專利名稱：一種溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料和生物大分子自組裝技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前，聚乳酸材料已經(jīng)成為生物醫(yī)用材料中最受重視的材料之一，并且被廣泛應(yīng)用于組織工程支架、醫(yī)用縫合線、藥物控制釋放載體等生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。然而，聚乳酸材料表面缺少生物活性基團，從而降低了其對生物體的相容性能。此外,普通的生物材料本身不具有抗菌性，植入人體后材料表面會出現(xiàn)細菌的黏附和繁殖，從而引發(fā)機體組織發(fā)生病變，這是導(dǎo)致相關(guān)組織感染和植入手術(shù)的失敗的主要原因[Biomaterials，1998，19(7 9) : 851 859]。因此，如果使生物材料表面具有較好生物相容性的同時還具有抗菌活性，就能對植入材料引起的術(shù)后感染及其并發(fā)癥起到有效控制和預(yù)防作用。常用的生物材料表面修飾方法有表面化學(xué)接枝修飾、等離子表面改性以及表面層層自組裝修飾等。近年來，材料表面層層自組裝的研究引起了人們的廣泛關(guān)注，層層自組裝技術(shù)(Layer-by-Layer self-assemble, LbL)是基于聚電解質(zhì)陰陽離子所帶正負電荷間相互作用的一種自組裝超分子技術(shù)。該技術(shù)與其它生物材料表面修飾技術(shù)相比，具有一系列優(yōu)點，例如操作簡單，制備條件溫和，自組裝分子的選擇范圍廣泛等[AdvancedMaterials, 2006, 18，3203]。并且，該方法可在常溫水溶液中進行，因而有利于保持生物大分子的天然構(gòu)象和生物活性。因此，該技術(shù)已成為生物醫(yī)用材料表面功能設(shè)計的有效手段。生物多糖是一種廣泛存在于生物體中，具有特殊生理活性以及良好生物相容性的一類物質(zhì)。目前，將生物多糖類物質(zhì)固定在材料表面是改善生物醫(yī)用材料的生物相容性和表面生物性能最為有效的途徑之一。值得注意的是，在為數(shù)眾多的生物多糖中，香菇多糖表現(xiàn)出十分顯著的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗菌等多方面的生物活性[AppliedMicrobiology and Biotechnology, 2002, 60 (3):258 274]。此外，溶菌酶(Iysozyme)是一種天然的抑菌劑，它廣泛存在于人體的多種組織器官以及血液、汗液等分泌物中。這種酶是一種專門作用于微生物細胞壁的糖苷水解酶，它能通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸(NAM)的I位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子間的β -I, 4糖苷鍵，使細菌的細胞壁分解，從而起到抑制細菌活性的作用[Bioprocess and Biosystems Engineering, 2009, 32:633 639]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料及其制備方法，該方法制備的聚乳酸材料的表面具有良好的抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌活性，該材料表面的血液相容性也得到改善；同時該材料制備工藝較簡單，反應(yīng)迅速，易于控制，成本較低廉。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用以下的技術(shù)方案
