測量用于測定未純化的樣品中細胞生活力的酶活性的方法相關申請的交叉引用本申請為非臨時申請，將其以引用方式并入本文，并要求提交于2010年4月16日的第61/324,939號美國臨時申請、提交于2010年4月16日的第61/324,949號美國臨時申請和提交于2010年4月19日的第61/325,413號美國臨時申請的部分優(yōu)先權。發(fā)明領域本發(fā)明一般涉及檢測微生物的領域，特別是細菌的檢測。本發(fā)明也提供了檢測微生物的改進方法，該方法靈敏度高，適用于未純化的樣品，并具有多種用途，以及檢測試劑盒，所述檢測試劑盒依賴作為細菌生活力的指示劑的連接酶和/或磷酸酶的存在。發(fā)明背景在許多情況下，測量與細胞生活力相關的某些分子的存在和水平是很重要的。例如，在哺乳動物細胞中測量ATP的水平對于生長分析和毒理學目的是有用的。培養(yǎng)方法可以用于檢測少量的細菌，但該技術需要數日完成，尤其當試圖檢測少量細菌以及當檢測生長較緩慢的微生物時。作為另外一種選擇，可基于對分子存在的測定進行試驗，所述分子的存在與在污染的細胞或生物體的樣品中的存在相關。最常檢測的分子為三磷酸腺苷（ATP）。雖然死亡后細胞中可變的核酸留存導致DNA和RNA的存在和生活力之間的聯(lián)系不明確，但也提出了DNA和RNA的檢測（Keer&Birch,JournalofMicrobiologicalMethods53(2003)175-183）。也提出了作為生活力指示劑的腺苷酸激酶的檢測（SquirrellDJ,MurphyMJ,LeslieRL,GreenJCD:AcomparisonofATPandadenylatekinaseasbacterialcellmarkers:correlationwithagarplatecounts,inBioluminescenceandChemiluminescenceProgressandCurrentApplications.Editedby:StanleyRA,KrickaLJ.JohnWileyandSons;2002和WO96/02665）。通常采用的測定ATP水平的方法涉及生物發(fā)光的利用。該方法利用反應的ATP依賴性，在所述反應中發(fā)光的熒光素酶催化熒光素的氧化。方法可用于測量相對低濃度的ATP。利用生物發(fā)光檢測ATP有用的試劑盒可商購得自Roche、NewHorizonsDiagnosticsCorp、Celsis等。然而，生物發(fā)光檢測存在許多問題。例如，在來自非微生物源的ATP存在下僅檢測到微生物ATP可能是個問題。通過使用可以從ATP的非細菌源分離細菌的濾器，在一定程度上解決了該問題，從而提供更加準確的信號。因此，可以看出微生物檢測的常規(guī)技術存在許多問題。為了進一步解決這樣的問題，提出了連接酶的檢測，如公開于1996年2月1日的專利申請公開WO/1996/002665中所描述，其公開了用于測定存在于樣品中的微生物和/或其細胞內物質的存在和/或量的方法，其特征在于通過將樣品與二磷酸腺苷（ADP）混合，測定樣品由來自該ADP的樣品產生的三磷酸腺苷（ATP）的量，并將如此產生的ATP的量與腺苷酸激酶的存在/或量以及微生物和/或其細胞內物質相關聯(lián)，來估計樣品中的腺苷酸激酶的量，其中在足以允許ADP向ATP最大轉化的摩爾濃度的鎂離子存在下進行ADP向ATP的轉化。所存在的鎂的量優(yōu)選為使得足以為一摩爾ADP提供一摩爾鎂，以使所有ADP分子可以與至少一個鎂離子相關聯(lián)。在于2009年1月15日公開的名稱為DETECTIONOFMICRO-ORGANISMSBASEDONTHEIRNAD-DEPENDENTDNALIGASEACTIVITY的專利申請公開WO/2009/007719中公開了作為樣品中（存活）微生物存在的有用指示劑的連接酶，特別是NAD-依賴性連接酶。連接酶為催化核酸分子連接的酶。連接反應根據所涉及的連接酶需要ATP或NAD+作為輔因子。在本公開中，利用NAD-依賴性連接酶活性作為樣品中（存活）微生物存在的指示劑。由于允許該酶的活性用作樣品中存活微生物細胞，特別是細菌源的存活微生物細胞的指示劑，NAD-依賴性連接酶活性和生活力之間的聯(lián)系是在該申請中所公開的發(fā)明的核心（Korycka-Machala等人,AntimicrobialAgentsandChemotherapy,Aug.2007,第2888-2897頁）。然而，在引導本發(fā)明形成的實驗中，發(fā)現(xiàn)在該專利申請公開WO/2009/007719中所描述的技術和教導無法應用于未純化樣品中的存活微生物的測定，所述未純化樣品如粗微生物裂解物、血液或血液培養(yǎng)物，從而構成如該參考文獻所述技術的主要缺陷。然而，已發(fā)現(xiàn)這些方法也有問題。例如，如上述引用的專利申請所公開，已發(fā)現(xiàn)當用于其預定的樣品類型時（血液衍生的微生物粗細胞裂解物），一般地常規(guī)連接酶底物檢測設計和其所產生的檢測信號無連接酶特異性。這些正是本發(fā)明所要解決和克服的問題。發(fā)明概述與上述常規(guī)方法相反，在一個方面，本發(fā)明涉及酶如聚合酶的檢測，在優(yōu)選的實施方案中所述聚合酶為DNA或RNA聚合酶，所述酶作為樣品中（存活）微生物或微生物存在的有用指示劑，特別是樣品例如粗微生物裂解物或未純化的血液或血液培養(yǎng)物。根據本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的酶活性例如聚合酶活性和微生物（micoorganism）或微生物（microbe）的生活力之間的關聯(lián)使得這些酶的活性檢測可用作樣品中存活微生物細胞，特別是細菌來源的存活微生物細胞的指示劑。