本發(fā)明屬于醫(yī)學領域。本發(fā)明涉及細菌分類群霍氏真桿菌和近緣種(Eubacteriumhallietrel.)和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種(Alcaligenesfaecalisetrel.)，其可選地用于藥物、食品或飼料組合物中，用作藥物，特別是用于預防和/或治療胰島素抗性和/或胰島素抗性相關的并發(fā)癥如代謝性綜合征、血脂異常以及2型糖尿病。

背景技術：
肥胖癥主要是有害營養(yǎng)和身體習慣對抗不利遺傳背景的結(jié)果。其是常見醫(yī)學病癥如代謝性綜合征、2型糖尿病以及心血管疾病發(fā)展的主要風險因素。作為代謝活性器官，人腸道含有密集且多樣化的微生物群落，以上千種不同的細菌種類為主。越來越多的證據(jù)證明腸微生物群在宿主新陳代謝中的作用。占腸微生物群的絕大部分的門(phyla)包括革蘭氏陰性擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)以及革蘭氏陽性厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)。以前表明，腸微生物群導致小鼠發(fā)生飲食誘導的肥胖。肥胖小鼠中的結(jié)腸微生物群似乎特征在于微生物多樣性較低以及碳水化合物和脂質(zhì)利用者(lipid-utilizer)豐富。據(jù)推定，由特定腸細菌產(chǎn)生的短鏈脂肪酸乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽可作為直接影響宿主的肝胰島素敏感性和外周胰島素敏感性的信號。另一方面，最近的研究表明，小鼠中較低的腸微生物多樣性與內(nèi)毒素血癥誘發(fā)的慢性炎癥和隨后發(fā)生的胰島素抗性有關。人類中，結(jié)腸微生物群的改變與肥胖相關，但缺乏關于物種的特定細菌群和致病作用的證據(jù)的共識。因為基于胰島素抗性的缺乏或存在而存在代謝健康的和不健康的肥胖表型，已發(fā)表的關于腸微生物群組成和人類肥胖之間的關聯(lián)的報告似乎被肥胖表型中的異質(zhì)性，各種混合因素(例如飲食，藥物使用)以及分析腸微生物群的研發(fā)方法連累。對于相對難見到的但暴露于大表面的小腸微生物群，尤其正確。已發(fā)現(xiàn)小腸的微生物多樣性小于結(jié)腸的微生物多樣性，且顯著富含屬于乳酸桿菌目(Lactobacillales)和韋永氏球菌(Veillonella)的細菌(Booijnketal.2010EnvMicrobiol12:3213-27)。因此，本領域需要找到適合治療和/或預防胰島素抗性和/或2型糖尿病的其它藥物，優(yōu)選可容易地融入患者生活方式的藥物，例如以用于日常消耗的食品組合物的形式。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明涉及用于預防和/或治療胰島素抗性和/或胰島素抗性相關的病癥如代謝性綜合征、血脂異常和2型糖尿病以及內(nèi)分泌疾病中的胰島素抗性(例如患有1型糖尿病、庫興氏病(Cushing'sdisease)和脂肪代謝障礙綜合征的肥胖個體)的霍氏真桿菌和近緣種(Eubacteriumhallietrel.)和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種(Alcaligenesfaecalisetrel.)。第二方面，本發(fā)明提供包含霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的藥物、食品或飼料組合物，用于預防和/或治療胰島素抗性和/或相關病癥如代謝性綜合征、血脂異常和2型糖尿病以及內(nèi)分泌疾病中的胰島素抗性(例如患有1型糖尿病、庫興氏病和脂肪代謝障礙綜合征的肥胖個體)。另一方面，本發(fā)明涉及預防和/或治療有需要的個體中胰島素抗性和/或相關病癥的方法，所述方法包括提高小腸中霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種水平的步驟?？梢酝ㄟ^選自下組中的方法提高小腸中霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的水平，即對所述個體施用有效量的霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種，以及施用能提高小腸中霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種水平的有效量的化合物。另一方面，本發(fā)明涉及包含糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的藥物、食品或飼料組合物。所述組合物可以是飲料。包含糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的所述藥物、食品或飼料組合物可用作藥物。定義本發(fā)明上下文中使用的術語“胰島素抗性(insulinresistance)”具有本領域中的通常含義。胰島素抗性是生理病癥，其中天然激素胰島素降血糖的效果變差。由此引起的血糖提高可將水平提升至正常范圍外，并對健康產(chǎn)生不利影響如代謝性綜合征、血脂異常以及隨后的2型糖尿病。