本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)，尤其涉及一種重組釀酒酵母表達(dá)的乙肝表面抗原及其生產(chǎn)方法、乙肝疫苗及其生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：
乙行肝炎病毒（HBV）是一種DNA病毒，HBV感染呈世界性流行，但不同地區(qū)HBV感染的流行強(qiáng)度差異很大。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染過(guò)HBV，其中3.5億人為慢性HBV感染者，每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。我國(guó)是乙型肝炎高流行區(qū)，每年平均報(bào)告發(fā)病人50多萬(wàn)例。多年來(lái)乙肝發(fā)病數(shù)和發(fā)病率在我國(guó)法定報(bào)告?zhèn)魅局校恢备呔忧傲?，給病人、家庭、社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是我國(guó)現(xiàn)階段最突出的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。乙型肝炎難治易防，接種乙肝疫苗是預(yù)防乙肝最有效、最經(jīng)濟(jì)的方法。1989年，美國(guó)（默沙東）默克公司與中國(guó)政府達(dá)成了技術(shù)轉(zhuǎn)讓許可協(xié)議，向中國(guó)轉(zhuǎn)讓當(dāng)時(shí)最為先進(jìn)的基因工程乙肝疫苗生產(chǎn)技術(shù)。我司從美國(guó)默克公司引進(jìn)的基因重組酵母乙肝疫苗工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)，自1994年投產(chǎn)以來(lái)，累計(jì)銷(xiāo)售2億多人份，使得超過(guò)2億的中國(guó)兒童得到了有效保護(hù)，安全性和有效性得到了極高的評(píng)價(jià)。我國(guó)從美國(guó)默克公司引進(jìn)的基因重組酵母乙肝疫苗工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)，其生產(chǎn)乙肝表面抗原蛋白（HBsAg）的工藝主要包括：酵母培養(yǎng)→細(xì)胞破碎液→微過(guò)濾→硅膠吸附粗提純→疏水吸附精提純。其中硅膠吸附粗提純的工藝方法是：硅膠懸浮攪拌→硅膠沉降清洗→離心收集沉淀→硼酸緩沖液洗脫抗原→離心收集上清，得到粗純樣品硅膠洗脫液（簡(jiǎn)稱(chēng)離心法）。在這一粗提純工藝中，須使用8～10臺(tái)大容量中速離心機(jī)，生產(chǎn)操作時(shí)間為4天，手工操作強(qiáng)度大，工藝不能完全在密閉系統(tǒng)中完成。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種重組釀酒酵母表達(dá)的乙肝表面抗原的生產(chǎn)方法，該方法可大大降低產(chǎn)品污染幾率、減輕人工勞動(dòng)強(qiáng)度、節(jié)省設(shè)備投資和維修成本、減少設(shè)備占用空間，縮短生產(chǎn)時(shí)間。本發(fā)明進(jìn)一步所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種重組釀酒酵母表達(dá)的乙肝表面抗原，抗原污染率低，且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)時(shí)間短、占用生產(chǎn)設(shè)備少、生產(chǎn)成本低。