專利名稱：南瓜蛋白在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物領(lǐng)域，尤其涉及南瓜蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病，目前臨床常用的化療藥物在殺傷腫瘤 細(xì)胞的同時(shí)，也很大地?fù)p傷了正常組織和細(xì)胞，這就限制了它的應(yīng)用。尋找高效、低毒的治 療腫瘤的藥物已成為當(dāng)前抗癌藥物研究的方向和迫切任務(wù)。從天然物質(zhì)中尋找抗腫瘤藥物 已被認(rèn)為是一種有效的途徑，對(duì)天然活性物質(zhì)進(jìn)行抗腫瘤作用的研究，尤其在抑制增殖及 誘導(dǎo)凋亡和分化方面進(jìn)行探索，將有助于獲得理想的抗腫瘤藥物。核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating protein, RIP)廣泛存在于高等植物 中，迄今分離到的植物RIP約80余種。植物RIP通常按結(jié)構(gòu)不同分為兩型1型RIP為單鏈 蛋白，如天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)，在植物RIP中占多數(shù)；II型RIP是通過(guò)二硫鍵 連接的雙鏈蛋白，如蓖麻毒素(ricin)。它們是一類RNA N-糖苷酶或多核苷酸腺苷糖苷 酶，具有抗生育、抗病毒和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性。植物RIP抗腫瘤方面的研究早就引起 人們的興趣RIP對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用遠(yuǎn)比對(duì)正常細(xì)胞的強(qiáng)，尤其是與單克隆抗體交聯(lián) 成的免疫毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向性和高殺傷效應(yīng)。而有關(guān)RIP抗腫瘤的機(jī)制，最初認(rèn)為 在于RIP的細(xì)胞毒作用所致的腫瘤細(xì)胞壞死，后來(lái)發(fā)現(xiàn)是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的。CN 1263107A提供了從南瓜中分離出的類型IRIP-南瓜蛋白(Cucurmosin)，并公 開(kāi)了它的制備方法。SDS-PAGE顯示它的分子量為27kDa，等電點(diǎn)pi > 9，具有強(qiáng)烈抑制細(xì) 胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)合成的活性。南瓜蛋白已長(zhǎng)出可供χ-射線衍射用的單晶，晶體結(jié)構(gòu)分 析結(jié)果指出，南瓜蛋白與天花粉蛋白具有結(jié)構(gòu)同源性[Chen et al. Acta Cryst. D562000, 665-666 ；Shi etal =Chinese J. struct, chem. 2003, 22 (2), 165-168] CN 1603340A 提供了 南瓜蛋白具有RNA N糖苷酶活性和體外抑制白血病細(xì)胞增殖的抗腫瘤活性。本發(fā)明是基于上述現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了南瓜蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的實(shí)體瘤 細(xì)胞(胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤等)及小鼠移植瘤(黑色素瘤、宮頸癌和肺癌 等)具有顯著的抑制作用，而對(duì)人正常肝細(xì)胞株L02及外周血淋巴細(xì)胞的影響小，表現(xiàn)出明 顯的選擇性。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞增殖周期分析及瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定等研究發(fā)現(xiàn)，南 瓜蛋白對(duì)胃癌、肝癌和黑色素瘤等實(shí)體瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用。此外，以黑色素瘤B16 細(xì)胞為模型，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察、流式細(xì)胞儀分析及黑色素含量測(cè)定等研究發(fā)現(xiàn)，南瓜蛋白 對(duì)黑色素瘤細(xì)胞尚具有誘導(dǎo)分化的作用；對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡和誘導(dǎo)分化作用同時(shí)存 在，但低濃度時(shí)以誘導(dǎo)分化為主，而高濃度時(shí)則具有顯著的誘導(dǎo)凋亡的作用。我們首次發(fā)現(xiàn) 南瓜蛋白能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，誘導(dǎo)分化是其抗腫瘤的新機(jī)制。南瓜蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘 導(dǎo)凋亡和誘導(dǎo)分化作用是其抗腫瘤活性的重要機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過(guò)研究南瓜蛋白在體內(nèi)外的抗腫瘤活性，提供南瓜蛋白在抗腫 瘤制藥中的應(yīng)用采用溫和的分離純化方法，包括鹽溶液抽提、DEAE-纖維素過(guò)濾、CM-纖維素或 SP-瓊脂糖等強(qiáng)或弱的陽(yáng)離子凝膠介質(zhì)二次離子交換層析分離，可以從南瓜果肉中分離到 南瓜蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)分子量為27kDa。