專利名稱：使用人胎盤灌洗液和人來自胎盤的中間體自然殺傷細(xì)胞的腫瘤抑制的制作方法
使用人胎盤灌洗液和人來自胎盤的中間體自然殺傷細(xì)胞的
腫瘤抑制本申請要求于2008年9月28日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/995，763和于2008 年8月21日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/090，555的優(yōu)選權(quán)，所述申請的全部內(nèi)容通過 參考納入本文。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了通過將腫瘤細(xì)胞與胎盤灌洗液、來自胎盤的細(xì)胞、來自胎盤(例如 來自胎盤灌洗液)的自然殺傷細(xì)胞、和/或包含來自胎盤(例如來自胎盤灌洗液)的自然 殺傷細(xì)胞和來自臍帶血的自然殺傷細(xì)胞的混合自然殺傷細(xì)胞接觸來抑制腫瘤細(xì)胞生長或 增殖的方法。本發(fā)明還提供了從胎盤，例如從胎盤灌洗液(例如人胎盤灌洗液)，來制備獨(dú) 特自然殺傷細(xì)胞群的方法。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了使用胎盤灌洗液及其中的自然殺傷細(xì) 胞抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法。
2.
背景技術(shù)：
胎盤灌洗液包含通過下述方式獲得的胎盤細(xì)胞群使灌洗溶液流經(jīng)胎盤血管系 統(tǒng)，并從所述血管系統(tǒng)、從所述胎盤的母體面、或從兩者收集灌洗液體。灌洗哺乳動物胎盤 的方法描述在例如美國專利號7，045，146和美國專利號7，255，879中。通過灌洗獲得的胎 盤細(xì)胞群是異源性的，包含造血細(xì)胞(CD34+)、有核細(xì)胞例如粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、 小百分比(少于1%)的組織培養(yǎng)基質(zhì)-粘附的胎盤干細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。至今還無人 描述胎盤灌洗液或來自灌洗液的胎盤細(xì)胞群在抑制腫瘤細(xì)胞增殖中的用途。自然殺傷(NK)細(xì)胞是構(gòu)成先天免疫系統(tǒng)的主要組分的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞。在人 體中，NK細(xì)胞不表達(dá)T-細(xì)胞抗原受體(TCR)、CD3或表面免疫球蛋白(Ig)B細(xì)胞受體，但通 常表達(dá)表面標(biāo)記物⑶16(FcyRIII)和⑶56。NK細(xì)胞是細(xì)胞毒性的；其細(xì)胞質(zhì)中的小顆粒 包含特殊蛋白質(zhì)如穿孔素和被稱為粒酶的蛋白酶。當(dāng)在非常接近于待殺死的細(xì)胞周圍釋放 時，穿孔素在靶細(xì)胞的細(xì)胞膜中形成孔，粒酶和相關(guān)分子可以通過所述孔進(jìn)入，誘導(dǎo)細(xì)胞凋 亡。一種粒酶，粒酶B (也被稱為粒酶2和細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞-結(jié)合的絲氨酸酯酶1)，是 在細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答中快速誘導(dǎo)靶細(xì)胞細(xì)胞凋亡的一種重要的絲氨酸蛋白酶。NK細(xì)胞響應(yīng)干擾素或巨噬細(xì)胞_衍生的細(xì)胞因子而被活化。活化的NK細(xì)胞被稱 為淋巴因子活化的殺傷(LAK)細(xì)胞。NK細(xì)胞具有兩類表面受體，標(biāo)記為“活化受體”和“抑 制受體”，它們控制細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。除了其它活性，NK細(xì)胞在宿主的腫瘤排異反應(yīng)中起作用。因?yàn)榘┘?xì)胞具有降低的 或沒有I型MHC表達(dá)，它們可以成為NK細(xì)胞的靶點(diǎn)。大量臨床數(shù)據(jù)表明從PBMC或骨髓分 離的人NK細(xì)胞的單倍體相合移植可介導(dǎo)強(qiáng)烈的抗白血病效應(yīng)，而不會產(chǎn)生可檢測的移植 物抗宿主病(GVHD)。參見Ruggeri等人，Science 295:2097-2100(2002))。自然殺傷細(xì)胞 可由缺乏或呈現(xiàn)低水平的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)蛋白的細(xì)胞活化。活化的和擴(kuò)增的 NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞已被用于對患有晚期癌癥的患者的離體治療和體內(nèi)治療，并在骨髓相關(guān)疾病(例如白血病)、乳腺癌、和某些類型的淋巴瘤的治療中取得了一定的成功。LAK細(xì)胞 治療要求患者首先接受IL-2，接著接受白細(xì)胞分離法，然后在IL-2的存在下，將收集的自 體血細(xì)胞離體培育和培養(yǎng)幾天。LAK細(xì)胞必須與相對高劑量的IL-2 —起重新輸注，以完成 治療。該凈化治療(purging treatment)價格昂貴且可能引起嚴(yán)重的副作用。這些副作用 包含體液潴留、肺水腫、血壓降低和高熱。盡管NK細(xì)胞在殺死腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞中具有有利的性質(zhì)，處理它們和 將它們用于免疫治療仍然很難，主要原因在于在培養(yǎng)和擴(kuò)增期間，很難保持它們的腫瘤靶 向和殺死腫瘤的能力。因而，本領(lǐng)域存在對自然殺傷細(xì)胞的易用供給的需要。3.發(fā)明概述本發(fā)明提供了胎盤灌洗液；來自胎盤灌洗液的細(xì)胞，例如來自胎盤灌洗液的所有 有核細(xì)胞；胎盤灌洗液細(xì)胞和臍帶血細(xì)胞的組合；和/或來自胎盤的自然殺傷細(xì)胞，例如來 自胎盤灌洗液的自然殺傷細(xì)胞或通過消化胎盤組織獲得的自然殺傷細(xì)胞在抑制腫瘤細(xì)胞 增殖中的用途。在一個方面，本發(fā)明提供一種抑制腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞群增殖的方法，該方法包 括將所述腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞群與人胎盤灌洗液接觸。在該方法的具體實(shí)施方案中，所述 腫瘤細(xì)胞為血癌細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞為多個血癌細(xì)胞。在另一具 體實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞為實(shí)體瘤細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞為多個 實(shí)體瘤細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞為原發(fā)性導(dǎo)管癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、急性T 細(xì)胞白血病細(xì)胞、慢性髓細(xì)胞樣淋巴瘤(CML)細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、慢性髓性白血病 (CML)細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、成視網(wǎng) 膜細(xì)胞瘤細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞或結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述接觸在 體外進(jìn)行。在另一具體實(shí)施方案中，所述接觸在體內(nèi)進(jìn)行。在更具體的實(shí)施方案中，所述體 內(nèi)接觸在人體中進(jìn)行。在另一具體實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液為已流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)(例如僅流經(jīng)胎 盤血管系統(tǒng))的灌洗液。在另一具體實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液已流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)，且 是從胎盤的母體面收集的。在另一具體實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液中所有的或基本上所 有的(例如大于90%、95%、98%或99%)的細(xì)胞是胎兒細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所 述胎盤灌洗液包含胎兒細(xì)胞和母體細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液中的胎 兒細(xì)胞包含少于約90%、80%、70%、60%或50%的所述灌洗液中的細(xì)胞。在另一具體實(shí)施 方案中，所述灌洗液是通過用0. 9% NaCl溶液流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)獲得的。在另一具體實(shí)施 方案中，所述灌洗液包含培養(yǎng)基。在另一具體實(shí)施方案中，所述灌洗液已經(jīng)過處理除去了大 量紅細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了一種抑制腫瘤細(xì)胞或多個腫瘤細(xì)胞增殖的方法，該方 法包括將所述腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞與眾多胎盤灌洗液細(xì)胞接觸。在另一具體實(shí)施方案 中，所述眾多胎盤灌洗液細(xì)胞是或包含來自胎盤灌洗液的所有有核細(xì)胞。在另一具體實(shí)施 方案中，所述胎盤灌洗液或胎盤灌洗液細(xì)胞(例如來自胎盤灌洗液的所有有核細(xì)胞)已經(jīng) 過處理除去了至少一類細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述接觸在體外進(jìn)行。在另一具體 實(shí)施方案中，所述接觸在體內(nèi)進(jìn)行。在更具體的實(shí)施方案中，所述體內(nèi)接觸在哺乳動物(例 如人類)中進(jìn)行。在另一具體實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液細(xì)胞已經(jīng)過處理從而富集了至少一類細(xì)胞，例如CD56+細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液細(xì)胞為CD56+胎盤 細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述CD56+細(xì)胞為CD56+CD16_自然殺傷細(xì)胞，例如胎盤中間 體自然殺傷(PINK)細(xì)胞，所述細(xì)胞例如從胎盤灌洗液細(xì)胞獲得，或從通過機(jī)械破壞或酶破 壞胎盤組織獲得的胎盤細(xì)胞中獲得。在另一具體實(shí)施方案中，所述CD56+細(xì)胞通過CD56-偶 聯(lián)微珠選擇。在另一具體實(shí)施方案中，所述CD56+細(xì)胞包含的細(xì)胞與等量的CD56+CD16+自然 殺傷細(xì)胞相比，顯示出可檢測的更低的NKG2D、NKp46或⑶94的表達(dá)。在另一具體實(shí)施方案 中，所述PINK細(xì)胞為CD3_。在更具體的實(shí)施方案中，在所述胎盤灌洗液細(xì)胞中的至少50% 的細(xì)胞是所述CD56+細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，其中所述CD56+細(xì)胞為至少50%的所 述胎盤灌洗液細(xì)胞，所述腫瘤細(xì)胞為原發(fā)性導(dǎo)管癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、急性T細(xì)胞白血病細(xì) 胞、慢性髓細(xì)胞樣淋巴(CML)細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、慢性髓性白血病(CML)細(xì)胞、肺癌 細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤細(xì)胞、結(jié) 腸直腸癌細(xì)胞或結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述接觸為體外接觸。在另一實(shí) 施方案中，所述接觸為體內(nèi)接觸，例如在哺乳動物(例如人體)中。在另一個方面，本發(fā)明提供一種抑制腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞增殖的方法，該方 法包括將所述腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞與眾多來自胎盤的自然殺傷細(xì)胞(例如PINK細(xì)胞) 接觸。在具體實(shí)施方案中，所述來自胎盤的自然殺傷細(xì)胞為從胎盤灌洗液獲得的自然殺傷 細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述自然殺傷細(xì)胞為通過物理破壞和/或酶消化胎盤組織 獲得的自然殺傷細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述自然殺傷細(xì)胞為CD56+CD16—自然殺傷 細(xì)胞，例如PINK細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述自然殺傷細(xì)胞通過CD56-偶聯(lián)微珠從 例如胎盤灌洗液細(xì)胞或通過物理破壞和/或酶消化胎盤組織獲得的細(xì)胞中選擇。在另一具 體實(shí)施方案中，所述自然殺傷細(xì)胞為CD3—。在具體實(shí)施方案中，所述眾多自然殺傷細(xì)胞為包 含該自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞群中的至少80%的細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述接觸在體 外進(jìn)行。在另一具體實(shí)施方案中，所述接觸在體內(nèi)進(jìn)行。在更具體的實(shí)施方案中，所述體內(nèi) 接觸在哺乳動物(例如人類)中進(jìn)行。在所述方法的另一具體實(shí)施方案中，所述眾多自然殺傷細(xì)胞包含的細(xì)胞與等量的 ⑶56+CD16+自然殺傷細(xì)胞相比，顯示出可檢測的更低的NKG2D、NKp46或⑶94的表達(dá)。在 另一具體實(shí)施方案中，與外周血液自然殺傷細(xì)胞相比，所述眾多自然殺傷細(xì)胞(例如PINK 細(xì)胞)以可檢測的更高的水平表達(dá)以下一種或多種微小RNA :hsa-miR-100、hsa-miR-127、 hsa—miR-211、hsa_miR-302c、hsa-miR-326、hsa-miR-337、hsa-miR-497、hsa-miR-512_3p、 hsa-miR-515_5p、hsa_miR-517b、hsa_miR-517c、hsa-miR-518a> hsa_miR-518e、 hsa_miR-519d、hsa_miR-520g、hsa_miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618 禾口 / 或 hsa-miR-99a。在另一具體實(shí)施方案中，將所述眾多自然殺傷細(xì)胞(例如PINK細(xì)胞)與一定量 的免疫調(diào)節(jié)化合物接觸一段時間，所述量和所述時間足以使得所述眾多自然殺傷細(xì)胞與沒 有接觸所述免疫調(diào)節(jié)化合物的等量的所述自然殺傷細(xì)胞相比，表達(dá)可檢測的更多的粒酶B。 在更具體的實(shí)施方案中，所述免疫調(diào)節(jié)化合物為來那度胺或pomalid0mide(3-氨基_N_(2， 6- 二氧代-3-哌啶基)鄰苯二甲酰亞胺)。在另一具體實(shí)施方案中，將所述眾多自然殺傷細(xì) 胞(例如PINK細(xì)胞)與一定量的免疫調(diào)節(jié)化合物接觸一段時間，所述量和所述時間足以使 得所述自然殺傷細(xì)胞與沒有接觸所述免疫調(diào)節(jié)化合物(例如來那度胺或pomalidomide)的等量的所述自然殺傷細(xì)胞相比，顯示出針對所述腫瘤細(xì)胞的可檢測的更高的細(xì)胞毒性。在 另一具體實(shí)施方案中，與沒有接觸所述免疫調(diào)節(jié)化合物的等量的所述自然殺傷細(xì)胞相比， 所述眾多自然殺傷細(xì)胞(例如PINK細(xì)胞)以更高水平表達(dá)BAX、CCL5、CCR5、CSF2、FAS、 ⑶SB、IL2RA或TNFRSF18中的一種或多種。在另一具體實(shí)施方案中，與沒有接觸所述免疫 調(diào)節(jié)化合物的等量的所述自然殺傷細(xì)胞相比，所述眾多自然殺傷細(xì)胞(例如PINK細(xì)胞)以 更高水平表達(dá) ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL5、CCR5、CSF1、CSF2、ECE1、FAS、GNLY、⑶SB、GZMB、 ILIA、IL2RA、IL8、IL10、LTA、PRF1、PTGS2、SKI 和 TBX21 中的一種或多種。在另一實(shí)施方案中，將來自胎盤的自然殺傷細(xì)胞與來自另一來源(例如胎盤血和 /或臍帶血)的自然殺傷細(xì)胞混合，例如以形成混合的自然殺傷細(xì)胞。本文使用的短語“來 自胎盤的自然殺傷細(xì)胞”不包含來自臍帶血或胎盤血的自然殺傷細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方 案中，來自胎盤的自然殺傷細(xì)胞與來自另一來源的自然殺傷細(xì)胞的混合比例為約100 1、 95 5、90 10,85 15,80 20,75 25,70 30,65 35,60 40,55 45,50 50、 45 55,40 60,35 65,30 70,25 75,20 80,15 85,10 90、5 95,100 1、 95 1、90 1、85 1、80 1、75 1、70 1、65 1、60 1、55 1、50 1、45 1、 40 1、35 1、30 1、25 1、20 1、15 1、10 1、5 1、1 1、1 5、1 10、1 15、 1 20、1 25、1 30、1 35、1 40、1 45、1 50、1 55、1 60、1 65、1 70、 1 75、1 80、1 85、1 90、1 95、1 100 等。在具體實(shí)施方案中，所述混合的自然殺傷細(xì)胞沒有進(jìn)行培養(yǎng)，且其包含與來自 外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3—CD56+CD16-自然殺傷細(xì) 胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更低數(shù)量的CD3TD56+CD16+ 自然殺傷細(xì)胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更高數(shù)量的 ⑶3_CD56+KIR2DL2/L3+自然殺傷細(xì)胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測 的更低數(shù)量的CD3_CD56+NKp46+自然殺傷細(xì)胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相 比，可檢測的更高數(shù)量的CD3_CD56+NKp30+自然殺傷細(xì)胞；與來自外周血液的等量的自然殺 傷細(xì)胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3_CD56+2B4+自然殺傷細(xì)胞；與來自外周血液的等量的 自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3TD56+CD94+自然殺傷細(xì)胞。在其它具體實(shí)施方 案中，所述混合的自然殺傷細(xì)胞沒有進(jìn)行培養(yǎng)，且其包含與來自外周血液的等量的自然殺 傷細(xì)胞相比，可檢測更低數(shù)量的⑶3TD56+KIR2DL2/L3+自然殺傷細(xì)胞；與來自外周血液的 等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3_CD56+NKp46+自然殺傷細(xì)胞；與來自外 周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3_CD56+NKp44+自然殺傷細(xì)胞； 與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3_CD56+NKp30+自然殺 傷細(xì)胞。在任一上述方法的具體實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞為實(shí)體瘤細(xì)胞。在另一具體實(shí) 施方案中，所述腫瘤細(xì)胞為液體腫瘤細(xì)胞，例如血液腫瘤細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所 述腫瘤細(xì)胞為原發(fā)性導(dǎo)管癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞、慢性髓細(xì)胞樣淋巴 瘤(CML)細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、慢性髓性白血病(CML)細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì) 胞、組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞或 結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含分離的胎盤⑶56+、⑶16—自然殺傷
9細(xì)胞(例如PINK細(xì)胞)。在一具體實(shí)施方案中，所述胎盤自然殺傷細(xì)胞是從胎盤灌洗液中 分離的。在另一具體實(shí)施方案中，所述胎盤自然殺傷細(xì)胞是通過物理破壞和/或酶消化胎 盤組織從胎盤中分離的。在另一具體實(shí)施方案中，所述自然殺傷細(xì)胞包含所述組合物中至 少50%的細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述自然殺傷細(xì)胞包含所述組合物中至少80%的細(xì) 胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述組合物包含分離的CD56+、CD16+自然殺傷細(xì)胞。在更具體 的實(shí)施方案中，所述CD56+、CD16+自然殺傷細(xì)胞來自與所述CD56+、CD16_自然殺傷細(xì)胞不同 的個體。在另一具體實(shí)施方案中，所述分離的CD56+、CD16_自然殺傷細(xì)胞來自單個個體。在 更具體的實(shí)施方案中，所述分離的CD56+、CD16—自然殺傷細(xì)胞包含來自至少兩個不同個體 的自然殺傷細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述胎盤自然殺傷細(xì)胞(例如所述PINK細(xì)胞) 被擴(kuò)增。在更具體的實(shí)施方案中，所述組合物包含胎盤自然殺傷細(xì)胞和來自另一來源的自 然殺傷細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述其它來源為臍帶血和/或臍帶血。在另一具體實(shí)施 方案中，所述其它來源為外周血液。在更具體的實(shí)施方案中，來自胎盤的自然殺傷細(xì)胞與來 自另一來源的自然殺傷細(xì)胞的混合比例為約100 1、95 5、90 10,85 15,80 20、 75 25,70 30,65 35,60 40,55 45,50 50,45 55,40 60,35 65,30 70、 25 75,20 80,15 85,10 90、5 95,100 1、95 1、90 1、85 1、80 1、 75 1、70 1、65 1、60 1、55 1、50 1、45 1、40 1、35 1、30 1、25 1、 20 1、15 1、10 1、5 1、1 1、1 5、1 10、1 15、1 20、1 25、1 30、1 35、 1 40、1 45、1 50、1 55、1 60、1 65、1 70、1 75、1 80、1 85、1 90、 1 95、1 100 等。在另一具體實(shí)施方案中，所述組合物包含分離的胎盤灌洗液。在更具體的實(shí)施方 案中，所述胎盤灌洗液與所述自然殺傷細(xì)胞來自相同的個體。在另一更具體的實(shí)施方案中， 所述胎盤灌洗液包含來自與所述自然殺傷細(xì)胞不同個體的胎盤灌洗液。在另一具體實(shí)施方 案中，所述胎盤灌洗液中所有的或基本上所有的(例如大于90%、95%、98%或99%)的細(xì) 胞為胎兒細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液包含胎兒細(xì)胞和母體細(xì)胞。在更具 體的實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液中的胎兒細(xì)胞包含少于約90 %、80%、70%、60 %或50% 的所述灌洗液中的細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述灌洗液是通過用0. 9% NaCl溶液流 經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)而獲得的。在另一具體實(shí)施方案中，所述灌洗液包含培養(yǎng)基。在另一具體 實(shí)施方案中，所述灌洗液已經(jīng)處理除去了眾多紅細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述組合物包含胎盤灌洗液細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案 中，所述胎盤灌洗液細(xì)胞與所述自然殺傷細(xì)胞來自相同的個體。在另一更具體實(shí)施方案中， 所述胎盤灌洗液細(xì)胞與所述自然殺傷細(xì)胞來自不同的個體。在另一具體實(shí)施方案中，所述 組合物包含分離的胎盤灌洗液和分離的胎盤灌洗液細(xì)胞，其中所述分離的灌洗液和所述分 離的胎盤灌洗液細(xì)胞來自不同的個體。在任一上述包含胎盤灌洗液的實(shí)施方案中的另一更 具體實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液包含來自至少兩個個體的胎盤灌洗液。在任一上述包含 胎盤灌洗液細(xì)胞的實(shí)施方案中的另一更具體實(shí)施方案中，所述分離的胎盤灌洗液細(xì)胞來自 至少兩個個體。所述組合物可另外包含分離的PINK細(xì)胞，其中所述PINK細(xì)胞與所述胎盤 灌洗液或所述灌洗液細(xì)胞來自不同的個體。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離胎盤自然殺傷細(xì)胞的方法，該方法包括獲得眾多胎盤細(xì)胞，和從所述眾多胎盤細(xì)胞分離自然殺傷細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述胎盤細(xì) 胞是或包含胎盤灌洗液細(xì)胞，例如來自胎盤灌洗液的所有有核細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案 中，所述眾多胎盤細(xì)胞是或包含通過機(jī)械破壞和/或酶消化胎盤組織獲得的胎盤細(xì)胞。在 另一實(shí)施方案中，所述分離是使用一種或多種抗體進(jìn)行的。在更具體的實(shí)施方案中，所述一 種或多種抗體包含一種或多種針對CD3、CD16或CD56的抗體。在更具體的實(shí)施方案中，所述 分離包括在所述眾多胎盤細(xì)胞中將CD56+細(xì)胞與CD56_細(xì)胞分離。在更具體的實(shí)施方案中， 所述分離包括將⑶56+、⑶16_胎盤細(xì)胞與⑶56_或⑶16+胎盤細(xì)胞分離。在更具體的實(shí)施方 案中，所述分離包括將⑶56+、⑶16_、⑶3_胎盤細(xì)胞與⑶56_、OT16+或⑶3+胎盤細(xì)胞分離。在 另一實(shí)施方案中，所述分離胎盤自然殺傷細(xì)胞的方法產(chǎn)生的胎盤細(xì)胞群的至少50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或至少 99%細(xì)胞是 CD56+、CD16-自然殺 傷細(xì)胞。在上述方法的某些實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液細(xì)胞已經(jīng)在培養(yǎng)基中擴(kuò)增。在各 種實(shí)施方案中，所述細(xì)胞擴(kuò)增了至少、大約或不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 天。在具體實(shí)施方案中，所述胎盤 灌洗液細(xì)胞已經(jīng)在滋養(yǎng)層的存在下和/或在至少一種細(xì)胞因子的存在下擴(kuò)增。在更具體的 實(shí)施方案中，所述滋養(yǎng)層包含K562細(xì)胞或外周血液單核細(xì)胞。在另一更具體實(shí)施方案中， 所述至少一種細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素_2。3. 1.定義本文使用的“混合的自然殺傷細(xì)胞”是例如來自匹配的臍帶和人胎盤灌洗液的自 然殺傷細(xì)胞，其中胎盤灌洗液與臍帶血獲自相同的胎盤。分別或同時分離來自兩者的自然 殺傷細(xì)胞，并將其混合。本文使用的“PINK”和“PINK細(xì)胞”指胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞，其是從人胎盤(例 如人胎盤灌洗液或已被機(jī)械破壞和/或酶破壞的胎盤組織)獲得的。所述細(xì)胞為CD56+和 CD16_，例如可通過流式細(xì)胞術(shù)，例如使用針對CD56和CD 16的抗體熒光激活細(xì)胞分類術(shù)測 定。PINK細(xì)胞不是從臍帶血或外周血液獲得的。本文使用的“胎盤灌洗液”指已流經(jīng)至少一部分胎盤(例如人胎盤)例如流經(jīng)胎 盤血管系統(tǒng)的灌洗溶液，其包含灌洗溶液在流經(jīng)胎盤期間收集的眾多細(xì)胞。本文使用的“胎盤灌洗液細(xì)胞”指從胎盤灌洗液分離或可從其中分離的有核細(xì)胞 (例如所有有核細(xì)胞)。本文使用的“腫瘤細(xì)胞抑制”、“腫瘤細(xì)胞增殖的抑制”等包括例如通過將腫瘤細(xì)胞 群與PINK細(xì)胞、包含PINK細(xì)胞的細(xì)胞群、混合的自然殺傷細(xì)胞、包含混合的自然殺傷細(xì)胞 的細(xì)胞群、人胎盤灌洗液等接觸，例如通過殺死所述腫瘤細(xì)胞群中的一個或多個腫瘤細(xì)胞， 來減緩腫瘤細(xì)胞群的生長。4.附圖簡要說明

