lián)蛋白β-4前體整聯(lián)蛋白β-5前體膜-結合的溶解性胞壁質轉糖酶D前體肥大細胞表面糖蛋白GP49B前體Oxysterol結合蛋白相關蛋白8Ryanodine受體1穿孔素1前體6.3.實施例3：自然殺傷細胞對腫瘤細胞的細胞毒性該實施例證實了胎盤中間體自然殺傷細胞對腫瘤細胞有細胞毒性。如在細胞毒性試驗和NK細胞的細胞因子分泌Luminex分析中所證實的，來自HPP的PINK細胞對急性髓性白血病細胞有細胞毒性。在細胞因子分泌試驗中，將來自HPP的CD56微珠富集的NK細胞與KG-1a急性髓性白血病細胞按照1：1的比例混合。在培養(yǎng)24小時后，收集上清液，并對其進行IFN-γ和GM-CSF分泌的Luminex分析。如圖2所示，在將CD56-富集的HPP細胞與KG-1a細胞共同培養(yǎng)24小時后，觀察到IFN-γ和GM-CSF的水平增加。PINK細胞的細胞毒性在使用PINK細胞的細胞毒性試驗中，用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)標記靶腫瘤細胞。CFSE是一種對細胞無毒的活體染料，且其在細胞分裂期間可分配至子細胞中。隨后將所述細胞置于96-孔U型底組織培養(yǎng)板中，并在補充了10%FBS的RPMI1640中，按照20:1、10:1、5:1和1:1的效應細胞-靶細胞(E:T)比例，將所述細胞與新鮮分離的CD56+CD16-PINK細胞共同培養(yǎng)。在4小時的培養(yǎng)時間之后，收集細胞，并通過流式細胞術檢測CFSE的存在。使用從不含NK細胞的培養(yǎng)物中回收的靶細胞數(shù)作為參考。細胞毒性定義為：(1-CFSE樣品/CFSE對照)×100%。在20:1比例觀察到顯著的腫瘤細胞細胞毒性。參見圖3。腫瘤細胞對經(jīng)培養(yǎng)的PINK細胞的易感性乳酸脫氫酶(LDH)-釋放試驗。使用CYTOTOX96細胞毒性比色試驗試劑盒(Promega，目錄號G1780)進行該LDH-釋放試驗。在該試驗中，經(jīng)培養(yǎng)的NK細胞(包含源自匹配的HPP/UCB的CD56+CD16-細胞和CD56+CD16+細胞的組合)為效應細胞，腫瘤細胞為靶細胞。將效應細胞和靶細胞置于96-孔U型底組織培養(yǎng)板中，并在補充了2%人AB血清(Gemini，目錄號100-512)的不含酚紅的100μlRPMI1640(Invitrogen，目錄號11835-030)中，按照各種效應細胞-靶細胞(E:T)比例進行培養(yǎng)。在5%CO2中，于37℃培育培養(yǎng)物4小時。在培育后，將50μl上清液轉移到酶標板中，按照制造商的要求檢測LDH活性，并在ELISA讀板儀(SynergyHT，Biotek)中測量在490nm的吸收。根據(jù)下述等式計算細胞毒性程度：%細胞毒性=(樣品-效應細胞自發(fā)的-靶細胞自發(fā)的)/(靶細胞的最大值-靶細胞自發(fā)的)×100。某些腫瘤類型可較其它腫瘤類型對NK細胞更具響應性。為了分析腫瘤細胞對培養(yǎng)的PINK細胞的易感性，在LDH釋放試驗中，分析與PINK細胞共同培養(yǎng)的十二種不同腫瘤細胞系。所述12種腫瘤細胞系包括人慢性髓性白血病(CML)、淋巴瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤(RB)、和多發(fā)性骨髓瘤(MM)(表9)。在共同培養(yǎng)4小時后，通過LDH釋放試驗來測量NK細胞的細胞毒性。表9.ATCC腫瘤細胞系名稱描述CCRF-CEM人白血病KG-1人急性髓細胞樣白血病KG-1A人急性髓細胞樣白血病K562人慢性髓細胞樣白血病KU812人慢性髓細胞樣白血病U-937人組織細胞性淋巴瘤WERI-RB-1人成視網(wǎng)膜細胞瘤HCC2218人乳腺癌RPMI8226人多發(fā)性骨髓瘤HCT116人結腸直腸癌HT29人結腸直腸腺癌U266人多發(fā)性骨髓瘤按照101的效應細胞對靶細胞(E:T)比例，觀察到經(jīng)培養(yǎng)的PINK細胞對以下細胞具有顯著細胞毒性：對K562細胞(CML)為88.6%±5.6%；對U937細胞(淋巴瘤)為89.2%±9.8%；對WERI-RB-1細胞(RB)為73.3%±11.8%；對RPMI8226細胞(MM)為61.3%±1.3%；和對U266細胞(MM)為57.4%±4.7%(表10)。