層析純的南瓜蛋白(純度>97%)經(jīng)過(guò)濾除菌 后用于實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明提供了南瓜蛋白作為制備治療肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌、黑色素瘤 藥物的應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式下面用具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明南瓜蛋白的藥效作用和有益效果實(shí)施例1 南瓜蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用及對(duì)人正常細(xì)胞的影 響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞(胃癌細(xì)胞SGC·，肝癌細(xì)胞！fepG2、Bel74tl4,非小細(xì)胞肺 癌細(xì)胞A549，乳腺癌細(xì)胞MCF-7及黑色素瘤細(xì)胞B16)和人正常肝細(xì)胞L02接種于96孔培 養(yǎng)板上，每孔接種量分別為3000 4000個(gè)/100 μ L和6000個(gè)/100 μ L ；無(wú)菌采集健康獻(xiàn) 血者靜脈血15mL，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，用含10%胎牛血 清的RPMI1640配制單個(gè)細(xì)胞懸夜，調(diào)細(xì)胞濃度為2 X IO5個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔 IOOyL0上述各培養(yǎng)板細(xì)胞培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組加不同濃度的南瓜蛋白100 μ L，每個(gè)濃度 做三個(gè)復(fù)孔；陰性對(duì)照組加營(yíng)養(yǎng)液100μ 1，空白對(duì)照孔加營(yíng)養(yǎng)液IOOyL,用于儀器調(diào)零。作 用不同時(shí)間(48h和72h)后，每孔加5mg/mL的MTT20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，甩去上清，每孔加 二甲亞砜150 μ L。用酶標(biāo)儀(BI0-RAD產(chǎn)品)測(cè)定570nm各孔的吸光度值(A57tl),各組取平 均值，計(jì)算抑制率抑制率=(I-實(shí)驗(yàn)組A57tl/對(duì)照組A57tl) X 100%。用SPSS12. 0進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 學(xué)分析，并計(jì)算IC5(I。結(jié)果南瓜蛋白對(duì)上述胃癌、肝癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌及黑色素瘤 細(xì)胞均具有明顯的增殖抑制作用，并呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性，其48h的IC5tl從9. 77到 36. 91 μ g/mL, 72h的IC5tl從1. 94 μ g/mL到13. 54 μ g/mL ；而南瓜蛋白對(duì)人正常肝細(xì)胞和外 周血淋巴細(xì)胞抑制作用較小，其48h的IC50分別> 80 μ g/mL和> 40 μ g/mL, 72h的IC50分 別為27. 30 μ g/mL和> 40 μ g/mL (表1)?？梢?jiàn)南瓜蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞具有明顯的選擇性抑制 作用。表1南瓜蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度
權(quán)利要求
1.南瓜蛋白在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
南瓜蛋白在制藥中的應(yīng)用，能夠從南瓜果肉中分離出一種核糖體失活蛋白—南瓜蛋白，該蛋白顯示了良好的抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤藥物。南瓜蛋白能顯著抑制體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞SGC7901，肝癌細(xì)胞HepG2、Bel7404，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，乳腺癌細(xì)胞MCF-7及黑色素瘤細(xì)胞B16，而對(duì)人正常肝細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞的抑制作用較小，表現(xiàn)出明顯的選擇性；南瓜蛋白亦能在小鼠體內(nèi)明顯抑制宮頸癌U14、黑色素瘤B16和肺癌Lewis等動(dòng)物移植瘤。此外，本發(fā)明也證實(shí)了南瓜蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡和誘導(dǎo)分化作用是其抗腫瘤活性的重要機(jī)制。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102038934SQ20101016668
公開(kāi)日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月3日
發(fā)明者謝捷明, 陳明晃 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所, 福建醫(yī)科大學(xué)