專利名稱：一種雙酶復(fù)配生產(chǎn)γ-環(huán)糊精的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙酶復(fù)配生產(chǎn)Y-環(huán)糊精的生產(chǎn)工藝，屬于環(huán)糊精生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
環(huán)糊精(Cyclodextrins,通常簡(jiǎn)稱為⑶s),是一類由淀粉或其衍生物在環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)作用下生成的環(huán)狀化合物的總稱。CDs是以D-吡喃型葡萄糖為組成單元，通過α -1，4-糖苷鍵相連，常見的環(huán)糊精由6、7和8個(gè)葡萄糖單元構(gòu)成，分別被稱為α-、β-和Υ-環(huán)糊精。由于環(huán)糊精自身結(jié)構(gòu)的特殊性，它可以包埋許多無機(jī)和有機(jī)化合物，例如作為藥物的載體、品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定劑和吸附劑等，所以在食品、化學(xué)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)環(huán)保、生物技術(shù)和紡織技術(shù)等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用。在三種常見的環(huán)糊精中，β_環(huán)糊精由于水溶解度最小，所以容易通過分步結(jié)晶的方法制得，成本較低，在目前的生產(chǎn)中被大量制備和廣泛應(yīng)用。但其溶解度小也限制了它在多種包合作用方面的應(yīng)用。α-、Υ-環(huán)糊精具有很好的水溶性，但是由于現(xiàn)有CGTase生產(chǎn)α -環(huán)糊精時(shí)轉(zhuǎn)化率低，產(chǎn)物特異性差，且α -環(huán)糊精的溶解度相對(duì)較高，不容易通過濃縮、結(jié)晶等的物理方法從反應(yīng)液中分離純化出來，因此造成生產(chǎn)成本太高，難以工業(yè)大規(guī)模應(yīng)用。Y-環(huán)糊精具有更高的溶解度和更大的空腔，能夠包合分子量更大的化合物從而增加化合物的有效溶解度，改善化合物的乳化性等性質(zhì)，且毒性和刺激性很小，安全性高，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域已顯示出巨大的應(yīng)用潛力。雖然市場(chǎng)對(duì)Y-環(huán)糊精產(chǎn)品需求量大，但由于Y-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化效率極低，導(dǎo)致Y-環(huán)糊精價(jià)格高昂不下，大大限制了它的應(yīng)用。目前國(guó)外也只有Wacker和Cyclolab等少數(shù)幾家公司小規(guī)模地生產(chǎn)Y-環(huán)糊精。生產(chǎn)Y-環(huán)糊精方法目前只有生物法。生物法生產(chǎn)Y-環(huán)糊精的工藝一般是采用淀粉酶對(duì)淀粉液化，再加入Y-CGTase進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)制備Y-環(huán)糊精。淀粉原料中含有75-85%的支鏈淀粉，它是高度分支的多糖，結(jié)構(gòu)是每隔17-28個(gè)葡萄糖單元就有一個(gè)α-1，6_糖苷鍵，由于Y-CGTase沒有水解α-1，6糖苷鍵的活性，反應(yīng)容易終止，從而導(dǎo)致生產(chǎn)周期長(zhǎng)，淀粉利用率低。異淀粉酶(isoamylase，EC3.2.1.68)作為一種可以催化水解糖原、支鏈淀粉以及它們的β_極限糊精中的α-1，6_糖苷支鏈的脫支酶，主要被用于水解淀粉生產(chǎn)食品添加劑，如麥芽糖，海藻糖和環(huán)糊精等。