圖1顯示了對于從人胎盤灌洗液(HPP)中通過⑶56微珠選擇的細(xì)胞，使用抗-⑶3 抗體和抗-CD56抗體的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。大部分的分離細(xì)胞是CD56+CD3_。圖2描述了在24小時培養(yǎng)期間，PINK細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞因子的生成。 圖2A描述了單獨(dú)或在KG-Ia腫瘤細(xì)胞的存在下，來自胎盤灌洗液的中間體自然殺傷細(xì)胞 (PINK)對干擾素Y (IFN)的分泌。PINK細(xì)胞和KG-Ia細(xì)胞單獨(dú)或按1 1的比例混合培養(yǎng)。Y軸培養(yǎng)物生成的IFNy的皮克數(shù)。圖2B描述了 PINK細(xì)胞單獨(dú)或在KG-Ia腫瘤細(xì) 胞的存在下對粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的分泌。PINK細(xì)胞和KG-Ia細(xì)胞 單獨(dú)或按1 1的比例混合培養(yǎng)。Y軸培養(yǎng)物生成的GM-CSF的皮克數(shù)。圖3描述了在PINK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞以1 1、5 1、10 1或20 1的比例進(jìn) 行的24小時共同培養(yǎng)中，PINK細(xì)胞對KG-Ia腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。X軸PINK細(xì)胞與腫瘤 細(xì)胞的比例。Y軸相對于沒有PINK細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞死亡百分?jǐn)?shù)。圖4描述了培養(yǎng)了 21天的胎盤NK細(xì)胞和外周血液(PB) NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的細(xì) 胞毒性。誤差柱代表4個單位的培養(yǎng)的胎盤NK細(xì)胞或3個單位的培養(yǎng)的外周血液NK細(xì)胞 的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖5描述了在HPP細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞以1 1、5 UlO 1或20 1的比例進(jìn)行 的24小時共同培養(yǎng)中，從胎盤獲得的全部人胎盤灌洗液對KG-Ia腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。X 軸HPP細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的比例。Y軸相對于沒有HPP細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞死亡百 分?jǐn)?shù)。圖6描述了在HPP細(xì)胞或UCB細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞以100 1、50 1、25 1、 12.5 1,6. 25 1,3. 12 1,1. 56 1或0. 78 1的系列稀釋進(jìn)行的48小時共同培養(yǎng) 中，從胎盤和臍帶血獲得的全部人胎盤灌洗液對KG-Ia腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。X軸HPP細(xì) 胞或臍帶細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的比例。Y軸在48小時后相對于沒有HPP細(xì)胞或臍帶細(xì)胞的腫 瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞死亡百分?jǐn)?shù)。圖7 描述了在HPP 細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞以 100 1、50 1、25 1,12. 5 1,6. 25 1、 3.12 1,1.57 1或0.78 1的系列稀釋進(jìn)行的48小時共同培養(yǎng)中，從胎盤獲得的全部 人胎盤灌洗液對KG-Ia腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。使用收集的灌洗液或經(jīng)100U/ml或1000U/ml 白細(xì)胞介素-2(IL-2)刺激24小時的灌洗液。X軸HPP細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的比例。Y軸在 48小時后相對于沒有HPP細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞死亡百分?jǐn)?shù)。圖8描述了在HPP或UCB細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞以50 1的比例進(jìn)行培養(yǎng)后，人胎盤灌 洗液對一組腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性作用。圖8A:共同培養(yǎng)24小時。圖8B:共同培養(yǎng)48小 時。X軸測試的腫瘤細(xì)胞系。Y軸共同培養(yǎng)后相對于不存在腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞數(shù)的腫 瘤細(xì)胞死亡百分?jǐn)?shù)。圖9描述了 HPP細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的按不同比例下，與KG-Ia腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)的 HPP細(xì)胞的IFNy生成。X軸實(shí)驗(yàn)條件，包括HPP細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的比例，Y軸在24小時 共培養(yǎng)后每毫升的IFNy水平。圖10與一組腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)的HPP或UCB細(xì)胞對IFN γ的生成。將HPP或UCB 細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞系按照50 1的比例共同培養(yǎng)24小時(圖10Α)或48小時(圖10Β)。通 過Luminex試驗(yàn)(HCYT0-60K-03, Millipore)測定IFNy水平。X軸測試的腫瘤細(xì)胞系。 Y軸與不存在腫瘤細(xì)胞下生成的IFNy的皮克數(shù)相比，HPP或UCB細(xì)胞生成的IFNY的皮 克數(shù)。圖11描述了當(dāng)向患有KG-I細(xì)胞腫瘤(體積約為332mm3)的小鼠施用2X107個人 胎盤灌洗液(HPP)細(xì)胞時腫瘤尺寸的減小。瘤內(nèi)——將HPP細(xì)胞直接注射到皮下腫瘤部位。 IV——靜脈內(nèi)施用HPP細(xì)胞。對照——僅施用運(yùn)載體。腫瘤體積以mm3計。5.詳細(xì)說明
本發(fā)明提供了從胎盤獲得的胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞和/或胎盤灌洗液衍生 的自然殺傷(“PINK”)細(xì)胞在抑制腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞生長或增殖中的用途。特別 地，本發(fā)明提供了從胎盤灌洗液(例如人胎盤灌洗液)分離的或從機(jī)械破壞和/或酶破壞 的胎盤組織分離的自然殺傷(NK)細(xì)胞和NK細(xì)胞群、獲得NK細(xì)胞的方法、和使用所述細(xì)胞 的方法。本發(fā)明還提供了包含自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞群，例如胎盤細(xì)胞群。獲得胎盤灌洗液 和從胎盤灌洗液獲得細(xì)胞的方法描述在下述部分5. 1中。來自胎盤灌洗液的自然殺傷細(xì)胞 和獲得所述細(xì)胞的方法描述在下述部分5. 2中。使用胎盤灌洗液、來自胎盤灌洗液的細(xì)胞 來自或胎盤灌洗液的自然殺傷細(xì)胞(例如中間體自然殺傷細(xì)胞)抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法 描述在下述部分5. 3中。5. 1.胎盤灌洗液5. 1. 1.細(xì)胞采集組合物本發(fā)明提供的胎盤灌洗液、灌洗液細(xì)胞和來自胎盤灌洗液的自然殺傷細(xì)胞可以通 過使用胎盤細(xì)胞采集組合物灌洗哺乳動物例如人分娩后的胎盤來收集。可以通過使用任何 生理學(xué)可接受的溶液(例如鹽溶液、培養(yǎng)基或更復(fù)雜的細(xì)胞采集組合物)灌洗胎盤來從胎 盤收集灌洗液。適于灌洗胎盤、和適于收集和保存灌洗液細(xì)胞(例如所有有核胎盤灌洗液 細(xì)胞或PINK細(xì)胞)的細(xì)胞采集組合物詳細(xì)描述在相關(guān)美國申請公開號2007/0190042中， 該申請的全部內(nèi)容通過參考納入本文。所述細(xì)胞采集組合物可以包含適于收集和/或培養(yǎng)干細(xì)胞的任何生理學(xué)可接受 的溶液，例如鹽溶液(例如磷酸鹽緩沖鹽水、Kreb，s溶液、改良的Kreb，s溶液、Eagles，s 溶液、0. 9% NaCl等)、培養(yǎng)基(例如DMEM、H. DMEM等)等。所述細(xì)胞采集組合物可以包含一種或多種易于保存胎盤細(xì)胞的組分，所述保存即 自收集時至培養(yǎng)時，防止胎盤細(xì)胞死亡、或延遲胎盤細(xì)胞死亡、減少死亡的細(xì)胞群中胎盤細(xì) 胞的數(shù)量等。這些組分可以是例如細(xì)胞凋亡抑制劑(例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑 或JNK抑制劑)；血管擴(kuò)張藥(例如硫酸鎂、抗高血壓藥、心房利鈉肽(ANP)、促腎上腺皮質(zhì) 激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、硝普鈉、胼屈嗪、三磷腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸鎂、磷 酸二酯酶抑制劑等)；壞死抑制劑(例如2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊基氨基-馬來酰亞胺、 吡咯烷二硫代氨基甲酸酯或氯硝西泮)；TNF-a抑制劑；和/或載氧全氟化碳(例如全氟辛 基溴、全氟癸基溴等)。所述細(xì)胞采集組合物可以包含一種或多種組織降解酶，例如金屬蛋白酶、絲氨酸 蛋白酶、中性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、RNase或DNase等。這些酶包括但不限于膠原酶(例如 膠原酶I、II、III或IV，來自溶組織梭菌(Clostridiumhistolyticum)的膠原酶等)；分散 酶；嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、胰蛋白酶、LIBERASE、透明質(zhì)酸酶等。所述細(xì)胞采集組合物可以包含殺菌或抑菌有效量的抗生素。在某些非限制性實(shí) 施方案中，所述抗生素是大環(huán)內(nèi)酯類(例如妥布霉素)、頭孢菌素類(例如頭孢氨芐、頭孢 霉定、頭孢呋辛、頭孢丙烯、頭孢克洛、頭孢克肟或頭孢羥氨芐)、克拉霉素、紅霉素、青霉素 (例如青霉素V)或喹諾酮類(例如氧氟沙星、環(huán)丙沙星或諾氟沙星)、四環(huán)素、鏈霉素等。在 特別實(shí)施方案中，所述抗生素具有抗革蘭氏陽性(+)和/或革蘭氏陰性(_)細(xì)菌(例如綠 月農(nóng)假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等) 的活性。
所述細(xì)胞采集組合物還可包含一種或多種下述化合物腺苷(約ImM至約50mM)； D-葡萄糖(約20mM至約IOOmM)；鎂離子(約ImM至約50mM)；分子量大于20，000道爾頓 的大分子，在一實(shí)施方案中，其以足夠保持內(nèi)皮完整性和細(xì)胞生存力的量存在(例如，合成 的或天然存在的膠體、多糖例如葡聚糖或聚乙二醇，以約25g/l至約100g/l、或約40g/l至 約60g/l存在)；抗氧化劑(例如丁羥茴醚、丁羥甲苯、谷胱甘肽、維生素C或維生素E，以 約25 μ M至約100 μ M存在)；還原劑(例如N-乙酰半胱氨酸，以約0. ImM至約5mM存在)； 防止鈣進(jìn)入細(xì)胞的試劑(例如維拉帕米，以約2 μ M至約25 μ M存在)；硝化甘油(例如，約 0. 05g/l至約0. 2g/l)；抗凝血藥，在一個實(shí)施方案中，以足以幫助防止殘余血液凝固的量 存在(例如肝素或水蛭素，以約1000單位/1至約100，000單位/1的濃度存在)；或包含 阿米洛利的化合物(例如阿米洛利、乙基異丙基阿米洛利、環(huán)六亞甲基阿米洛利、二甲基阿 米洛利或異丁基阿米洛利，以約1. 0 μ M至約5 μ M存在)。5. 1. 2.胎盤的收集和處理通常，在出生后胎盤娩出后立即回收人胎盤。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在患者簽署知情 同意書以及在獲取患者的全部病史并將其與所述胎盤關(guān)聯(lián)后，回收患者的胎盤。優(yōu)選地，在 產(chǎn)后繼續(xù)跟蹤病史。這樣的病史可用于調(diào)整所述胎盤或從其中獲得的細(xì)胞的后續(xù)使用。例 如，根據(jù)病史，人胎盤細(xì)胞可用于對與所述胎盤相關(guān)的嬰兒、或該嬰兒的父母、同胞或其它 親屬的個性化用藥。在回收灌洗液之前，除去臍帶血和胎盤血。在某些實(shí)施方案中，在產(chǎn)后，回收胎盤 中的臍帶血?？蓪λ鎏ケP進(jìn)行常規(guī)的臍帶血回收處理。典型地，使用針或插管，借助于 重力來給胎盤排血(參見，例如Anderson，美國專利號5，372，581 ；Hessel等人，美國專利 號5，415，665)。通常將所述針或插管置于臍靜脈中，可以輕輕按摩胎盤以幫助將臍帶血排 出胎盤。這樣的臍帶血回收可以商業(yè)化進(jìn)行，例如LifeBank Inc. , Cedar Knolls, N. J., ViaCord,Cord BloodRegistry and CryoCell。優(yōu)選地，所述胎盤依靠重力排空而無需進(jìn)一 步處理，由此在回收臍帶血期間對組織破壞最小化。典型地，將胎盤從產(chǎn)房或分娩房轉(zhuǎn)運(yùn)到另外的地點(diǎn)(例如實(shí)驗(yàn)室)以回收臍帶血 和收集灌洗液。胎盤優(yōu)選地在無菌隔熱的轉(zhuǎn)運(yùn)裝置(將胎盤溫度保持在20-28°C之間)中 轉(zhuǎn)運(yùn)，例如將夾住近端臍帶的胎盤置于無菌自封塑料袋中，然后將其放置到絕熱容器中。在 另一實(shí)施方案中，將胎盤在基本上如美國專利號7，147，626所述的臍帶血收集試劑盒中轉(zhuǎn) 運(yùn)。優(yōu)選地，在產(chǎn)后四至二十四小時將胎盤遞送到實(shí)驗(yàn)室。在某些實(shí)施方案中，在臍帶血回 收之前，夾住近端臍帶，優(yōu)選地在插入到胎盤盤的4-5cm(厘米)以內(nèi)處夾住近端臍帶。在 其它實(shí)施方案中，在回收臍帶血之后但在進(jìn)一步處理胎盤之前，夾住近端臍帶。在收集灌洗液之前，可以將胎盤貯存在無菌條件和在室溫或5至25°C (攝氏溫 度)下。胎盤可被貯存超過四十八個小時，優(yōu)選地貯存四至二十四小時，之后灌洗胎盤以除 去任何殘留臍帶血。胎盤優(yōu)選地貯存在5°C至25°C (攝氏溫度)的抗凝血溶液中。合適的 抗凝血溶液是本領(lǐng)域所熟知的。例如，可以使用肝素或華法林鈉的溶液。在優(yōu)選實(shí)施方案 中，所述抗凝血溶液包含肝素溶液(例如，在1 1000溶液中l(wèi)%w/w)。在收集胎盤灌洗 液之前，無血胎盤優(yōu)選地貯存不超過36小時。5. 1. 3.胎盤的灌洗灌洗哺乳動物胎盤的方法公開在例如Hariri的美國專利號7，045，148和7. 255，879、以及題為“ Improved Composition for Collecting and PreservingOrgans (米 集和保存器官的改進(jìn)的組合物)，，的和美國申請公開號2007/0190042中，所述專利和專利 申請的全部內(nèi)容通過參考納入本文?？梢酝ㄟ^使灌洗溶液(例如鹽溶液、培養(yǎng)基或上述的細(xì)胞采集組合物)流經(jīng)胎盤 血管系統(tǒng)來獲得灌洗液。在一個實(shí)施方案中，通過使灌洗溶液流經(jīng)臍動脈和臍靜脈中的任 意一個或兩者來灌洗哺乳動物的胎盤?？梢岳美缦蛱ケP內(nèi)的重力流來實(shí)現(xiàn)灌洗溶液經(jīng) 過胎盤的流動。優(yōu)選地，使用泵例如蠕動泵迫使灌洗溶液經(jīng)過胎盤?？梢杂门c無菌連接裝 置(例如無菌管)連接的插管(例如TEFLON 或塑料插管)對臍靜脈插管。所述無菌連 接裝置連接灌洗歧管。在準(zhǔn)備灌洗時，優(yōu)選地以臍動脈和臍靜脈位于胎盤最高點(diǎn)的方式來定位胎盤?？?以通過使灌洗溶液流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)，或者流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)和周圍組織來灌洗胎盤。在 一個實(shí)施方案中，臍動脈和臍靜脈同時連接移液器，該移液器經(jīng)由彈性連接體連接到灌洗 溶液儲庫。灌洗溶液流入臍靜脈和臍動脈。所述灌洗溶液從血管流出和/或穿過血管壁 進(jìn)入胎盤的周圍組織，并從妊娠期間連接母親子宮的胎盤表面將其收集到合適的開放器皿 中。也可以通過臍帶開口引入灌洗溶液，并允許其從與母體子宮壁相連的胎盤壁中的開口 流出或滲濾出。在另一實(shí)施方案中，灌洗溶液流經(jīng)臍靜脈并從臍動脈收集，或其流經(jīng)臍動脈 而從臍靜脈收集，即，灌洗溶液只流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)(胎兒組織)。在一個實(shí)施方案中，例如，臍動脈和臍靜脈同時連接例如移液器，該移液器經(jīng)由彈 性連接體連接到灌洗溶液儲庫。灌洗溶液流入臍靜脈和臍動脈。所述灌洗溶液從血管流出 和/或穿過血管壁進(jìn)入胎盤的周圍組織，并從妊娠期間連接母親子宮的胎盤表面將其收集 到合適的開口器皿中。也可以通過臍帶開口引入灌洗溶液，并允許其從與母體子宮壁相連 的胎盤壁中的開口流出或滲濾出。用該方法(其可以稱為“鍋”法)收集的胎盤細(xì)胞典型 地是胎兒細(xì)胞和母體細(xì)胞的混合物。在另一實(shí)施方案中，灌洗溶液流經(jīng)臍靜脈并從臍動脈收集，或流經(jīng)臍動脈并從臍 靜脈收集。用該方法(其可以稱為“閉路”法)收集的胎盤細(xì)胞典型地幾乎僅僅是胎兒細(xì) 胞。在一個實(shí)施方案中，所述閉路灌洗法可以如下進(jìn)行。在分娩后約48小時之內(nèi)獲得 分娩后的胎盤。夾住臍帶，并在夾鉗上方切下臍帶?？梢詠G棄臍帶，或者可以處理臍帶以回 收例如臍帶干細(xì)胞，和/或處理臍帶膜以制備生物材料。在灌洗期間，可以保留羊膜，或者 例如使用手指鈍剝離將羊膜與絨毛膜分離。如果羊膜與絨毛膜在灌洗前分離，例如可以棄 去羊膜，或處理羊膜以獲得干細(xì)胞(例如通過酶消化)、或制備例如羊膜生物材料(例如在 美國申請公開號2004/0048796中描述的生物材料)。在例如使用消毒紗布清洗胎盤的所有 可見血塊和殘余血液后，暴露出臍帶血管，例如通過部分切開臍帶膜以暴露臍帶的橫截面。 例如，通過推進(jìn)封閉的鱷魚夾進(jìn)入各血管的切口末端，識別和打開血管。然后，將連接灌洗 裝置或蠕動泵的裝置(例如塑料管)插入到每個胎盤動脈中。所述泵可以是適用于所述目 的的任何泵，例如蠕動泵。然后，將連接收集儲庫(例如血袋，例如250mL的收集袋)的塑 料管插入到胎盤靜脈中。或者，將連接泵的管插入到胎盤靜脈中，并且將連接儲庫的管插入 到胎盤的一個或兩個動脈中。然后，用一定體積的灌洗溶液(例如約750ml灌洗溶液)灌 洗胎盤。接著，例如通過離心收集灌洗液中的細(xì)胞。
在一個實(shí)施方案中，在灌洗期間夾住近端臍帶，更優(yōu)選地，在臍帶插入到胎盤盤體 的4-5cm (厘米)之內(nèi)夾住臍帶。通常，在排血過程中，哺乳動物胎盤灌洗流體的第一批采集物被臍帶血和/或胎 盤血的殘留紅細(xì)胞著色。隨著灌洗的進(jìn)行以及胎盤的殘留臍帶血細(xì)胞被洗凈，所述灌洗流 體進(jìn)一步變成無色。通常，30至IOOmL的灌洗流體足以初步?jīng)_洗胎盤中的血液，但可以根據(jù) 觀察結(jié)果，使用更多或更少的灌洗流體。用于灌洗胎盤的灌洗液體的體積可以根據(jù)待收集的胎盤細(xì)胞數(shù)量、胎盤尺寸、由 單個胎盤形成的采集物的數(shù)量等變化。在各種實(shí)施方案中，灌洗液體的體積可以為50mL 至 5000mL、50mL 至 4000mL、50mL 至 3000mL、IOOmL 至 2000mL、250mL 至 2000mL、500mL 至 2000mL、或750mL至2000mL。典型地，在排血后，用700-800mL的灌洗液體灌洗胎盤。可以在幾個小時或幾天期間，多次灌洗胎盤。當(dāng)灌洗胎盤多次時，可將胎盤置于 容器或其它合適的器皿中，在無菌條件下保持或培養(yǎng)，并用細(xì)胞采集組合物或標(biāo)準(zhǔn)灌洗溶 液灌洗(例如，生理鹽水溶液例如磷酸鹽緩沖鹽水(“PBS”)，其含有或不含抗凝血劑(例 如肝素、華法林鈉、香豆素、雙香豆素)，和/或含有或不含抗微生物劑(例如β-巰基乙醇 (0. ImM)；抗生素例如鏈霉素(例如40-100 μ g/ml)、青霉素(例如40U/ml)、兩性霉素B (例 如0. 5μ g/ml))。在一個實(shí)施方案中，將分離的胎盤保持或培養(yǎng)一段時間而不收集灌洗液， 因此在灌洗和收集灌洗液之前，保持或培養(yǎng)胎盤1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23或24小時、或2或3或更多天?？梢砸淮位蚋啻蔚乇３纸?jīng)灌 洗的胎盤例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 更多個小時，并用例如700-800mL的灌洗液體再次灌洗。可以灌洗胎盤1、2、3、4、5或更多 次，例如每1、2、3、4、5或6個小時一次。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重復(fù)灌洗胎盤和收集灌洗溶 液(例如胎盤細(xì)胞采集組合物)，直到回收的有核細(xì)胞數(shù)量低于100個細(xì)胞/ml?？梢赃M(jìn)一 步分別處理不同時間點(diǎn)的灌洗液，以回收時間依賴性細(xì)胞群，例如所有有核細(xì)胞。也可以匯 總不同時間點(diǎn)的灌洗液。5. 1. 4.胎盤灌洗液和胎盤灌洗液細(xì)胞胎盤灌洗液保包含細(xì)胞的異源采集物。典型地，在使用之前，去除胎盤灌洗液中的 紅細(xì)胞。這樣的去除可以通過分離紅細(xì)胞與有核血細(xì)胞的已知方法進(jìn)行。在某些實(shí)施方案 中，冷凍保存灌洗液或灌洗液細(xì)胞。在某些其它實(shí)施方案中，胎盤灌洗液或灌洗液細(xì)胞僅包 含胎兒細(xì)胞或包含胎兒細(xì)胞和母體細(xì)胞的組合。典型地，來自單次胎盤灌洗的胎盤灌洗液包含約1億至約5億個有核細(xì)胞。在某 些實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液或灌洗液細(xì)胞包含CD34+細(xì)胞，例如造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。 在更具體的實(shí)施方案中，這些細(xì)胞可以包含⑶34+CD45_干細(xì)胞或祖細(xì)胞、⑶34+⑶45+干細(xì) 胞或祖細(xì)胞、骨髓祖細(xì)胞、淋巴祖細(xì)胞和/或紅系祖細(xì)胞。在其它的實(shí)施方案中，胎盤灌洗 液和胎盤灌洗液細(xì)胞包含粘附性胎盤干細(xì)胞，例如CD34—干細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，所述 胎盤灌洗液和胎盤灌洗液細(xì)胞包含例如內(nèi)皮祖細(xì)胞、骨祖細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。在某些實(shí) 施方案中，從胎盤收集并去除紅細(xì)胞的胎盤灌洗液，或從這樣的灌洗液分離的灌洗液細(xì)胞， 包含約6-7%的自然殺傷細(xì)胞(⑶3_、⑶56+)；約21-22%的T細(xì)胞(⑶3+)；約6_7%的B細(xì) 胞(CD19+)；約1-2%的內(nèi)皮祖細(xì)胞(CD34+、CD31+)；約2_3%的神經(jīng)祖細(xì)胞(巢蛋白+)；約 2-5%的造血祖細(xì)胞(CD34.)；和約0. 5-1. 5%的粘附性胎盤干細(xì)胞(例如CD34—、CD117—、⑶105+和⑶44+)，如通過流式細(xì)胞術(shù)，例如通過FACS分析所測定的。5. 2.破壞和消化胎盤組織以獲得PINK細(xì)胞胎盤自然殺傷細(xì)胞(例如PINK細(xì)胞)可以從已經(jīng)機(jī)械破壞和/或酶破壞的胎盤 組織獲得?？梢允褂靡环N或多種組織降解酶(例如金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、 RNase或DNase等)破壞胎盤組織。這樣的酶包括但不限于膠原酶(例如膠原酶I、II、 III或IV，來自溶組織梭菌的膠原酶等)、分散酶、嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、胰蛋白酶、 LIBERASE、透明質(zhì)酸酶等。典型地，在消化后，使消化的組織穿過濾網(wǎng)或?yàn)V器以除去部分消 化的細(xì)胞簇，留下基本上單細(xì)胞的懸浮液。在獲得胎盤細(xì)胞的懸浮液后，可以使用例如針對⑶3和⑶56的抗體分離自然殺傷 細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，通過如下方法分離胎盤自然殺傷細(xì)胞選擇CD56+細(xì)胞以形成第 一細(xì)胞群；將所述第一細(xì)胞群與CD3和/或CD16特異性抗體接觸；從所述第一細(xì)胞群中除 去⑶3+或⑶56+細(xì)胞，由此形成第二細(xì)胞群，其基本上是⑶56+和⑶3 ⑶56+和⑶16 或 CD56\ CD3"和 CD16-細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，使用磁珠從胎盤細(xì)胞的懸浮液中分離胎盤自然殺傷細(xì)胞。所 述細(xì)胞可以使用例如磁性激活細(xì)胞分類(MACS)技術(shù)來分離，該技術(shù)是基于顆粒結(jié)合磁珠 (例如約0. 5-lOOym直徑)的能力分離顆粒的方法，所述磁珠包含一種或多種特定抗體，例 如抗-CD56抗體。對所述磁性微球可以進(jìn)行多種有用的修飾，包括共價添加特異性識別特 定的細(xì)胞表面分子或半抗原的抗體。然后，將所述珠與細(xì)胞混合以允許結(jié)合。然后，使細(xì)胞 經(jīng)過磁場以分離出具有特定細(xì)胞表面標(biāo)記物的細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，隨后可以分離這 些細(xì)胞，并將其與偶聯(lián)了針對另一種細(xì)胞表面標(biāo)記物的抗體的磁珠再混合。將所述細(xì)胞再 次經(jīng)過磁場，分離同時結(jié)合兩種抗體的細(xì)胞。隨后，可以將這些細(xì)胞稀釋到單獨(dú)的皿中，例 如用于克隆分離的微量滴定皿。5. 3.胎盤自然殺傷細(xì)胞在一方面，本發(fā)明提供了可從胎盤(例如從胎盤灌洗液、和/或經(jīng)機(jī)械破壞和/或 酶破壞的胎盤組織)獲得的自然殺傷細(xì)胞以及包含這樣的自然殺傷細(xì)胞的組合物的分離、 表征和用途。在具體實(shí)施方案中，所述胎盤自然殺傷細(xì)胞為“胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞”或 “PINK”細(xì)胞，其被表征為⑶56+⑶16—，即呈現(xiàn)⑶56細(xì)胞標(biāo)記物且缺乏⑶16細(xì)胞標(biāo)記物，例 如，如上所述通過流式細(xì)胞術(shù)，例如使用抗CD16和CD56的抗體的熒光激活細(xì)胞分類術(shù)所測 定的。因而，本發(fā)明提供了分離的PINK細(xì)胞和分離的眾多PINK細(xì)胞。本發(fā)明還提供了分 離的眾多細(xì)胞，其包含⑶56+CD16—PINK細(xì)胞與⑶56+⑶16+自然殺傷細(xì)胞的組合。在更具體 實(shí)施方案中，所述CD56+CD16+自然殺傷細(xì)胞可以從胎盤、或另一來源(例如外周血液、臍帶 血、骨髓等)中分離。因而，在各種其它實(shí)施方案中，PINK細(xì)胞可以與CD56+CD16+自然殺傷 細(xì)胞例如以約 1 10、2 9、3 8、4 7 、5 6、6 5、7 4、8 3、9 2、1 10、 1 9、1 8、1 7、1 6、1 5、1 4、1 3、1 2、1 1、2 1、3 1、4 1、5 1、 6 1、7 1、8 1或約9 1的比例混合。本文使用的“分離的”指所述細(xì)胞以從其正常 環(huán)境例如胎盤中移出。在某些實(shí)施方案中，所述PINK細(xì)胞是⑶3_。在其它實(shí)施方案中，所述PINK細(xì)胞不呈現(xiàn)完全成熟的自然殺傷細(xì)胞所呈現(xiàn)的一種或多種細(xì)胞標(biāo)記物(例如CD16)，或者相對于完全成熟的自然殺傷細(xì)胞以可檢測的更低 的水平呈現(xiàn)這樣的一種或多種標(biāo)記物，或者呈現(xiàn)出與自然殺傷細(xì)胞前體相關(guān)但與完全成熟 的自然殺傷細(xì)胞無關(guān)的一種或多種細(xì)胞標(biāo)記物。在具體實(shí)施方案中，與完全成熟的NK細(xì)胞 相比，本文提供的PINK細(xì)胞以可檢測的更低的水平表達(dá)NKG2D、⑶94和/或NKp46。在另 一具體實(shí)施方案中，本文提供的眾多PINK細(xì)胞與等量的完全成熟的NK細(xì)胞相比以可檢測 的更低的水平表達(dá)全部NKG2D、⑶94和/或NKp46。在某些實(shí)施方案中，與外周血液自然殺傷細(xì)胞相比，PINK細(xì)胞以可檢測的更 高的水平表達(dá)以下一種或多種微小RNA :hsa-miR-100、hsa-miR-127、hsa-miR-211、 hsa_miR-302c、 hsa-miR-326、 hsa-miR-337、 hsa-miR-497、 hsa-miR-512_3p、 hsa-miR-515_5p、hsa_miR-517b、hsa_miR-517c、hsa-miR-518a> hsa_miR-518e、 hsa_miR-519d、hsa_miR-520g、hsa_miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618 禾口 / 或 hsa-miR-99a。在某些實(shí)施方案中，所述胎盤自然殺傷細(xì)胞(例如PINK細(xì)胞)已在培養(yǎng)基中擴(kuò) 增。在某些其它實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液細(xì)胞已在培養(yǎng)基中擴(kuò)增。在具體實(shí)施方案中， 所述胎盤灌洗液細(xì)胞已在滋養(yǎng)層的存在下和/或在至少一種細(xì)胞因子的存在下擴(kuò)增。在更 具體的實(shí)施方案中，所述滋養(yǎng)層包含K562細(xì)胞或外周血液單核細(xì)胞。在另一更具體的實(shí)施 方案中，所述至少一種細(xì)胞因子為白細(xì)胞介素_2。在另一實(shí)施方案中，本文提供了分離的眾多PINK細(xì)胞(例如細(xì)胞群)。在另一具體 實(shí)施方案中，通過從胎盤灌洗液中用CD56-微珠分離細(xì)胞生成分離的細(xì)胞群。在各種具體 實(shí)施方案中，所述群包含至少約 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 98%或至少約99%的PINK細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，眾多PINK細(xì)胞包含沒有經(jīng)過擴(kuò)增的 PINK細(xì)胞，或由其組成；例如，從胎盤灌洗液收集的。在另一實(shí)施方案中，眾多PINK細(xì)胞包 含經(jīng)過擴(kuò)增的PINK細(xì)胞，或由其組成。擴(kuò)增自然殺傷細(xì)胞的方法描述在例如Ohno等人的 美國專利申請公開號2003/0157713中；也可參見Yssel等人，J. Immunol. Methods 72(1) 219-227(1984)和 Litwin 等人，J. Exp. Med. 178(4) 1321-1326 (1993)，以及在下述實(shí)施例 1中對自然殺傷細(xì)胞擴(kuò)增的描述。在其它實(shí)施方案中，所述分離的眾多PINK細(xì)胞不呈現(xiàn)完全成熟的自然殺傷細(xì)胞 所呈現(xiàn)的一種或多種細(xì)胞標(biāo)記物(例如CD16)，或者相對于完全成熟的自然殺傷細(xì)胞以可 檢測的更低的水平呈現(xiàn)這樣的一種或多種標(biāo)記物，或者呈現(xiàn)出與自然殺傷細(xì)胞前體相關(guān)但 與完全成熟的自然殺傷細(xì)胞無關(guān)的一種或多種細(xì)胞標(biāo)記物。在具體實(shí)施方案中，與完全成 熟的NK細(xì)胞相比，本文提供的PINK細(xì)胞以可檢測的更低的水平表達(dá)NKG2D、CD94和/或 NKp46。在另一具體實(shí)施方案中，本文提供的眾多PINK細(xì)胞與等量的完全成熟的NK細(xì)胞相 比以可檢測的更低的水平表達(dá)全部NKG2D、⑶94和/或NKp46。在某些實(shí)施方案中，與外周血液自然殺傷細(xì)胞相比，PINK細(xì)胞群以可檢測的 更高的水平表達(dá)以下一種或多種微小RNA :hsa-miR-100、hsa-miR-127、hsa-miR-211、 hsa_miR-302c、 hsa-miR-326、 hsa-miR-337、 hsa-miR-497、 hsa-miR-512_3p、 hsa-miR-515_5p、hsa_miR-517b、hsa-miR-517c、hsa-miR-518a、hsa-miR-518e、 hsa_miR-519d、hsa_miR-520g、hsa_miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618 禾口 /或hSa-miR-99a。在另一具體實(shí)施方案中，與等量的外周血液自然殺傷細(xì)胞相比，PINK細(xì)胞群表達(dá)可檢測的更高量的粒酶B。在其它實(shí)施方案中，本文提供的PINK細(xì)胞已在培養(yǎng)基中擴(kuò)增。在具體實(shí)施方案 中，PINK細(xì)胞已經(jīng)過培養(yǎng)(例如在培養(yǎng)基中擴(kuò)增)至少、大約、或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27 或 28 天。在具體實(shí)施方案 中，所述PINK細(xì)胞培養(yǎng)了約21天。在另一實(shí)施方案中，本文提供了一種包含PINK細(xì)胞的分離的細(xì)胞群，例如胎盤細(xì) 胞群。在具體實(shí)施方案中，所述分離的細(xì)胞群為來自胎盤灌洗液的所有有核細(xì)胞(例如胎 盤灌洗液細(xì)胞)，其包含自體的、分離的PINK細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群是 通過從胎盤灌洗液中使用CD56-微珠分離細(xì)胞而生成的分離的細(xì)胞群。