本文中使用的術語“胰島素抗性相關的并發(fā)癥(insulinresistance-relatedcomplications)”和“胰島素抗性相關的病癥(insulinresistance-relatedconditions)”包含但不限于，代謝性綜合征、血脂異常和2型糖尿病以及內(nèi)分泌疾病中的胰島素抗性(例如患有1型糖尿病、庫興氏病和脂肪代謝障礙綜合征的肥胖個體)。在屬類(genus-like)組名(2級組名)后的加入詞“和近緣種(etrel.)”代表“和近緣種(etrelatives)”，表示該系統(tǒng)發(fā)育組的所有近緣種，即WO2011/043654(通過引用并入本文)的表3中標題為“3級(level3)”的列中所示的那些。該信息，包括顯示的16SrRNA基因序列，可以用于研發(fā)特異性PCR引物或LCR探針以檢測這些組的一個或多個成員。在一些文獻中，該加入詞“和近緣種”由“類(-like)”代替，來表示該組包括不只一個相關種類。然而，這是一個相當模糊不清的指定，因此所有帶有“和近緣種”的術語清楚地限定在已由Rajilic-Stojaniovic等公開的WO2011/043654的表3中(2007.Environ.Microbiol.9(9):2125-2136)。在本發(fā)明上下文中，個體可以是動物或人類。優(yōu)選地，該個體是人類。本文涉及的“健康個體(healthysubject)”沒有患有胰島素抗性和/或糖尿病，且優(yōu)選未患有任何胃腸道病癥或疾病，以及更優(yōu)選未患有任何已知的病癥或疾病。優(yōu)選地，本文涉及的“健康個體”的體重指數(shù)(BMI)范圍在18.5kg/m2和24.9kg/m2之間。如同本文使用的，當在樣品例如腸(例如十二指腸的或糞便的)樣品中的分類群霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌水平顯著高于對照樣品例如腸(例如十二指腸的或糞便的)對照樣品中所述一種或多種細菌的水平時，其提高。當樣品中的分類群霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌水平比對照樣品中的分類群霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌高至少5％，如10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％時，也認為其提高。本文中使用的“對照樣品(controlsample)”指的是在可選地以有效量施用分類群霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌之前，從接受通過施用分類群霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌的治療的個體獲得的樣品。本文中使用的術語“有效量(effectiveamount)”指的是足以實現(xiàn)期望的治療效果和/或預防效果的量，例如引起治療和/或預防胰島素抗性和/或胰島素抗性相關病癥如血脂異常和2型糖尿病以及內(nèi)分泌疾病中的胰島素抗性(例如患有1型糖尿病、庫興氏病和脂肪代謝障礙綜合征的肥胖個體)的量。在治療或預防應用情況下，對個體施用的細菌的量取決于疾病或病癥的種類和嚴重度，以及個體的特征如總體健康狀況、年齡、性別、體重和對藥物的耐受性。其還將取決于疾病或病癥的程度、嚴重度和種類。熟練技術人員根據(jù)這些和其它因素將能確定合適的劑量。該細菌還可以與一種或多種額外的治療化合物聯(lián)合施用。例如，短語細菌的“治療有效量”指能夠改善與胰島素抗性和/或胰島素抗性相關病癥如血脂異常和2型糖尿病以及內(nèi)分泌疾病中的胰島素抗性(例如患有1型糖尿病、庫興氏病和脂肪代謝障礙綜合征的肥胖個體)有關的疾病或病癥的生理效應的細菌水平。熟練技術人員將能確定何時這種疾病或病癥已被治療和/或預防。在本文件和其權利要求書中，動詞“包含(tocomprise)”及其變化形式以非限定形式使用，指包括了該詞后面的項目(item)，但并不排除沒有明確提及的項目。另外，動詞“組成(toconsist)”可以被“主要是由…組成(toconsistessentiallyof)”代替，意思是本發(fā)明的組合物可以包含除明確指明的組分以外的其它組分，所述其它組分不改變本發(fā)明的獨特特征。另外，除非本文清楚地要求有且只有元素中的一種，否則，由不定冠詞“一個(a)”或“一種(an)”提及的元素不排除存在不只一個元素的可能性。因此，不定冠詞“一個(a)”或“一種(an)”一般指“至少一個”。發(fā)明詳述本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)小腸微生物群在胰島素抗性和血脂異常中的致病作用。通過插入十二脂腸管及隨后隨機分配異體糞便移植或自體糞便移植對新診斷有代謝性綜合征的18例男性個體進行小腸活檢以及隨后的聚乙二醇腸灌洗。在對9例個體進行的異體糞便移植組中，該糞便材料來自健康的瘦的捐贈者。自體移植組包括9例其它個體，且這些個體接受他們自己的糞便材料。發(fā)現(xiàn)與自體組的那些個體相比，異體組的個體特征在于不同的S形腸微生物群，使用系統(tǒng)微陣列(人腸道芯片，HITChip)(Rajilic-Stojanovic.2009.Environ.Microbiol.11(7):1736-1751)進行分析確定。異體組個體中的富含TG的脂蛋白的空腹水平(TG/ApoB比)顯著降低，而自體糞便輸注后沒有影響。盡管個體的體重保持穩(wěn)定，但糞便移植6周后，發(fā)現(xiàn)6周時異體組中的外周(Rd)胰島素敏感度和肝胰島素敏感度(EGP抑制)均得到改善，而自體治療組中沒有發(fā)現(xiàn)顯著變化。