活性藥物成分及其中間物的酶促合成發(fā)明領域本發(fā)明一般涉及化學
技術領域：
，特別是使用酶制備活性藥物成分(API)或其中間物的方法。特別的是，本發(fā)明涉及HMG-CoA還原酶抑制劑的制劑，其也被稱為抑制素，其中提供某些酶用于催化合成中的特別步驟。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及通過提供所述酶制備中間物的方法。本發(fā)明還涉及有效翻譯所述酶的表達體系。此外，本發(fā)明涉及這類酶用于制備API或其中間物，特別是用于制備抑制素或其中間物的具體用途。發(fā)明背景合成途徑常規(guī)上是通過在體外進行化學反應實施的?；瘜W能夠變得復雜，并能夠需要昂貴的試劑、多個長的步驟，由于低立體異構選擇性，可能伴隨低產率。在特定情況下，可以應用微生物或其部分，所述微生物或其部分能夠在其生物化學途徑中使用起始材料作為底物的，將起始材料轉化為理想的化合物。在微生物或其部分(例如酶)的幫助下，任選地連同合成方法步驟，可以組合完整的合成途徑，用于制備API或其中間物，但這是充滿挑戰(zhàn)的任務。例如，Patel等人，EnzymeMicrob.Technol.，第14卷，778-784(1992)描述了通過使用馬肝醇脫氫酶或通過氧化化合物的微生物，立體異構選擇性地將7-氧雙環(huán)[2.2.1]庚烷-2,3-二甲醇微生物/酶促氧化為相應的手性內半縮醛和內酯。此外，Moreno-Horn等人，JournalofMolecularCatalysisB:Enzymes，第49卷，24-27(2007)描述了使用紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)作為生物催化劑，經γ-內半縮醛將1,4-烷二醇氧化成γ-內酯。復雜合成途徑的特定例子是酶3-羥基-3-甲基戊二?；?輔酶A還原酶(HMGCoA還原酶)的抑制劑合成，發(fā)現其可作為優(yōu)秀的工具，用于降低血液的脂類和膽固醇水平，以降低由動脈硬化觸發(fā)的病理學過程和疾病中的嚴重心血管事件造成的死亡率。在HMGCoA還原酶抑制劑中，天然的洛伐他汀是已知的，它已被半合成的普伐他汀、辛伐他汀，而后被完全合成的阿托伐他汀、西立伐他汀、羅蘇伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀和達伐他汀取代。臨床上有效的HMGCoA還原酶抑制劑也被稱為他汀類(特征是INN名稱結尾的他汀)。所有的抑制素都共享特征性側鏈，所述側鏈分別由與抑制素骨架(方案1)相連的庚烯酸或庚酸部分(游離的酸、鹽或內酯)組成。抑制素的生物學活性與該結構及其立體化學相聯系。一般需要多個化學步驟制備庚烯酸或庚酸部分。該側鏈的構建對化學家而言仍然是一個挑戰(zhàn)。方案1經內半縮醛制備側鏈和抑制素的首次嘗試公開在US7414119中。WO2006/134482公開了應用醛縮酶(特別是2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶；DERA；EC分類EC4.1.2.4.)合成內半縮醛，后者能夠直接偶聯得到阿托伐他汀。為了其他用途和最終生產抑制素的化合物，必需氧化內半縮醛。在J.Am.Chem.Soc.116(1994),第8422-8423頁和WO2008/119810中，通過Br2/BaCO3將純化的內半縮醛氧化為內酯。WO2006/134482公開了用于相同目的的催化脫氫的應用(例如Pt/C，Pd/C)。本發(fā)明的目標是提供新的方法，所述方法一般允許在制備API或其中間物時，以數量減少的方法步驟、較短的時間、高產率和改善的、更經濟、更簡化的方式氧化或脫氫。本發(fā)明的具體方面可用于制備抑制素或其中間物。發(fā)明概述為了實現上述目的，本發(fā)明提供了根據權利要求1的方法。從屬權利要求中提出了優(yōu)選的實施方案。本發(fā)明還提供了根據權利要求9的反應體系，根據權利要求13的制備藥物組合物的方法，根據權利要求14和15的表達體系，和根據權利要求18-21的用途。令人驚訝的發(fā)現，可以使用特定的酶將某些內半縮醛氧化成通常用于抑制素類化合物合成的內酯部分。應注意的是，用化學試劑氧化內半縮醛需要先分離內半縮醛，這是非常麻煩并耗費大量有機溶劑的。此外，必需先用羥基保護基保護4-羥基-內半縮醛，這增加了反應步驟數和API的最終雜質譜。另一方面，相對于現有技術中用Br2/BaCO3化學氧化或化學催化脫氫(例如Pt/C，Pd/C)，用如根據本發(fā)明上文定義的酶催化劑實施式(II)的化合物的氧化或脫氫是非常有利的?；瘜W氧化劑是非特異性的，因此需要先純化內半縮醛，否則在副產物或試劑甚至溶劑的氧化中會消耗太多試劑。內半縮醛純化是要求高的，且需要大量的溶劑進行萃取，這與內半縮醛通常是親水性，且難以萃取到有機溶劑(如乙酸乙酯)中的事實相關。還應注意，需要蒸發(fā)用于萃取的溶劑，這對于工業(yè)規(guī)模的操作是不理想的。本發(fā)明的方法解決了化學氧化的所有上述缺點。通過使用能夠催化氧化或脫氫的酶，規(guī)避了純化和蒸發(fā)步驟，顯著縮短了制備式(I)的化合物的方法。雖然內半縮醛(如化合物(II))是非天然類型的化合物，但令人驚訝的是發(fā)現可以用作為本文公開的酶的有效底物?；谠摪l(fā)現，使用能夠催化氧化或脫氫的酶為一般性制備合成的API或其合成的中間物提供了寶貴的工具。因此，一般而言，在本發(fā)明用于制備非天然的合成API或其中間物的用途中的底物不同于能夠催化氧化或脫氫的酶的天然存在的底物，從而排除了例如選自乙醇、甲醇、乙醛、乙酸、天然存在的糖或氨基酸、或源自糖的糖酸，包括具有羧基的單糖(如葡萄糖酸)的天然底物。下列項目概況了本發(fā)明的方面、優(yōu)勢特征和優(yōu)選的實施方案，分別單獨或組合地對解決本發(fā)明的目的有貢獻。(1)用于制備式(I)的化合物或其可藥用的鹽或酯或立體異構體的方法，其中R1獨立于R2表示H、X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、O-(CH2)n-CH3、S-(CH2)n-CH3、NR3R4、OCO(CH2)nCH3、NR3CO(CH2)nCH3、CH2-R5，任選地取代的單環(huán)或二環(huán)芳基、雜環(huán)或脂環(huán)基；和R2獨立于R1地表示H、(CH2)m-CH3或芳基；或R1和R2都表示X、OH或O((CH2)nCH3)；或R1和R2共同表示＝O、＝CH-R5，或共同形成環(huán)-(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亞芳香基)-(CH2)s-，其中上述任一個CH2或CH3基團可任選地被X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、芳基、O-(CH2)n-CH3、OCO(CH2)nCH3、NR3R4、NR3CO(CH2)nCH3另外取代；或每個CH2連接碳原子都可被O、S或NR3替換；其中R3和R4彼此獨立地，或共同表示H、(CH2)m-CH3，或共同形成環(huán)–(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亞芳香基)-(CH2)s-、-(CO)r-(1,2-亞芳香基)-(CO)s-；R5表示任選地取代的單環(huán)或二環(huán)芳基、雜環(huán)或脂環(huán)基，X表示F、Cl、Br或I；n代表0至10的整數；m代表0至3的整數；p代表2至6的整數；并且r和s中至少一個是1；所述方法包括使式(II)的化合物，其中R1和R2的定義如上，與能夠催化氧化或脫氫的酶接觸，和任選地使產品成鹽、酯化或立體異構選擇性地解析產品。(2)根據項(1)的方法，其中R5表示選自式(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)和(IX)的部分；(3)根據項(1)或(2)的用于制備式(I)的化合物的方法，其中R1獨立于R2地表示H、X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、O-(CH2)n-CH3、S-(CH2)n-CH3、NR3R4、OCO(CH2)nCH3或NR3CO(CH2)nCH3，任選的取代的單環(huán)或二環(huán)芳基、雜環(huán)或脂環(huán)基；和R2獨立于R1地表示H、(CH2)m-CH3或芳基；或者R1和R2都表示X、OH或O(CH2)nCH3；或者R1和R2共同表示＝O，或共同形成環(huán)-(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亞芳香基)-(CH2)s-，其中上述任一個CH2或CH3基團可任選地被X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、芳基、O-(CH2)n-CH3、OCO(CH2)nCH3、NR3R4、NR3CO(CH2)nCH3另外取代；或每個CH2連接碳原子都可被O、S或NR3替換；其中R3和R4彼此獨立地，或共同表示H、(CH2)m-CH3，或共同形成環(huán)–(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亞芳香基)-(CH2)s-、-(CO)r-(1,2-亞芳香基)-(CO)s-；X表示F,Cl,Br或I；n代表0至10的整數；m代表0至3的整數；p代表2至6的整數；并且r和s中至少一個是1。(4)根據任一項前述項目的用于制備式(I)的化合物的方法，其中R1獨立于R2地表示H、X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、O-(CH2)n-CH3、S-(CH2)n-CH3、NR3R4、OCO(CH2)nCH3，或NR3CO(CH2)nCH3；和R2獨立于R1地表示H或(CH2)m-CH3；或者R1和R2都表示X、OH或O(CH2)nCH3；或者R1和R2共同表示＝O、-(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亞芳香基)-(CH2)s-，其中R3和R4彼此獨立地，或共同表示H、(CH2)m-CH3，或共同形成環(huán)–(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亞芳香基)-(CH2)s-、-(CO)r-(1,2-亞芳香基)-(CO)s-；X表示F,Cl,Br或I；n代表0至10的整數；m代表0至3的整數；p代表2至6的整數；并且r和s中至少一個是1。(5)根據任一項前述項目的方法，其中能夠催化氧化或脫氫的酶是氧化酶或脫氫酶。(6)根據任一項前述項目的方法，其中能夠催化氧化或脫氫的酶能夠催化醛糖脫氫。(7)根據任一項前述項目的方法，其中能夠催化氧化或脫氫的酶是醛糖脫氫酶。(8)根據任一項前述項目的方法，其中能夠催化氧化或脫氫的酶特異性氧化內半縮醛羥基。(9)根據任一項前述項目的方法，其中能夠催化氧化或脫氫的酶是醛糖1-脫氫酶(EC1.1.5.2)。(10)根據任一項前述項目的方法，其中能夠催化氧化或脫氫的酶選自吡咯并喹啉醌(PQQ)依賴性脫氫酶。(11)根據任一項前述項目的方法，其中酶是水溶性的或膜結合的。(12)根據任一項前述項目的方法，其中酶選自由脫氫酶編碼基因編碼的脫氫酶，所述脫氫酶編碼基因包含在SEQIDNO.01、03、05、07、09、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59和61的任一條核苷酸序列內，或由SEQIDNO.01、03、05、07、09、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59和61的任一條核苷酸序列構成；或者由任一條氨基酸序列定義的脫氫酶，所述氨基酸序列包含在SEQIDNO.02、04、06、08、10、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62內，或由SEQIDNO.02、04、06、08、10、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62組成；或分別與所述序列具有至少50％，優(yōu)選70％，更優(yōu)選90％核苷酸序列同一性或氨基酸序列同一性的任何脫氫酶，只要所獲得的序列變體保持脫氫酶活性。(13)根據任一項前述項目的方法，其中酶是Ylil醛糖脫氫酶或Gcd膜結合的葡萄糖脫氫酶。(14)根據任一項前述項目的方法，其中2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA,EC4.1.2.4)用于制備式(II)的化合物。(15)根據項(14)的方法，其中2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA,EC4.1.2.4)用于合成步驟中，所述合成步驟先于，或備選地至少在重疊的時間段內同時地，使式(II)的化合物與能夠催化氧化或脫氫的酶接觸。(16)根據任一項前述項目的方法，其中在沒有先分離或純化式(II)的化合物的條件下，使式(II)的化合物與能夠催化氧化或脫氫的酶接觸。(17)根據任一項前述項目的方法，其中能夠催化氧化或脫氫的酶，任選地以及DERA酶，獨立地包含在活的全細胞、失活的全細胞、均質化的全細胞或無細胞提取物中；或者是純化的、固定的和/或處于胞外表達的蛋白質的形式，優(yōu)選地在活的全細胞、失活的全細胞，或均質化的全細胞中，更優(yōu)選地在活的全細胞或失活的全細胞中，特別是包含在活的全細胞中。(18)根據項(14)至(17)的任一項的方法，其中式(I)的化合物至少部分是與式(II)的化合物制劑同時制備的。在項(14)至(17)定義的優(yōu)選的實施方案中，安排使用2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA)制備化合物(II)，并允許產物用于，優(yōu)選地至少在重疊的時間段內同時用于能夠催化氧化或脫氫的酶的隨后的氧化反應，對于方法的效率和減少方法所需的時間而言是特別有利的。當方法至少部分同時進行時，所制備的式(II)的化合物可以作為隨后氧化反應的底物立即消耗，這使第一反應的穩(wěn)態(tài)平衡向產物的方向移動。(19)根據任一項前述項目的方法，其中電子受體包含在方法中或添加到能夠催化氧化或脫氫的酶中，優(yōu)選使用或添加氧；和/或其中為了變得有功能，方法包含或添加酶的輔助因子，例如選自FAD、NAD(P)+和/或PQQ的輔助因子，和任選地本文公開的其他添加劑和助劑。當根據該另外的優(yōu)選的實施方案向能夠催化氧化或脫氫的酶添加氧時，或者當反應在存在氧的條件下進行時，例如在充氣條件下，優(yōu)選地當向由脫氫或氧化酶催化的脫氫或氧化反應中鼓氣時，反應變成不可逆的，這確保了獲得的產物，并且當同時制備式(II)和(I)的化合物時，進一步增強了第一反應的穩(wěn)態(tài)平衡移動。存在氧，特別是存在大于5％的溶解氧，其中100％溶解氧理解為給定方法條件下的氧飽和溶液，也是增加產率和減少反應時間的有利方法參數。此外，在特定情況下允許存在氧促進了所用微生物的增殖。類似的解釋可用于相應酶的輔助因子和任選的其他有用的添加劑和助劑的使用。(20)用于制備式(I)的化合物或其可藥用的鹽、酯或立體異構體的反應體系，或單罐裝(onepot)方法，其中，R1和R2如項(1)至(4)的任一項所定義，反應體系能夠或被安排用于，或單罐裝(onepot)方法包括，將式(X)的化合物與乙醛在存在2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA)和能夠催化氧化或脫氫的酶的條件下反應，其中，R表示式(I)的R1-CH-R2部分，R1和R2如項(1)至(4)的任一項所定義，并且任選地成鹽、酯化或立體異構選擇性地解析產物。在本文中，能夠催化氧化或脫氫的酶優(yōu)選是由項(5)至(13)的任一項定義的酶表示。術語“反應體系”意指技術體系，例如體外系統、反應器、培養(yǎng)容器或發(fā)酵罐。術語“能夠”或“被安排”意指反應體系是合適的，或者條件和構象設置為可以進行定義的反應。(21)根據項(20)的體系或方法，其中項(1)定義的式(II)的化合物是作為中間物生成的，其未分離。(22)根據項(20)或(21)的任一項的體系或方法，其中能夠催化氧化或脫氫的酶，任選地以及DERA酶，都獨立地包含在活的全細胞、失活的全細胞、均質化的全細胞或無細胞提取物中；或者是純化的、固定的和/或處于胞外表達的蛋白質的形式，優(yōu)選地在活的全細胞、失活的全細胞或均質化的全細胞中，更優(yōu)選地在活的全細胞或失活的全細胞中，特別是包含在活的全細胞中。(23)根據項(20)至(22)的任一項的體系或方法，其中兩種所述的酶，即，DERA和能夠催化氧化或脫氫的酶，都由相同細胞表達。(24)根據項(17)的方法，或根據項(22)或(23)的體系或方法，其中細胞是細菌、酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，優(yōu)選的是細菌或酵母，更優(yōu)選的是細菌。(25)根據項(24)的體系或方法，其中細菌選自埃希氏菌屬(Escherichia)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、紅球菌屬(Rhodococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enteorobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、根瘤菌屬(Rhizobioum)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、克呂沃爾氏菌屬(Kluyvera)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、拉恩氏菌屬(Rahnella)和異常球菌屬(Deinococcus)。在更特定的含義中，微生物可選自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)、扭脫甲基桿菌(Methylobacteriumextorquens)、中間克呂沃爾菌(Kluyveraintermedia)、腸桿菌(Enterobacter)、氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylovora)、水生拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis)、耐放射異常球菌(Deinococcusradiodurans)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)，最優(yōu)選選自大腸桿菌、氧化葡糖桿菌、乙酸鈣不動桿菌和中間克呂沃爾菌，特別是大腸桿菌。(26)根據項(24)的體系或方法，其中酵母選自酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、裂殖酵母屬(Shizosaccharomyces)和假絲酵母屬(Candida)，優(yōu)選酵母屬。(27)根據項(24)的體系或方法，其中哺乳動物細胞是中華田鼠卵巢細胞或肝細胞，優(yōu)選的是中華田鼠卵巢細胞。(28)根據任一項前述項目的方法，還包括使所述化合物(I)經歷這樣的條件，所述條件足以制備抑制素或其可藥用的鹽，優(yōu)選地洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、羅蘇伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀或達伐他汀或其可藥用的鹽，更優(yōu)選地阿托伐他汀、羅蘇伐他汀或匹伐他汀或其可藥用的鹽，特別是羅蘇伐他汀或其可藥用的鹽。(29)制備抑制素或其可藥用的鹽、酯或立體異構體的方法，包括步驟：(I)使式(II)的化合物：與能夠催化氧化或脫氫的酶接觸，以制備項(1)至(4)的任一項定義的式(I)的化合物，其中R1和R2如項(1)至(4)的任一項所定義；和(II)使所述化合物(I)經歷足以制備抑制素的條件；(III)任選地成鹽,酯化或立體異構選擇性地解析產物。(30)根據前述項目的方法，其中式(II)的化合物是通過2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA,EC4.1.2.4)制備的。(31)根據前述項目的方法，其中至少部分同時制備式(II)和(I)的化合物。(32)根據項(29)至(31)的任一項的方法，其中抑制素是洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、羅蘇伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀或達伐他汀，更優(yōu)選地阿托伐他汀、羅蘇伐他汀或匹伐他汀，特別是羅蘇伐他汀。(33)根據項(29)至(32)的任一項的方法，其中還滿足單獨或組合的項(5)至(19)，或(20)至(27)的任一項定義的其他特定條件。(34)根據項(29)至(33)的任一項的方法，還包括在藥物配方中配制所述抑制素或其可藥用的鹽，優(yōu)選地洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、羅蘇伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀或達伐他汀或其可藥用的鹽，更優(yōu)選地阿托伐他汀、羅蘇伐他汀或匹伐他汀或其可藥用的鹽，特別是羅蘇伐他汀或其可藥用的鹽。(35)包含一種或多種細胞類型的表達體系，相應的細胞類型經遺傳改造，在所有的細胞類型中表達2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA)和能夠催化氧化或脫氫的酶。(36)表達體系，其能夠翻譯2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA)和能夠催化氧化或脫氫的酶，并過表達所述翻譯需要的兩種基因。(37)根據項(35)或(36)的表達體系，其中能夠催化氧化或脫氫的酶是氧化酶或脫氫酶。(38)根據項(35)至(37)的任一項的表達體系，其中能夠催化氧化或脫氫的酶能夠催化醛糖脫氫。(39)根據項(35)至(38)的任一項的表達體系，其中能夠催化氧化或脫氫的酶是醛糖脫氫酶。(40)根據項(35)至(38)的任一項的表達體系，其中能夠催化氧化或脫氫的酶選自廣譜的糖脫氫酶。(41)根據項(35)至(40)的任一項的表達體系，其中能夠催化氧化或脫氫的酶在位置C1特異性氧化。(42)根據項(35)至(41)的任一項的表達體系，其中能夠催化氧化或脫氫的酶是醛糖1-脫氫酶(EC1.1.5.2)。(43)根據項(35)至(42)的任一項的表達體系，還能夠表達用于提供吡咯并喹啉醌(PQQ)的基因簇。(44)根據項(35)至(43)的任一項的表達體系，其中所述表達體系是細菌、酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，優(yōu)選是細菌或酵母，更優(yōu)選是細菌。(45)根據項(44)的表達體系，其中細菌選自埃希氏菌屬(Escherichia)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、紅球菌屬(Rhodococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enteorobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、根瘤菌屬(Rhizobioum)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、克呂沃爾氏菌屬(Kluyvera)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、拉恩氏菌屬(Rahnella)和異常球菌屬(Deinococcus)。在更特定的含義中，微生物可選自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)、扭脫甲基桿菌(Methylobacteriumextorquens)、中間克呂沃爾菌(Kluyveraintermedia)、腸桿菌(Enterobacter)、氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylovora)、水生拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis)、耐放射異常球菌(Deinococcusradiodurans)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)，最優(yōu)選選自大腸桿菌、氧化葡糖桿菌、乙酸鈣不動桿菌和中間克呂沃爾菌，特別是大腸桿菌。(46)根據項(44)的表達體系，其中酵母選自酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、裂殖酵母屬(Shizosaccharomyces)和假絲酵母屬(Candida)，優(yōu)選酵母屬。(47)根據項(44)的表達體系，其中哺乳動物細胞是中華田鼠卵巢細胞或肝細胞，優(yōu)選的是中華田鼠卵巢細胞。(48)根據項(35)至(47)的任一項的表達體系，經安排同時表達能夠催化氧化或脫氫的酶、DERA(脫氧核糖5-磷酸醛縮酶)、PQQ依賴性脫氫酶和PQQ生物合成的途徑基因。(49)根據項(35)至(48)的任一項的表達體系，其中能夠催化氧化或脫氫的酶選自由脫氫酶編碼基因編碼的脫氫酶，所述脫氫酶編碼基因包含在SEQIDNO.01、03、05、07、09、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59和61的任一條核苷酸序列中，或由SEQIDNO.01、03、05、07、09、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59和61的任一條核苷酸序列構成；或者由任一條氨基酸序列定義的脫氫酶，所述氨基酸序列包含在SEQIDNO.02、04、06、08、10、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62中或由SEQIDNO.02、04、06、08、10、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62組成；或分別與所述序列具有至少50％，優(yōu)選70％，更優(yōu)選90％核苷酸序列同一性或氨基酸序列同一性的任何脫氫酶，只要所獲得的序列變體保持脫氫酶活性。(50)根據項(35)至(49)的任一項的表達體系，其中通過如下方式提供PQQ：通過表達PQQ-合成編碼基因，所述PQQ-合成編碼基因包含在SEQIDNO.11、17、63、64、65、66、67、68、69、70的任一條核苷酸序列中，或由SEQIDNO.11、17、63、64、65、66、67、68、69、70的任一條核苷酸序列組成；或者通過表達編碼SEQIDNO.12、13、14、15、16、18、19、20、21和22的任一條氨基酸序列的PQQ-合成基因；或者通過表達與所述序列具有至少50％，優(yōu)選70％，更優(yōu)選90％核苷酸序列同一性或氨基酸序列同一性的的PQQ-合成編碼基因，只要所獲得的序列變體保持生產PQQ的活性。(51)根據項(50)的表達體系，提供了PQQ基因簇。(52)能夠催化氧化或脫氫的酶用于制備合成的API或其中間物的用途。(53)根據項(52)的用途，其中合成的API或其中間物是能夠催化氧化或脫氫的酶的底物化合物，所述化合物是選自取代的或未取代的雙脫氧醛糖,合成的非天然醇、被另外羥基化的酯和被另外羥基化的內半縮醛的非天然化合物，優(yōu)選地所述非天然化合物包含內半縮醛結構部分。根據該實施方案，能夠催化氧化或脫氫的酶，更具體的是項(5)至(13)的任一項定義的酶，可作用于包含相應的內半縮醛結構部分的前體化合物。(54)根據項(52)或(53)的能夠催化氧化或脫氫的酶的用途，與DERA酶同時或隨后使用。(55)根據項(52)至(54)的任一項的用途，其中排除了通過能夠催化氧化或脫氫的酶轉化乙醇、單糖或乙醛。(56)醛糖脫氫酶用于制備式(I)的化合物的用途，其中式(I)如項(1)至(4)的任一項所定義。(57)根據項(56)的醛糖脫氫酶的用途，其中所述酶與項(1)定義的式(II)的化合物接觸。(58)根據項(52)至(57)的任一項的用途，其中還滿足單獨或組合的項(2)至(51)的任一種的條件。(59)醛糖脫氫酶用于制備抑制素或其可藥用的鹽，優(yōu)選地洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、羅蘇伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀或達伐他汀或其可藥用的鹽，更優(yōu)選的阿托伐他汀、羅蘇伐他汀或匹伐他汀或其可藥用的鹽，特別是羅蘇伐他汀或其可藥用的鹽的用途。