同樣地，本發(fā)明在一個優(yōu)選實施方案中提供了用于檢測作為樣品中微生物存在的指示劑的DNA或RNA聚合酶的方法。該方法可以包括：（a）將樣品與核酸分子接觸，所述核酸分子用作樣品中聚合酶活性的底物；（b）在適合于聚合酶活性的條件下孵育這樣接觸的樣品；和（c）測定由微生物聚合酶作用于底物核酸分子而產生的核酸分子的存在（和/或量）測定，從而指示微生物的存在。此外，本發(fā)明提供了用于上述方法中的試劑，以及包括該試劑的檢測試劑盒以進行該方法。另一個方面，本發(fā)明提供了于2009年1月15日公開的名稱為DETECTIONOFMICRO-ORGANISMSBASEDONTHEIRNAD-DEPENDENTDNALIGASEACTIVITY的專利申請公開WO/2009/007719中所述方法、組合物和試劑盒的改進，所述申請公開識別作為（存活）微生物（micoorganism）或微生物（microbe）存在的有用指示劑的連接酶，特別是NAD-依賴性連接酶。將所述WO/2009/007719包含的整個公開內容以引用方式并入本文，并使其成為本申請的一部分。因此，本發(fā)明提供了如WO/2009/007719中所公開的檢測作為樣品中微生物存在的指示劑的酶的方法、組合物和基于其的試劑盒的改進，所述酶選自NAD-依賴性連接酶或磷酸酶或上述的混合物，所述改進的方法包括：（a）將樣品與核酸分子接觸，同時不允許來自DNA聚合酶的干擾信號，所述核酸分子用作樣品中酶活性的底物；（b）在適合酶活性的條件下孵育這樣接觸的樣品；和（c）測定由所選擇的酶或混合物作用于底物核酸分子而產生的酶修飾的核酸分子的存在（和/或量），以指示微生物的存在。因此，應認識到本發(fā)明的改進的方法用于識別表達（或已表達）該類酶或其混合物的所有微生物。如本文所述，方法中的第一步包括將樣品與核酸分子接觸，同時不允許來自DNA聚合酶的干擾信號，所述核酸分子用作樣品中酶活性的底物。因此應認識到一旦連接變可以特異性檢測到的任何合適的可連接分子可以用于本發(fā)明的方法中。附圖的簡要說明圖1，圖A至D顯示了通過根據本文所述的本發(fā)明進行的實驗所產生的結果的模板圖和圖示說明。圖2，圖A至D為圖示說明，其顯示不可連接的有利于聚合酶的底物在得自微生物的粗細胞裂解物中具有敏感性和特異性。圖3為圖示說明，其顯示不可連接的有利于聚合酶的底物在得自微生物加標血液培養(yǎng)物的粗細胞裂解物中具有敏感性和特異性。發(fā)明詳述因此，從之前的描述中可以認識到本發(fā)明所述方法可用于識別表達（或已表達）酶如合適的聚合酶的所有微生物。在某些實施方案中，將本發(fā)明所述方法應用于存活微生物的檢測，因此可視為檢測樣品中存活微生物的方法。特別地，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述方法可以用于識別細菌或微生物，其中核酸聚合酶基因及其翻譯的活性蛋白聚合酶是其存活所必需的。然而，最近提出的非存活（例如通過使用抗菌劑處理）微生物，如細菌可以保留可檢測的聚合酶活性，直到酶被降解。在本發(fā)明的開發(fā)中，發(fā)現(xiàn)在功能性細胞生化成分的樣品制備中發(fā)生了模式轉變，這是由于本發(fā)明使得能夠直接對來自溫和裂解細胞的樣品進行檢測，不需通過傳統(tǒng)且通常極端的基于變性的分離方案加入昂貴的復雜物質。因此，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明能夠檢測樣品中的存活微生物，如粗臨床裂解物，包括但不限于來自全血和/或血液培養(yǎng)物的細胞成分，和來自較大體積的全血和/或血液培養(yǎng)物的細胞成分，大體積通常為10-20ml，優(yōu)選為0.1-100ml。本發(fā)明特別用于檢測與敗血癥相關的和與包括但不限于菌血癥、真菌血癥的疾病和病毒及寄生蟲疾病相關的所有生物體。意外地發(fā)現(xiàn)根據本發(fā)明可以實現(xiàn)在如上所述的該未純化樣品中對該生物體進行檢測，相比之下，當對未純化樣品進行時，常規(guī)技術的教導中的得自樣品的聚合酶抑制，以及干擾蛋白酶和核酸酶的存在一直是該檢測方法的障礙。如上所述，已公開連接酶，特別是NAD-依賴性連接酶作為樣品中（存活）微生物存在的假定有用指示劑。然而，相反地，本發(fā)明提供了其它不是連接酶的得自存活微生物細胞的酶，類似地可以將所述酶用于將其來自存活細胞的活性與高靈敏度的信號發(fā)生器相聯(lián)系，如通過技術如PCR等擴增。本發(fā)明的該特征也可能能夠區(qū)別細菌與真菌。在本發(fā)明的一個實施方案的實例中，可以使用以下物質：a.激酶加PO4可用于啟動連接酶或停止聚合酶b.磷酸鹽可用于除去PO4并啟動聚合酶c.DNA和RNA聚合酶可用于延伸底物以啟動下游傳統(tǒng)PCR或等溫擴增d.等溫擴增可使核酸內切酶的酶活性降低e.核糖體f.miRNA機理g.促旋酶h.解旋酶i.核酸外切酶，5'-3'，3'-5'即除去封閉基團如PO4、TaqMan等j.核酸內切酶k.蛋白酶l.DNA酶m.RNA酶n.尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDGlycosolase）o.修復酶在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，發(fā)現(xiàn)根據本發(fā)明進行的DNA聚合酶活性的測定使得測定來自微生物粗裂解物的細胞生活力成為可能。