表10.腫瘤細胞對經(jīng)培養(yǎng)的PINK細胞的差異易感性。計算3個供體的平均細胞毒性的平均數(shù)標準誤差(S.E.M.)。細胞系%細胞毒性S.E.MCCRF-CEM7.61.2KG-120.51.5KG-1a60.03.2K56288.65.6KU81240.38.2U-93789.29.8WERI-RB-173.311.8RPMI822661.31.3U26657.44.7HCT-11661.05.1HCC221814.83.7HT2945.66.0用來那度胺和Pomalidomide處理增強了PINK細胞的細胞毒性RNA的分離和純化。使用RNAQUEOUS-4PCR試劑盒(Ambion，目錄號AM1914)從分離的或擴增的NK細胞制備RNA。簡言之，在胍鹽裂解溶液中裂解NK細胞(0.5至1.5×106個細胞)。隨后將樣品裂解物與乙醇溶液混合，并使其通過基于二氧化硅的濾器，該濾器選擇性地和定量地結合mRNA和更大的核醣體RNA；而不定量結合非常小的RNA，例如tRNA和5S核糖體RNA。隨后洗滌濾器以除去殘留的DNA、蛋白及其它污染物，用包含痕量EDTA(用于螯合重金屬)而不含核酸酶的水洗脫RNA。將二氧化硅濾器放在小柱中，將該小柱安裝到由試劑盒提供的不含RNase的微離心管中。通過離心或真空壓力使樣品裂解物、洗滌溶液和洗脫溶液通過所述濾器。在從濾器洗脫后，用所述試劑盒提供的超高純的DNase1處理RNA，以除去痕量的DNA。最后，通過也由所述試劑盒提供的試劑除去DNase和二價陽離子。通過測定其在260nm和280nm的吸光度來確定回收的RNA的濃度和純度。定量實時(qRT-PCR)分析?？蓪⒎蛛x的RNA用于使用TAQMAN反轉錄試劑(AppliedBiosystems，目錄號N8080234)的cDNA合成，隨后使用人免疫陣列(AppliedBiosystems，目錄號4370573)和人微小RNA陣列(AppliedBiosystems，目錄號4384792)通過7900HT快速實時PCR系統(tǒng)進行實時PCR分析。來那度胺和pomalidomide是沙立度胺的化學類似物，其具有增強的抗癌和抗炎活性。為了研究來那度胺和pomalidomide是否可以增強PINK細胞的細胞毒性，用來那度胺或pomalidomide預處理離體培養(yǎng)的(第19天)PINK細胞，接著將所述細胞與靶標結腸直腸癌細胞系HCT-116共同培養(yǎng)。經(jīng)來那度胺處理的NK細胞表現(xiàn)出42.1%的細胞毒性，經(jīng)pomalidomide處理的NK細胞顯示出47.4%的細胞毒性，而作為對照的未經(jīng)處理的PINK細胞僅僅顯示出24.3%的細胞毒性。定量實時PCR(qRT-PCR)和流式細胞術分析顯示，pomalidomide激發(fā)的NK細胞細胞毒性的增強與粒酶B(GZMB)的基因表達增加(增加60%±1.7%)(表11)和GZMB-陽性NK細胞的百分數(shù)增加(增加25%)有關。另外，在經(jīng)來那度胺(增加232%±1.6%)和pomalidomide(增加396%±0.3%)-處理的PINK細胞中，GM-CSF的表達增加(表11A、11B)。表11A，11B.與未經(jīng)處理的細胞相比，經(jīng)來那度胺和pomalidomide處理的培養(yǎng)的PINK細胞的qRT-PCT分析。11A：對于所列基因，經(jīng)來那度胺處理的和未經(jīng)來那度胺處理的樣品之間基因表達的倍數(shù)變化。