(60)根據項(35)至(51)的任一項的表達體系用于制備式(I)的化合物的用途，其中式(I)如項(1)至(4)的任一項所定義。(61)根據項(60)的表達體系的用途，其中還滿足單獨或組合的項(2)至(34)的任一種條件。(62)根據項(35)至(51)的任一項的表達體系用于制備洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、羅蘇伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀或達伐他汀，更優(yōu)選地阿托伐他汀、羅蘇伐他汀或匹伐他汀，特別是羅蘇伐他汀的用途。(63)根據項(62)的表達體系的用途，其中還滿足單獨或組合的項(2)至(34)的任一種條件。(64)微生物用于制備式(I)的化合物或其可藥用的鹽或酯或立體異構體的用途，其中R1獨立于R2地表示H、X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、O-(CH2)n-CH3、S-(CH2)n-CH3、NR3R4、OCO(CH2)nCH3、NR3CO(CH2)nCH3、CH2-R5，任選地取代的單環(huán)或二環(huán)芳基、雜環(huán)或脂環(huán)基；和R2獨立于R1地表示H、(CH2)m-CH3或芳基；或者R1和R2都表示X、OH或O(CH2)nCH3；或者R1和R2共同表示＝O、＝CH-R5或共同形成環(huán)-(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亞芳香基)-(CH2)s-，其中任一種上述CH2或CH3基可任選地被X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、芳基、O-(CH2)n-CH3、OCO(CH2)nCH3、NR3R4、NR3CO(CH2)nCH3另外取代；或每個CH2連接碳原子都可被O、S或NR3替換；其中R3和R4彼此獨立地，或共同表示H、(CH2)m-CH3，或共同形成環(huán)–(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亞芳香基)-(CH2)s-、-(CO)r-(1,2-亞芳香基)-(CO)s-；R5表示任選地取代的單環(huán)或二環(huán)芳基、雜環(huán)或脂環(huán)基，X表示F、Cl、Br或I；n代表0至10的整數；m代表0至3的整數；p代表2至6的整數；并且r和s中至少一個是1；任選地進一步加工式(I)的化合物以制備抑制素；其中微生物(i)選自源自克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enteorobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、根瘤菌屬(Rhizobioum)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、克呂沃爾氏菌屬(Kluyvera)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)、拉恩氏菌屬(Rahnella)和異常球菌屬(Deinococcus)的細菌；更特別地選自具體微生物肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)、扭脫甲基桿菌(Methylobacteriumextorquens)、中間克呂沃爾菌(Kluyveraintermedia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylovora)、水生拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis)、耐放射異常球菌(Deinococcusradiodurans)；優(yōu)選選自氧化葡糖桿菌、乙酸鈣不動桿菌和中間克呂沃爾菌；或(II)是大腸桿菌，所述的大腸桿菌經過遺傳改造以能夠表達用于提供吡咯并喹啉醌(PQQ)的基因簇的基因，或補充添加了外源性PQQ。發(fā)明詳述我們令人驚訝的發(fā)現了用于制備式(I)的化合物或其可藥用的鹽或酯或立體異構體的方法，其中R1獨立于R2地表示H、X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、O-(CH2)n-CH3、S-(CH2)n-CH3、NR3R4、OCO(CH2)nCH3或NR3CO(CH2)nCH3、CH2-R5，或任選地取代的單環(huán)或二環(huán)芳基、雜環(huán)或脂環(huán)基；和R2獨立于R1地表示H、(CH2)m-CH3或芳基；或者R1和R2都表示X、OH或O(CH2)nCH3；或者R1和R2共同表示＝O、＝CH-R5或共同形成環(huán)-(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亞芳香基)-(CH2)s-，其中任一種上述CH2或CH3基可任選地被X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、芳基、O-(CH2)n-CH3、OCO(CH2)nCH3、NR3R4、NR3CO(CH2)nCH3另外取代；或每個CH2連接碳原子都可被O、S或NR3替換；其中R3和R4彼此獨立地，或共同表示H、(CH2)m-CH3，或共同形成環(huán)–(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亞芳香基)-(CH2)s-、-(CO)r-(1,2-亞芳香基)-(CO)s-；R5表示任選地取代的單環(huán)或二環(huán)芳基、雜環(huán)或脂環(huán)基，X表示F、Cl、Br或I；n代表0至10的整數；m代表0至3的整數；p代表2至6的整數；并且r和s中至少一個是1；其中，可以簡單地使式(II)的化合物：與能夠催化氧化或脫氫的酶接觸，和任選地將產物成鹽、酯化或立體異構選擇性解析，其中R1和R2的定義如上。術語“單環(huán)或二環(huán)芳基”在本文中指任何單環(huán)或二環(huán)、5-、6-或7-元芳香環(huán)或芳香雜環(huán)，例如吡咯基、呋喃基、噻吩基(tiophenyl)、苯基、咪唑基、嘧啶基、噠嗪基(piridazinyl)、吲哚基、kinolinylftaliminyl和苯并咪唑基。除非對特定實施方案另外說明，術語“芳基”在本文中包括指代包含6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16環(huán)碳原子的芳香環(huán)系統。芳基可以是苯基。還可以是具有2個或多個環(huán)的多環(huán)系統，其中至少一個是芳香環(huán)。該術語包括了苯基、萘基、芴基、甘菊環(huán)基(azulenyl)、茚基、蒽基等。術語“單環(huán)或二環(huán)的雜環(huán)基”在本文中指任何單環(huán)或二環(huán)、5-、6-或7-元的飽和或不飽和環(huán)，其中環(huán)中的至少1個碳被選自氧、氮和硫的原子取代。單環(huán)或二環(huán)的雜環(huán)基的非限制性例子是oksazolyl、噻唑基(tiazolyl)、異噻唑基(isotiazolyl)、嗎啉基(morfolinyl)。除非對特定實施方案另外說明，術語“雜環(huán)”在本文中包括具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個環(huán)原子的飽和(例如，雜環(huán)烷基)或不飽和(例如，雜環(huán)芳基)雜環(huán)部分，至少1個所述原子選自氮和氧。特別是，雜環(huán)包括3-至10-元環(huán)或環(huán)系統，并且更特別的是5-或6-或7-元環(huán)，其可以是飽和或不飽和的；其例子包括環(huán)氧乙烷基、azirinyl、1,2-oxathiolanyl、咪唑基、噻吩基、呋喃基、四氫呋喃基、吡喃基、thiopyranyl、噻蒽基、異苯并呋喃基、苯并呋喃基、苯并二氫吡喃基、2H-吡咯基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑烷基、苯并咪唑基、吡唑基、吡嗪基、吡唑烷基、噻唑基、異噻唑基、二噻唑基、唑基、異唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哌啶基、哌嗪基、噠嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基，尤其是硫代嗎啉基、吲哚嗪基、異吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、苯并咪唑基、cumaryl、吲唑基、三唑基、四唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、異喹啉基、喹啉基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、苯并噻吩基、二苯并噻吩基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、萘嵌間二氮雜苯基、鄰二氮雜菲基、呋咕基(furazanyl)、吩嗪基、吩噻嗪基、吩嗪基、ehromenyl、異苯并二氫吡喃基、苯并二氫吡喃基等。更具體而言，飽和的雜環(huán)部分可具有3、4、5、6或7個環(huán)碳原子，和1、2、3、4或5個選自氮和氧的環(huán)雜原子?；鶊F可以是多環(huán)系統，但更常見的是單環(huán)，例如包括氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基、四氫呋喃基、哌啶基、環(huán)氧乙烷基、吡唑烷基、咪唑基、吲哚里西定基(indolizidinyl)、哌嗪基、噻唑烷基、嗎啉基、硫代嗎啉基、quinolinidinyl等。另外，“雜芳基”可包括具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個環(huán)原子的芳香雜環(huán)系統，其中至少1個原子選自氮和氧?；鶊F可以是具有2個或多個環(huán)的多環(huán)系統，其中至少1個環(huán)是芳香族的，但更常見單環(huán)的。該術語包括嘧啶基、呋喃基、苯并[b]苯硫基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡咯烷基、吡啶基、苯并[b]呋喃基、吡嗪基、嘌呤基、吲哚基、苯并咪唑基、喹啉基、吩噻嗪基、三嗪基、酞嗪基、2H-苯并二氫吡喃基、唑基、異唑基、噻唑基、異吲哚基、吲唑基、嘌呤基、異喹啉基、喹唑啉基、蝶啶基等。術語“單環(huán)或雙環(huán)脂環(huán)基”在本文中指任何單環(huán)或二環(huán)、5-,6-或7-元脂環(huán)族環(huán)。在可被任選地取代的式(I)或(II)的化合物、API或抑制素的上下文中，術語“成鹽”或“可藥用的鹽”在本文中指處于鹽形式例如，鉀、鈉、鈣、鎂、鹽酸、氫溴酸等的化合物或抑制素，其基本上也是生理耐受的。可以通過任選地在含水溶劑，或有機溶劑，或其混合物中，混合式(I)或(II)的化合物、API或抑制素或其中間物與酸或堿，使式(I)或(II)的化合物、API或抑制素成鹽，或成為鹽的形式。優(yōu)選的溶劑是在后去除的。在式(I)或(II)的化合物、API或抑制素的上下文中，術語“酯化”或“酯”在本文中指式(I)或(II)的化合物或抑制素，其結構中具有至少1個酯鍵。在化合物或抑制素含有羥基的情況下，通過偶聯式(I)或(II)的化合物、API或抑制素或其中間物與含羧酸或磷酸基的化合物，可以實現此類酯鍵或酯化化合物。在式(I)或(II)的化合物、API或抑制素或其中間物含有羧酸或磷酸基的情況下，可以通過與另一個化合物的羥基偶聯來實現。術語“立體異構選擇性解析的”在本文中用于指任何本領域技術人員已知的分離立體異構體的混合物，立體特異性化合物的制備化學或分析學的方法?？梢酝ㄟ^例如HPLC獲得立體異構體，其中使用立體選擇性柱。立體選擇性柱是本領域已知的。酶、生物體術語“能夠催化氧化或脫氫的酶”在本文中指催化氧化或脫氫的任何酶。酶識別和使用例如式(II)的化合物作為底物。本發(fā)明還考慮酶的組合、多單元酶(其中不同的單元任選地催化不同的反應)、融合或聯結的酶，或與另一種結構性或非催化性化合物、單元、亞基或部分偶聯的酶，只要滿足能夠催化氧化或脫氫的要求。酶可以是例如在原核或真核細胞的電子傳遞鏈中的酶，或真核或原核細胞的醇、醛或糖的生物化學途徑中的酶。預料之外的發(fā)現：通常作用于天然底物的酶識別和氧化相當復雜的合成化合物，特別是將內半縮醛轉變?yōu)閮弱セ蚩赡苻D變?yōu)轷?。本發(fā)明的一個重要的方面是意在用于能夠催化氧化或脫氫的酶的反應通常不是自然界中存在的，因為底物不同于天然存在的底物，例如排除使用乙醇、甲醇、乙醛、乙酸、天然存在的糖或天然存在的氨基酸或從糖獲得的酸，例如葡萄糖酸。然而，令人驚訝的發(fā)現，本文公開的合成底物，即使結構相當復雜，也可以通過使用能夠催化氧化或脫氫的酶方便地加工，以最終獲得API，特別是抑制素或其中間物，包括例如式(I)的內酯化合物。一般而言，酶可以選自氧化還原酶。根據酶命名法，可用于本發(fā)明中的酶主要屬于EC1.1(主要作用于供體的CH-OH基團上的氧化還原酶)，更具體的是但不限于以下亞類：EC1.1.1(以NAD+或NADP+為受體)、EC1.1.2(以細胞色素為受體)、EC1.1.3(以氧為受體)、EC1.1.5(以醌或核黃素或相似化合物為受體)。反應可使用本領域已知的任何氧化還原酶，不論其序列同一性。下文將進一步詳細描述原則上可用于本發(fā)明中的酶——之后將描述示例性的實驗例子，需要時，本文還提供了合適的篩選和/或驗證測試。在本發(fā)明之前，已描述和任選地使用了一些特定的酶，但是在不同于本發(fā)明的其他條件或領域中。下文將闡述和列舉其公開內容并入本文中的參考文獻。具有糖氧化/脫氫活性的酶已廣泛地用于工業(yè)中。氧化發(fā)酵的典型例子是D-葡萄糖酸鹽(葡萄糖酸)、L-山梨糖等的傳統生產。這些方法是在澄清相應酶的分子機制前，基于對一些微生物特性的經驗性的發(fā)現，作為實踐產業(yè)出現的[Adachi,2007]。糖氧化酶在食品加工中被用作添加劑，在乳業(yè)和乳過氧化物酶體系中用于食品防腐，在面包制作中用于生產干燥蛋粉末，作為抗氧化劑/防腐劑(氧清除劑)用于還原含醇酒，作為葡萄糖測定和燃料細胞[Wong,2008]。糖氧化酶也被用作電流測定的生物傳感器，例如用于測量血液中的葡萄糖濃度[Igarashi,2004]，用于檢測重金屬[Lapenaite,2003]，用于檢測空氣中的甲醛[Acmann,2008]，用于檢測流動注射分析中的酚類化合物[Rose,2001]，用于腎上腺素的超敏型雙酶傳感器用于[Szeponik,1997]，用于確定木糖濃度[Smolander,1992]等。普遍已知的能夠氧化六元糖的酶是葡萄糖氧化酶，Gox(EC1.1.3.4)，作為黑曲霉(Aspergillusniger)的提取物可自Sigma購買。該酶具有非常狹窄的底物特異性[Keilin,1952]。它是在一些真菌和昆蟲中天然產生的，其中該酶的催化產物——過氧化氫——作為抗菌和抗真菌劑發(fā)揮作用。Gox一般被視為安全的，黑曲霉的Gox是許多工業(yè)應用的基礎[Wong,2008]。Gox催化的反應還被用于烘焙、干燥蛋粉末生產、酒生產、葡萄糖酸生產等。它的電化學活性使其成為葡萄糖傳感器中的重要組分，尤其是在糖尿病中以及PQQ依賴性糖脫氫酶的情況下，并潛在地在燃料細胞中應用。葡萄糖氧化酶能夠氧化單糖、硝基烷和羥基化合物[Wilson,1992]。利用葡萄糖的反應速率作為參照(100％)，僅2-脫氧-D-葡萄糖(20–30％)、4-O-甲基-D-葡萄糖(15％)和6-脫氧-D-葡萄糖(10％)被黑曲霉的葡萄糖氧化酶以顯著速率氧化[Pazur,1964；Leskovac,2005]。葡萄糖氧化酶對其他底物的活性通常低下，反應速率低于葡萄糖的2％[Keilin,1948；Pazur,1964；Leskovac,2005]。在優(yōu)選的實施方案中，能夠催化氧化或脫氫的酶是脫氫酶。特別地，酶能夠催化糖脫氫，更特別地能夠催化醛糖脫氫。優(yōu)選的酶是糖脫氫酶(EC1.1)。在具體的實施方案中，酶是醛糖脫氫酶或葡萄糖脫氫酶?，F有技術中描述這類酶的術語可能與本發(fā)明提供的不同，但應理解，本文中考慮的底物特異性和酶催化化合物(II)或其他化合物氧化/脫氫的能力不依賴于現有技術中的術語。一個例子是大腸桿菌中發(fā)現的酶的術語(YliI,Adh,Asd)，該酶被一些作者稱為“可溶性葡萄糖脫氫酶”，被另一些作者稱為“醛糖糖脫氫酶”或“可溶性醛糖脫氫酶”。另一個例子是關于大腸桿菌中發(fā)現的膜結合的葡萄糖脫氫酶的術語(mGDH,GCD,PQQMGDH)，該酶被一些作者稱為“PQQ依賴性葡萄糖脫氫酶”，被另一些作者稱為“膜結合的葡萄糖脫氫酶”或GCD。糖脫氫酶(醛糖脫氫酶)的天然底物是被氧化的多種糖。醛糖脫氫酶可以作用的糖的廣泛范圍涵蓋了戊糖、己糖、二糖和三糖。優(yōu)選地，能夠催化氧化或脫氫的酶在位置C1特異性氧化。在醛糖1-脫氫酶的情況下，酶將醛或環(huán)狀半縮醛氧化為內酯。與上文一致，根據電子受體(在一些情況下，這些電子受體是這些酶使用從而有功能的輔助因子，即，FAD、NAD(P)+或PQQ)將糖氧化還原酶分類。按照在糖氧化還原酶亞類之間的顯著不同的底物特異性，本發(fā)明優(yōu)選使用PQQ依賴性脫氫酶(EC1.1.5)。FAD-(黃素蛋白脫氫酶)和PQQ-依賴性糖脫氫酶(醌蛋白脫氫酶)，EC1.1.5，分別使用黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或吡咯并喹啉醌(PQQ)輔助因子，并位于細菌細胞膜的外表面，其活性位點朝向周質空間。這些通常被稱為膜糖脫氫酶。可選的，尤其在PQQ-依賴性糖脫氫酶組中，發(fā)現許多酶處于可溶性的形式，位于周質空間中。根據本發(fā)明，對使用的糖脫氫酶的溶解度沒有任何本性的限制，但關于可利用的克隆、表達方法和分子工具，優(yōu)選選擇可溶的、細胞周質的糖脫氫酶，即，水溶性的酶。構建用于有效的細胞周質表達這類酶的表達菌株在技術上是較簡單的，因此是優(yōu)選的。另一方面，膜結合的糖脫氫酶對于有效表達是更加挑戰(zhàn)性的，但由于與呼吸鏈更密切的聯系(通過從PQQ向泛醌池傳遞電子)，也是優(yōu)選的。在本發(fā)明的過程中，提供了例如這樣的實例，其中使用天然存在的膜結合的糖脫氫酶以及過表達的膜結合的糖脫氫酶，用于以工業(yè)有用的產率將化合物(II)轉化為化合物(I)。呼吸鏈；電子受體在宿主生物的呼吸鏈中，氧化過程中產生的電子通過酶輔助因子(電子載體)從底物傳遞到末端的泛醇氧化酶，以泛醌作為中間物。終末電子受體是氧，被呼吸鏈氧化還原酶還原成水。呼吸鏈是一系列氧化還原酶，具有在最終以氧的還原結束的精密協同的逐步反應的級聯中，從經還原的分子傳遞電子的能力。每個步驟利用氧化還原電勢的差異進行有效工作，例如，將質子傳遞穿過細胞膜，還原其他分子等。電子載體在呼吸鏈和細胞的整體氧化還原過程中具有重要的作用。電子可以在多個水平進入呼吸鏈。在氧化NADH/NADPH(通過細胞內的多種氧化還原過程獲得的)的NADH脫氫酶的水平，將電子傳遞給泛醌池，并釋放質子至胞外空間?？蛇x的，氧化還原酶可以通過酶結合的輔助因子(FAD,PQQ)直接將電子傳遞給泛醌。泛醌再被末端的氧化還原酶(例如，細胞色素、硝酸鹽還原酶等)進一步氧化，從而將電子與胞外質子偶聯來還原氧(形成水)，而泛醌結合的質子則被釋放到胞外空間。任何能夠利用氧化還原電勢運輸質子的系統通常被稱為質子泵。因此建立起跨膜質子電勢，這是ATP合成酶發(fā)揮作用的動力。這些水平相繼具有更正的氧化還原電勢，即，相對于終末電子受體差異相繼降低的電勢。個體細菌通常同時使用多種電子傳遞鏈。細菌可以利用多種不同的電子供體、多種不同的脫氫酶、不同的氧化酶和還原酶，和不同的電子受體。例如，大腸桿菌(當有氧生長時，使用葡萄糖作為能源)使用2種不同的NADH脫氫酶和2種不同的醌醇氧化酶，同時運行共計4種不同的電子傳遞鏈。因此很明顯，僅當提供電子受體時，氧化還原酶(例如糖脫氫酶)才能夠有功能。在天然系統的情況下是由呼吸鏈提供的，可選的,可以使用相比底物/酶/輔助因子級聯反應具有恰當的氧化還原電勢的人工電子受體。在后一選項中，缺點是必須提供相當大量的人工電子受體，換言之，通常是必需與氧化底物等摩爾的量。在該方面，反應混合物中可以提供由能夠催化氧化或脫氫的酶產生的電子受體，從而促進電子流和化合物(II)的氧化或脫氫。受體可以選自但不限于：二氯酚吲哚酚(DCPIP)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、鐵氰化鉀(PF)、草酸鐵鉀、對苯醌、苯對苯醌、杜醌、硅鉬酸鹽、維生素K3、二氨基杜烯(DAD)、N,N,N’,N’-四甲基-對苯二胺(TMDP)。電子受體還可以是氧。本領域技術人員將認識到并可以例如應用作為Hill試劑列舉的化合物、作為還原時變色的人工電子受體發(fā)揮作用的染料，并從文獻中發(fā)現多個其他的候選受體。PQQ脫氫酶已顯示了PQQ具有在溶液中復合二價陽離子的能力，這是細菌醌蛋白脫氫酶的催化活性的先決條件[Mutzel,1991；Itoh,1998；Itoh,2000]。為了活化細菌醌蛋白脫氫酶(不論其來源)，除PQQ外還必須存在二價離子(例如，Mg2+、Ca2+)，以實現成功重建全酶形式[James,2003]。除了結構性作用外，復合的二價離子在維持PQQ的活性構象中也有作用[Anthony,2001]。在篩選PQQ依賴性醛糖脫氫酶后，令人驚訝的發(fā)現：在存在電子受體的情況下，測試的所有酶(例如，大腸桿菌的YliI醛糖脫氫酶，大腸桿菌的Gcd膜結合的葡萄糖脫氫酶，乙酸鈣不動桿菌的GDH(可溶性的或膜結合的形式)，氧化葡糖桿菌的GDH，中間克呂沃爾菌的GDH)都可以將化合物(II)氧化為化合物(I)–(R1＝H，R2＝O-CO-CH3)，而不論受體是合成的分子或微生物的呼吸鏈。實際上，我們的實驗發(fā)現測試的所有含有PQQ依賴性氧化還原酶的生物體都成功地將乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯氧化為乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯。一些還成功地測試用于其他化合物(II)分子，如下文示例。從這個意義上來說，本發(fā)明的優(yōu)選的方面涉及PQQ依賴性脫氫酶(醌蛋白，EC1.1.5)，更具體的是PQQ依賴性糖1-脫氫酶(EC1.1.5.2)。例如，YliI是大腸桿菌的醛糖糖脫氫酶，其活性需要PQQ[Southall,2006]。盡管大腸桿菌本身缺少合成PQQ的能力[Hommes,1984；Matsushita,1997]，其對環(huán)境中發(fā)現的PQQ表現出正趨化效應[deJonge,1998]，并可以利用外部供應的輔助因子[Southall,2006]。YliI醛糖糖脫氫酶是可溶性的周質蛋白質，含有通過細胞質膜遷移至周質所必需的N-端信號序列。YliI醛糖糖脫氫酶(Asd)的折疊含有6個四鏈反平行的β-片層，其中PQQ結合位點位于蛋白質表面上暴露給溶劑的淺縫中。YliI蛋白是單體，每個單體結合2個鈣離子，其中1個位于PQQ結合口袋中，另一個壓縮在形成螺旋槳折疊的六條鏈中的兩條之間[Southall,2006]。已顯示[Southall,2006]D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、D-阿拉伯糖、D-巖藻糖、D-甘露糖、D-來蘇糖、D-木糖、D-核糖、木糖醇、肌醇、L-山梨糖、甘露醇、2-脫氧-D-葡萄糖、葡萄糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、葡萄糖1-磷酸、葡萄糖6-磷酸、麥芽糖、α-乳糖、D-蔗糖、D-纖維二糖、蜜二糖和麥芽三糖是YliI醛糖1-脫氫酶的可接受的天然底物。Suthall等人沒有測試與化合物(II)類似的、在C3位具有立體異構化學的天然糖，例如D-阿洛糖、D-阿卓糖、D-古羅糖或D-艾杜糖。除YliI醛糖糖脫氫酶外，大腸桿菌還含有膜結合的葡萄糖脫氫酶(mGDH)，這也是參與醇和糖的細胞周質氧化呼吸鏈的醌蛋白[Yamada,2003]。該酶也被稱為GCD或mGDH或PQQGDH，以與YliI相似的脫輔基酶的形式存在，原因是大腸桿菌缺少合成酶的輔基——吡咯并喹啉醌(PQQ)的能力。mGDH是膜結合醌蛋白[Matsushita,1993；Anthony,1996；Goodwin,1998]，其在其延伸到周質空間中的C-端結構域上，催化D-葡萄糖氧化為D-葡萄糖酸鹽。PQQ介導的電子傳遞進一步受N端的膜整合結構域驅動；流向呼吸鏈的電子流穿過泛醌池至泛醇氧化酶[VanSchie,1985；Matsushita,1987；Yamada,1993]。通過添加PQQ和Mg2+或Ca2+或其他二價金屬離子，獲得mGDH酶的活性全酶形式。GCD是單體蛋白質，其具有跨內膜的N-端疏水結構域[Yamada,1993]，和位于周質空間中的含有PQQ和Mg2+或Ca2+的結合位點的大型C-端結構域[Yamada,1993；Cozier,1999]。令人驚訝的是，mGDH酶還能夠催化人工底物，式(II)的化合物的氧化。Cozier等人測試了它對D-阿洛糖的活性，所述D-阿洛糖是測試的唯一與化合物(II)具有相似的C-3原子立體異構化學的天然己醛糖，并且表現出較之D-葡萄糖相似的活性。應注意的是，D-阿洛糖在C-2和C-4上的另外兩個OH基中不同于化合物(II)，這使得對化合物(II)的活性同樣令人驚訝和預料之外的。PQQ依賴性糖脫氫酶的另一個例子是乙酸鈣不動桿菌GDH。至少2種不同的乙酸鈣不動桿菌的醌蛋白葡萄糖脫氫酶是已知的：膜結合形式(mGDH)和可溶形式(sGDH)，其含有用于通過細胞質膜遷移至周質所需的24個氨基酸的N-端信號序列。兩種形式的所有特征是不同的，例如底物特異性、分子大小、動力學、最佳pH、免疫活性。sGDH的底物特異性與mGDH不同。sGDH優(yōu)選氧化D-葡萄糖、麥芽糖和乳糖，較不成功氧化D-巖藻糖、D-木糖、D-半乳糖；而mGdh較不與二糖反應；其優(yōu)選氧化D-葡萄糖、6-脫氧-D-葡萄糖、2-脫氧-D-葡萄糖、D-阿洛糖、D-巖藻糖、2-氨基-D-葡萄糖(葡萄糖胺)、3-脫氧-D-葡萄糖、D-蜜二糖、D-半乳糖、D-甘露糖、3-O-甲基-D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-來蘇糖和D-核糖，較不成功氧化麥芽糖和乳糖[Cozier,1999；Adachi,2007]。sGDH的兩種可能的反應機制是：(A)添加-消除機制，包括廣義堿-催化的去質子作用，再通過共價添加底物和之后消除產物；(B)包括廣義堿催化的去質子作用的機制，所述去質子作用與從底物直接傳遞氫化物至PQQ并互變異構化為PQQH2相呼應[Oubrie,1999]。大腸桿菌YliI醛糖脫氫酶也假設是相似的機制。與上述PQQ依賴性脫氫酶相似，sGDH和mGDH的二聚化和功能需要鈣或鎂[Olsthoorn,1997]?，F有結構驗證了每個單體存在3個鈣結合位點[Oubrie,1999]。如本發(fā)明示例的多種上述酶，就結構特性、定位、輔助因子結合和電子傳遞的機制等而言，不影響所述多種酶催化化合物(II)氧化為化合物(I)的功效。PQQ依賴性糖脫氫酶的現有工業(yè)應用包括在經典發(fā)酵方法中生產D-葡萄糖酸(氧化葡糖桿菌)，以及生產多種天然糖。氧化葡糖桿菌生物體的不完全氧化天然碳底物，例如D-山梨糖醇(生產用于維生素C合成的L-山梨糖)、甘油(生產二羥基丙酮)、D-果糖和D-葡萄糖(生產葡萄糖酸、5-酮-、2-酮-和2,5-二酮葡萄糖酸)的重要能力用于生物技術應用中是普遍已知的。與上述說明不同，在乙酸鈣不動桿菌中發(fā)現了PQQ依賴性脫氫酶，所述乙酸鈣不動桿菌是醋生產中使用的工業(yè)微生物。對PQQ依賴性糖脫氫酶的最新關注是涉及研發(fā)不同的電流測定生物傳感器，例如用于測量血液中的葡萄糖濃度[D’Costa,1986；Igarashi,2004；Heller,2008]，用于檢測重金屬[Lapenaite,2003]，用于檢測空氣中的甲醛[Acmann,2008]，用于檢測流動注射分析中的酚類化合物[Rose,2001]，作為用于腎上腺素的超敏型雙酶傳感器[Szeponik,1997]，用于確定木糖濃度[Smolander,1992]等。PQQ依賴性糖脫氫酶還可以在納米技術中用作生物燃料細胞[Gao,2010]?？扇苄訮QQ依賴性葡萄糖脫氫酶已成為用于自身監(jiān)控血糖的生物傳感器體系中使用的主要酶類，因為這些酶與葡萄糖氧化酶不同，依賴于氧存在[Heller,2008]。在現有技術中，不存在或尚未考慮過使用PQQ依賴性醛糖脫氫酶生產非天然化合物，尤其是與活性藥物化合物或其中間物聯合的方法，但如本發(fā)明所公開和提供的，已經證明這類酶提供用于有用的非天然化合物的有效且簡單的合成原理是可行和可實現的。