專利名稱：雙馬來酸酐交聯(lián)劑在固定細(xì)胞樣品或組織樣品中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及新穎的雙馬來酸酐(bis-maleic anhydride)。本申請(qǐng)尤其涉及以下發(fā)現(xiàn)雙馬來酸酐交聯(lián)劑可被用于保存/固定細(xì)胞樣品或組織樣品。因其具有很大優(yōu)勢(shì)，故雙馬來酸酐交聯(lián)劑可用于需要固定細(xì)胞樣品或組織樣品并且與此同時(shí)需要固定劑對(duì)隨后的操作(如免疫組織化學(xué)、熒光原位雜交或RT-PCR)中對(duì)蛋白或核酸的檢測(cè)幾乎沒有影響的方法。本申請(qǐng)同樣證實(shí)了使用雙馬來酸酐交聯(lián)劑作為固定劑很大程度地促進(jìn)了在預(yù)先固定的細(xì)胞樣品或組織樣品中對(duì)感興趣的分析物的隨后的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
迄今為止，沒有通?？蓱?yīng)用的、“理想的”方式來制備例如分別用于免疫組織化學(xué)或感興趣的核酸的檢測(cè)的細(xì)胞樣品或組織樣品。固定和通過固定所引入的負(fù)面效應(yīng)的可逆性分別對(duì)多肽抗原和核酸的可檢測(cè)性，以及對(duì)由此獲得的結(jié)果的再現(xiàn)性產(chǎn)生主要影響。對(duì)于細(xì)胞樣品或組織樣品中的抗原的成功的免疫染色，至少要滿足三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)a) 抗原在其原位的保留(retention)，b)抗原的可接近性(accessibility)和c)對(duì)感興趣的抗原/表位進(jìn)行正確的構(gòu)建/保存。目前看來，沒有固定和/或檢測(cè)操作完全滿足了所有這三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于本領(lǐng)域已知的操作而言，對(duì)于這些標(biāo)準(zhǔn)中的一個(gè)或兩個(gè)的最好的表現(xiàn)導(dǎo)致了至少一個(gè)其它標(biāo)準(zhǔn)的降低的表現(xiàn)的代價(jià)。一些固定劑是可獲得的并且在臨床病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室的例行程序中使用，如戊二醛、 甲醛和丙酮，或其它有機(jī)溶劑。然而，絕大部分的固定操作是基于交聯(lián)劑的使用，如甲醛。 固定劑溶液通常為含有磷酸鈉的甲醛水溶液，其被配制成提供至PH為7. 2-7. 6的緩沖作用 (在加入少量的強(qiáng)酸或堿后產(chǎn)生最小的PH變化)和大約等滲的溶液(一種其滲透壓與哺乳動(dòng)物細(xì)胞外液相同的溶液，通常基于生理鹽水)。按照現(xiàn)有技術(shù)的發(fā)展水平，需要固定操作是正好恰當(dāng)?shù)?。如果固定時(shí)間太短，則僅發(fā)生由用于使樣品脫水的醇導(dǎo)致的蛋白質(zhì)的凝結(jié)，而不發(fā)生固定。這可能例如負(fù)面地影響組織形態(tài)學(xué)的保存或損傷長(zhǎng)期的保存穩(wěn)定性。伴隨著延長(zhǎng)的甲醛固定，交聯(lián)蛋白分子形成可削弱石蠟的滲透或/和抗體分子進(jìn)入的致密的網(wǎng)絡(luò)。由此，感興趣的抗原可能被可逆性地或者甚至不可逆地掩蔽。進(jìn)一步地， 表位可能被化學(xué)修飾(“破壞”)(例如，通過與甲醛反應(yīng))。此外，已知甲醛固定后大多數(shù)酶的活性受到了損傷。如上所提及，在甲醛中的固定在臨床病理學(xué)上的應(yīng)用最為廣泛。其主要原因最可能是通過用甲醛固定，感興趣的抗原被捕捉在其在活體中所占據(jù)的位置。憑借甲醛固定后引入的亞甲基橋，細(xì)胞樣品或組織樣品的形態(tài)學(xué)也得以很好的保存。然而，這些正面作用需要付出樣品通透性方面的代價(jià)，并導(dǎo)致了引起易接近性和/或感興趣的抗原/表位的構(gòu)型的變化、核酸的損傷和酶活性的失活的固定。由甲醛固定導(dǎo)致的交聯(lián)可能會(huì)掩蔽或損壞表位，導(dǎo)致假陰性免疫染色。當(dāng)主要的免疫試劑為單克隆抗體時(shí)，上述失效甚至比使用多克隆抗血清時(shí)更有可能會(huì)發(fā)生。