在各種具體實(shí)施方 案中，所述群包含至少約 50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%^； 至少約99%的PINK細(xì)胞。因?yàn)榉置浜蟮奶ケP包含來自胎兒和來自母親的組織和細(xì)胞，根據(jù)收集的方法，胎 盤灌洗液可以僅包含胎兒細(xì)胞，或基本上主要包含胎兒細(xì)胞(例如大于約90%、95%、98% 或99% )，或者可以包含胎兒細(xì)胞和母體細(xì)胞的混合物(例如，胎兒細(xì)胞包含少于約90%、 80%、70%、60%、或50%的灌洗液的所有有核細(xì)胞)。在一個實(shí)施方案中，所述PINK細(xì)胞 僅源自胎兒胎盤細(xì)胞，例如閉路灌洗胎盤獲得的細(xì)胞(見上)，其中所述灌洗產(chǎn)生包含基本 上大多數(shù)或僅包含胎兒胎盤細(xì)胞的灌洗液。在另一實(shí)施方案中，所述PINK細(xì)胞源于胎兒細(xì) 胞和母體細(xì)胞，例如通過所述鍋法(見上)灌洗獲得的細(xì)胞，其中所述灌洗產(chǎn)生包含胎兒和 母體胎盤細(xì)胞混合物的灌洗液。因而，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了來自胎盤的中間體 自然殺傷細(xì)胞群，其中基本上大多數(shù)具有胎兒基因型。在另一實(shí)施方案中，本文提供了來自 胎盤的中間體自然殺傷細(xì)胞群，其包含具有胎兒基因型的自然殺傷細(xì)胞和具有母親表型的 自然殺傷細(xì)胞。本文還提供了來自胎盤的中間體自然殺傷細(xì)胞群，其包含來自非胎盤來源的自然 殺傷細(xì)胞。例如，在一個實(shí)施方案中，本文提供了 PINK細(xì)胞群，其還包含來自臍帶血、外周 血液、骨髓或前述兩種或多種組合的自然殺傷細(xì)胞。包含PINK細(xì)胞和來自非胎盤來源的 自然殺傷細(xì)胞的自然殺傷細(xì)胞群可以包含例如如下比例的細(xì)胞約1 10、2 9、3 8、 4 7 、5 6、6 5、7 4、8 3、9 2、10 1、1 9、1 8、1 7、1 6、1 5、 1 4、1 3、1 2、1 1、2 1、3 1、4 1、5 1、6 1、7 1、8 1、9 1,100 1、 95 5、90 10,85 15,80 20,75 25,70 30,65 35,60 40,55 45:50 50、 45 55,40 60,35 65,30 70,25 75,20 80,15 85,10 90、5 95,100 1、 95 1、90 1、85 1、80 1、75 1、70 1、65 1、60 1、55 1、50 1、45 1、 40 1、35 1、30 1、25 1、20 1、15 1、10 1、5 1、1 1、1 5、1 10、1 15、 1 20、1 25、1 30、1 35、1 40、1 45、1 50、1 55、1 60、1 65、1 70、 1 75、1 80,1 85、1 90,1 95 或約 1 100 等。本發(fā)明進(jìn)一步提供了臍帶血和分離的PINK細(xì)胞的組合。在各種實(shí)施方案中，臍 帶血與PINK細(xì)胞的混合比例為每毫升臍帶血約1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、 5X 106、1X 107、5X 107、1X 108、或 5X 108 或更多個 PINK 細(xì)胞。本發(fā)明還提供分離PINK細(xì)胞的方法。在一個實(shí)施方案中，通過如下方法收集 PINK細(xì)胞獲得胎盤灌洗液，然后將所述胎盤灌洗液與特異性結(jié)合CD56+細(xì)胞的組分例如抗⑶56的抗體接觸，之后基于所述結(jié)合分離⑶56+細(xì)胞，形成⑶56+細(xì)胞群。所述⑶56+細(xì) 胞群包含分離的自然殺傷細(xì)胞群。在具體實(shí)施方案中，將CD56+細(xì)胞與特異性結(jié)合CD16+細(xì) 胞的組分例如抗CD16的抗體，并從CD56+細(xì)胞群中排除CD16+細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案 中，還從所述⑶56+細(xì)胞群中排除了⑶3+細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，從胎盤灌洗液如下獲得PINK細(xì)胞。將分娩后的人胎盤排血， 并例如用約200-800mL的灌洗溶液僅灌洗流過胎盤血管系統(tǒng)。在具體實(shí)施方案中，在所述 灌洗之前，去除所述胎盤的臍帶血，并例如用灌洗溶液沖洗胎盤血管系統(tǒng)除去殘余血液。收 集灌洗液，并且處理除去任何殘留的紅細(xì)胞。在灌洗液的所有有核細(xì)胞中的自然殺傷細(xì)胞 可以基于⑶56和⑶16的表達(dá)來分離。在某些實(shí)施方案中，PINK細(xì)胞的分離包括使用針對 CD56的抗體分離，其中分離的細(xì)胞為CD56+。在另一實(shí)施方案中，PINK細(xì)胞的分離包括使用 針對CD16的抗體分離，其中分離的細(xì)胞為CD16_。在另一實(shí)施方案中，PINK細(xì)胞的分離包 括使用針對CD56的抗體分離，并且使用針對CD16的抗體排除眾多非-PINK細(xì)胞，其中分離 的細(xì)胞包含⑶56+、⑶16_細(xì)胞。細(xì)胞分離可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來實(shí)現(xiàn)，例如熒光激活細(xì)胞分類術(shù) (FACS)，或者優(yōu)選地使用偶聯(lián)特定抗體的微珠的磁性細(xì)胞分類術(shù)?？梢允褂美鏏UT0MACS Separator(Miltenyi)進(jìn)行磁性細(xì)胞分離和并實(shí)現(xiàn)自動化。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離胎盤自然殺傷細(xì)胞的方法，該方法包括獲得 眾多胎盤細(xì)胞，從所述眾多胎盤細(xì)胞中分離自然殺傷細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述胎盤細(xì) 胞是或包含胎盤灌洗液細(xì)胞，例如來自胎盤灌洗液的所有有核細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案 中，所述眾多胎盤細(xì)胞是或包含通過機(jī)械消化和/或酶消化胎盤組織獲得的胎盤細(xì)胞。在 另一實(shí)施方案中，使用一種或多種抗體進(jìn)行所述分離。在更具體的實(shí)施方案中，所述一種或 多種抗體包含一種或多種針對CD3、CD16或CD56的抗體。在更具體的實(shí)施方案中，所述分離 包括在所述眾多胎盤細(xì)胞中將CD56+細(xì)胞與CD56_細(xì)胞分離。在更具體的實(shí)施方案中，所述 分離包括將⑶56+、⑶16—胎盤細(xì)胞，例如胎盤自然殺傷細(xì)胞(例如PINK細(xì)胞)，與⑶56—或 ⑶16+胎盤細(xì)胞分離。在更具體的實(shí)施方案中，所述分離包括將⑶56+、⑶16_、⑶3_胎盤細(xì)胞 與CD56+、CD16+或CD3+胎盤細(xì)胞分離。在另一實(shí)施方案中，所述分離胎盤自然殺傷細(xì)胞的 方法生成的胎盤細(xì)胞群中至少 50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%, 98%或至少99%的細(xì)胞是⑶56+、⑶16—自然殺傷細(xì)胞。
_5] 5. 4.來j匹配』射Il洗液禾Π臍帶血的胎盤自然殺傷細(xì)朐,本發(fā)明進(jìn)一步提供了從匹配單元的胎盤灌洗液和臍帶血的組合獲得的和可獲得 的自然殺傷細(xì)胞，本文稱為混合的自然殺傷細(xì)胞。本文使用的“匹配單元”表示，NK細(xì)胞從 胎盤灌洗液細(xì)胞和臍帶血細(xì)胞獲得，其中所述臍帶血細(xì)胞從胎盤的臍帶血獲得，所述胎盤 灌洗液也獲自所述胎盤，即所述胎盤灌洗液細(xì)胞和臍帶血細(xì)胞以及從其中各自得到的自然 殺傷細(xì)胞都來自相同的個體。在某些實(shí)施方案中，混合的胎盤殺傷細(xì)胞僅包含、或基本上僅包含CD56+和 CD16_的自然殺傷細(xì)胞。在某些其它實(shí)施方案中，混合的胎盤殺傷細(xì)胞包含CD56+和CD16_的 NK細(xì)胞以及CD56+和CD16+的NK細(xì)胞。在某些具體實(shí)施方案中，所述混合的胎盤殺傷細(xì)胞包 含至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 99. 5% 的 CD56+CD16-自 然殺傷細(xì)胞(PINK細(xì)胞)。
在一個實(shí)施方案中，所述混合的自然殺傷細(xì)胞未經(jīng)培養(yǎng)。在具體實(shí)施方案中，與來 自外周血液的等量自然殺傷細(xì)胞相比，所述混合的自然殺傷細(xì)胞包含可檢測的更高數(shù)量的 CD3—CD56+CD16-自然殺傷細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷 細(xì)胞相比，所述混合的自然殺傷細(xì)胞包含可檢測的更低數(shù)量的CD3_CD56+CD16_自然殺傷細(xì) 胞。在另一具體實(shí)施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細(xì)胞相比，所述混合的自然殺 傷細(xì)胞包含可檢測的更高數(shù)量的⑶3TD56+KIR2DL2/L3+自然殺傷細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方 案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細(xì)胞相比，所述混合的自然殺傷細(xì)胞包含可檢測的 更低數(shù)量的CD3_CD56+NKp46+自然殺傷細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，與來自外周血液的等 量自然殺傷細(xì)胞相比，所述混合的自然殺傷細(xì)胞包含可檢測的更低數(shù)量的CD3_CD56+NKp30+ 自然殺傷細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細(xì)胞相比，所述混 合的自然殺傷細(xì)胞包含可檢測的更低數(shù)量的CD3_CD56+2B4+自然殺傷細(xì)胞。在另一具體實(shí) 施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細(xì)胞相比，所述混合的自然殺傷細(xì)胞包含可檢 測的更低數(shù)量的⑶3TD56+⑶94+自然殺傷細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述混合的自然殺傷細(xì)胞已經(jīng)培養(yǎng)例如21天。在具體實(shí)施方 案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細(xì)胞相比，所述混合的自然殺傷細(xì)胞包含可檢測的 更低數(shù)量的⑶3TD56+KIR2DL2/L3+自然殺傷細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述混合的自 然殺傷細(xì)胞未經(jīng)培養(yǎng)。在另一具體實(shí)施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細(xì)胞相比， 所述混合的自然殺傷細(xì)胞包含可檢測的更高數(shù)量的CD3_CD56+NKp44+自然殺傷細(xì)胞。在具 體實(shí)施方案中，與來自外周血液的等量自然殺傷細(xì)胞相比，所述混合的自然殺傷細(xì)胞包含 可檢測的更高數(shù)量的⑶3TD56+NKp30+自然殺傷細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，與等量的外周血液自然殺傷細(xì)胞相比，所述混合的自然殺傷 細(xì)胞表達(dá)可檢測的更高量的粒酶B。本發(fā)明進(jìn)一步提供了臍帶血和混合的自然殺傷細(xì)胞的組合。在各種實(shí)施方案 中，臍帶血與混合的自然殺傷細(xì)胞的混合比例為每毫升臍帶血約1X104、5X104、1X105、 5 X 105、1 X 106、5 X 106、1 X 107、5 X 107、1 X 108、5 X 108 個混合的自然殺傷細(xì)胞。5. 5.灌洗液/細(xì)胞組合除了胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞和胎盤自然殺傷細(xì)胞 (例如胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞)之外，本發(fā)明還提供了包含所述灌洗液或細(xì)胞的組合物， 其用于抑制腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞的增殖。5.5. 1.胎盤灌洗液、灌洗液細(xì)胞和來自胎盤的中間體自然殺傷細(xì)胞的組合本發(fā)明進(jìn)一步提供了組合物，其包含在以上5. 1,5. 3或5. 4部分中描述的胎盤灌 洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞、胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞和/或混合的自然殺傷細(xì)胞的組合。在一 個實(shí)施方案中，例如，本發(fā)明提供了一定體積的胎盤灌洗液，其中補(bǔ)充了眾多胎盤灌洗液細(xì) 胞和/或眾多胎盤自然殺傷細(xì)胞，例如從胎盤灌洗液細(xì)胞、或經(jīng)機(jī)械破壞或酶破壞的胎盤 組織獲得的胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，例如每毫升胎盤灌洗液補(bǔ)充了 約1\104、5\104、1\105、5\105、1\106、5\106、1\107、5\107、1\108、5\108或更多個胎 盤灌洗液細(xì)胞、胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞和/或混合的自然殺傷細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中， 眾多胎盤灌洗液細(xì)胞補(bǔ)充了胎盤灌洗液、胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞和/或混合的自然殺傷 細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，眾多胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞補(bǔ)充了胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞和/或混合的自然殺傷細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)灌洗液被用于補(bǔ)充時，灌洗液的體 積是、大于或少于細(xì)胞(溶液中)加灌洗液總體積的約50%、45%、40%、35%、30%、25%、 20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%或1%。在某些其它實(shí)施方案中，當(dāng)胎盤灌洗液細(xì)胞與 眾多PINK細(xì)胞和/或混合的自然殺傷細(xì)胞混合時，所述胎盤灌洗液細(xì)胞通常包含大約、 大于約或小于約 50%,45%,40%,35%,30%,25%,20%,15%,10%,8%,6%,4%,2%^； 的細(xì)胞總數(shù)。在某些其它實(shí)施方案中，當(dāng)PINK細(xì)胞與眾多胎盤灌洗液細(xì)胞和/或混合 的自然殺傷細(xì)胞混合時，所述PINK細(xì)胞通常包含大約、大于約或小于約50%、45%、40%、 35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%或的細(xì)胞總數(shù)。在某些其它實(shí)施 方案中，當(dāng)混合的自然殺傷細(xì)胞與PINK細(xì)胞和/或胎盤灌洗液細(xì)胞混合時，所述混合的自 然殺傷細(xì)胞通常包含大約、大于約或小于約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、 10%、8%、6%、4%、2%或的細(xì)胞總數(shù)。在某些其它實(shí)施方案中，當(dāng)PINK細(xì)胞、混合的 自然殺傷細(xì)胞或胎盤灌洗液細(xì)胞被用于補(bǔ)充胎盤灌洗液時，其中懸浮了細(xì)胞的溶液(例如 鹽溶液、培養(yǎng)基等)的體積包含灌洗液加細(xì)胞總體積的大約、大于約、或小于約50%、45%、 40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%或 1%，其中在補(bǔ)充前，PINK 細(xì) 胞以每毫升約 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108 或更多個細(xì)胞懸浮。在其它實(shí)施方案中，任一上述組合都隨后與臍帶血或來自臍帶血的有核細(xì)胞混
口 o本發(fā)明進(jìn)一步提供了匯總的胎盤灌洗液，其從兩種或多種來源(例如兩個或多個 胎盤)獲得，并混合(例如匯總)。這樣的匯總的灌洗液可以包含大約等體積的來自各來源 的灌洗液，或可以包含不同體積的來自各來源的灌洗液。來自各來源的相對體積可以隨機(jī) 地選擇，或可基于例如一種或多種細(xì)胞因素(例如細(xì)胞因子、生長因子、激素等)的濃度或 數(shù)量、來自各來源的灌洗液中胎盤細(xì)胞的數(shù)量、或來自各來源的灌洗液的其它特征選擇。來 自相同胎盤的多次灌洗的灌洗液可以類似地匯總。類似地，本發(fā)明提供了胎盤灌洗液細(xì)胞和來自胎盤的中間體自然殺傷細(xì)胞，其從 兩個或多個來源(例如兩個或多個胎盤)獲得并匯總。這樣的匯總的細(xì)胞可以包含大約等 量的來自兩個或多個來源的細(xì)胞，或不同數(shù)量的來自一個或多個匯總來源的細(xì)胞。來自各 來源的細(xì)胞的相對量可以基于例如待匯總的細(xì)胞中一種或多種特定細(xì)胞類型的數(shù)量，例如 CD34+細(xì)胞的數(shù)量、CD56+細(xì)胞的數(shù)量等來選擇。匯總庫(Pool)可包含例如補(bǔ)充了胎盤灌洗液細(xì)胞的胎盤灌洗液；補(bǔ)充了來自胎 盤的中間體自然殺傷(PINK)細(xì)胞的胎盤灌洗液；同時補(bǔ)充了胎盤灌洗液細(xì)胞和PINK細(xì)胞 的胎盤灌洗液；補(bǔ)充了胎盤灌洗液的胎盤灌洗液細(xì)胞；補(bǔ)充了 PINK細(xì)胞的胎盤灌洗液細(xì) 胞；同時補(bǔ)充了胎盤灌洗液和PINK細(xì)胞的胎盤灌洗液細(xì)胞；補(bǔ)充了胎盤灌洗液的PINK細(xì) 胞；補(bǔ)充了胎盤灌洗液細(xì)胞的PINK細(xì)胞；或同時補(bǔ)充了胎盤灌洗液細(xì)胞和胎盤灌洗液的 PINK細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞和胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞， 及其匯總庫或其組合，已經(jīng)對其進(jìn)行了測試以確定從例如給定量的胎盤灌洗液或PINK細(xì) 胞或給定體積的灌洗液預(yù)期可產(chǎn)生的腫瘤抑制(即效力)的程度或量。例如，在所述腫瘤 細(xì)胞將增殖的條件下，將已知數(shù)量的腫瘤細(xì)胞與等分試樣或樣本量的細(xì)胞接觸，并且將胎
22盤灌洗液、灌洗液細(xì)胞、胎盤自然殺傷細(xì)胞或其組合存在時腫瘤細(xì)胞隨時間(例如1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10周，或更長時間)的增殖速率與在不存在灌洗液、灌洗液細(xì)胞、胎盤自然 殺傷細(xì)胞或其組合時等量腫瘤細(xì)胞的增殖速率進(jìn)行比較。胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞和/ 或PINK細(xì)胞，或其組合或匯總庫的效力可以表示為例如以約10%、15%、20%、25%、30%、 35%,40%,45%,50%等抑制腫瘤細(xì)胞生長所需的細(xì)胞數(shù)量或溶液體積。在某些 實(shí)施方案中，胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞和PINK細(xì)胞作為藥物級可施用 單位提供。這樣的單位可以以離散的體積提供，例如1 OOmL、150mL、200mL、250mL、300mL、 350mL、400mL、450mL、500mL等。也可以提供這樣的單位使得其包含規(guī)定量的例如胎盤灌 洗液細(xì)胞、胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞或兩者，例如1 X 104、5X 104、1 X IO5,5X IO5,1 X 106、 5 X IO6UX IO7,5 X IO7UX IO8,5 X IO8 或更多個細(xì)胞 / 毫升，或 1 X 104、5 X 104、1 X 105、 5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、5X109、1X1010、5X1010、 1 X IO11或更多個細(xì)胞/單位?？梢蕴峁┻@樣的單位以包含規(guī)定量的胎盤灌洗液、胎盤灌洗 液細(xì)胞和/或PINK細(xì)胞中的任何兩種或所有三種。在胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞和/或PINK細(xì)胞的上述組合中，胎盤灌洗液、胎盤 灌洗液細(xì)胞和/或PINK細(xì)胞中的任一種、任兩種或所有三種可以是接受者自體的(即，從 接受者獲得)、或與接受者同源的(即，從除所述接受者之外的至少一個其它個體獲得)。PINK細(xì)胞、胎盤灌洗液細(xì)胞和/或胎盤灌洗液的任何上述組合或匯總庫可以包 含來自例如胎盤灌洗液、外周血液、臍帶血、骨髓等的CD56+CD16+自然殺傷細(xì)胞。在具體 實(shí)施方案中，所述組合包含大約、至少約、或至多約1 X 104、5X 104、1 X 105、5X 105、1 X 106、 5X 106、1X 107、5X 107、1X 108、5X IO8或更多個這樣的自然殺傷細(xì)胞/毫升，或者IX 104、 5 X IO4UX IO5,5 X IO5UX IO6,5 X IO6UX IO7,5 X IO7UX IO8,5 X IO8UX 10\5 X 10\ 1 X 101(l、5 X IO10,1 X IO11或更多個細(xì)胞/單位?？梢允褂脧淖匀粊碓捶蛛x的所述⑶56+⑶16+ 自然殺傷細(xì)胞，或者可以在擴(kuò)增所述CD56+CD16+自然殺傷細(xì)胞之后將其包含在一種上述組 合或匯總庫中。所述CD56+CD16+NK細(xì)胞可以是自體的(即，從與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì) 胞和/或PINK細(xì)胞相同的個體獲得的；或者從接受者獲得的)或同源的(即，來源于與胎 盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞和/或PINK細(xì)胞不同的個體；或者來源于非接受者的個體)。優(yōu)選地，標(biāo)記每個單位以說明細(xì)胞體積、數(shù)量，細(xì)胞類型，該單位是否已富集了特 定類型的細(xì)胞，和/或該單位中給定數(shù)量的細(xì)胞的效力，或?qū)μ囟愋偷哪[瘤細(xì)胞的增殖 產(chǎn)生可測量抑制的所述單位的給定毫升數(shù)。本發(fā)明還提供了僅包含胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞、或包含胎盤中間體自然殺傷細(xì) 胞與胎盤灌洗液細(xì)胞和/或胎盤灌洗液組合的組合物。因而，在另一方面，本發(fā)明提供了包 含分離的CD56+、CD16—自然殺傷細(xì)胞的組合物，其中所述自然殺傷細(xì)胞從胎盤灌洗液分離， 且其中所述自然殺傷細(xì)胞包含至少50%的所述組合物中的細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述 自然殺傷細(xì)胞包含至少80%的所述組合物中的細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述組合物 包含分離的⑶56+、⑶16+自然殺傷細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述⑶56+、⑶16+自然殺 傷細(xì)胞與所述CD56+、CD16_自然殺傷細(xì)胞來自不同的個體。在另一具體實(shí)施方案中，所述自 然殺傷細(xì)胞來自單個單體。在更具體的實(shí)施方案中，所述分離的自然殺傷細(xì)胞包含來自至 少兩個不同個體的自然殺傷細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述組合物包含分離的胎盤灌 洗液。在更具體的實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液與所述自然殺傷細(xì)胞來自相同的個體。在另一更具體的實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液包含的胎盤灌洗液與所述自然殺傷細(xì)胞來自不 同個體。在另一具體實(shí)施方案中，所述組合物包含胎盤灌洗液細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案 中，所述胎盤灌洗液細(xì)胞與所述自然殺傷細(xì)胞來自相同的個體。在另一更具體的實(shí)施方案 中，所述胎盤灌洗液細(xì)胞與所述自然殺傷細(xì)胞來自不同的個體。在另一具體實(shí)施方案中，所 述組合物還包含分離的胎盤灌洗液和分離的胎盤灌洗液細(xì)胞，其中所述分離的灌洗液和所 述分離的胎盤灌洗液細(xì)胞來自不同的個體。在包含胎盤灌洗液的任一上述實(shí)施方案的另一 更具體的實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液包含來自至少兩個個體的胎盤灌洗液。在包含胎盤 灌洗液細(xì)胞的任一上述實(shí)施方案的另一更具體的實(shí)施方案中，所述分離的胎盤灌洗液細(xì)胞 來自至少兩個個體。5.5.2.包含粘附件胎盤干細(xì)胞的組合物在其它實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液、眾多胎盤灌洗液細(xì)胞和/或眾多PINK細(xì)胞 或任意前述的組合或匯總庫補(bǔ)充了粘附性胎盤干細(xì)胞。這樣的干細(xì)胞描述在例如Hariri 的美國專利號7，045，148和7，255，879中。粘附性胎盤干細(xì)胞不是滋養(yǎng)細(xì)胞。所述胎盤灌洗液、眾多胎盤灌洗液細(xì)胞和/或眾多PINK細(xì)胞、或任意前述的組 合或匯總庫可以補(bǔ)充例如 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、 1X108、5X108 或更多個細(xì)胞 / 毫升，或 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、 lxio^sxio^ixio^sxio^ixio^sxio^ixiolsxiolixio^sxio11 或更多個粘 附性胎盤細(xì)胞。在所述組合中的粘附性胎盤干細(xì)胞可以是例如已經(jīng)培養(yǎng)發(fā)生例如1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 或 40 次群體倍增或更多的 粘附性胎盤干細(xì)胞。當(dāng)在原始培養(yǎng)中或在細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)時，粘附性胎盤干細(xì)胞粘附組織培養(yǎng)基質(zhì)， 例如組織培養(yǎng)容器表面(例如組織培養(yǎng)塑料)。培養(yǎng)中的粘附性胎盤干細(xì)胞通常具有成纖 維樣、星形外觀，具有從中央細(xì)胞體延伸出的若干胞質(zhì)突。然而，在相同條件下，粘附性胎盤 干細(xì)胞與培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上是可區(qū)分的，因?yàn)樘ケP干細(xì)胞比成纖維細(xì)胞顯示出 更多數(shù)量的此類突起。在形態(tài)學(xué)上，胎盤干細(xì)胞也可和造血干細(xì)胞相區(qū)分，培養(yǎng)中的造血干 細(xì)胞通常呈現(xiàn)更圓或卵圓的形態(tài)學(xué)?？捎糜诒疚奶峁┑慕M合物和方法的粘附性胎盤干細(xì)胞和胎盤干細(xì)胞群表達(dá)眾多 標(biāo)記物，這些標(biāo)記物可被用于鑒別和/或分離所述干細(xì)胞或包含所述干細(xì)胞的細(xì)胞群。可 用于本文提供的組合物和方法中的粘附性胎盤干細(xì)胞和粘附性干細(xì)胞群包括干細(xì)胞和直 接從胎盤或其任何部分(例如，羊膜、絨毛膜、羊膜-絨毛膜板、胎盤母面絨毛小葉、臍帶等) 獲得的含有干細(xì)胞的細(xì)胞群。在一個實(shí)施方案中，所述粘附性胎盤干細(xì)胞群是在培養(yǎng)中的 粘附性胎盤干細(xì)胞群，例如在容器(例如袋)中的細(xì)胞群。粘附性胎盤干細(xì)胞通常表達(dá)標(biāo)記物⑶73、⑶105、⑶200、HLA-G和/或0CT-4，而不 表達(dá)CD34、CD38或CD45。粘附性胎盤干細(xì)胞也可以表達(dá)HLA-ABC(MHC-l)和HLA-DR。這些 標(biāo)記物可用于鑒別粘附性胎盤干細(xì)胞，和將胎盤干細(xì)胞與其它干細(xì)胞類型相區(qū)分。因?yàn)樘?盤干細(xì)胞可以表達(dá)CD73和CD105，它們可以具有間充質(zhì)干細(xì)胞樣特征。然而，因?yàn)樗稣?附性胎盤干細(xì)胞可以表達(dá)CD200和HLA-G (—種胎兒特異性標(biāo)記物)，它們可以與既不表達(dá) CD200也不表達(dá)HLA-G的間充質(zhì)干細(xì)胞(例如來自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞)相區(qū)分。同樣地， ⑶34、⑶38和/或⑶45表達(dá)的缺乏確定所述粘附性胎盤干細(xì)胞不是造血干細(xì)胞。