因此，本發(fā)明開辟了這類酶在其他氧化還原反應中的新應用領域，用于合成非天然化合物的目的，所述非天然化合物尤其是屬于合成API及其中間物化合物的類別。選擇本發(fā)明中特別有用的酶利用本文提供的信息和實驗指導，本領域技術人員可以理解和推測如何選擇能夠催化氧化或脫氫的酶，從而基于其底物特異性或雜亂性、操作pH、溫度和離子強度窗、對其他離子或輔助因子的需求等，將例如式(II)的化合物轉變?yōu)槭?I)的化合物。通常選擇產生最佳酶活性的底物和反應條件。然而，可以協調對攜帶酶的細胞產生最小抑制效應或降低產物的穩(wěn)定性的底物和條件，與達到最佳活性的底物和條件。原則上，允許增強的，優(yōu)選最佳的酶活性的底物是優(yōu)選的，反之亦然，對理想的化合物底物具有增強的，優(yōu)選最佳特異性的酶是優(yōu)選的。本領域技術人員可立即理解：反應條件一方面包括溫度、pH、溶劑組成、攪拌和允許理想產物積累的反應長度。除了滿足酶活性外，本領域技術人員根據本文提供的公開內容可知，調整條件以應用合適的pH、溫度和反應時間，來阻止產物(例如內酯或酯)破壞。如果需要，可以向酶加入特定的輔助因子、共底物和/或鹽，從而允許或改善酶的活性。輔助因子是鹽或化學化合物。通常，所述種類已經包括在溶劑混合物中，尤其是如果酶包含在活的全細胞、失活的全細胞、均質化的全細胞或無細胞提取物中。即使如此，還可以向酶、溶劑或反應混合物中加入輔助因子、共底物和/或鹽。取決于酶，可以向酶、溶劑、基質或包含酶的反應混合物中加入二價銅、鐵、鎳、硒、鋅、鎂、鈣、鉬或錳離子，或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、硫鋅酰胺、抗壞血酸、黃素單核苷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、輔酶Q、輔酶F420、吡咯并喹啉醌、輔酶B、谷胱甘肽、血紅素、四氫生物蝶呤等。例如，對于醛糖-1-脫氫酶或優(yōu)選的Ylil或Gcd，向反應混合物、酶或溶劑或基質中加入鈣離子或鎂離子和吡咯并喹啉醌、或相似的電子受體。具體而言，下文實施例中說明了合適的條件。用于本發(fā)明的脫氫酶可特別選自任何對上述底物(II)具有氧化活性的酶。一般而言，可以使用本領域已知的任何糖1-脫氫酶，而不論其與下文所列舉酶(即脫氫酶)的序列同一性。應注意，挑選能夠在C1位置特異性催化氧化或脫氫的酶是有利的。在醛糖1-脫氫酶的情況下，酶將醛或環(huán)狀半縮醛氧化為內酯。本發(fā)明還考慮酶的特殊變體，例如，在耐熱性微生物菌株中發(fā)現的酶。這也同樣適用于經過修飾或改良的天然存在的酶，其氨基酸序列或結構已經改變，以獲得更好的底物特異性、更高的活性、在更寬溫度或pH范圍內的活性、對存在的有機溶劑或溶劑中的高離子強度的抗性等。令人驚訝的發(fā)現了兩種不同的糖脫氫酶，其源自分類學不同的微生物，并且僅具有21,8％氨基酸序列同一性，在本實驗中同樣成功地實施。具體而言，在代表的大腸桿菌的GDH01醛糖糖脫氫酶YliI的氨基酸序列SEQIDNO.02與代表乙酸鈣不動桿菌的GDH02葡萄糖脫氫酶GdhB的氨基酸序列SEQIDNO.06之間實施比較。用VectorNTIAdvance11.0軟件(Invitrogen)的組件，AlignX模塊的默認設置進行序列比較算法，使用clustalW算法作為默認設置。此外，還發(fā)現盡管在略微不同的反應條件下，甚至結構高度不同的酶，如具有氨基酸序列SEQIDNO.02的大腸桿菌的可溶性醛糖1-脫氫酶，和具有氨基酸序列SEQIDNO.04的大腸桿菌的膜結合的葡萄糖脫氫酶，也在本實驗中同樣成功。由于此令人驚訝的發(fā)現，有理由預期能夠將化合物(II)轉變?yōu)榛衔?I)或相似反應的蛋白質的氨基酸序列可以顯著不同。然而，反應的產率依賴于各個糖脫氫酶酶的底物特異性。合適的脫氫酶的例子包括但不限于序列表中的酶，所述酶是由其核苷酸序列、或各自的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列、或序列表中所述的氨基酸序列定義的。GDH01是包含在SEQIDNO.01的核苷酸序列中的脫氫酶編碼基因，或SEQIDNO.02的氨基酸序列。GDH02是具有SEQIDNO.03的核苷酸序列或SEQIDNO.04的氨基酸序列的脫氫酶。GDH03是具有SEQIDNO.05的核苷酸序列或SEQIDNO.06的氨基酸序列的脫氫酶。GDH04是具有SEQIDNO.07的核苷酸序列或SEQIDNO.08的氨基酸序列的脫氫酶。GDH05是具有SEQIDNO.09的核苷酸序列或SEQIDNO.10的氨基酸序列的脫氫酶。GDH06是具有SEQIDNO.23的核苷酸序列或SEQIDNO.24的氨基酸序列的脫氫酶。GDH07是具有SEQIDNO.25的核苷酸序列或SEQIDNO.26的氨基酸序列的脫氫酶。GDH08是具有SEQIDNO.27的核苷酸序列或SEQIDNO.28的氨基酸序列的脫氫酶。GDH09是具有SEQIDNO.29的核苷酸序列或SEQIDNO.30的氨基酸序列的脫氫酶。GDH10是具有SEQIDNO.31的核苷酸序列或SEQIDNO.32的氨基酸序列的脫氫酶。GDH11是具有SEQIDNO.33的核苷酸序列或SEQIDNO.34的氨基酸序列的脫氫酶。GDH12是具有SEQIDNO.35的核苷酸序列或SEQIDNO.36的氨基酸序列的脫氫酶。GDH13是具有SEQIDNO.37的核苷酸序列或SEQIDNO.38的氨基酸序列的脫氫酶。GDH14是具有SEQIDNO.39的核苷酸序列或SEQIDNO.40的氨基酸序列的脫氫酶。GDH15是具有SEQIDNO.41的核苷酸序列或SEQIDNO.42的氨基酸序列的脫氫酶。GDH16是具有SEQIDNO.43的核苷酸序列或SEQIDNO.44的氨基酸序列的脫氫酶。GDH17是具有SEQIDNO.45的核苷酸序列或SEQIDNO.46的氨基酸序列的脫氫酶。GDH18是具有SEQIDNO.47的核苷酸序列或SEQIDNO.48的氨基酸序列的脫氫酶。GDH19是具有SEQIDNO.49的核苷酸序列或SEQIDNO.50的氨基酸序列的脫氫酶。GDH20是具有SEQIDNO.51的核苷酸序列或SEQIDNO.52的氨基酸序列的脫氫酶。GDH21是具有SEQIDNO.53的核苷酸序列或SEQIDNO.54的氨基酸序列的脫氫酶。GDH22是具有SEQIDNO.55的核苷酸序列或SEQIDNO.56的氨基酸序列的脫氫酶。GDH23是具有SEQIDNO.57的核苷酸序列或SEQIDNO.58的氨基酸序列的脫氫酶。GDH24是具有SEQIDNO.59的核苷酸序列或SEQIDNO.60的氨基酸序列的脫氫酶。GDH25是具有SEQIDNO.61的核苷酸序列或SEQIDNO.62的氨基酸序列的脫氫酶。因此，用于本發(fā)明的糖脫氫酶可以是對化合物(II)具有糖1-脫氫酶活性的任何化合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，糖1-脫氫酶是PQQ依賴性糖1-脫氫酶。合適的PQQ依賴性糖1-脫氫酶的例子包括但不限于：GDH01、GDH02、GDH03、GDH04、GDH05、GDH06、GDH07、GDH08、GDH09、GDH10、GDH11、GDH12、GDH13、GDH14、GDH15、GDH16、GDH17、GDH18、GDH19、GDH20、GDH21、GDH22、GDH23、GDH24和GDH25，其中每個酶是通過上文序列表所述的相應的核苷酸序列、或各自的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列、或氨基酸序列定義的。本發(fā)明提供了與選自GDH01、GDH02、GDH03、GDH04、GDH05、GDH06、GDH07、GDH08、GDH09、GDH10、GDH11、GDH12、GDH13、GDH14、GDH15、GDH16、GDH17、GDH18、GDH19、GDH20、GDH21、GDH22、GDH23、GDH24和GDH25的任何脫氫酶具有至少50％，優(yōu)選至少70％氨基酸序列同一性的糖脫氫酶。通過序列比較算法分析或目測，確定氨基酸序列標識。在一個方面，用VectorNTIAdvance11.0軟件(Invitrogen)的組件，AlignX模塊的默認設置進行序列比較，使用clustalW算法作為默認設置。本發(fā)明提供的優(yōu)選糖1-脫氫酶可以是源自大腸桿菌的糖脫氫酶，在上文序列表中鑒定為GDH01，并具有相應的核苷酸序列SEQIDNO.01和氨基酸序列SEQIDNO.02。本發(fā)明提供的同樣優(yōu)選的糖1-脫氫酶可以是源自大腸桿菌的糖脫氫酶，在上文序列表中鑒定為GDH02，并具有相應的核苷酸序列SEQIDNO.03和氨基酸序列SEQIDNO.04。本發(fā)明提供的另一個優(yōu)選的糖1-脫氫酶可選自源自乙酸鈣不動桿菌的糖脫氫酶，在上文序列表中鑒定為GDH03，并具有相應的核苷酸序列SEQIDNO.05和氨基酸序列SEQIDNO.06。本發(fā)明提供的另一個優(yōu)選的糖1-脫氫酶可選自源自乙酸鈣不動桿菌的糖脫氫酶，在上文序列表中鑒定為GDH04，并具有相應的核苷酸序列SEQIDNO.07和氨基酸序列SEQIDNO.08。本發(fā)明提供的最優(yōu)選的糖1-脫氫酶可以是源自大腸桿菌的糖脫氫酶，在上文序列表中鑒定為GDH02，并具有相應的核苷酸序列SEQIDNO.03和氨基酸序列SEQIDNO.04。本領域和本發(fā)明中也描述了所述糖1-脫氫酶為PQQ依賴性糖脫氫酶、PQQ依賴性葡萄糖脫氫酶、膜結合的葡萄糖脫氫酶、PQQ依賴性醛糖脫氫酶、醛糖脫氫酶、醛糖脫氫酶醌蛋白或葡萄糖脫氫酶醌蛋白。該特定的酶是由大腸桿菌中天然存在的基因gcd編碼的，并編碼被稱為Gcd、mGDH或PQQGDH的蛋白質。本發(fā)明示例性地利用了與氨基酸序列SEQIDNO.02具有至少21.8％、50％，優(yōu)選至少70％氨基酸序列同一性的糖脫氫酶。在本發(fā)明中，根據作為產品的所需的合成的API或其前體化合物，可以篩選能夠氧化式(II)的內半縮醛或另一種非天然底物的酶/生物體。在本發(fā)明的一個方面，本領域技術人員可以從文獻中發(fā)現其他候選酶，可用于理想類型的酶促轉化?？梢栽诓煌奈⑸锖?或酶中篩選對化合物(II)的氧化/脫氫活性。術語“分析的材料”在本文中指可用于篩選方法中的任何微生物和/或酶，所述方法篩選和鑒別由本發(fā)明的任何微生物提供的作為活的全細胞催化劑、剩余的全細胞催化劑、無細胞裂解液、部分純化的或純化酶、固定化酶或任何其他形式的催化劑，能夠將化合物(II)轉變?yōu)榛衔?I)的微生物和/或酶，而不論所述微生物是天然的或遺傳修飾的微生物。出于實踐目的，下文可理解術語“分析的材料”包括上述候選催化劑的所有制劑。本公開內容中提供了若干允許篩選和鑒別對化合物(II)的氧化/脫氫活性的方法，以及因此用于篩選和鑒別可用于執(zhí)行本發(fā)明的生物體和/或酶的方法。為了成功的實施所述篩選方法，可以根據培養(yǎng)特性，獲得“分析的材料”。可以實施培養(yǎng)，以在滿足營養(yǎng)需求的生長培養(yǎng)基中獲得“分析的材料”的生物量。可以在液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中實施培養(yǎng)。生長培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可以選自但不限于Difco&BBLManual,2010，以及本領域技術人員普遍已知的其他規(guī)程?？梢詫⑴囵B(yǎng)的微生物制備成由本發(fā)明提供的不同的形式的催化劑。特別是在允許化合物(I)形成和積累的條件下，使“分析的材料”與化合物(II)接觸。在一個方面，這些條件包括提供足以能夠實施氧化/脫氫的負載的“分析的材料”；在另一個方面，反應中存在的底物和電子受體的量對催化劑活性表現出最低的抑制作用，在另一個方面，溫度、pH、溶劑組成、攪拌和反應的長度允許積累理想的產物，在另一個方面，所述條件對產物穩(wěn)定性沒有有害作用。具體而言，這類條件可如實施例公開的值或條件所示定義，或從實施例公開的值或條件修飾或改變而來?！胺治龅牟牧稀痹诒举|上能夠提供對化合物(I)(即PQQ)的活性所需的所有輔助因子，或者當如本發(fā)明所述從外部提供PQQ時，“分析的材料”具有將化合物(II)轉變?yōu)榛衔?I)的能力。在本文提供的所有篩選方法中，可以優(yōu)選地添加所述和示例的濃度的PQQ。以鹽的形式(例如CaCl2或MgCl2)提供的二價金屬離子(例如鈣或鎂離子)促進PWW重構為脫輔基酶蛋白，獲得活性形式的醛糖脫氫酶。這些可優(yōu)選地以所述和示例的濃度添加至酶。對本領域技術人員顯而易見的是：可以通過上述方法和本說明書別處所述，定量確定PQQ的存在。在此情況下，用于方法的材料必須耗盡PQQ，或本質上已不含任何PQQ。一個這類篩選和鑒別候選催化劑的方法是使“分析的材料”與化合物(II)接觸。應該在上述最佳反應條件下實施化合物(II)向化合物(I)的轉變?？梢酝ㄟ^本領域已知的任何普遍已知的層析方法，在存在“分析的材料”的條件下，實現對底物轉變?yōu)楫a物的檢測。非限制性的例子包括液相HPLC、GC、TLC分析等。用于監(jiān)控化合物(I)和相應化合物(II)的示例而非限制性的方法是氣相層析分析(層析柱：DB-1100％二甲基聚硅氧烷；溫度程序：初始溫度：50℃，初始時間：5min，溫度速率：10℃/min，終末溫度：215℃，終末時間：10min；注射器：分流/無分流注射器；運載氣體：氦，初始流動：10mL/min；檢測器：火焰離子化檢測器(FID)，檢測器溫度：230℃)。執(zhí)行這類方法的先決條件是反應混合物中存在電子受體。對于存在天然電子受體(例如呼吸鏈)的“分析的材料”，不需要任何其他組分(除了與空氣中的氧氣)而能夠通過利用所述層析方法，觀察從化合物(II)形成化合物(I)。當不能獲得能夠釋放PQQ的電子對的電子受體的情況下(例如在無細胞裂解液或細胞膜級分中)，就需要人工電子受體，如DCPIP。然而，所述方法是分析方法，僅需要少量人工電子受體，優(yōu)選的方式是在存在人工電子受體的條件下，用任何種類的“分析的材料”進行篩選方法。用于進行上述方法的示例性和優(yōu)選的條件由實施例中公開的數值和條件定義。本發(fā)明提供的另一種篩選方法是在存在可選的人工電子受體的條件下實施的方法，所述人工電子受體具有相比可使用的底物/酶/輔助因子級聯反應的恰當的氧化還原電勢。就該意義而言，本發(fā)明提供了使用人工電子受體的篩選方法，所述人工電子受體在被還原時會改變自身的光學可測量特性(例如顏色、吸光值、光譜等)。可以在反應混合物(連接了染料的體系)中提供這類人工電子，從而促進電子流，因而提示化合物(II)的氧化或脫氫。受體/指示劑可選自但不限于：2,6-二氯酚吲哚酚(DCPIP)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、鐵氰化鉀(PF)、草酸鐵鉀、對苯醌、苯對苯醌、杜醌、硅鉬酸鹽、維生素K3、二氨基杜烯(DAD)、N,N,N’,N’-四甲基-對苯二胺(TMDP)。本領域技術人員將認識到作為Hill試劑列舉的化合物、作為還原時變色的人工電子受體發(fā)揮作用的染料，并可以從文獻中發(fā)現許多其他的候選受體/指示劑。優(yōu)選地，可以使用2,6-二氯酚吲哚酚(DCPIP)與吩嗪硫酸甲酯(PMS)的組合。示例性的篩選方法在反應混合物中含有下列組分：DCPIP與PMS組合作為人工電子受體、“分析的材料”和化合物(II)。分光光度法由DCPIP吸光值的降低，跟蹤“分析的材料”對化合物(II)的氧化/脫氫活性，其中DCPIP被氧化時是藍色的，被還原時變?yōu)闊o色。當“分析的材料”能夠對化合物(II)具有氧化/脫氫活性時，電子被傳遞給人工電子受體，所述人工電子受體被還原并因此反應混合物的顏色從藍色變成無色。進行所述方法的一個例子是遵從下列方法：對于兩種所述人工電子受體DCPIP和PMS都使用從約0.01mM至約10mM的濃度，特別是從約0.05mM至約5mMDCPIP與0.01mM至約2mMDCPIP組合。優(yōu)選的，篩選方法中提供的DCPIP的量是濃度從0.1mM至約1mM，與濃度從0.05mM至約0.5mMPMS組合。最優(yōu)選的，所提供的DCPIP與PMS的組合的量允許在分光光度法可以跟蹤的時間線內觀察到吸光值的降低。可以將化合物(II)溶解在恰當的含水溶液中，并在篩選方法中使用從約0.5mM至約1M，優(yōu)選從約10mM至約500mM，最優(yōu)選20mM至200mM的濃度?？梢詫⒒衔?II)溶解在蒸餾水或合適的緩沖溶液中。用于調節(jié)pH值的合適緩沖液是由酸、堿、鹽或其混合物制備的，特別是可以使用磷酸和氫氧化鈉。實施篩選方法的含水懸浮液可以緩沖至pH5.5-9.0，優(yōu)選6.0-8.5，更優(yōu)選6.0.-8.0。在所述含水懸浮液中(特別是在從約0.05g/L至約50g/L的濃度范圍內)，任選地在緩沖溶液(特別是磷酸緩沖液，pH6.0-8.5)中，將“分析的材料”加入到反應混合物中。可以跟蹤吸光值降低的時間線，可以在380nm至750nm之間的波長，優(yōu)選在450nm至650nm之間的波長，更優(yōu)選在550nm至650nm之間的波長內，用分光光度法觀察，對能夠將化合物(II)轉變?yōu)榛衔?I)的催化劑進行篩選和鑒別。本發(fā)明還提供了醛糖脫氫酶活性單位。醛糖脫氫酶活性單位定義為每單位濕重的用于制備任何“分析的材料”的培養(yǎng)的微生物中，每分鐘吸光值減少的絕對值(abs[mAUmin-1mg-1])。為了比較研究，可以將測試的微生物的細胞密度定量化為每mL樣品的濕重mg、蛋白質濃度和/或本領域技術人員普遍已知的的其他用于定量的間接或直接方法。用于鑒別能夠將化合物(II)轉變?yōu)榛衔?I)的生物體的另一種篩選方法是使用本領域任意已知的耗氧量測量方法。本發(fā)明提供的非限制性例子是使用加入化合物(II)后的測試生物的培養(yǎng)物中的溶解氧的測量值。更特別地，實驗設置由含有測試生物的液體培養(yǎng)肉湯的攪拌型充氣容器，和溶解氧的傳感器組成。在加入化合物(II)后，可以觀察到增加的的耗氧量，顯示為溶解氧的數值下降。在標準化條件下，溶解氧的數值下降越快越深，測試生物促進化合物(II)的氧化速率越高。PQQ吡咯并喹啉醌(4,5-二氫-4,5-二氧-1H-吡咯-[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸：PQQ)是使用醌蛋白時發(fā)揮功能所需要的分子。PQQ，氧化還原輔助因子，是水溶性和熱穩(wěn)定的，被認為是生物氧化還原作用中除煙酰胺和黃素以外的第三類輔酶，是Hauge,1964發(fā)現的。當時，Anthony和Zatman還在醇脫氫酶中發(fā)現了未知的氧化還原輔助因子，并命名為methoxantin[Anthony,1967]。之后，據報道PQQ存在于脫氫酶、氧化酶、加氧酶、水合酶和脫羧酶中。這些醌蛋白的作用是催化非磷酸化的底物，例如醇、醛或醛糖的初級氧化步驟。在原核(例如肺炎克雷伯氏菌、乙酸鈣不動桿菌、扭脫甲基桿菌、中間克呂沃爾菌、氧化葡糖桿菌、銅綠假單胞菌、解淀粉歐文氏菌、水生拉恩氏菌、耐放射異常球菌)和真核生物(例如云芝(Polyporusversicolor)、漆樹(Rhusvernicifera))中都已發(fā)現了PQQ[Goodwin,1998；Hoelscher,2006；Yang,2010]。一般接受的PQQ結構是：其中，PQQox是輔助因子的氧化形式，PQQred是輔助因子的還原形式。參與PQQ生物合成的基因數隨物種而不同，一般已知生物合成至少需要5或6個基因，通常成簇存在于pqqABCDE或pqqABCDEF操縱子中。由下列實施例可見，基因的數量和組織方式是可變的。在肺炎克雷伯氏菌中，PQQ生物合成的基因成簇存在于pqqABCDEF操縱子中，而在銅綠假單胞菌中，pqqF則與pqqABCDE操縱子分開。在乙酸鈣不動桿菌中，已知存在pqqABCDE，但沒有pqqF基因。兼性甲基營養(yǎng)性的扭脫甲基桿菌AM1含有pqqABC/DE操縱子，其中融合了pqqC和pqqD基因，而pqqFG基因與其他3個基因形成操縱子。雖然了解了許多關于使用PQQ作為輔助因子的酶，但關于PQQ的生物合成卻知之甚少。然而，PQQ的骨架是由谷氨酸和酪氨酸構建的。最可能的是，這些氨基酸被編碼在前體肽PqqA中。不同生物體之間的小肽長度不同(肺炎克雷伯氏菌是23個氨基酸，熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)是39個)，而在所有的變體中段中，PqqA肽基序Glu-X-X-X-Tyr是保守的。PqqB蛋白可能參與了其向周質的運輸，因此不是PQQ生物合成直接必需的。PqqC蛋白的殘基在PqqC蛋白之間是高度保守的，其負責催化不同細菌的PQQ形成的最后一步。盡管不同生物體的PqqD蛋白的蛋白質序列比對顯示出嚴格保守的殘基，但PqqD的功能尚未完全解析。在肺炎克雷伯氏菌中，顯示了PqqE識別連接C9和C9a的PqqA，之后被PqqF接受，所述PqqF切斷相連的氨基酸。在所述生物體中，顯示出下一步反應(Schiff堿)是自發(fā)的，在雙加氧作用。最后的環(huán)化和氧化步驟由PqqC催化[Puehrunger,2008]。當在蛋白質數據庫中實施源自肺炎克雷伯氏菌的PqqF和PqqG蛋白比較時，據稱所述蛋白質與切割小肽的、含二價陽離子的內肽酶家族具有相似性[Meulenberg,1992]。盡管扭脫甲基桿菌的PqqF和PqqG蛋白與線粒體加工的肽酶的2個亞基具有一定程度的相似性[Springer,1996]，肺炎克雷伯氏菌的PqqF與由tldD基因編碼的大腸桿菌的肽酶溶加壓素(pitrilysin)最密切相關[Meulenberg,1992]。假設并實驗顯示了可以使用僅包含pqqABCDE基因而缺少pqqF的PQQ基因簇，在大腸桿菌中提供完整的PQQ生物合成裝置(KimC.H.等人，2003,YangX.-P.等人，2010)。溶加壓素蛋白酶(由tldD基因編碼)明顯與一些微生物中發(fā)現的pqqF基因的活性互補。雖然大腸桿菌本身缺少合成PQQ的能力[Hommes,1984；Matsushita,1997]，但它對環(huán)境中的PQQ表現出正趨化效應[deJonge,1998]，并可以使用外部供應的輔助因子[Southall,2006]。因此，可以在大腸桿菌中重組表達PQQ生物合成基因，這是本發(fā)明描述的一個方面。一般而言，對于上述內容，至少有3種方式向PQQ-依賴性脫氫酶原位提供PQQ：首先，可以向含有醛糖脫氫酶的活細胞、或休眠細胞或無細胞裂解液、或純化的醛糖脫氫酶添加PQQ。全酶形式重構為活性的脫輔基酶蛋白幾乎是瞬間的，這是本發(fā)明顯示的一個方面。為了促進酶與PQQ的偶聯，向混合物中加入鈣、鎂或其他二價金屬離子。這可以通過向酶混合物中添加鹽(如MgCl2或CaCl2)來實現。此外，還有其他一些添加PQQ的可能性，所述可能性不需要純化成膳食補充劑、基質組分，如酵母提取物等的形式。醌蛋白對PQQ具有非常高的親和力的這一事實[deJonge,1998]允許使用與醌蛋白等摩爾的量。實際上，這意味著納摩爾濃度至微摩爾水平。對本領域技術人員顯而易見的是，為了降低方法的成本，可方便地實施醛糖脫氫酶的最佳活性所需要的PQQ量的優(yōu)化。作為非限制性的例子，向醛糖脫氫酶催化劑添加遞增量(從0.1nM起)的PQQ，并且當所述催化劑的活性不再隨提供的額外的PQQ增加時，所添加的量是最佳的。就該意義而言，本發(fā)明提供了向醛糖脫氫酶提供PQQ的方法。更具體的是向活的全細胞催化劑、休眠或失活的全細胞催化劑、無細胞裂解液或提取物，或本發(fā)明提供的任何其他的催化劑形式，濃度為從約0.1nM至約5mM。特別是可以提供從約1nM至約100uM的PQQ。更優(yōu)選的是提供濃度為從100nM至約5uM的PQQ。最優(yōu)選的是提供允許所述催化劑的最大活性的最少量的PQQ?？梢詮娜魏蝸碓传@得PQQ，并作為固體物質或PQQ儲液提供給催化劑。為了便于PQQ重構醛糖脫氫酶，向酶提供鈣或鎂離子，優(yōu)選濃度為從約0.1mM至約50mM，更優(yōu)選從約1mM至約20mM的CaCl2或MgCl2。MgCl2是優(yōu)選的選項，但不同的酶對具體二價離子的偏好可以不同。其次選擇是用于生產恰當的脫氫酶的宿主生物本質上具有PQQ生物合成的能力，換言之，在其遺傳材料中已經整合了含有PQQ生物合成的功能基因。非限制性的例子是：肺炎克雷伯氏菌、乙酸鈣不動桿菌、扭脫甲基桿菌、中間克呂沃爾菌、氧化葡糖桿菌、銅綠假單胞菌、解淀粉歐文氏菌、水生拉恩氏菌、耐放射異常球菌等。當使用這類微生物作為表達同源或異源醛糖脫氫酶的宿主時，表達的酶與PQQ偶聯，以形成活性形式。一些所述微生物除PQQ生產能力外，還存在活性PQQ依賴性醛糖脫氫酶，其能夠將化合物(II)轉變?yōu)榛衔?I)。在本發(fā)明的一些方面，該方法經證實是非常有效且成功的，如下文示例。在這一方面，本發(fā)明提供了具有生產PQQ的天然能力的微生物，所述微生物可用作同源或異源表達PQQ依賴性醛糖脫氫酶的宿主。所述微生物優(yōu)選選自細菌，更優(yōu)選是可以工業(yè)培養(yǎng)的細菌，特別是肺炎克雷伯氏菌、乙酸鈣不動桿菌、扭脫甲基桿菌、中間克呂沃爾菌、腸桿菌、氧化葡糖桿菌、銅綠假單胞菌、解淀粉歐文氏菌、水生拉恩氏菌、耐放射異常球菌。在最優(yōu)選的實施方案中，可以使用肺炎克雷伯氏菌、乙酸鈣不動桿菌、銅綠假單胞菌、解淀粉歐文氏菌、氧化葡糖桿菌。類似地，還在不同的實施方案中，本發(fā)明提供了具有將化合物(II)轉變?yōu)榛衔?I)的天然能力的微生物。所提供的生物不需要進行任何遺傳修飾以獲得能夠實施所需氧化的催化劑。因此，本發(fā)明提供了用于本公開目的和用途的微生物，選自細菌來源，更特別的是來自以下屬：克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、不動桿菌屬、根瘤菌屬、甲基桿菌屬、克呂沃爾氏菌屬、葡糖桿菌屬、假單胞菌屬、歐文氏菌屬、拉恩氏菌屬和異常球菌屬。在更特定的含義中，微生物可選自肺炎克雷伯氏菌、乙酸鈣不動桿菌、扭脫甲基桿菌、中間克呂沃爾菌、腸桿菌、氧化葡糖桿菌、銅綠假單胞菌、解淀粉歐文氏菌、水生拉恩氏菌、耐放射異常球菌，最優(yōu)選的選自氧化葡糖桿菌、乙酸鈣不動桿菌和中間克呂沃爾菌。上述是具有執(zhí)行本發(fā)明的理想特性的非限制性微生物實例。此外，還公開和提供了允許篩選和鑒別這類微生物的方法。第三個選項特別可用于本質上不具有生物合成PQQ的能力的微生物，例如大腸桿菌。本領域普遍已知，一些微生物(如大腸桿菌)和大部分高等生物的基因組中編碼了PQQ-依賴性酶，并在某些條件下表達，但缺乏PQQ的生物合成[Matshushita,1997]。本領域認為這類微生物獲得PQQ作為必需營養(yǎng)素，或換言之，作為維生素。在用于本發(fā)明的這類生物體中建立PQQ的生物合成的方式對本領域技術人員是顯而易見的。已描述了向這類生物體提供PQQ的生物合成的方式(參見例如Goosen,1988；Yoshida,2001；Kim,2003；Khairnar,2003；Hoelscher,2006；Yang,2010)。本發(fā)明還提供了可以通過從具有PQQ生物合成機制的微生物中克隆PQQ生物合成基因簇至質粒載體或細菌染色體，然后允許這類基因在宿主生物中表達，予以建立。適用于該目的的微生物的非限制性例子包括肺炎克雷伯氏菌、扭脫甲基桿菌、銅綠假單胞菌、氧化葡糖桿菌、中間克呂沃爾菌、解淀粉歐文氏菌等。作為上述方法描述的普遍建立的術語，本領域技術人員可立刻理解術語“PQQ基因簇的異源表達”。對于在本發(fā)明中使用，可使用任何PQQ基因簇，只要所述基因簇編碼具有PQQ生物合成能力的上述功能蛋白，不論單獨或與宿主生物的酶協調生物合成PQQ。在本發(fā)明的一個實施方案中，pQQ基因簇可自任何生產PQQ的活的生物體中獲得。在本發(fā)明的更特別的實施方案中，PQQ基因簇可以從選自細菌的任何微生物中獲得，更特別的選自以下屬：克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、不動桿菌屬、根瘤菌屬、甲基桿菌屬、克呂沃爾氏菌屬、葡糖桿菌屬、假單胞菌屬、歐文氏菌屬、拉恩氏菌屬和異常球菌屬。在更特定的含義中，微生物可選自肺炎克雷伯氏菌、乙酸鈣不動桿菌、扭脫甲基桿菌、中間克呂沃爾菌、腸桿菌、氧化葡糖桿菌、銅綠假單胞菌、解淀粉歐文氏菌、水生拉恩氏菌、耐放射異常球菌，最優(yōu)選地選自氧化葡糖桿菌、乙酸鈣不動桿菌和中間克呂沃爾菌。合適的PQQ基因簇的例子包括但不限于簇的核苷酸序列或包括在序列表中的基因，這是由序列表中所述的核苷酸序列或氨基酸序列鑒定的。一般而言，反應可以使用提供本領域已知的功能基因的任何PQQ簇，不論其與列舉的PQQ簇、包含在內的基因和由所述基因編碼的蛋白質的序列同一性。PQQ01是來自氧化葡糖桿菌621H的PQQ編碼基因簇，其包含在核苷酸序列SEQIDNO.68中并允許表達分別編碼蛋白質PqqA、PqqB、PqqC、PqqD和PqqE的基因pqqA、pqqB、pqqC、pqqD和pqqE，所述蛋白質分別具有氨基酸序列SEQIDNO.12、13、14、15、16。PQQ02是來自中間克呂沃爾菌的PQQ編碼基因簇，包含在核苷酸序列SEQIDNO.69中并允許表達分別編碼蛋白質PqqA、PqqB、PqqC、PqqD和PqqE的基因pqqA、pqqB、pqqC、pqqD和pqqE，所述蛋白質分別具有氨基酸序列SEQIDNO.18、19、20、21、22。