本發(fā)明進(jìn)一步所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種乙肝疫苗，該乙肝疫苗污染率低，且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)時(shí)間短、占用生產(chǎn)設(shè)備少、生產(chǎn)成本低。本發(fā)明進(jìn)一步所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種乙肝疫苗的生產(chǎn)方法，該方法可大大降低產(chǎn)品污染幾率、減輕人工勞動(dòng)強(qiáng)度、節(jié)省設(shè)備投資和維修成本、減少設(shè)備占用空間，縮短生產(chǎn)時(shí)間。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種重組釀酒酵母表達(dá)的乙肝表面抗原的生產(chǎn)方法，該方法包括有用重組釀酒酵母種子培養(yǎng)酵母菌的酵母培養(yǎng)步驟、從所述酵母菌中提取抗原的抗原提取步驟和對(duì)所述抗原進(jìn)行純化的純化步驟，所述純化步驟包括有依次進(jìn)行的粗純化步驟和精純化步驟，在所述抗原提取步驟之后和純化步驟之前，還包括有：去曲通步驟，將所述抗原提取步驟提取到的抗原用XAD-4柱循環(huán)去除曲通，得到去曲通抗原樣液；所述粗純化步驟包括：裝柱步驟，將孔徑為1000A、顆粒大小為35μm～70μm的大孔硅膠裝入層析柱中形成大孔硅膠柱后，用pH值為7.6±0.2的磷酸緩沖液對(duì)所述大孔硅膠柱進(jìn)行平衡處理；上樣步驟，將所述去曲通抗原樣液用NaOH調(diào)pH值至7.6±0.2后，上樣到所述大孔硅膠柱，其中，所述大孔硅膠柱與去曲通抗原樣液上樣量的體積比為1:1～1:3，上樣溫度為2～8℃；后處理步驟，用pH值為7.2±0.2的磷酸緩沖液對(duì)上樣步驟所得的大孔硅膠柱進(jìn)行洗雜后，在45～49℃溫度下用pH值為8.7±0.2的硼酸緩沖液對(duì)洗雜后的大孔硅膠柱進(jìn)行洗脫處理并收集洗脫液，對(duì)所述洗脫液進(jìn)行超濾濃縮 處理，得到澄清抗原。優(yōu)選地，所述洗脫處理包括：將洗雜后的大孔硅膠柱的溫度從2～8℃上升到45～49℃，上升時(shí)間控制在1.5小時(shí)以?xún)?nèi)；在45～49℃溫度下用pH值為8.7±0.2的硼酸緩沖液對(duì)洗雜后的大孔硅膠柱進(jìn)行洗脫處理并收集洗脫液，洗脫處理時(shí)洗脫線(xiàn)速度不超過(guò)80厘米/小時(shí)，洗脫液的pH值控制在7～9；將洗脫液降溫至2～8℃，再進(jìn)行超濾濃縮處理。優(yōu)選地，所述抗原提取步驟之中還包括：蛋白酶抑制步驟，在所述抗原提取步驟提取到的抗原中加入蛋白酶抑制劑。優(yōu)選地，所述精純化步驟具體包括：將所述澄清抗原依次經(jīng)過(guò)丁基瓊脂糖疏水層析，硫氰酸鹽轉(zhuǎn)型處理，并用磷酸鹽緩沖液稀釋至蛋白濃度為20～81ug/ml，除菌過(guò)濾后，得到HBsAg原液。優(yōu)選地，所述酵母培養(yǎng)步驟包括：將表達(dá)HBsAg的重組釀酒酵母工作種子批菌種依次經(jīng)錐形瓶、種子罐、生產(chǎn)罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，收獲酵母菌；所述抗原提取步驟包括：經(jīng)高壓勻漿器破碎酵母菌，濾膜過(guò)濾除去酵母菌碎片，得到抗原。優(yōu)選地，所述表達(dá)HBsAg的重組釀酒酵母工作種子批菌種為美國(guó)默克公司生產(chǎn)的以DNA重組技術(shù)構(gòu)建的表達(dá)HBsAg的重組釀酒酵母工作種子批菌種。相應(yīng)地，本發(fā)明還公開(kāi)了一種重組釀酒酵母表達(dá)的乙肝表面抗原，該乙肝表面抗原采用上述任一種方法生產(chǎn)制得。