當(dāng)將異淀粉酶和CGTase兩種酶混合一起進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，異淀粉酶能夠先切斷淀粉中的分支點(diǎn)，進(jìn)而加速CGTase的環(huán)化反應(yīng)，提高環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率；由于提高了淀粉的利用率，還直接降低了生產(chǎn)成本。Ivan Pishtiyski等用普魯蘭酶對(duì)馬鈴薯淀粉脫 枝后再采用酶轉(zhuǎn)化20小時(shí)制備環(huán)糊精，發(fā)現(xiàn)淀粉濃度2.5%轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，為65%。Rendleman等報(bào)道采用脫支酶(普魯蘭酶和異淀粉酶)對(duì)蠟質(zhì)玉米淀粉脫枝，再加入a-CGTase，15°C反應(yīng)5天，最終轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到76%。但這些工藝也存在底物濃度過低和反應(yīng)周期長(zhǎng)等嚴(yán)重問題。未發(fā)現(xiàn)關(guān)于異淀粉酶與Y-CGTase聯(lián)合使用來生產(chǎn)Y-環(huán)糊精的報(bào)道，因?yàn)閅-CGTase在偏中性條件下的酶活很低，只有最高酶活的10%左右；而異淀粉酶在堿性條件下酶活很低，甚至失活。Y Nakagawa等報(bào)道來源于嗜堿芽胞桿菌(Alkalophilic Bacillus7364)的 Y-CGTase 的突變體 y -CGTase (A223K)的突變體在偏中性條件下的酶活是最高酶活的30% -40%，在此條件下，為其與異淀粉酶復(fù)配打下了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供了一種雙酶復(fù)配生產(chǎn)Y-環(huán)糊精的生產(chǎn)工藝，降低了 Y-環(huán)糊精的生產(chǎn)成本。為解決上述問題，本發(fā)明技術(shù)方案為:米用來源于嗜喊芽胞桿菌7364 (Alkalophilic Bacillus7364)的 y-CGTase 的突變體Y-CGTase (A223K)與異淀粉酶復(fù)配生產(chǎn)Y _環(huán)糊精；按照5_20 %的濃度進(jìn)行淀粉調(diào)漿，在60-90°C條件下保溫5-15分鐘；再設(shè)定溫度40-60°C，調(diào)pH7.0-8.0后，按照每克淀粉10-100個(gè)單位的量加入Y-CGTase和10-100U的異淀粉酶，加入5% (w/v)的有機(jī)溶劑后，充分反應(yīng)6-12小時(shí)；回收有機(jī)溶劑，采用結(jié)晶方法得到Y(jié)-環(huán)糊精。所述微生物發(fā)酵生產(chǎn)Y-CGTase (A223K)的方法為，以自己構(gòu)建的基因工程菌E.coliBL21 (DE3) /pET24a (+) - y -CGTase (A223K)為出發(fā)菌株，在一定培養(yǎng)條件下(紀(jì)麗萍，吳丹，吳敬，陳堅(jiān).重組大腸桿菌產(chǎn)Y-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的搖瓶發(fā)酵優(yōu)化中國(guó)生物工程雜志，2011，31 (10):50-56)，發(fā)酵一定時(shí)間，經(jīng)過高速離心，去除菌體，得到含有Y-CGTase的發(fā)酵液，上清即為粗酶液。所述的表達(dá)異淀粉酶由本實(shí)驗(yàn)室重組表達(dá)獲得(專利申請(qǐng)?zhí)?201110459137.x)。所述在60_90°C條件下保溫5-15分鐘淀粉調(diào)漿的目的在于使淀粉顆粒充分溶脹。所述Y-CGTase (A223K)和異淀粉酶的最適反應(yīng)溫度為40_60°C左右，溫度會(huì)影響酶對(duì)底物的催化效率， 從而影響酶的活力，溫度過高或過低都會(huì)影響酶的作用效果。所述a-、￠-和Y-環(huán)糊精的分析采用高效液相色譜法。色譜條件:Waters600HPLC 色譜儀，Waters 自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱 ZORBAX NH2 (4.6mmX 150mm),Waters2410示差檢測(cè)器；流動(dòng)相(v/v)為75%乙腈水溶液，流速1.0mL/min ;柱溫40。。。處理樣品時(shí)，8000r/min離心15min,棄沉淀，上清液中加入0.1mL a -淀粉酶液作用Ih,