PQQ03是來自肺炎克雷伯氏菌324的基因簇pqqABCDEF，具有核苷酸序列SEQID.NO63并允許表達分別編碼蛋白質PqqA、PqqB、PqqC、PqqD、PqqE和PqqF的基因pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE和pqqF。上述序列可作為基因組序列的一部分獲得，在NCBI基因組數據庫具有登錄號CP000964，位置在2602846和2599706之間。PQQ04是來自扭脫甲基桿菌AM1的基因簇pqqABC/DE和pqqFG，分別具有核苷酸序列SEQID.NO64和SEQID.NO65并允許表達編碼蛋白質PqqA、PqqB、PqqC、PqqD、PqqE和PqqF的基因pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE和pqqF。上述序列可作為基因組序列的一部分獲得，在NCBI基因組數據庫具有登錄號CP001510，位置在1825235和1821763(pqqABC/DE)之間，2401055和2403792(pqqEF)之間。PQQ05是來自銅綠假單胞菌PA7的基因簇pqqABCDE和pqqF，分別具有核苷酸序列SEQID.NO66和SEQID.NO67，并允許表達編碼蛋白質PqqA、PqqB、PqqC、PqqD、PqqE和PqqF的基因pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE和pqqF。上述序列可作為基因組序列的一部分獲得，在NCBI基因組數據庫具有登錄號CP000744，位置在3420385和3423578(pqqABCDE)之間，3439512和3437221(pqqF)之間。PQQ06是來自解淀粉歐文氏菌ATCC49946的基因簇pqqABCDEF，具有核苷酸序列SEQID.NO70，并允許表達編碼蛋白質PqqA、PqqB、PqqC、PqqD、PqqE和PqqF的基因pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE和pqqF。上述序列可作為基因組序列的一部分獲得，在NCBI基因組數據庫具有登錄號FN666575，位置在597604和600850之間。利用普遍建立的數據挖掘工具，本領域技術人員還將認識到在公眾可利用的數據庫(GenBank、Swiss-Prot/TrEMBL、RCSBPDB、BRENDA、KEGG、MetaCyc)中的供PQQ合成的其他候選基因簇。可以使用本發(fā)明提供的用于測量PQQ依賴性醛糖脫氫酶活性的方法,如本發(fā)明示例，篩選和鑒別能夠生產PQQ的生物體而不論其來源(天然的或遺傳修飾的)，并且如果需要，還允許評估所生產的PQQ的量的半定量的方法?？梢允褂萌魏涡问降腜QQ依賴性醛糖脫氫酶，優(yōu)選在大腸桿菌中表達的(或任何其他不能生產PQQ的微生物)，用于重構活性全酶。比較校準曲線和補充了分析的樣品的所述PQQ依賴性醛糖脫氫酶的活性，所述校準曲線是通過測量補充了多種PQQ量的所述PQQ依賴性醛糖脫氫酶的活性獲得的。在方法的線性范圍內，分析的樣品中存在越多的PQQ，就觀察到越高的活性。在本發(fā)明的特定實施方案中，PQQ基因簇(或其部分)源自中間克呂沃爾菌或氧化葡糖桿菌。特別是可以使用氧化葡糖桿菌621H的基因簇，所述基因簇包含在核苷酸序列SEQIDNO.68中。可選的，本發(fā)明的特定實施方案提供了中間克呂沃爾菌的基因簇的用途，所述基因簇包含在核苷酸序列SEQIDNO.69中。可以通過本領域已知的方法，例如，Sambrook和Russell,MolecularCloning：ALaboratoryManual,3'^”Ed.,ColdSpringHarbor,NY2001中描述的方法修飾所述基因簇，從而允許所述簇中編碼的基因在大腸桿菌中表達?？梢允褂萌我獾亩喾N大腸桿菌菌株：例如大腸桿菌K12菌株，如JM109、DH5、DH10、HB101、MG4100等，或大腸桿菌B菌株，如BL21、Rossetta、Origami等。可以通過本領域已知的任何遺傳方法，將基因導入到所述宿主菌株中，例如，通過轉染、轉化、電穿孔、接合轉移等。所述基因簇可以以本領域已知的任何形式維持在所述宿主微生物中，例如，編碼在自主復制型質粒中，或整合到宿主的基因組中。可以通過利用天然啟動子的活性控制所述基因表達，或者通過更適合在所述宿主微生物中表達的啟動子替代啟動子，獲得所述基因簇中編碼的基因的表達。進行這類修飾的方法是本領域普遍已知的。在一個方面，本發(fā)明提供了來自氧化葡糖桿菌621H的基因簇，其包含在核苷酸序列SEQIDNO.68中，由包含在宿主大腸桿菌菌株中的自主復制型質粒攜帶。在該特定的方面，簇上編碼的基因在其相應的天然啟動子的控制下表達。在一個方面，本發(fā)明提供了來自中間克呂沃爾菌的基因簇，其包含在核苷酸序列SEQIDNO.69中，由包含在宿主大腸桿菌菌株中的自主復制型質粒攜帶。在該特定的方面，簇上編碼的基因在其相應的天然啟動子的控制下表達。在同一特定的方面，用于在大腸桿菌中提供PQQ合成的基因是pqqABCDE，而pqqF的功能由大腸桿菌的固有活性提供。根據我們的發(fā)現，在異源表達PQQ依賴性脫氫酶的過程中，PQQ的可用性對其正確的折疊、運輸、前導序列的切割和其他翻譯后修飾作用幾乎沒有影響。這意味著不論何時(即，在任何時間或在任何時間段中)，例如在培養(yǎng)和誘導表達的過程中或之后向脫氫酶提供PQQ，脫氫酶活性都幾乎沒有差異。在允許與細胞的天然電子受體(呼吸鏈)最優(yōu)偶聯的條件下，當在周質空間或細胞膜中建立起增強的、或者甚至最大的PQQ依賴性醛糖脫氫酶活性時，其他參數是更加相關的。參數之一是存在恰當的前導序列，將蛋白質定向至周質空間或細胞膜。另一個這類參數是表達強度，它可以受培養(yǎng)溫度、選定的轉錄啟動子、PQQ依賴性醛糖脫氫酶編碼基因中的密碼子使用、表達誘導劑的量等的控制。另一個這類參數是選定的PQQ依賴性醛糖脫氫酶的內在特性，例如在異源宿主中正確折疊的能力，對異源宿主的毒性、對宿主的降解酶的抗性等。所有這類可用于增強活性和優(yōu)化的參數，以及實施它們的方法，對本領域技術人員都是顯而易見的。本發(fā)明的其他示例性、修改的或備選的實施方案根據上述說明書，執(zhí)行本發(fā)明的其他多種實施方案、修改的和備選方案是顯而易見的。進一步示例，本發(fā)明提供了例如特定的方法，包括步驟：在脫氫酶催化氧化的條件下反應底物(II)以形成相應的內酯(I)，其中，在第一實施方案中，脫氫酶選自GDH01或GDH02或GDH03或GDH04或GDH05，或任何與上述酶具有至少70％，更優(yōu)選90％氨基酸序列同一性的脫氫酶。在另一個實施方案中，脫氫酶選自GDH06或GDH07或GDH08或GDH09或GDH10，或任何與上述酶具有至少70％，更優(yōu)選90％氨基酸序列同一性的脫氫酶。在另一個具體的方面，本發(fā)明涉及構建和提供恰當的合成的生物學途徑的方法，例如以大腸桿菌作為宿主微生物示例，其中同時表達DERA(脫氧核糖5-磷酸醛縮酶)、PQQ依賴性脫氫酶和任選地PQQ生物合成的途徑基因。還建立和提供了宿主生物的呼吸鏈。Gcd醛糖脫氫酶滿足所有的優(yōu)選特征，并因此是使用的最優(yōu)選的酶。Gcd涵蓋了與本文所述Gcd具有至少50％，優(yōu)選70％氨基酸序列同一性的任何醛糖脫氫酶。氨基酸序列同一性是通過序列比較算法分析或目測確定的。在一個方面，用VectorNTI9.0(InforMax)的AlignX算法的默認設置，進行序列比較算法。在其他特定的方面，本發(fā)明涉及使用上述酶氧化或脫氫化合物(II)的方法，所述方法包括提供作為活的全細胞催化劑、休眠的全細胞催化劑、無細胞裂解液、部分純化的或純化酶、固定化酶或任何其他形式的催化劑使用的微生物或微生物來源材料，其中，上述能夠催化氧化或脫氫反應的酶是在所述微生物中天然表達的，即，是微生物的天然特性。在所述方面，當培養(yǎng)和在所述反應中用作催化劑時，這類生物可以將化合物(II)轉變?yōu)橄鄳膬弱?，而不需要對所述微生物進行額外的遺傳修飾。所述微生物可選自下文示例的多種細菌。具有所述特性的生物可選自細菌，更特別的是變形菌門、放線菌目、mixobacteriaceae。更特別的，所述微生物可選自γ變性菌綱。就該意義而言，最優(yōu)選的生物選自腸細菌、根瘤菌、葡糖桿菌和不動桿菌?？紤]到胞外提供的公開內容，如何搜尋具有氧化或脫氫化合物(II)的能力的生物對本領域技術人員是顯而易見的。一種這類方法是向研究微生物的培養(yǎng)物提供一定量的化合物(II)，并尋找活性。在另一特定的實施方案中，式(II)的化合物以及因此式(I)的化合物的定義也可以限制于R5表示選自式(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)和(IX)的部分。在另一個特定的實施方案中，式(II)以及因此式(I)的定義可具體化為以下定義，其中：R1獨立于R2地表示H、X、N3、CN、NO2、OH、(CH2)n-CH3、O-(CH2)n-CH3、S-(CH2)n-CH3、NR3R4、OCO(CH2)nCH3或NR3CO(CH2)nCH3；和R2獨立于R1地表示H或(CH2)m-CH3；或R1和R2都表示X、OH或O((CH2)nCH3)；或R1和R2共同表示＝O、-(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亞芳香基)-(CH2)s-，其中R3和R4彼此獨立地，或共同表示H、(CH2)m-CH3，或共同形成環(huán)–(CH2)p-、-(CH2)r-(1,2-亞芳香基)-(CH2)s-、-(CO)r-(1,2-亞芳香基)-(CO)s-；X表示F、Cl、Br或I；n代表0至10的整數；m代表0至3的整數；p代表2至6的整數；并且r和s中至少一個是1。由本發(fā)明方法獲得的式(I)的化合物可用作制備抑制素的中間物。本領域技術人員已知如何將根據本發(fā)明獲得所述化合物的方法放入抑制素合成的環(huán)境中。原則上，獲得抑制素有2種基本方式。根據第一種方式，從內半縮醛制備內酯，然后與抑制素骨架偶聯?？蛇x的，先制備含有醛側鏈部分的抑制素骨架，所述骨架之后通過使用例如2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA)轉變?yōu)閮劝肟s醛，然后氧化為內酯。作為例子，對于阿托伐他汀的具體情況，可以參考WO2006134482的方案2-4。在具體的實施方案中，使用2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA，EC4.1.2.4)制備式(II)的化合物，所述化合物之后被能夠催化氧化或脫氫的酶轉變?yōu)閮弱?。本領域已知DERA酶的多個野生型、變體或突變形式，包括但不限于J.Am.Chem.Soc.116(1994),第8422-8423頁，WO2005/118794或WO2006/134482。在優(yōu)選的實施方案中，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶用于剛好位于使式(II)的化合物與能夠催化氧化或脫氫的酶接觸的步驟之前的合成步驟。在另一個優(yōu)選的實施方案，使用DERA制備式(II)的化合物至少是部分地與能夠催化氧化或脫氫的酶將所述化合物轉化為式(I)的化合物同時進行的。應立即理解，催化制備式(II)的化合物的反應和將所述化合物氧化成式(I)的反應所必需的酶可以在反應混合物中使用，或者可以同時、相繼、一次性、間隔地或連續(xù)地添加到反應混合物中。具有由DERA制備的式(II)的化合物，以及因此與能夠催化氧化或脫氫的酶反應的起始材料的實施方案是有利的，因為這一安排的相容性更好，并允許在在先步驟中使用含水溶劑，從而不必在提供給能夠催化氧化或脫氫的酶用于轉化為內酯轉化之前純化式(II)的化合物。因此，優(yōu)選的實施方案是在不先分離或純化所述化合物的條件下，使式(II)的化合物與能夠催化氧化或脫氫的酶接觸。在該事件中，在先步驟的全部反應混合物可用于后續(xù)反應，減少了方法步驟的數量，簡化了方法。避免純化步驟也增加了產率。此外，由于酶特異性優(yōu)于化學氧化劑，在大部分程度上僅式(II)的化合物被氧化成內酯，而剩余的存在的化合物不變，因此降低了形成雜質的傾向，改善了后續(xù)的工作或純化規(guī)程。根據本發(fā)明的任何酶反應中的所有底物可以一次性加入到反應中，或者可以在較長時間內連續(xù)添加，或以一批或間隔數批添加。當與制備式(II)的化合物至少部分同時制備式(I)的化合物時，可以實現明顯的改善。與此同時，還克服了單獨使用DERA酶的反應的多個缺陷。例如，用作DERA酶制備式(II)的化合物的起始材料的醛傾向于在反應過程中使DERA酶失活，因而降低酶活性。此外，構成反應混合物中的式(II)的內半縮醛對活的微生物是有毒的。因此，縮短DERA的反應步驟和盡快消耗起始的醛和/或內半縮醛是非常理想的，這可以在兩個酶促反應步驟至少部分同時實施時實現。即，當兩個反應步驟至少部分同時實施時，優(yōu)選完全同時實施時，有毒的內半縮醛立即進入后續(xù)反應并被轉化為無毒的內酯。此外，由于如下文實施例驗證的，第二個反應步驟通常不是限速步驟，并比使用DERA的第一個步驟速度更快，因此，第一步反應的穩(wěn)態(tài)平衡向產物方向移動。這導致完成第一個步驟的時間減少，因此，保護DERA不被失活。還保護活細胞免受高濃度內半縮醛的破壞。本發(fā)明的重要方面涉及微生物通過其呼吸鏈將由(II)的氧化/脫氫產生的電子傳遞給氧(終末電子受體)的固有能力。這驅使全細胞體系中酶催化的化合物(II)的氧化/脫氫的反應。顯而易見的是，作為電子池發(fā)揮作用的能力是如本發(fā)明所述的全細胞體系的重要和有益特性。因此，利用完整的細胞避免使用額外的電子受體，如DCIP和上述其他電子受體。利用全細胞的方法的額外的好處是能夠在一個生物體中提供所述合成的生物學途徑的所有方面，即，DERA酶、PQQ和PQQ依賴性糖脫氫酶。如下示例，由于這類方法的生產力和產率適合產業(yè)，優(yōu)選利用全細胞因為成本可被控制在顯著低于其他方法的水平，例如無酶的方法、固定化酶、無細胞裂解液等。利用單罐裝(onepot)設計，能夠完全或部分地同時實施DERA和氧化/脫氫步驟也導致用于工業(yè)規(guī)模時的成本顯著降低。就利用全細胞體系作為電子池的意義而言，還有利的是在存在氧的條件下實施所述方法，特別是所提供的氧的量允許在給定的方法條件下為至少5％，優(yōu)選至少15％的溶解氧，其中100％的溶解氧理解為在給定的方法條件下飽和的氧溶液，0％理解為在所述給定的方法條件下的無氧液體，并且氧濃度和溶解氧百分比之間的相關性在0％至100％之間是線性的。在這一方面，方法條件理解為液體組成、溫度、pH、壓力，其中在動態(tài)過程中測量理解為是在均質的固/液/氣多相體系中實施的。存在的氧的量使氧化或脫氫反應是不可逆的，這確保了所獲得的內酯，并進一步增強了第一反應的穩(wěn)態(tài)平衡向產物移動。因此，該優(yōu)選的實施方案增加了產率，并降低了方法所需的時間。能夠催化氧化或脫氫的酶，和/或DERA酶，可以分別單獨地或組合地，任選獨立地包含在單個或多個活的全細胞、失活的全細胞、均質化的全細胞或無細胞提取物中；或者分別是純化的、固定化的和/或處于胞外表達的蛋白的形式。優(yōu)選地兩種酶之一，更優(yōu)選地兩種酶包含在同一活的全細胞、同一失活的全細胞或同一均質化的全細胞中，更優(yōu)選地在同一活的全細胞或同一失活的全細胞中，特別是包含在同一活的全細胞中，因為酶在共同的全細胞或至少在共同的失活的全細胞中不需要在其用于方法之前對酶進行更多處理，降低了成本。此外，酶包含在同一活的全細胞中使得能夠通過過濾簡單地去除酶，這減輕了在工業(yè)規(guī)模的最終純化步驟。此外，允許在后續(xù)批次中重復利用包含在活細胞中的酶。利用在全細胞或至少在失活的全細胞中的酶的另一個優(yōu)點是能夠如上文詳述，固有地提供PQQ輔助因子。作為有利的選擇，可以安排能夠翻譯2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA)酶和能夠催化氧化或脫氫的酶的全細胞體系來過表達所述翻譯所需的兩種基因。用于過表達的手段是本領域技術人員已知的，有時可參考本文的其他地方。根據本發(fā)明的另一方面，提供的表達體系包含一種或多種細胞類型，各自的細胞類型經遺傳改造以在所有的細胞類型中表達2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA)酶和能夠催化氧化或脫氫的酶。表達體系可以由恰當的生物體或細胞，任選地其他因子和添加物組成，其中參考本文提供的公開內容。在一個方面，本發(fā)明提供了構建或提供用于本發(fā)明的合成的生物學途徑的方法，以大腸桿菌作為宿主微生物為例，其中同時表達DERA(脫氧核糖5-磷酸醛縮酶)、PQQ依賴性脫氫酶和任選地PQQ生物合成的途徑基因?？紤]到宿主生物的呼吸鏈，所述合成的生物學途徑具有從簡單分子(如下述化合物(X)和乙醛)生產化合物(I)的能力。由于該方法聯合了之前生產化合物(II)、生產化合物(II)和將化合物(II)氧化為化合物(I)的單獨的步驟，因此，該方法是有利的。此外，在一個工業(yè)發(fā)酵方法中實施培養(yǎng)攜帶所述合成的生物學途徑的生物體，所述方法立刻提供了能夠將分子(如化合物(IX)和乙醛)轉變?yōu)槭?I)的化合物的材料。本發(fā)明的另一個實施方案是在單罐裝(onepot)方法中，通過在存在2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA)酶和能夠催化氧化或脫氫的酶的條件下，使用于DERA酶反應的起始材料起反應，獲得式(I)的化合物或其鹽、酯或立體異構體，和任選地將產物成鹽、酯化或立體異構選擇性解析。該實施方案考慮從式(X)的化合物開始：其中，R表示式(I)的R1-CH-R2部分，R1和R2如上文定義；和在存在兩種酶(即，醛縮酶(DERA)酶和能夠催化氧化或脫氫的酶)的條件下，使所述化合物(X)與乙醛反應。該設置允許以單個方法步驟從簡單的起始材料(如乙醛)獲得式(I)的化合物。因為反應在若干小時內完成，因此適合工業(yè)。導致不需要中間物純化步驟。此外，提供了一起加入兩種酶的可能性——第一酶促反應的產物形成第二酶促反應的底物——優(yōu)選包含在同一活的全細胞、失活的全細胞、均質化的全細胞或無細胞提取物中；或者是純化的、固定化的和/或處于胞外表達的蛋白的形式，優(yōu)選包含在同一活的全細胞、失活的全細胞或均質化的全細胞中，更優(yōu)選包含在同一活的全細胞或失活的全細胞中，特別是包含在同一活的全細胞中。這利用了組合酶促反應的所有有利效應，包括但不限于本文所述的那些。在一個方面，向混合物中加入底物總量，使所加入的底物(X)總量是從每升反應混合物約20mmol至每升反應混合物約2mol，特別是從每升反應混合物約100mmol至每升反應混合物約1.5mmol，更特別是從每升反應混合物約200mmol至每升反應混合物約700mmol。可以通過若干種手段添加乙醛。在一個方面，在一批或多批中，或可選地連續(xù)向反應混合物中加入乙醛。可以預先混合乙醛和式(X)的底物，并加入到反應混合物中。加入到反應混合物中的乙醛總量是從受體底物總量的約0.1至約4摩爾當量，特別是從約2至約2.5摩爾當量。在本發(fā)明的一個方面，反應使用的pH值是從約4至約11。在一個實施方案中，反應使用的pH值是從約5至約10。在另一個實施方案中，反應使用的pH值是從約5至約8。具體而言，可以通過合適的緩沖液將pH值維持在5.2至7.5的范圍內。可選地上述pH值可以根據對本領域技術人員顯而易見的需要，由可控地加入酸或堿來控制，但不限于此。在一個方面，可以優(yōu)化本發(fā)明所述反應使用的pH，使在最佳酶活性和最佳底物和/或產物穩(wěn)定性之間達成妥協。在本文中應理解，本發(fā)明所述的不同酶的最佳酶促活性可以不與底物/產物穩(wěn)定性的最佳條件相同。本領域技術人員可發(fā)現，通過調節(jié)條件犧牲一部分酶活性來適合底物和/或產物穩(wěn)定性(反之亦然)，從而獲得最佳產物產率是有利的。具體而言，醛縮酶酶，任選地與能夠催化氧化或脫氫的酶是至少部分共同地在含水溶液中制備的(特別是每者濃度為0.1g/L至3g/L)，任選存在鹽(特別是濃度為從50至500mM的NaCl)，任選添加PQQ(特別是濃度250nM至5uM)和CaCl2、MgCl2或備選的鈣鹽或鎂鹽，特別是濃度從0.1至20mM。含水溶液可含有與水混溶的有機溶劑(特別是濃度為從2-15％V/V的二甲亞砜)，并可緩沖至pH4-11。一些常用的緩沖液通過限制醛縮酶-縮合中間物，特別是第一縮合反應產物的可用性，可以降低從乙醛開始的上述反應的產率，因為所述反應產物在緩沖液中進行化學反應。例如，Bis-Tris丙烷與所述中間物((S)-3-羥基-4,4-二甲氧基丁醛)反應，產生(S,Z)-2-(3-((1,3-二羥基-2-羥基甲基)丙烷-2-基)(3-羥基-4,4-二甲氧丁-1-烯基)氨基)丙胺基)-2-(羥基甲基)丙烷-1,3-二醇。其他可以相似反應的緩沖液是Bis-Tris、tricin、Tris、Bicin或具有伯胺、仲銨或叔氨基的任何其他緩沖液。因此，當如果調節(jié)pH，用于調節(jié)pH的合適緩沖液是用酸、堿、鹽或其混合物制成的緩沖液，特別是磷酸和氫氧化鈉。在特別優(yōu)選的實施方案中，緩沖液是磷酸緩沖液。特別是可以使用濃度10至500mM的磷酸緩沖液。還可以通過將醛縮酶，任選地與能夠催化氧化或脫氫的酶至少部分地共同加入到水中，制備含水溶液，并通過自動添加無機酸、堿、鹽或其混合物，維持反應過程中的pH值。在本發(fā)明的一個方面，用于始自乙醛的反應的溫度是從約10至約70℃。在一個實施方案中，用于反應的溫度是從約20至約50℃。在另一個實施方案中，用于反應的溫度是從約25至約40℃。在一個方面，可以優(yōu)化用于本發(fā)明所述反應的溫度，使在最佳酶活性和最佳底物和/或產物穩(wěn)定性之間達成妥協。在本文中應理解，本發(fā)明所述的不同酶的最佳酶促活性可以不與底物/產物穩(wěn)定性的最佳條件相同。本領域技術人員可發(fā)現，通過調節(jié)條件犧牲一部分酶活性來適合底物和/或產物穩(wěn)定性(反之亦然)，從而獲得最佳產物產率是有利的。在完成反應后，可以從反應混合物中去除兩者之中任一種酶，例如通過向1體積的反應混合物中添加至少約1體積的乙腈。可選的，可以通過本領域已知的任何鹽析方法去除酶。在一個實施方案中，通過添加至少5％m/V硫酸銨來實施鹽析。在酶包含在活細胞或失活細胞中的實施方案中，可以通過過濾或離心反應混合物去除酶。在另一個實施方案中，通過液/液萃取至多種不與水混溶或難以混溶的溶劑之一，去除產物。溶劑可以選自但不限于：二氯甲烷、乙酸乙酯、二乙醚、丙酸乙酯、甲基叔丁基醚(MTBE)、硝基甲烷、戊烷、己烷、庚烷、1,2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳、正丁醇、正戊醇、苯、甲苯、鄰-、間-、對-二甲苯、環(huán)己烷、石油醚、三乙胺。在用選定的溶劑液/液萃取前，可以將產物水溶液的pH調節(jié)至1至12之間，優(yōu)選2至8之間，更優(yōu)選3至5之間的值。在完成萃取后，可以通過但不限于添加鹽來干燥有機相中的殘留水，所述鹽列舉如下：硫酸鈉、硫酸鎂(單水合)、硫酸鈣、氯化鈣、硫酸銅。一般而言，可以通過本領域已知的任何方式制備所使用的醛縮酶和/或能夠催化氧化或脫氫的酶，例如，通過Sambrook等人，(1989)Molecularcloning：AlaboratoryManual第2版,NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor中描述的蛋白質表達方法?？梢詫⒕幋a醛縮酶和/或能夠催化氧化或脫氫的酶的基因克隆到表達載體中，并在合適的表達宿主中表達所述酶。已知的醛縮酶或能夠催化氧化或脫氫的酶的修經飾的形式可以是必需的，或根據克隆條件獲得，并也涵蓋在本發(fā)明中。細胞和生物本發(fā)明的一個方面提供了使用本文所述的處于任何形式的、表達能夠催化氧化或脫氫反應的酶的微生物，將化合物(II)或本文所述其他化合物氧化或脫氫的方法。在所述方面，當這類微生物被培養(yǎng)和用作催化劑時，可以將化合物(II)轉變?yōu)橄鄳膬弱?，而不需要對所述微生物作出額外的遺傳修飾。本發(fā)明中示例了鑒別這類生物的方法。這類生物的非限制性例子可選自多種細菌，更特別的是埃希氏菌屬、棒桿菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬、紅球菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、不動桿菌屬、根瘤菌屬、甲基桿菌屬、克呂沃爾氏菌屬、歐文氏菌屬、拉恩氏菌屬和異常球菌屬。在所述實施方案中，并且為了以最好的方式實踐本發(fā)明的實施方案，提供了特別調整過的表達體系，所述表達體系能夠翻譯2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA)酶和能夠催化氧化或脫氫的酶，并過表達所述翻譯必需的兩種基因。術語“過表達”在本文中指處于強啟動子控制下的表達，或其中基因以高水平表達(相比野生型表達對照)并在胞內或胞外積累。獲得這類修飾的表達的方法是本領域技術人員已知的。例如，可以使用Sambrook等人，(1989)Molecularcloning：AlaboratoryManual第2版,NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor描述的克隆方法。例如，可以將酶的基因克隆到相同或不同的載體上，并轉化到細胞中。備選地，表達體系包含單獨的細胞，其中第一細胞過表達醛縮酶基因，第二細胞過表達能夠催化氧化或脫氫的酶的基因。本說明書示例而非限制性地面對一般常識，提供了制備這類表達體系的例子。所述表達體系特別適合制備抑制素或其中間物。本領域技術人員可以理解用于制備或容納DERA酶或能夠催化氧化或脫氫的酶的所有可能的細胞體系，單獨或組合的，和任選地彼此依賴的。一般而言，細胞體系可以是原核或真核的。在具體實施方案中，可以合成制備酶。用于制備或容納兩者之中任一種酶的細胞可以是細菌、酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。優(yōu)選的細胞是細菌或酵母，更優(yōu)選的是細菌，因為細菌或酵母細胞更易于培養(yǎng)和生長。細菌可選自埃希氏菌、棒桿菌、假單胞菌、鏈霉菌、紅球菌、芽孢桿菌和乳桿菌，優(yōu)選選自埃希氏菌和乳桿菌，更優(yōu)選埃希氏菌，特別是大腸桿菌。在酵母的情況下，細胞可選自酵母屬、畢赤酵母屬、裂殖酵母屬和假絲酵母屬，優(yōu)選酵母屬。哺乳動物細胞的例子是中華田鼠卵巢細胞或肝細胞，優(yōu)選中華田鼠卵巢細胞。本發(fā)明的另一個實施方案是用于制備化合物(I)的方法，特別是工業(yè)發(fā)酵方法，其中所述方法包括培養(yǎng)能夠氧化化合物(II)的微生物的步驟，其中使所述微生物與化合物(II)接觸。本發(fā)明的另一個實施方案是用于制備化合物(I)的方法，特別是工業(yè)發(fā)酵方法，其中所述方法包括培養(yǎng)能夠氧化化合物(II)的微生物的步驟，其中使所述微生物與具有酶促生產(II)的能力的另一種微生物接觸，特別是通過DERA的催化，并且其中向反應混合物提供允許生產化合物(II)的底物。本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案是用于制備化合物(I)的方法，特別是工業(yè)發(fā)酵方法，其中所述方法包括培養(yǎng)能夠生產以及氧化/脫氫化合物(II)的微生物的步驟，并且其中向反應混合物提供允許生產化合物(II)的底物。在特定的實施方案中，根據本發(fā)明的方法包括下列步驟：步驟a1)如果尚未了解或提供，如本文他處公開的，該步驟包括鑒別能夠將化合物(II)氧化/脫氫的微生物，和/或產生經遺傳修飾而獲得如本發(fā)明所述將化合物(II)氧化/脫氫的能力的微生物菌株。特別優(yōu)選的是具有糖1-脫氫酶活性的生物體。步驟a2)如果尚未了解或提供，如本文他處公開的，該步驟包括鑒別能夠生產化合物(II)的微生物，和/或產生經遺傳修飾而獲得如本發(fā)明所述生產化合物(II)的能力的微生物菌株。特別優(yōu)選的是具有醛縮酶催化能力的生物體。特別優(yōu)選的是鑒別和/或遺傳修飾微生物，從而獲得步驟a1)和步驟a2)所述的兩種性質。就這一意義而言，本發(fā)明具體涉及遺傳修飾的微生物菌株，其中菌株的遺傳材料包括至少1個過表達的基因，所述基因編碼能夠催化縮合醛醇形成化合物(II)的酶，更具體的是編碼DERA酶的基因。本發(fā)明中詳細示例了步驟a1)和步驟a2)所述的鑒別和/或遺傳修飾微生物的方法，然而，本領域技術人員可立即找到替代的方法，獲得所述微生物相同的理想特性。例如，可以使用Sambrook等人，(1989)Molecularcloning：AlaboratoryManual2ndEdition,NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor所述的克隆方法。例如，可以將酶的基因克隆到相同或不同的載體中，并轉化到細胞中。