相應(yīng)地，本發(fā)明還公開(kāi)了一種乙肝疫苗，其特征在于：該乙肝疫苗的活性成分包括有上所述的重組釀酒酵母表達(dá)的乙肝表面抗原。相應(yīng)地，本發(fā)明還公開(kāi)了一種乙肝疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法包括如上述任一種重組釀酒酵母表達(dá)的乙肝表面抗原的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的實(shí)施例通過(guò)選取孔徑為1000A、顆粒大小為35μm～70μm的大孔硅膠，采用柱層析法進(jìn)行乙肝表面抗原的粗提純，并且其粗提純的產(chǎn)品經(jīng)過(guò)后續(xù)工藝的精純化，得到了符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)的乙肝表面抗原。由于整個(gè)工藝在密閉系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行，大大提高了自動(dòng)化程度，免除了手工操作，從而大大降低了產(chǎn)品污染幾率、減輕勞動(dòng)了強(qiáng)度、節(jié)省了設(shè)備投資和維修成本、減少了設(shè)備占用空間，生產(chǎn)操作時(shí)間從4天縮短到了2天，也更符合GMP要求。具體實(shí)施方式本發(fā)明的核心在于，采用大孔硅膠柱層析法替代現(xiàn)有技術(shù)的離心法對(duì)乙肝表面抗原進(jìn)行粗提純，工藝完全在相對(duì)密閉的層析柱中進(jìn)行，減少了頻繁的分裝離心導(dǎo)致產(chǎn)品暴露而被污染的機(jī)會(huì)。工作強(qiáng)度小，自動(dòng)化程度高，其主要工藝流程為：裝柱→柱平衡→上樣→洗雜→洗脫（→柱清洗和再生），得到粗純樣品硅膠洗脫液。要改變?nèi)魏我呀?jīng)使用多年被驗(yàn)證為有效的純化工藝，必須考慮到諸多影響因子，如破碎后的細(xì)胞釋放出大量蛋白酶對(duì)目標(biāo)蛋白的水解、由于目標(biāo)蛋白分子及分離介質(zhì)表面的不均勻性（電荷分布、疏水性等等），在洗脫時(shí)造成目標(biāo)蛋白分子的斷裂。主要手段包括①通過(guò)加入蛋白酶抑制劑（苯甲基磺酰氟）、控制層析的溫度（上樣時(shí)，溫度要控制在4～8℃，層析柱采用夾套電子控溫，確保溫度精確控制）等方法，降低或消除蛋白酶對(duì)目標(biāo)蛋白分子的降解作用；②由于目標(biāo)蛋白分子和分離介質(zhì)表面的電荷分布和疏水性是不均勻的，在洗脫時(shí)可能因分子間的作用力而導(dǎo)致目標(biāo)蛋白分子斷裂，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白活力下降或喪失，因此需要控制好洗脫時(shí)目標(biāo)蛋白分子所處理化環(huán)境的變化情況（洗脫時(shí)，層析柱的溫度從4～8℃上升到45℃需控制在1.5小時(shí)內(nèi)，洗脫液需立即降溫至2～8℃；另外，洗脫時(shí)，線(xiàn)速度控制在80厘米/小時(shí)以?xún)?nèi)，洗脫液的pH值控制在7～9），從而減少目標(biāo)蛋白分子的斷裂現(xiàn)象。