在一個實(shí)施方案中，所述粘附性胎盤干細(xì)胞是CD200+、HLA-G+的，其中所述干細(xì)胞 可檢測地抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長。在具體實(shí)施方案中，所述粘附性干細(xì)胞也是CD73+和 ⑶105+的。在另一具體實(shí)施方案中，所述粘附性干細(xì)胞也是⑶34_、⑶38_或⑶45_的。在更 具體的實(shí)施方案中，所述粘附性干細(xì)胞也是⑶34_、⑶38_、⑶45_、⑶73+和⑶105+的。在另 一實(shí)施方案中，當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時，所述粘附性干細(xì)胞生成一個或多個 胚樣體。在另一實(shí)施方案中，所述粘附性胎盤干細(xì)胞是⑶73+、⑶105+、⑶200+的，其中所述 干細(xì)胞可檢測地抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長。在所述群的具體實(shí)施方案中，所述粘附性干 細(xì)胞是HLA-G+的。在另一具體實(shí)施方案中，所述粘附性干細(xì)胞是⑶34—、⑶38—或⑶45—的。 在另一具體實(shí)施方案中，所述粘附性干細(xì)胞是CD34_、CD38_和CD45—的。在更具體的實(shí)施方 案中，所述粘附性干細(xì)胞是⑶34—、⑶38—、⑶45—和HLA-G+的。在另一具體實(shí)施方案中，當(dāng)在 允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時，所述粘附性胎盤干細(xì)胞生成一個或多個胚樣體。在另一實(shí)施方案中，所述粘附性胎盤干細(xì)胞是⑶200+、0CT-4+的，其中所述干細(xì)胞 可檢測地抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長。在具體實(shí)施方案中，所述粘附性干細(xì)胞是CD73+和 CD105+的。在另一具體實(shí)施方案中，所述粘附性干細(xì)胞是HLA-G+的。在另一具體實(shí)施方案 中，所述粘附性干細(xì)胞是⑶34—、⑶38—和⑶45—的。在另一具體實(shí)施方案中，所述粘附性干 細(xì)胞是⑶34-、⑶38\⑶45-、⑶73+、⑶105+和HLA-G+的。在另一具體實(shí)施方案中，當(dāng)在允許 胚樣體的形成條件下培養(yǎng)時，所述粘附性胎盤干細(xì)胞生成一個或多個胚樣體。在另一實(shí)施方案中，所述粘附性胎盤干細(xì)胞是⑶73+、⑶105+和HLA-G+的，其中所 述粘附性干細(xì)胞可檢測地抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長。在上述多個方案的具體實(shí)施方案 中，所述粘附性干細(xì)胞也是CD34_、CD38_或CD45_的。在另一具體實(shí)施方案中，所述粘附性干 細(xì)胞也是⑶34_、⑶38_和⑶45_的。在另一具體實(shí)施方案中，所述粘附性干細(xì)胞也是0CT-4+ 的。在另一具體實(shí)施方案中，所述粘附性干細(xì)胞也是CD200+的。在更具體的實(shí)施方案中， 所述粘附性干細(xì)胞也是CD34-、CD38-、CD45-、0CT-4+和CD200+的。在另一實(shí)施方案中，所述粘附性胎盤干細(xì)胞是⑶73+、⑶105+干細(xì)胞，其中當(dāng)在 允許胚樣體形成的條件下時，所述干細(xì)胞生成一個或多個胚樣體，并且其中所述粘附性干 細(xì)胞可檢測地抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長。在具體實(shí)施方案中，所述粘附性干細(xì)胞也是 ⑶34_、⑶38—或⑶45—的。在另一具體實(shí)施方案中，所述粘附性干細(xì)胞也是⑶34_、⑶38—和 CD45—的。在具體實(shí)施方案中，所述粘附性干細(xì)胞也是0CT-4+的。在更具體的實(shí)施方案中， 所述粘附性干細(xì)胞也是0CT-4+、⑶34-、⑶38-和⑶45-的。在另一實(shí)施方案中，所述粘附性胎盤干細(xì)胞是0CT-4+干細(xì)胞，其中當(dāng)在允許胚樣 體形成的條件下培養(yǎng)時，所述干細(xì)胞生成一個或多個胚樣體，并且其中所述干細(xì)胞已經(jīng)被 證實(shí)可檢測地抑制癌細(xì)胞增殖或腫瘤生長。在各種實(shí)施方案中，至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少 60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的所述分離的胎盤細(xì)胞是0CT4+干細(xì)胞。 在上述群的具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是CD73+和CD105+的。在另一具體實(shí)施方案中，所 述干細(xì)胞是⑶34_、⑶38_或⑶45_的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是⑶200+的。在更 具體的實(shí)施方案中，所述粘附性干細(xì)胞也是⑶73+、⑶105+、⑶200+、⑶34—、⑶38—和⑶45—的。 在另一具體實(shí)施方案中，所述群已經(jīng)過擴(kuò)增，例如已傳代至少一次、至少三次、至少五次、至少10次、至少15次或至少20次。在任意上述實(shí)施方案的更具體的實(shí)施方案中，所述粘附性胎盤細(xì)胞表達(dá) ABC-p (—種胎盤-特異性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；參見，例如Allikmets等人，CancerRes. 58(23) 5337-9(1998))。在另一實(shí)施方案中，所述粘附性胎盤干細(xì)胞是⑶29+、⑶44+、⑶73+、⑶90+、⑶105+、 ⑶200+、⑶34_和⑶133_的。在另一實(shí)施方案中，所述粘附性胎盤干細(xì)胞、胎 盤干細(xì)胞組成性 分泌IL-6、IL-8和單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-I)。每種上述提及的胎盤干細(xì)胞可以包含從哺乳動物胎盤直接獲得和分離的胎盤干 細(xì)胞，或已經(jīng)過培養(yǎng)和傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30或更多次 的胎盤干細(xì)胞，或其組合。腫瘤細(xì)胞抑制性的大量上述粘附性胎盤干細(xì)胞可以包含大約、至 少或不超過 1 X IO5,5X IO5U X IO6,5X IO6U X IO7,5X IO7U X IO8,5X IO8U X 10\5X IO9, 1 X 101Q、5 X 101Q、1 X IO11或更多個粘附性胎盤干細(xì)胞。5. 5. 3.包含胎盤干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的組合物本發(fā)明還提供了包含PINK細(xì)胞、胎盤灌洗液和/或胎盤灌洗液以及另外的條件培 養(yǎng)基的腫瘤-抑制性組合物的用途。粘附性胎盤干細(xì)胞、胎盤灌洗液細(xì)胞和/或胎盤中間 體自然殺傷細(xì)胞可用于生成腫瘤細(xì)胞抑制性的條件培養(yǎng)基，即包含干細(xì)胞分泌或排出的一 種或多種生物分子的培養(yǎng)基，其對眾多的一種或多種類型的免疫細(xì)胞具有可檢測的腫瘤細(xì) 胞抑制作用。在各種實(shí)施方案中，所述條件培養(yǎng)基包含胎盤細(xì)胞(例如干細(xì)胞、胎盤灌洗液 細(xì)胞、PINK細(xì)胞)已在其中生長了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天的培 養(yǎng)基。在其它實(shí)施方案中，所述條件培養(yǎng)基包含胎盤細(xì)胞已在其中生長至至少30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%匯合或直至100%匯合的培養(yǎng)基。這樣的條件培養(yǎng)基可用于支 持獨(dú)立的胎盤細(xì)胞群或另一類型的細(xì)胞群的培養(yǎng)。在另一實(shí)施方案中，本文提供的條件培 養(yǎng)基包含粘附性胎盤干細(xì)胞和非胎盤干細(xì)胞已在其中經(jīng)過培養(yǎng)的培養(yǎng)基。這樣的條件培養(yǎng)基可以與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞和/或胎盤中間體自然殺 傷細(xì)胞中的任一種或任意組合混合以形成腫瘤細(xì)胞抑制性組合物。在某些實(shí)施方案中， 所述組合物包含小于一半體積的條件培養(yǎng)基，例如大約或小于約50 %、45 %、40 %、35 %、 30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或 體積。因而，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含來自胎盤干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基， 其中所述胎盤干細(xì)胞(a)粘附于基質(zhì)；(b)表達(dá)⑶200和HLA-G，或表達(dá)⑶73、⑶105和 CD200,或表達(dá)CD200和0CT-4，或表達(dá)CD73、CD105和HLA-G，或表達(dá)CD73和CD105且當(dāng)在允 許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)包含所述胎盤干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群時促進(jìn)所述群中形成一個 或多個胚樣體，或者表達(dá)0CT-4且當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)包含所述胎盤干細(xì)胞 的胎盤細(xì)胞群時促進(jìn)所述群中形成一個或多個胚樣體；和(c)可檢測地抑制腫瘤細(xì)胞或腫 瘤細(xì)胞群的生長或增殖。在具體實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含眾多所述胎盤干細(xì)胞。 在另一具體實(shí)施方案中，所述組合物包含眾多非胎盤細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述非 胎盤細(xì)胞包含⑶34+細(xì)胞，例如造血祖細(xì)胞(例如外周血液造血祖細(xì)胞、臍帶血造血祖細(xì)胞 或胎盤血造血祖細(xì)胞)。所述非胎盤細(xì)胞也可以包含其它干細(xì)胞，例如間充質(zhì)干細(xì)胞(例 如來自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞)。所述非胎盤細(xì)胞也可以是一種或多種類型成年細(xì)胞或細(xì)胞 系。在另一具體實(shí)施方案中，所述組合物包含抗增殖試劑，例如抗-MIP-I α或抗-MIP-I β抗體。在具體實(shí)施方案中，胎盤細(xì)胞_條件化的培養(yǎng)基或上清液是從與眾多腫瘤細(xì)胞共 培養(yǎng)的眾多胎盤干細(xì)胞得到的，所述胎盤干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的比例為約1 1、約2 1、約 3 1、約4 1或約5 1。例如，所述條件化的培養(yǎng)基或上清液可以從包含約1X105個 胎盤干細(xì)胞、約IX106個胎盤干細(xì)胞、約1X107個胎盤干細(xì)胞或約IX 108個胎盤干細(xì)胞或 更多個胎盤干細(xì)胞的培養(yǎng)物中得到的。在另一具體實(shí)施方案中，所述條件化的培養(yǎng)基或上 清液是從包含如下細(xì)胞的共同培養(yǎng)物中得到的約1X105至約5X105個胎盤干細(xì)胞和約 1X105個腫瘤細(xì)胞；約IX 106至約5 X106個胎盤干細(xì)胞和約IX 106個腫瘤細(xì)胞；約1X107 至約5 X 107個胎盤干細(xì)胞和約1 X 107個腫瘤細(xì)胞；或約1 X 108至約5 X 108個胎盤干細(xì)胞 和約1X108個腫瘤細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，適于施用至70kg個體的條件培養(yǎng)基包含的上清液是被約 200mL培養(yǎng)基中的約7千萬個胎盤干細(xì)胞條件化的?？梢詽饪s條件培養(yǎng)基以制備可施用的藥物級產(chǎn)品。例如，通過除去水(例如通過 蒸發(fā)、冷凍干燥等)，可將培養(yǎng)基濃縮至約90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、 10%或更少。在具體實(shí)施方案中，例如，來自約7千萬胎盤干細(xì)胞的200mL條件培養(yǎng)基可被 濃縮至約 180mL、160mL、140mL、120mL、100mL、80mL、60mL、40mL、20mL 或更少的體積。所述條 件培養(yǎng)基也可以例如通過蒸發(fā)、冷凍干燥等手段基本上干燥成例如粉末。5. 6.灌洗液和胎盤細(xì)胞的保存胎盤灌洗液或胎盤細(xì)胞，例如灌洗液細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞和PINK細(xì)胞可以 保存，即放置在允許長期儲存的條件下，或放置在抑制細(xì)胞死亡(例如因凋亡或壞死而死 亡)的條件下。胎盤灌洗液可以通過使胎盤細(xì)胞組合物流經(jīng)至少一部分胎盤(例如流經(jīng)胎盤血 管系統(tǒng))而生成。所述胎盤細(xì)胞采集組合物包含一種或多種能夠保存包含在灌洗液內(nèi)的 細(xì)胞的化合物。這樣的胎盤細(xì)胞采集組合物在上述部分5. 1中描述，例如包含細(xì)胞凋亡 抑制劑、壞死抑制劑和/或載氧全氟化碳的組合物，如在2006年12月28日提交的題為 “Improved Composition for Collecting andPreserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition (采集和保存胎盤干細(xì)胞的改進(jìn)組合物和使用該組合 物的方法)”的相關(guān)美國申請?zhí)?1/648,812中所述。在一個實(shí)施方案中，流經(jīng)胎盤或胎盤 組織的胎盤細(xì)胞采集組合物是可用于下述部分5. 4中描述的方法的胎盤灌洗液。在一個實(shí)施方案中，通過將細(xì)胞與包含細(xì)胞凋亡抑制劑和載氧全氟化碳的胎盤細(xì) 胞采集組合物接觸，從哺乳動物(例如人)分娩后的胎盤收集胎盤灌洗液和/或胎盤細(xì)胞， 其中和沒有與細(xì)胞凋亡抑制劑接觸的干細(xì)胞群相比，所述細(xì)胞凋亡抑制劑存在的量和時間 足以減少或預(yù)防干細(xì)胞群的細(xì)胞凋亡。例如，可以用胎盤細(xì)胞采集組合物灌洗所述胎盤并 從中分離胎盤細(xì)胞(例如所有有核胎盤細(xì)胞)。在具體實(shí)施方案中，細(xì)胞凋亡抑制劑是半胱 氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑。在另一具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞凋亡抑制劑為JNK抑制劑。 在更具體的實(shí)施方案中，所述JNK抑制劑不能調(diào)節(jié)所述干細(xì)胞的分化或增殖。在另一實(shí)施 方案中，所述胎盤細(xì)胞采集組合物在分離相中包含所述細(xì)胞凋亡抑制劑和所述載氧全氟化 碳。在另一實(shí)施方案中，所述胎盤細(xì)胞采集組合物在乳液中包含的所述細(xì)胞凋亡抑制劑和 所述載氧全氟化碳。在另一實(shí)施方案中，所述胎盤細(xì)胞采集組合物還包含乳化劑，例如卵磷月旨。在另一實(shí)施方案中，在接觸胎盤細(xì)胞時，所述細(xì)胞凋亡抑制劑和所述全氟化碳為約0°c 至約25°C之間。在另一更具體的實(shí)施方案中，在接觸胎盤細(xì)胞時，所述細(xì)胞凋亡抑制劑和所 述全氟化碳在約2°C至10°C之間、或約2°C至約5°C之間。在另一更具體的實(shí)施方案中，所 述接觸在轉(zhuǎn)運(yùn)所述干細(xì)胞群期間進(jìn)行。在另一更具體的實(shí)施方案中，所述接觸在冷凍和解 凍所述干細(xì)胞群期間進(jìn)行。在另一實(shí)施方案中，可以通過將所述灌洗液和/或細(xì)胞與細(xì)胞凋亡抑制劑和器 官-保存化合物接觸來收集和保存胎盤灌洗液和/或胎盤細(xì)胞，其中與沒有和所述細(xì)胞凋 亡抑制劑接觸的灌洗液或胎盤細(xì)胞相比，所述細(xì)胞凋亡抑制劑存在的量和時間足以減少或 預(yù)防所述細(xì)胞的凋亡。
在具體實(shí)施方案中，所述器官-保存化合物為UW溶液(描述在美國專利號 4，798，824 中；也稱為 VIASPAN ；也可參見 Southard 等人，Transplantation 49 (2) 251-257(1990)或描述在Stern等人，美國專利號5，552，267中的溶液。在另一實(shí)施方案 中，所述器官_保存組合物為羥乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖或其組合。在另一實(shí)施方案中，所 述胎盤細(xì)胞采集組合物還在兩相中或作為乳液包含載氧全氟化碳。在所述方法的另一實(shí)施方案中，在灌洗期間，將胎盤灌洗液和/或胎盤細(xì)胞與包 含細(xì)胞凋亡抑制劑和載氧全氟化碳、器官_保存化合物、或其組合的胎盤細(xì)胞采集組合物 接觸。在另一實(shí)施方案中，在通過灌洗進(jìn)行收集之后，將胎盤細(xì)胞與所述干細(xì)胞采集組合物 接觸。典型地，在胎盤細(xì)胞收集、富集和分離期間，優(yōu)選地減少或消除由于缺氧和機(jī)械應(yīng) 力引起的細(xì)胞應(yīng)激。因此，在所述方法的另一實(shí)施方案中，在所述保存期間，在收集、富集 或分離期間，胎盤灌洗液、胎盤細(xì)胞或胎盤細(xì)胞群暴露于缺氧狀態(tài)下少于六小時，其中缺氧 狀態(tài)為氧濃度低于正常血氧濃度。在更具體的實(shí)施方案中，在所述保存期間，所述胎盤細(xì)胞 群暴露于所述缺氧狀態(tài)下少于兩小時。在另一更具體的實(shí)施方案中，在收集、富集或分離期 間，將所述胎盤細(xì)胞群暴露于所述缺氧狀態(tài)少于一小時、或少于三十分鐘、或不暴露于缺氧 狀態(tài)下。在另一具體實(shí)施方案中，在收集、富集或分離期間，所述胎盤細(xì)胞群不暴露于剪切 應(yīng)力下。本文提供的胎盤細(xì)胞可以冷凍保存在例如在小容器(例如安瓿)中的冷凍保存培 養(yǎng)基中。合適的冷凍保存培養(yǎng)基包括但不限于培養(yǎng)基，包括例如生長培養(yǎng)基或細(xì)胞冷凍培 養(yǎng)基，例如市售的細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基，例如C2695、C2639或C6039 (Sigma)。冷凍保存培養(yǎng)基 優(yōu)選地包含濃度為例如約10% (ν/ν)的DMSO(二甲亞砜)。冷凍保存培養(yǎng)基可以包含另外 的試劑，例如甲基纖維素和/或甘油。在冷凍保存期間，優(yōu)選地將胎盤細(xì)胞以約1°C /分鐘 冷卻。優(yōu)選的冷凍保存溫度為約-80°C至約_180°C，優(yōu)選地約_125°C至約_140°C。在解凍 使用之間，可以將冷凍保存的胎盤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中。在某些實(shí)施方案中，例如，一旦安瓿 達(dá)到約_90°C，將其轉(zhuǎn)移到液氮貯存區(qū)。冷凍保存的細(xì)胞優(yōu)選地在約25°C至約40°C的溫度 下解凍，優(yōu)選地在約37°C的溫度解凍。5. 7.胎謝瞿洗液、PINK細(xì)朐,禾Π、混合_臺盤自然殺傷細(xì)朐舶泡丨腫瘤細(xì)朐并長的用 途本發(fā)明還提供了使用胎盤灌洗液、從胎盤灌洗液分離的細(xì)胞、分離的混合自然殺 傷細(xì)胞或分離的胎盤自然殺傷細(xì)胞(例如來自胎盤的中間體自然殺傷細(xì)胞)抑制腫瘤細(xì)胞生長(例如增殖)的方法。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種抑制腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞增殖的方法， 該方法包括將腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞、分離的混合自然 殺傷細(xì)胞和/或PINK細(xì)胞接觸，使得與沒有和胎盤灌洗液、灌洗液細(xì)胞、分離的混合自然殺 傷細(xì)胞和/或PINK細(xì)胞接觸的同樣類型腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞相比，所述腫瘤細(xì)胞或眾 多腫瘤細(xì)胞的增殖可檢測地減少了。在一個實(shí)施方案中，本文使用的“接觸”包含在胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞、胎盤 自然殺傷細(xì)胞(例如胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞)和/或分離的混合自然殺傷細(xì)胞以及腫瘤 細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞之間的直接物理接觸，例如細(xì)胞-細(xì)胞接觸。在另一實(shí)施方案中，“接 觸”包含存在于相同的物理空間中，例如將胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞、胎盤自然殺傷細(xì) 胞(例如胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞)和/或分離的混合自然殺傷細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞或眾多腫 瘤細(xì)胞置于相同的容器中，例如培養(yǎng)皿(多孔板)中。在另一實(shí)施方案中，將胎盤灌洗液、 胎盤灌洗液細(xì)胞、混合自然殺傷細(xì)胞或胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì) 胞“接觸”是通過例如將所述胎盤灌洗液或細(xì)胞(例如胎盤灌洗液細(xì)胞)、混合的自然殺傷 細(xì)胞或胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞注射或輸注到個體中完成的，所述個體例如包含腫瘤細(xì)胞 或眾多腫瘤細(xì)胞的人，例如癌癥患者。在某些實(shí)施方案中，將胎盤灌洗液以能對包含腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞的個體 (例如癌癥患者)產(chǎn)生可檢測的治療益處的任何量使用。在某些其它實(shí)施方案中，將胎盤灌 洗液細(xì)胞、胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞和/或混合的自然殺傷細(xì)胞以能對包含腫瘤細(xì)胞或眾 多腫瘤細(xì)胞的個體(例如癌癥患者)產(chǎn)生可檢測的治療益處的任何量使用。因而，在另一 實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抑制腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞增殖的方法，該方法包括在 個體內(nèi)將腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞和/或來自胎盤的中間 體自然殺傷細(xì)胞或眾多PINK細(xì)胞接觸，使得所述接觸對所述個體有可檢測的或可證實(shí)的 治療益處。本文使用的“治療益處”包括但不限于例如減小腫瘤的尺寸；減輕或終止腫瘤的擴(kuò) 張；減少每單位體積的組織樣品例如血樣中的癌細(xì)胞數(shù)量；臨床上改善所述個體患有的具 體癌癥的任何癥狀，減輕或終止所述個體患有的具體癌癥的任何癥狀的惡化等。實(shí)現(xiàn)任一 或多項(xiàng)這樣的治療益處的胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞和/或PINK細(xì)胞的接觸被稱作是治 療有益的。在某些實(shí)施方案中中，將胎盤灌洗液細(xì)胞，例如來自胎盤灌洗液的有核細(xì)胞、混合 的自然殺傷細(xì)胞和/或胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞以能對包含腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞的 個體(例如癌癥患者)產(chǎn)生可檢測的治療益處的任何量或數(shù)量使用?？梢詫⑻ケP灌洗液細(xì) 胞、混合的自然殺傷細(xì)胞和/或胎盤自然殺傷細(xì)胞(例如胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞)以一 定的細(xì)胞數(shù)量施用至這樣的個體，例如可以向所述個體施用大約、至少約或至多約1X105、 5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、5X109、1X101CI 或 5X1010 個 胎盤灌洗液細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞和/或自然殺傷細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，可以將 胎盤灌洗液細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞和/或來自胎盤的中間體自然殺傷細(xì)胞以一定的細(xì) 胞數(shù)量施用至這樣的個體，例如可以向所述個體施用大約、至少約或至多約IX 105、5X105、 1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、5X109、1X101ci 或 5X1010 個胎盤灌洗液細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞和/或自然殺傷細(xì)胞/每千克個體?？梢愿鶕?jù)胎盤灌洗液細(xì) 胞和/或胎盤自然殺傷細(xì)胞(例如胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞)與所述個體中腫瘤細(xì)胞的近 似比例向這樣的個體施用胎盤灌洗液細(xì)胞和/或來自胎盤的中間體自然殺傷細(xì)胞。例如， 可以將胎盤灌洗液細(xì)胞和/或胎盤自然殺傷細(xì)胞(例如胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞)與個 體的腫瘤細(xì)胞數(shù)以大約、至少約或至多約1 1、1 1、3 1、4 1、5 1、6 1、7 1、 8 1、9 UlO 1、15 1、20 1、25 1、30 1、35 1、40 1、45 1、50 1、 55 1、60 1、65 1、70 1、75 1、80 1、85 1、90 1、95 1 或 100 1 的比例 施用至所述個體。在這樣的個體中的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量可以例如通過對來自所述個體的組織 樣品(例如血樣、 活組織檢查等)中的腫瘤細(xì)胞計數(shù)來估計。在具體實(shí)施方案中，例如，對 于實(shí)體瘤，所述計數(shù)與對所述腫瘤成像以獲得近似腫瘤體積結(jié)合進(jìn)行。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種使用胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞 和/或來自胎盤的中間體自然殺傷細(xì)胞的組合抑制腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞增殖的方法。 在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抑制腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞增殖的方法，該方法 包括將所述腫瘤細(xì)胞與如下物質(zhì)接觸補(bǔ)充了眾多胎盤灌洗液細(xì)胞或PINK細(xì)胞的胎盤灌 洗液；補(bǔ)充了胎盤灌洗液或眾多PINK細(xì)胞的胎盤灌洗液細(xì)胞；補(bǔ)充了胎盤灌洗液和胎盤灌 洗液細(xì)胞的PINK細(xì)胞；眾多PINK細(xì)胞和眾多混合的自然殺傷細(xì)胞；眾多混合的自然殺傷 細(xì)胞和眾多胎盤灌洗液細(xì)胞；補(bǔ)充了混合的自然殺傷細(xì)胞的胎盤灌洗液；或胎盤灌洗液、 胎盤灌洗液細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞和PINK細(xì)胞全部的組合。在一個具體實(shí)施方案中，例如，腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞的增殖被補(bǔ)充了眾多胎 盤灌洗液細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞和/或眾多胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞的胎盤灌洗液 所抑制。在具體實(shí)施方案中，例如每毫升的胎盤灌洗液補(bǔ)充了約1X104、5X104、1X105、 5X 105、1X 106、5X IO6或更多個胎盤灌洗液細(xì)胞或胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞。在其它具體 實(shí)施方案中，胎盤灌洗液，例如一單元(即，來自單個胎盤的收集物)或約100、150、200、 250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950 或 IOOOmL 的灌洗液 補(bǔ)充了約 1 X 10\5 X IO4U X IO5,5 X IO5U X IO6,5 X IO6U X IO7,5 X IO7U X IO8,5 X IO8 或 更多個PINK細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞和/或胎盤灌洗液細(xì)胞/毫升，或1 X 104、5X 104、 1 X IO5,5 X IO5UX IO6,5 X IO6UX IO7,5 X IO7UX IO8,5 X IO8UX 10\5 X 10\1X IO10, 5X IO10,1 X IO11或更多個PINK細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞和/或胎盤灌洗液細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞的增殖被補(bǔ)充了胎盤灌洗液、 混合的自然殺傷細(xì)胞和/或眾多胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞的眾多胎盤灌洗液細(xì)胞所抑制。 在更具體實(shí)施方案中，約 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、 1 X 108、5X IO8 或更多個胎盤灌洗液細(xì)胞 / 毫升，或 1 X 104、5X 104、1 X IO5,5X IO5,1 X 106、 5 X IO6U X IO7,5 X IO7U X IO8,5 X IO8U X IO9,5 X IO9UX IO10,5 X IO10U X IO11 或更多個胎 盤灌洗液細(xì)胞補(bǔ)充了大約、或至少約 1 X 104、5X 104、1 X IO5,5X IO5,1 X IO6,5X IO6,1 X 107、 5X 107、1 X 108、5X IO8或更多個PINK細(xì)胞和/或混合的自然殺傷細(xì)胞/毫升，或1 X 104、 5 X IO4UX IO5,5 X IO5UX IO6,5 X IO6UX IO7,5 X IO7UX IO8,5 X IO8UX 10\5 X 10\ 1 X 1010、5 X 1010、1 X IO11 >更多個PINK細(xì)胞。在其它更具體實(shí)施方案中，約1 X 104、5 X 104、 1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108 或更多個胎盤灌洗液細(xì)胞、 PINK細(xì)胞和/或混合的自然殺傷細(xì)胞/毫升，或1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106UX 107,5X 107UX 108,5X 108UX109,5X10\lX1010,5X1010UX10n 或更多個胎 盤灌洗液細(xì)胞補(bǔ)充 了大約、或至少約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、 700、750、800、850、900、950或1000mL的灌洗液或約1單元的灌洗液。在另一具體實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì)胞的增殖被補(bǔ)充了胎盤灌洗液、 胎盤灌洗液細(xì)胞和/或混合的自然殺傷細(xì)胞的眾多胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞所抑制。在更 具體實(shí)施方案中，約 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、 5X108或更多個胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞，或1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、 5X106UX 107,5X 107UX 108,5X 108UX 109,5X 109UX1010,5X1010UX10n 或更多個 PINK 細(xì)胞補(bǔ)充了約 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、 5X108或更多個胎盤灌洗液細(xì)胞和/或混合的自然殺傷細(xì)胞/毫升，或1 X 104、5X 104、 1X105、5X 105、1X 106、5X 106、1X 107、5X 107、1X 108、5X 108、1X 109、5X109、1X 1010、 sxiolixio11或更多個胎盤灌洗液細(xì)胞和/或混合的自然殺傷細(xì)胞。在其它更具體實(shí) 施方案中，約 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108 或更多個胎盤灌洗液細(xì)胞和/或混合的自然殺傷細(xì)胞/毫升，或1\104、5\104、1\105、 5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、5X109、1X1010、5X1010、 IX 1011或更多個胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞和/或混合的自然殺傷細(xì)胞補(bǔ)充了大約、或 至少約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950 或 1000mL的灌洗液或約1單元的灌洗液。在另一具體實(shí)施方案中，通過將腫瘤細(xì)胞與補(bǔ)充了粘附性胎盤干細(xì)胞的胎盤灌洗 液、灌洗液細(xì)胞、PINK細(xì)胞和/或混合的自然殺傷細(xì)胞接觸來抑制腫瘤細(xì)胞或眾多腫瘤細(xì) 胞的增殖。在具體實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液、灌洗液細(xì)胞或PINK細(xì)胞補(bǔ)充了約1X104、 5X 104、1X 105、5X 105、1X 106、5X 106、1X 107、5X 107、1X 108、5X 108 或更多個粘附性胎盤 干細(xì)胞 / 毫升，或者 1X104、5X104、1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、 5 X 108、1 X 109、5 X 109、1 X 1010、5 X 1010、1 X 1011 或更多個粘附性胎盤干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，通過將腫瘤細(xì)胞與補(bǔ)充了粘附性胎盤干細(xì)胞-條件培養(yǎng)基的 胎盤灌洗液、灌洗液細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞和/或PINK細(xì)胞接觸來抑制腫瘤細(xì)胞或眾 多腫瘤細(xì)胞的增殖，例如每單位灌洗液、灌洗液細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞和/或PINK細(xì) 胞，或每 104、105、106、107、108、109 或 101Q 個細(xì)胞補(bǔ)充了 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 1、 0. 