在備選方案中，表達體系包括不同的細胞，其中第一細胞過表達醛縮酶的基因，第二細胞過表達能夠催化氧化或脫氫的酶的基因。本說明書示例而非限制的考慮了公知常識，提供了制備這類修飾的微生物的例子。微生物特別適合制備抑制素或其中間物。本領域技術人員了解所有的可能的細胞體系，所述細胞體系用于制備或容納DERA酶或能夠催化氧化或脫氫的酶，或任選的，PQQ生物合成基因，以單獨的或組合的，以及任選的以彼此依賴的方式。一般而言，細胞體系可以是原核的或真核的。在特定的實施方案中，可以合成制備酶。用于制備或容納任一酶的細胞可以是細菌、酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。優(yōu)選的細胞是細菌或酵母，更優(yōu)選的是細菌，因為細菌或酵母細胞更易于培養(yǎng)和生長。細菌可選埃希氏菌屬(Escherichia)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、紅球菌屬(Rhodococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enteorobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、根瘤菌屬(Rhizobioum)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、克呂沃爾氏菌屬(Kluyvera)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、拉恩氏菌屬(Rahnella)和異常球菌屬(Deinococcus)。就更特定的含義而言，微生物可選自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)、扭脫甲基桿菌(Methylobacteriumextorquens)、中間克呂沃爾菌(Kluyveraintermedia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylovora)、水生拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis)、耐放射異常球菌(Deinococcusradiodurans)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)，最優(yōu)選大腸桿菌、氧化葡糖桿菌、乙酸鈣不動桿菌和中間克呂沃爾菌。在酵母的情況下，細胞可選自酵母屬、畢赤酵母屬、裂殖酵母屬和假絲酵母屬，優(yōu)選酵母屬和畢赤酵母屬。特別優(yōu)選的是鑒別和/或遺傳修飾微生物，從而獲得步驟a1)和步驟a2)中所述的兩種特性。就該含義而言，本發(fā)明具體涉及遺傳修飾的微生物菌株，其中菌株的遺傳材料包括至少1個過表達的基因，所述基因編碼能夠催化縮合醛醇形成化合物(II)的酶，更具體的是編碼DERA醛縮酶的基因。相應的，本發(fā)明提供了構建合成的生物學通路的示例性方法，以大腸桿菌作為宿主微生物為例，其中同時表達DERA(脫氧核糖5-磷酸醛縮酶)、PQQ依賴性脫氫酶和任選的PQQ生物合成的通路基因?？紤]到宿主生物的呼吸鏈，所述合成的生物學通路具有從簡單分子(例如化合物(X)和乙醛)生產化合物(I)的能力。本發(fā)明描述的一個方面是同時或獨立的培養(yǎng)步驟a1和a2中描述的微生物。步驟b)制備種子培養(yǎng)基可以通過本領域技術人員已知的方法培養(yǎng)本發(fā)明所述的微生物。各種微生物的培養(yǎng)方法描述在例如手冊“Difco&BBLManual,ManualofMicrobiologicalCultureMedia”(ZimbroM.J.等人，2009，第2版，ISBN0-9727207-1-5)中。優(yōu)選的，從所述微生物的菌落開始，生產可用于生產(I)的主要發(fā)酵方法的種子微生物。在這一方面，根據本申請的方法包括制備所述微生物的冷凍儲液?？墒褂矛F有技術已知的方法制備該冷凍儲液，例如使用液體擴增培養(yǎng)基。優(yōu)選的，該微生物的冷凍儲液通過接種營養(yǎng)培養(yǎng)基，用于生產營養(yǎng)性種子培養(yǎng)基。可以將種子培養(yǎng)基無菌的轉移至生物反應器。原則上，可以在如主發(fā)酵方法(步驟c所述)的條件(例如，pH和溫度)下進行種子微生物的培養(yǎng)。步驟c)主發(fā)酵方法優(yōu)選的在生物反應器中進行利用本申請所述微生物的主發(fā)酵方法，特別是在攪拌和/或充氣的條件下。優(yōu)選的，在浸泡式好氧條件下，在含水營養(yǎng)培養(yǎng)基(生產培養(yǎng)基)中，進行用于生產本申請所述化合物(I)的方法中的微生物的培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有可同化的碳源、氮源、磷酸源和礦物質源?？梢栽谂囵B(yǎng)方法的過程中或之后，向生產培養(yǎng)基中添加其他化合物，從而獲得恰當的酶活性?？梢园ū磉_誘導劑、輔助因子源和/或允許保持遺傳元件的化合物(例如抗生素)。優(yōu)選的，主發(fā)酵方法包括用步驟b)中獲得的種子微生物接種生產培養(yǎng)基，特別是通過無菌的轉移到反應器中。優(yōu)選使用微生物的營養(yǎng)形態(tài)進行接種。在主發(fā)酵方法中，向反應器中添加營養(yǎng)培養(yǎng)基(生產培養(yǎng)基)可以進行一次，或多次分批，或連續(xù)進行?？梢栽诎l(fā)酵方法之前和/或過程中添加營養(yǎng)培養(yǎng)基(生產培養(yǎng)基)。營養(yǎng)培養(yǎng)基中的優(yōu)選碳源可選自糊精、葡萄糖、可溶性淀粉、甘油、乳酸、麥芽糖、果糖、磨拉石和蔗糖，如下文示例。營養(yǎng)培養(yǎng)基中的優(yōu)選氮源是氨溶液、酵母提取物、大豆蛋白胨、大豆粉(soybeanmeal)、細菌蛋白胨、酪蛋白水解物、L-賴氨酸、硫酸銨、玉米漿等。還可以向培養(yǎng)基中添加無機/礦物鹽，例如碳酸鈣、氯化鈉、磷酸鈉或磷酸鉀、鎂、錳、鋅、鐵和其他鹽。特別是可以在主發(fā)酵方法中添加其他已知的用于發(fā)酵方法的添加劑。為了阻止培養(yǎng)基過度發(fā)泡，可以加入止泡劑，例如硅油(siliconeoil)、脂肪油、植物油等。特別是可以在發(fā)酵方法過程中加入基于硅酮(silicone)的止泡劑，阻止培養(yǎng)基過度發(fā)泡。可以向培養(yǎng)基中加入表達誘導劑，例如異丙基β-D-1-半乳糖硫吡喃糖苷(IPTG)、阿拉伯糖、四環(huán)素、indoleacrilate等。此外，可以加入輔助因子，例如PQQ(吡咯并喹啉醌)、NAD(P)、FAD，改善所涉及的酶的活性。在特定的方面，可以使用IPTG和PQQ?？梢栽诤醚鯒l件下實施發(fā)酵方法，伴隨生產培養(yǎng)基的攪拌和充氣?？梢砸远喾N方式實現培養(yǎng)混合物的攪拌和充氣?？梢酝ㄟ^螺旋槳或相似的機械裝置提供生產培養(yǎng)基的攪拌，并根據發(fā)酵條件和規(guī)模作出不同程度的改變。相對于生物反應器的工作體積，充氣速率可以在0.5至2.5VVM的范圍內變化(每分鐘每單位液體體積的氣流體積(體積/體積/分鐘))。在約6.3-8.5的pH范圍和18-37℃的溫度范圍內，進行本方法的主發(fā)酵方法。優(yōu)選的，pH在約6.5-8.3的pH范圍，溫度在約21-31℃的范圍內。優(yōu)選的，孵育培養(yǎng)物16至約300小時，更優(yōu)選約30至70小時。對本領域技術人員顯而易見的是：不同的微生物可能需要不同的生長條件，且本領域普遍描述了如何確定特定生物生長的最佳條件。對本領域技術人員還顯而易見的是：不同的生長條件對參與所提供方法的酶活性具有巨大的影響。本發(fā)明提供了可用于優(yōu)化生長條件，獲得所述酶的最大活性和反應速率的方法的詳細例子。本發(fā)明的另一個實施方案涵蓋了同時或獨立的培養(yǎng)步驟a)所述的微生物。同時，還可以進行反應，分別或同時、相繼或以單罐裝的方式制備化合物(II)和化合物(I)。具體而言，在步驟c)之后，在含水溶液中制備脫氫酶/氧化酶(特別是在0.1g/L至300g/L的濃度范圍)，任選的在存在鹽的條件下(特別是濃度范圍50-500mM的NaCl)，稀釋或濃縮至所述濃度范圍。當補充新鮮的培養(yǎng)基或允許生物體的活力培養(yǎng)基組分時，獲得活的全細胞催化劑。當在含水的緩沖溶液或在使用的培養(yǎng)基中制備時，獲得休眠的全細胞催化劑。含水溶液可以緩沖至pH4.0-11，優(yōu)選pH5.0-10.0，更優(yōu)選5.0-pH8.0。最優(yōu)選的，溶液緩沖至約pH5.2-約pH7.5?？梢詮乃?、堿、鹽或其混合物、本領域已知的任何其他緩沖體系(除了具有伯氨基、仲氨基或叔氨基的以外)制備合適的緩沖液。特別是可以使用濃度10至500mM的磷酸鹽緩沖液。可以通過向水中加入所述脫氫酶/氧化酶，制備含水溶液，并通過自動添加無機或有機酸、堿、鹽或其混合物的手段，維持反應過程中的pH。步驟d)酶促反應提供實施本發(fā)明的一些選項?？梢苑謩e或同時、相繼或以單罐裝的方式進行制備化合物(II)和化合物(I)的反應。在一個實施方案中，改變是：1.將化合物(II)加入到具有氧化/脫氫化合物(II)的能力的微生物培養(yǎng)物中在主發(fā)酵步驟中完成前述培養(yǎng)能夠氧化/脫氫化合物(II)的微生物的步驟后，使化合物(II)與所述微生物接觸。所述微生物可內在的含有所有需要的輔助因子，或者可以使用外部添加PQQ?？梢蕴砑訚舛燃s0.1nM至約5mM的PQQ。特別是可以提供約1nM至約100uM的PQQ。更優(yōu)選的是提供濃度100nM至約10μM的PQQ。最優(yōu)選的是提供允許所述催化劑的最大活性的最少量的PQQ。實踐中，是在250nM至5μM終濃度范圍內的PQQ。為了促進用外部提供的PQQ重構能夠氧化/脫氫的酶，可以加入鎂或鈣離子。優(yōu)選的加入濃度約0.1mM至約50mM，特別是約1mM至約20mM，最優(yōu)選濃度約2mM至約20mM的MgCl2或CaCl2。任選的，加入與本發(fā)明所述化合物II等摩爾濃度的人工電子受體。優(yōu)選的使用能夠接受脫氫/氧化反應的過程中形成的電子進入其內在呼吸鏈中的微生物實施所述方法?；衔?II)可以作為從之前的反應混合物或其他來源(有機合成)中獲得的部分或完全分離的化合物(II)提供，所述反應混合物含有在醛縮酶-催化的醛醇縮合條件下的DERA醛縮酶?？梢酝ㄟ^本發(fā)明所述的任何手段和速率添加化合物(II)，終濃度為約20mM至約1M，優(yōu)選約50mM至約700mM，最優(yōu)選的濃度是在100mM至500mM之間。在化合物(II)脫氫/氧化的過程中，可以以與步驟c)所述相似的方式，添加其他營養(yǎng)物，從而支持微生物的活力。實踐中，向本發(fā)明所述的反應化合物中提供額外的碳源是有利的，任選還獨立或額外的添加氮源。在這一特殊方面，允許化合物(II)脫氫/氧化的一般反應條件如本發(fā)明的“醛糖脫氫/氧化條件”中定義?？梢栽谝慌蚨嗯?，向反應混合物添加作為氧化酶/脫氫酶底物的化合物(II)以獲得化合物(II)。在一個方面，添加到混合物中的底物總量使添加的化合物(II)的總量為約每升反應混合物20mmol至約每升反應混合物1.5mol，更特別的是每升反應混合物約100mmol至每升反應混合物約700mmol。在優(yōu)選的實施方案中，通過可編程的泵，在任何給定的反應時間，以特定流速向反應混合物中連續(xù)添加底物。流速最好確定為反應混合物中不積累底物時的最大流速。特別地，這允許最低濃度的不想要產物。在另一個實施方案中，可以使用校正添加對策，進一步最小化底物的抑制效應。2.使用DERA醛縮酶和氧化/脫氫酶酶連續(xù)反應在這一方面，本發(fā)明提供了d1)所述的變化形式，然而，在此情況下，化合物(II)是以反應混合物的形式直接原位提供的，所述反應混合物是通過本領域已知的方法反應DERA醛縮酶和化合物(X)和乙醛獲得的。優(yōu)選的，該方法使用了實施單罐裝反應的優(yōu)勢，因此顯著影響了組合方法的簡便性。有利的是在根據“醛縮酶-催化的醛醇縮合條件”的在先步驟中，使用含有DERA醛縮酶的全細胞催化劑。3.使用在兩個分開的催化劑中的DERA醛縮酶和氧化/脫氫酶酶的同時反應兩種催化劑都是通過發(fā)酵方法同時或獨立獲得的(如步驟c所述)，然后，將催化劑轉移到合適的容器或反應器中，優(yōu)選合并于或留在用于獲得催化劑的同一發(fā)酵罐中。在本方法的另一個相似的方面，兩種酶活性都存在于優(yōu)選如步驟c所述獲得的單個微生物中。在特定的實施方案中，同時方法含有使用DERA醛縮酶和能夠氧化/脫氫的酶，因此提供化合物(I)。更優(yōu)選的，乙酰氧基乙醛(CH3CO2CH2CHO)作為DERA醛縮酶的底物以獲得化合物(II)，可以被連續(xù)的添加到反應混合物中，或可選的，乙酰氧基乙醛(CH3CO2CH2CHO)可以在一個或多個批次中添加到反應混合物中。在一個方面，混合物中添加的底物總量使得添加的乙酰氧基乙醛(CH3CO2CH2CHO)的總量是每升反應混合物約20mmol至每升反應混合物約1.5mol，更特別的是每升反應混合物約100mmol至每升反應混合物約700mmol?？梢酝ㄟ^若干種手段添加乙醛。在一個方面，在一個或多個批次中向反應混合物中添加乙醛，或可選的連續(xù)添加。乙醛可以與乙酰氧基乙醛(CH3CO2CH2CHO)預先混合，并添加到反應混合物中。相對于受體底物乙酰氧基乙醛(CH3CO2CH2CHO)的總量，添加到反應混合物中的乙醛總量是約0.1至約4摩爾當量，特別是約1至約3摩爾當量，更優(yōu)選約2-2.5摩爾當量。特別的是，這允許最低濃度的不想要產物。任選的，向反應混合物中添加的PQQ濃度是約0.05μM至約10mM，更優(yōu)選的0.1uM至約100uM。為了促進外部提供的PQQ重構能夠氧化/脫氫的酶，可以添加鎂或鈣離子。優(yōu)選的，MgCl2或CaCl2添加的濃度是約0.1mM至約50mM，特別是約1mM至約20mM，最優(yōu)選的濃度是約2mM至約20mM。在優(yōu)選的實施方案中，通過可編程的泵，在任何給定的反應時間，以特定流速向反應混合物中連續(xù)添加底物。流速確定為反應混合物中不積累底物時的最大流速。特別地，這允許最低濃度的不想要產物。在另一個實施方案中，可以使用校正添加對策，進一步最小化底物的抑制效應。在一個方面，用于脫氫酶/氧化酶-催化的反應的溫度是從約10℃至約70℃。在一個實施方案中，用于脫氫酶/氧化酶反應的溫度是從約20至約50℃。在一個實施方案中，用于脫氫酶/氧化酶反應的溫度是從約25℃至約40℃。由于反應在少數小時內完成，因此是適合工業(yè)的。術語“醛糖脫氫/氧化條件”在本文中使用時指本領域已知的任何脫氫/氧化條件，可以被任何脫氫酶/氧化酶催化，如本文所述。特別是脫氫酶/氧化酶活性條件是允許形成和積累所需產物的條件。這些條件一方面包括脫氫酶/氧化酶是以足夠的負載提供而能夠實施脫氫/氧化作用的活性酶。在另一個方面，作為底物的化合物(II)在反應混合物中存在的量對醛縮酶的活性表現出最低的抑制。優(yōu)選的，反應的溫度、pH、溶劑組成、攪拌和反應長度允許積累理想的產物，因此從化合物(II)形成相應的化合物(I)，在另一個方面，所述條件對穩(wěn)定性沒有不利影響，具體而言，這些條件是由實施例中公開的值定義的。用于本發(fā)明的脫氫酶/氧化酶可以是任何對式(II)的化合物具有脫氫酶/氧化酶活性的酶。在優(yōu)選的實施方案中，脫氫酶/氧化酶包括但不限于：GDH01、GDH02、GDH03、GDH04、GDH05、GDH06、GDH07、GDH08、GDH09、GDH10、GDH11、GDH12、GDH13、GDH14、GDH15、GDH16、GDH17、GDH18、GDH19、GDH20、GDH21、GDH22、GDH23、GDH24和GDH25，其中每種酶都是通過其相應的核苷酸序列或各自的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列或氨基酸序列表征的，如上文序列表所述。本文所述的脫氫酶/氧化酶催化劑可以本發(fā)明提供的任何生物學活性形式使用。一般而言，在合適的容器或反應器中提供能夠獲得化合物(I)的催化劑，分批或連續(xù)的添加化合物(II)，或通過至少部分地同時生產化合物(II)來提供化合物(II)，優(yōu)選的在“醛縮酶-催化的醛醇縮合條件”下的同一容器中。術語“醛縮酶-催化的醛醇縮合條件”在本文使用時指本領域已知的可以被任何醛縮酶催化的、任何醛醇縮合條件，描述在例如WO2008/119810A2中。醛縮酶-催化的丁間醛醇縮合條件特別是允許形成和積累所需產物，更優(yōu)選形成和積累取代的乙醛R1CO2CH2CHO的條件，更特別的是反應混合物中存在作為底物的乙酰氧基乙醛(CH3CO2CH2CHO)與乙醛，存在的量對醛縮酶的活性表現出最低的抑制，在另一個方面，反應的溫度、pH、溶劑組成、攪拌和反應長度允許積累理想的產物，因此形成相應的內半縮醛(化合物II)。本文所述的DERA醛縮酶可以所述發(fā)明提供的任何生物學活性形式使用。根據相應的化合物(II)選擇DERA醛縮酶的底物，式(X)的化合物。這些具有被遮蔽的醛基的產物在WO2008/119810A2和WO2009/092702A2中是關鍵中間物，允許制備抑制素的進一步步驟，特別優(yōu)選的是產生具有醛基的產物的底物。化合物(X)特別可以是乙酰氧基乙醛(CH3CO2CH2CHO)。任選的步驟e)：分離和/或純化化合物(I)可在另一獨立步驟中，從所述培養(yǎng)基中分離和/或純化在主發(fā)酵步驟中生產的化合物(I)。在第一個分離步驟中，可以通過任何已知類型的過濾/絮凝/沉降/離心方法去除反應混合物中存在的全細胞催化劑，或對含有反應混合物的全細胞實施其他分離步驟。優(yōu)選的，本發(fā)明的目標是省略分離固體顆粒與反應混合物的步驟，和在完成反應后立刻實施直接的抽提步驟，如進一步所述。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以通過在能夠結合化合物(I)的吸附劑上吸附顯著的水平，并在洗脫條件下釋放化合物(I)，來分離化合物(I)，所述洗脫條件例如用更加非極性的化合物替代培養(yǎng)基。吸附劑可以選自但不限于：硅膠、沸石、活性炭、AmberliteTMXADTM吸附樹脂、AmberliteTM和AmberliteTMFP離子交換樹脂等?？蛇x的，可以使用與水混溶的溶劑(例如乙腈或甲醇)，并向混合物補充高濃度的鹽，進行液-液抽提，任選的在被稱為“鹽析”抽提方法中補充高濃度的氯化鈉。在該方法中，觀察到相分離，化合物(I)優(yōu)選分布在富含溶劑的相中。在優(yōu)選的實施方案中，用于液/液抽提的抽提溶劑選自任何一些不與水混溶的或較難混溶的溶劑。溶劑可以選自但不限于：二氯甲烷、乙醚、丙酸乙酯、甲基叔丁基醚(MTBE)、硝基甲烷、戊烷、己烷、庚烷、1,2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳、正丁醇、正戊醇、苯、甲苯、鄰-、間-、對二甲苯、環(huán)己烷、石油醚、三乙胺。在用選定的有機溶劑液/液抽提前，產物水溶液的pH可以調節(jié)至1至9之間，優(yōu)選2至8之間，更優(yōu)選2至5之間的值。此外，在優(yōu)選的實施方案中，在添加任何無機/有機酸、鹽或堿進行液/液抽提前，水相的離子強度增加。這類酸、鹽或堿的非限制性例子是：磷酸及其鹽、硫酸及其鹽、檸檬酸及其鹽、鹽酸及其鹽等。增加的水相離子強度增加了化合物(II)在水相和有機相之間的分布系數，因此增加了抽提方法的效果。在完成抽提后，干燥有機相中的剩余水可以通過但不限于添加下列鹽來實施：硫酸鈉、硫酸鎂(單水合)、硫酸鈣、氯化鈣、硫酸銅。在純化方法的最優(yōu)選的實施方案中，首先校正反應混合物的pH至約1至9，優(yōu)選約2至8，更優(yōu)選約3至6的值。最優(yōu)選的，使用酸性化合物校正pH至約5，例如磷酸、硫酸或鹽酸等。添加的硫酸鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉等的濃度是從50g/L至300g/L，最優(yōu)選從100至200g/L。至少添加1次乙酸乙酯，是向1體積的反應混合物添加至少1體積的乙酸乙酯，優(yōu)選的至少3次向1體積的反應混合物添加至少1體積的乙酸乙酯。最優(yōu)選的，進行添加乙酸乙酯和分離提取物的步驟，直到水相中存在不超過5％化合物(I)。收集乙酸乙酯級分，用本領域已知的任何干燥鹽(優(yōu)選CaCl2或MgSO4)或本領域已知的其他脫水方法干燥。在一個方面，可以蒸發(fā)得到的乙酸乙酯提取物，產生分離的化合物(I)，形式為室溫下黃色-琥珀色的油狀物，或可選的可以進入其他步驟，從而產生藥物有效的化合物，優(yōu)選抑制素。任選的步驟f)：進一步加工在獲得式(I)的化合物后，通過使所述化合物(I)經歷足以制備API，優(yōu)選抑制素的條件，可以將式(I)的化合物進一步轉化為API，優(yōu)選的抑制素或其可藥用的鹽。因此，在實施方案中，通過(i)使上文定義的式(II)的化合物與能夠催化氧化或脫氫的酶接觸，制備上文定義的式(I)的化合物；(ii)使所述化合物(I)經歷足以制備抑制素的條件；和(III)任選的將產物成鹽、酯化或立體異構選擇性的解析，來制備抑制素或其鹽、酯或立體異構體。此外，可以使用2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA，EC4.1.2.4)酶，制備式(II)的化合物?？梢园才欧磻O置，基本上同時或相繼、一次性或連續(xù)的在一批或間隔的批次中，導入兩種酶。優(yōu)選的，至少部分同時的，更優(yōu)選基本同時的制備式(II)和(I)的化合物。有利的是在酶的情況下，使用酶制備式(I)和/或(II)的化合物，因為產物立刻含有正確的取代基空間構象，不需要其他純化或分立。在需要其他立體異構體的情形下，方法可以與本領域技術人員已知的立體特異性化學方法組合。在優(yōu)選的實施方案中，制備的抑制素是洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、羅蘇伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀或達伐他汀，更優(yōu)選阿托伐他汀、羅蘇伐他汀或匹伐他汀，特別是羅蘇伐他汀。術語“足以生產API，優(yōu)選抑制素的條件”在本文使用時指本領域描述過的手段，包括本文描述過的用于將式(I)的化合物進一步轉化為API，優(yōu)選抑制素的手段。在具體的實施方案中，在制備抑制素時，本領域技術人員可以通過選擇正確的R1和R2，或R，來選擇化學途徑。在選擇R1、R2和R代表抑制素骨架的情形下，式(I)的化合物已經是抑制素分子或其“高級”中間物。但是，還可以修飾抑制素，例如，通過打開內酯環(huán)，形成鹽或酯或從立體異構體的混合物解析理想的立體異構體。在可選的方案中，如果通過首先提供內酯然后與抑制素骨架偶聯來制備抑制素，可以遵循反應方案2。在獲得式(I)的化合物后，可以用保護基P(式(XI))保護第4位的羥基，所述保護基可以是任何常規(guī)使用的保護基，特別是甲硅烷基保護基。之后，使化合物成為醛或其水合物的形式(分別是式(XII)和(XIII))?？梢赃M一步使用從I獲得的式(XII)的化合物或其水合物(XIII)制備抑制素，通過在Wittig偶聯條件下，使式(XII)的化合物或其水合物(XIII)與雜環(huán)或脂環(huán)衍生物(抑制素骨架)反應，需要時再進行氫化。在涉及制備羅蘇伐他汀的具體實施方案中，在后續(xù)反應步驟中，可以在Wittig偶聯條件下(存在堿)，使(2S,4R)-4-(對氧基)-6-氧代-四氫-2H-吡喃-2-甲醛(XII)與((4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-(N-甲基甲磺胺)嘧啶-5-基)甲基)三苯基-鹵化或任何其他的((4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-(N-甲基甲基磺酰氨基)嘧啶-5-基)甲基)鹽，或可選的二-i-丙基({4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-[甲基(甲基磺酰)氨基]-5-嘧啶基}甲基膦酸鹽，或任何其他的({4-(4-氟苯基)-6-異丙基-2-[甲基(甲基磺酰)氨基]-5-嘧啶基}甲基膦酸酯反應，產生N-(5-((E)-2-((2S,4R)-4-(對氧基)-6-氧代-四氫-2H-吡喃-2-基)乙烯)-4-(4-氟苯基)-6-異丙基嘧啶-2-基)-N-甲基甲烷磺酰胺。可以使用六甲基二硅氮烷鋰(LiHMDS)、六甲基二硅氮烷鉀(KHMDS)、六甲基二硅氮烷鈉(NaHMDS)、二異丙胺鋰(LDA)、氫化鈉、丁基鋰或Grignard試劑，優(yōu)選六甲基二硅氮烷鋰，作為堿。當來源是水合物形式的XIII，或XII與其水合物形式的XIII的混合物時，其溶解在選自THF、Et2O、i-Pr2O、tBuMeO的醚；選自戊烷、己烷、環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、庚烷的烴類；選自甲苯或其氯化衍生物的芳香族烴類；選自氯仿和二氯甲烷的氯化烴類；或上述溶劑的混合物中，在添加到形成的內鹽溶液之前，應該先去除從水合物中釋放的水。反應的優(yōu)選溶劑是無水甲苯和二氯甲烷?？梢栽?80℃至90℃之間，優(yōu)選0至90℃，更優(yōu)選80至90℃之間的溫度下實施反應。在1-12小時內完成反應?？梢杂肁cOEt、醚或烷烴，優(yōu)選用BuMeO實施利用抽提分離粗制產物?？扇コＷo基，打開內酯，生產羅蘇伐他汀的游離酸或其鹽，任選的可以轉化為半鈣鹽的胺?？梢栽诤线m的溶劑中，在0℃-80℃，優(yōu)選20或40℃的溫度下實施去保護化，優(yōu)選的溶劑選自醇、乙酸、THF、乙腈、甲基四氫呋喃、二烷、CH2Cl2，更優(yōu)選的是醇和THF/AcOH的混合物?？梢允褂贸Ｒ姷娜ケＷo劑，例如四-正丁基氟化銨、氟化銨、AcCl、FeCl3、TMSCl/HF·2H2O、氯乙基氯甲酸酯(CEC)、Ph3PCH2COMeBr。內酯的打開優(yōu)選發(fā)生在20℃-60℃的溫度下的THF/H2O的4:1至2:1混合物中，以及純的THF中，其中含合適的堿，例如NaOH、KOH、氨或胺。在30分鐘(60℃)至2小時(20℃)內完成水解。在水解步驟之后，可以在10℃至50℃的溫度下進行THF減壓蒸發(fā)，并在0℃-40℃的溫度下實施向鈣鹽的轉化，優(yōu)選通過添加Ca(OAc)2.×H2O，其可以作為一份或在5至60分鐘內逐滴添加。在添加Ca(OAc)2.×H2O后，可以在0℃-40℃的溫度下攪拌得到的懸浮液30分鐘至2小時。這類反應的細節(jié)是本領域已知的，包括但不限于WO2008/119810。通過任何上述實施方案獲得的API，優(yōu)選抑制素，可以配制在藥物配方中。用API，優(yōu)選抑制素制備藥物制劑的方法是本領域技術人員已知的。一般而言，可以選擇制備制劑，例如散劑、顆粒劑、片劑、膠囊、栓劑、溶液劑、軟膏劑、混懸劑、泡沫劑、貼劑、輸注液、注射用溶液等。為了修飾API的特定方面，例如釋放性、穩(wěn)定性、功效或安全性，可以改變制劑。根據API，本領域技術人員已知如何選擇用于所述API的正確的施用途徑?；谶@一點，可以選擇正確的制劑。然后，本領域技術人員能夠選擇配制藥物制劑所需的賦形劑。除API外(可以與至少一種其他API任選的組合)，本領域技術人員可以選擇賦形劑和添加劑來配制藥物制劑。合適的賦形劑可以是例如，粘合劑、稀釋劑、潤滑劑、崩解劑、填充劑、助流劑、溶劑、pH調節(jié)劑、離子強度調節(jié)劑、表面活性劑、緩沖劑、抗氧化劑、著色劑、穩(wěn)定劑、增塑劑、乳化劑、防腐劑、粘度調節(jié)劑、passifier、矯味劑，但不限于此，均可以單獨或組合使用。根據選定的制劑，方法可涉及混合、研磨、濕法造粒、干法造粒、壓片、溶解、冷凍干燥、膠囊填充，但不限于此。API及其中間物的應用在本發(fā)明的其他方面，一般可使用能夠催化氧化或脫氫的酶制備與本文公開的酶促體系相容的API或其中間物。本發(fā)明的這一方面優(yōu)選涉及合成這樣的API或其中間物，所述物質可分別歸類為以取代的或未取代的雙脫氧醛糖、內半縮醛(任選的包含多個羥基)和合成的非天然醇類作為可能的底物，和以(任選的被羥基化的)內酯或酯作為可能的產物。根據本發(fā)明的公開內容及其技術特征應理解：在糖(例如糖酵解、戊糖磷酸通路、糖原生成)、脂肪酸或細胞呼吸鏈的生物化學通路中天然存在的或出現的化合物將被排除視為能夠催化氧化或脫氫的酶的底物或根據本發(fā)明的API或其中間物。以相同的方式，天然存在的氨基酸、維生素或輔助因子也被排除在根據本發(fā)明的API或其中間物的定義之外。這類通路在自然界中的底物或產物包括甲醇、乙醇、甲醛、乙醛、甲酸、乙酸、單糖、二糖、三糖、葡萄糖酸，尤其是甲醇、乙醇、甲醛、乙醛、甲酸、乙酸、單糖、葡糖醛酸，特別是乙醇、乙酸和單糖。在優(yōu)選的實施方案中，能夠催化氧化或脫氫的酶用于制備式(I)的化合物，其中式(I)定義如上。在這一方面，最有效的是使用酶作用于式(II)的化合物，其中式(II)定義如上。