一種溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料，其特征在于它由基材和修飾層組成，基材由表面氨基化的聚乳酸材料構(gòu)成，修飾層是在所述基材的表面利用層層自組裝技術(shù)進行表面修飾而得到；其中，修飾層中含有在所述基材表面交替層層自組裝的溶菌酶和香菇多糖硫酸酯。本發(fā)明先通過化學(xué)修飾方法制備香菇多糖硫酸酯，再 利用氨基化反應(yīng)使聚乳酸基材表面帶上氨基基團，然后使基材表面帶正電后，再通過表面層層自組裝交替吸附溶菌酶和香菇多糖硫酸酯，從而構(gòu)成修飾層；基材采用普通商用聚乳酸材料，其和修飾層構(gòu)成所述的一種溶菌酶和香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料。上述一種溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料的制備方法，其特征在于它包括如下步驟
1)香菇多糖硫酸酯衍生物的制備
按香燕多糖二甲基亞砜卩比唳氯磺酸=(0. 6 I. 2) g: (50 100) mL: (9 18) mL: (3. 7 7. 4) mL,選取香燕多糖、二甲基亞砜、卩比唳和氯磺酸,備用；
將香菇多糖加入裝有二甲基亞砜的反應(yīng)容器中，在20 30°C下攪拌12 18小時，再以2 4mL/分鐘的速度緩慢逐滴滴加吡啶，繼續(xù)攪拌30 40分鐘，然后將反應(yīng)容器置于冰浴中，攪拌下用恒壓漏斗以0. 5 ImL/分鐘的速度逐滴緩慢滴加氯磺酸，滴加完畢后升溫至80°C繼續(xù)攪拌反應(yīng)100 120分鐘，反應(yīng)停止后冷卻至室溫，用質(zhì)量百分數(shù)為I 10wt%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0，得到反應(yīng)液；再將所得反應(yīng)液注入再生纖維素透析袋中，在pH為10的NaOH溶液中透析12 18小時,再用自來水流水透析4 6天,蒸懼水透析3 5天，然后將透析液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，最后經(jīng)過冷凍干燥，得到黃色粉末狀的香菇多糖硫酸酯；
2)聚乳酸膜片的制備
按聚乳酸二氯甲烷=(6 12) g: (45 90) mL，選取聚乳酸和二氯甲烷，首先將聚乳酸材料溶于二氯甲烷中，待攪拌完全溶解后將溶液倒入平底成膜盤內(nèi)，在室溫下干燥24 48小時，待溶劑完全揮發(fā)后，得到聚乳酸薄膜；
將上述聚乳酸薄膜切成圓形膜片，在體積比為I : I的乙醇水溶液中攪拌清洗2 3小時，以除去表面的雜質(zhì)，然后用大量的蒸餾水清洗，在40 50°C真空干燥24 48小時，得到聚乳酸膜片；
3)聚乳酸膜片表面氨基化
按聚乳酸膜片含乙二胺的異丙醇溶液=(4 8)g: 60mL，選取聚乳酸膜片和含乙二胺的異丙醇溶液，含乙二胺的異丙醇溶液的濃度為0. 09g/mL ；
將上述的聚乳酸膜片放入含乙二胺的異丙醇溶液中，在45 50°C下攪拌反應(yīng)3 5分鐘，得到表面帶有氨基官能團的聚乳酸膜片，再用大量蒸餾水沖洗聚乳酸膜片，以除去其表面物理粘附的乙二胺，然后在室溫下將表面帶有氨基官能團的聚乳酸膜片用濃度為
0.012mol/L的HCl溶液浸泡15 30分鐘，再用蒸餾水洗滌膜片4 8次，得到表面氨基化的聚乳酸膜片基材；
4)香菇多糖硫酸酯溶液、溶菌酶溶液的制備
按溶菌酶香菇多糖硫酸酯=(1.0 2.0)mg: (I. 0 2.0)mg，選取溶菌酶和香菇多糖硫酸酯；