這可以通過使用更多選擇性修飾的寡核苷酸底物與選擇性非常強的“熱啟動”（如本領域熟知的）組合，以及控制RT，37，60C活性來證實。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明應用于血液產品篩選，尤其是血小板的篩選，這是由于在該應用中任何微生物生長均由丟棄產品所導致，并且不需要區(qū)分細菌和真菌。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以采用磷酸酶，由于它們可除去5'或3'磷酸酯而留下-OH，從而可以通過所包括的設計的5'Taq的去除或連接酶（除去3'）啟動任何聚合酶，因此該磷酸酶很可能為另一種極好的啟動聚合酶活性的候選酶。此外，磷酸酶較穩(wěn)固并有助于通過優(yōu)化pH而區(qū)分酵母和細菌。因此應認識到如通過本文的教導所預期的能夠啟動聚合酶的任何合適的酶可以用于實施本發(fā)明。在本發(fā)明的實施中，微生物的檢測可以包括最近存活的微生物，視情況而定，直到DNA聚合酶已降解的點。如果需要區(qū)別存活和最近存活的微生物，那么在適當的條件下，簡單的時程或兩個或多個時間點之間的聚合酶活性的比較應足以測定聚合酶活性是否隨時間推移升高、保持或降低。在一個優(yōu)選的實施方案中，如果發(fā)現(xiàn)聚合酶活性在長時間內或在（一個或多個）更晚的時間點（與初始測量相比）保持或升高，這可以表明微生物為存活的。如果聚合酶活性在（一個或多個）更晚的時間點降低，這可以表明所檢測的活性來自最近存活的微生物。當應用于抗生素敏感試驗（AST）以及其它合適的療法的測定時，該時程測量方法尤其有用。本文詳細討論了檢測方法。在本發(fā)明的優(yōu)選的具體實施方案中，微生物為如本文所述的細菌，并且本發(fā)明所述的方法具有更加普遍的應用性（Wilkinson等人,MolecularMicrobiology(2001)40(6),1241-1248）。細菌也可以為例如嗜溫性細菌和/或嗜熱細菌。本發(fā)明的上下文中的“樣品”定義為包括需要測試微生物，特別是細菌的存在的任何樣品。因此樣品可以例如由臨床提供的粗微生物裂解物組成，或可包括血液或血液培養(yǎng)物的臨床樣品，或包括適合于體外檢測系統(tǒng)的樣品。樣品也可以包括飲品或食品樣品或其制劑，或藥品或化妝品如個人護理產品，包括洗發(fā)劑、護發(fā)素、保濕劑等，按常規(guī)針對微生物污染對其所有進行測試。樣品可以包括組織或細胞，并且可以包括痰或血小板樣品。此外，本發(fā)明所述的方法和試劑盒可以用于監(jiān)測表面污染，例如制品食品的位置。在一個優(yōu)選的實施方案中，聚合酶活性的存在表明有污染。污染可以來自任何微生物源，特別是細菌污染。此外，本發(fā)明也用于監(jiān)測環(huán)境條件如供水、廢水、海洋環(huán)境等。本發(fā)明也用于在發(fā)酵過程和空氣采樣中監(jiān)測細菌生長，其中可以在醫(yī)院、工業(yè)設備或生物防御應用中評估細菌或孢子含量。本發(fā)明所述方法依賴于以下事實，即如果樣品中存在一種或多種（存活）微生物特別是細菌，那么會存在酶活性，優(yōu)選DNA聚合酶活性。因此在適當的條件下，酶可以催化反應以生成新型可檢測的核酸分子（在隨后的過程中）。可以通過任何合適的裝置如下文所述的裝置檢測新型核酸分子，從而可測定待測樣品中微生物的存在。因此，如果樣品中不存在微生物，樣品中就沒有酶（例如，聚合酶）活性，因此不會生成新型的可檢測的核酸分子。本發(fā)明所述方法提供了顯著的技術優(yōu)點，在很大程度上是由于生成新型核酸分子作為方法的一部分的事實。在本發(fā)明所述方法中，未反應的核酸分子不影響信號，因此當實施方法時不會產生假陽性信號。此外，本發(fā)明提供的方法高度靈敏，并可以提供低至毫微微克，甚至可能為微微微克水平的存在于樣品中的酶（例如，聚合酶）的檢測。靈敏度來自以下事實：每個細菌細胞含有成千上萬種酶分子，因此在合適的條件下每種酶分子可以催化多個事件。與直接PCR方法不同，所述PCR方法必須靶向每個細胞中基因的一個或數個拷貝，或使用其它步驟或試劑檢測核糖體或信使RNA，而本文所述的方法以簡單的檢測形式靶向每個細胞中酶的多拷貝的檢測。如本文所述，根據本發(fā)明所述的方法中的第一步包括將樣品與核酸分子接觸，所述核酸分子用作樣品中酶例如聚合酶活性的底物。以下更詳細地描述用于本發(fā)明的合適的底物核酸分子。核酸分子可視情況摻入合成的核苷酸類似物或可以是例如基于RNA或DNA的核酸分子，或其混合物。在某些實施方案中可以使用如熒光標記，或FRET對對核酸分子進行標記以便于檢測。本文描述了合適的檢測方法?！昂怂帷痹诒疚闹卸x為包括任何天然核酸和天然或合成類似物，它們通過聚合酶的作用能夠生成可檢測的核酸分子。合適的核酸分子可由例如雙鏈或單鏈DNA和雙鏈或單鏈RNA構成。雖然核酸底物可以包括平端雙鏈DNA分子，但是在本發(fā)明的一個實施方案中聚合酶的核酸底物包括兩個雙鏈DNA分子，在其要連接的末端具有互補的突出端（overhang）和5'磷酸酯基團。在一個具體實施方案中，互補的突出端為2至10個堿基對，如3或5個堿基對。在可選的實施方案中，核酸底物包括DNA分子，其具有含有5'磷酸酯的切口。合成的核酸分子可商購得到，并可以定做為連接的末端5'磷酸酯基團。100%的本發(fā)明所述方法中所使用的核酸分子將標記5'磷酸酯基團具有技術優(yōu)勢。在特別優(yōu)選的本發(fā)明的實施方案中，如果樣品中存在聚合酶，其會催化并形成新型核酸分子（摻入整個新型序列），在如本文詳細描述的該核酸分子通過隨后的過程中（例如PCR）可以檢測到。