8,0. 9、l、2、3、4、5、6、7、8、9、10mL 的干細(xì)胞條件化培養(yǎng)基。在其它實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞、胎盤自然殺傷細(xì)胞(例如 PINK細(xì)胞)、混合的自然殺傷細(xì)胞，及包含它們的組合和匯總庫按其最初獲得的形式使用， 即灌洗液是灌洗期間獲得的，胎盤灌洗液細(xì)胞是從這樣的灌洗液分離的，混合的自然殺傷 細(xì)胞是從這樣的灌洗液和匹配的臍帶血得到的，或PINK細(xì)胞是從這樣的灌洗液或這樣的 胎盤灌洗液細(xì)胞分離的。在其它實(shí)施方案中，所述胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞、PINK細(xì)胞 及它們的組合和匯總庫在使用前經(jīng)過處理。例如，胎盤灌洗液可以以其從胎盤收集的原始 的、未經(jīng)處理的形式被使用。胎盤灌洗液也可以在使用前被處理，例如通過陰性選擇一種或 多種類型的細(xì)胞，通過脫水減小體積；凍干和再水合等方式進(jìn)行處理。類似地，灌洗液細(xì)胞群可以以其最初從胎盤灌洗液分離的形式(如從胎盤灌洗液分離的所有有核細(xì)胞)被使 用，或者可以經(jīng)過處理以例如除去一種或多種細(xì)胞類型(例如紅細(xì)胞)。PINK細(xì)胞可以以 其最初從胎盤灌洗液分離(例如使用CD56微珠分離)的形式被使用，或者可以經(jīng)過處理例 如以除去一種或多種非殺傷細(xì)胞類型。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將用 腫瘤細(xì)胞與胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞、PINK細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞或包含它們的匯 總庫或組合接觸，其中在所述接觸之前，所述胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞、PINK細(xì)胞、混 合的自然殺傷細(xì)胞或包含它們的匯總庫或組合已經(jīng)與白細(xì)胞介素-2(IL-2)接觸了一段時 間。在某些實(shí)施方案中，在所述接觸之前，所述一段時間為大約、至少或至多1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46 或 48 小時?？梢栽诳拱┲委煰煶讨?，向患有癌癥的個體、或具有腫瘤細(xì)胞的個體施用一次所 述灌洗液、灌洗液細(xì)胞、PINK細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞或它們的匯總庫和/或組合，或者 可以施用多次，例如在治療期間，每 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22或23小時施用一次，或每1、2、3、4、5、6或7天施用一次，或每1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10或更多周施用一次。可以施用所述灌洗液、灌洗液細(xì)胞、PINK細(xì)胞、包含它們的匯 總庫和/或組合，而不用考慮在過去是否曾向患有癌癥或具有腫瘤細(xì)胞的人施用過所述灌 洗液、灌洗液細(xì)胞、PINK細(xì)胞、包含它們的匯總庫和/或組合。因而，本文提供的方法包括 向患有癌癥或具有腫瘤細(xì)胞的人施用胎盤灌洗液、灌洗液細(xì)胞、PINK細(xì)胞、包含它們的匯總 庫和/或組合的任一種組合。在具體實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞為血癌細(xì)胞。在各種具體實(shí)施方案中，所述腫 瘤細(xì)胞為原發(fā)性導(dǎo)管癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞、慢性髓細(xì)胞樣淋巴瘤 (CML)細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、慢性髓性白血病(CML)細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、 組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞或結(jié)腸 直腸腺癌細(xì)胞。所述胎盤灌洗液、灌洗液細(xì)胞、PINK細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞、包含它們的匯總 庫和/或組合可以屬于包括一種或多種其它抗癌劑的抗癌治療方案的一部分。這些抗癌 劑是本領(lǐng)域熟知的。除了所述灌洗液、灌洗液細(xì)胞、PINK細(xì)胞、包含它們的匯總庫和/或 組合之外，可以向患有癌癥的個體施用的具體抗癌劑包括但不限于阿西維辛；阿柔比星； 阿考達(dá)唑鹽酸鹽；阿克羅寧；阿多來新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；阿美蒽醌乙酸 鹽；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；門冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素； 巴馬司他；苯佐替派；比卡魯胺；比生群鹽酸鹽；二甲磺酸雙奈法德；比折來新；硫酸博來 霉素；布喹那鈉；溴匹立明；白消安；放線菌素C ；卡普睪酮；卡醋胺；卡貝替姆；卡鉬；卡氮 芥；鹽酸卡柔比星；卡折來新；西地芬戈；塞來考昔(C0X-2抑制劑)；苯丁酸氮芥；西羅霉 素；順鉬；克拉屈濱；甲磺酸克立那托；環(huán)磷酰胺；阿糖胞苷；達(dá)卡巴嗪；更生霉素；鹽酸柔 紅霉素；地西他濱；右奧馬鉬；地扎呱寧；甲磺酸地扎呱寧；地吖醌；多西他賽；多柔比星； 鹽酸多柔比星；屈洛昔芬；檸檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；達(dá)佐霉素；依達(dá)曲沙；鹽酸依 氟鳥氨酸；依沙蘆星；恩洛鉬；恩普氨酯；依匹哌啶；鹽酸表柔比星；厄布洛唑；鹽酸依索比 星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸鈉；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；鹽酸法 倔唑；法扎拉濱；芬維A胺；氟尿苷；磷酸氟達(dá)拉濱；氟尿嘧啶；氟西他濱；磷喹酮；福司曲星鈉；吉西他濱；鹽酸吉西他濱；羥基脲；伊達(dá)比星鹽酸鹽；異環(huán)磷酰胺；伊莫福新；異丙 鉬；依立替康；鹽酸依立替康；乙酸蘭瑞肽；來曲唑；醋酸亮丙瑞林；鹽酸利阿唑；洛美曲索 鈉；環(huán)己亞硝脲；鹽酸洛索蒽醌；馬索羅酚；美登素；鹽酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美侖孕 酮；美法侖；美諾立爾；巰嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤鈉；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米 托卡星；絲裂紅素；米托潔林；米托馬星；絲裂霉素；米托司培；米托坦；鹽酸米托蒽醌；麥 考酚酸；諾考達(dá)唑；諾拉霉素；奧馬鉬；奧昔舒侖；紫杉醇；培門冬酶；佩里霉素；戊氮芥；培 洛霉素硫酸鹽；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡羅蒽醌鹽酸鹽；普卡霉素；普洛美坦；卟 菲爾鈉；泊非霉素；潑尼莫司??；鹽酸甲基芐胼；嘌呤霉素；鹽酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素； 利波腺苷；沙芬戈；沙芬戈鹽酸鹽；司莫司??；二甲二苯四氮烯；sparfosate鈉；司帕霉素； 鹽酸鍺螺胺；螺莫司?。宦葶f；鏈黑菌素；鏈佐星；磺氯苯脲；他利霉素；tecogalan鈉；泰索 帝；替加氟；鹽酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替羅昔??；睪內(nèi)酯；硫咪嘌呤；硫鳥嘌呤； 噻替派；噻唑呋林；替拉扎明；檸檬酸托瑞米芬；乙酸曲托龍；磷酸曲西立濱；三甲曲沙；葡 糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；妥布氯唑鹽酸鹽；尿嘧啶氮芥；尿烷亞胺；伐普肽；維替泊芬； 硫酸長春堿；硫酸長春新堿；長春地辛；硫酸長春地辛；硫酸長春匹定；硫酸長春甘酯；硫 酸長春羅辛；酒石酸長春瑞濱；硫酸長春羅定；硫酸長春利定；伏氯唑；折尼鉬；凈司他丁 ； 和鹽酸佐柔比星。 其它抗癌藥物包括但不限于20_表-1，25_ 二羥維生素D3 ；5-乙炔基尿嘧啶；阿 比特龍；阿柔比星；?；幌?；腺環(huán)戊醇；阿多來新；阿地白介素；ALL-TK拮抗劑；六甲蜜 胺；氨莫司??；2，4_ 二氯苯氧乙酸；氨磷?。话被阴１?；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷； 阿那曲唑；穿心蓮內(nèi)酯；血管生成抑制劑；拮抗劑D ；拮抗劑G ；安雷利克斯；抗背側(cè)發(fā)育形 態(tài)發(fā)生蛋白-1 ；抗雄激素藥，前列腺癌；抗雌激素藥；抗瘤酮；反義寡核苷酸；甘氨酸阿非 迪霉素；細(xì)胞凋亡基因調(diào)節(jié)劑；細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑；無嘌呤酸；阿糖-CDP-DL-PTBA ；精氨酸 U兌；asulacrine ；Hftk^fi ；H^WjtT ；axinastatin 1 ；axinastatin 2 ；axinastatin 3 ；阿扎司瓊；阿扎毒素；重氮酪氨酸；漿果赤霉素III衍生物；balanol ；巴馬司他；BCR/ABL 拮抗劑；苯并二氫卟吩；苯甲酰星孢素；日內(nèi)酰胺衍生物；日-alethine ；亞阿克拉霉素B ； 白樺脂酸；bFGF抑制劑；比卡魯胺；比生群；雙氮丙啶基精胺；雙奈法德；bistratene A ；比 折來新；breflate ；溴匹立明；布度鈦；丁硫氨酸亞砜胺；卡泊三醇；抑激酶素C ；喜樹堿衍 生物；卡培他濱；甲酰胺-氨基-三唑；羧基酰胺基三唑；CaRest M3 ；CARN 700 ；軟骨衍生的 抑制劑；卡折來新；酪蛋白激酶抑制劑(IC0S)；澳粟精胺；殺菌肽B ；西曲瑞克；chlorlns ； 氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；順卟啉；克拉屈濱；克羅米芬類似物；克霉唑；collismycin A ；collismycin B ；考布他汀 A4 ；考布他汀類似物；conagenin ；crambescidin 816 ；克立那 ft MMM^X 8 ；月太 A；curacin A ；cyclopentanthraquinones ；cycloplatam ；
cypemycin ；阿糖胞苷十八烷基磷酸鈉；細(xì)胞溶解因子；cytostatin ；達(dá)昔單抗；地西他 濱；脫氫膜海鞘素BWehydrodidemnin B)；地洛瑞林；地塞米松；右異環(huán)磷酰胺；右雷佐 生；右維拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B ;didox ；二乙基去甲精胺(diethylnorspermine)； 二氫-5-氮胞苷；二氫紫杉醇，9- ；dioxamycin ； 二苯基螺莫司??；多西他賽；二十二烷 醇；多拉司瓊；去氧氟尿苷；多柔比星；屈洛昔芬；屈大麻酚；倍癌霉素SA;依布硒啉； 依考莫司汀；依地福新；依決可單抗；依氟鳥氨酸；欖香烯；乙嘧替氟；表柔比星；依立 雄胺；雌莫司汀類似物；雌激素激動劑；雌激素拮抗劑；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉濱；芬維A胺；非格司亭；非那司提；黃酮類抗腫瘤藥；氟卓斯?。?fluasterone ；氟達(dá)拉濱；鹽酸fluorodaunorunicin ；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫 司??；釓替沙林；硝酸鎵；加洛他濱；加尼瑞克；明膠酶抑制劑；吉西他濱；谷胱甘肽抑制 劑；h印sulfam ；heregulin ；六亞甲基雙乙酸胺；金絲桃素；伊班膦酸；伊達(dá)比星；艾多昔 芬；伊決孟酮；伊莫福新；伊洛馬司他；伊馬替尼(例如GLEEVEC )；咪喹莫特；免疫刺激 肽；胰島素樣生長因子-1受體抑制劑；干擾素激動劑；干擾素；白細(xì)胞介素；碘芐胍；碘阿 霉素；甘薯苦醇，4-；伊羅普拉；伊索拉定；isobengazole ；isohomohalicondrinB ；伊他司 瓊；jasplakinolide ；kahalalide F ；三醋酸片螺素-N ；蘭瑞肽；leinamycin ；來格司亭; 硫酸蘑菇多糖；leptolstatin;來曲唑；白血病抑制因子；白細(xì)胞a干擾素；亮丙瑞林+ 雌激素+黃體酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；線性聚胺類似物；親脂性二糖肽；親脂性 鉬類化合物；lissoclinamide 7 ；洛鉬；胍乙基磷酸絲氨酸；洛美曲索；氯尼達(dá)明；洛索蒽 醌；洛索立賓；勒托替康；德卟啉镥(lutetium texaphyrin) ；lysofylline ；裂解肽；美坦 辛；制苷糖酶素A ；馬立馬司他；馬索羅酚；乳腺絲抑蛋白(maspin)；基質(zhì)溶解素抑制劑； 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑；美諾立爾；美巴龍；美替瑞林；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制 劑；米非司酮；米替福新；米立司亭；米托胍腙；二溴衛(wèi)矛醇；絲裂霉素類似物；米托萘胺； mitotoxin成纖維細(xì)胞生長因子-皂草素蛋白；米托蒽醌；莫法羅??；莫拉司亭；愛必妥，人 絨毛膜促性腺激素；單磷酰脂質(zhì)A+分支桿菌細(xì)胞壁sk ；莫哌達(dá)醇；芥子類抗癌劑；印度洋 海綿(myCaper0Xide)B ；分支桿菌細(xì)胞壁提取物；myriaporone ；N-乙?；啬橇?；N-取代 的苯甲酰胺；那法瑞林；那瑞替噴；納洛酮+噴他佐辛；napavin ；naphterpin ；那托司亭；奈 達(dá)鉬；奈莫柔比星；奈立膦酸；尼魯米特；nisamycin ；—氧化氮調(diào)節(jié)劑；硝基氧抗氧化劑； nitrullyn ；奧利默森(GENASENSE ) ；06-芐基鳥嘌呤；奧曲肽；okicenone ；寡核苷酸；奧那 司酮；奧坦西隆；昂丹司瓊；oracin ； 口服細(xì)胞因子誘導(dǎo)物；奧馬鉬；奧沙特?。粖W沙利鉬； oxaunomycin ；紫杉醇；紫杉醇類似物；紫杉醇衍生物；palauamine ；棕櫚酰根霉素；帕米磷 酸；人參三醇；帕諾米芬；菌鐵素；帕折普??；培門冬酶；培得星；戊聚糖多硫酸鈉；噴司他 丁 ；pentrozole ；全氟溴烷；培磷酰胺；紫蘇子醇；苯連氮霉素；乙酸苯酯；磷酸酶抑制劑； 溶血性鏈球菌制劑；鹽酸毛果蕓香堿；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A ；placetin B ；纖溶 酶原活化因子抑制劑；鉬絡(luò)合物；鉬化合物；鉬-三胺絡(luò)合物；卟菲爾鈉；泊非霉素；撥尼 松；丙基二吖啶酮；前列腺素J2 ；蛋白酶體抑制劑；基于蛋白A的免疫調(diào)節(jié)劑；蛋白激酶C 抑制劑；微藻蛋白激酶C抑制劑；蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶抑制劑；嘌呤核苷磷酸化酶抑制劑； 紫紅素；吡唑啉吖啶；吡多酸化血紅蛋白聚乙二醇偶聯(lián)物；raf拮抗劑；雷替曲塞；雷莫司 瓊；ras-法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑；ras抑制劑；ras-GAP抑制劑；脫甲基瑞替普??；依替 磷酸錸Re 186 ；根霉素；核酶；RII維甲酰胺；rohitukine ；羅莫肽；羅喹美克；rubiginone B1 ；ruboxyl ；沙芬戈；saintopin ； SarCNU ；肉芝軟珊瑚醇(sarcophytol) A ；沙格司亭； Sdi 1模擬物；司莫司?。凰ダ涎苌种苿? ；有義寡核苷酸；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑；西佐喃； 索布佐生；硼卡鈉；苯基乙酸鈉；solverol ；生長調(diào)節(jié)素結(jié)合蛋白；索納明；膦門冬酸；穗 霉素D ；螺莫司??；脾臟五肽；海綿抑制素1 ；角鯊胺；stipiamide ；溶基質(zhì)蛋白酶抑制劑； sulfinosine ；超活性血管活性腸肽拮抗劑；suradista ；蘇拉明；八氫吲嗪三醇；他莫司??； 他莫昔芬甲碘化物；?；悄就?；他扎羅汀；替可加蘭鈉；替加氟；tellurapyrylium ；端 粒酶抑制劑；替莫泊芬；替尼泊苷；十氧化四氯(tetrachlorodecaoxide) ；tetrazomine ；thaliblastine ；噻可拉林；血小板生成素；血小板生成素模擬物；胸腺法新；胸腺生成 素受體激動劑；噻可拉林；促甲狀腺激素；錫乙基初紫紅素；替拉扎明；二氯二茂鈦； topsentin ；托瑞米芬；翻譯抑制劑；維甲酸；三乙酰尿苷；曲西立濱；三甲曲沙；曲普瑞林； 托烷司瓊；妥羅雄脲；酪氨酸激酶抑制劑；酪氨酸磷酸化抑制劑；UBC抑制劑；烏苯美司；來 自泌尿生殖竇的生長抑制因子；尿激酶受體拮抗劑；伐普肽；variolin B ；維拉雷瑣；藜蘆 胺；verdins ；維替泊芬；長春瑞濱；vinxaltine ；牡荊堿；伏氯唑；扎諾特隆；亞芐維C和凈 司他丁斯酯。5. 8.用免疫調(diào)節(jié)化合物處理自然殺傷細(xì)胞本文其它部分所述的分離的自然殺傷細(xì)胞(例如PINK細(xì)胞或混合的自然殺傷細(xì) 胞)可以用免疫調(diào)節(jié)化合物處理，例如與免疫調(diào)節(jié)化合物接觸，以增強(qiáng)所述細(xì)胞的抗腫瘤 活性。因此，本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性的方法，該方法包 括將所述自然殺傷細(xì)胞與一定濃度的免疫調(diào)節(jié)化合物接觸一段時間，與沒有與所述免疫調(diào) 節(jié)化合物接觸的自然殺傷細(xì)胞相比，所述濃度和時間足以使所述自然殺傷細(xì)胞表現(xiàn)出對腫 瘤細(xì)胞增強(qiáng)的細(xì)胞毒性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種增加自然殺傷細(xì)胞中粒酶 B表達(dá)的方法，該方法包括將所述自然殺傷細(xì)胞與一定濃度的免疫調(diào)節(jié)化合物接觸一段時 間，與沒有與所述免疫調(diào)節(jié)化合物接觸的自然殺傷細(xì)胞相比，所述濃度和時間足以使所述 自然殺傷細(xì)胞表現(xiàn)出增加的粒酶B的表達(dá)。所述免疫調(diào)節(jié)化合物可以是如下所述的任一種 化合物，例如來那度胺或pomalidomide。本發(fā)明還提供了一種增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞群(例如PINK細(xì)胞群或混合的自然殺傷 細(xì)胞群)對眾多腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性的方法，該方法包括將所述自然殺傷細(xì)胞群與一定濃 度的免疫調(diào)節(jié)化合物接觸一段時間，與沒有與所述免疫調(diào)節(jié)化合物接觸的等量自然殺傷細(xì) 胞群相比，所述濃度和時間足以使所述自然殺傷細(xì)胞群表現(xiàn)出對所述眾多腫瘤細(xì)胞可檢測 的增強(qiáng)的細(xì)胞毒性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種增加自然殺傷細(xì)胞群中粒酶B 表達(dá)的方法，該方法包括將所述自然殺傷細(xì)胞群與一定濃度的免疫調(diào)節(jié)化合物接觸一段時 間，與沒有與所述免疫調(diào)節(jié)化合物接觸的等量自然殺傷細(xì)胞群相比，所述濃度和時間足以 使所述自然殺傷細(xì)胞群表達(dá)可檢測的增多量的粒酶B。在具體實(shí)施方案中，所述自然殺傷細(xì) 胞群包含在胎盤灌洗液細(xì)胞(例如來自胎盤灌洗液的所有有核細(xì)胞)內(nèi)。在上述實(shí)施方案的具體實(shí)施方案中，所述自然殺傷細(xì)胞是CD56+、〔016_胎盤中間 體自然殺傷細(xì)胞(PINK細(xì)胞)。在上述實(shí)施方案的另一具體實(shí)施方案中，所述自然殺傷細(xì)胞 為混合的自然殺傷細(xì)胞，即來自匹配的胎盤灌洗液和臍帶血的自然殺傷細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，與沒有與所述免疫調(diào)節(jié)化合物接觸的等量所述自然殺傷 細(xì)胞相比，與所述免疫調(diào)節(jié)化合物接觸的所述眾多自然殺傷細(xì)胞(例如PINK細(xì)胞或混合的 自然殺傷細(xì)胞)以更高水平表達(dá)BAX、CCL5、CCR5、CSF2、FAS、⑶SB、IL2RA或TNFRSF18中的 一種或多種。在另一具體實(shí)施方案中，與沒有和所述免疫調(diào)節(jié)化合物接觸的等量所述自然 殺傷細(xì)胞相比，與所述免疫調(diào)節(jié)化合物接觸的所述眾多自然殺傷細(xì)胞(例如PINK細(xì)胞)以 更高水平表達(dá) ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL5、CCR5、CSF1、CSF2、ECE1、FAS、GNLY、⑶SB、GZMB、 ILIA、IL2RA、IL8、IL10、LTA、PRF1、PTGS2、SKI 和 TBX21 中的一種或多種。本發(fā)明還提供了一種增強(qiáng)人胎盤灌洗液細(xì)胞群(例如來自胎盤灌洗液的所有有 核細(xì)胞群)對眾多腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性的方法，該方法包括將所述胎盤灌洗液細(xì)胞與一定濃度的免疫調(diào)節(jié)化合物接觸一段時間，與沒有和所述免疫調(diào)節(jié)化合物接觸的等量胎盤灌洗 液細(xì)胞相比，所述濃度和時間足以使所述胎盤灌洗液細(xì)胞表現(xiàn)出對所述眾多腫瘤細(xì)胞的可 檢測的增強(qiáng)的細(xì)胞毒性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種增加胎盤灌洗液細(xì)胞群中 粒酶B表達(dá)的方法，該方法包括將所述胎盤灌洗液細(xì)胞群與一定濃度的免疫調(diào)節(jié)化合物接 觸一段時間，與沒有與所述免疫調(diào)節(jié)化合物接觸的等量胎盤灌洗液細(xì)胞相比，所述濃度和 時間足以使所述胎盤灌洗液細(xì)胞群表達(dá)可檢測的增多量的粒酶B。免疫調(diào)節(jié)化合物可以是商業(yè)上購買的或根據(jù)本文提及的專利或?qū)＠_物中描 述的方法制備的，所有這些專利或?qū)＠_物通過參考納入本文。進(jìn)一步地，可以不對稱合 成或者使用已知拆分試劑或手性柱以及其它標(biāo)準(zhǔn)合成有機(jī)化學(xué)技術(shù)拆分得到光學(xué)純的組 分。免疫調(diào)節(jié)化合物可以是外消旋的、立體異構(gòu)富集的或立體異構(gòu)純的，并且可以包含其藥 學(xué)可接受的鹽、溶劑化物及前藥。除非另有說明，本文使用的術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)化合物”包含顯著地抑制TNF a、LPS誘 導(dǎo)的單核細(xì)胞IL-IB和IL-12，且部分地抑制IL-6生成的有機(jī)小分子。在具體實(shí)例中，所述 免疫調(diào)節(jié)化合物為來那度胺、pomalidomide或沙立度胺。免疫調(diào)節(jié)化合物的具體實(shí)例包括但不限于取代的苯乙烯的氰基和羧基衍生物， 例如在美國專利號5，929，117中公開的那些；1-氧代-2- (2,6- 二氧代-3-氟哌啶-3-基) 異二氫吲哚和1，3- 二氧代-2- (2,6 二氧代-3-氟哌啶-3-基)異二氫吲哚，例如在美國專 利號5，874，448和5，955，476中公開的那些；在美國專利號5，798，368中描述的四取代的 2- (2,6- 二氧代哌啶-3-基)-1-氧代異二氫吲哚；1-氧代和1，3- 二氧代-2- (2,6- 二氧代 哌啶-3-基)異二氫吲哚(例如，沙立度胺的4-甲基衍生物)，包括但不限于在美國專利號 5，635，517,6, 476，052,6, 555，554 和 6，403，613 中公開的那些；在美國專利號 6，380，239 中描述的在二氫吲哚環(huán)的4-或5-位發(fā)生取代的1-氧代和1，3-二氧代異二氫吲哚(例 如，4-(4_氨基-1，3-二氧代異二氫吲哚-2-基)-4_氨基甲酰基丁酸)；在美國專利號 6，458，810中描述的在2-位用2，6- 二氧代-3-羥基哌啶_5_基取代的異二氫吲哚酮 和異二氫吲哚-1，3- 二酮(例如，2- (2,6- 二氧代-3-羥基-5-氟代哌啶-5-基)-4-氨基異 二氫吲哚-1-酮)；在美國專利號5，698，579和5，877，200中公開的一類非多肽環(huán)酰胺；氨 基沙立度胺及氨基沙立度胺的類似物、水解產(chǎn)物、代謝產(chǎn)物、衍生物和前體，和取代的2-(2， 6- 二氧代哌啶-3-基)鄰苯二甲酰亞胺和取代的2-(2，6- 二氧代哌啶-3-基)-1_氧異吲 哚，例如在美國專利號6，281，230和6，316，471中描述的那些；以及異吲哚_酰亞胺化合 物，例如在美國專利公開號2003/0045552 A1、美國專利號7，091，353和TO 02/059106中描 述的那些。本文提及的每個專利和專利申請的全部內(nèi)容通過參考納入本文。免疫調(diào)節(jié)化合 物不包含沙立度胺。在某些實(shí)施方案中，所述免疫調(diào)節(jié)化合物是在苯環(huán)上發(fā)生氨基取代的1-氧代-和 1，3- 二氧代-2- (2,6- 二氧代哌啶-3-基)異二氫吲哚，如在美國專利號5，635，517中所描 述的，該專利的全部內(nèi)容通過參考納入本文。這些化合物具有結(jié)構(gòu)I 其中X和Y之一是C = 0，X和Y中的另一個為C = 0或CH2，且R2是氫或低級烷 基，特別是甲基。具體的免疫調(diào)節(jié)化合物包括但不限于Ι 氧代哌啶 -3-基)-4-氨基異二氫吲哚 氧代哌啶-3-基)-5-氨基異二氫吲哚 氧代哌啶-3-基)-6-氨基異二氫吲哚 氧代哌啶-3-基)-7-氨基異二氫吲哚1，3- 二氧代-2- (2,6- 二氧代哌啶-3-基)-4-氨基異二氫吲哚； 1，3- 二氧代-2- (2,6- 二氧代哌啶-3-基)-5-氨基異二氫吲哚；
1-氧代-2-(2，6-1-氧代-2-(2，6-1-氧代-2-(2，6-1-氧代-2-(2 Α-其它具體免疫調(diào)節(jié)化合物屬于一類取代的2-(2，6_ 二氧代哌啶-3-基)鄰苯 二甲酰亞胺和取代的2-(2，6_ 二氧代哌啶-3-基)-1_氧代異吲哚，例如在美國專利號 6，281，230,6, 316，471,6, 335，349、和 6，476，052，以及 WO 98/03502 中描述的那些，每專利
和專利公開物均通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式 其中X和Y之一是C = 0，且X和Y中的另一個是C = 0或CH2 ；(i)各Ri、R2、R3和R4彼此獨(dú)立地是鹵素、1至4個碳原子的烷基、或1至4個碳原 子的烷氧基，或(ii) R1、R2、R3和R4中的一個是-NHR5，且R1、R2、R3和R4中其余的是氫；R5是氫、或1至8個碳原子的烷基；R6是氫、1至8個碳原子的烷基、芐基或鹵素；條件是如果X和Y是C = 0，且⑴各HR3和R4是氟或(U)R1U或R4中 的一個是氨基，則R6不為氫。這類的代表性化合物具有下式 其中R1是氫或甲基。在單獨(dú)的實(shí)施方案中，包含了這些化合物的對映體純的形式 (例如光學(xué)純的(R)或(S)對映異構(gòu)體)的用途。其它具體免疫調(diào)節(jié)化合物屬于公開在美國專利申請公開號US2003/0096841和US 2003/0045552和WO 02/059106中的一類異吲哚_酰亞胺，各專利和專利公開物通過參考納 入本文。代表性的化合物具有下式II 及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、 外消旋體和立體異構(gòu)體的混合物，其中X和Y中的一個是C = 0，且X和Y中的另一個是CH2或C = 0 ；R1 是 H、(C1-C8)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、 (C0-C4)烷基-(CfC6)雜環(huán)烷基、(C0-C4)燒基-(C2-C5)雜芳基、C(O) R3、C (S)R3、C(O) OR4、 (C1-C8)燒基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O) OR5、C(O) NHR3、C ⑶ NHR3、C(O) NR3R3'、C (S) NR3R3'、或(C1-C8)烷基-0 (CO) R5 ；R2 是 H、F、芐基、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、或(C2-C8)炔基；R3和R3’獨(dú)立地是(C1-C8)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、 芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、(C0-C8)烷基-N(R6)2、 (C-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O) OR5、(C1-C8)烷基-0 (CO) R5、或 C (0) OR5 ；R4 是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C4)烷基 _0R5、芐基、芳基、 (C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基、或(Ctl-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基；