當考慮上文公開的本發(fā)明的其他實施方案、方面或優(yōu)選特征時，用途的具體替代方案對本領域技術人員是顯而易見的。為了給出進一步示例的例子，下列式XIV給出了對底物的可能有用的進一步定義，以及因此可用于制備恰當的API或其中間物的起始化合物，從而導致獲得由式XV定義的相應產物化合物。其中Q是任何理想的結構部分，例如選自上文定義的R1、R2和R5，任選的在R1、R2或R5與內半縮醛/內酯環(huán)之間具有中間接頭分子。如結構式所示，未被氧化的非內半縮醛羥基可位于內半縮醛/內酯環(huán)的任何位置。在優(yōu)選的實施方案中，同時或相繼使用能夠催化氧化或脫氫的酶和DERA酶，制備API或其中間物。實施例下列實施例僅僅是本發(fā)明的示例性例子，不應被視為以任何方式對本發(fā)明范圍的限制，根據本公開內容和所附權利要求，這些例子及其其他的等價形式對本領域技術人員是顯而易見的。實施例1：制備包含在全細胞內的醛糖脫氫酶如下文實施例所述，制備一些醛糖脫氫酶：首先，制備由基因gcd(大腸桿菌GeneBank#JW0120，位置標簽b0124)編碼的、膜結合的葡萄糖脫氫酶，其為吡咯并喹啉醌(PQQ)依賴性脫氫酶。使用WizardGenomicDNAPurificationKit(Promega,Madison,WI,USA)，根據生產商的說明分離大腸桿菌DH5α的基因組DNA。使用在LB培養(yǎng)基上37℃生長的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，分離基因組DNA。使用寡核苷酸引物GCGCCATATGGCAATTAACAATACAGGCTCGCG和GCGCGCTCAGCGCAAGTCTTACTTCACATCATCCGGCAG通過PCR實施基因gcd的擴增。通過Pfx50DNA聚合酶(Invitrogen,Calsbad,CA,USA)，如下實施擴增：在94℃初始變性10min，再進行30個循環(huán)的94℃下45s，52℃下45s和68℃下150s。在68℃下實施最終延伸420s。通過瓊脂糖凝膠電泳分離含有gcd(SEQIDNO.03)的2.4-kbDNA片段，并純化。在T4連接酶反應中，將產物連接到質粒pGEMT-Easy(Promega,Madison,WI,USA)中。用限制性內切酶NdeI和BlpI切割質粒構建體，在瓊脂糖凝膠電泳上分離得到的片段，并純化含有gcd的2.4kb片段。使用相同的上述限制性內切酶切割表達載體pET30a(+)(NovagenInc.,Madison,WI,USA)，并純化。在T4連接酶反應中，將含有gcd基因的2.4kb片段與切割過的表達載體裝配。用獲得的連接反應物轉化大腸桿菌JM109細胞，并培養(yǎng)卡那霉素抗性菌落。然后分離質粒DNA。得到的構建體被命名為pET30/Gcd，測序驗證基因序列。實施克隆方法，允許表達具有序列(SEQIDNO.04)的蛋白質，其含有摻入到細胞膜中必需的信號。通過用所述質粒轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，制備表達膜結合的葡萄糖脫氫酶的生物。第二，制備由基因yliI(大腸桿菌GeneBank#ECK0827，位置標簽b0837)編碼的水溶性醛糖脫氫酶，是一種吡咯并喹啉醌(PQQ)依賴性脫氫酶。使用WizardGenomicDNAPurificationKit(Promega,Madison,WI,USA)，根據生產商的說明分離大腸桿菌DH5α的基因組DNA。使用在LB培養(yǎng)基上37℃生長的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，分離基因組DNA。使用寡核苷酸引物GCGCCATATGCATCGACAATCCTTT和GCGCGCTCAGGCTAATTGCGTGGGCTAACTTTAAG通過PCR實施基因yliI的擴增。通過Pfx50DNA聚合酶(Invitrogen,Calsbad,CA,USA)，如下實施擴增：在94℃初始變性10min，再進行30個循環(huán)的94℃下45s，52℃下45s和68℃下150s。在68℃下實施最終延伸420s。通過瓊脂糖凝膠電泳分離含有yliI(SEQIDNO.01)的1.2-kbDNA片段，并純化。在T4連接酶反應中，將產物連接到質粒pGEMT-Easy(Promega,Madison,WI,USA)中。用限制性內切酶NdeI和SalI切割質粒構建體，在瓊脂糖凝膠電泳上分離得到的片段，并純化含有yliI的1.2kb片段。使用相同的上述限制性內切酶切割表達載體pET30a(+)(NovagenInc.,Madison,WI,USA)，并純化。在T4連接酶反應中，將含有yliI基因的1.2kb片段與切割過的表達載體裝配。用獲得的連接反應物轉化大腸桿菌JM109細胞，并培養(yǎng)卡那霉素抗性菌落。然后分離質粒DNA。得到的構建體被命名為pET30/YliI，測序驗證基因序列。實施克隆方法，允許表達具有序列(SEQIDNO.02)的蛋白質，其包括YliI易位到周質的前導序列。通過用所述質粒轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，制備表達醛糖脫氫酶的生物。使用在乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)中發(fā)現的另一種水溶性醛糖脫氫酶進行備選的氧化研究。優(yōu)化編碼基因的核苷酸序列和用于轉運到周質的前導序列(PQQGdhB，乙酸鈣不動桿菌GeneBank#X15871)，用于在大腸桿菌中表達，并化學合成DNA(Geneart,Regensburg,Germany)(SEQID.NO.05)。用具有核苷酸序列gdhB的人工質粒轉化大腸桿菌JM109細胞，并培養(yǎng)卡那霉素抗性菌落。然后分離質粒DNA，用限制性內切核酸酶NdeI和HindIII切割構建體，在瓊脂糖凝膠電泳上分離得到的片段，并純化1.5kb片段(SEQID.NO.05)。使用相同的上述限制性內切核酸酶切割表達載體pET30a(+)(NovagenInc.,Madison,WI,USA)，并純化。在T4連接酶反應中，將含有gdhB基因的1.5kb片段裝配在切割過的表達載體中。用獲得的連接反應物轉化大腸桿菌JM109細胞，并培養(yǎng)卡那霉素抗性菌落。然后分離質粒DNA。得到的構建體被命名為pET30/GdhB，測序驗證基因序列。實施克隆方法，目標是允許表達具有序列SEQIDNO.06的蛋白質。通過用所述質粒轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，制備來自乙酸鈣不動桿菌表達生物的醛糖脫氫酶。使用在乙酸鈣不動桿菌中發(fā)現的另一種的水溶性醛糖脫氫酶(PQQGdhB，乙酸鈣不動桿菌GeneBank#X15871)，其具有改變的序列和增加的熱穩(wěn)定特性[Igarashi,2003]。優(yōu)化編碼基因的核苷酸序列和用于轉運到周質的前導序列(PQQGdhB，乙酸鈣不動桿菌GeneBank#X15871)，用于在大腸桿菌中表達，并化學合成DNA(Geneart,Regensburg,Germany)(SEQID.NO.07)。用具有核苷酸序列gdhB_therm的人工質粒轉化大腸桿菌JM109細胞，并培養(yǎng)氨芐青霉素抗性菌落。然后分離質粒DNA，用限制性內切核酸酶NdeI和HindIII切割構建體，在瓊脂糖凝膠電泳上分離得到的片段，并純化1.5kb片段(SEQID.NO.07)。使用相同的上述限制性內切核酸酶切割表達載體pET30a(+)(NovagenInc.,Madison,WI,USA)，并純化。在T4連接酶反應中，將含有gdhB_therm基因的1.5kb片段裝配在切割過的表達載體中。用獲得的連接反應物轉化大腸桿菌JM109細胞，并培養(yǎng)卡那霉素抗性菌落。然后分離質粒DNA。得到的構建體被命名為pET30/GdhB_therm，測序驗證基因序列。通過用所述質粒轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，制備表達備選的醛糖脫氫酶的生物。實施克隆方法，目標是允許表達具有序列SEQIDNO.08的蛋白質。與SEQIDNO.06相比，SEQIDNO.08具有改變的序列，第231位編碼的Ser殘基變?yōu)長ys殘基。當提起時，使用具有表達質粒載體pET30a(+)(NovagenInc.,Madison,WI,USA)的大腸桿菌BL21(DE3)作為陰性對照。通過用所述質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，制備對照細胞，并培養(yǎng)卡那霉素抗性菌落。在大腸桿菌中表達各種酶的方法如方法1A所述。在表達后，收獲細胞，如方法1B所述獲得全細胞催化劑。為了獲得休眠的全細胞催化劑，進行方法1C。-----------------方法1A：用來自新鮮劃線的VD瓊脂平板，并預先培養(yǎng)至對數后期(37℃，250rpm，8h)的單菌落大腸桿菌BL21DE(3)pET30/Gcd或大腸桿菌BL21DE(3)pET30/YliI或BL21DE(3)pET30/GdhB或BL21DE(3)pET30/GdhB_therm，接種補充了卡那霉素(25μg/mL)的VD培養(yǎng)基(30mL；10g/Lbacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/LNaCl，4g/LNaH2PO4·2H2O，用1MNaOH調節(jié)pH至pH＝7.0)。然后，將預培養(yǎng)的細胞(接種量10％，v/v)轉移到補充了卡那霉素(25μg/mL)的新鮮VD培養(yǎng)基(100mL；10g/Lbacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/LNaCl，4g/LNaH2PO4·2H2O，用1MNaOH調節(jié)pH至pH＝7.0)中。為了誘導蛋白質表達，加入0.1mM異丙基-β-D-半乳糖硫吡喃糖苷類(IPTG，購自SigmaAldrich,Germany)。細胞在搖瓶中25℃，250rpm培養(yǎng)16h。方法1B：在表達后(如方法1A所述)，通過離心(10000g，5min，4℃)收獲細胞。拋棄離心后的上清液，將沉淀重懸在新鮮的VD培養(yǎng)基(10g/Lbacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/LNaCl，4g/LNaH2PO4·2H2O，用1MNaOH調節(jié)pH至pH＝6.0)中。細胞重懸在十分之一的初始培養(yǎng)體積中。方法1C：在拋棄上清液后(涉及方法1A)，將沉淀重懸在磷酸鹽緩沖液(50mMKH2PO4，150mMNaCl，pH＝6.0)中。細胞重懸在十分之一的初始培養(yǎng)體積中。實施例2：制備包含在無細胞裂解物中的醛糖脫氫酶為了獲得表達大腸桿菌YliI、大腸桿菌GdhB、大腸桿菌Gcd或大腸桿菌GdhB_therm后的無細胞裂解物(如實施例1所述，更具體的在進行方法1A后)，通過離心(10000g，5min，4℃)收獲細胞。拋棄離心后的上清液，將沉淀重懸在十分之一初始體積的磷酸鹽緩沖液(50mMKH2PO4，150mMNaCl，pH＝7.0)中。細胞補充了1mg/mL溶菌酶溶液。在37℃下實施裂解1h。在裂解后，通過沉降(10min，20000g，4℃)去除細胞碎片，獲得清澈的含水溶液。因此獲得了包含在無細胞提取物中的醛糖脫氫酶?？蛇x的，將沉淀重懸在裂解緩沖液(50mMNaH2PO4，pH＝7.0，300mMNaCl，2mMDTT)中，使用每1L所述緩沖液200g沉淀。使用Branson數字超聲儀將細胞超聲波處理(3x15s)，通過沉降(10min，20000g，4℃)去除細胞碎片，獲得清澈的含水溶液。因此獲得了包含在無細胞提取物中的醛糖脫氫酶。以上述相同的方式，從中間克呂沃爾菌(Klyuveraintermedia)和氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)的全細胞中制備無細胞裂解物(全細胞催化劑的培養(yǎng)和制備分別描述在實施例9和實施例10中)。用相同的方法處理作為陰性對照的大腸桿菌BL21(DE3)pET30培養(yǎng)物。實施例3：制備含有醛糖脫氫酶的周質細胞級分為了獲得表達大腸桿菌YliI、大腸桿菌Gcd、大腸桿菌GdhB或大腸桿菌GdhB_therm后周質蛋白的特定釋放(如實施例1所述，更具體的在進行方法1A后)，使用下列方法。通過離心沉淀來自新鮮表達的培養(yǎng)物的細胞，完全去除生長培養(yǎng)基。在20mMTris-HCl(pH7.5)中洗滌細胞沉淀3次。然后，在重懸在十分之一初始培養(yǎng)體積的高滲溶液之前，離心(10000g，5min，4℃)細胞沉淀，所述高滲溶液含有20mMTrisHCl(pH7.5)、20％蔗糖和0.5mMEDTA。將細胞懸浮液在冰上孵育10min。在離心(10min，12000g，4℃)后，通過移液至與高滲溶液等體積的低滲溶液(50mMTris-HClpH7.0)中，溫和的重懸細胞沉淀。再在冰上孵育細胞10min。通過離心(10min，20000g，4℃)沉淀細胞，將上清液移除并視為周質級分。用相同的方法處理作為陰性對照的大腸桿菌BL21(DE3)pET30培養(yǎng)物。實施例4：制備含有醛糖脫氫酶的膜細胞級分為了獲得表達大腸桿菌Gcd后膜結合蛋白的特定釋放(如實施例1所述，更具體的在進行方法1A后)，使用下列方法。通過離心沉淀來自新鮮表達的培養(yǎng)物的細胞，完全去除生長培養(yǎng)基。將細胞沉淀重懸在含有0.05％(v/v)TritonX-100和1mg/mL溶菌酶的初始體積的磷酸鹽緩沖液(50mMKH2PO4，150mMNaCl，pH6.0)中，在37℃下孵育30分鐘。通過離心(30min，20000g，4℃)去除細胞碎片，將上清液分離并標記為膜級分。用相同的方法處理作為陰性對照的大腸桿菌BL21(DE3)pET30的培養(yǎng)物。實施例5：制備包含在全細胞內的脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶酶(DERA)通過多種方法獲得包含在全細胞催化劑中的醛縮酶基因deoC(大腸桿菌GeneBank#EG10221，位置標簽b4381)，例如WO2009/092702所述。然而，本文提供了制備包含在全細胞內的醛縮酶酶(DERA)的非限制性實施例。使用WizardGenomicDNAPurificationKit(Promega,Madison,WI,USA)，根據生產商的說明分離大腸桿菌DH5α的基因組DNA。使用在LB培養(yǎng)基上37℃生長的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，分離基因組DNA。使用寡核苷酸引物CCGGCATATGACTGATCTGAAAGCAAGCAG和CCGCTCAGCTCATTAGTAGCTGCTGGCGCTC通過PCR實施基因deoC的擴增。通過Pfx50DNA聚合酶(Invitrogen,Calsbad,CA,USA)，如下實施擴增：在95℃初始變性10min，再進行30個循環(huán)的94℃下45s，60℃下45s和68℃下60s。在68℃下實施最終延伸420s。通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到的片段并純化。通過瓊脂糖凝膠電泳分離含有deoC(SEQIDNO.09)的0.9-kbDNA片段，并純化。在T4連接酶反應中，將產物連接到質粒pGEMT-Easy(Promega,Madison,WI,USA)中。用限制性內切酶NdeI和BlpI切割由此得到的質粒構建體，在瓊脂糖凝膠電泳上分離得到的片段，并純化含有deoC的0.9kb片段。使用相同的上述限制性內切酶切割表達載體pET30a(+)(NovagenInc.,Madison,WI,USA)，并純化。在T4連接酶反應中，將含有deoC基因的0.9kb片段與切割過的表達載體裝配。用獲得的連接反應物轉化大腸桿菌JM109細胞，并培養(yǎng)卡那霉素抗性菌落。然后分離質粒DNA。得到的構建體被命名為pET30/DeoC，測序驗證基因序列。實施克隆方法，目標是允許表達具有序列(SEQIDNO.10)的蛋白質。通過用所述質粒轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，制備表達DERA醛縮酶的生物。deoC的表達：用來自新鮮劃線且培養(yǎng)過夜(37℃，250rpm)的單菌落大腸桿菌BL21DE(3)pET30/DeoC，接種補充了卡那霉素(25μg/mL)的VD培養(yǎng)基(50mL；10g/Lbacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/LNaCl，4g/LNaH2PO4·2H2O，pH＝7.0)。按方法1A所述進行大腸桿菌DeoC的表達方法，唯一的差別在于IPTG誘導劑的濃度是0.5mM。在收獲表達細胞后，如用于獲得活的全細胞催化劑的方法1B所述，獲得全細胞催化劑。為了獲得休眠的細胞催化劑，進行方法1C。實施例6：制備包含在單個微生物的全細胞培養(yǎng)物中的醛縮酶(DERA)和醌蛋白葡萄糖脫氫酶構建同時具有醛縮酶活性(DERA)和葡萄糖脫氫酶活性的遺傳修飾的生物體的兩個例子。在第一種情況下，將具有額外的核糖體結合位點(RBS)的基因yliI加入到構建體pET30/DeoC中。得到的構建體具有兩種不同的編碼序列(一種編碼DERA，另一種編碼Yli)，所述編碼序列被組織在一個操縱子中，并處于IPTG誘導型啟動子的轉錄控制下。具體而言，使用WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationKit(Promega,Madison,WI,USA)，根據生產商的說明從大腸桿菌JM109pET30/YliI(實施例1中描述了它的構建)中分離質粒DNA。使用在LB培養(yǎng)基上37℃生長的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，分離質粒DNA。在PCR反應中，使用分離的質粒pET30/YliI作為模板，擴增含有基因yliI和源自表達載體pET30a(+)的編碼區(qū)上游的RBS的序列。使用寡核苷酸引物GCAGGCTGAGCTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG和GCGCGCTCAGCCTAATTGCGTGGGCTAACTTTAAG實施PCR反應。使用PfuULTRAIIFusionHSDNA200聚合酶(Agilent,SantaClara,CA,USA)，如下實施該片段的擴增：在98℃初始變性3min，再進行30個循環(huán)的98℃下20s，55℃下20s和72℃下90s。在72℃下實施最終延伸180s。通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到的片段，并純化含有yliI和RBS位點的1.2kb片段。將產物轉移到質粒pGEMT-Easy(Promega,Madison,WI,USA)中，命名為pGEM/RBS_yliI。用限制性內核酸切酶BlpI切割構建體，在瓊脂糖凝膠電泳上分離得到的片段，并純化含有yliI和RBS位點的1.2kb片段。使用上述限制性內切核酸酶(BlpI)切割構建體pET30a/DeoC(實施例5中描述了它的構建)，并純化。根據生產商的說明，使用蝦堿性磷酸酶(SAP，購自Promega,Madison,WI,USA)將切割過的pET30a/DeoC的5’磷酸化末端去磷酸化。從而阻止pET30/DeoC的自身連接。在T4連接酶反應中裝配片段。用獲得的連接反應物轉化大腸桿菌JM109細胞，并培養(yǎng)卡那霉素抗性菌落。然后分離質粒DNA。得到的構建體被命名為pET30/DeoC_RBS_YliI，測序驗證基因序列。通過用所述質粒轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，制備表達DERA醛縮酶和醌蛋白葡萄糖脫氫酶的生物。在第二種情況下，將不僅具有額外的核糖體結合位點(RBS)，還具有額外的T7啟動子序列的基因gcd加入到構建體pET30/DeoC中。得到的載體具有處于IPTG誘導型啟動子的轉錄控制下的2種不同的編碼序列(1種編碼DERA，另一種編碼Gcd)。具體而言，使用WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationKit(Promega,Madison,WI,USA)，根據生產商的說明從大腸桿菌JM109pET30/Gcd(實施例1中描述了它的構建)中分離質粒DNA。使用在LB培養(yǎng)基上37℃生長的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，分離質粒DNA。在PCR反應中，使用分離的質粒DNA作為模板，擴增含有基因gcd和源自表達載體pET30a(+)的編碼區(qū)上游的RBS序列的序列。使用寡核苷酸引物GCTGGCTCAGCCTCGATCCCGCGAAATTAATA和GCGCGCTCAGCGCAAGTCTTACTTCACATCATCCGGCAG實施PCR反應。使用PfuULTRAIIFusionHSDNA200聚合酶(Agilent,SantaClara,CA,USA)，如下實施該片段的擴增：在98℃初始變性3min，再進行30個循環(huán)的98℃下20s，55℃下20s和72℃下90s。在72℃下實施最終延伸180s。通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到的片段，并純化含有gcd和RBS位點的1.2kb片段。將產物轉移到質粒pGEMT-Easy(Promega,Madison,WI,USA)中，命名為pGEM/T7p_RBS_gcd。用限制性內核酸切酶BlpI切割構建體，在瓊脂糖凝膠電泳上分離得到的片段，并純化含有gcd、RBS和T7啟動子序列位點的2.4kb片段。使用相同的上述限制性內切核酸酶(BlpI)切割構建體pET30a/DeoC(實施例5中描述了它的構建)，并純化。根據生產商的說明，使用蝦堿性磷酸酶(SAP，購自Promega,Madison,WI,USA)將切割過的pET30a/DeoC的5’磷酸化末端去磷酸化。從而阻止pET30/DeoC的自身連接。在T4連接酶反應中裝配片段。用獲得的連接反應物轉化大腸桿菌JM109細胞，并培養(yǎng)卡那霉素抗性菌落。然后分離質粒DNA。得到的構建體被命名為pET30/DeoC_T7p_RBS_Gcd，測序驗證基因序列。通過用所述質粒轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，制備表達DERA醛縮酶和醌蛋白葡萄糖脫氫酶的生物。除非另外指出，如方法1A所述，實施由上述方法獲得的菌株編碼的酶的表達。實施例7：制備能夠合成吡咯并喹啉醌(PQQ)的大腸桿菌在大腸桿菌中表達參與吡咯并喹啉醌(PQQ)生物合成的氧化葡糖桿菌(ATCC621H)基因簇pqqABCDE(pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE，GeneBank#CP000009，大致位置在基因組1080978…1084164)。使用WizardGenomicDNAPurificationKit(Promega,Madison,WI,USA)，根據生產商的說明分離氧化葡糖桿菌(ATCC621H)的基因組DNA。使用在甘露醇培養(yǎng)基(10g/Lbacto酵母提取物，3g/L蛋白胨，5g/L甘露醇，pH7.0)上26℃生長48h的氧化葡糖桿菌培養(yǎng)物，分離基因組DNA。使用所述分離的基因組作為模板，擴增基因簇pqqABCDE及其本身的啟動子。使用寡核苷酸引物GCGCGGTACCGCACATGTCGCGGATGTTCAGGTGTTC(SEQIDNO.80)和GCGCGGATCCGGGCGGAGAGTTTGGAGAACCTCTTCA(SEQIDNO.81)，和使用PfuULTRAIIFusionHSDNA200聚合酶(Agilent,SantaClara,CA,USA)，如下通過PCR實施擴增：在95℃初始變性2min，再進行30個循環(huán)的95℃下20s，65℃下20s和72℃下120s。在72℃下實施最終延伸180s。通過瓊脂糖凝膠電泳分離具有pqqABCDE操縱子和部分上游和下游序列的氧化葡糖桿菌的3.4-kbDNA片段，并純化。將3.4-kb產物(SEQIDNO.11)連接到質粒pGEMT-Easy(Promega,Madison,WI,USA)中。用獲得的連接反應物轉化大腸桿菌JM109細胞，并培養(yǎng)氨芐青霉素抗性菌落，和分離質粒DNA。得到的質粒構建體被命名為pGEMpqqA-E，測序驗證基因序列。實施克隆方法，目標是允許處于其天然啟動子控制下的基因表達，因此生產源自氧化葡糖桿菌的蛋白質PqqA、PqqB、PqqC、PqqD和PqqE(分別是SEQIDNO.12、13、14、15、16)。在大腸桿菌中合成PQQ：(方法7A)：用來自新鮮劃線且預培養(yǎng)至對數末期(37℃，250rpm，8h)的單菌落大腸桿菌JM109pGEM/pqqA-E，接種補充了氨芐青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基(30mL；20g/LBactoLB肉湯)。通過離心(10000g，10min)沉淀預培養(yǎng)的細胞，用50mM磷酸鹽緩沖液(pH＝7.0)洗滌3次。將預培養(yǎng)的細胞重懸在與預培養(yǎng)中相同體積的同一上述緩沖液中。然后，將懸浮液(接種量5％，v/v)轉移到葡萄糖基礎培養(yǎng)基(100mL，5g/LD-葡萄糖，2g/L檸檬酸鈉，10g/LK2HPO4，3.5g/L(NH4)2SO4，pH7.0)中。在37℃，250rpm下生長培養(yǎng)物48h。細胞培養(yǎng)物補充了1mg/mL溶菌酶溶液。在37℃實施裂解1h。在裂解后，通過沉降(10min，20000g，4℃)去除細胞碎片，獲得清澈的含水溶液。因此獲得了包含在無細胞提取物中的PQQ。用于驗證大腸桿菌中的PQQ生產的方法描述在實施例13中。實施例8：制備包含在能夠合成吡咯并喹啉醌(PQQ)的單個微生物的全細胞培養(yǎng)物中的醛糖脫氫酶構建具有基因yliI和基因簇pqqA-E的表達質粒。用限制性內切核酸酶SphI消化構建體pET30/YliI(如實施例1所述制備)。根據生產商的說明，使用蝦堿性磷酸酶(SAP，購自Promega,Madison,WI,USA)將切割過的pET30/YliI的5’磷酸化末端去磷酸化。從而阻止pET30/YliI的自身連接。之后，用SphI切割后，將含有雙限制性酶識別位點SphI和用于限制性內切核酸酶BamHI、KpnI和HindIII的識別位點的雙鏈接頭GCGCAAGCATGCGGATCCGGTACCAAGCTTGCATGCACACTA(SEQIDNO.82)(訂購自Invitrogen,Calsbad,CA,USA)，導入到經過消化的構建體pET30/YliI的SphI位點中。在T4連接酶反應中裝配切割接頭和切割的構建體。接頭的導入在質粒中插入了額外的限制性內切核酸酶識別位點。用限制性內切核酸酶BamHI和KpnI切割構建體pGEM/pqqA-E(根據實施例7)，然后在瓊脂糖凝膠電泳上分離得到的片段，并純化含有基因操縱子pqqABCDE的3.4kb片段。使用上述限制性內切核酸酶切割含接頭的構建體pET30/YliI，并純化。在T4連接酶反應中裝配片段(分別是含接頭的切割過的pET30/YliI和pqqA-E)。用獲得的連接反應物轉化大腸桿菌JM109細胞，并培養(yǎng)卡那霉素抗性菌落，分離質粒DNA。得到的質粒構建體被命名為pET30/YliI+pqqA-E，測序驗證基因序列。通過用所述質粒轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，制備能夠表達醛糖脫氫酶，同時合成吡咯并喹啉醌的生物。如方法1A所述，進行大腸桿菌YliI的表達，所述YliI包含在能夠生產PQQ的單個微生物的全細胞培養(yǎng)物中。根據方法1B和1C，分別制備活的全細胞催化劑和休眠的全細胞催化劑。按實施例2描述的方法，制備無細胞裂解物。用于驗證大腸桿菌的氧化能力和PQQ生產的方法描述在實施例13中。此外，組裝含有DERA、和醛糖脫氫酶YliI、以及氧化葡糖桿菌(ATCC621H)的PQQ生物合成簇的構建體。與上述方法類似的實施所述方法，但使用載體pET30/DeoC_RBS_YliI(描述在實施例6中)作為起點。得到的質粒被命名為pET30/DeoC_RBS_YliI+pqqA-E(圖1)。實施例9：制備中間克呂沃爾菌的全細胞催化劑培養(yǎng)中間克呂沃爾菌(ATCC33421，以前稱為中間腸桿菌(Enterobacterintermedia))：用來自新鮮劃線的VD瓊脂平板，并預先培養(yǎng)至對數后期(30℃，250rpm，8h)的單菌落中間克呂沃爾菌，接種VD培養(yǎng)基(30mL；10g/Lbacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/LNaCl，4g/LNaH2PO4·2H2O，用1MNaOH調節(jié)pH至pH＝7.0)。