因此，事實上底物核酸分子視情況可以包括兩個或多個核酸分子。這通常適用于本發(fā)明所述方法和試劑盒。在某些實施方案中，核酸底物包括具有單鏈互補突出端的兩個雙鏈核酸分子。應認識到，通過采集疑似含有聚合酶和連接酶兩者的樣品并在不同的反應容器中針對聚合酶和連接酶兩者進行平行測試，然后減去信號，本發(fā)明所述的新型方法可以用于區(qū)分連接酶和聚合酶，從而真正確定樣品中發(fā)現(xiàn)的真實連接酶水平。這可以由以下方程式表示：[聚合酶信號-連接酶信號（聚合酶+連接酶）=真實連接酶信號]也應認識到在本發(fā)明的任意實施方案中，聚合酶對核酸的作用是眾所周知的，因此可以看出可以選擇使用如本文所述的許多不同類型的核酸底物，該核酸底物在本發(fā)明所述的新型方法中具有利用優(yōu)勢。優(yōu)選地，存在比樣品中的聚合酶過量的核酸底物，特別是較大的摩爾過量。這是優(yōu)于現(xiàn)有技術方法的重要技術區(qū)別。由于檢測到新型聚合核酸分子，只有樣品中的該分子的出現(xiàn)對有效進行檢測方法是必要的。因此，如果樣品中存在其它核酸分子，本發(fā)明所述的方法不會受到損害，如來自待檢測細菌的核酸分子或例如在待測樣品中發(fā)現(xiàn)的來自哺乳動物或真菌來源的核酸分子?？梢酝ㄟ^參照根據本發(fā)明進行的實驗工作的以下實施例來更加充分地描述本發(fā)明。此外，雖然以上對本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案進行描述并具體例示，但不意味著本發(fā)明局限于該實施方案。實施例1連接酶獨立性機理的發(fā)現(xiàn)：將三種不同的DNA底物（A）與大腸桿菌（E.coli）連接酶一起或在無連接酶的情況下孵育并在UNG存在/不存在下進行PCR，所述PCR含有全長DNA連接酶底物特異性PCR引物。通過SYBR綠（qPCR）監(jiān)測PCR，并對產生的反應進行凝膠分析（B）。將三種不同的DNA底物（A）與大腸桿菌連接酶或在無連接酶的情況下孵育并在UNG存在/不存在下進行PCR，所述PCR含有S1-延伸檢測引物。通過市場上可獲得的Zeus-探針（qPCR）方法（ZeusScientific,Inc.,Raritan,NJ）監(jiān)測PCR，并對產生的反應進行凝膠分析（C）。將降低量的不可連接的DNA底物（僅有S1/AS）與三種不同的市場上可獲得的DNA聚合酶一起孵育，并進行Zeus-探針qPCR分析。圖1以圖表形式描述了這些實驗的結果。實施例2發(fā)現(xiàn)不可連接的有利于聚合酶的底物在得自微生物的粗細胞裂解物中具有敏感性和特異性：通過玻珠研磨裂解降低量的微生物，并將其在DNA聚合酶緩沖液和dNTP的存在下在37℃下與DNA底物（僅有S1/AS）一起孵育30min（A）。然后對裂解物進行含有S1-延伸特異性引物的Zeus-探針qPCR。結果以圖表形式顯示在圖2中。實施例3發(fā)現(xiàn)不可連接的有利于聚合酶的底物在得自微生物加標血液培養(yǎng)物的粗細胞裂解物中具有敏感性和特異性：通過玻珠研磨裂解降低量的微生物，并將其在DNA聚合酶緩沖液和dNTP的存在下在37℃下與DNA底物（僅有S1/AS）一起孵育30min（A）。然后對裂解物進行含有S1-延伸特異性引物的Zeus-探針qPCR。結果以圖表形式顯示在圖3中。因此，在另一個方面，本發(fā)明對WO/2009/007719所描述和要求的發(fā)明進行了改進。根據本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)根據所述WO/2009/007719的公開內容假定的DNA連接酶特異性底物產生來自純化DNA聚合酶或純化DNA連接酶的穩(wěn)定信號，使得當應用于預定樣品類型如敗血癥樣品中時，其中所記載的方法不能使DNA連接酶具有特異性。例如，在本發(fā)明的開發(fā)中，將使用由WO/2009/007719所教導的樣品制備方法制備的敗血癥樣品輸入到其教導的檢測方案中，作為含有大量DNA聚合酶的粗微生物細胞裂解物。所有活細胞均含有豐富的DNA聚合酶。發(fā)現(xiàn)當輸入非連接酶純化樣品時，如WO/2009/007719所公開的檢測不能區(qū)分任何DNA聚合酶和DNA連接酶產生的信號，由于如該參考文獻所公開，當試圖獲得來自臨床樣品的結果時，分離連接酶既不現(xiàn)實也不是常規(guī)程序，因此從實際角度出發(fā)，所述非連接酶純化樣品包括所有臨床樣品輸入。相反，發(fā)現(xiàn)根據該參考文獻的教導進行的實驗產生了被DNA聚合酶所污染的檢測信號，而不是DNA連接酶特異性信號，這顯然是根據該參考文獻的所需結果。上述這些結果與根據WO/2009/007719的教導所產生的系統(tǒng)的特異性檢測存活細胞中的DNA連接酶的能力相反。由于活性聚合酶普遍存在于所有存活細胞中并且不能區(qū)分于該檢測系統(tǒng)中的任何連接酶，因此進一步排除了該參考文獻所公開的檢測的用于區(qū)分存活細胞衍生的NAD依賴性細菌連接酶與ATP依賴性真菌連接酶的預定能力。因此，識別該參考文獻或任何其它已知領域顯然未預料到的這一關鍵問題后，本發(fā)明通過提供如下文所述的可供選擇的、替代的DNA底物，提供了能夠從未純化的連接酶樣品中檢測特異性連接酶信號的改進，其不允許檢測到來自DNA聚合酶的干擾信號。