本發(fā)明人已確定了接受異體糞便移植或自體糞便移植的個體之間的小腸微生物群中的變化。對異體組中在基線時和6周后的小腸微生物群組成進行比較顯示，與回腸寄居者糞產(chǎn)堿桿菌和產(chǎn)丁酸鹽的霍氏真桿菌有關的細菌大量提高。特別是，輸注后在自體組中，后面的產(chǎn)丁酸鹽菌幾乎降低兩倍。屬于霍氏真桿菌和近緣種的細菌包括相對快速生長的厭氧菌。它們具有在需要乙酸鹽的過程中將乳酸鹽轉(zhuǎn)化為丁酸鹽的代謝能力(Munoz-Tamayoetal2011FEMSMicrobiolEcolo76:615-624)。乳酸鹽和乙酸鹽是上腸道中豐富的代謝物，上腸道中寄生有能產(chǎn)生這些化合物的鏈球菌和乳酸桿菌(Booijinketal2010,參見上文)。然而，將底物乳酸鹽和乙酸鹽包含于含有屬于分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌的制劑，可以是本發(fā)明的一個具體實施方案。與糞產(chǎn)堿桿菌(屬于分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種)相關的細菌是降解各種底物的兼性厭氧細菌—其具有在低氧條件下，在氨存在時產(chǎn)生一氧化二氮和一氧化氮的非凡能力(Andersonetal1993ApplEnvironMicrobiol95:3525-33)。因為在上腸中滿足這些條件，所以糞產(chǎn)堿桿菌產(chǎn)生一氧化氮是可行的。已提出一氧化氮是治療患有2型糖尿病和代謝性綜合征的患者的一種治療方法(Ahanchietal2008.AmJPhysiolHeartCircPhysiol295:H2388-98)。然而，還沒有關于由腸細菌通過其生產(chǎn)遞送一氧化二氮的描述。因此，本發(fā)明涉及用于預防和/或治療胰島素抗性和/或胰島素抗性相關并發(fā)癥如代謝性綜合征、血脂異常和2型糖尿病以及內(nèi)分泌疾病中的胰島素抗性(例如患有1型糖尿病、庫興氏病和脂肪代謝障礙綜合征的肥胖個體)的分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌。另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于預防和/或治療哺乳動物如人類中由降血糖效果變差的內(nèi)源激素胰島素和之后的血漿膽固醇分析(profile)引起的臨床病癥的分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌。這種臨床病癥的非限制性實施包括代謝性綜合征、血脂異常和2型糖尿病以及內(nèi)分泌疾病中的胰島素抗性(例如患有1型糖尿病、庫興氏病和脂肪代謝障礙綜合征的肥胖個體)。任一種分類群中的細菌可以單獨用作用于指定目的的藥物，或者分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌可以一起用作藥物。此外，這些分類群的細菌的任一種或任一種分類群的細菌的組合可以與目前臨床實踐中使用的治療劑(例如雙胍、磺基尿素衍生物、PPARγ激動劑、DPPIV抑制劑以及可注射藥物如GLP1激動劑和/或外源短/長效胰島素)一起使用。本發(fā)明還涉及包含霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的藥物、食品或飼料組合物，其用于預防和/或治療胰島素抗性和/或相關并發(fā)癥如血脂異常和2型糖尿病的)。該藥物、食品或飼料組合物優(yōu)選包含有效量的霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種。優(yōu)選地，該藥物、食品或飼料組合物包含總計約106至約1012個、優(yōu)選約108至約1012個分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌。優(yōu)選地，按日常劑量包含所述細菌。另一方面，本發(fā)明涉及包含糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的藥物、食品或飼料組合物，其可選地用作藥物。這種組合物可以包含載體如惰性載體。優(yōu)選地，本文涉及的組合物用于腸內(nèi)給藥或口服給藥。用于腸內(nèi)給藥或口服給藥的組合物可以是食品組合物、飼料組合物或藥物組合物。這種食品組合物、飼料組合物或藥物組合物不包括糞便組合物或衍生自糞便組合物的組合物。除了分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌外，該藥物組合物一般還包含載體如藥物載體。該載體優(yōu)選是惰性載體。優(yōu)選的形式取決于給藥和(治療)應用的既定模式。藥物載體可以是適合將分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌遞送至個體的胃腸道的任何可兼容的無毒物質(zhì)。例如，無菌水或惰性固體可以用作載體，其通常輔以藥學上可接受的助劑、緩沖劑、分散劑等。組合物將是液體的形式，例如分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌的穩(wěn)定懸浮液，或是固體的形式，例如分類群霍氏真桿菌和近緣種的凍干細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌的粉末。在凍干情況時，可以想到冷凍保護劑如乳糖、海藻糖或糖原。