0.45 u m超濾膜過濾后取10 ii L上機(jī)分析。所述有機(jī)溶劑為環(huán)十二酮。環(huán)十二酮不僅能與Y-環(huán)糊精特異性的形成包絡(luò)物沉淀從而提高淀粉總的轉(zhuǎn)化率，而且環(huán)十二酮價(jià)格相對(duì)較低，沸點(diǎn)低，可以通過水蒸氣蒸餾幾乎全部除去，極少殘留在最終的產(chǎn)品中。所述回收有機(jī)溶劑，通過結(jié)晶手段得到Y(jié)-環(huán)糊精的具體方法為:待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液直接過濾，濾餅用蒸餾水清洗2-3次，收集濾餅，其中包括未反應(yīng)的淀粉和有機(jī)溶劑與Y-環(huán)糊精形成的絡(luò)合物沉淀；將濾餅用水復(fù)溶，然后通過水蒸氣蒸餾的方法分離有機(jī)溶劑和Y -環(huán)糊精，將獲得的環(huán)糊精的水溶液經(jīng)過布氏漏斗過濾除掉不溶性淀粉。將水溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，低溫放置得到Y(jié)-環(huán)糊精的結(jié)晶。本發(fā)明的技術(shù)原理如下:y -CGTase除了能與淀粉發(fā)生環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)生Y -環(huán)糊精外，還能發(fā)生偶合、歧化和水解反應(yīng)，偶合反應(yīng)是環(huán)化反應(yīng)的逆反應(yīng)。當(dāng)采用麥芽低聚糖為底物時(shí)，底物中存在的葡萄糖等小分子糖會(huì)抑制Y-CGTase的環(huán)化反應(yīng)，影響最終收率。本發(fā)明直接采用糊化的淀粉來生產(chǎn)環(huán)糊精以解除小分子糖對(duì)環(huán)化反應(yīng)的抑制，在中溫?cái)嚢璧臈l件下，淀粉顆粒充分溶脹，然而淀粉中含有大量的α-1，6-糖苷鍵，Y-CGTase無法水解a-1，6糖苷鍵而不能充分利用淀粉原料，此時(shí)加入異淀粉酶可水解α-1，6-糖苷鍵，從而利于環(huán)化反應(yīng)，縮短反應(yīng)時(shí)間，提高Y-⑶的轉(zhuǎn)化率。Y-環(huán)糊精可以與有機(jī)物形成不溶于水的包絡(luò)物，當(dāng)添加一定比例的有機(jī)溶劑可以連續(xù)地從反應(yīng)系統(tǒng)中去除環(huán)糊精，使反應(yīng)向著環(huán)糊精的生成方向不斷進(jìn)行，有利于環(huán)糊精生產(chǎn)，同時(shí)解除了 Y -環(huán)糊精對(duì)Y -CGTase的產(chǎn)物抑制作用。本發(fā)明是根據(jù)Y-CGTase (Α223Κ)和異淀粉酶以及產(chǎn)物Y-環(huán)糊精的特點(diǎn)生產(chǎn)Y-環(huán)糊精的工藝，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn):I)提供一種高轉(zhuǎn)化率、低成本的Y-環(huán)糊精的生產(chǎn)方法，填補(bǔ)了該技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的空白，為生物法大規(guī)模生產(chǎn)Y-環(huán)糊精奠定基礎(chǔ)；2)本反應(yīng)總的反應(yīng)周期短，只需要6-12小時(shí)；3)酶反應(yīng)的溫度比較低，不需要進(jìn)行劇烈的溫度變化，低能耗，適合工業(yè)化生產(chǎn)；4)直接利用原淀粉作為底物，解除了葡萄糖等小分子糖抑制Y-環(huán)糊精的生成的作用；添加一定比例的有機(jī)溶劑，連續(xù)地從反應(yīng)系統(tǒng)中去除Y-環(huán)糊精，使其向生成Y-環(huán)糊精的反應(yīng)方向不斷進(jìn)行，提聞了 Y _環(huán)糊的轉(zhuǎn)化率，總轉(zhuǎn)化率最聞可達(dá)到70%左右,其中