使用配對t-檢驗來確定在經(jīng)來那度胺處理的和未經(jīng)來那度胺處理的樣品中的倍數(shù)變化是否相等。11B：對于所列25個基因，經(jīng)pomalidomide處理的和未經(jīng)pomalidomide處理的樣品之間基因表達的倍數(shù)變化。使用配對t-檢驗來確定在經(jīng)處理的和未經(jīng)處理的樣品中的變化倍數(shù)是否相等。表11ABAX-BCL2-相關X蛋白CCL5-趨化因子(C-C基序)配體5CCR5-趨化因子(C-C基序)受體5CSF2-集落刺激因子2(粒細胞-巨噬細胞)FAS-TNF受體超家族，成員6GUSB-葡糖醛酸糖苷酶βIL2RA-α白細胞介素2受體TNFRSF18-腫瘤壞死因子受體超家族，成員18表11BACTB-β-肌動蛋白BAX-BCL2-相關X蛋白CCL2-趨化因子(C-C基序)配體2CCL3-趨化因子(C-C基序)配體3CCL5-趨化因子(C-C基序)配體5CCR5-趨化因子(C-C基序)受體5CSF1-集落刺激因子1(巨噬細胞)CSF2-集落刺激因子2(粒細胞-巨噬細胞)ECE1-內皮素轉化酶1FAS-TNF受體超家族，成員6GNLY-粒溶素GUSB-葡糖醛酸糖苷酶-βGZMB-粒酶B(粒酶2，細胞毒性T-淋巴細胞-相關絲氨酸酯酶1)IL1A-α白細胞介素1IL2RA-白細胞介素2受體-αIL8-白細胞介素8IL10-白細胞介素10LTA-淋巴細胞毒性α(TNF超家族，成員1)PRF1-穿孔素1(成孔蛋白)PTGS2-前列腺素-內過氧化物合酶2(前列腺素G/H合成酶和環(huán)氧合酶)SKI-v-ski肉瘤病毒癌基因同系物(鳥類的)TBX21-T-box21混合的自然殺傷細胞的細胞毒性在獨立的細胞毒性試驗中，經(jīng)培養(yǎng)的來源于供體匹配的臍帶血和胎盤灌洗液的NK細胞為效應細胞，而腫瘤細胞為靶細胞。用PKH26(Sigma-Aldrich目錄號PKH26-GL)標記腫瘤細胞(參見，例如Lee-MacAry等人，J.Immunol.Meth.252(1-2):83-92(2001))，PKH26由于其親脂性脂肪族殘基而插入到細胞質膜中，隨后將所述腫瘤細胞置于96-孔U型底組織培養(yǎng)板中，在200μl補充了10%FBS的RPMI1640中，按照各種效應細胞-靶細胞(E:T)比例，與經(jīng)培養(yǎng)的NK細胞共同培養(yǎng)。在5%CO2中，于37℃培育該培養(yǎng)物4小時。在培育后，收集細胞，并將TO-PRO-3(Invitrogen目錄號T3605)，一種膜不可滲透的DNA染色劑，加入到培養(yǎng)物中至最終濃度為1μM，隨后使用BDFACSCanto進行FACS分析。細胞毒性可以表示為死細胞(PKH26+TO-PRO-3+)在全部PKH26+靶腫瘤細胞內的百分數(shù)。在該細胞毒性試驗中，用PKH26標記人慢性髓細胞樣淋巴瘤(CML)K562細胞，PKH26插入到細胞質膜中，并將所述K562細胞置于96-孔U型底組織培養(yǎng)板中。在補充了10%v/vFBS的RPMI1640中，按照10:1、5:1、2.5:1和1.25:1的效應細胞與靶細胞(E:T)比例，將培養(yǎng)了21天的胎盤(混合體)或外周血液NK細胞與K562細胞混合。在4小時的培育時間后，收集細胞，將TO-PRO-3加入到細胞培養(yǎng)物中，接著用流式細胞術測定PKH26和TO-PRO-3的存在。細胞毒性表示為PKH26+TO-PRO-3+死細胞在全部PKH26+靶腫瘤細胞內的百分數(shù)。在測試的所有E:T比例下，胎盤NK細胞和外周血液NK細胞都顯示出對K562細胞的明顯毒性(圖4)。在兩個E:T比例(10:1和5:1)下，觀察到胎盤NK細胞對K562細胞的毒性顯著高于外周血液NK細胞對K562細胞的毒性(圖4)。6.4.實施例4∶人胎盤灌洗液對腫瘤細胞的細胞毒性本實施例證實了人胎盤灌洗液細胞對腫瘤細胞具有細胞毒性，且來自HPP的所有有核細胞(TNC-HPP)對KG-1a的細胞毒性高于來自匹配的UCB的TNC的細胞毒性。