將溶菌酶溶解于濃度為O. 15mol/L的NaCl溶液中，得到溶菌酶溶液，其中溶菌酶的濃度 I. O 2. O mg/mL ；
將香菇多糖硫酸酯溶解于濃度為O. 15mol/L的NaCl溶液中，得到香菇多糖硫酸酯溶液，其中香燕多糖硫酸酯的濃度為I. O 2. O mg/mL ；
5)在聚乳酸表面進行溶菌酶和香菇多糖硫酸酯的層層自組裝
將上述步驟3)得到的表面氨基化的聚乳酸膜片基材加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15 20分鐘，然后分離出膜片用O. 15mol/L NaCl溶液洗滌4 6次，制備出表面具有香菇多糖硫酸酯的膜片；
再將該膜片加入到溶菌酶溶液中浸泡15 20分鐘，分離出膜片用O. 15 mol/L NaCl溶液洗滌4 6次，然后再加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15 20分鐘，分離出膜片用
O.15mol/L NaCl溶液洗滌4 6次，完成聚乳酸表面的第一個雙分子層的自組裝；按上述步驟，在溶菌酶溶液和香菇多糖硫酸酯溶液中分別交替自組裝5次后，得到香菇多糖硫酸酯為最外層的含5個雙分子層的表面層層自組裝修飾的聚乳酸膜片，再用去離子水洗滌4 6次后，再將聚乳酸膜片在室溫的條件下干燥24 48小時，得到一種溶菌酶和香菇多糖硫酸酯層層自組裝修飾的聚乳酸材料；
本發(fā)明制備得到的一種溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料應(yīng)用于生物醫(yī)用材料方面，特別適用于制備既具有良好生物相容性又具有抑菌抗感染作用的人造器官和裝置的生物醫(yī)用材料具有廣泛的用途。本發(fā)明一種溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料，采用的層層自組裝表面修飾的物質(zhì)是溶菌酶和香菇多糖硫酸酯。因此，本發(fā)明采用的聚乳酸表面修飾物質(zhì)均是具有生物活性的生物大分子；并且，將生物多糖類生物大分子固定在材料表面是改善生物醫(yī)用材料的生物相容性和表面生物性能最為有效的途徑之一。值得注意的是，在為數(shù)眾多的生物多糖中，香菇多糖及其衍生物表現(xiàn)出十分顯著的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等多方面的生物活性；香菇多糖硫酸酯是一種帶有磺酸基的類肝素物質(zhì)，在生理環(huán)境中帶負電，有利于排斥血漿蛋白的非特異性吸附，因此，利用香菇多糖硫酸酯進行生物材料的表面修飾有利于提高被修飾材料的血液相容性。溶菌酶是一種來自于生物體的天然抗菌劑，它具有良好的生物相容，能夠有效水解細菌細胞壁中的糖苷鍵，使細菌細胞壁變松弛，失去對細胞的保護作用，最終導(dǎo)致細菌溶解死亡。因此，利用溶菌酶進行生物材料的表面修飾有利于提高被修飾材料的抗菌活性。本發(fā)明的有益效果是該方法制備的聚乳酸材料的表面具有良好的抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌活性，同時材料表面的血液相容性也得到改善。本發(fā)明通過表面層層自組裝的方法將溶菌酶和香菇多糖硫酸酯固定在聚乳酸基材表面。首先，本發(fā)明所采用的層層自組裝表面修飾技術(shù)，具有一系列優(yōu)點，例如操作簡單，制備條件溫和，自組裝分子的選擇范圍廣泛等。并且，該方法可在常溫水溶液中進行，因而有利于保持生物大分子的天然構(gòu)象和生物活性。其次，因此，本發(fā)明采用的聚乳酸表面修飾物質(zhì)均是具有生物活性的生物大分子(溶菌酶和香菇多糖硫酸酯)，它們具有良好的生物相容性，因此利用香菇多糖硫酸酯進行聚乳酸的表面修飾有利于改善材料的生物相容性。