這就是為什么進(jìn)行了許多次嘗試并發(fā)現(xiàn)于與處理逆轉(zhuǎn)甲醛固定效應(yīng)相關(guān)的文獻(xiàn)中。為進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存，固定的細(xì)胞樣品或組織樣品通常需要為脫水的并且包埋在合適的包埋劑中。相對(duì)于塑料包埋或用震動(dòng)切片機(jī)(vibrating microtome)或在恒冷切片機(jī)中切割未包埋樣品，石蠟包埋通常是優(yōu)選的。如上所述，在某種程度上，所有的固定操作表示各種妥協(xié)方案。最好的形態(tài)學(xué)保存經(jīng)常付出了對(duì)于抗體的易接近性或在抗原或其上的表位的破壞的代價(jià)。但是且對(duì)于本發(fā)明而言同樣重要的，不僅存在在樣品的制備期間(如樣品的固定或進(jìn)一步的加工如用石蠟包埋)引入的高的差異性，還可能存在甚至更大的差異性，其是由各種方式和途徑的在核酸檢測(cè)中恢復(fù)免疫反應(yīng)性或可接近性，即在被稱為抗原修復(fù)的操作中所導(dǎo)致的。盡管例如免疫組織化學(xué)方法或用于在細(xì)胞樣品或組織樣品中檢測(cè)感興趣的核酸的方法得以廣泛應(yīng)用并具有重要用途，仍存在對(duì)進(jìn)一步改善的巨大需求。這樣的改善可以例如涉及更溫和的細(xì)胞樣品或組織樣品的固定、抗原修復(fù)中的改善或/和結(jié)果的更好的可比性和再現(xiàn)性，以及可以甚至涉及使用其中相應(yīng)的抗原或表位在標(biāo)準(zhǔn)操作如甲醛固定中被破壞的抗體的可能性。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)雙馬來酸酐作為交聯(lián)劑在細(xì)胞樣品或組織樣品的制備/固定中的用途具有巨大優(yōu)勢(shì)，并且可以且將導(dǎo)致關(guān)于本領(lǐng)域已知的至少一個(gè)或甚至幾個(gè)問題的顯著性的改善。

發(fā)明內(nèi)容
本方面涉及用于體外固定細(xì)胞樣品或組織樣品的方法，其中所述細(xì)胞樣品或所述組織樣品與雙馬來酸酐交聯(lián)劑孵育，由此將所述細(xì)胞樣品或所述組織樣品固定。本申請(qǐng)進(jìn)一步公開了保存細(xì)胞樣品或組織樣品的方法，所述方法包括用雙馬來酸酐交聯(lián)劑固定組織樣品和將所述固定的樣品包埋于石蠟中的步驟。本發(fā)明還公開了用于在細(xì)胞樣品或組織樣品上進(jìn)行免疫組織化學(xué)的方法，所述方法包括如下步驟用雙馬來酸酐交聯(lián)劑固定細(xì)胞樣品或組織樣品，將所述固定的樣品包埋于石蠟中，將所述樣品脫去石蠟，除去雙馬來酰胺交聯(lián)以及免疫檢測(cè)感興趣的表位。本申請(qǐng)還描述了用于通過在細(xì)胞樣品或組織樣品上進(jìn)行原位雜交從而體外檢測(cè)感興趣的核酸的方法，所述方法包括以下步驟用雙馬來酸酐交聯(lián)劑固定細(xì)胞樣品或組織樣品，將所述固定的樣品包埋于石蠟中，將所述樣品脫去石蠟，除去雙馬來酰胺交聯(lián)以及通過原位雜交來檢測(cè)感興趣的核酸。本申請(qǐng)進(jìn)一步給出了用于通過在細(xì)胞樣品或組織樣品中的RT-PCR從而體外檢測(cè)感興趣的核酸的方法，所述方法包括以下步驟用雙馬來酸酐交聯(lián)劑固定細(xì)胞樣品或組織樣品，將所述固定的樣品包埋于石蠟中，將所述樣品脫去石蠟，除去雙馬來酰胺交聯(lián)以及通過進(jìn)行RT-PCR來檢測(cè)感興趣的核酸。本申請(qǐng)也顯示了基于本發(fā)明的方法，在從細(xì)胞樣品或組織樣品制備的相同的樣品中感興趣的多肽和感興趣的核酸均可以被檢測(cè)出來。本發(fā)明涉及用于在一個(gè)包含細(xì)胞樣品或組織樣品的測(cè)試樣品中通過免疫組織化學(xué)體外檢測(cè)至少一種感興趣的多肽和檢測(cè)至少一種感興趣的核酸的方法，所述方法包括以下步驟用雙馬來酸酐交聯(lián)劑固定細(xì)胞樣品或
5組織樣品，將所述固定的樣品包埋于石蠟中，將所述樣品脫去石蠟，除去雙馬來酰胺交聯(lián)以及通過進(jìn)行RT-PCR或熒光原位雜交來免疫檢測(cè)至少一種感興趣的多肽和檢測(cè)至少一種感興趣的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及雙馬來酸酐交聯(lián)劑在固定細(xì)胞樣品或組織樣品中的用途以及雙馬來酸酐交聯(lián)劑在制造用于固定細(xì)胞樣品或組織樣品的固定劑中的用途。