R5是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、或(C2-C5)雜芳基；R6每次出現(xiàn)時獨(dú)立地是H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、(C2-C5)雜芳基、或(Ctl-C8)烷基-C(O)O-R5,或多個R6基團(tuán)可以連接形成雜環(huán)烷基基團(tuán)；η 是 0 或 1 ；和*代表手性-碳中心。在式II的具體化合物中，當(dāng)η是0時，則R1是(C3-C7)環(huán)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8) 炔基、芐基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、C(O)R3, C(O)0R\ (C1-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、C(S)NHR3、或(C1-C8) 烷基-O(CO)R5 ；R2 是 H、或(C1-C8)烷基；且R3 是(C1-C8)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、(C0-C4) 烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、(C5-C8)烷基-N(R6)2 ； (C0-C8)烷 基-NH-C (0) O-R5 ； (C1-C8)烷基-OR5，(C1-C8)烷基-C (0) OR5、(C1-C8)烷基-0 (CO) R5 或-C (0) OR5 ；且其它變量具有相同的定義。在式II的其它具體化合物中，R2是H、或(C1-C4)烷基。在式II的其它具體化合物中，R1是(C1-C8)烷基、或芐基。在式II的其它具體化合物中，R1是H、(C1-C8)烷基、芐基、CH2OCH3^ CH2CH2OCH3、或 在式II化合物的另一實(shí)施方案中，R1是 其中Q是0或S，R7每次出現(xiàn)時獨(dú)立地是H、(C1-C8)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C2-C8) 烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、鹵素、(Ctl-C4)烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基、(Ctl-C4)烷基-(C2-C5) 雜芳基、(Ctl-C8)烷基-N(R6)2、(C「C8)烷基-OR5、(C「C8)烷基-C(O) OR5、(C「C8)烷基-O(CO) R5、或C(0)0R5，或相鄰出現(xiàn)的R7可以結(jié)合在一起形成雙環(huán)烷基或芳環(huán)。在式II的其它具體化合物中，R1是C(0)R3。在式II的其它具體化合物中，R3是(Ctl-C4)燒基-(C2-C5)雜芳基、(C1-C8)烷基、 芳基、或(Ctl-C4)烷基-0R5。在式II的其它具體化合物中，雜芳基是吡啶基、呋喃基、或噻吩基。在式II的其它具體化合物中，R1是C(0)0R4。在式II的其它具體化合物中，C(O)NHC(O)的H可以被(C1-C4)烷基、芳基、或芐基代替。該類型中的化合物的進(jìn)一步實(shí)例包括但不限于[2- (2，6- 二氧代-哌啶-3-基)-1，3- 二氧代-2，3- 二氫-IH-異吲哚-4-基甲基]-酰胺；(2- (2,6- 二氧代-哌 啶-3-基)-1，3- 二氧代-2，3- 二氫-IH-異吲哚-4-基甲基)-氨基甲酸叔丁酯；4-(氨基 甲基)-2- (2，6- 二氧代(3-哌啶基))-異二氫吲哚-1，3- 二酮；N- (2- (2，6- 二氧代-哌 啶-3-基)-1，3- 二氧代-2，3- 二氫-IH-異吲哚-4-基甲基)-乙酰胺；N- {(2- (2,6- 二氧代 (3-哌啶基)-1，3- 二氧代異二氫吲-4-基)甲基}環(huán)丙基-甲酰胺；2-氯-N- {(2- (2，6- 二 氧代(3-哌啶基))_1，3-二氧代異二氫吲-4-基)甲基}乙酰胺；N-(2-(2，6-二氧代(3-哌 啶基))-1，3_二氧代異二氫吲-4-基)-3_吡啶基甲酰胺；3-{1-氧代-4-(芐基氨基)異二 氫吲哚_2_基}哌啶-2，6-二酮；2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-4-(芐基氨基)異二氫吲 哚-1，3- 二酮；N- {(2- (2,6- 二氧代(3-哌啶基))-1，3- 二氧代異二氫吲哚-4-基)甲基} 丙酰胺；N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代異二氫吲哚-4-基)甲基}_3_吡 啶基甲酰胺；N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3_ 二氧代異二氫吲-4-基)甲基}庚 酰胺；N-{(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3_ 二氧代異二氫吲哚-4-基)甲基}_2_呋 喃基甲酰胺；{N-(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3_ 二氧代異二氫吲-4-基)氨基甲酰 基}乙酸甲酯；N-(2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3_ 二氧代異二氫吲哚-4-基)戊酰 胺；N- (2- (2,6- 二氧代(3-哌啶基))-1，3- 二氧代異二氫吲哚-4-基)-2-噻吩基甲酰胺； N-{[2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3_ 二氧代異二氫吲哚-4-基]甲基} (丁基氨基)甲 酰胺；N-{[2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3-二氧代異二氫吲哚-4-基]甲基}(辛基氨 基)甲酰胺；和N-{[2-(2，6-二氧代(3-哌啶基))-1，3_ 二氧代異二氫吲哚-4-基]甲基} (芐基氨基)甲酰胺。其它具體免疫調(diào)節(jié)化合物屬于在美國專利申請公開號2002/0045643、國際公開號 WO 98/54170和美國專利號6，395，7546中公開的一類異吲哚-酰亞胺，各專利和專利公開 物均通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式III 及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、溶劑化物、包合物、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、 外消旋體和立體異構(gòu)體的混合物，其中X禾口 Y中的一個是C = 0，且X和Y中的另一個是CH2或C = 0 ；R 是 H、或 CH20C0R，；(i)各Ri、R2、R3和R4彼此獨(dú)立地是鹵素、1至4個碳原子的烷基，或1至4個碳原 子的烷氧基，或(ii) R1、R2、R3或R4中一個是硝基或-NHR5，且R1、R2、R3或R4中其余的是氫；R5是氫、或1至8個碳原子的烷基；R6是氫、1至8個碳原子的烷基、苯基、氯、或氟；R，是 R7-CHRici-N (R8R9)；R7間-亞苯基、或?qū)?亞苯基、或-(CnH2n)-,其中η具有0至4的值；各R8和R9彼此獨(dú)立地是氫、或1至8個碳原子的烷基，或R8和R9結(jié)合在一起是四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2-,其中X1是-O-、-S-或-NH-；R10是氫、1至8個碳原子的烷基、或苯基；且*代表手性碳中心。其它代表性的化合物具有下式 其中 X禾口 Y中的一個是C = 0，且X和Y中的另一個是C = 0或CH2 ；(i)各Ri、R2、R3或R4彼此獨(dú)立地是鹵素、1至4個碳原子的烷基、或1至4個碳原 子的烷氧基，或(ii) R1、R2、R3和R4中的一個是-NHR5，且R1、R2、R3和R4中其余的是氫；R5是氫、或1至8個碳原子的烷基；R6是氫、1至8個碳原子的烷基、苯基、氯、或氟；R7是間-亞苯基、或?qū)?亞苯基、或-(CnH2n)-,其中η具有0至4的值；各R8和R9彼此獨(dú)立地是氫、或1至8個碳原子的烷基，或R8和R9結(jié)合在一起是四 亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中X1是-0-、-S-、或-NH-；R10是氫、1至8個碳原子的烷基、或苯基。其它代表性的化合物具有下式 其中X和Y中的一個是C = 0，且X禾口 Y中的另一個是C = 0或CH2 ；(i)各Ri、R2、R3和R4彼此獨(dú)立地是鹵素、1至4個碳原子的烷基、或1至4個碳原 子的烷氧基，或(ii) R1、R2、R3和R4中的一個是硝基或被保護(hù)的氨基，且R1、R2、R3和R4中其 余的是氫；且R6是氫、1至8個碳原子的烷基、苯基、氯、或氟；其它代表性的化合物具有下式 其中X禾口 Y中的一個是C = 0，且X和Y中的另一個是C = 0或CH2 ；(i)各Ri、R2、R3和R4彼此獨(dú)立地是鹵素、1至4個碳原子的烷基、或1至4個碳原 子的烷氧基，或(ii) R1、R2、R3和R4中的一個是-NHR5，且R1、R2、R3和R4中其余的是氫；R5是氫、1至8個碳原子的烷基、或CO-R7-CH(Riq) NR8R9,其中每個R7、R8、R9和Riq如 本文所定義；且R6是1至8個碳原子的烷基、苯基、氯、或氟。所述化合物的具體實(shí)例具有下式 其中X禾口 Y中的一個是C = 0，且X和Y中的另一個是C = 0或CH2 ；R6是氫、1至8個碳原子的烷基、芐基、氯或氟；R7是間-亞苯基、對-亞苯基、或-(CnH2n)-,其中η具有0至4的值；各R8和R9彼此獨(dú)立地是氫、或1至8個碳原子的烷基，或R8和R9結(jié)合在一起是四 亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2-,其中X1是-0-、-S-、或-NH-；且R10是氫、1至8個碳原子的烷基、或苯基。最優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)化合物是4-(氨基)-2- (2,6- 二氧代(3_哌啶基))-異二氫吲 哚-1，3- 二酮和3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2，6- 二酮。所 述化合物可以經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)的合成方法(參見例如美國專利號5，635，517，通過參考納入本文) 獲得。所述化合物可從 Celgene Corporation，Warren，NJ 獲得。4-(氨基)-2-(2，6-二氧
代(3-哌啶基))_異二氫吲哚-1，3-二酮具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu) 化合物3-(4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6_ 二酮具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu) 在另一實(shí)施方案中，具體免疫調(diào)節(jié)化合物包含3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異 口引哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的多晶型，例如晶型A、B、C、D、E、F、G和H，其公開在美國公 開號US 2005/0096351 Al中，該申請通過參考納入本文。例如，3_(4_氨基-1-氧代-1， 3- 二氫_異吲哚-2-基)_哌啶-2，6- 二酮的晶型A是可從非水溶劑系統(tǒng)獲得的非溶劑化 的結(jié)晶材料。晶型A的X射線粉末衍射圖包含在約8、14. 5、16、17. 5,20. 5、24和26度2 θ 處的顯著峰，和具有約270°C的差示掃描量熱法熔融溫度峰值。晶型A為弱吸濕性的或非 吸濕性的，且似乎是迄今為止發(fā)現(xiàn)的3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚-2-基)-哌 啶_2，6-二酮的熱力學(xué)最穩(wěn)定的無水晶型。3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6_ 二酮的晶型B是半 水合的結(jié)晶材料，其可以從各種溶劑系統(tǒng)中獲得，所述溶劑系統(tǒng)包括但不限于己烷、甲苯和 水。晶型8的乂射線粉末衍射圖包含在約16、18、22和27度2 9處的顯著峰，且其DSC曲 線在約146°C和268°C吸熱，所述約146°C和268°C溫度通過熱臺顯微鏡試驗(yàn)鑒定為脫水和 熔融溫度?；プ冄芯匡@示晶型B在水性溶劑系統(tǒng)中轉(zhuǎn)變成晶型E，且在丙酮及其它無水體系 中轉(zhuǎn)變成其它形式。3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6_ 二酮的晶型C是半 溶劑化的結(jié)晶材料，其可以從多種溶劑(例如但不限于丙酮)中獲得。晶型C的X射線粉 末衍射圖包含在約15. 5和25度2 θ處的顯著峰，和具有約269°C的差示掃描量熱法熔融溫 度峰值。晶型C在低于約85%的RH時是非吸濕性的，但可以在較高相對濕度下可轉(zhuǎn)變成晶 型B。3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6- 二酮的晶型D是從 乙腈和水的混合物中制備的結(jié)晶的、溶劑化的多晶型物。晶型D的X射線粉末衍射圖包含 在約27和28度2 θ處的顯著峰，且具有約270°C的差示掃描量熱法熔融溫度峰值。晶型D 為弱吸濕性的或非吸濕性的，但是當(dāng)在較高相對濕度下，其通常將轉(zhuǎn)變成晶型B。3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6_ 二酮的晶型E是二 水合的結(jié)晶材料，其可以通過將3-(4_氨基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2， 6_ 二酮在水中制漿并在具有約9 1比例的丙酮水的溶劑系統(tǒng)中緩慢蒸發(fā)3-(4_氨 基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2，6- 二酮而獲得。晶型E的X射線粉末 衍射圖包含在約20、24. 5和29度2 θ處的顯著峰，和具有約269°C的差示掃描量熱法熔融 溫度峰值。晶型E可以在丙酮溶劑系統(tǒng)中轉(zhuǎn)變成晶型C，且可在THF溶劑系統(tǒng)中轉(zhuǎn)變成晶型 G。在水性溶劑系統(tǒng)中，晶型E似乎是最穩(wěn)定的形式。對晶型E進(jìn)行的去溶劑化試驗(yàn)表明， 當(dāng)在約125°C加熱約五分鐘后，晶型E可以轉(zhuǎn)變成晶型B。當(dāng)在175°C加熱約五分鐘后，晶型 B可以轉(zhuǎn)變成晶型F。
3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6_ 二酮的晶型F是非 溶劑化的結(jié)晶物質(zhì)，其可以通過使晶型E脫水獲得。晶型F的X射線粉末衍射圖包含在約 19、19. 5和25度2 θ處的顯著峰，且具有約269°C的差示掃描量熱法熔融溫度峰值。3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6_ 二酮的晶型G是非 溶劑化的結(jié)晶物質(zhì)，其可以通過將晶型B和E在溶劑中制漿而獲得，所述溶劑例如但不限于 四氫呋喃(THF)。晶型G的X射線粉末衍射圖包含在約21、23和24. 5度2 θ處的顯著峰， 且具有約267°C的差示掃描量熱法熔融溫度峰值。
3- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚_2_基)-哌啶_2，6- 二酮的晶型H是部 分水合的(約0. 25摩爾)結(jié)晶材料，其可以通過將晶型E暴露于0%相對濕度而獲得。晶 型H的X射線粉末衍射圖包含在約15、26和31度2 θ處的顯著峰，且具有約269°C的差示 掃描量熱法熔融溫度峰值?？捎糜诒景l(fā)明提供的方法的其它具體免疫調(diào)節(jié)化合物包括但不限于1-氧 代-2- (2,6- 二氧代-3-氟哌啶-3-基)異二氫吲哚和1，3- 二氧代-2- (2,6- 二氧代-3-氟 哌啶-3-基)異二氫吲哚，例如在美國專利號5，874，448和5，955，476中描述的那些，各專 利通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式 其中Y為氧或H2，且各R1、R2、R3和R4彼此獨(dú)立地為氫、鹵素、1至4個碳原子的烷基、1至4個碳原子
的烷氧基，或氨基?？捎糜诒景l(fā)明提供的方法的其它具體免疫調(diào)節(jié)化合物包括但不限于在美國專利 號5，798，368中描述的四取代的2- (2,6- 二氧代-哌啶-3-基)-1-氧代異二氫吲哚，該專 利通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式 其中各R1、! 2、! 3和R4彼此獨(dú)立地為鹵素、1至4個碳原子的烷基、或1至4個碳原
子的烷氧基?？捎糜诒景l(fā)明提供的方法的其它具體免疫調(diào)節(jié)化合物包括但不限于在美國專利 號6，403，613中描述的1-氧代和1，3- 二氧代-2- (2,6- 二氧代哌啶-3-基)異二氫吲哚，
該專利通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式 其中Y 為氧或 H2,R1和R2中的第一個為鹵素、烷基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、氰基、或氨基甲 ?；琑1和R2中的第二個(獨(dú)立于第一個)是氫、鹵素、烷基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨 基、氰基、或氨基甲酰基，且R3為氫、烷基、或芐基。所述化合物的具體實(shí)例具有下式 其中R1和R2中的第一個為鹵素、1至4個碳原子的烷基、1至4個碳原子的烷氧 基、其中各烷基具有1至4個碳原子的二烷基氨基、氰基、或氨基甲?；?，R1和R2中的第二個(獨(dú)立于第一個)是氫、鹵素、1至4個碳原子的烷基、1至4個 碳原子的烷氧基、其中烷基具有1至4個碳原子的烷基氨基、其中各烷基具有1至4個碳原 子的二烷基氨基、氰基、或氨基甲酰基，且R3為氫、1至4個碳原子的烷基、或芐基。具體實(shí)例包括但不限于1-氧代_2-(2， 6- 二氧代哌啶-3-基)-4-甲基異二氫吲哚?？捎糜谠诒景l(fā)明提供的方法的其它化合物具有下式 其中R1和R2中的第一個為鹵素、1至4個碳原子的烷基、1至4個碳原子的烷氧 基、其中各烷基具有1至4個碳原子的二烷基氨基、氰基、或氨基甲?；?，R1和R2中的第二個(獨(dú)立于第一個)是氫、鹵素、1至4個碳原子的烷基、1至4個 碳原子的烷氧基、其中烷基具有1至4個碳原子的烷基氨基、其中各烷基具有1至4個碳原 子的二烷基氨基、氰基、或氨基甲?；?，且R3為氫、1至4個碳原子的烷基、或芐基?？捎糜诒景l(fā)明提供的方法的其它具體免疫調(diào)節(jié)化合物包括但不限于在美國專利號6，380，239和美國申請公開號2006/0084815中描述的在二氫吲哚環(huán)的4-或5-位發(fā)生 取代的1-氧代和1，3-二氧代異二氫吲哚，所述專利和專利公開物通過參考納入本文。代 表性的化合物具有下式 其中，指明為Cf的碳原子構(gòu)成手性中心(當(dāng)η不為零且R1與R2不同時)；X1和X2 中的一個為氨基、硝基、一至六個碳的烷基、或ΝΗ-Ζ，且X1或X2中的另一個為氫；各R1和R2 彼此獨(dú)立地是羥基或NH-Z ；R3是氫、一至六個碳的烷基、鹵素、或鹵代烷基；Z為氫、芳基、一 至六個碳的烷基、甲酰基、或一至六個碳的酰基；且η具有為0、1或2的值；條件是如果X1 是氨基，且η是1或2，則R1和R2不同時是羥基；及其鹽?？捎糜诒景l(fā)明提供的方法的進(jìn)一步的化合物具有下式 其中，當(dāng)η不是零且R1與R2不同時，指明為C*的碳原子構(gòu)成手性中心；X1和X2中 的一個是氨基、硝基、一至六個碳的烷基、或ΝΗ-Ζ，且X1或X2中的另一個是氫；各R1和R2彼 此獨(dú)立地是羥基、或NH-Z ；R3是一至六個碳的烷基、商素、或氫；Z是氫、芳基、或一至六個碳 的烷基或?；?；且η具有0、1或2的值。可用于本發(fā)明提供的方法的化合物的具體實(shí)例包括但不限于分別具有如下結(jié)構(gòu) 的2- (4-氨基-1-氧代-1，3- 二氫-異吲哚-2-基)-4-氨基甲?；∷岷?- (4-氨基-1-氧 代-1，3- 二氫-異吲哚-2-基)-4-氨基甲酰基-丁酸，及其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、 前藥和立體異構(gòu)體 其它代表性的化合物具有下式 其中，當(dāng)η不是零且R1與R2不同時，指明為C*的碳原子構(gòu)成手性中心；X1和X2中 的一個是氨基、硝基、一至六個碳的烷基、或ΝΗ-Ζ，且X1或X2中的另一個是氫；各R1和R2彼 此獨(dú)立地是羥基、或NH-Z ；R3是一至六個碳的烷基、商素、或氫；Z是氫、芳基、或一至六個碳 的烷基或?；?；且η具有0、1或2的值；及其鹽。具體實(shí)例包括但不限于分別具有如下結(jié)構(gòu)的4-氨基甲?；?4-{4_[(呋 喃-2-基-甲基)_氨基]-1，3- 二氧代-1，3- 二氫-異吲哚-2-基} - 丁酸、4-氨基甲酰 基-2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基}-丁酸、 2- {4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3- 二氧代-1，3- 二氫-異吲哚-2-基} -4-苯肌氨 基甲?；?丁酸、和2-{4-[(呋喃-2-基-甲基)-氨基]-1，3- 二氧代-1，3- 二氫-異吲 哚-2-基}_戊二酸，及其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、前藥和立體異構(gòu)體 所述化合物的其它具體實(shí)例具有下式 其中X1和X2中的一個是硝基、或ΝΗ-Ζ，且X1或X2中的另一個是氫；各R1和R2彼此獨(dú)立地是羥基、或NH-Z ；R3是一至六個碳的烷基、鹵素、或氫；Z是氫、苯基、一至六個碳的?；?、或一至六個碳的烷基；且
η具有0、1或2的值；條件是如果X1和X2中的一個是硝基，且η是1或2，則R1和R2不是羥基；和如果-COR2和-(CH2)n-COR1不同，指明為C*的碳原子構(gòu)成手性中心。其它代表性
的化合物具有下式 其中X1和X2中的一個是一至六個碳的烷基；各R1和R2彼此獨(dú)立地是羥基、或NH-Z ；R3是一至六個碳原子的烷基、鹵素、或氫；Z是氫、苯基、一至六個碳的?；⒒蛞恢亮鶄€碳的烷基；且η具有0、1或2的值；且如果-COR2和-(CH2)n-COR1不同，指明為C*的碳原子構(gòu)成手性中心。其它具體免疫調(diào)節(jié)化合物包括但不限于在美國專利號6，458，810中描述的在 2-位用2，6- 二氧代-3-羥基哌啶-5-基取代的異二氫吲哚-1-酮和異二氫吲哚-1，3- 二 酮，該專利通過參考納入本文。代表性的化合物具有下式 其中指明為*的碳原子構(gòu)成手性中心；X 是-C(O) _、或-CH2-；R1是1至8個碳原子的烷基、或-NHR3;R2是氫、1至8個碳原子的烷基、或鹵素；且R3 是氫，1至8個碳原子的烷基，未取代，或被1至8個碳原子的烷氧基、鹵素、氨基、或1至 4個碳原子的烷基氨基取代，3至18個碳原子的環(huán)烷基，苯基，未取代，或被1至8個碳原子的烷基、1至8個碳原子的烷氧基、鹵素、氨基、 或1至4個碳原子的烷基氨基取代，芐基，未取代，或被1至8個碳原子的烷基、1至8個碳原子的烷氧基、鹵素、氨基、 或1至4個碳原子的烷基氨基、或-COR4取代，其中
R4 是氫，1至8個碳原子的烷基，未取代，或被1至8個碳原子的烷氧基、鹵素、氨基、或1至 4個碳原子的烷基氨基取代，3至18個碳原子的環(huán)烷基，苯基，未取代，或被1至8個碳原子的烷基、1至8個碳原子的烷氧基、鹵素、氨基、 或1至4個碳原子的烷基氨基取代，或芐基，未取代，或被1至8個碳原子的烷基、1至8個碳原子的烷氧基、鹵素、氨基、 或1至4個碳原子的烷基氨基取代。本發(fā)明提供的化合物可以是商業(yè)購買的或根據(jù)在本文公開的專利或?qū)＠_物 中描述的方法制備。進(jìn)一步地，可以不對稱合成或者使用已知的拆分試劑或手形柱以及其 它標(biāo)準(zhǔn)合成有機(jī)化學(xué)技術(shù)拆分獲得光學(xué)純的化合物。各種免疫調(diào)節(jié)化合物包含一個或多個手性中心，且可以作為對映異構(gòu)體的外消 旋混合物或非對映異構(gòu)體的混合物存在。本發(fā)明涵蓋這些化合物的立體異構(gòu)純形式的用 途，以及這些形式的混合物的用途。例如，在本發(fā)明提供的方法和組合物中可以使用包含 等量或不等量特定免疫調(diào)節(jié)化合物的對映異構(gòu)體的混合物。這些異構(gòu)體可以是不對稱 合成的或者使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如手性柱或手性拆分劑拆分的。參見，例如Jacques，J.，等 人，Enantiomers, Racematesand Resolutions(ffiley-Interscience, New York,1981)； ffilen, S. H.等 人’ Tetrahedron 33 2725 (1977) ；Eliel, E. L. , Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,NY,1962)；禾口Wilen,S. H. ,Tables of Resolving Agents andOptical Resolutions p. 268(E. L. Eliel,Ed. ,Univ. of Notre Dame Press,NotreDame, IN,1972)。應(yīng)當(dāng)注意，如果圖示的結(jié)構(gòu)和給予該結(jié)構(gòu)的名稱之間存在差異，以圖示的結(jié)構(gòu)為 重。另外，如果結(jié)構(gòu)或一部分結(jié)構(gòu)的立體化學(xué)沒有用例如加粗線或虛線表示，則該結(jié)構(gòu)或部 分結(jié)構(gòu)應(yīng)當(dāng)解釋為包含其所有立體異構(gòu)體。5. 9. PINK細(xì)朐,、人胎盤灌洗液或、混合的自然殺傷細(xì)朐,的施用可以通過本領(lǐng)域已知適于施用活細(xì)胞的任何醫(yī)學(xué)可接受的途徑，將PINK細(xì)胞、人 胎盤灌洗液細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞、包含這些細(xì)胞的細(xì)胞群、或其組合施用至個體，例 如具有腫瘤細(xì)胞的個體，例如癌癥患者。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的細(xì)胞可以通過外 科手術(shù)植入、注射、輸注(例如經(jīng)由導(dǎo)管或注射器)、或以其它方式，直接或間接施用至需要 修復(fù)或加強(qiáng)的部位。在一個實(shí)施方案中，將所述細(xì)胞靜脈內(nèi)施用至個體。在另一實(shí)施方案 中，將所述細(xì)胞施用至個體的腫瘤(例如實(shí)體瘤)部位。在其中個體在超過一個部位具有 腫瘤的具體實(shí)施方案中，將所述細(xì)胞施用至至少兩個或所有的腫瘤部位。在某些其它實(shí)施 方案中，本發(fā)明提供的細(xì)胞或包含這些細(xì)胞的組合物被口服、鼻腔、動脈內(nèi)、腸胃外、眼內(nèi)、 肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、心室內(nèi)、腦室內(nèi)、鞘內(nèi)、腦池內(nèi)、脊椎內(nèi)和/或脊椎旁施用。在某些 具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞經(jīng)由帶有或者沒有泵裝置的顱內(nèi)或脊柱內(nèi)針和/或?qū)Ч苓f送。所述PINK細(xì)胞、人胎盤灌洗液細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞、或其組合，或包含這些 細(xì)胞的細(xì)胞群可以作為組合物(例如包含所述細(xì)胞的基質(zhì)、水凝膠、支架等)施用至個體。在一個實(shí)施方案中，將本發(fā)明提供的細(xì)胞接種在天然基質(zhì)(例如胎盤生物材料例如羊膜材料)上。這樣的羊膜材料可以是例如直接從哺乳動物胎盤解剖出的羊膜；經(jīng)固 定或熱處理的羊膜、基本上干燥(即< 20% H20)的羊膜、絨毛膜、基本上干燥的絨毛膜、基 本上干燥的羊膜和絨毛膜等?？梢栽谄渖辖臃N胎盤干細(xì)胞的優(yōu)選的胎盤生物材料描述在 Hariri的美國申請公開號2004/0048796中，該專利申請的全部公開內(nèi)容通過參考納入本 文。在另一實(shí)施方案中，將所述PINK細(xì)胞、人胎盤灌洗液細(xì)胞、混合的自然殺傷細(xì)胞、 或其組合，或包含這些細(xì)胞的細(xì)胞群懸浮在適于例如注射的水凝膠溶液中。用于這些組合 物的合適的水凝膠包含自組裝肽，例如RAD 16。在一個實(shí)施方案中，可允許包含所述細(xì)胞的 水凝膠溶液硬化，例如在模中硬化，以形成用于植入的、具有細(xì)胞分散在其中的基質(zhì)。也可 以培養(yǎng)這些基質(zhì)中的細(xì)胞，使得所述細(xì)胞在植入前有絲分裂擴(kuò)增。所述水凝膠可以是例如 有機(jī)聚合物(天然的或合成的)，其通過共價鍵、離子鍵、或氫鍵交聯(lián)以形成三維開放-晶格 結(jié)構(gòu)，其俘獲水分子形成凝膠。形成水凝膠的材料包含多糖，例如海藻酸及其鹽、肽、聚磷嗪 和聚丙烯酸酯，其通過離子交聯(lián)；或嵌段聚合物，例如聚氧化乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物， 其分別通過溫度或PH交聯(lián)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的水凝膠或基質(zhì)是可生物降解的。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述制劑包含原位可聚合的凝膠(參見，例如美國 專利申請公布 2002/0022676 ;Anseth 等人，J. Control Release, 78 (1-3) 199-209 (2002)； Wang 等人，Biomaterials, 24 (22) :3969_80 (2003))。在某些實(shí)施方案中，所述聚合物至少部分地可溶于水性溶液(例如水、緩沖鹽溶 液或水性醇溶液)中，所述聚合物具有帶電側(cè)基或其一價離子鹽。具有可以與陽離子反應(yīng) 的酸性側(cè)基的聚合物的實(shí)例為聚(磷腈)(p0ly(ph0sphazenes))、聚(丙烯酸)、聚(甲基 丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(乙酸乙烯酯)、和磺化聚合物例如磺化聚苯乙 烯。也可以使用通過丙烯酸或甲基丙烯酸和乙烯醚單體或聚合物反應(yīng)形成的具有酸性側(cè)基 的共聚物。酸性基團(tuán)的實(shí)例是羧酸基、磺酸基、鹵化(優(yōu)選氟化)醇基、酚0H基和酸性0H 基。本發(fā)明的胎盤干細(xì)胞或其共同培養(yǎng)物可以被接種在三維框架(framework)或支 架上，或植入體內(nèi)。這樣的框架可以與刺激組織形成或以其它方式加強(qiáng)或改善本發(fā)明實(shí)施 的任何一種或多種生長因子、細(xì)胞、藥物或其它組分聯(lián)合植入?？捎糜诒景l(fā)明的支架的實(shí)例包括無紡墊、多孔泡沫、或自組裝肽。無紡墊可以使 用由合成的易吸收的乙醇酸和乳酸的共聚物(例如PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc.， Somerville, N.J.)制成的纖維形成。也可以使用通過例如冷凍干燥或凍干等方法形成的 由例如聚(￡ “己內(nèi)酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物組成的泡沫(參見，例如美國專利 號6，355，699)作為支架。本發(fā)明的胎盤干細(xì)胞也可被接種在生理學(xué)可接受的陶瓷材料上或與其接觸，所 述生理學(xué)可接受的陶瓷材料包括但不限于磷酸一鈣、磷酸二鈣、磷酸三鈣、a -磷酸三鈣、
磷酸三鈣、和磷酸四鈣、羥基磷灰石、氟磷灰石、硫酸鈣、氟化鈣、氧化鈣、碳酸鈣、磷酸 鈣鎂、生物學(xué)活性玻璃例如BI0GLASS 及其混合物。目前市售的多孔生物相容性陶瓷材料 舌 SURG I BONE (CanMedica Corp. ， Canada)、END0B0N (Merck Biomaterial France, France)、CER0S (Mathys, AG, Bettlach, Switzerland)、和礦化的膠原骨移植產(chǎn)品例如 HEALOS(TM) (DePuy, Inc.，Raynham, MA)和 VIT0SS ，RHAK0SS R C0RT0SS (Orthovita,Malvern, Pa.)。所述框架可以是天然和/或合成材料的混合物、摻合物或復(fù)合物。在另一實(shí)施方案中，胎盤干細(xì)胞可被接種在氈上或與其接觸，所述氈可以是例如由生物可吸收材料(例如PGA、PLA、PCL共聚物或摻合物，或透明質(zhì)酸)制成的復(fù)絲組成。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的胎盤干細(xì)胞可被接種在泡沫支架上，所述泡沫支架 可以是復(fù)合結(jié)構(gòu)。可以將這樣的泡沫支架模壓成有用的形狀，例如待修復(fù)、替代或增強(qiáng)的一 部分體內(nèi)特定結(jié)構(gòu)的形狀。在某些實(shí)施方案中，例如用0. IM乙酸處理所述框架，接著在聚 賴氨酸、PBS和/或膠原中培養(yǎng)，之后接種本發(fā)明的細(xì)胞以增強(qiáng)細(xì)胞粘附?？梢酝ㄟ^如下方 法修飾基質(zhì)的外表面以改善細(xì)胞粘附或生長和組織分化，例如血漿_包涂基質(zhì)，或加入一 種或多種蛋白(例如膠原、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如硫酸肝素、軟骨 素-4-硫酸鹽、軟骨素-6-硫酸鹽、硫酸皮膚素、硫酸角蛋白等)、細(xì)胞基質(zhì)和/或其它材料 (例如但不限于明膠、海藻酸鹽、瓊脂、瓊脂糖和植物膠等)。在某些實(shí)施方案中，所述支架包含使其不形成血栓的材料，或經(jīng)所述材料處理。這 些處理和材料也可以促進(jìn)和維持內(nèi)皮生長、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)沉積。這些材料和處理的 實(shí)例包括但不限于天然材料，例如基底膜蛋白(例如層粘連蛋白和IV型膠原)、合成材料 (例如 EPTFE)、和分段的聚氨酯脲硅酮(例如 PURSPAN (The Polymer Technology Group, Inc.，Berkeley, Calif.))。所述支架也可以包含抗血栓形成劑，例如肝素；也可以在用胎 盤干細(xì)胞接種前，處理所述支架以改變表面電荷(例如用血漿包涂)。