然后，將預培養(yǎng)的細胞(接種量10％，v/v)轉移到新鮮的VD培養(yǎng)基(100mL；10g/Lbacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/LNaCl，4g/LNaH2PO4·2H2O，用1MNaOH調節(jié)pH至pH＝7.0)中。細胞在30℃，250rpm下維持16h。制備全細胞催化劑(方法1B)：在培養(yǎng)后，通過離心(10000g，5min，4℃)收獲細胞。拋棄離心后的上清液，將沉淀重懸在新鮮的VD培養(yǎng)基(10g/Lbacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/LNaCl，4g/LNaH2PO4·2H2O，用1MNaOH調節(jié)pH至pH＝6.0)中。細胞重懸在十分之一的初始培養(yǎng)體積中。因此在新鮮培養(yǎng)基中獲得了包含在活的全細胞中的醛糖脫氫酶?？蛇x的(方法1C)：在拋棄離心后的上清液后，將沉淀重懸在磷酸鹽緩沖液(50mMKH2PO4，150mMNaCl，pH＝6.0)中。細胞重懸在十分之一的初始培養(yǎng)體積中。因此獲得了包含在休眠全細胞中的醛糖脫氫酶。按實施例2描述的方法制備無細胞裂解物。實施例10：制備氧化葡糖桿菌的全細胞催化劑培養(yǎng)氧化葡糖桿菌(ATCC#621H)：用來自新鮮劃線的甘露醇瓊脂平板的單菌落氧化葡糖桿菌，接種甘露醇培養(yǎng)基(100mL；10g/Lbacto酵母提取物，3g/L蛋白胨，5g/L甘露醇，用1MNaOH調節(jié)pH至pH＝7.0)，并培養(yǎng)。細胞在26℃，250rpm下維持48h。制備全細胞催化劑(方法1B)：在培養(yǎng)后，通過離心(10000g，5min，4℃)收獲細胞。拋棄離心后的上清液，將沉淀重懸在新鮮的VD培養(yǎng)基(10g/Lbacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/LNaCl，4g/LNaH2PO4·2H2O，用1MNaOH調節(jié)pH至pH＝6.0)中。細胞重懸在十分之一的初始培養(yǎng)體積中。因此在新鮮培養(yǎng)基中獲得了包含在活的全細胞中的醛糖脫氫酶?？蛇x的(方法1C)：在拋棄離心后的上清液后，將沉淀重懸在磷酸鹽緩沖液(50mMKH2PO4，150mMNaCl，pH＝6.0)中。細胞重懸在十分之一的初始培養(yǎng)體積中。因此獲得了包含在休眠全細胞中的醛糖脫氫酶。按實施例2描述的方法制備無細胞裂解物。實施例11：使用DCPIP作為電子受體，確定化合物(II)的氧化/脫氫活性的方法該方法可用于確定醛糖脫氫酶活性(或其他脫氫酶和/或氧化酶的活性)。相應的，使用相同的方法篩選和鑒別能夠進行化合物(II)的氧化/脫氫反應，獲得化合物(I)的酶和/或生物體?？梢允褂萌魏挝⑸锏幕畹娜毎呋瘎?涉及方法1B)、休眠的全細胞催化劑(涉及方法1C)、裂解物(按實施例2描述的制備)、周質級分(實施例3)或膜級分(實施例4)，測量對化合物(II)的氧化/脫氫活性，不論所述微生物是天然的或遺傳修飾的微生物。出于實踐的目的，下文可以理解術語“分析材料”包括前述實施例中描述的所有催化劑制品。所提供的下表分別給出了使用不同制品獲得的結果。為了比較研究，將測試微生物的細胞密度定量為每mL樣品的濕重(mg)。通過離心(10000g，10min)分離樣品中的細胞和肉湯，稱重濕的沉淀。裂解時，使用周質級分或膜級分作為測試級分，考慮這些級分所來源的全細胞的細胞濕重數據。1mL“分析材料”補充了5μMPQQ(SigmaAldrich，Germany)和10mMMgCl2(SigmaAldrich，Germany)，并在室溫孵育10分鐘。在測量前，用1MNaOH調節(jié)“分析材料”的pH值至8.0。當另外說明時(符號“＊”表示例外)，測量的差異是pH值，更特別的是pH6.0。當說明時，除了內在的PQQ外，不向反應混合物中添加額外的PQQ。為了篩選和鑒別可用于將乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯轉化為乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯的“分析材料”，在存在人工電子受體2,6-二氯吲哚酚(2,6-dichlorobenzenone-indophenole,DCPIP)與吩嗪硫酸甲酯(PMS)組合的條件下，在96孔板中實施篩選方法。反應混合物(總體積200μL)含有磷酸鹽緩沖液pH8.0(或者當說明時，磷酸鹽緩沖液pH6.0)、100mM底物乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯)、1mMDCPIP(SigmaAldrich，Germany)、0.4mMPMS(SigmaAldrich，Germany)。將“分析材料”加入到反應混合物中。需要時(由于反應快速完成)，將“分析材料”在磷酸鹽緩沖液pH8.0或磷酸鹽緩沖液pH6.0(指出時)中稀釋。所有測試的“分析材料”都制備一式三份。發(fā)現測定是線性的有效范圍是在10至400mAU/sec。用分光光度計SpectraMaxProM2(MolecularDevices,USA)實施方法。在28℃下每15秒測量600nm的吸光度，測量15分鐘。收集結果，并使用軟件SoftMaxProDataAcquisition&AnalysisSoftware分析?！胺治霾牧稀钡幕钚?，和執(zhí)行將化合物(II)轉化為化合物(I)的反應的能力，具體而言是將乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯轉化為乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯的能力，定義為反應混合物中存在的每單位濕重的培養(yǎng)細胞每分鐘吸光度單位減少的絕對值(abs[mAUmin-1mg-1])，所述培養(yǎng)細胞根據方法1C、2、3或4用于制備任何“分析材料”。數據是3組平行測量值的平均值，顯示在下表中。標記：‘’＊”-反應的pH值是6.0‘’＊＊”-在“無PQQ”的列中，除內在的PQQ外，沒有加入額外的PQQ對于陰性對照，適當時用磷酸鹽緩沖液pH8.0或pH6.0替代反應混合物的至少一種組分(除電子受體DCPIP與PMS的組合)。即使經過延長的孵育后，在所有的陰性對照孔中沒有觀察到任何變色。當用磷酸鹽緩沖液替代清澈的醛糖脫氫酶水溶液時，沒有觀察到變色。當用磷酸鹽緩沖液替代任何底物(乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯、葡萄糖、半乳糖或甘油)時，沒有觀察到變色。當通過本發(fā)明所述的任何手段，不向反應混合物提供PQQ(除了混合物9、10和11，其中PQQ是內在提供的)時，沒有觀察到變色。實施例12：在存在DCPIP的條件下，確定包含在大腸桿菌中的醛糖脫氫酶的特性a)為了確定大腸桿菌YliI醛糖脫氫酶對其他底物和不同濃度的活性，實施額外的實驗。將50μL“分析材料”(更特別的是用5μLPQQ和10mMMgCl2重構的大腸桿菌BL21pET30/YliI，并進行方法1B)，將1mMDCPIP，0.4mMPMS以及不同濃度(2.5–10g/L)的底物(乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯、D-葡萄糖和D-半乳糖)置于96孔微滴度板的孔內。反應混合物的最終體積是200μL，所有組分都溶解在磷酸鹽緩沖液pH8.0中。在這些孔中觀察到了DCPIP變色。使用乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯作為底物的變色速率比含有D-葡萄糖或D-半乳糖作為底物的對照孔快約2倍。使用10g/L乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯作為底物時比2.5g/L所述底物變色更快。僅當反應混合物中的乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯的濃度升至大于40g/L時，觀察到對反應速率輕微的底物抑制作用。為了評估產物乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯對反應速率的可能影響，在反應開始前，向反應混合物中加入各種量的所述產物。僅當除10g/L乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯以外，加入超過35g/L乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯時，才觀察到反應速率的輕微降低。為了研究大腸桿菌YliI醛糖脫氫酶的底物特異性和最適pH，實施下列實驗：一種反應混合物(總體積200μL)含有磷酸鹽緩沖液pH8.0，50mM底物(乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯、D-葡萄糖或甘油)，1mMDCPIP，0.4mMPMS。向混合物中加入50μL補充了5μMPQQ(SigmaAldrich，Germany)和10mMMgCl2的“分析材料”(下文進一步詳述)。催化劑大腸桿菌BL21pET30/YliI培養(yǎng)物是作為休眠的全細胞催化劑(進行方法1C獲得的)或裂解物(如實施例2所述)獲得的。反應混合物的初始pH值是8.0。所有的測試溶液都一式三份。制備與上述相同的第二種反應混合物，唯一的區(qū)別是：配制的混合物的pH值是6.0(將反應混合物的所有化合物溶解在磷酸鹽緩沖液pH6.0中，因此反應混合物的初始pH值是6.0)。所有的測試溶液都一式三份。用分光光度計SpectraMaxProM2(MolecularDevices,USA)確定所述反應混合物中不同的最適條件下醛糖脫氫酶的差異和由此的轉化底物的差異。在28℃下每15秒測量600nm的吸光度，測量15分鐘。收集結果，并使用軟件SoftMaxProDataAcquisition&AnalysisSoftware分析。如實施例11所述實施實驗。在下表中，顯示了“分析材料”的活性(abs[mAUmin-1mg-1])。b)另外，使用DCPIP方法，評估大腸桿菌的膜結合的葡萄糖脫氫酶Gcd在結構上不同的特征。將50μL“分析材料”(更具體是用5μLPQQ和10mMMgCl2重構的大腸桿菌BL21pET30/Gcd，并接受方法1B)，1mMDCPIP，0.4mMPMS置于96孔微滴度板的孔內，加入不同濃度(2.5–10g/L)的底物(乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯、D-葡萄糖和D-半乳糖)。反應混合物的最終體積是200μL，所有組分都溶解在磷酸鹽緩沖液pH6.0中。在這些孔中觀察到了DCPIP變色。使用乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯作為底物的變色速率比含有D-葡萄糖或D-半乳糖作為底物的對照孔慢約2倍。使用10g/L乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯作為底物時比2.5g/L所述底物變色更快。僅當反應混合物中的乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯的濃度升至大于60g/L時，觀察到對反應速率輕微的底物抑制作用。為了評估產物乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯對反應速率的潛在影響，在反應開始前，向反應混合物中加入各種量的所述產物。僅當除10g/L乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯以外，加入超過55g/L乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯時，才觀察到反應速率的輕微降低。為了研究所述大腸桿菌膜醛糖脫氫酶的底物特異性和最佳pH，在催化劑大腸桿菌BL21pET30/Gcd上實施上述實驗。結果顯示，當底物是乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯時，在膜中過表達Gcd醌蛋白脫氫酶在pH6.0時的性能更好。對乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯的活性略微慢于使用葡萄糖作為底物時的活性。結果明確的顯示，即使源自同一生物(大腸桿菌)，不同的醌蛋白脫氫酶也具有完全不同的活性最佳值和其他特性，提示了對于每種單個酶的單個表征和反應條件優(yōu)化的需求。實施例13：使用pO2傳感器，在生物反應器中確定全細胞的催化能力使用具有最大體積2L的實驗室生物反應器InforsISF100確定大腸桿菌醛糖脫氫酶的全細胞的催化能力。如下所述對反應器攪拌反應器、充氣、控制溫度和pH。當具有全醛糖脫氫酶的全細胞催化劑暴露給各種底物時，出現了不常見的耗O2量。使用pO2傳感器HamiltonOXYFERMFDA225PN237452，發(fā)現提供底物后的pO2隨時間的下降速率(耗氧量)與全細胞的催化能力的速率相關。使用全細胞催化劑大腸桿菌BL21pET30/Gcd實施實驗(制備方法如實施例1，方法1A和實施例25所述)。將全細胞催化劑溶解在磷酸鹽緩沖液(50mMKH2PO4，150mMNaCl，pH6.2)中，至生物反應器的終體積(1L)的濃度為5g/L，10g/L和20g/L。在加入底物前的初始方法參數如下：37℃，氣流速率1.0L/min(1.0VVM)，攪拌速度1000rpm，pH6.2，保持溶解氧濃度≥80％飽和。向生物反應器肉湯中提供5μMPQQ和10mMMgCl2。補料溶液是12.5％(v/v)氫氧化銨溶液，并連續(xù)補料硅酮止泡化合物synperonic止泡劑(Sigma，A-5551)。一次性加入底物(D-葡萄糖和乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯)，濃度為0.25g/L，0.5g/L和1g/L。當以肉湯提供底物時，按時間記錄耗氧量。就溶解氧水平隨時間變化的數學描述而言，所述系統是非常復雜的。一方面取決于kLa(容器性質、攪拌、充氣、培養(yǎng)基、溫度等)，另一方面取決于醛糖脫氫酶的的酶促動力學。此外，氧探針延遲的動力學也發(fā)揮了重要作用。因此，在經驗上發(fā)現：在底物的脈沖補料之后的階段直到該動力學系統中溶解氧最小值，期間的耗氧量與二次方程最相關。所研究的生物催化劑的活性潛力的良好指標是該二次方程的斜率，測量在具體時間值(例如，t＝15秒)。根據二次方程的第一導數計算斜率。該計算過程顯示了良好的可重復性和方法的線性。實施例14：從多種來源用PQQ重構醛糖脫氫酶全酶，并用DCPIP作為電子受體測定有不同的可能性通過向PQQ-依賴性醛糖脫氫酶原位提供PQQ和恰當的二價陽離子(如Mg2+和Ca2+)并且因此獲得活性醛糖脫氫酶來構建全酶。為了確定，使用了實施例11所述的人工電子受體(DCPIP組合PMS)的方法。根據方法1B或1C制備的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30或全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI、大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd、大腸桿菌BL21(DE3)pET30/GdhB、大腸桿菌BL21(DE3)pET30/GdhB_therm、大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC、大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC_RBS_YliI和pET30/DeoC_T7p_RBS_Gcd，可以如下供應PQQ：-方法14A：向活的全細胞催化劑或休眠的全細胞催化劑(5mL)加入5μMPQQ(SigmaAldrich，Germany)，10mMMgCl2(SigmaAldrich，Germany)和磷酸鹽緩沖液pH6.0(5mL)，室溫孵育10min。-方法14B：在存在10mMMgCl2的條件下，5mL培養(yǎng)的大腸桿菌JM109pGEM/pqqA-E的上清液(如方法7D所述獲得的裂解物)，補充全細胞催化劑或休眠的細胞催化劑(5mL)，室溫孵育10min。-方法14C：5mL培養(yǎng)的中間克呂沃爾菌或氧化葡糖桿菌的上清液(其培養(yǎng)分別描述在實施例10和實施例11中)，補充全細胞催化劑或休眠的細胞催化劑(5mL)。離心培養(yǎng)物(10000g，5min，4℃)后獲得上清液，在懸浮存在10mMMgCl2的條件下，室溫孵育10min。按相同的體積比，用磷酸鹽緩沖液pH＝6.0和10mMMgCl2補充進行過方法1B或1C的活的全細胞催化劑或休眠的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI+pqqA-E(5mL)，室溫孵育10min。在存在人工電子受體DCPIP的條件下，進行實施例11所述的方法，在96孔微滴度板中測試所有反應混合物將乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯轉化為乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯的能力。符號：“＊”-反應的pH值為6.0在大腸桿菌BL21(DE3)細胞中誘導質粒pET30、pET30/YliI、pET30/Gcd、pET30/GdhB、pET30a/GdhB_therm表達時(按方法1A)，加入5μMPQQ和10mMMgCl2，揭示了與在反應前立刻添加相似的結果。實施例15：用包含在活的全細胞催化劑中的各種醛糖脫氫酶氧化內半縮醛乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯測試含有醛糖脫氫酶(各種酶分別描述在實施例1、7、8、9和10中)的各種活的全細胞催化劑將乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯生物轉化為乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯。按方法1B所述制備活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30a、大腸桿菌BL21(DE3)pET30a/YliI、大腸桿菌BL21(DE3)pET30a/Gcd、大腸桿菌BL21(DE3)pET30a/GdhB、大腸桿菌BL21(DE3)pET30a/GdhB_therm(制備描述在實施例1中)。實施反應時，將9mL上述活的全細胞催化劑的樣品轉移到100mLErlenmeyer搖瓶中。反應混合物補充了1μMPQQ(10μL的1mM預先制備的PQQ儲液，Sigma)和10mMMgCl2(2.5μL的4M預先制備的MgCl2儲液，Sigma)。按方法1B所述制備活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30a/YliI+pqqA-E(制備描述在實施例7中)。實施反應時，將9mL上述細胞的樣品轉移到100mLErlenmeyer搖瓶中。按方法1B所述制備活的全細胞催化劑中間克呂沃爾菌(實施例10)和氧化葡糖桿菌(實施例11)。實施反應時，將9mL上述細胞的樣品轉移到100mLErlenmeyer搖瓶中。將乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯溶解在磷酸鹽緩沖液(50mMKH2PO4，150mMNaCl，pH6.0)中，濃度為2mol/L。濃縮的活的全細胞催化劑的所有樣品補充了1mL2mol/L乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯。在旋轉搖床上，37℃、250rpm下進行反應6小時。在時間0’、60’、120’、180’、240’、300’和360’，采集樣品。用乙腈稀釋每個樣品50倍，用于GC-MS分析。下表顯示了時間0’、180’和360’時的結果。反應的主要產物具有與通過現有技術所述的化學氧化獲得的乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯相同的滯留時間和離子分布。在360min后，用等體積的乙酸乙酯提取反應混合物5次，收集所有的有機級分，并在旋轉蒸發(fā)儀上干燥。最后獲得黃色油狀物。得到的產物的結構用NMR驗證，與現有技術報道的相同。1HNMR(300MHz，丙酮-d6)δ4.88(m，1H)，4.45(d，J＝3.0Hz，1H)，4.38(hex，J＝3.0Hz，1H)，4.23(dd，J＝3.5Hz，J＝12.0Hz，1H)，4.16(dd，J＝5.5Hz，J＝12.1Hz，1H)，2.68(dd，J＝4.3Hz，J＝17.5HZ，1H)，2.51(dddd，J＝0.8Hz，J＝2.0Hz，J＝3.3Hz，J＝17.5Hz，1H)，2.03(s，3H)，1.91(m，2H)，13CNMR(75MHz，丙酮-d6)δ170.8、169.7、74.2、66.5、62.7、39.1、32.3、20.6。使用大腸桿菌BL21(DE3)pET30作為陰性對照。在上述相同的條件下進行反應，反應結束時，觀察到少量的乙酸((2S.4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯。然而，并非所有提供的乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯都保持未被接觸。轉化的原因是當提供PQQ和MgCl2時，激活了存在于大腸桿菌中的內源性醌蛋白脫氫酶(YliI和Gcd))，形成了全酶。實施例16：使用DERA醛縮酶和醛糖脫氫酶(YliI或Gcd)的系列反應，用于從乙酰氧基乙醛和乙醛生產乙酸((2S.4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯根據方法1B，按實施例5所述，制備活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC。將5mL活的全細胞催化劑轉移到100mLErlenmeyer搖瓶中。制備乙酰氧基乙醛和乙醛的儲液。將600.5mg乙酰氧基乙醛(在本實驗室中化學合成所述化合物，顯示為85％純度)和467.2mg乙醛(購自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸鹽緩沖液pH6.0中，至終體積10mL。在0’時，向反應混合物中加入1mL所述乙酰氧基乙醛和乙醛的儲液。在旋轉搖床上，37℃、250rpm實施反應3小時。3小時后，將補充了1μMPQQ(SigmaAldrich，Germany)和10mMMgCl2(SigmaAldrich，Germany)的5mL活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI(根據方法1B按實施例1所述制備)，加入到同一Erlenmeyer搖瓶中。在旋轉搖床上，37℃、250rpm再保留氧化反應3小時。在0’、60’、120’、180’、240’、300’和360’時，采集樣品。用乙腈稀釋每個樣品50倍，用于GC-MS分析。反應的主要產物具有與通過現有技術所述的化學氧化獲得的乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯相同的滯留時間和離子分布。在360’后，觀察到12.3g/L乙酸((2S.4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯，代表64％摩爾產率。使用活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd(根據方法1B按實施例1所述制備)，實施上述相同的方法。在360’od后，向含大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反應混合物添加5ml活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd活的全細胞催化劑。觀察到14.45g/L乙酸((2S.4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯，代表75％摩爾產率。實施例17：使用DERA醛縮酶和醛糖脫氫酶(Gcd)同時反應，從乙酰氧基乙醛和乙醛生產乙酸((2S.4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯按方法1B所述，制備活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC(分別按實施例1和5所述制備)。將兩種活的全細胞催化劑按相同的體積比(5mL)轉移到100mLErlenmeyer搖瓶中。設置兩種不同的反應，都存在活的全細胞催化劑。第一種反應混合物補充了5μMPQQ(SigmaAldrich，Germany)和10mMMgCl2(SigmaAldrich，Germany)，而第二種用作對照，僅存在脫輔基的醛糖脫氫酶。制備乙酰氧基乙醛和乙醛的儲液。將1.201g乙酰氧基乙醛(在本實驗室中化學合成所述化合物，顯示為85％純度)和934.4mg乙醛(購自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸鹽緩沖液pH6.0中，至終體積10mL。在0’時，向反應混合物中加入1mL所述乙酰氧基乙醛和乙醛的儲液。乙酰氧基乙醛和乙醛的最終濃度分別是100mM和210mM。反應在37℃、250rpm實施6小時。在0’、60’、120’、180’、240’、300’和360’時，采集樣品。用乙腈稀釋每個樣品50倍，用于GC-MS分析。反應的主要產物具有與通過現有技術所述的化學氧化獲得的乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯相同的滯留時間和離子分布。在存在脫氫酶全酶的第一反應混合物中，在360’后，觀察到13.6g/L乙酸((2S.4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯，代表71％摩爾產率。在360’后，僅觀察到少量的內半縮醛乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯，然而，此時仍然存在底物(乙醛和乙酰氧基乙醛)和中間物((S)-(4-hydroxyoxtetan-2-基)甲基乙酸酯)。與此同時，在僅存在脫輔基脫氫酶并且因此在反應中僅DERA醛縮酶具有活性的第二反應混合物中，僅產生9.55g/L的內半縮醛內半縮醛乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯。上述顯示：用醛糖脫氫酶(Gcd)的反應步驟比用醛縮酶酶(DERA)催化的步驟更快，醛糖脫氫酶的存在使DERA反應步驟的穩(wěn)態(tài)平衡移向產物，而同時與醛糖脫氫酶(Gcd)的反應實際上改善了向內酯(化合物I)的整體速率。實施例18：包含在單個微生物的活的全細胞催化劑中的DERA醛縮酶和醛糖脫氫酶(YliI或Gcd)的用于從乙酰氧基乙醛和乙醛生產乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯的同時反應下列實施例提供了由活的微生物提供的合成生物學通路，所述通路能夠從簡單便宜的分子：乙酰氧基乙醛和乙醛，生產高度對映異構純的乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯。按方法1A所述，制備活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC_RBS_YliI和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC_T7p_RBS_Gcd(按實施例6所述制備)。分別通過離心(5000g，10min)濃縮所述全細胞催化劑，并將沉淀重懸在十分之一初始體積的相同上清液中。拋棄多余的上清液。將10mL所述濃縮的活的全細胞催化劑轉移到100mLErlenmeyer搖瓶中。向細胞肉湯中補充5μMPQQ和10mMMgCl2，用氨溶液將肉湯的pH值調節(jié)為6.0。制備包含乙酰氧基乙醛和乙醛的儲液。將1.201g乙酰氧基乙醛(在本實驗室中化學合成所述化合物，顯示為85％純度)和934.4mg乙醛(購自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸鹽緩沖液pH6.0中，至終體積10mL。在0’時，向反應混合物中加入1mL所述乙酰氧基乙醛和乙醛的儲液。