具體實(shí)施例方式在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于體外固定細(xì)胞樣品或組織樣品的方法，其中所述細(xì)胞樣品或所述組織樣品與式I的雙馬來酸酐孵育，
權(quán)利要求
1.用于體外固定細(xì)胞樣品或組織樣品的方法，其中所述細(xì)胞樣品或所述組織樣品與式 I的雙馬來酸酐孵育，
2.權(quán)利要求1的方法，其中在所述雙馬來酸酐中，Rl為氫或甲基且R2為氫或甲基。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中在所述雙馬來酸酐中，Rl和R2是相同的。
4.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中在所述雙馬來酸酐中，連接基X的長(zhǎng)度為1-20個(gè)原子。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的雙馬來酸酐，其中連接基X的主鏈由碳原子和任選的一個(gè)或多個(gè)選自0、N和S的雜原子組成。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品與雙馬來酸酐孵育1-72個(gè)小時(shí)。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括將固定的樣品包埋于石蠟中的步驟。
8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括如下步驟a)將固定的樣品包埋于石蠟中，b)將所述樣品脫去石蠟，c)除去雙馬來酰胺交聯(lián)，和e)對(duì)感興趣的表位進(jìn)行免疫檢測(cè)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述感興趣的表位為當(dāng)包括所述表位的所述細(xì)胞樣品或組織樣品用甲醛固定劑固定時(shí)被掩蔽或破壞的表位。
10.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括如下步驟a)將步驟(a)的固定的樣品包埋于石蠟中，b)將所述樣品脫去石蠟，c)除去雙馬來酰胺交聯(lián)，和d)通過進(jìn)行原位雜交來檢測(cè)感興趣的核酸。
11.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括如下步驟a)將固定的樣品包埋于石蠟中，b)將所述樣品脫去石蠟，c)除去雙馬來酰胺交聯(lián)，和d)通過進(jìn)行RT-PCR來檢測(cè)感興趣的核酸。
12.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括如下步驟 a)將固定的樣品包埋于石蠟中，b)將所述樣品脫去石蠟，c)除去雙馬來酰胺交聯(lián)，和d)通過進(jìn)行RT-PCR或熒光原位雜交來免疫檢測(cè)至少一種感興趣的多肽以及檢測(cè)至少一種感興趣的核酸。
13.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括如下步驟a)將固定的樣品包埋于石蠟中，b)將所述樣品脫去石蠟，c)除去雙馬來酰胺的交聯(lián)，d)分離核酸，和e)用步驟(d)中分離的核酸進(jìn)行突變分析。
14.雙馬來酸酐交聯(lián)劑在固定細(xì)胞樣品或組織樣品中的用途。
15.雙馬來酸酐交聯(lián)劑在制備用于固定細(xì)胞樣品或組織樣品的固定劑中的用途。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及新穎的雙馬來酸酐。本發(fā)明尤其涉及以下發(fā)現(xiàn)雙馬來酸酐交聯(lián)劑可被用于保存/固定細(xì)胞樣品或組織樣品。因其具有很大優(yōu)勢(shì)，故雙馬來酸酐交聯(lián)劑可用于需要固定細(xì)胞樣品或組織樣品并且與此同時(shí)需要固定劑對(duì)隨后的操作如免疫組織化學(xué)、熒光原位雜交或RT-PCR中對(duì)蛋白或核酸的檢測(cè)幾乎沒有影響的方法。
文檔編號(hào)G01N1/30GK102472696SQ201080036711
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者H-P.喬賽爾, M.杰格, R.I.西茲迪亞茲, R.赫爾曼 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司