6.實(shí)施例6. 1.實(shí)施例1 來自胎盤灌洗液禾Π臍帶血的胎盤Φ丨旬體自然殺傷細(xì)朐,的表征本實(shí)施例說明了來自人胎盤灌洗液的自然殺傷細(xì)胞的分離和培養(yǎng)。胎盤自然殺傷細(xì)胞的分離。使用CD56-偶聯(lián)的微珠，從8個單元的人胎盤灌洗液 (HPP)和4個單元的臍帶血(UCB)中分離自然殺傷細(xì)胞。通過磁珠選擇(Miltenyi Biotec) 進(jìn)行PINK細(xì)胞的分離。將分娩后的胎盤排血，并用約200至約750mL的灌洗溶液(0. 9% NaCl注射溶液，USP級(目錄號68200-804，VWR))灌洗。收集未處理的灌洗液，并處理以除 去紅細(xì)胞。用熒光激活細(xì)胞分類(FACS)緩沖液(RPMI 1640，不含酚紅，加入5% FBS)洗滌 來自HPP或UCB的單核細(xì)胞一次，然后以1500rpm離心6分鐘。計數(shù)細(xì)胞數(shù)量，將細(xì)胞沉淀 以107個總細(xì)胞/8(^1^緩沖液重懸，并加入2(^1^的0)31^(^(^63(18(目錄號130-050-101， Miltenyi)。均勻混合所述系統(tǒng)，并在4_8°C下培養(yǎng)15分鐘。向每IO7個總細(xì)胞加入l_2mL緩 沖液，然后以300g離心該混合物10分鐘。完全吸除上清液。將細(xì)胞沉淀重懸為IO8個細(xì)胞 /500 μ L緩沖液，并準(zhǔn)備進(jìn)行磁分離。將LS柱(Miltenyi Biotec)置于MIDIMACS 細(xì)胞分 離器(Miltenyi Biotec)的磁場中，用3mL的緩沖液洗滌所述柱，并將細(xì)胞/微珠懸浮液加 樣至所述柱。使用2X3mL的洗滌緩沖液，收集流過所述柱且包含自然殺傷細(xì)胞的未標(biāo)記的 CD3—細(xì)胞。計數(shù)CD3—細(xì)胞，洗滌一次，然后用CD56微珠(目錄號130-050-401，Miltenyi) 染色，并使用與上述CD3微珠分離相同的方案分離所述細(xì)胞。由此收集了 CD56+CD3—群并 用于進(jìn)一步分析。HPP中的自然殺傷細(xì)胞的百分比范圍為3. 52至11. 6 (中值6. 04，平均 5.22)，UCB中的自然殺傷細(xì)胞的百分比范圍為1.06至8.44(中值3.42，平均4. 2)。對 來自HPP的自然殺傷細(xì)胞的⑶56微珠選擇產(chǎn)生約80%純的群。參見圖1。在整個⑶56+、 ⑶3_自然殺傷細(xì)胞群中，來自HPP的⑶56+、⑶16—自然殺傷細(xì)胞(即PINK細(xì)胞)的百分比范圍為56. 6至87.2 (中值74. 2，平均65. 5)，來自UCB的CD56+、CD16"自然殺傷細(xì)胞(即PINK細(xì)胞)的百分比范圍為53. 7至96. 6 (中值72. 8)。來自HPP的CD56+，CD16+自然殺傷 細(xì)胞的百分比范圍為12. 8至43. 3 (中值25. 8，平均34. 5)，來自UCB的CD56+，CD16+自然殺 傷細(xì)胞的百分比范圍為3. 4至46. 3 (中值27. 3，平均33. 4)。在其它試驗(yàn)中，使用靶向人血細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原(⑶3、⑶4、⑶14、⑶19、⑶20、 ⑶36、⑶66b、⑶123、HLA-DR、血型糖蛋白A)的磁性陰性選擇試劑盒分離自然殺傷細(xì)胞。 將HPP和UCB低溫保存單元解凍，并按與解凍培養(yǎng)基(RPMI Media 1640 (目錄號22400， Gibco)和20%的熱滅活的胎牛血清(目錄號SH30070.03，Hyclone)) 1 1的比例稀釋，并 以1500rpm離心8分鐘。去除上清液，并用氯化銨處理以進(jìn)一步去除紅細(xì)胞；將各單元重 懸在約30mL冰冷的FACS緩沖液(RPMI 1640，不含酚紅，加入5 % FBS)中，接著加入60mL 冰冷的氯化銨(目錄號07850，Stem Cell)，渦旋所述溶液，然后在冰上培育5分鐘。然后， 用FACS緩沖液洗滌單核細(xì)胞3次，接著以1500rpm離心8分鐘。計數(shù)細(xì)胞數(shù)，將細(xì)胞沉淀 以5X IO7個活細(xì)胞/ml重懸在RoboS印緩沖液中(目錄號20104，Stem Cell)中，并向細(xì) 胞懸浮液中加入0. lmg/mL的DNA酶I溶液(目錄號07900，Stem Cell)，用移液器輕輕地 混合，并在室溫下培育15分鐘，之后分離。通過用40μπι目尼龍濾網(wǎng)(目錄號352340，BD Falcon)過濾，從所述細(xì)胞懸浮液中除去細(xì)胞團(tuán)，之后進(jìn)行分離。使用包括EasySep陰性選 擇人NK細(xì)胞富集雞尾酒和EasyS印磁微粒子的人NK細(xì)胞富集試劑盒(目錄號19055，Stem Cell)，用裝置 Robos印(目錄號 20000，Stem Cell)和程序“Human NK Negative Selection 19055and high recovert” (加入50 μ L/mL混合物，加入100 μ L/mL微粒子，培育10分鐘 和5分鐘，進(jìn)行1X2. 5分鐘的分離)進(jìn)行自動分離。由此收集⑶56+⑶3_群并用于進(jìn)一步 分析。自然殺傷細(xì)胞的擴(kuò)增。通常，如下擴(kuò)增自然殺傷細(xì)胞。基于Yssel等人， J. Immunol. Methods 72(1) 219-227 (1984)禾口 Litwin 等人，J. Exp. Med. 178(4) 1321-1326 (1993)中描述的方案的改進(jìn)，制備用于自然殺傷細(xì)胞培養(yǎng)的初始培養(yǎng)基。簡而言 之，初始培養(yǎng)基包含具有10% FCS(Hyclone)的IMDM(Invitrogen)，其包含以下終濃度的試 劑35 μ g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma-Aldrich)、5 μ g/ml 胰島素(Sigma-Aldrich)、2X ICT5M 乙醇 胺(Sigma-Aldrich)、1 μ g/ml 油酸(Sigma-Aldrich)、1 μ g/ml 亞油酸(Sigma-Aldrich)、 0. 2 μ g/ml 棕櫚酸(Sigma-Aldrich)、2· 5 μ g/ml BSA(Sigma-Aldrich)和 0. 1 μ g/ml 植物凝 集素(PHA-P，Sigma-Aldrich)。將CD56+CD;TNK細(xì)胞以2. 5 X IO5個活細(xì)胞/mL初始培養(yǎng)基 (加入200iu/mL的IL-2 (R&D Systems))重懸在細(xì)胞培養(yǎng)物處理的24孔板或T燒瓶中。將 絲裂霉素C-處理的異體PBMC和K562細(xì)胞(慢性粒性白血病細(xì)胞系)作為滋養(yǎng)細(xì)胞加入 到初始培養(yǎng)基中，最終濃度為lX106/mL。在5% CO2中，于37°C下，培養(yǎng)NK細(xì)胞5-6天。在 5-6天后，每3-4天向所述培養(yǎng)物中加入等體積的維持培養(yǎng)基(含有10% FCS,2% HumanAB 血清、抗生素、L-谷氨酰胺和400單位IL-2/mL的IMDM)。在第21天，收集NK細(xì)胞。來自胎盤的中間體自然殺傷細(xì)胞的表征。將供體匹配的HPP和CB解凍，用FACS緩 沖液(含有5%FBS&RPMI-1640)洗滌所述細(xì)胞。然后，按照制造商的說明，使用R0B0SEP 磁分離系統(tǒng)(StemCell Technologies)用CD56微珠富集自然殺傷細(xì)胞。用下述抗體(BD Bioscience，如果沒有另外說明的話)對CD56富集的自然殺傷細(xì)胞群進(jìn)行染色以進(jìn)行免 疫表型的表征偶聯(lián) PE-Cy-7 的抗-CD56、抗-CD3APC Cy7、抗-CD 16FITC、抗-NKG2D APC、抗-NKp46APC、抗-CD94PE (R&D)、抗-NKB1PE、和抗-KIR-NKAT2PE。在 NK 祖細(xì)胞中，NKG2D 和NKp46為不存在的標(biāo)記物，或顯示出表達(dá)減少，但在完全分化的NK細(xì)胞中存在NKG2D和 NKp46。參見Freud等人,“Evidence forDiscrete States of Human Natural Killer Cell Differentiation In Vivo", J. Exp. Med. 203(4) :1033_1043(2006) ；Eagle & Trowsdale， "Promiscuity and the SingleReceptor :NKG2D，，,Nature Reviews Immunology Published online, 2007 年 8 月 3 日；Walzer 等人，“Natural Killer Cells =From CD3"NKp46+to Post-GenomicsMeta-Analyses，，, Curr. Opinion Immunol. 19 :365_372 (2007)。如表 1 所不， 在來自HPP的富集的⑶56+細(xì)胞群和來自臍帶血(CB)的HLA-匹配的⑶56+細(xì)胞群之間， KIR3DL1、KIR2DL2/L3、NKG2D、NKp46 和 CD94 的表達(dá)沒有顯著地不同。表1.具有某些標(biāo)記物組合的NK細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。3個樣品的平均值。

6. 2.實(shí)施例2 來自混合的胎盤灌洗液和臍帶血的胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞的表 證混合臍帶血和胎盤灌洗液的供體匹配的單核細(xì)胞(混合體)，并用FACS緩沖液 (含有5 % FBS的RPMI-1640)洗滌一次，并使用表2中列出的抗體，在BDFACSCanto (BD Biosciences)上進(jìn)行免疫表型表征。用Flowjo軟件(Tree Star)分析數(shù)據(jù)。表2 在免疫表型表征中使用的抗體列表 胎盤NK細(xì)胞和外周血液(PB)NK細(xì)胞的免疫表型的表征。將NK細(xì)胞分成兩個主 要的組⑶56+⑶16+NK細(xì)胞和⑶56+⑶16-細(xì)胞。⑶56+⑶16+NK細(xì)胞具有大量溶細(xì)胞顆粒且高 度表達(dá)⑶16，因此，能夠激發(fā)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。相反，⑶56+⑶16_NK 細(xì)胞具有非常少的溶細(xì)胞顆粒，低水平表達(dá)或不表達(dá)CD16，但在活化時能夠生成細(xì)胞因子 和趨化因子。每種NK細(xì)胞顯示出活化和抑制受體的不同組合，所述受體包括殺傷免疫球蛋 白樣受體(KIR，例如KIR3DL1和KIR2DL2/3)、自然細(xì)胞毒性受體NCR (例如NKp30、NKp44和 NKp46)、殺傷細(xì)胞凝集素樣受體(KLR ；例如⑶94、NKG2D)、2B4和⑶226。使用針對特定NK受體的熒光偶聯(lián)的單克隆抗體對胎盤NK和外周血液NK細(xì)胞進(jìn) 行FACS分析。在表征的11個NK亞組中，在胎盤NK和外周血液NK細(xì)胞之間，11個NK亞 組的七個亞組(CD3TD56+CD16\ CD3XD56+CD16+、CD3TD56+KIR2DL2/3+、CD3TD56+NKp46+、 CD3_CD56+NKp30+、CD3_CD56+2B4+、和 CD3_CD56+CD94+)中的細(xì)胞數(shù)顯示出顯著性差異(ρ < 0. 05)(相當(dāng)于64%的差異)(表3Α;也可參見表3Β和3C)。表3Α.在16個單元的混合的供體-匹配的臍帶血和人胎盤灌洗液(混合體)和 13個單元的外周血液(PB)中CD3—CD56+NK細(xì)胞的表型表征。使用雙樣本t_檢驗(yàn)來確定胎 盤和外周血液單位中的群均值是否相等。
表3B和3C顯示了獨(dú)立的試驗(yàn)中，在16個單元的混合的供體-匹配的臍帶血和人 胎盤灌洗液(混合體)和13個單位的外周血液(PB)中的⑶3_CD56+D16_和⑶3TD56+D16+NK 細(xì)胞的表型表征。表 3B 表 3C 60. 9 %的胎盤NK細(xì)胞是⑶56+CD16—(來自胎盤的中間體自然殺傷(PINK)細(xì)
胞)，而僅僅21.4%的外周血液NK細(xì)胞是⑶56+⑶16_的。在培養(yǎng)21天后，在胎盤和外周
血液NK細(xì)胞之間，11個NK亞組中的四個亞組(⑶3TD56+KIR2DL2/3+、⑶3TD56+NKp46+、
CD3XD56+NKp44+和CD3XD56+NKp30+)的百分比顯示出顯著性差異(ρ < 0. 05)(表4)。表4來源于12個單元的混合的供體_匹配的臍帶血和人胎盤灌洗液(混合體)
和9個單元的外周血液(PB)的21天培養(yǎng)的NK細(xì)胞的表型表征。使用雙樣本t-檢驗(yàn)來確
定組合和外周血液單位中的群均值是否相等。 另外，在獨(dú)立試驗(yàn)中確定，在培養(yǎng)21天后，胎盤和外周血液NK細(xì)胞表現(xiàn)出獨(dú)特的 細(xì)胞因子特征，特別是對于IL-8，如通過Luminex所測定(表5)。表 5 胎盤NK細(xì)胞和外周血液NK細(xì)胞的微小RNA表征。使用MIRVANA miRNA分離試劑 盒(Ambion,目錄號1560)從分離的或擴(kuò)增的NK細(xì)胞制備微小RNA(miRNA)。NK細(xì)胞(0. 5至1.5 X IO6個細(xì)胞)在變性的裂解緩沖液中裂解。接著，對樣品進(jìn)行酸-苯酚+氯仿抽提 以分離高度富集小RNA的RNA。加入100%的乙醇以使樣品含有25%的乙醇。當(dāng)該裂解產(chǎn) 物/乙醇混合物穿過玻璃纖維濾器時，大的RNA無法移動，而小RNA被收集在濾液中。然 后，將濾液的乙醇濃度增加至55%。使該混合物穿過第二個玻璃纖維濾器，在此，小RNA變 得無法移動。洗滌該RNA若干次，用低離子強(qiáng)度溶液洗脫。通過測量其在260和280nm的 吸光度來測定回收的小RNA的濃度和純度。表6中顯示了被發(fā)現(xiàn)是PINK細(xì)胞所特有的miRNA。發(fā)現(xiàn)一種miRNA(命名為 hsa-miR-199b)是外周血液NK細(xì)胞所特有的。表6.經(jīng)由qRT-PCR對piNK細(xì)胞和PB NK細(xì)胞的miRNA表征 經(jīng)培養(yǎng)的胎盤NK細(xì)胞和未培養(yǎng)的NK細(xì)胞的免疫表型的表征。通過大量免疫表型 研究和細(xì)胞毒性試驗(yàn)來評價經(jīng)培養(yǎng)的PINK細(xì)胞的整體性質(zhì)。為了測定擴(kuò)增的NK細(xì)胞的表 型，分析了 NK受體(NKR)例如KIR、NKG2D、NKp46、NKp44、和2B4的表達(dá)。通過用PKH26標(biāo) 記腫瘤細(xì)胞(K562細(xì)胞)，然后將其與PINK細(xì)胞共同培養(yǎng)4小時來進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。從 第0天至第21天，離620的表達(dá)從60.9% 士4. 8%增加至86% 士 17. 4% (p值為0. 024)； NKp46 的表達(dá)從 10. 5% 士5. 4%增加至 82. 8% ±9. 0% (p 值為 0. 00002) ；NKp44 的表達(dá)從 9. 6% 士6. 5%增加至 51. 6% ±27. 5% (p 值為 0. 022)；且 2B4 的表達(dá)從 13. 0% 士7. 減 少至0.65% 士 0.5% (p值為0.009% )(表7)。在這些培養(yǎng)條件下，在21天的擴(kuò)增期間， 抑制性KIR，包括KIR3DL1 (殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體，三個結(jié)構(gòu)域，長胞質(zhì)尾1，抑制性受 體)和KIR2DL2/L3(殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體，兩個結(jié)構(gòu)域，長胞質(zhì)尾2和長胞質(zhì)尾3 ；抑 制性受體)保持不受影響。NKR表達(dá)的變化進(jìn)一步與針對K562細(xì)胞的溶細(xì)胞活性在第21 天相比于第14天的顯著增加相關(guān)(63% 士 15%對45% 士4%，p值為0.0004)。這些發(fā)現(xiàn) 帶來了對NK細(xì)胞中與NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性密切相關(guān)的推定標(biāo)記物的鑒別。表7.在21天培養(yǎng)前后piNK細(xì)胞的表型表征。計算了 5個供體的群均值的標(biāo)準(zhǔn) 偏差(Stdev)。
用基于脂質(zhì)的蛋白固定技術(shù)和線性離子俘獲LC/MS對經(jīng)培養(yǎng)的胎盤NK細(xì)胞和經(jīng) 培養(yǎng)的外周血液NK細(xì)胞的膜蛋白組學(xué)進(jìn)行表征。膜蛋白純仆,在細(xì)胞裂解之前，將培養(yǎng)21 天的來自混合的胎盤灌洗液和臍帶血細(xì)胞的胎盤自然殺傷細(xì)胞及PB的NK細(xì)胞與蛋白酶 抑制劑混合物溶液(P8340，SigmaAldrich, St. Louis, M0 ；包含4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟 (AEBSF)、胃酶抑素A、E-64、抑氨肽酶素b、亮肽素和抑酶肽，不含金屬螯合劑)培育15分 鐘。然后，通過加入10mM HC1溶液而不加入去污劑，裂解所述細(xì)胞，并且以400g離心10分 鐘至沉淀，并除去細(xì)胞核。將去核后的上清液轉(zhuǎn)移到超離心管中，并且以100，000g在具有 T-1270 轉(zhuǎn)子的 WX80 超離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific,Asheville,NC)上離心 150 分 鐘，產(chǎn)生膜蛋白沉淀。蛋白脂質(zhì)體的生成、固定和消化使用NAN0XIS 緩沖液(10mM Tris,300mM NaCl， pH 8)洗滌所述膜蛋白沉淀若干次。將膜蛋白沉淀懸浮在1.5mLNAN0XIS 緩沖液中，并在 冰上使用 VIBRA-CELL (TM) VC505 超聲處理器(Sonics & Materials，Inc.，Newtown, CT)尖 端超聲20分鐘。通過用FM1-43染料染色(Invitrogen, Carlsbad, CA)和用熒光顯微鏡 觀察來測定所述蛋白脂防體的大小。通過BCA試驗(yàn)(Thermo Scientific)來確定所述蛋 白脂質(zhì)體懸浮液的蛋白濃度。然后，使用標(biāo)準(zhǔn)移液器吸頭將該蛋白脂質(zhì)體注射至LPI(TM) FlowCell(Nanoxis AB, Gothenburg, Sweden)上，使其無法移動1小時。在無法移動后，進(jìn) 行一系列洗滌步驟，將胰蛋白酶(Princeton Separations,Adelphi,NJ)以5 y g/ml直接注 射至LPI(TM)Flow Cell上。在37°C下，培養(yǎng)小片過夜。之后，從該小片洗脫胰蛋白酶消化 后的肽，然后使用 S印-Pak 柱(WatersCorporation，Milford，MA)脫鹽。強(qiáng)陽離子交換(SCX)分餾將胰蛋白酶消化后的肽重新配制在0. 的甲酸/水 溶液中，并加樣至強(qiáng)陽離子交換(SCX)TOP-TIP 柱(PolyLC, Columbia, MD)上，用30iim的polysufoETHYL aspartamide SCX填充材料裝填移液器吸頭。使用甲酸銨緩沖液，pH 2.8(10mM-500mM)的階躍梯度從SCX TOP TIP 洗脫肽。使用speed-vac系統(tǒng)干燥各SCX餾 分，并用5%的乙腈、0. 的甲酸重配以準(zhǔn)備用于下游LC/MS分析。LTQ線件離子俘獲LC/MS/MS分析使用180分鐘的梯度(緩沖液A 水，0. 1 %甲 酸；緩沖液 B 乙腈，0. 甲酸)，在 0. 2讓X15(kim 3 y m 的200A MAGIC C18 柱(Michrom Bioresources,Inc. , Auburn, CA)上分離各SCX餾分，所述柱直接連接到軸向去溶劑化真空 輔助納米毛細(xì)電噴霧電離(ADVANCE)源(Michrom Bioresources，Inc.)。所述ADVANCE源 達(dá)到了與常規(guī)納米ESI相當(dāng)?shù)撵`敏度，但其以相對較高的流速3 u L/分鐘運(yùn)行。在LTQ線 性離子阱質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)上分析洗脫的肽，所述質(zhì)譜儀 在每次全掃描質(zhì)譜后進(jìn)行十次數(shù)據(jù)依賴性的MS/MS掃瞄。牛物信息學(xué)在SORCERER S0L0 工作站(Sage-N Research, San Jose,CA)上使 用SEQUEST算法工具，在IPI人類數(shù)據(jù)庫中對六個原始文件(對應(yīng)于從各腫瘤細(xì)胞系(AML， CML)收集的6種鹽餾分)進(jìn)行單次檢索。規(guī)定肽質(zhì)量允差為1.2amu，規(guī)定甲硫氨酸的氧化 為差異修飾(differential modification)，且規(guī)定氨基甲酰基甲基化為靜態(tài)修飾(static modification)。使用 Trans-Proteomic Pipeline (TPP)的 Scaffold 軟件工具來整理和解 析膜蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。如果蛋白被確定為95%肽概率、95%蛋白概率和1個特有的肽，則進(jìn) 行蛋白分析。使用公司內(nèi)部研發(fā)的常規(guī)Perl程序進(jìn)行膜蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集之間的比較。分析顯示，相對于從外周血液NK細(xì)胞鑒定出的膜蛋白，從經(jīng)培養(yǎng)的胎盤NK細(xì)胞鑒 定出的8個膜蛋白是特有的。參見表8。進(jìn)一步，相對于經(jīng)培養(yǎng)的胎盤NK細(xì)胞，從外周血液 NK細(xì)胞鑒定出特有的8個膜蛋白。參見表8。發(fā)現(xiàn)僅有10個鑒定出的膜蛋白是經(jīng)培養(yǎng)的 胎盤NK細(xì)胞和外周血液NK細(xì)胞共有的。表8 6. 3.實(shí)施例3 自然殺傷細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒件 該實(shí)施例證實(shí)了胎盤中間體自然殺傷細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性。如在細(xì)胞毒性 試驗(yàn)和NK細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌Luminex分析中所證實(shí)的，來自HPP的PINK細(xì)胞對急性髓 性白血病細(xì)胞有細(xì)胞毒性。在細(xì)胞因子分泌試驗(yàn)中，將來自HPP的⑶56微珠富集的NK細(xì)胞與KG-Ia急性髓 性白血病細(xì)胞按照1 1的比例混合。在培養(yǎng)24小時后，收集上清液，并對其進(jìn)行IFN-γ 和GM-CSF分泌的Luminex分析。如圖2所示，在將CD56-富集的HPP細(xì)胞與KG-Ia細(xì)胞共 同培養(yǎng)24小時后，觀察到IFN- γ和GM-CSF的水平增加。PINK細(xì)胞的細(xì)胞毒性在使用PINK細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記靶 腫瘤細(xì)胞。CFSE是一種對細(xì)胞無毒的活體染料，且其在細(xì)胞分裂期間可分配至子細(xì)胞中。 隨后將所述細(xì)胞置于96-孔U型底組織培養(yǎng)板中，并在補(bǔ)充了 10% FBS的RPMI 1640中， 按照20 UlO 1、5 1和1 1的效應(yīng)細(xì)胞-靶細(xì)胞(E T)比例，將所述細(xì)胞與新 鮮分離的CD56+CD16—PINK細(xì)胞共同培養(yǎng)。在4小時的培養(yǎng)時間之后，收集細(xì)胞，并通過流式 細(xì)胞術(shù)檢測CFSE的存在。使用從不含NK細(xì)胞的培養(yǎng)物中回收的靶細(xì)胞數(shù)作為參考。細(xì)胞 毒性定義為(I-CFSEtis/CFSEwm) X 100%。在20 1比例觀察到顯著的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒 性。參見圖3。腫瘤細(xì)胞對經(jīng)培養(yǎng)的PINK細(xì)胞的易感性乳酸脫氫酶(LDH)-釋放試驗(yàn)。使用CYT0T0X 96 細(xì)胞毒性比色試驗(yàn)試劑盒 (Promega,目錄號G1780)進(jìn)行該LDH-釋放試驗(yàn)。在該試驗(yàn)中，經(jīng)培養(yǎng)的NK細(xì)胞(包含 源自匹配的HPP/UCB的⑶56+CD16—細(xì)胞和⑶56+⑶16+細(xì)胞的組合)為效應(yīng)細(xì)胞，腫瘤細(xì) 胞為靶細(xì)胞。將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞置于96-孔U型底組織培養(yǎng)板中，并在補(bǔ)充了 2 %人 AB 血清(Gemini，目錄號 100-512)的不含酚紅的 100 μ 1 RPMI 1640 (Invitrogen,目錄號 11835-030)中，按照各種效應(yīng)細(xì)胞-靶細(xì)胞(E T)比例進(jìn)行培養(yǎng)。在5% CO2中，于37°C 培育培養(yǎng)物4小時。在培育后，將50 μ 1上清液轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中，按照制造商的要求檢測 LDH活性，并在ELISA讀板儀(Synergy HT, Biotek)中測量在490nm的吸收。根據(jù)下述等 式計算細(xì)胞毒性程度％細(xì)胞毒性=(樣品-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)的-靶細(xì)胞自發(fā)的)/(靶細(xì)胞 的最大值-靶細(xì)胞自發(fā)的)X100。某些腫瘤類型可較其它腫瘤類型對NK細(xì)胞更具響應(yīng)性。為了分析腫瘤細(xì)胞對培 養(yǎng)的PINK細(xì)胞的易感性，在LDH釋放試驗(yàn)中，分析與PINK細(xì)胞共同培養(yǎng)的十二種不同腫 瘤細(xì)胞系。所述12種腫瘤細(xì)胞系包括人慢性髓性白血病(CML)、淋巴瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤 (RB)、和多發(fā)性骨髓瘤(MM)(表9)。在共同培養(yǎng)4小時后，通過LDH釋放試驗(yàn)來測量NK細(xì) 胞的細(xì)胞毒性。表9. ATCC腫瘤細(xì)胞系
0422] 按照10 1的效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞(E T)比例，觀察到經(jīng)培養(yǎng)的PINK細(xì)胞對以 下細(xì)胞具有顯著細(xì)胞毒性對K562細(xì)胞(CML)為88. 6% 士5. 6% ；對U937細(xì)胞(淋巴瘤) 為 89. 2% 士 9. 8%;對 TORI-RB-1 細(xì)胞(RB)為 73. 3% 士 11. 8%;對 RPMI8226 細(xì)胞(MM)為 61. 3% 士 1.3% ；和對 U266 細(xì)胞(MM)為 57. 4% 士4. 7% (表 10)。表10.腫瘤細(xì)胞對經(jīng)培養(yǎng)的PINK細(xì)胞的差異易感性。計算3個供體的平均細(xì)胞 毒性的平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差(S. E. M.)。
用來那度胺和Pomalidomide處理增強(qiáng)了 PINK細(xì)胞的細(xì)胞毒性RNA的分離和純化。使用RNAQUEOUS -4PCR試劑盒(Ambion，目錄號AM1914)從 分離的或擴(kuò)增的NK細(xì)胞制備RNA。簡言之，在胍鹽裂解溶液中裂解NK細(xì)胞(0. 5至1. 5X106 個細(xì)胞)。隨后將樣品裂解物與乙醇溶液混合，并使其通過基于二氧化硅的濾器，該濾器選 擇性地和定量地結(jié)合mRNA和更大的核醣體RNA ；而不定量結(jié)合非常小的RNA，例如tRNA和 5S核糖體RNA。隨后洗滌濾器以除去殘留的DNA、蛋白及其它污染物，用包含痕量EDTA(用 于螯合重金屬)而不含核酸酶的水洗脫RNA。將二氧化硅濾器放在小柱中，將該小柱安裝到 由試劑盒提供的不含RNase的微離心管中。通過離心或真空壓力使樣品裂解物、洗滌溶液 和洗脫溶液通過所述濾器。在從濾器洗脫后，用所述試劑盒提供的超高純的DNase 1處理 RNA，以除去痕量的DNA。最后，通過也由所述試劑盒提供的試劑除去DNase和二價陽離子。 通過測定其在260nm和280nm的吸光度來確定回收的RNA的濃度和純度。定量實(shí)時(q RT-PCR)分析?？蓪⒎蛛x的RNA用于使用TAQMAN 反轉(zhuǎn)錄試劑 (Applied Biosystems,目錄號N8080234)的cDNA合成，隨后使用人免疫陣列(Applied Biosystems,目錄號 4370573)和人微小 RNA 陣列(AppliedBiosystems,目錄號 4384792)通 過7900HT快速實(shí)時PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時PCR分析。來那度胺和pomalidomide是沙立度胺的化學(xué)類似物，其具有增強(qiáng)的抗癌和抗炎 活性。為了研究來那度胺和pomalidomide是否可以增強(qiáng)PINK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，用來那度 胺或pomalidomide預(yù)處理離體培養(yǎng)的(第19天)PINK細(xì)胞，接著將所述細(xì)胞與靶標(biāo)結(jié)腸 直腸癌細(xì)胞系HCT-116共同培養(yǎng)。經(jīng)來那度胺處理的NK細(xì)胞表現(xiàn)出42. 的細(xì)胞毒性，經(jīng) pomalidomide處理的NK細(xì)胞顯示出47. 4%的細(xì)胞毒性，而作為對照的未經(jīng)處理的PINK細(xì)
65胞僅僅顯示出24. 3%的細(xì)胞毒性。定量實(shí)時PCR(qRT-PCR)和流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，pomalidomide激發(fā)的NK細(xì)胞細(xì) 胞毒性的增強(qiáng)與粒酶B (GZMB)的基因表達(dá)增加(增加60% 士 1. 7% )(表11)和GZMB-陽性 NK細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)增加(增加25%)有關(guān)。另外，在經(jīng)來那度胺(增加232% 士 1.6%)和 pomalidomide (增加396% 士0. 3 處理的PINK細(xì)胞中，GM-CSF的表達(dá)增加(表11A、 11B)。表11A，11B.與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，經(jīng)來那度胺和pomalidomide處理的培養(yǎng)的 PINK細(xì)胞的qRT-PCT分析。IlA 對于所列基因，經(jīng)來那度胺處理的和未經(jīng)來那度胺處理的 樣品之間基因表達(dá)的倍數(shù)變化。使用配對t-檢驗(yàn)來確定在經(jīng)來那度胺處理的和未經(jīng)來那 度胺處理的樣品中的倍數(shù)變化是否相等。IlB 對于所列25個基因，經(jīng)pomalidomide處理 的和未經(jīng)pomalidomide處理的樣品之間基因表達(dá)的倍數(shù)變化。使用配對t_檢驗(yàn)來確定在 經(jīng)處理的和未經(jīng)處理的樣品中的變化倍數(shù)是否相等。表 IlA BAX-BCL2-相關(guān) X 蛋白CCL5-趨化因子(C-C基序)配體5
CCR5-趨化因子(C-C基序)受體5CSF2-集落刺激因子2 (粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞)
FAS-TNF受體超家族，成員6⑶SB-葡糖醛酸糖苷酶3IL2RA-Q白細(xì)胞介素2受體TNFRSF18-腫瘤壞死因子受體超家族，成員18表 11B ACTB-3-肌動蛋白BAX-BCL2-相關(guān) X 蛋白CCL2-趨化因子(C-C基序)配體2CCL3-趨化因子(C-C基序)配體3CCL5-趨化因子(C-C基序)配體5CCR5-趨化因子(C-C基序)受體5CSF1-集落刺激因子1 (巨噬細(xì)胞)CSF2-集落刺激因子2 (粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞)ECE11-內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶1FAS-TNF受體超家族，成員6GNLY-粒溶素⑶SB-葡糖醛酸糖苷酶_ 3GZMB-粒酶B (粒酶2，細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞-相關(guān)絲氨酸酯酶1)ILIA-a白細(xì)胞介素1IL2RA-白細(xì)胞介素2受體-aIL8-白細(xì)胞介素8IL10-白細(xì)胞介素10LTA-淋巴細(xì)胞毒性a (TNF超家族，成員1)PRF1-穿孔素1(成孔蛋白)