同時，香菇多糖硫酸酯是帶有磺酸基的類肝素物質(zhì)，這些磺酸基團在生理環(huán)境中帶有較強的負電荷，這有利于排斥血漿蛋白的非特異性吸附，因此，利用香菇多糖硫酸酯進行生物材料的表面修飾有利于提高被修飾材料的血液相容性。此外，用于基材表面修飾的溶菌酶是一種廣泛存在于生物體中的天然抗菌劑，它具有抗菌性強、安全無毒、熱穩(wěn)定性好和作用范圍廣等優(yōu)點。同時，溶菌酶對于革蘭氏陽性菌具有很好的殺滅作用。因此，本發(fā)明提供的香菇多糖硫酸酯和溶菌酶自組裝修飾的聚乳酸材料，可以有效提高被修飾材料的血液相容性和生物相容性，并且賦予被修飾材料特殊的抗菌活性。本發(fā)明一種溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料能夠在生物材料領(lǐng)域具有十分廣泛的用途；同時，該材料的制備工藝簡單，易于控制，制備條件溫和，成本低廉，特別適用于制備具有良好生物相容性和抑菌抗感染作用的人造器官和裝置的生物醫(yī)用材料。


圖I是聚乳酸材料氨基化修飾前與茚三酮反應(yīng)的顏色變化，其中PLA代表未修飾的聚乳酸材料。圖2是聚乳酸材料氨基化修飾后與茚三酮反應(yīng)的顏色變化，其中PLA-NH2代表氨基化修飾后的聚乳酸材料。圖3是層層自組裝修飾過程中聚乳酸材料表面的靜態(tài)水接觸角的變化圖，其中PLA代表未經(jīng)表面修飾的聚乳酸材料，PLA-NH2代表氨基化修飾后的聚乳酸材料，PLA/LS-(Lys-LS) 5代表香菇多糖硫酸酯(LS)為最外層的含有五個雙分子層的層層自組裝修飾的聚乳酸材料。圖4是修飾前后的聚乳酸材料表面對大腸桿菌的抑制效果圖,其中control代表未加樣品的空白對照組，PLA代表未經(jīng)表面修飾的聚乳酸材料，PLA/LS- (Lys-LS) 5代表香菇多糖硫酸酯(LS)為最外層的含有五個雙分子層的層層自組裝修飾的聚乳酸材料。圖5是修飾前后的聚乳酸材料表面對金黃色葡萄球菌的抑制效果圖，其中control代表未加樣品的空白對照組，PLA代表未經(jīng)表面修飾的聚乳酸材料，PLA/LS-(Lys-LS) 5代表香菇多糖硫酸酯(LS)為最外層的含有五個雙分子層的層層自組裝修飾的聚乳酸材料。
具體實施例方式為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實施例。實施例I :
一種溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料的制備方法，它包括如下具體步驟
I)香菇多糖硫酸酯衍生物的制備
將0. 6g香菇多糖加入裝有50mL 二甲基亞砜的反應(yīng)瓶中，在20°C下攪拌12小時，再以2mL/分鐘的速度緩慢逐滴滴加9mL吡啶，繼續(xù)攪拌30分鐘，然后將反應(yīng)瓶置于冰浴中，攪拌下用恒壓漏斗以0. 5mL/分鐘的速度緩慢逐滴滴加3. 7mL氯磺酸(其中氯磺酸與吡啶的摩爾比為I :2)，然后升溫至80°C繼續(xù)攪拌反應(yīng)100分鐘，反應(yīng)停止后冷卻至室溫，用濃度為5wt%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0，得到反應(yīng)液；再將所得反應(yīng)液注入再生纖維素透析袋(36mm, Mw :8000-14000)中，在pH為10的NaOH溶液中透析12小時，再用自來水流水透析4天，蒸餾水透析3天，然后將透析液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，最后經(jīng)冷凍干燥得到黃色粉末狀的香菇多糖硫酸酯(LS)；
2)聚乳Ifel吳片的制備