將來自HPP或臍帶血(UCB)的所有有核細胞與KG-1a細胞按照1:1、5:1、10:1、20:1或100：1的比例混合。在培育24小時或48小時后，收集細胞，并通過FACS分析(BDFACSCanto，BDBioscience)檢測CFSE的存在。使用單獨培養(yǎng)的腫瘤細胞作為對照。細胞毒性定義為：(1-CFSE樣品/CFSE對照)×100%。在100:1的比例下，顯示出顯著的細胞毒性。參見圖5。在獨立的實驗中，比較來自HPP的所有有核細胞的細胞毒性與來自臍帶血的所有有核細胞的細胞毒性。按照0.78:1、1.56:1、3.12:1、6.25:1、12.5:1、25:1、50:1或100:1的比例，將匹配的TNC-HPP或UCB與KG-1a細胞混合。在所有比例下，TNC-HPP始終顯示出較UCB更高的細胞毒性。參見圖6。在另一實驗中，在與KG-1a細胞培育24小時之前，用100U/mL或l000U/mL的IL-2刺激TNC-HPP，同時使用RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)的HPP作為對照。在6.25NK細胞/KG-1a細胞及以上的比例下，IL-2似乎增強了TNC-HPP的細胞毒性。參見圖7。如表12所示，使用更廣泛的腫瘤細胞類型，使用5×105個HPP細胞和1×104個腫瘤細胞重復該實驗。表12∶用來測量胎盤灌洗液細胞毒性作用的腫瘤細胞HCC2218人原發(fā)性導管癌CCRF-CEM人白血病J.RT3-T3.5人急性T細胞白血病K526人慢性髓細胞樣淋巴瘤(CML)KG-1人急性髓性白血病KG-1a人急性髓性白血病(AML)KU812人白血病(CML)NCI-H1417人肺癌SNU-CI人結腸腺癌U-937人組織細胞性淋巴瘤WERI-RB-1人成視網(wǎng)膜細胞瘤HCT-116人結腸癌HT-29人結腸直腸腺癌U266人骨髓瘤當按照50∶1的比例共同培養(yǎng)HPP細胞和腫瘤細胞24小時或48小時后，HPP細胞顯示出對腫瘤細胞的明顯毒性。對于這兩個時間段，共同培養(yǎng)都引起超過50%的腫瘤細胞死亡。參見圖8A和8B。6.5.實施例5∶人胎盤灌洗液細胞在暴露于腫瘤細胞期間細胞因子的生成為了確定負責介導HPP細胞的抗白血病作用的主要作用機制，使用多重Luminex試驗，在不同時間點對與腫瘤細胞系共同培養(yǎng)的HPP細胞的細胞因子釋放特征進行了分析，并將其與UCB細胞的細胞因子釋放特征進行了比較。對培養(yǎng)后收集的上清液進行Luminex試驗，以確定IFN-γ、TNF-α和GM-CSF(目錄號HCYTO-60K-03，Millipore)的濃度。這三種細胞因子與NK細胞毒性有關(參見，例如Imai等人，Blood2005.106(1):376-83)。使用AppliedBiosystemsFAST7900HT儀器和引物，進行定量RT-PCR，以檢測IFN-γ、TNF-α和GM-CSF的表達。培養(yǎng)條件與上述的共同培養(yǎng)細胞毒性試驗的條件相同。使用Luminex試驗來確定細胞因子的濃度。確定與腫瘤細胞共同培養(yǎng)的HPP細胞對IFN-γ、TNF-α和GM-CSF的分泌顯著地高于UCB細胞的分泌。在一個實驗中，在存在或不存在100U的IL-2的情況下，按照0.78:1、1.56:1、3.12:1、6.25:1、12.5:1、25:1、50:1或100:1的比例，將HPP細胞與KG-1a細胞混合。與不存在IL-2相比，在IL-2的存在下，TNC-HPP顯示出IFN-γ生成的持續(xù)增加。確定在24小時，IFN-γ的水平增加了約5-26倍(中值∶16倍)；在48小時，增加了約3-65倍(中值∶27倍)，其與細胞毒性研究得到的結果一致。參見圖9。