因此本發(fā)明也提供了檢測作為樣品中微生物存在的指示劑的酶的改進的方法、組合物和基于其的試劑盒，所述酶選自NAD-依賴性連接酶、或磷酸酶或其混合物，所述方法包括：（a）將樣品與核酸分子接觸，同時不允許出現(xiàn)來自DNA聚合酶的干擾信號，所述核酸分子用作樣品中酶活性的底物；（b）在適合于酶活性的條件下孵育這樣接觸的樣品；和（c）對由所選擇的酶或混合物作用于底物核酸分子而產生的酶修飾的核酸分子的存在（和/或量）進行測定，從而指示微生物的存在。因此，本發(fā)明所述的改進方法用于識別其中表達（或已表達）NAD依賴性連接酶、或磷酸酶、或其混合物的所有微生物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本文所公開的改進的方法中的第一步包括將樣品與核酸分子接觸，同時不允許出現(xiàn)來自DNA聚合酶的干擾信號，所述核酸分子用作樣品中NAD依賴性連接酶活性的底物。一旦連接后可以特異性檢測到的任何合適的酶修飾的、或可連接的分子可以用于本發(fā)明的方法中。用于本發(fā)明所述的方法中和包括在試劑盒中的底物核酸分子必須具有使得NAD依賴性連接酶可以作用于分子從而產生可檢測的酶修飾的或連接的（新型）核酸分子，并且使得不允許來自DNA聚合酶的干擾信號的序列和結構。應認識到在本發(fā)明的開發(fā)中，注意到由于確定其為必須獨立解決的獨立的檢測系統(tǒng)問題，因而在本公開內容的范圍之外，所以對于在如WO/2009/007719公開的目前的底物設計中所發(fā)現(xiàn)的特異性的缺乏，消除聚合酶鏈反應（PCR）Taq-DNA聚合酶產生的背景不是可行的解決方案。因此，在引出本發(fā)明的實驗的情況中，具體地設定以不干擾連接酶的抑制劑添加劑阻斷所有DNA聚合酶活性的目標。為了實現(xiàn)這一目標，指出DNA聚合酶具有充分證實的需要中和/控制酶功能：（a）5'-3'DNA聚合酶活性（b）3'-5'核酸外切酶活性（c）5'-3'核酸外切酶活性（d）內在酯酶活性已根據本發(fā)明確定用于本發(fā)明所述的新型方法中的合適的底物核酸分子策略可以包括但不限于以下物質，所述策略適合取代WO/2009/007719所述方法中使用的已公開的底物分子：1.抑制聚合酶的任何活性的修飾的核苷酸2.雙脫氧核苷酸ddCTP，ddGTP，其在第一個堿基加入時停止聚合酶并使用dATP隔絕-中和其活性，同時使連接酶具有產出性反應3.防止AS寡核苷酸被延伸的雙脫氧核苷酸4.S1寡核苷酸，其摻入了聚合酶抑制修飾的堿基以阻斷其對該DNA底物的活性5.抑制該活性的DNA聚合酶特異性抗體-這在PCR領域中眾所周知6.適體寡核苷酸抑制復合物7.DNA底物雜交策略，其通過縮短與真正的“熱啟動”，本領域已知該術語結合的5'側的AS來消除聚合酶延伸的底物以防止在下游擴增如PCR中被檢測到8.DNA底物雜交策略，其通過縮短3'側的AS來消除聚合酶以防止結合和延伸，但不影響連接酶9.與聚合酶延伸長度結合的相對速率動力學，其平衡有利于連接酶10.Per-PCRS13'-二脫氧競爭（全長，或與AS的3'互補的13聚體）11.Pre-PCRS13'磷酸酯競爭12.使用最佳的UNG（標準UNG酶）條件完全去除AS13.使用熱穩(wěn)定UNG（NEB）完全去除AS?？蔁崽幚鞺NG以消除污染的連接酶/聚合酶，PCRmm必須具有dTTP14.制備具有脫氧尿苷（去除UNG）和其余RNA堿基的AS，以允許在PCR之前進行UNG/RNA酶共處理15.需要得到雙脫氧3'AS16.縮短AS的3'端以降低較高溫度（即65度）下的Taq對接17.在連接/延伸步驟中共價連接于固體支持物上的AS18.3'-雙脫氧S2反向互補物（全長，或可能僅為與S1Pol延伸互補的13聚體）19.用于背景降低-本領域所熟知的“熱啟動”策略-100%消除不需要的寡核苷酸或延伸的寡核苷酸雜交a.真正有形的-由于所有接觸材料必須在約90℃的熱溫度下，并且必須不能降至約65℃的溫度閾值以下而不易進行，應避免轉移過程產生溫度下降的問題。b.非酶熱啟動，例如滴入2mMMgCl（1mMEDTA保護的），引物，dNTP或其它必需成分c.化學-引物熱啟動雖然已顯示可以通過以本文所述的合適的底物核酸分子取代WO/2009/007719中所描述的那些來實現(xiàn)本發(fā)明的改進，但應認識到本發(fā)明并不限于本文所述的具體實施方案的范圍。事實上根據以上描述，除本文所述以外的本發(fā)明的各種修改對于本領域技術人員是顯而易見的。所有這樣的修改均將落入本發(fā)明的范圍內。此外，認為本文所描述的所有實施方案可廣泛應用并可視情況與任何和所有其它一致的實施方案相結合。本領域普通技術人員應認識到廣泛的基本原理和本發(fā)明的教導能夠用于優(yōu)化所有各種生物組織樣品（包括但不限于血液、體液和軟組織）的能夠變性的粗裂解物（玻珠研磨和超聲）-直接探針/SYBR-PCR分析的改變，其不僅針對如上具體所述的微生物（microorganism）或微生物（microbe），也可針對各種病原體，如任何細菌、真菌、病毒、寄生蟲等。雖然本文具體參照PCR，但應進一步認識到本發(fā)明的改進不限于PCR或類似方法。預期用于本發(fā)明的擴增檢測（amplificationassay）包括但不限于，其它熟知的基于核酸的技術如DNA擴增檢測、摻入熱穩(wěn)定性聚合酶的PCR檢測（PCRassay）和等溫擴增方法。應認識到本領域技術人員可以設想將用于實施本發(fā)明的各種合適的擴增方法，因此本發(fā)明將不被其限制。也應認識到本發(fā)明可應用于任何及所有涉及DNA診斷的方法、程序和過程中。該應用的實例包括但不限于涉及食品、水安全、生物恐怖活動、醫(yī)療/藥物的應用和/或涉及病原體檢測的任何應用。在食品工業(yè)中，本發(fā)明可以用于監(jiān)測防腐劑的療效。