將6g聚乳酸材料(浙江海正生物材料股份有限公司產(chǎn)品)溶于45mL 二氯甲烷中，待攪拌完全溶解后將溶液倒入平底成膜盤內(nèi)，在室溫下干燥24小時，待溶劑完全揮發(fā)后，得到聚乳酸薄膜；再將上述聚乳酸薄膜切成圓形膜片，在體積比為I : I的乙醇水溶液中攪拌清洗2小時，以除去表面的雜質(zhì)，然后用大量的蒸餾水清洗，在40°C真空干燥24小時，得到聚乳酸膜片；
3)聚乳酸膜片表面氨基化
將4g上述的聚乳酸膜片放入60mL濃度為0. 09g/mL乙二胺的異丙醇溶液中，在45°C下攪拌反應(yīng)3分鐘，得到表面帶有氨基官能團的聚乳酸膜片，再用大量蒸餾水沖洗聚乳酸膜片，以除去其表面物理粘附的乙二胺，然后在室溫下將表面帶有氨基官能團的聚乳酸膜片用濃度為0. 012mol/L的HCl溶液浸泡15分鐘，再用蒸餾水洗滌膜片4次，得到表面氨基化的聚乳酸膜片基材；
4)香菇多糖硫酸酯溶液、溶菌酶溶液的制備
將IOOmg香菇多糖硫酸酯溶解于IOOmL濃度為0. 15mol/L的NaCl溶液中，得到香菇多糖硫酸酯溶液，其中香燕多糖硫酸酯的濃度為1.0 mg/mL ；
將IOOmg溶菌酶溶解于IOOmL濃度為0. 15mol/L的NaCl溶液中，得到溶菌酶溶液，其中溶菌酶的濃度I. 0 mg/mL ；
5)在聚乳酸表面進行溶菌酶和香菇多糖硫酸酯的層層自組裝
將上述步驟3)得到的表面氨基化的聚乳酸膜片基材加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15分鐘，然后分離出膜片用0. 15mol/L NaCl溶液洗滌4次，制備出表面具有香菇多糖硫酸酯的PLA/LS膜片；
再將該膜片加入到溶菌酶溶液中浸泡15分鐘，分離出膜片用0. 15 mol/L NaCl溶液洗滌4次，然后再加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15分鐘，分離出膜片用0. 15mol/L NaCl溶液洗滌4次，完成聚乳酸表面的第一個雙分子層的自組裝；按上述步驟，在溶菌酶溶液和香菇多糖硫酸酯溶液中分別交替自組裝5次后，得到香菇多糖硫酸酯為最外層的含5個雙分子層的表面層層自組裝修飾的聚乳酸膜片，再用去離子水洗滌4次后，再將聚乳酸膜片在室溫的條件下干燥24小時，得到一種溶菌酶和香菇多糖硫酸酯層層自組裝修飾的聚乳酸材料 PLA/LS-(Lys-LS)5。圖I和圖2分別是聚乳酸材料氨基化修飾前后與茚三酮反應(yīng)的顏色變化。茚三酮是一種常見的用于分析氨基酸的試劑，它可以與氨、伯胺、仲胺反應(yīng)顯色，茚三酮與伯胺反應(yīng)生成一種藍紫色的復(fù)合物，從而證明氨基基團的存在，因此用茚三酮來檢測聚乳酸表面的氨基。將聚乳酸膜片加入到I. 0 mol/L的茚三酮/乙醇溶液中浸泡5分鐘，然后直接放入盛有ImL蒸餾水的干凈試管中，在80°C水浴中加熱15分鐘，反應(yīng)完畢后觀察聚乳酸膜片表 面的顏色變化。由圖I可知，未改性的PLA與茚三酮反應(yīng)后，其表面未出現(xiàn)任何顏色變化；由圖2可知，經(jīng)過氨基化修飾的PLA-NH2與茚三酮反應(yīng)后，表面變?yōu)樗{紫色。以上結(jié)果表明，通過與乙二胺反應(yīng)，在聚乳酸材料表面進行了氨基化修飾。圖3是實施例I表面層層自組裝過程中聚乳酸材料表面的靜態(tài)水接觸角的變化。測試過程為在接觸角測試儀(C 201型，上海梭倫科技)上將20 μ L去離子水滴到待測聚乳酸膜片表面(待測聚乳酸膜片為實施例I中所得到的溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料)，待穩(wěn)定后測出薄膜與水滴的左右兩個夾角，每個樣品測量6次，其平均值為最終的水接觸角，其標準偏差為接觸角的誤差。從圖2中可以看出，未經(jīng)表面修飾的聚乳酸材料PLA的水接觸角為75. 