PTGS2-前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶2 (前列腺素G/H合成酶和環(huán)氧合酶)SKI-v-ski肉瘤病毒癌基因同系物(鳥類的)TBX21-T-box 21混合的自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性在獨(dú)立的細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，經(jīng)培養(yǎng)的來源于供體匹配的臍帶血和胎盤灌洗液的NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，而腫瘤細(xì)胞為靶細(xì)胞。用PKH26 (Sigma-Aldrich目錄號PKH26-GL)標(biāo)記腫 瘤細(xì)胞(參見，例如 Lee-MacAry 等人，J. Immunol. Meth. 252(1-2) :83_92 (2001))，PKH26 由 于其親脂性脂肪族殘基而插入到細(xì)胞質(zhì)膜中，隨后將所述腫瘤細(xì)胞置于96-孔U型底組織 培養(yǎng)板中，在200 μ 1補(bǔ)充了 10% FBS的RPMI 1640中，按照各種效應(yīng)細(xì)胞-靶細(xì)胞(Ε Τ) 比例，與經(jīng)培養(yǎng)的NK細(xì)胞共同培養(yǎng)。在5% CO2中，于37°C培育該培養(yǎng)物4小時。在培育 后，收集細(xì)胞，并將T0-PR0-3 (Invitrogen目錄號T3605)，一種膜不可滲透的DNA染色劑，力口 入到培養(yǎng)物中至最終濃度為1 μ Μ,隨后使用BD FACSCanto進(jìn)行FACS分析。細(xì)胞毒性可以 表示為死細(xì)胞(PKH26+T0-PR0-3+)在全部ΡΚΗ26+靶腫瘤細(xì)胞內(nèi)的百分?jǐn)?shù)。在該細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，用ΡΚΗ26標(biāo)記人慢性髓細(xì)胞樣淋巴瘤(CML)Κ562細(xì)胞， ΡΚΗ26插入到細(xì)胞質(zhì)膜中，并將所述Κ562細(xì)胞置于96-孔U型底組織培養(yǎng)板中。在補(bǔ)充了 10% v/v FBS的RPMI 1640中，按照10 1、5 1,2. 5 1和1. 25 1的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì) 胞(Ε Τ)比例，將培養(yǎng)了 21天的胎盤(混合體)或外周血液NK細(xì)胞與Κ562細(xì)胞混合。 在4小時的培育時間后，收集細(xì)胞，將T0-PR0-3加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中，接著用流式細(xì)胞術(shù)測 定ΡΚΗ26和T0-PR0-3的存在。細(xì)胞毒性表示為PKH26+T0-PR0-3+死細(xì)胞在全部ΡΚΗ26+靶 腫瘤細(xì)胞內(nèi)的百分?jǐn)?shù)。在測試的所有E T比例下，胎盤NK細(xì)胞和外周血液NK細(xì)胞都顯 示出對Κ562細(xì)胞的明顯毒性(圖4)。在兩個E T比例(10 1和5 1)下，觀察到胎 盤NK細(xì)胞對Κ562細(xì)胞的毒性顯著高于外周血液NK細(xì)胞對Κ562細(xì)胞的毒性(圖4)。6. 4.實(shí)施例4 人胎盤灌洗液對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性本實(shí)施例證實(shí)了人胎盤灌洗液細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，且來自HPP的所有 有核細(xì)胞(TNC-HPP)對KG-Ia的細(xì)胞毒性高于來自匹配的UCB的TNC的細(xì)胞毒性。將來 自HPP或臍帶血(UCB)的所有有核細(xì)胞與KG-Ia細(xì)胞按照1 1、5 UlO 1,20 1 或100 1的比例混合。在培育24小時或48小時后，收集細(xì)胞，并通過FACS分析(BD FACSCanto,BD Bioscience)檢測CFSE的存在。使用單獨(dú)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞作為對照。細(xì)胞 毒性定義為(l-CFSE樣s/CFSE對照)X100%。在100 1的比例下，顯示出顯著的細(xì)胞毒性。 參見圖5。在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，比較來自HPP的所有有核細(xì)胞的細(xì)胞毒性與來自臍帶血的所有 有核細(xì)胞的細(xì)胞毒性。按照 0.78 1,1. 56 1,3. 12 1,6. 25 1,12. 5 1、25 1、 50 1或100 1的比例，將匹配的TNC-HPP或UCB與KG-Ia細(xì)胞混合。在所有比例下， TNC-HPP始終顯示出較UCB更高的細(xì)胞毒性。參見圖6。在另一實(shí)驗(yàn)中，在與KG-Ia細(xì)胞培育24小時之前，用100U/mL或1000U/mL的IL-2 刺激TNC-HPP，同時使用RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)的HPP作為對照。在6. 25NK細(xì)胞/KG-Ia細(xì)胞及 以上的比例下，IL-2似乎增強(qiáng)了 TNC-HPP的細(xì)胞毒性。參見圖7。如表12所示，使用更廣泛的腫瘤細(xì)胞類型，使用5 X IO5個HPP細(xì)胞和1 X IO4個腫
瘤細(xì)胞重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。
表12 用來測量胎盤灌洗液細(xì)胞毒性作用的腫瘤細(xì)胞 當(dāng)按照50 1的比例共同培養(yǎng)HPP細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞24小時或48小時后，HPP細(xì) 胞顯示出對腫瘤細(xì)胞的明顯毒性。對于這兩個時間段，共同培養(yǎng)都引起超過50%的腫瘤細(xì) 胞死亡。參見圖8A和8B。6. 5.實(shí)施例5 人胎盤灌洗液細(xì)胞在暴露于腫瘤細(xì)胞期間細(xì)胞因子的牛成為了確定負(fù)責(zé)介導(dǎo)HPP細(xì)胞的抗白血病作用的主要作用機(jī)制，使用多重Luminex 試驗(yàn)，在不同時間點(diǎn)對與腫瘤細(xì)胞系共同培養(yǎng)的HPP細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放特征進(jìn)行了分 析，并將其與UCB細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放特征進(jìn)行了比較。對培養(yǎng)后收集的上清液進(jìn)行Luminex試驗(yàn)，以確定IFN- y、TNF- a和GM-CSF (目 錄號HCYT0-60K-03，MillipOre)的濃度。這三種細(xì)胞因子與NK細(xì)胞毒性有關(guān)(參見，例如 Imai 等人，Blood 2005. 106(1) :376_83)。使用 AppliedBiosystems FAST 7900HT 儀器和引物，進(jìn)行定量RT-PCR，以檢測IFN- y ,TNF- α和GM-CSF的表達(dá)。培養(yǎng)條件與上述的共同 培養(yǎng)細(xì)胞毒性試驗(yàn)的條件相同。使用Luminex試驗(yàn)來確定細(xì)胞因子的濃度。確定與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)的HPP細(xì)胞對IFN-γ、TNF- α和GM-CSF的分泌顯著 地高于UCB細(xì)胞的分泌。在一個實(shí)驗(yàn)中，在存在或不存在100U的IL-2的情況下，按照 0. 78 1,1. 56 1,3. 12 1,6. 25 1,12. 5 1、25 1、50 1 或 100 1 的比例，將 HPP細(xì)胞與KG-Ia細(xì)胞混合。與不存在IL-2相比，在IL-2的存在下，TNC-HPP顯示出IFN-γ 生成的持續(xù)增加。確定在24小時，IFN- γ的水平增加了約5-26倍(中值16倍)；在48 小時，增加了約3-65倍(中值27倍)，其與細(xì)胞毒性研究得到的結(jié)果一致。參見圖9。在另一個實(shí)驗(yàn)中，在與KG-Ia細(xì)胞培育24小時之前，用100U/mL或1000U/mL IL-2 刺激TNC-HPP，同時使用RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)的HPP作為對照。在與KG-Ia細(xì)胞共同培育之前， 在存在或不存在IL-2的情況下，培養(yǎng)HPP或匹配的UCB細(xì)胞24小時。在與K562和KG-Ia 共同培養(yǎng)48小時的HPP細(xì)胞中，IFN- γ的分泌增加最多。當(dāng)用100U/ml IL-2處理HPP細(xì) 胞時，在第24小時和48小時，HPP細(xì)胞對KG-Ia的細(xì)胞毒性增加。當(dāng)用IL-2處理時，HPP 細(xì)胞中IFN- γ的分泌水平高于匹配的UCB細(xì)胞。通過對來自匹配的HPP和UCB的細(xì)胞的 RT-PCR分析確認(rèn)了更高的IFN-Y表達(dá)。這些結(jié)果表明與UCB細(xì)胞相比，HPP細(xì)胞顯示出更 高的抗白血病活性，并且該更高的活性與IFN-Y生成的顯著增加有關(guān)。使用表1中列出的腫瘤細(xì)胞系對與一組腫瘤細(xì)胞系共同培養(yǎng)期間HPP細(xì)胞和臍帶 血細(xì)胞中的IFN-Y生成進(jìn)行分析。按照50 1的比例，使用IO4個腫瘤細(xì)胞和5 X IO5個 HPP細(xì)胞共同培養(yǎng)HPP細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞24小時或48小時。對于CCRF-CEM、J. RT3-T3. 5、 K562、KGU KG-la, KU812、NC1-H1417、U-937 和 WERl-RB-I 細(xì)胞系，在共同培養(yǎng) 24 小時時， HPP細(xì)胞的IFN-Y生成的增加超過了與這些細(xì)胞系共同培養(yǎng)相同時間的臍帶血細(xì)胞。參 見圖IOA0在共同培養(yǎng)48小時時，對于所有的腫瘤細(xì)胞系，HPP細(xì)胞的IFN-Y生成的增加 超過臍帶血。參見圖10B。在所有腫瘤細(xì)胞系中，在24小時和48小時，K562細(xì)胞均誘導(dǎo)了 HPP細(xì)胞中IFN-Y生成的最大增加。對于TNF-α和GM-CSF，觀察到類似的結(jié)果。細(xì)胞周期分析證實(shí)，與單獨(dú)培養(yǎng)的KG-Ia細(xì)胞相比，當(dāng)與HPP共同培養(yǎng)時，處于S 期的KG-Ia的百分比降低30%。使用HPP的不同富集部分進(jìn)行的進(jìn)一步共同培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證 實(shí)，HPP的抗白血病活性極大地歸因于高濃度的特有的未成熟自然殺傷細(xì)胞，所述未成熟自 然殺傷細(xì)胞的特征為高水平表達(dá)⑶56+，而不表達(dá)⑶16。6. 6.實(shí)施例6 人胎盤灌洗液細(xì)胞在體內(nèi)對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制6. 6. 1.材料和方法本實(shí)施例通過使用N0D/SCID小鼠異種移植腫瘤模型證實(shí)了人胎盤灌洗液在體內(nèi) 對腫瘤細(xì)胞的功效。KG-I細(xì)胞的培養(yǎng)。將KG-I細(xì)胞保持在37°C下，在95%空氣/5% CO2和100% 濕度下的Iscove’ s改良的Dulbecco，s培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了 20%的胎牛血清(生 長培養(yǎng)基)。每隔一天更換所述培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基，每周將細(xì)胞傳代。KG-I細(xì)胞呈懸浮生 長。因此，為了更換培養(yǎng)基或?qū)⒓?xì)胞傳代，將細(xì)胞懸浮液收集在離心管中，并且在S0RVALL HERAEUS 轉(zhuǎn)子(零件號75006434)中以2，OOOrpm離心10分鐘。棄去上清液，并將合適量 的細(xì)胞沉淀重懸在生長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。用于植入的KG-I細(xì)胞制劑。為了將細(xì)胞植入小鼠，如上所述通過離心收集細(xì)胞。收集細(xì)胞沉淀，并將其重懸在磷酸鹽緩沖鹽水中。為了確定待植入到小鼠的細(xì)胞數(shù)量，使用 血細(xì)胞計數(shù)器對等分試樣的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行計數(shù)。使用臺盼藍(lán)染料排除懸浮液中的死細(xì) 胞。用于植入的HPP細(xì)胞制劑。為了 HPP的貯存和解凍，將接收的樣品冷凍在良好條件 下的干燥運(yùn)送容器中。將所述單位貯存在干燥的運(yùn)送容器中，直到2007年2月7日解凍。 在解凍當(dāng)天，從冷凍干燥器中取出HPP單元(每次一個)，放置到自封口塑料袋中。然后，將 該袋放到37°C水浴中，輕輕搖晃，直到大部分解凍(袋中仍存留小冷凍塊)。隨后從水浴中 取出所述袋，從自封口袋中取出所述單元，并輕輕倒置該單元直到完全解凍。隨后將該單元 放入層流凈化罩中，通過用70%的乙醇噴霧對血袋的外表面進(jìn)行滅菌。使用無菌剪刀剪開 血袋，用無菌移液器將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無菌的50ml錐形管(每個HPP單位1管；每個UCB單位 2管)中。接著，將10mL解凍緩沖液(2.5%人白蛋白，5%葡聚糖40)慢慢地加入到每個管 中，輕輕地混合(在2. 2-2. 9分鐘期間)。然后，用10mL解凍緩沖液沖洗每個血袋，隨后將 該沖洗緩沖液慢慢地加入到50ml的錐形管中(在0. 7-1. 3分鐘期間)。在解凍后，在離心前將每個單位貯存在濕冰上。將所有的管離心10分鐘(440 X g， 10°C )，使用無菌移液器吸出上清液，通過振搖所述管輕輕地打散沉淀。將1ml等分試樣的 運(yùn)載體(PBS+1%胎牛血清)加入到一個管中，并通過輕輕地旋轉(zhuǎn)混合所述管。使用2ml移 液器，將內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到第二個管中，接著轉(zhuǎn)移到第三個管，之后轉(zhuǎn)移到第四個管。用0. 2ml 稀緩沖液洗滌空管。為了細(xì)胞計數(shù)，將25 yl等分試樣轉(zhuǎn)移到在冰上的15ml錐形管中，該管中含有 975 yl運(yùn)載體。然后，通過加入4ml冷的氯化銨裂解試劑并在冰上培育10分鐘來裂解紅 細(xì)胞。在培育后，將5ml的冷PBS加入到每個管中，離心所述管(10min，400Xg，10°C )。在 RBC裂解后，通過血細(xì)胞計數(shù)器對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，使用臺盼藍(lán)評價生存力。計數(shù)結(jié)果針對稀 釋進(jìn)行校正并除以裂解因子(0. 46)，以估計在RBC裂解之前存在的細(xì)胞數(shù)。對于HPP劑量配制，在計數(shù)后，通過加入運(yùn)載體將HPP細(xì)胞稀釋至1 X 108個細(xì)胞/ ml。然后將HPP細(xì)胞貯存在冰上，直到填充注射器。從解凍第一個單位到完成劑量配制之 間的間隔時間少于3小時。在填充注射器之前，留出50 iU等分試樣的給藥材料，用于通過如上所述的計數(shù) 進(jìn)行給藥后的驗(yàn)證。在給藥后，評價剩余給藥材料以進(jìn)行給藥驗(yàn)證。研究設(shè)計。在第1天，將5百萬個活KG-1細(xì)胞S/C植入到二十四個N0D/SCID雄 性小鼠(Jackson Laboratories)的側(cè)腹區(qū)域。分開所述小鼠，使得四至五只小鼠飼養(yǎng)在具 有木屑床的小分離籠系統(tǒng)中。隨意提供無菌的嚙齒類動物飼料和水。每周兩次嚴(yán)格地監(jiān)測 小鼠的腫瘤生長。在第25天，觀察到第一個可測量的腫瘤。然后，每周一次記錄體重，并每 周兩次用測徑器記錄腫瘤測量結(jié)果。在植入后第52天，將動物隨機(jī)分成三個獨(dú)立的組，腫 瘤體積平均為約300-350mm3。參見下表13。第一組由具有平均腫瘤體積為312mm3的四只 對照小鼠組成。這些小鼠中，兩只靜脈內(nèi)(IV)、兩只動脈內(nèi)(IT)分別植入200iU和50iU 運(yùn)載體溶液。具有平均腫瘤體積345mm3的第二組由靜脈內(nèi)植入200 yl HPP細(xì)胞/小鼠 (2X107個細(xì)胞)的四只小鼠組成。IT植入50 yl HPP細(xì)胞/小鼠的最后一組也由具有平 均腫瘤體積332mm3的四只小鼠組成。表13 用于體內(nèi)腫瘤抑制試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組 在第66天，植入HPP細(xì)胞后14天，由于腫瘤體積過大而終止研究。6. 6. 2.結(jié)果測量腫瘤體積(TV)直到第66天(HPP-細(xì)胞植入后第14天)，此時對照組的TV達(dá) 到平均2921mm3。在研究結(jié)束時，IV處理組的平均TV為2076mm3，IT組的TV為2705mm3。關(guān) 于處理后TV的增加％，與對照組相比，IT組顯示出對腫瘤生長20%的中度抑制，而IV組顯 示出對腫瘤生長超過35%的抑制。IT組的抑制是可證實(shí)的。參見圖11。等同物本發(fā)明不受限于本文所描述的具體實(shí)施方案的范圍。實(shí)際上，除了描述的那些外， 根據(jù)以上描述和附圖，對本發(fā)明進(jìn)行的各種改變對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見 的。這樣的改變落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文引用的所有參考文獻(xiàn)通過參考完整納入本文，且為了所有的目的以相同程度 納入本文，就如同各單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾埍惶貏e地且單獨(dú)地指明為了所有目的通過參考完整納入本文一樣。對任何出版物的引用針對其在本申請日之前的公開內(nèi)容，而 不應(yīng)認(rèn)為是承認(rèn)是本發(fā)明由于在先發(fā)明而不能享有該出版物之前的日期。
權(quán)利要求
一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將所述腫瘤細(xì)胞與人胎盤灌洗液細(xì)胞接觸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞為血癌細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞為實(shí)體瘤細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞為原發(fā)性導(dǎo)管癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、急性T細(xì) 胞白血病細(xì)胞、慢性髓細(xì)胞樣淋巴瘤(CML)細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、慢性髓性白血病 (CML)細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸 腺癌細(xì)胞、或成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述胎盤灌洗液是僅流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)的灌洗液。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述胎盤灌洗液已流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)，并且從胎盤的母體 面被收集。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述灌洗液是通過用0.9% NaCl溶液流經(jīng)胎盤血管系統(tǒng)而 獲得的。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述灌洗液包含培養(yǎng)基。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述灌洗液已經(jīng)過處理除去了眾多紅細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸是體外接觸。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸是體內(nèi)接觸。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述接觸是在人體中。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述眾多胎盤灌洗液細(xì)胞是來自胎盤灌洗液的所有有核 細(xì)胞。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述胎盤灌洗液細(xì)胞已經(jīng)過處理除去了至少一類細(xì)胞。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述胎盤灌洗液細(xì)胞已經(jīng)過處理富集了至少一類細(xì)胞。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述胎盤灌洗液細(xì)胞包含至少約50%的CD56+胎盤細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述⑶56+細(xì)胞是由⑶56-偶聯(lián)微珠選擇的。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述灌洗液細(xì)胞和所述腫瘤細(xì)胞以每個腫瘤細(xì)胞約5個灌 洗液細(xì)胞的比例接觸。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述灌洗液細(xì)胞和所述腫瘤細(xì)胞以每個腫瘤細(xì)胞約10個 灌洗液細(xì)胞的比例接觸。
20.一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將所述腫瘤細(xì)胞與眾多CD56+、CD16lg 盤中間體自然殺傷(PINK)細(xì)胞接觸。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述接觸在體外進(jìn)行。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述接觸在體內(nèi)進(jìn)行。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述接觸在人體中進(jìn)行。
24.權(quán)利要求20的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞為原發(fā)性導(dǎo)管癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、急性T 細(xì)胞白血病細(xì)胞、慢性髓細(xì)胞樣淋巴瘤(CML)細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、慢性髓性白血病 (CML)細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、結(jié)腸直 腸癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞、或成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤細(xì)胞。
25.權(quán)利要求20的方法，其中與外周血液自然殺傷細(xì)胞相比，所述PINK細(xì)胞以 可檢測的更高水平表達(dá)以下微小RNA中的一種或多種hsa-miR-100、hsa-miR-127、hsa—miR-211、hsa_miR-302c、hsa-miR-326、hsa-miR-337、hsa-miR-497、hsa-miR-512_3p、 hsa-miR-515_5p、hsa_miR-517b、hsa_miR-517c、hsa-miR-518a> hsa_miR-518e、 hsa-miR-519d、hsa-miR-520g、hsa-miR-520h、hsa-miR-564、hsa-miR-566、hsa-miR-618、禾口 / 或 hsa-miR-99a。
26.權(quán)利要求20的方法，其中將所述PINK細(xì)胞與一定量的免疫調(diào)節(jié)化合物接觸一段時 間，所述量和所述時間足以使得所述PINK細(xì)胞與沒有接觸所述免疫調(diào)節(jié)化合物的等量的 PINK細(xì)胞相比表達(dá)可檢測的更多的粒酶B。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)化合物為來那度胺或pomalidomide。
28.權(quán)利要求20的方法，其中將所述PINK細(xì)胞與一定量的免疫調(diào)節(jié)化合物接觸一段時 間，所述量和所述時間足以使得所述PINK細(xì)胞與沒有接觸所述免疫調(diào)節(jié)化合物的等量的 PINK細(xì)胞相比顯示出對所述腫瘤細(xì)胞的可檢測的更高的細(xì)胞毒性。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)化合物為來那度胺或pomalidomide。
30.權(quán)利要求26或權(quán)利要求28的方法，其中所述PINK細(xì)胞與沒有接觸所述免疫調(diào)節(jié) 化合物的等量的PINK細(xì)胞相比，以更高水平表達(dá)BAX、CCL5、CCR5、CSF2、FAS、⑶SB、IL2RA、 或TNFRSF18中的一種或多種。
31.權(quán)利要求26或權(quán)利要求28的方法，其中所述PINK細(xì)胞與沒有接觸所述免疫調(diào)節(jié) 化合物的等量的PINK細(xì)胞相比，以更高水平表達(dá)ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL5、CCR5、CSF1、 CSF2、ECE1、FAS、GNLY、GUSB、GZMB、I LI A、IL2RA、IL8、IL10、LTA、PRF1、PTGS2、SKI、和 TBX21 中的一種或多種。
32.—種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法，該方法包括將所述腫瘤細(xì)胞與混合的自然殺傷細(xì) 胞接觸，其中所述混合的自然殺傷細(xì)胞包含從胎盤灌洗液分離的自然殺傷細(xì)胞和從臍帶血 分離的自然殺傷細(xì)胞，其中所述臍帶血分離自從中獲得所述胎盤灌洗液的所述胎盤。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述接觸在體外進(jìn)行。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述接觸在體內(nèi)進(jìn)行。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述接觸在人體中進(jìn)行。
36.權(quán)利要求32的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞為原發(fā)性導(dǎo)管癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、急性T 細(xì)胞白血病細(xì)胞、慢性髓細(xì)胞樣淋巴瘤(CML)細(xì)胞、急性髓性白血病細(xì)胞、慢性髓性白血病 (CML)細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、結(jié)腸腺癌細(xì)胞、組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、結(jié)腸直 腸癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞、或成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤細(xì)胞。
37.權(quán)利要求32的方法，其中所述混合的自然殺傷細(xì)胞包含與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3—CD56+CD16-自 然殺傷細(xì)胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更低數(shù)量的CD3—CD56+CD16+自 然殺傷細(xì)胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3TD56+KIR2DL2/ L3+自然殺傷細(xì)胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更低數(shù)量的CD3_CD56+NKp46+自 然殺傷細(xì)胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3_CD56+NKp30+自然殺傷細(xì)胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3_CD56+2B4+自然 殺傷細(xì)胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3—CD56+CD94+自 然殺傷細(xì)胞。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述自然殺傷細(xì)胞沒有經(jīng)過培養(yǎng)。
39.權(quán)利要求32的方法，其中所述混合的自然殺傷細(xì)胞包含與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更低數(shù)量的CD3TD56+KIR2DL2/ L3+自然殺傷細(xì)胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3_CD56+NKp46+自 然殺傷細(xì)胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3_CD56+NKp44+自 然殺傷細(xì)胞；與來自外周血液的等量的自然殺傷細(xì)胞相比，可檢測的更高數(shù)量的CD3_CD56+NKp30+自 然殺傷細(xì)胞。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述自然殺傷細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述自然殺傷細(xì)胞已經(jīng)被培養(yǎng)約21天。
42.一種組合物，其包含分離的⑶56+、⑶16—自然殺傷細(xì)胞，其中所述自然殺傷細(xì)胞是 從胎盤灌洗液分離的，且其中所述自然殺傷細(xì)胞包含所述組合物中至少50%的細(xì)胞。
43.權(quán)利要求42的組合物，其中所述自然殺傷細(xì)胞包含所述組合物中至少80%的細(xì)胞。
44.權(quán)利要求42的組合物，其中所述組合物包含分離的⑶56+、⑶16+自然殺傷細(xì)胞。
45.權(quán)利要求32的組合物，其中所述⑶56+、⑶16+自然殺傷細(xì)胞與所述⑶56+、⑶16—自 然殺傷細(xì)胞來自不同的個體。
46.權(quán)利要求30的組合物，其中所述自然殺傷細(xì)胞來自單個個體。
47.權(quán)利要求30的組合物，其中所述分離的自然殺傷細(xì)胞包含來自至少兩個不同個體 的自然殺傷細(xì)胞。
48.權(quán)利要求30的組合物，該組合物包含分離的胎盤灌洗液。
49.權(quán)利要求36的組合物，其中所述胎盤灌洗液與所述自然殺傷細(xì)胞來自相同的個體。
50.權(quán)利要求36的組合物，其中所述胎盤灌洗液包含與所述自然殺傷細(xì)胞來自不同個 體的胎盤灌洗液。
51.權(quán)利要求30的組合物，該組合物包含分離的胎盤灌洗液細(xì)胞。
52.權(quán)利要求39的組合物，其中所述胎盤灌洗液細(xì)胞與所述自然殺傷細(xì)胞來自相同的 個體。
53.權(quán)利要求39的組合物，其中所述胎盤灌洗液細(xì)胞與所述自然殺傷細(xì)胞來自不同的 個體。
54.權(quán)利要求30的組合物，該組合物包含分離的胎盤灌洗液和分離的胎盤灌洗液細(xì) 胞，其中所述分離的灌洗液和所述分離的胎盤灌洗液細(xì)胞來自不同的個體。
55.權(quán)利要求36的組合物，其中所述胎盤灌洗液包含來自至少兩個個體的胎盤灌洗液。
56.權(quán)利要求39的組合物，其中所述分離的胎盤灌洗液細(xì)胞來自至少兩個個體。
全文摘要
本發(fā)明提供了胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞和來自胎盤的中間體自然殺傷(PINK)細(xì)胞及其組合。本發(fā)明還提供了包含胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞和來自胎盤的中間體自然殺傷細(xì)胞及其組合的組合物，以及使用胎盤灌洗液、胎盤灌洗液細(xì)胞和來自胎盤的中間體自然殺傷細(xì)胞及其組合抑制腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞等的生長或增殖的方法和治療具有腫瘤細(xì)胞的個體的方法。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含分離的CD56+、CD16-自然殺傷細(xì)胞。
文檔編號A61K35/50GK101878034SQ200880118399
公開日2010年11月3日 申請日期2008年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日
發(fā)明者尼拉弗·迪利普·帕德里亞, 曉奎·張, 琳·康, 瓦內(nèi)薩·A·沃斯基納里安-貝爾斯 申請人:細(xì)胞基因細(xì)胞療法公司