本發(fā)明的方法有可能應用于所有細胞。雖然在實例中例示了細菌細胞，但本領域普通技術人員可以容易地看出本發(fā)明所述方法可以應用于許多其它細胞類型。本發(fā)明也可以用于識別可以破壞膜和/或殺死細胞例如細菌細胞的物質。由于多藥耐藥生物體活躍并在醫(yī)療機構和患者中傳播，因此識別新的消毒劑和/或抗生素為優(yōu)先事項。應進一步認識到本發(fā)明所述方法與定量PCR組合作為一種工具可以迅速和成功地識別消毒劑和/或抗生素的影響，無需花費時間培養(yǎng)細胞并等待生長。在某些情況下，需要數日至數周培養(yǎng)生物體，因此會花費大量時間來看候選物質是否能夠殺死細胞，如微生物。在其它情況下，某些生物體不會在細胞培養(yǎng)物中生長，因此使得難以確定物質是否有效。因此，應用本發(fā)明所述的新型方法可以節(jié)省用于識別新型消毒劑和/或抗生素的時間和資源。根據本發(fā)明所述的新型方法的另一個優(yōu)點是其易于使用。例如，使用這些方法可以容易地測試大量樣品中存活細胞例如細菌的存在。例如，可以測試樣品中具有完整細胞膜的潛在活細菌的存在。在另一個實施方案中，可以測試環(huán)境樣品中存活細胞例如細菌的存在。這些樣品可以例如從土壤中收集而來或為植物的部分。如本發(fā)明所述的方法可以進一步用于在釋放之前和之后測試處理的廢水。根據本發(fā)明所述的方法可以進一步用于測試醫(yī)藥樣品，例如糞便樣品、血液培養(yǎng)物、痰、組織樣本（和切片）、傷口材料、尿，和來自呼吸道、植入物和導管表面的樣品。根據本發(fā)明所述的方法的另一個應用領域可以為食品的控制。在其它實施方案中，食物樣品得自牛奶或牛奶制品（酸奶、奶酪、甜奶酪、黃油和脫脂乳）、飲用水、飲品（檸檬汁、啤酒和果汁）、烘培制品或肉制品。本發(fā)明所述方法可以測定食物中的防腐劑或對食物進行抗菌處理（如巴氏滅菌）是否阻止細胞生長。根據本發(fā)明所述的方法的再一個應用領域為藥品和化妝品的分析，例如軟膏劑、乳膏劑、酊劑、果汁、溶液劑、滴劑等。此外，本發(fā)明所述的方法可以識別用于生態(tài)學研究的微生物群落的潛在存活的成員、用于農業(yè)和/或生態(tài)系統(tǒng)的特定土壤的衛(wèi)生狀況。傳統(tǒng)上使用基于培養(yǎng)的方法或平板計數進行細菌菌落的識別。菌落計數越多，估計原始樣品中的細菌就越多。然而，有時較長的培養(yǎng)時間（數日）所產生的問題使該方法不適合于及時和準確的結果。這些缺點利用本發(fā)明所述的方法?？梢允褂帽景l(fā)明所述的方法進行分析或使用本發(fā)明所述的方法檢測樣品中潛在生活力的細菌的非限定性實例包括例如：百日咳鮑特菌（B.pertussis）、波蒙那鉤端螺旋體（Leptospirapomona）、甲型和乙型副傷寒沙門菌（S.paratyphiAandB）、白喉桿菌（C.diphtheriae）、破傷風梭菌（C.tetani）、肉毒梭菌（C.botidinum）、產氣莢膜梭菌（C.perfringens）、費氏梭菌（C.feseri）和其它氣性壞疽細菌、炭疽桿菌（B.anthracis）、鼠疫巴斯德菌（P.pestis）、多殺性巴斯德菌（P.multocida）、腦膜炎奈瑟菌（Neisseriameningitidis）、淋病奈瑟菌（N.gonorrheae）、流感嗜血桿菌（Hemophilusinfluenzae）、放線菌屬（Actinomyces）（例如，諾卡氏菌（Norcardia））、不動桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌科（Bacillaceae）（例如，炭疽桿菌（Bacillusanthrasis））、擬桿菌屬（Bacteroides）（例如，脆弱擬桿菌（Bacteroidesfragilis））、芽生菌（Blastomycosis）、博德特氏菌（Bordetella）、疏螺旋體屬（Borrelia）（例如，伯氏疏螺旋體（Borreliaburgdorferi））、布魯氏菌（Brucella）、彎曲桿菌屬（Campylobacter）、衣原體屬（Chlamydia）、球孢子菌屬（Coccidioides）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）（例如，白喉桿菌（Corynebacteriumdiptheriae））、大腸桿菌（E.coli）（例如，腸產毒性大腸埃希菌（EnterotoxigenicE.coli）和腸出血型大腸埃希菌（EnterohemorrhagicE.coli））、腸桿菌屬（Enterobacter）（例如，產氣腸桿菌（Enterobacteraerogenes））、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）（克雷伯氏桿菌屬（Klebsiella））、沙門氏菌屬（Salmonella）（例如，傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphi）、腸炎沙門氏菌（Salmonellaenteritidis）、沙雷氏菌屬（Serratia）、耶爾森氏菌屬（Yersinia）、志賀氏菌屬（Shigella））、丹毒絲菌屬（Erysipelothrix）、嗜血桿菌屬（Haemophilus）（例如，B型流感嗜血桿菌（HaemophilusinfluenzatypeB））、螺桿菌屬（Helicobacter）、軍團桿菌屬（Legionella）（例如，嗜肺軍團菌（Legionellapneumophila））、鉤端螺旋體屬（Leptospira