1°，經(jīng)過氨基化修飾的PLA-NH2的水接觸角為70. 8°，而經(jīng)過修飾的聚乳酸材料PLA/LS-(Lys-LS)5表面水接觸角達為48. 1°，說明經(jīng)溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾后聚乳酸材料表面的親水性增加。以上結(jié)果表明，經(jīng)過溶菌酶和香菇多糖硫酸酯層層自組裝修飾的聚乳酸材料其表面具有良好的親水性。圖4是實施例I表面層層自組裝修飾前后聚乳酸材料對大腸桿菌的抑制效果圖。其測試過程參考中華人民共和國輕工行業(yè)標準QB/T 2591-2003《抗菌塑料一抗菌性能測試方法和抗菌效果》。實驗時采用連續(xù)轉(zhuǎn)接2次的新鮮細菌培養(yǎng)物(24h內(nèi)轉(zhuǎn)接)，加入培養(yǎng)液中，依次做10倍遞增稀釋，選擇菌液濃度為(5. O 10. O) X IO5 CFU/ml的稀釋液作為試驗用菌液。參考GB 4789.2《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》的方法，在每個培養(yǎng)管中加入2mL菌液，分別加入5片表面修飾前后的聚乳酸膜片，而不加入膜片的培養(yǎng)管作為空白對照組，在37°C恒溫振蕩培養(yǎng)24小時后，用平板計數(shù)法計算出菌落數(shù)目。每組數(shù)據(jù)做兩次平行實驗，每個樣品做三個平行抗菌測試。從圖3中可以看出，control代表的未加入樣品的空白培養(yǎng)基經(jīng)過過夜培養(yǎng)后大腸桿菌的濃度為8. 04X 107 CFU/mL，未經(jīng)修飾的聚乳酸材料PLA經(jīng)過過夜培養(yǎng)后的大腸桿菌濃度為7. 84 X IO7 CFU/mL，而經(jīng)過層層自組裝修飾后的聚乳酸材料PLA/LS-(Lys-LS) 5過夜培養(yǎng)后的大腸桿菌濃度為4. 57 X IO7 CFU/mL,與未經(jīng)修飾的聚乳酸材料PLA相比，經(jīng)過修飾的聚乳酸材料抗菌性能提高了 41. 7%。以上結(jié)果表明，經(jīng)過層層自組裝修飾的聚乳酸材料其表面具有良好的抑制大腸桿菌的抗菌活性。圖5是實施例I表面層層自組裝修飾前后聚乳酸材料對金黃色葡萄球菌的抑制效果圖。其測試過程參考中華人民共和國輕工行業(yè)標準QB/T 2591-2003《抗菌塑料一抗菌性能測試方法和抗菌效果》。實驗時采用連續(xù)轉(zhuǎn)接2次的新鮮細菌培養(yǎng)物(24h內(nèi)轉(zhuǎn)接)，加入培養(yǎng)液中，依次做10倍遞增稀釋，選擇菌液濃度為(5. O 10. O) X IO9 CFU/mL的稀釋液作為試驗用菌液。參考GB 4789.2《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》的方法，在每個培養(yǎng)管中加入2mL菌液，分別加入5片表面修飾前后的聚乳酸膜片，而不加入膜片的培養(yǎng)管作為空白對照組，在37°C恒溫振蕩培養(yǎng)24小時后，用平板計數(shù)法計算出菌落數(shù)目。每組數(shù)據(jù)做兩次平行實驗，每個樣品做三個平行抗菌測試。從圖4中可以看出，control代表的未加入樣品的空白培養(yǎng)基經(jīng)過過夜培養(yǎng)后金黃色葡萄球菌的濃度為2. 72X1011 CFU/mL，未經(jīng)修飾的聚乳酸材料PLA經(jīng)過過夜培養(yǎng)后的金黃色葡萄球菌濃度為2. 61 X IO11 CFU/mL,而經(jīng)過層層自組裝修飾后的聚乳酸材料PLA/LS-(Lys-LS)5過夜培養(yǎng)后的金黃色葡萄球菌濃度為O. 