例如對于口服給藥，分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌可以以固體劑形式如膠囊、片劑和粉劑施用，或者以液體劑形式如酏劑、糖漿和懸浮劑施用。分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌可以與非活性成分和粉末載體，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纖維素或纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸、糖精鈉、滑石、碳酸鎂等一起裝入膠囊如明膠膠囊中。本發(fā)明的優(yōu)選組合物適于被優(yōu)選是人類或非人動物的個體使用。這種組合物可以是食品補充劑或食品或食品組合物(本文中共同稱為“食品組合物”)的形式，除分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌以外，其還含有適合的食品配料(foodbase)?？蛇x擇地，這種組合物可以是飼料補充劑或飼料或飼料組合物(本文中共同稱為“飼料組合物”)的形式。本文中的食品或食品組合物或飼料組合物理解為包括用于人類或非人動物消耗的液體，例如飲料(drink)或飲料(beverage)。食品或食品組合物或飼料組合物可以是固體的，半固體的和/或液體的食品或食品組合物，且具體地可以是乳制品，如發(fā)酵乳制品，包括但不限于酸奶、基于酸奶的飲料或脫脂乳。可以按本身已知的方式制備這種食品或食品組合物或飼料組合物，例如通過將分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌以合適的量加到適合的食品、食品配料或飼料配料中。同樣，因為它們必須通過低pH的胃，所以可以包括以如上所述的膠囊形式使用這些細菌。其還可以是降低與屬于分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌的生長有關的丁酸鹽的含量的優(yōu)選方式，且可能會產(chǎn)生食品或食品組合物中的異味。在另一個實施方案中，分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌可以用于或用來制備食品或食品組合物或飼料組合物，例如通過發(fā)酵。在這種情況下，可以以已知的方式將分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌用于制備這種發(fā)酵食品或食品組合物或發(fā)酵的飼料組合物，例如以已知的方式使用乳酸細菌制備發(fā)酵的乳制品。在這種方法中，除了通常使用的微生物以外，還可使用分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌，和/或其可代替通常使用的微生物的一種或多種或部分。優(yōu)選地，上述組合物將包含以允許上述方便(口服)給藥的量(例如作為或以每天或每周一劑或多劑)的分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌。特別是，制劑可以含有單位劑量的分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌。另一方面，本發(fā)明涉及預防和/或治療有需要的個體中胰島素抗性和/或相關并發(fā)癥如血脂異常和2型糖尿病的方法，所述方法包含提高小腸中霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種水平的步驟?？梢酝ㄟ^測定所述一種或多種細菌的特定的核酸序列、氨基酸序列和/或代謝物的水平，優(yōu)選所述一種或多種細菌的特定的核酸序列的水平，來測定所述分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌的水平。優(yōu)選地，可以通過測定來自小腸的測試樣品中的特定核酸序列的水平來測定所述一種或多種細菌，其中所述核酸序列優(yōu)選是分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌和/或分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌的16SrRN基因序列，更優(yōu)選地是所述16SrRN基因序列的一種或多種可變區(qū)，例如所述16SrRN基因序列的可變區(qū)V1和/或V6的一種或多種。可以通過選自下組中的方法提高小腸中霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的水平，即對所述個體施用有效量的霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種，以及施用能提高小腸中霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種水平的有效量的化合物。能提高小腸中霍氏真桿菌和近緣種水平的化合物可以包括但不限于乳酸鹽和乙酸鹽?？蛇x擇地，霍氏真桿菌和近緣種可以與產(chǎn)乳酸的細菌如乳酸菌(Lactobacillusspp.)和雙歧桿菌(Bifidobacteriumspp.)聯(lián)合施用。該產(chǎn)乳酸的細菌可以存在于發(fā)酵食品產(chǎn)品如酸奶或酸奶飲料本身中，并且可以加入霍氏真桿菌和近緣種中。