）、李斯特菌屬（Listeria）（例如，單核細胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes））、支原體屬（Mycoplasma）、分支桿菌屬（Mycobacterium）（例如，麻風分支桿菌（Mycobacteriumleprae）和結核分支桿菌（Mycobacteriumtuberculosis））、弧菌屬（Vibrio）（例如，霍亂弧菌（Vibriocholerae））、Pasteurellacea、變形菌屬（Proteus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（例如，銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa））、立克次體科（Rickettsiaceae）、螺旋菌屬（Spirochetes）（例如，密螺旋體屬（Treponemaspp.）、細螺旋體屬（Leptospiraspp.）、疏螺旋體屬（Borreliaspp.））、志賀菌屬（Shigellaspp.）、腦膜炎球菌（Meningiococcus）、肺炎球菌屬（Pneumococcus）和所有鏈球菌屬（Streptococcus）（例如，肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）和甲、乙、丙型鏈球菌（GroupsA3B,andCStreptococci）)、尿原體（Ureaplasmas）。蒼白密螺旋體（Treponemapollidum）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、溶血巴斯德菌（Pasteurellahaemolytica）、白喉棒狀桿菌類毒素（Corynebacteriumdiptheriaetoxoid）、腦膜炎球菌多糖菌（Meningococcalpolysaccharide）、百日咳博德特氏菌（Bordetellapertusis）、肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）、破傷風梭菌類毒素（Clostridiumtetanitoxoid），和牛型結核菌（Mycobacteriumbovis）。以上列舉僅為說明性的，絕不意味著將本發(fā)明限定于對那些特定細菌生物體的檢測。本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案利用PCR。第4,683,195號美國專利（Mullis等人）和第4,683,202號美國專利（Mullis等人）教導了PCR的一般程序。然而，用于每個擴增反應的最佳PCR條件通常憑經驗確定或通過本領域技術人員通常采用的計算機軟件估算。許多參數影響反應的成功。其中參數為退火溫度和時間、延伸時間、Mg2+、pH，和引物、模板及脫氧核糖核苷酸的相對濃度。通常，在聚合酶反應前通過加熱至至少約95℃1至10分鐘使模板核酸變性。通過在90℃至96℃變性0.05至1分鐘，在48℃至72℃的溫度下退火0.05至2分鐘，以及在68℃至75℃下延伸至少0.1分鐘完成大約具有最佳終循環(huán)的20-99個擴增循環(huán)。在一個實施方案中，PCR反應可以包含約100ng模板核酸，20uM上游和下游引物，和0.05至0.5mm每種dNTP，和0.5至5單位市場上可獲得的熱穩(wěn)定DNA聚合酶。常規(guī)PCR的改變?yōu)槟孓D錄PCR反應（RT-PCR），其中逆轉錄酶首先將RNA分子轉化為單鏈的cDNA分子，然后在聚合酶鏈反應中采用該單鏈的cDNA分子作為模板進行后續(xù)擴增。本領域熟知RNA的分離。在進行RT-PCR時，通常在將靶核酸加熱變性后將逆轉錄酶加入到反應樣品中。然后將反應在合適溫度下（例如30-45℃）保持足夠的時間（10-60分鐘），以在預定的擴增循環(huán)發(fā)生前生成cDNA模板。本領域技術人員應認識到如果需要定量結果，必須注意使用保持或控制擴增核酸的相對拷貝數的方法。“定量”擴增的方法為本領域技術人員所熟知。例如，定量PCR可以涉及使用相同引物同時共擴增已知量的對照序列。這提供了可以用于校正PCR反應的內標。另一種PCR替代方案為定量PCR（qPCR）?？梢酝ㄟ^競爭性技術，采用內部同源對照來運行qPCR，所述內部同源對照通過較小的插入或缺失而與靶標大小不同。然而，也可以使用非競爭性和動態(tài)定量PCR。將沿著靶序列可以同時檢測到的實時、動態(tài)PCR檢測與內部同源對照組合在一起可以是有利的。用于PCR、RT-PCR和/或qPCR的引物選自區(qū)域內或特定的細菌，所述引物僅會擴增針對該具體生物體選擇的DNA區(qū)域。作為另外一種選擇，選擇將雜交和擴增所有生物體共有的DNA片段的引物。本領域公知引物的選擇和構建。通常，一條引物位于待擴增序列的每端。該引物長度通常為10至35個核苷酸，并且優(yōu)選的長度為18至22個核苷酸?？梢员粩U增的最小序列的長度為約50個核苷酸（例如，正向和反向引物長度均為20個核苷酸，其在序列中的位置至少間隔10個核苷酸）?？梢詳U增更長的序列。一個引物稱為“正向引物”并位于待擴增的區(qū)域左端。正向引物與DNA的上游鏈的區(qū)域中的序列相同（當使用顯示上游鏈具有5'至3'方向極性的慣例繪制雙鏈DNA時）。正向引物的序列是這樣的，使其雜交于與DNA上游鏈互補的DNA鏈。另一種引物稱為“反向引物”，并且位于待擴增的區(qū)域右端。反向引物的序列是這樣的，使其在序列上與DNA上游鏈的區(qū)域互補，即其為DNA上游鏈的區(qū)域中的序列的反向互補物。