84 X IO11 CFU/mL,與未經(jīng)修飾的聚乳酸材料PLA相比，經(jīng)過修飾的聚乳酸材料抗菌性能提高了 67.81%。以上結(jié)果表明，經(jīng)過層層自組裝修飾的聚乳酸材料其表面具有良好的抑制金黃色葡萄球菌的抗菌活性。表I是實施例I表面層層自組裝修飾前后聚乳酸材料的溶血試驗結(jié)果，其中陽性對照代表未加膜片在蒸餾水中對照組，陰性對照代表未加膜片在生理鹽水中對照組，、PLA代表未經(jīng)表面修飾的聚乳酸材料，PLA/LS- (Lys-LS) 5代表香菇多糖硫酸酯(LS)為最外層的含有五個雙分子層的層層自組裝修飾的聚乳酸材料。其測試過程參考中華人民共和國國家標準GB/T 16175-2008《醫(yī)用有機硅材料生物學(xué)評價試驗方法》進行。將待測膜片放入含有IOmL生理鹽水的試管中，以IOmL蒸餾水的試管為陽性對照，IOmL生理鹽水的試管為陰性對照，將試管分別放入37°C水浴中30min。將新鮮抗凝血液用生理鹽水按4 5稀釋，然后向每個試管中加入0. 2mL稀釋的血液，在37°C恒溫水浴中維持60min。然后以2500r/min離心lOmin。小心抽取上清液，紫外可見分光光度計(UV-7504，上海欣茂儀器有限公司)在545nm處測定其吸光度。每組 數(shù)據(jù)做兩次平行實驗，每個樣品做三個平行測試。溶血率計算公式為[(D#s-Dsw)/(D卩日性-Dto)] X 100%，其中D#s代表測試樣品的吸光度，Dsw代表陰性對照的吸光度，Dratt代表陽性對照的吸光度。從表I中可以看出未經(jīng)修飾的聚乳酸材料PLA的溶血率為I. 09%,經(jīng)過修飾的聚乳酸材料PLA/LS- (Lys-LS) 5溶血率為0. 76%，該結(jié)果說明經(jīng)過層層自組裝修飾的聚乳酸材料其表面血液相容性得到了改善。表 I
權(quán)利要求
1.一種溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料，其特征在于它由基材和修飾層組成，基材由表面氨基化的聚乳酸材料構(gòu)成，修飾層是在所述基材的表面利用層層自組裝技術(shù)進行表面修飾而得到；其中，修飾層中含有在所述基材表面交替層層自組裝的溶菌酶和香菇多糖硫酸酯。
2.如權(quán)利要求I所述的溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料的制備方法，其特征在于它包括如下步驟 1)香菇多糖硫酸酯衍生物的制備 按香燕多糖二甲基亞砜卩比唳氯磺酸=(0. 6 I. 2) g: (50 100) mL: (9 18) mL: (3. 7 7. 4) mL,選取香燕多糖、二甲基亞砜、卩比唳和氯磺酸,備用； 將香菇多糖加入裝有二甲基亞砜的反應(yīng)容器中，在20 30°C下攪拌12 18小時，再以2 4mL/分鐘的速度緩慢逐滴滴加吡啶，繼續(xù)攪拌30 40分鐘，然后將反應(yīng)容器置于冰浴中，攪拌下用恒壓漏斗以0. 5 ImL/分鐘的速度逐滴緩慢滴加氯磺酸，滴加完畢后升溫至80°C繼續(xù)攪拌反應(yīng)100 120分鐘，反應(yīng)停止后冷卻至室溫，用質(zhì)量百分數(shù)為I 10wt%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0，得到反應(yīng)液；再將所得反應(yīng)液注入再生纖維素透析袋中，在pH為10的NaOH溶液中透析12 18小時,再用自來水流水透析4 6天,蒸懼水透析3 5天，然后將透析液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，最后經(jīng)過冷凍干燥，得到黃色粉末狀的香菇多糖硫酸酯； 