在另一個實驗中，在與KG-1a細胞培育24小時之前，用100U/mL或1000U/mLIL-2刺激TNC-HPP，同時使用RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)的HPP作為對照。在與KG-1a細胞共同培育之前，在存在或不存在IL-2的情況下，培養(yǎng)HPP或匹配的UCB細胞24小時。在與K562和KG-1a共同培養(yǎng)48小時的HPP細胞中，IFN-γ的分泌增加最多。當用100U/mlIL-2處理HPP細胞時，在第24小時和48小時，HPP細胞對KG-1a的細胞毒性增加。當用IL-2處理時，HPP細胞中IFN-γ的分泌水平高于匹配的UCB細胞。通過對來自匹配的HPP和UCB的細胞的RT-PCR分析確認了更高的IFN-γ表達。這些結果表明與UCB細胞相比，HPP細胞顯示出更高的抗白血病活性，并且該更高的活性與IFN-γ生成的顯著增加有關。使用表1中列出的腫瘤細胞系對與一組腫瘤細胞系共同培養(yǎng)期間HPP細胞和臍帶血細胞中的IFN-γ生成進行分析。按照50:1的比例，使用104個腫瘤細胞和5×105個HPP細胞共同培養(yǎng)HPP細胞和腫瘤細胞24小時或48小時。對于CCRF-CEM、J.RT3-T3.5、K562、KG1、KG-1a、KU812、NC1-H1417、U-937和WER1-RB-1細胞系，在共同培養(yǎng)24小時時，HPP細胞的IFN-γ生成的增加超過了與這些細胞系共同培養(yǎng)相同時間的臍帶血細胞。參見圖10A。在共同培養(yǎng)48小時時，對于所有的腫瘤細胞系，HPP細胞的IFN-γ生成的增加超過臍帶血。參見圖10B。在所有腫瘤細胞系中，在24小時和48小時，K562細胞均誘導了HPP細胞中IFN-γ生成的最大增加。對于TNF-α和GM-CSF，觀察到類似的結果。細胞周期分析證實，與單獨培養(yǎng)的KG-1a細胞相比，當與HPP共同培養(yǎng)時，處于S期的KG-1a的百分比降低30%。使用HPP的不同富集部分進行的進一步共同培養(yǎng)實驗證實，HPP的抗白血病活性極大地歸因于高濃度的特有的未成熟自然殺傷細胞，所述未成熟自然殺傷細胞的特征為高水平表達CD56+，而不表達CD16。6.6.實施例6∶人胎盤灌洗液細胞在體內對腫瘤細胞增殖的抑制6.6.1.材料和方法本實施例通過使用NOD/SCID小鼠異種移植腫瘤模型證實了人胎盤灌洗液在體內對腫瘤細胞的功效。KG-1細胞的培養(yǎng)。將KG-1細胞保持在37℃下，在95%空氣/5%CO2和100%濕度下的Iscove’s改良的Dulbecco’s培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補充了20%的胎牛血清(生長培養(yǎng)基)。每隔一天更換所述培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基，每周將細胞傳代。KG-1細胞呈懸浮生長。因此，為了更換培養(yǎng)基或將細胞傳代，將細胞懸浮液收集在離心管中，并且在轉子(零件號75006434)中以2,000rpm離心10分鐘。棄去上清液，并將合適量的細胞沉淀重懸在生長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。用于植入的KG-1細胞制劑。為了將細胞植入小鼠，如上所述通過離心收集細胞。收集細胞沉淀，并將其重懸在磷酸鹽緩沖鹽水中。為了確定待植入到小鼠的細胞數(shù)量，使用血細胞計數(shù)器對等分試樣的細胞懸浮液進行計數(shù)。使用臺盼藍染料排除懸浮液中的死細胞。用于植入的HPP細胞制劑。為了HPP的貯存和解凍，將接收的樣品冷凍在良好條件下的干燥運送容器中。將所述單位貯存在干燥的運送容器中，直到2007年2月7日解凍。在解凍當天，從冷凍干燥器中取出HPP單元(每次一個)，放置到自封口塑料袋中。然后，將該袋放到37℃水浴中，輕輕搖晃，直到大部分解凍(袋中仍存留小冷凍塊)。隨后從水浴中取出所述袋，從自封口袋中取出所述單元，并輕輕倒置該單元直到完全解凍。