反向引物與DNA的上游端雜交。也應選擇符合許多其它條件的PCR引物。PCR引物應足夠長（優(yōu)選長度為10至30個核苷酸）以盡量減少其與模板中多于一個區(qū)域的雜交。如果可能，應避免單堿基長時間運行的引物。引物應優(yōu)選地具有40%至60%的G+C百分含量。如果可能，引物的3'端的G+C百分含量應高于引物的5'端的G+C百分含量。引物不應包含可以雜交于引物中另一個序列的序列（即回文序列）。在相同PCR反應中使用的兩條引物不應能夠互相雜交。雖然PCR引物的選擇優(yōu)選符合以上建議，但引物不需與這些條件一致。其它引物也可以有效，但產生良好結果的幾率稍低?？梢允褂迷S多可用的計算機程序中的一種選擇可以用于在給定序列內擴增DNA的PCR引物。該程序選擇用于擴增給定序列的最佳引物（即，該程序選擇符合上述條件以及可以使PCR引物的功能最大化的其它條件的引物）。一個計算機程序為GeneticsComputerGroup（GCG最近成為Accelrys）分析軟件包，其具有選擇PCR引物的程序。以下公開的寡核苷酸引物和探針可以由多種方法制成。一種制備這些寡核苷酸的方法為使用市場上可獲得的核酸合成器來合成。存在許多該合成器并且為本領域技術人員熟知。也可以通過雜交方法檢測核酸。在這些方法中，可以將標記的核酸加入到含有標記或未標記的核酸探針的底物中。作為另外一種選擇，可以將標記或未標記的核酸加入到含有標記的核酸探針的底物中。雜交方法公開于例如MicroArrayAnalysis,MarcSchena,JohnWileyandSons,HobokenN.J.2003中。檢測核酸的方法可以包括使用標記。例如，可以使用感光膠片或磷光影像分析儀（phosphoimager）（用于檢測和定量放射性磷酸酯的摻入）來檢測放射性標記?？梢允褂霉鈾z測器檢測并定量熒光標記物以檢測發(fā)射的光（參見針對典型裝置的第5,143,854號美國專利）。通常通過向酶提供底物并測量酶作用于底物而產生的反應產物來檢測酶標記。通過簡單地使有色標記可視化來檢測比色標記。在一個實施方案中，通過使用核酸嵌入染料直接對擴增產物進行染色來使擴增的核酸分子可視化。如對本領域技術人員顯而易見的，示例性的染料包括但不限于SYBR綠、SYBR藍、DAPI、碘化丙啶和溴化乙錠。嵌入到擴增的DNA分子中的熒光染料的量直接與擴增的產物的量成比例，所述熒光染料的量可以根據制造商的說明，使用傳統(tǒng)檢測裝置方便地定量。該方法的一個改變是擴增產物的凝膠電泳，接著對所選擇的嵌入染料進行染色和可視化。作為另外一種選擇，標記的寡核苷酸雜交探針（例如，熒光探針如熒光共振能量轉移（FRET）探針和比色探針）可以用于檢測擴增。需要時可以通過測序或顯示擴增的產物具有預測的大小、顯示預測的限制性酶切圖譜、或雜交至正確的克隆核苷酸序列來證實代表被測試的生物實體的基因組序列的特異性擴增。本發(fā)明還包括試劑盒。例如，試劑盒可以包括含有針對樣品中所選擇的酶或混合物活性的核酸分子的底物（同時不允許來自DNA聚合酶的干擾信號），用于在適合于酶活性的條件下孵育樣品和底物的孵育裝置和用于特異性測定由所選擇的酶或混合物作用于底物核酸分子而產生的核酸分子的存在（和/或量）的裝置（作為微生物存在的指示）。該試劑盒也可以包括其它適合于進行本發(fā)明所述新型方法的試劑，用于篩選正常無菌體液中微生物的存在或不存在，并提供診斷性、預后性患者管理信息，以及用于擴增與生物體特異性或一般性對應的核酸分子的引物，用于分離DNA的緩沖液和試劑，和用于PCR的試劑。試劑盒可以進一步包括與核酸序列雜交的可檢測的標記寡核苷酸，所述核酸序列編碼與所關注生物體對應的多肽。試劑盒也可以包含可以對其進行檢測并與所包含的測試樣品進行比較的一種對照樣品或一系列對照樣品?？梢詫⒃噭┖械拿糠N成分封閉在單獨的容器中，并且所有各種容器可以與解釋使用該試劑盒進行的檢測結果的說明書一起置于單個包裝中。也應認識到本發(fā)明所提供的方法進一步包括利用本文提供的原理和教導進行完整的或部分的微生物基因組和/或轉錄組序列分析，并且其中可以使用如本文所述的單一樣品制劑同時、一致、或平行地進行所述完整或部分微生物基因組和/或轉錄組序列分析。也應認識到本發(fā)明所述的新型方法可以提供用于患者管理的具有抗微生物或抗聚合酶活性的藥物的診斷性測量和檢測。在貫穿本申請中所引用的所有參考文獻、專利和公布的專利申請的內容均以引用方式并入本文，其引用的程度如同每個單獨的出版物、專利或專利申請具體而獨立地以引用方式并入。前面的詳細描述是僅出于理解清楚的目的給出的，并且由于修改對本領域技術人員是顯而易見的，因此不應從其中推斷出不必要的限定。未承認本文所提供的任何信息為現(xiàn)有技術或與目前所要求保護的發(fā)明相關，或任何具體或隱含引用的出版物為現(xiàn)有技術。除非另有規(guī)定，本文所使用的所有技術和科學術語的含義與本發(fā)明所屬領域的技術人員通常所理解的含義相同。雖然對本發(fā)明進行了詳細描述，但是以具體舉例說明本發(fā)明實施方案的方式并出于清楚理解的目的來提供本文的具體實例。根據本文所述的本發(fā)明的教導，在不背離本發(fā)明的精神或范圍的前提下，對由此所描述的這些實施方案進行許多變化和修改對于本領域普通技術人員是顯而易見的。雖然結合其具體實施方案對本發(fā)明進行了描述，但應理解能夠進一步修改，并且該申請期待通常根據發(fā)明的原理涵蓋本發(fā)明的任何變化、使用或修改，并且當在本發(fā)明涉及的領域內的已知或習慣實施的范圍內，以及當可應用于上文所述的和在如下所附權利要求的范圍內的必要特征時，包括該與本發(fā)明的偏離。