因此要成功實(shí)現(xiàn)柱層析取代離心分離必須解決上述難題，這也是蛋白生產(chǎn)工藝帶有共性的問(wèn)題，有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例更具體的描述說(shuō)明本發(fā)明提供的重組釀酒酵母表達(dá)的乙肝表面抗原的生產(chǎn)方法的一個(gè)實(shí)施例；本實(shí)施例主要包括有用重 組釀酒酵母種子培養(yǎng)酵母菌的酵母培養(yǎng)步驟、從所述酵母菌中提取抗原的抗原提取步驟和對(duì)所述抗原進(jìn)行純化的純化步驟，所述純化步驟包括有依次進(jìn)行的粗純化步驟和精純化步驟，在所述抗原提取步驟之后和純化步驟之前，還包括有：去曲通步驟，將所述抗原提取步驟提取到的抗原用XAD-4柱循環(huán)去除曲通，得到去曲通抗原樣液；所述粗純化步驟包括：裝柱步驟，將孔徑為1000A、顆粒大小為35μm～70μm的大孔硅膠裝入層析柱中形成大孔硅膠柱后，用pH值為7.6±0.2的磷酸緩沖液對(duì)所述大孔硅膠柱進(jìn)行平衡處理；上樣步驟，將所述去曲通抗原樣液用NaOH調(diào)pH值至7.6±0.2后，上樣到所述大孔硅膠柱，其中，所述大孔硅膠柱與去曲通抗原樣液上樣量的體積比為1:1～1:3，上樣溫度為2～8℃；后處理步驟，用pH值為7.2±0.2的磷酸緩沖液對(duì)上樣步驟所得的大孔硅膠柱進(jìn)行洗雜后，在47～49℃溫度下用pH值為8.7±0.2的硼酸緩沖液對(duì)洗雜后的大孔硅膠柱進(jìn)行洗脫處理并收集洗脫液，對(duì)所述洗脫液進(jìn)行超濾濃縮處理，得到澄清抗原。具體實(shí)現(xiàn)時(shí)，，所述洗脫處理可包括：將洗雜后的大孔硅膠柱的溫度從2～8℃上升到45～49℃，上升時(shí)間控制在1.5小時(shí)以?xún)?nèi)；在45～49℃溫度下用pH值為8.7±0.2的硼酸緩沖液對(duì)洗雜后的大孔硅膠柱進(jìn)行洗脫處理并收集洗脫液，洗脫處理時(shí)洗脫線(xiàn)速度不超過(guò)80厘米/小時(shí)，洗脫液的pH值控制在7～9；將洗脫液降溫至2～8℃，再進(jìn)行超濾濃縮處理。優(yōu)選地，所述抗原提取步驟之中還包括：蛋白酶抑制步驟，在所述抗原提取步驟提取到的抗原中加入蛋白酶抑制劑。所述酵母培養(yǎng)步驟可包括：將表達(dá)HBsAg的重組釀酒酵母工作種子批菌種依次經(jīng)錐形瓶、種子罐、 生產(chǎn)罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，收獲酵母菌；所述抗原提取步驟可具體包括：經(jīng)高壓勻漿器破碎酵母菌，濾膜過(guò)濾除去酵母菌碎片，得到抗原。所述精純化步驟可具體包括：將所述澄清抗原依次經(jīng)過(guò)丁基瓊脂糖疏水層析，硫氰酸鹽轉(zhuǎn)型處理，并用磷酸鹽緩沖液稀釋至蛋白濃度為20～81ug/ml，除菌過(guò)濾后，得到HBsAg原液。作為本實(shí)施例的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述表達(dá)HBsAg的重組釀酒酵母工作種子批菌種采用的是美國(guó)默克公司生產(chǎn)的以DNA重組技術(shù)構(gòu)建的表達(dá)HBsAg的重組釀酒酵母工作種子批菌種。實(shí)施例1取美國(guó)默克公司以DNA重組技術(shù)構(gòu)建的表達(dá)HBsAg的重組釀酒酵母工作種子批菌種經(jīng)0.25L錐形瓶27-29℃藥瓶培養(yǎng)17-19小時(shí)、2L錐形瓶27-29℃藥瓶培養(yǎng)17-19小時(shí)、70L種子罐27-29℃發(fā)酵培養(yǎng)16-22小時(shí)、800L生產(chǎn)罐27-29℃發(fā)酵培養(yǎng)44-48小時(shí)，收獲酵母菌。經(jīng)高壓勻漿器破碎酵母菌后，加入等體積含TritonX-100的磷酸鹽緩沖液，在加入的過(guò)程中邊用濾膜過(guò)濾除去酵母菌碎片，抽提HBsAg。通過(guò)XAD-4柱去除曲通，制備成去曲通抗原（PBP）。