能提高小腸中糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種水平的化合物可以包括但不限于，允許在低氧條件下氨存在時產(chǎn)生一氧化二氮和一氧化氮的底物。在一個實施方案中，分類群霍氏真桿菌和近緣種的細菌是來自霍氏真桿菌菌種L2-7的細菌。霍氏真桿菌菌種L2-7(DSM17630)可從DeutscheSammlungvonMikroorganismen(DSMZ)獲得?？梢岳绨凑誂nnamalai等的方法培養(yǎng)分類群糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的細菌(AnnMicrobiol.2011December；61(4):801-807)。熟練技術人員將能夠使用本領域中常規(guī)方法選擇能提高小腸中霍氏真桿菌和近緣種和/或糞產(chǎn)堿桿菌和近緣種的水平的有效量的化合物。本說明書中引用的所有專利和參考文獻，通過引用全文并入本文中。將清楚的是，上述說明是為了說明本發(fā)明的一些實施方案，而不限制其保護范圍。從本發(fā)明開始，在本發(fā)明的保護范圍和本質(zhì)內(nèi)以及現(xiàn)有技術領域的技術和本專利的內(nèi)容的明顯結(jié)合的更多的實施方案，對技術人員來說將是顯而易見的。實施例實施例1方法進行雙盲隨機對照實驗，其中研究了肥胖個體中單一異體(瘦捐贈者)微生物糞便輸注對與腸微生物群組成有關的葡萄糖代謝的影響。個體按包含腰圍>102cm和空腹血糖>5.6mmol/1的代謝性綜合征的特征篩選男性高加索人肥胖個體。將在過去三個月中做過膽囊切除術和/或使用任何藥物、益生菌和/或抗生素的17例個體排除。從所有個體獲得書面知情同意書。該研究經(jīng)過倫理審查委員會的同意，并按照赫爾辛基宣言的原則進行(1996)。該研究在在線荷蘭試驗注冊中心(DutchTrialRegister)注冊(NTR1776)。瘦捐贈者篩選還通過報紙廣告招募瘦男性高加索人(BMI<23kg/m2)。他們完成關于腸習慣、旅行歷史、伴隨疾病和藥物使用的問卷調(diào)查。根據(jù)荷蘭輸血服務部的問卷調(diào)查的改編版篩選存在感染性疾病的捐贈者(Sanquin)(Langeveldetal.2008.JClinEndocrinolMetab；93(3):845-851)。篩選存在對人免疫缺陷病毒、人T-淋巴細胞病毒、甲型、乙型及丙型肝炎、巨細胞病毒、愛潑斯坦－巴爾二氏病毒(Epstein-Barrvirus)、類圓線蟲病以及阿米巴病的抗體的血液。還排除篩選捐贈者糞便時顯示存在寄生蟲(例如人芽囊原蟲(Blastocystishominis)或脆弱雙核阿米巴(Dietamoebafragilis))、艱難梭狀芽胞桿菌(Clostribiumdifficile)和可能的其它病原細菌的捐贈者(Shigella,Campylobacter,Yersinia,Salmonella)。實驗設計使用[6,62H2]-葡萄糖測量基礎狀態(tài)中以及在兩步高胰島素正糖鉗夾術中的葡萄糖代謝，以測量內(nèi)源性葡萄糖生產(chǎn)(EGP)、肝胰島素敏感度和外周胰島素敏感度(處理率(Rateofdisposal),Rd)。記錄體重，并使用生物阻抗分析測量體成分。使用間接測熱法(Langeveld,JClinEndocrinolMetab2008；93(3):845-851)測量靜息能量消耗(REE)和呼吸商。允許參與者保持其自己的飲食，但要求保持每周在線營養(yǎng)日記(www.dieetinzicht.nl)以監(jiān)控熱量攝入。整夜禁食后，研究個體和捐贈者帶來新產(chǎn)生的晨便以供處理；以雙盲的方式通過胃-十二指腸灌注(參見手術程序)對研究個體隨機進行異體(來自BMI<23kg/m2的瘦男性捐贈者)或自體(自己收集的糞便)腸微生物灌注。首先對研究個體進行胃十二指腸吻合術，然后在特賴茨韌帶(Treitzligament)附近進行小腸(空腸)活檢。將活檢樣品收集到無菌試管中，于液氮中急凍并按之前描述的進行處理(Langeveldetal.,supra)。將十二指腸管定位，并用聚乙二醇溶液進行5小時以上腸灌洗以清除外源糞便污染，然后進行腸微生物灌注。移植6周后重復胃十二指腸吻合術輔助的活檢和高胰島素正糖鉗夾術。高胰島素正糖鉗夾術12h禁食后，將導管插入肘前靜脈以灌注穩(wěn)定同位素示蹤劑[6,6-2H2]葡萄糖(CambridgeIsotopes(劍橋同位素),Andover,MA)、胰島素和葡萄糖。將第二導管逆行插入對側(cè)手靜脈中，并保持在用于動脈化靜脈血采樣的溫控(60℃)干凈塑料盒中。以50mL/h的速率輸注0.9％NaCl的鹽水以將導管保持在體內(nèi)。在t＝0h(0800)時，抽取血液樣品用于測定背景富集。然后，開始同位素的引物連續(xù)輸注：[6,6-2H2]葡萄糖(引物：8.8μmol/kg；連續(xù)：0.11μmol·kg-1·min-1)，并繼續(xù)輸注直到鉗夾結(jié)束。2h(小時)平衡期后，抽取用于同位素富集的血液樣品和用于葡萄糖調(diào)節(jié)荷爾蒙，游離脂肪酸(FFA)以及腸降血糖素的樣品。其后(t＝2.0h)，開始兩步高胰島素正糖鉗夾術：步驟1包括以20mU·m-2·min-1的速率輸注胰島素(Actrapid200lU/mL；NovoNordiskFarmaBV,AlphenaandenRijn,Netherlands)以評價肝胰島素敏感度。開始20％的葡萄糖以保持5mmol/L的血糖濃度。每5分鐘使用貝克曼血糖儀(Beckmanglucosemeter)在旁邊測量血糖濃度。2h后(t＝4h)，每5分鐘間隔抽取血樣用于測量葡萄糖濃度和同位素富集。