2)聚乳酸膜片的制備 按聚乳酸二氯甲烷=(6 12) g: (45 90) mL，選取聚乳酸和二氯甲烷，首先將聚乳酸材料溶于二氯甲烷中，待攪拌完全溶解后將溶液倒入平底成膜盤內(nèi)，在室溫下干燥24 48小時，待溶劑完全揮發(fā)后，得到聚乳酸薄膜； 將上述聚乳酸薄膜切成圓形膜片，在體積比為I : I的乙醇水溶液中攪拌清洗2 3小時，以除去表面的雜質(zhì)，然后用大量的蒸餾水清洗，在40 50°C真空干燥24 48小時，得到聚乳酸膜片； 3)聚乳酸膜片表面氨基化 按聚乳酸膜片含乙二胺的異丙醇溶液=(4 8)g: 60mL，選取上述聚乳酸膜片和含乙二胺的異丙醇溶液，含乙二胺的異丙醇溶液的濃度為0. 09g/mL ； 將上述的聚乳酸膜片放入含乙二胺的異丙醇溶液中，在45 50°C下攪拌反應(yīng)3 5分鐘，得到表面帶有氨基官能團的聚乳酸膜片，再用大量蒸餾水沖洗聚乳酸膜片，以除去其表面物理粘附的乙二胺，然后在室溫下將表面帶有氨基官能團的聚乳酸膜片用濃度為.0.012mol/L的HCl溶液浸泡15 30分鐘，再用蒸餾水洗滌膜片4 8次，得到表面氨基化的聚乳酸膜片基材； 4)香菇多糖硫酸酯溶液、溶菌酶溶液的制備 按溶菌酶香菇多糖硫酸酯=(100 200)mg: (100 200)mg，選取溶菌酶和香菇多糖硫酸酯； 將溶菌酶溶解于濃度為0. 15mol/L的NaCl溶液中，得到溶菌酶溶液，其中溶菌酶的濃度 I. 0 2. 0 mg/mL ； 將香菇多糖硫酸酯溶解于濃度為0. 15mol/L的NaCl溶液中，得到香菇多糖硫酸酯溶液，其中香燕多糖硫酸酯的濃度為I. 0 2. 0 mg/mL ； 5)在聚乳酸表面進行溶菌酶和香菇多糖硫酸酯的層層自組裝將上述步驟3)得到的表面氨基化的聚乳酸膜片基材加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15 20分鐘，然后分離出膜片用O. 15mol/L NaCl溶液洗滌4 6次，制備出表面具有香菇多糖硫酸酯的膜片； 再將該膜片加入到溶菌酶溶液中浸泡15 20分鐘，分離出膜片用O. 15 mol/L NaCl溶液洗滌4 6次，然后再加入到香菇多糖硫酸酯溶液中浸泡15 20分鐘，分離出膜片用O.15mol/L NaCl溶液洗滌4 6次，完成聚乳酸表面的第一個雙分子層的自組裝；按上述步驟，在溶菌酶溶液和香菇多糖硫酸酯溶液中分別交替自組裝5次后，即得到香菇多糖硫 酸酯為最外層的含5個雙分子層的表面層層自組裝修飾的聚乳酸膜片，再用去離子水洗滌4 6次后，再將聚乳酸膜片在室溫的條件下干燥24 48小時，得到所述溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料和生物大分子自組裝技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料及其制備方法。溶菌酶與香菇多糖硫酸酯自組裝修飾的聚乳酸材料，它由基材和修飾層組成，基材由表面氨基化的聚乳酸材料構(gòu)成，修飾層是在該基材的表面利用層層自組裝技術(shù)進行表面修飾而得到；其中，修飾層中含有在基材表面交替層層自組裝的溶菌酶和香菇多糖硫酸酯。該方法制備的聚乳酸材料的表面具有良好的抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌活性，該材料表面的血液相容性也得到改善，同時，該材料的制備方法工藝簡單，易于控制，制備條件溫和，成本低廉。
文檔編號C08L67/04GK102675674SQ20121013980
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者熊燕飛, 王燕梅, 王藝峰, 連鑫鑫, 陳艷軍 申請人:武漢理工大學(xué)