Y-環(huán)糊精和β -環(huán)·糊精的比例約為9:1。5)有機(jī)溶劑去除過程方法簡(jiǎn)單，得到的產(chǎn)品純度高，雜質(zhì)少，可達(dá)95%左右，有機(jī)溶劑殘留量可用于醫(yī)藥行業(yè)等?？傮w來講，本發(fā)明具有生產(chǎn)周期短、原料轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品純度高、工藝流程簡(jiǎn)、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:基因工程菌的構(gòu)建及培養(yǎng)根據(jù)NCBI 中 Alkalophilic Bacillus7364 中 Y-CGTase 序列，以其 223 位的氨基酸由丙氨酸㈧突變?yōu)橘嚢彼幄群蟮男蛄袨槟０逶O(shè)計(jì)引物，PCR增后獲得，目的片段。將目的片段和載體pET24a雙酶切后膠回收，16 °C連接過夜后轉(zhuǎn)入E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到LB/Kana平板上37°C培養(yǎng)8h，挑取單克隆菌落至LB/Kana液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)8h，提取質(zhì)粒并酶切驗(yàn)證，得到重組表達(dá)載體 pET24a(+)-Y-CGTase(A223K)，轉(zhuǎn)入 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組菌E.coliBL21 (DE3) /pET24a (+) - y -CGTase (A223K)，接種于 TB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 24_48h，離心后取上清，即為粗酶液。實(shí)施例2原料預(yù)處理:按照5-20%的濃度進(jìn)行淀粉調(diào)漿，在60-90°C條件下保溫5_15分鐘，使淀粉顆粒充分吸水溶脹；酶法生產(chǎn)工藝:預(yù)處理后將溫度設(shè)定為40_60°C，調(diào)pH7.0_8.0后，按照每克淀粉同時(shí)加入10-100個(gè)單位的Y-CGTase和10-100U的異淀粉酶，然后加入5% (w/v)的環(huán)十二酮后，充分反應(yīng)6-12h ；
Y-環(huán)糊精的提取工藝:沸水浴滅酶后，將反應(yīng)液過濾，濾餅用蒸餾水清洗2-3次，收集濾餅，其中包括環(huán)十二酮與Y-環(huán)糊精形成的沉淀以及未反應(yīng)的淀粉；將濾餅重新用水復(fù)溶，然后采用水蒸氣蒸餾除去環(huán)十二酮，待蒸餾結(jié)束后，過濾蒸餾液除去沒有反應(yīng)的淀粉，即可得到Y(jié) -環(huán)糊精的水溶液；將水溶液蒸發(fā)濃縮，低溫放置即可得到Y(jié)-環(huán)糊精的結(jié)晶。所述α-、和Y-環(huán)糊精的分析采用高效液相色譜法。色譜條件:Waters600HPLC 色譜儀，Waters 自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱 ZORBAX NH2 (4.6mmX 150mm),Waters2410示差檢測(cè)器；流動(dòng)相(v/v)為75%乙腈水溶液，流速1.0mL/min ;柱溫40。。。處理樣品時(shí)，8000r/min離心15min,棄沉淀，上清液中加入0.1mL α -淀粉酶液作用Ih,
0.45 μ m超濾膜過濾后取10 μ L上機(jī)分析。結(jié)果見表1，淀粉總轉(zhuǎn)化率可達(dá)70 %，產(chǎn)品中Y-CD 所占比例為 65.4%, β-CD 占 4.6%，實(shí)施例3原料預(yù)處理:同實(shí)施例2酶法生產(chǎn)工藝:預(yù)處理后將溫度設(shè)定為40_60°C，調(diào)ρΗ7.0_8.0后，按照每克淀粉10-100個(gè)單位的比例先加入異淀粉酶，反應(yīng)2-6小時(shí)；然后再加入10-100個(gè)單位的Y -CGTase和5% (w/v)的環(huán)十二酮后，充分反應(yīng)4-10小時(shí)；Y -環(huán)糊精的提取工藝及檢測(cè)方法:
同實(shí)施例2淀粉的總轉(zhuǎn)化率高達(dá)68.8%，產(chǎn)品中Y-環(huán)糊精所占比例為64.3%，β -環(huán)糊精占 4.5!%。實(shí)施例4原料預(yù)處理:同實(shí)施例2酶法生產(chǎn)工藝:預(yù)處理后將溫度設(shè)定為40_60°C，調(diào)ρΗ7.0_8.0后，按照每克淀粉10-100個(gè)單位的比例先加入Y -CGTase和5% (w/v)的環(huán)十二酮，反應(yīng)2_6小時(shí)；再加入10-100U的異淀粉酶，充分反應(yīng)4-10小時(shí)；Y -環(huán)糊精的提取工藝及檢測(cè)方法:同實(shí)施例2 淀粉的總轉(zhuǎn)化率高達(dá)69.7%，產(chǎn)品中Y-環(huán)糊精所占比例為65.6%，β -環(huán)糊精占 4.1!%。
權(quán)利要求
1.一種雙酶復(fù)配生產(chǎn)Y-環(huán)糊精的生產(chǎn)工藝，其特征在于，采用來源于嗜堿芽胞桿菌(Alkalophilic BaciIIusclarkii7364)的 Y-CGTase 的突變體 y -CGTase (A223K)與異淀粉酶復(fù)配生產(chǎn)Y-環(huán)糊精；按照5-20%的濃度進(jìn)行淀粉調(diào)漿，在60-90°C條件下保溫5-15分鐘；設(shè)定溫度40-60°C，調(diào)pH7.0-8.0后，按照每克淀粉10-100個(gè)單位的量加入Y-CGTase (A223K)和10-100U的異淀粉酶，加入5 % (w/v)的有機(jī)溶劑后，充分反應(yīng)6_12小時(shí)；回收有機(jī)溶劑，采用結(jié)晶方法得到Y(jié)-環(huán)糊精。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述回收有機(jī)溶劑、結(jié)晶方法為:將反應(yīng)液直接過濾，濾餅用蒸餾水清洗2-3次，收集濾餅，其中包括有機(jī)溶劑與Y-環(huán)糊精形成的絡(luò)合物沉淀以及沒有反應(yīng)的淀粉；將濾餅重新復(fù)溶，然后采用水蒸氣蒸餾除去有機(jī)溶劑，待蒸餾結(jié)束后，過濾蒸餾液除去沒有反應(yīng)的淀粉，即可得到Y(jié)-環(huán)糊精的水溶液；將水溶液蒸發(fā)濃縮，低溫放置即可得到Y(jié)-環(huán)糊精的結(jié)晶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的 生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的有機(jī)溶劑為環(huán)十二酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙酶復(fù)配生產(chǎn)γ-環(huán)糊精的生產(chǎn)工藝，屬于環(huán)糊精生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供了一種雙酶復(fù)配生產(chǎn)γ-環(huán)糊精的工藝，降低了γ-環(huán)糊精的生產(chǎn)成本，技術(shù)方案為采用來源于嗜堿芽胞桿菌的γ-CGTase(A223K)和異淀粉酶生產(chǎn)γ-環(huán)糊精；按照5-20％的濃度進(jìn)行淀粉調(diào)漿，在60-90℃條件下保溫5-15分鐘；設(shè)定溫度40-60℃，調(diào)pH7.0-8.0后，按照每克淀粉10-100個(gè)單位的量加入γ-CGTase(A223K)和10-100U的異淀粉酶，加入5％(w/v)的有機(jī)溶劑后，充分反應(yīng)6-12小時(shí)；回收有機(jī)溶劑，采用結(jié)晶方法得到γ-環(huán)糊精。
文檔編號(hào)C08B37/16GK103074399SQ20131003679
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月17日
發(fā)明者吳敬, 王磊, 吳丹, 陳堅(jiān) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)