抽取其它血樣用于測量葡萄糖調(diào)節(jié)荷爾蒙和FFA。其后，將胰島素輸注速率提高到60mU·m-2·min-1(步驟2)以評價外周胰島素敏感度。另一個2h后(t＝6h)，重復血液采樣。用生物電阻抗分析測量基線時和6周后的體成分(MaltronBF906；Maltron,Rayleigh,UK)。在基礎狀態(tài)和高胰島素正糖鉗夾術的最后20min(分鐘)時，使用通風罩系統(tǒng)通過間接測熱法連續(xù)測量氧消耗(VO2)和CO2生產(chǎn)(VCO2)(Sensormedicsmodel2900；Sensormedics,Anaheim,CA)。由氧消耗和二氧化碳生產(chǎn)計算REE速率、碳水化合物氧化(CHO)速率以及脂肪酸氧化(FAO)速率。使用之前描述的非穩(wěn)定狀態(tài)測量的斯蒂爾方程(Steeleequation)的改進形式計算葡萄糖的出現(xiàn)速率(Ra)和消失速率(Rd)。外源葡萄糖生產(chǎn)(EGP)計算為Ra葡萄糖和葡萄糖輸液速率之間的差。外周(Rd)胰島素敏感度和肝胰島素敏感度(EGP抑制)都計算并表達為范圍的中值。腸微生物群分析DNA分離使用之前描述的重復珠擊打法加柱方法分離和純化DNA(Zoetendal,SystApplMicrobiol2001；24(3):405-410)。對于活檢的DNA分離，我們使用不同的珠擊打方案(Nadkarnietal.2002.Microbiology2002；148(Pt1):257-266)。簡言之，將0.5g(濕重)糞便懸浮于裂解液(Lysisbuffer)(500mMNaCl,50mMTris-HCIpH8,50mMEDTA,4％SDS)以及鋯珠和玻璃珠中。使用Fastprep(設為5.5)于4℃將試管搖晃3min(分鐘)，隨后于95℃培育15min。用乙酸銨和異丙醇沉淀上清液中的DNA，用70％的乙醇洗滌，然后用蛋白酶K和無DNaseRNase處理。最后，根據(jù)廠商說明書于QIAamp吸附柱(Qiagen)上純化DNA。使用NanoDrop1000分光光度計(Technologies,Wilmington,DE)定量DNA濃度。HIT芯片微生物群分析使用HIT芯片系統(tǒng)分析糞便中的微生物群和之前描述的小腸活檢(Rajilic-Stovanojic.2009,參見上文)。簡言之，使用T7prom-Bact-27-for和Uni-1492-rev引物用10ngDNA來擴增16SrRNA基因，之后進行體外轉(zhuǎn)錄并用分別用于糞便樣品的Cy3和Cy5標記。因為Uni-1492-rev主要以過多的人DNA為靶，導致對有效細菌16SrRNA基因的擴增的消耗，所以將引物Prok-1369-rev用作活檢樣品的逆向引物(數(shù)據(jù)未示出)。將Cy3/Cy5標記的16SrRNA靶的等摩爾混合物分段，之后在旋轉(zhuǎn)爐中于62.5℃在微陣列上雜交16h(AgilentTechnologies,Amstelveen,TheNetherlands)，然后洗滌并干燥切片。將樣品排成陣列，一式兩份(技術重復)。掃描切片后，使用安捷倫特征提取(AgilentFeatureExtraction)軟件，7.5-9.1版(http://www.agilent.com)，從微陣列圖像中提取數(shù)據(jù)。之后，將微陣列數(shù)據(jù)最小-最大標準化，并使用一系列基于R的腳本(scripts)(http://www.r-project.org/)結(jié)合MySQL數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)下運行的用戶定制相關數(shù)據(jù)庫(http://www.mysql.com)進行進一步分析。使用基于相關性的距離和全聯(lián)法進行探針曲線的分層聚類。糞便移植過程在輸注那天，患者和捐贈者遞交新產(chǎn)生的糞便(大約200g，使用前6小時內(nèi)產(chǎn)生)。于處理之前和之后提取糞便樣品(異體或自體)，以研究對微生物組成的手術影響。遞交后，用500cc無菌鹽水(0.9％NaCl)覆蓋糞便，轉(zhuǎn)移到混合器中，并混合10分鐘。然后用干凈的金屬篩將均質(zhì)的溶液過濾兩次。隨后，將過濾物轉(zhuǎn)移到1000ml的無菌玻璃瓶中，于室溫下儲存，直到患者完成腸灌洗。最后，通過十二指腸管于大約30分鐘內(nèi)逐步灌注糞便微生物溶液。生物化學獲取空腹血漿樣品，使用商用酶試驗來測定總膽固醇、LDL膽固醇(LDLc)、HDL膽固醇(HDLc)以及甘油三酯(TG)(Randox,USA和Daiichi,Japan)。使用CobasMira自動分析儀進行所有分析(Horiba,France)。使用商業(yè)ELISA(HyCult,USA和Roche,Switzerland)測定LPS結(jié)合蛋白(LBP)和C反應蛋白(CRP)。按之前描述的分析包含乙酸鹽、丁酸鹽和丙酸鹽的糞便短鏈脂肪酸濃度(Woleveretal.2000.BrJNutr；84(1):57-61)。腸微生物群和宿主粘膜反應分析從捐贈者和研究個體獲取基線時以及6周后分別收集的晨便樣品，以測定微生物群組成。將樣品收集進兩個塑料容器中，于-20℃立即冷凍，并在一周內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80℃。