將孔徑為1000A、顆粒大小為35μm～70μm的大孔硅膠裝入層析柱中形成大孔硅膠柱后，用pH值為7.6±0.2的磷酸緩沖液對(duì)所述大孔硅膠柱進(jìn)行平衡處理；將所述去曲通抗原樣液用NaOH調(diào)pH值至7.6±0.2后，上樣到所述大孔硅膠柱，其中，所述大孔硅膠柱與去曲通抗原樣液上樣量的體積比為1:1～1:3，上樣溫度為2～8℃；用pH值為7.2±0.2的磷酸緩沖液對(duì)上樣步驟所得的大孔硅膠柱進(jìn)行洗雜后，在47～49℃溫度下用pH值為8.7±0.2的硼酸緩沖液對(duì)洗雜后的大孔硅膠柱進(jìn)行洗脫處理并收集洗脫液，對(duì)所述洗脫液進(jìn)行超濾濃縮處理，得到初純的澄清抗原。將所述澄清抗原依次經(jīng)過(guò)丁基瓊脂糖疏水層析，硫氰酸鹽轉(zhuǎn)型處理，并 用磷酸鹽緩沖液稀釋至蛋白濃度為20～81ug/ml，除菌過(guò)濾后，即得HBsAg原液。對(duì)實(shí)施例1（采用柱層析法粗提純）與現(xiàn)有技術(shù)（采用離心法粗提純）作對(duì)照試驗(yàn)，其結(jié)果如下：表一、大孔硅膠柱層析法的工藝參數(shù)與檢測(cè)結(jié)果對(duì)照表2：本實(shí)施例得到的HBsAg原液與現(xiàn)有技術(shù)得到的HBsAg原液檢測(cè)結(jié)果對(duì)照表：從上述試驗(yàn)結(jié)果可以看出：本實(shí)施例得到的HBsAg原液的CLAP蛋白回收率在4.0％～7.6％之間；現(xiàn)有技術(shù)的對(duì)照批CLAP蛋白回收率在2.6％～5.0％之間。本實(shí)施例得到的HBsAg原液的PIII蛋白回收率在0.73％～1.7％之間；現(xiàn)有技術(shù)的對(duì)照批PIII蛋白回收率在0.87％～1.25％之間。本實(shí)施例得到的HBsAg原液的小分子Sub-P24含量平均值為15.5％，在5.3％～23.5％之間；而現(xiàn)有技術(shù)的對(duì)照批平均值為14.3％，在4.3％～23.1％之間。本實(shí)施例得到的HBsAg原液的所有檢測(cè)指標(biāo)均符合國(guó)家藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；本實(shí)施例與現(xiàn)有技術(shù)的工藝效果基本一致。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：由于在密閉系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行，自動(dòng)化程度高，免除了手工操作，大大降低了產(chǎn)品污染幾率，同時(shí)也減輕了勞動(dòng)強(qiáng)度。節(jié)省了設(shè)備投資和維修成本、減少了設(shè)備占用空間。生產(chǎn)操作時(shí)間從4天縮短為2天，提高了時(shí)間效率，生產(chǎn)能力提高了100％，也更符合新版GMP要求?？乖鞍椎寐逝c現(xiàn)有技術(shù)的工藝持平，所有檢測(cè)項(xiàng)目均符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)。下面詳細(xì)描述本發(fā)明提供的重組釀酒酵母表達(dá)的乙肝表面抗原的一個(gè)實(shí)施例；本實(shí)施例的乙肝表面抗原為采用前述實(shí)施例的方法所生產(chǎn)制得的產(chǎn)品，不再贅述。下面詳細(xì)描述本發(fā)明提供的重組釀酒酵母表達(dá)的乙肝疫苗的一個(gè)實(shí)施例；本實(shí)施例的乙肝疫苗的活性成分主要包括有前述實(shí)施例的重組釀酒酵母表達(dá)的乙肝表面抗原，不再贅述。下面詳細(xì)描述本發(fā)明提供的重組釀酒酵母表達(dá)的乙肝疫苗的生產(chǎn)方法的 一個(gè)實(shí)施例；本實(shí)施例的方法主要包括有前述實(shí)施例提供的重組釀酒酵母表達(dá)的乙肝表面抗原的生產(chǎn)方法，不再贅述。以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。