隨后將該單元放入層流凈化罩中，通過用70%的乙醇噴霧對血袋的外表面進行滅菌。使用無菌剪刀剪開血袋，用無菌移液器將細胞轉移到無菌的50ml錐形管(每個HPP單位1管；每個UCB單位2管)中。接著，將10mL解凍緩沖液(2.5%人白蛋白，5%葡聚糖40)慢慢地加入到每個管中，輕輕地混合(在2.2-2.9分鐘期間)。然后，用10mL解凍緩沖液沖洗每個血袋，隨后將該沖洗緩沖液慢慢地加入到50ml的錐形管中(在0.7-1.3分鐘期間)。在解凍后，在離心前將每個單位貯存在濕冰上。將所有的管離心10分鐘(440×g，10℃)，使用無菌移液器吸出上清液，通過振搖所述管輕輕地打散沉淀。將1ml等分試樣的運載體(PBS+1%胎牛血清)加入到一個管中，并通過輕輕地旋轉混合所述管。使用2ml移液器，將內含物轉移到第二個管中，接著轉移到第三個管，之后轉移到第四個管。用0.2ml稀緩沖液洗滌空管。為了細胞計數(shù)，將25μl等分試樣轉移到在冰上的15ml錐形管中，該管中含有975μl運載體。然后，通過加入4ml冷的氯化銨裂解試劑并在冰上培育10分鐘來裂解紅細胞。在培育后，將5ml的冷PBS加入到每個管中，離心所述管(10min，400×g，10℃)。在RBC裂解后，通過血細胞計數(shù)器對細胞進行計數(shù)，使用臺盼藍評價生存力。計數(shù)結果針對稀釋進行校正并除以裂解因子(0.46)，以估計在RBC裂解之前存在的細胞數(shù)。對于HPP劑量配制，在計數(shù)后，通過加入運載體將HPP細胞稀釋至1×108個細胞/ml。然后將HPP細胞貯存在冰上，直到填充注射器。從解凍第一個單位到完成劑量配制之間的間隔時間少于3小時。在填充注射器之前，留出50μl等分試樣的給藥材料，用于通過如上所述的計數(shù)進行給藥后的驗證。在給藥后，評價剩余給藥材料以進行給藥驗證。研究設計。在第1天，將5百萬個活KG-1細胞S/C植入到二十四個NOD/SCID雄性小鼠(JacksonLaboratories)的側腹區(qū)域。分開所述小鼠，使得四至五只小鼠飼養(yǎng)在具有木屑床的小分離籠系統(tǒng)中。隨意提供無菌的嚙齒類動物飼料和水。每周兩次嚴格地監(jiān)測小鼠的腫瘤生長。在第25天，觀察到第一個可測量的腫瘤。然后，每周一次記錄體重，并每周兩次用測徑器記錄腫瘤測量結果。在植入后第52天，將動物隨機分成三個獨立的組，腫瘤體積平均為約300-350mm3。參見下表13。第一組由具有平均腫瘤體積為312mm3的四只對照小鼠組成。這些小鼠中，兩只靜脈內(IV)、兩只動脈內(IT)分別植入200μl和50μl運載體溶液。具有平均腫瘤體積345mm3的第二組由靜脈內植入200μlHPP細胞/小鼠(2×107個細胞)的四只小鼠組成。IT植入50μlHPP細胞/小鼠的最后一組也由具有平均腫瘤體積332mm3的四只小鼠組成。表13∶用于體內腫瘤抑制試驗的實驗組在第66天，植入HPP細胞后14天，由于腫瘤體積過大而終止研究。6.6.2.結果測量腫瘤體積(TV)直到第66天(HPP-細胞植入后第14天)，此時對照組的TV達到平均2921mm3。在研究結束時，IV處理組的平均TV為2076mm3，IT組的TV為2705mm3。關于處理后TV的增加%，與對照組相比，IT組顯示出對腫瘤生長20%的中度抑制，而IV組顯示出對腫瘤生長超過35%的抑制。IT組的抑制是可證實的。參見圖11。等同物∶本發(fā)明不受限于本文所描述的具體實施方案的范圍。實際上，除了描述的那些外，根據(jù)以上描述和附圖，對本發(fā)明進行的各種改變對于本領域的技術人員來說是顯而易見的。這樣的改變落在所附權利要求的范圍內。本文引用的所有參考文獻通過參考完整納入本文，且為了所有的目的以相同程度納入本文，就如同各單獨的出版物、專利或專利申請被特別地且單獨地指明為了所有目的通過參考完整納入本文一樣。對任何出版物的引用針對其在本申請日之前的公開內容，而不應認為是承認是本發(fā)明由于在先發(fā)明而不能享有該出版物之前的日期。