使用人腸道芯片(HITChip)、含有覆蓋1000以上的腸種類的大約5500個寡核苷酸探針的定制安捷倫微陣列(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA,USA)測定小腸活檢和糞便樣品的微生物群組成(Rajilic-Stojanovicetal.2009,參見上文)。通過具有用于HIT芯片分析的同一DNA的16SrRNA基因定量PCR進行總細菌和產(chǎn)甲烷菌的定量分析。將使用人類HT-12v3表達陣列的小腸活檢轉(zhuǎn)錄組(lllumina,SanDiego,USA)原始數(shù)據(jù)上傳至基因表達數(shù)據(jù)庫(注冊號：GSE30854)中。補充附錄中提供腸微生物群和陣列分析的詳細信息。統(tǒng)計分析用SPSS軟件，16版，進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)表達為平均值±平均數(shù)標準誤差(正態(tài)分布)或平均值(偏態(tài)分布)。使用學生t-檢驗(t-test)(正態(tài)分布)或威氏符號秩次檢驗(WilcoxonSignedranktest)(偏態(tài)分布)比較組之間的數(shù)據(jù)。所有報告的P值都是兩面的。使用線性混合隨機森林方法以及典型相關分析(CCA)進行HIT芯片(HITChip)和llumina陣列(lluminaarray)的表達分析。使用微軟Excel或R統(tǒng)計軟件(http://r-project.org/)進行統(tǒng)計學檢驗。HITChip和llumina陣列的統(tǒng)計分析使用NLME包進行HIT芯片和llumina陣列的表達分析(PinheiroandBates.Mixed-effectmodelsinSandS-plus.Springer；2000(S和S+的混合效果模型))。構(gòu)建具有時間(0或6周)影響、處理(自體或異體)影響和兩種主要影響的交叉效果的線性混合模型。通過包括患者特異性隨機效果考慮實驗的重復測量設計。對于每個測量單元(基因或細菌)，使用multcomp包計算對比，且因此，通過q值包(q-valuepackage)對獲得的p值進行多重比較的相關性分析(Bretz.HTWP.MultipleComparisonsUsingR.CRCPress,BocaRaton,2010(使用R的多重比較)；StoreyJ.A.Adirectapproachtofalsediscoveryrates.JournaloftheRoyalStatisticalSocietySeriesB(statisticalmethodology)2010；64(3):479-498(錯誤發(fā)現(xiàn)率的直接法))。通過計算移植時獲取的樣品和6周后獲取的樣品之間的寡核苷酸水平中的皮爾森相關，測定兩組患者中糞便微生物群的獨特時間穩(wěn)定性。通過隨機森林法，使用移植之前和移植6周后的細菌組成變化作為協(xié)變量來測定空腸樣品中的與異體組和自體組之間的差異有關的細菌組。然后使用輔助程序(Bootstrap)求平均值(裝袋(bagging))(Breiman.Baggingpredictors.MachineLearning1996；24(2)(裝袋預報器))結(jié)合冗余分析，獲得導致差異的組的穩(wěn)健估計，以評估分離的p值，并將結(jié)果可視化。使用稀疏典型性相關分析(sparsecanonicalcorrelationanalysis,sparseCCA)測定基因表達和空腸樣品之間的關聯(lián)。為了降低過度擬合的影響，有關聯(lián)的系列基因由前10個差異表達基因組成。微生物群數(shù)據(jù)由關于發(fā)現(xiàn)能顯著引起空腸樣品中的自體樣品和異體樣品之間的差異的6個分類群的HIT芯片數(shù)據(jù)組成。CCA分析中，首先用留一交叉驗證法(leave-one-outcross-validation)估計正則化參數(shù)。然后用所有數(shù)據(jù)重復該模型，并且計算每一個變量與標準變量的相關性。結(jié)果基線特征按代謝性綜合征特征篩選總計44例男性肥胖個體，其中包括20例合格個體。由于在與微生物移植無關的實驗中使用抗生素，由分析排除兩例個體。因此，18例個體可用于分析。糞便移植對胰島素敏感度、糞便SCFA以及LBP的影響7例健康的瘦捐贈者，其中1例捐贈多個捐贈品，用于患有代謝性綜合征的9例肥胖個體的異體移植。給來自異體或自體微生物糞便輸注的肥胖個體輸注同等量的糞便(190±33和187±47g，ns)。另外，糞便產(chǎn)生和輸注之間的處理時間沒有不同(異體組和自體組中分別為5.8±0.8和6.1±1.2小時)。實驗中沒有肥胖個體有任何不良反應或患上羅馬Ⅲ標準(RomeIIIcriteria)的腸道易激綜合癥。兩組中基線時和6周時之間的體重保持穩(wěn)定(異體組：122.7±19-122.5±19kg；自體組：113.2±20-113.4±20kg，ns)。輸注微生物糞便后兩組中沒有觀察到有對日常飲食攝入、靜息時能量消耗或碳水化合物/脂肪酸氧化的影響(數(shù)據(jù)未示出)。異體糞便處理6周后外周胰島素敏感度顯著改善(中值Rd：26.2-45.3μmol/kg·min，p<0.05)，而自體處理組中沒有觀察到明顯變化(中值Rd：21.0-19.5μmol/kg·min，ns)。觀察到肝胰島素敏感度的改善趨勢，表達為從基本狀態(tài)開始的EGP抑制(中值EGP抑制：51.5-61.6％，p＝0.08)，而自體處理組中沒有觀察到影響(中值EGP抑制：53.8-52.4％，ns)。兩組的基本狀態(tài)中或高胰島素血癥時的葡萄糖調(diào)節(jié)荷爾蒙均沒有變化(數(shù)據(jù)見文檔)。瘦捐贈者的特征在于與肥胖參與者相比，收獲的丁酸鹽和丙酸鹽的糞便增加，以及異體微生物糞便輸注觀察到的特性。此外，我們發(fā)現(xiàn)瘦捐贈者移植6周后，脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)顯著減少(中值LBP：19.9-18.6μg/ml，p<0.05和中值CRP：1.5-1.6，ns)，而自體組中沒有顯著變化(中值LBP：23.0-22.3μg/ml，和中值CRP：3.1-2.5，ns)。糞便移植對糞便中腸微生物群的影響肥胖個體的糞便微生物群特征在于，與瘦捐贈個體相比，更低的腸微生物多樣性、更大量的擬桿菌以及減少量的梭狀芽孢桿菌屬XIVa細菌(數(shù)據(jù)未示出)。為了測定微生物移植的影響，我們比較了基線時和6周后的糞便微生物群。微生物糞便輸注后，糞便細菌的總數(shù)沒有變化。在6周時，對屬類水平的分析顯示屬于異體組和自體組的樣品清楚分離。異體微生物糞便輸注時，11例細菌組總量顯著增加(1.5-2.5倍)，并顯著地引起組的分離。這些包括與眾所周知的產(chǎn)丁酸鹽菌羅氏腸炎胎弧菌(Roseburiaintestinalis)、轉(zhuǎn)化草酸鹽的食草酸桿菌(Oxalobacterformigenes)、各種瘤胃球菌(Ruminococci)以及其它厚壁菌(Firmicutes)有關的那些。糞便移植對小腸中腸微生物群的影響微生物糞便輸注后，小腸細菌的總數(shù)量沒有變化。6周時檢測到與異體組和自體組之間的小腸活檢差異明顯有關的7種細菌(表1)。在另外的分析中，發(fā)現(xiàn)瘦捐贈者糞便移植6周后，小腸霍氏真桿菌濃度和患有代謝性綜合征的人類個體中胰島素敏感度(Rd)的改善之間有顯著關聯(lián)(r＝0.8，p<0.01)。另外，發(fā)現(xiàn)瘦捐贈者糞便移植6周后，小腸糞產(chǎn)堿桿菌濃度和患有代謝性綜合征的人類個體中胰島素敏感度(Rd)的改善之間有顯著關聯(lián)(r＝0.6，p<0.05)。顯著地，輸注后自體組中霍氏真桿菌幾乎降低兩倍。特別的是，與異體組相比，自體組中其它細菌增加，包括回腸寄居者如牛乳酸桿菌(Lachnobacillusbovis)、牛鏈球菌(Streptococcusbovis)和反芻瘤胃亞菌(Prevotellaruminicola)。棒狀桿菌(Corynebacteriumspp.)在異體組中減少，但在自體組中增加。最后，與革蘭氏陰性大腸桿菌有關的細菌在異體組中幾乎減少2倍，在自體組中增加2倍(表1)。表1異體糞便移植后空腸粘膜微生物群的變化(每組n＝9)實施例2如Barcenilla等(2000,Appl.Environ.Microbiol.,Apr；66(4):1654-61；DSM17630；obtainedfromthelaboratoryofProf.HarryFlint,RowettResearchInstitute,Aberdeen,Scotland,UK)描述的霍氏真桿菌于厭氧條件下在2個各500ml的Wilkins-Chalgren培養(yǎng)基瓶中生長(1976,Antimicrob.AgentsChemother.10.926-928)，直到每毫升有大約2×109個細胞。隨后，將培養(yǎng)物離心(4℃，10000rpm，15分鐘)，用厭氧PBS(20mM，pH7，如http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphate_buffered_saline中描述的)洗滌兩次，然后重懸浮于具有20mM葡萄糖和20mM麥芽糊精的20mMPBS中的20ml10％甘油中，以及于-80℃在含有大約1011個細胞/ml的100μl等分試樣中冷凍。所有操作于厭氧條件下進行。實施例3從杰克遜實驗室(JacksonLaboratory，BarHarbor,ME,USA)獲取C57BL68背景的8周齡db/db雄性老鼠以及雄性C57BL6老鼠，并允許其在開始實驗前的2周內(nèi)，先在AMC動物實驗室(ARIA)適應。將老鼠置于控溫控濕的恒定12小時光-暗循環(huán)中，并使其可隨意獲取食物(常規(guī)飲食)和水。一周測量一次體重。在10周齡時開始，按100μl高葡萄糖載體(20mM)中106、108或1010CFU口服施用霍氏真桿菌。早晨使用21號注射器通過日?？诜钗狗ㄊ┯迷撊芤?2天(每組n＝8)。只施用載體，用作對照。以漸增的劑量(分別是10×E10/100μl、10×E8/100μl和10×E6/100μl或溶劑(鹽水+甘油))對db/db老鼠(每組n＝8)口服施用培養(yǎng)的霍氏真桿菌2周。如實施例1中描述的測定其對脂質(zhì)檢查(如實施例1中描述的空腹血漿樣品中總膽固醇、LDLc、HDLc及TG的測定)、空腹血糖和胰島素抗性的胰島素水平(HOMA)以及餐后葡萄糖(口服葡萄糖耐量試驗)的影響。由質(zhì)譜測定外周血和肝門血(portalblood)中短鏈脂肪酸乙酸鹽、丁酸鹽和丙酸鹽的水平(參見Vriezeetal.,Gastroenterology2012,June20,印刷前電子版)。另外，小鼠犧牲后，研究小腸樣品和糞便樣品的霍氏真桿菌濃度。本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)補充到小腸的短期口服霍氏真桿菌L2-7對胰島素抗性標準化(如由HOMA計算和依據(jù)口服葡萄糖耐量曲線的AUC的餐后葡萄糖代謝測定的)以及db/db老鼠中空腹脂質(zhì)檢查的明顯影響。