乙酰氧基乙醛和乙醛在反應混合物中的終濃度分別是100mM和210mM。反應在37℃、250rpm實施6小時。在0’、60’、120’、180’、240’、300’和360’時，采集樣品。用乙腈稀釋每個樣品50倍，用于GC-MS分析。反應的主要產物具有與通過現有技術所述的化學氧化獲得的乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯相同的滯留時間和離子分布。在存在大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC_RBS_YliI作為催化劑時，在360’后，觀察到7.80g/L乙酸((2S.4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯，代表41％摩爾產率。在同一時間，在存在大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC_T7p_RBS_Gcd的條件下實施反應時，360’后，觀察到13.12g/L的乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯，代表69％摩爾產率。實施例19：包含DERA醛縮酶和活的全細胞催化劑中間克呂沃爾菌用于從乙酰氧基乙醛和乙醛生產乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯的同時反應按方法1B所述，制備活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC和中間克呂沃爾菌(分別按實施例1和11所述制備)。將兩種活的全細胞催化劑以相同的體積比(5mL)轉移到100mLErlenmeyer搖瓶中。制備乙酰氧基乙醛和乙醛的儲液。將1.201g乙酰氧基乙醛(在本實驗室中化學合成所述化合物，顯示為85％純度)和934.4mg乙醛(購自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸鹽緩沖液pH6.0中，至終體積10mL。在0’時，向反應混合物中加入1mL所述乙酰氧基乙醛和乙醛的儲液。乙酰氧基乙醛和乙醛在反應混合物中的終濃度分別是100mM和210mM。反應在37℃、250rpm實施6小時。在0’、60’、120’、180’、240’、300’和360’時，采集樣品。用乙腈稀釋每個樣品50倍，用于GC-MS分析。反應的主要產物具有與通過現有技術所述的化學氧化獲得的乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯相同的滯留時間和離子分布。在360’后，觀察到10.40g/L乙酸((2S.4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯，代表54％摩爾產率。實施例20：使用DERA醛縮酶和醛糖脫氫酶(Yli或Gcd)生產((4R,6S)-6-(氯甲基)-4-羥基四氫-2H-吡喃-2-酮)的同時反應按方法1B所述，制備活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI、大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC(分別按實施例1和5所述制備)。將6mL活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC，和3mL大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI或大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd轉移到50mL聚苯乙烯錐形管(BDFalcon,USA)中。反應混合物補充了1μMPQQ(SigmaAldrich，Germany)和10mMMgCl2。制備氯乙醛和乙醛的儲液。將817μL氯乙醛溶液(在H2O中50wt.％，購自Aldrich，USA)和500.6mg乙醛(購自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸鹽緩沖液pH6.0中，至終體積5mL。在0’時，向反應混合物中加入1mL所述氯乙醛和乙醛的儲液——總反應體積因此是10mL，且氯乙醛和乙醛在反應混合物中的起始濃度分別是100mM和225mM。反應在37℃、200rpm下水浴振蕩實施2小時。用氣相色譜監(jiān)控反應進程。120min后，用等體積的乙酸乙酯抽提反應混合物3次，收集所有的有機級分，在旋轉蒸發(fā)儀中干燥。在組合大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反應后，還剩余66mg(36.2％產率)的干燥產物(4R,6S)-6-(氯甲基)-4-羥基四氫-2H-吡喃-2-酮，在組合大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反應后，還剩余72mg(39％產率)的干燥產物。用NMR分析產物。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ5.01(m，1H)，4.47(m，1H)，3.80(m，1H)，3.68(m，1H)，2.69(d，J＝3.6Hz，2H)，2.09(m，1H)，1.97(m，1H)。13CNMR(75MHz，CDCl3)δ170.2、74.8、62.5、46.6、38.5、32.8。實施例21：使用DERA醛縮酶和醛糖脫氫酶(YliI或Gcd)生產((4R,6S)-6-(二甲氧甲基)-4-羥基四氫-2H-吡喃-2-酮)的同時反應按方法1B所述，制備活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI、大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC(分別按實施例1和5所述制備)。將6mL活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC，和3mL大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI或大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd轉移到50mL聚苯乙烯錐形管(BDFalcon,USA)中。反應混合物補充了1μMPQQ(SigmaAldrich，Germany)和10mMMgCl2。制備二甲氧乙醛和乙醛的儲液。將868μL的2,2-二甲氧乙醛溶液(在H2O中60wt.％，購自Fluka，USA)和500.6mg乙醛(購自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸鹽緩沖液pH6.0中，至終體積5mL。在0’時，向反應混合物中加入1mL所述二甲氧乙醛和乙醛的儲液——總反應體積因此是10mL，并且二甲氧乙醛和乙醛在反應混合物中的起始濃度分別是100mM和225mM。反應在37℃、200rpm下水浴振蕩實施2小時。用氣相色譜監(jiān)控反應進程。120min后，用等體積的乙酸乙酯抽提反應混合物3次，收集所有的有機級分，在旋轉蒸發(fā)儀中干燥。在組合大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反應后，還剩余53mg(25.3％產率)的干燥產物(4R,6S)-6-(二甲氧甲基)-4-羥基四氫-2H-吡喃-2-酮，在組合大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反應后，還剩余67mg(31.9％產率)的干燥產物。用NMR分析產物。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ4.74(五重峰，J＝3.5Hz，1H)，4.43(m，2H)，3.49(s，3H)，3.47(s，3H)，3.10(brs，1H)，2.72(dd，J＝3.5Hz，J＝17.8Hz，2H)，2.62(m，2H)，1.99(m，2H)。實施例22：使用DERA醛縮酶和醛糖脫氫酶(YliI或Gcd)生產((4R,6S)-6-(芐氧甲基)-4-羥基四氫-2H-吡喃-2-酮)的同時反應按方法1B所述，制備活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI、大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC(分別按實施例1和5所述制備)。將6mL活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC，和3mL大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI或大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd轉移到50mL聚苯乙烯錐形管(BDFalcon,USA)中。反應混合物補充了1μMPQQ(SigmaAldrich，Germany)和10mMMgCl2。制備芐氧乙醛和乙醛的儲液。將774.1mg芐氧乙醛(購自Fluka，USA)和500.6mg乙醛(購自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸鹽緩沖液pH6.0中，至終體積5mL。在0’時，向反應混合物中加入1mL所述芐氧乙醛和乙醛的儲液——總反應體積因此是10mL，并且芐氧乙醛和乙醛在反應混合物中的起始濃度分別是100mM和225mM。反應在37℃、200rpm下水浴振蕩實施2小時。用氣相色譜監(jiān)控反應進程。120min后，用等體積的乙酸乙酯抽提反應混合物3次，收集所有的有機級分，在旋轉蒸發(fā)儀中干燥。在組合大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反應后，還剩余51mg(19.6％產率)的干燥產物(4R,6S)-6-(芐氧甲基)-4-羥基四氫-2H-吡喃-2-酮，在組合大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反應后，還剩余56mg(21.5％產率)的干燥產物。粗制產物溶解在二氯甲烷中，與TBDMSCl和咪唑反應24h。濃縮溶液，并通過層析純化，產生TBDMSCl保護的化合物((4R,6S)-6-(芐氧甲基)-4-羥基四氫-2H-吡喃-2-酮)，其用NMR分析。1HNMR(500MHz，CDCl3)δ7.36(m，5H)，5.17(s，2H)，4.93(五重峰，J＝4.7Hz，1H)，4.38(dd，J＝3.4Hz，J＝11.8Hz，1H)，4.35(五重峰，J＝3.3Hz，1H)，4.27(dd，J＝4.7Hz，J＝11.8Hz，1H)，2.58(d，J＝3.3Hz，2H)，1.85(m，2H)，0.88(s，9H)，0.09(s，3H)，0.08(s，3H)，13CNMR(125MHz，CDCl3)δ154.8、134.8、128.7、128.6、128.4、73.2、70.0、68.8、63.2、39.0、32.2、25.6、17.8、-5.0。實施例23：使用DERA醛縮酶和醛糖脫氫酶(YliI或Gcd)生產((4R,6R)-4-羥基-6-甲基四氫-2H-吡喃-2-酮)的同時反應按方法1B所述，制備活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI、大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC(分別按實施例1和5所述制備)。將6mL活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC，和3mL大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI或大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd轉移到50mL聚苯乙烯錐形管(BDFalcon,USA)中。反應混合物補充了1μMPQQ(SigmaAldrich，Germany)和10mMMgCl2。制備乙醛的儲液。將445mg乙醛(購自Fluka，USA)溶解在冰冷的磷酸鹽緩沖液pH6.0中，至終體積5mL。在0’時，向反應混合物中加入1mL所述乙醛的儲液——總反應體積因此是10mL，并且乙醛在反應混合物中的最終濃度是200mM。反應在37℃、200rpm下水浴振蕩實施2小時。用氣相色譜監(jiān)控反應進程。120min后，用等體積的乙酸乙酯抽提反應混合物3次，收集所有的有機級分，在旋轉蒸發(fā)儀中干燥。在組合大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反應后，還剩余99mg(34.1％產率)的干燥產物(4R,6R)-4-羥基-6-甲基四氫-2H-吡喃-2-酮，在組合大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC的反應后，還剩余110mg(37.9％產率)的干燥產物。用NMR分析產物。1HNMR(300MHz，丙酮-d6)δ4.76(dq，Jd＝11.2Hz，Jq＝3.2Hz，1H)，4.41-4.15(m，2H)，2.63(dd，J＝4.3Hz，J＝17.0Hz，1H)，2.46(ddd，J＝1.7Hz，J＝3.3Hz，J＝17.0Hz，1H)，1.92(m，1H)，1.71(dd，J＝3.0Hz，J＝14.3Hz，1H)，1.29(d，J＝6.4Hz，3H)。13CNMR(75MHz，丙酮-d6)δ170.6、72.7、63.1、39.1、38.2、21.8。實施例24：高細胞密度生產活的全細胞催化劑和從乙酰氧基乙醛和乙醛單罐裝(onepot)順序生產乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯在使用最大體積2L的實驗室生物反應器InforsISF100的“補料分批”生物方法中，制備活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI+pqqA-E和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC(分別按實施例7和4所述制備)的高細胞密度培養(yǎng)物。如下文所述對反應器進行攪拌、充氣、控制溫度和pH。在消耗了培養(yǎng)基中提供的初始底物后，分別向方法中連續(xù)補料氨和葡萄糖作為氮源和碳源。培養(yǎng)基的組成和制備如下：13.3g/LKH2PO4、1.7g/L檸檬酸、60mg/L檸檬酸Fe(III)、40g/LD-葡萄糖、8mg/LZn(CH3COO)2·2H2O、1g/L(NH4)2HPO4、2.7g/LMgSO4·7H2O和10mL/L礦物質溶液。預先制備礦物質溶液如下：1.5g/LMnCl2·4H2O、0.3g/LH3BO3、0.25g/LNaMoO4·2H2O、0.25g/LCoCl2·6H2O、0.15g/LCuCl2·2H2O、0.84g/LEDTA、1g/LNa2PO4·2H2O。為了阻止沉淀，根據特定規(guī)程制備初始培養(yǎng)基：作為溶液順序添加KH2PO4、檸檬酸Fe(III)、礦物質溶液、Zn(CH3COO)2·2H2O和(NH4)2HPO4，至約二分之一終體積。在高壓蒸汽滅菌(121℃下20min)后，在用12.5％(v/v)氨水溶液調節(jié)pH至6.8之后/之前，加入葡萄糖、MgSO4·7H2O和卡那霉素(25mg/mL)的無菌溶液。加入無菌蒸餾水，調節(jié)生物反應器中的終體積(1L)。上述溶液分別被過濾(0.2μm)滅菌。補料溶液是12.5％(v/v)氨水溶液、硅氧烷止泡化合物synperonic止泡劑(Sigma，A-5551)和50％(w/v)葡萄糖。對于兩種培養(yǎng)物都提供50mL對數生長期的搖瓶培養(yǎng)物的接種。用來自新鮮劃線的VD瓊脂平板，并預先培養(yǎng)至對數后期(37℃，250rpm，8h)的所述全細胞催化劑的單菌落，接種VD培養(yǎng)基(50mL；10g/Lbacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/LNaCl，4g/LNaH2PO4·2H2O，用1MNaOH調節(jié)pH至pH＝7.0)。接種時的初始方法參數如下：25℃，空氣流速1.5L/min(1.5VVM)，攪拌速度800rpm，pH6.8。在培養(yǎng)過程中，通過pO2/震蕩速率控制環(huán)路(pO2/agitationratecontrolloop)和pO2/空氣流比例控制環(huán)路(pO2/airflowrationcontrolloop)，保持溶解的氧濃度≥20％飽和，至生物過程結束時(接近0％)，而生物反應器的能力達到最大值(攪拌速度2000rpm，充氣3L/min)。在整個過程中，使用pH傳感器控制型外部泵，保持pH為6.8，所述泵在pH降至低于6.8時向生物反應器提供氨溶液脈沖。在耗盡初始培養(yǎng)基中存在的葡萄糖后，觀察到pO2和pH水平的明顯升高(進入方法約10-12h)。此時，開始用50％(w/v)葡萄糖補料，并手動調節(jié)至接近指數曲線(補料開始使用0.1mL/min，在24h周期結束時使用0.6mL/min)?？梢酝ㄟ^底物供應控制方法；當葡萄糖濃度保持在動態(tài)0時，葡萄糖溶液流控制了培養(yǎng)物的呼吸速率。以該方式可以成功的克服關于供氧和熱傳遞的技術限制。在補料期開始6小時后，通過添加0.05mMIPTG(SigmaAldrich，Germany)誘導大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI+pqqA-E培養(yǎng)物中的蛋白質YliI表達。在補料期開始6小時后，通過添加0.1mMIPTG(SigmaAldrich，Germany)誘導大腸桿菌BL21(DE3)pET30a/DeoC培養(yǎng)物中的蛋白質DeoC表達。方法的總時長是34-42h，獲得了水平在200至240g/L之間的生物質濕重。將大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI+pqqA-E的高密度培養(yǎng)物冷卻至15℃，保持在輕轉速和充氣的反應器(400rpm，0.5L/min)中直到用于反應(5h)。將大腸桿菌BL21(DE3)pET30a/DeoC的高密度培養(yǎng)物保持在生物反應器中，以800rpm攪拌。將溫度升高至37℃，用可編程的泵向反應混合物中加入56.6g乙酰氧基乙醛和120mL水稀釋的乙醛(45.4g)。在30分鐘內，以恒定流速添加乙酰氧基乙醛的總量。如下表所述，在3小時實踐跨度內連續(xù)添加乙醛：在反應過程中，使用12.5％(v/v)氨水溶液和生物反應器的傳感器依賴性pH校正功能，將pH保持在5.8。在反應3h后，從反應器中去除一些反應混合物，留下1L反應混合物(在37℃下以800rpm攪拌)。將預熱至37℃的大腸桿菌BL21(DE3)pET30/YliI+pqqA-E的高密度培養(yǎng)物0.5L加入到反應混合物中，并提供充氣(1L/min)。保持反應混合物6小時，在此期間，向混合物中加入0.1mL/min甘油，并用12.5％(v/v)氨水溶液維持pH在5.8。6小時后終止反應。使用5MHCl溶液將pH降低至5，將反應混合物的總體積轉移到普通玻璃容器中，與1.5L乙酸乙酯混合，實施“總肉湯”抽提方法。收集有機相，并向水相中再加入1.5L乙酸乙酯。整個方法重復5次。合并收集到的有機相級分，加入200g無水硫酸鈉(為了結合乙酸乙酯溶解的水)并將其濾出。然后，通過在37℃低壓蒸發(fā)去除溶劑。剩余物質(82.6g)是黃色至琥珀色油狀物，在RT下與蜂蜜相似。后續(xù)分析使用1HNMR和GC-MS驗證了乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯的結構，層析純度為52％。反應的整體摩爾產率據估計是42.5％。實施例25：高細胞密度生產活的全細胞催化劑和從乙酰氧基乙醛和乙醛單罐裝(onepot)順序生產乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯在使用最大體積2L的實驗室生物反應器Infors-ISF100的“補料分批”生物方法中，制備活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd和大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC(分別按實施例1和5所述構建)的高細胞密度培養(yǎng)物。如下文所述對反應器進行攪拌、充氣、控制溫度和pH。在消耗了培養(yǎng)基中提供的初始底物后，分別向方法中連續(xù)補料氨和葡萄糖作為氮源和碳源。培養(yǎng)基的組成和制備如下：13.3g/LKH2PO4、1.7g/L檸檬酸、60mg/L檸檬酸Fe(III)、40g/LD-葡萄糖、8mg/LZn(CH3COO)2·2H2O、1g/L(NH4)2HPO4、2.7g/LMgSO4·7H2O和10mL/L礦物質溶液。預先制備礦物質溶液如下：1.5g/LMnCl2·4H2O、0.3g/LH3BO3、0.25g/LNaMoO4·2H2O、0.25g/LCoCl2·6H2O、0.15g/LCuCl2·2H2O、0.84g/LEDTA、1g/LNa2PO4·2H2O。為了阻止沉淀，根據特定規(guī)程制備初始培養(yǎng)基：作為溶液順序添加KH2PO4、檸檬酸Fe(III)、礦物質溶液、Zn(CH3COO)2·2H2O和(NH4)2HPO4，至約二分之一終體積。在高壓蒸汽滅菌(121℃下20min)后，在用12.5％(v/v)氨水溶液調節(jié)pH至6.8之后/之前，加入葡萄糖、MgSO4·7H2O和卡那霉素(25mg/mL)的無菌溶液。加入無菌蒸餾水，調節(jié)生物反應器中的終體積(1L)。上述溶液分別被過濾(0.2μm)滅菌。補料溶液是12.5％(v/v)氨水溶液、硅氧烷止泡化合物synperonic止泡劑(Sigma，A-5551)和50％(w/v)葡萄糖。對于兩種培養(yǎng)物都提供50mL對數生長期的搖瓶培養(yǎng)物的接種。用來自新鮮劃線的VD瓊脂平板，并預先培養(yǎng)至對數后期(37℃，250rpm，8h)的所述全細胞催化劑的單菌落，接種VD培養(yǎng)基(50mL；10g/Lbacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/LNaCl，4g/LNaH2PO4·2H2O，用1MNaOH調節(jié)pH至pH＝7.0)。接種時的初始方法參數如下：25℃，空氣流速1.5L/min(1.5VVM)，攪拌速度800rpm，pH6.8。在培養(yǎng)過程中，通過pO2/震蕩速率控制環(huán)路(pO2/agitationratecontrolloop)和pO2/空氣流比例控制環(huán)路(pO2/airflowrationcontrolloop)，保持溶解的氧濃度≥20％飽和，至生物過程結束時(接近0％)，而生物反應器的能力達到最大值(攪拌速度2000rpm，充氣3L/min)。在整個過程中，使用pH傳感器控制型外部泵，保持pH為6.8，所述泵在pH降至低于6.8時向生物反應器提供氨溶液脈沖。在耗盡初始培養(yǎng)基中存在的葡萄糖后，觀察到pO2和pH水平的明顯升高(進入方法約10-12h)。此時，開始用50％(w/v)葡萄糖補料，并手動調節(jié)至接近指數曲線(補料開始使用0.1mL/min，在24h周期結束時使用0.6mL/min)?？梢酝ㄟ^底物供應控制方法；當葡萄糖濃度保持在動態(tài)0時，葡萄糖溶液流控制了培養(yǎng)物的呼吸速率。以該方式可以成功的克服關于供氧和熱傳遞的技術限制。在補料期開始6小時后，通過添加0.1mMIPTG(SigmaAldrich，Germany)誘導大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd培養(yǎng)物中的蛋白質Gcd表達。在補料期開始6小時后，通過添加0.2mMIPTG(SigmaAldrich，Germany)誘導大腸桿菌BL21(DE3)pET30a/DeoC培養(yǎng)物中的蛋白質DeoC表達。方法的總時長是34-42h，獲得了水平在150至200g/L之間的生物質濕重。將大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd的高密度培養(yǎng)物冷卻至15℃，保持在輕轉速和充氣的反應器(400rpm，0.5L/min)中直到用于反應(5h)。將592ml大腸桿菌BL21(DE3)pET30a/DeoC的高密度培養(yǎng)物保持在生物反應器中，以1300rpm攪拌。將溫度升高至37℃，制備39.30g乙酰氧基乙醛和100mL水稀釋的乙醛(48.46g)。在27分鐘內，以恒定流速添加乙酰氧基乙醛的總量。如下表所述，在90分鐘實踐跨度內用可編程的泵向反應混合物連續(xù)添加乙醛溶液：時間[min]0306090添加的乙醛溶液體積[mL]0.0052.5071.7577.00流速[mL/min]1.7500.6420.1750.000在反應過程中，使用12.5％(v/v)氨水溶液和生物反應器的傳感器依賴性pH校正功能，將pH保持在5.8。在反應30min后，加入另外70mL大腸桿菌BL21(DE3)pET30a/DeoC的高密度培養(yǎng)物。在反應2h后，留下的735mL反應混合物在37℃下以1400rpm攪拌。GC-FID分析顯示：在反應結束時，存在濃度為75.6/L的乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯。將183mL預熱至37℃的大腸桿菌BL21(DE3)pET30/Gcd的高密度培養(yǎng)物加入到反應混合物中，并提供充氣(1.4L/min)。分別加入MgCl2和PQQ至其終濃度10mM和2μM，保持反應混合物攪拌10min，從而實現用PQQ完全重構Gcd酶。保持反應混合物3小時，在此期間，用12.5％(v/v)氨水溶液維持pH在6.2。在第二步反應開始65min后，將攪拌速度降低至1200rpm，充氣流速降低至1.2L/min。在第二步反應開始137min后，再次將攪拌速度降低至1000rpm，充氣流速降低至1.0L/min。GC-FID分析顯示：在反應結束時，存在濃度為58.6g/L的乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯。在該步中，根據GC-FID結果計算，從乙酸((2S,4R)-4,6-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯轉化為乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯的轉化產率高于95％。3小時后終止反應，使用5M磷酸溶液將pH降低至4.0，將反應混合物的總體積轉移到普通玻璃容器中，其中加入200g/LNa2SO4，再用5M磷酸將pH校正為4.0，與920mL乙酸乙酯混合(1:1)，實施“總肉湯”抽提方法。收集有機相，并向水相中再加入920mL乙酸乙酯。整個方法重復5次。合并收集到的有機相級分，加入～150g無水硫酸鎂(為了從乙酸乙酯相中去除水)并將其濾出。然后，通過在40℃低壓蒸發(fā)去除溶劑。剩余物質(51.1g)是黃色至琥珀色油狀物，在RT下與蜂蜜類似，所述物質是使用1HNMR和GC-MS來分析的，所述1HNMR和GC-MS驗證了乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯的結構，層析純度(GC-FID)為78.6％。兩步順序酶促反應的整體摩爾產率據計算為81.6％。實施例26：高細胞密度生產活的全細胞催化劑和從乙酰氧基乙醛和乙醛單罐裝(onepot)同時生產乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯在使用最大體積2L的實驗室生物反應器Infors-ISF100的“補料分批”生物方法中，制備活的全細胞催化劑大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC_T7p_RBS_Gcd(按實施例6所述制備)的高細胞密度培養(yǎng)物。如下文所述對反應器進行攪拌、充氣、控制溫度和pH。在消耗了培養(yǎng)基中提供的初始底物后，分別向方法中連續(xù)補料氨和葡萄糖作為氮源和碳源。培養(yǎng)基的組成和制備如下：13.3g/LKH2PO4、1.7g/L檸檬酸、60mg/L檸檬酸Fe(III)、40g/LD-葡萄糖、8mg/LZn(CH3COO)2·2H2O、1g/L(NH4)2HPO4、2.7g/LMgSO4·7H2O和10mL/L礦物質溶液。預先制備礦物質溶液如下：1.5g/LMnCl2·4H2O、0.3g/LH3BO3、0.25g/LNaMoO4·2H2O、0.25g/LCoCl2·6H2O、0.15g/LCuCl2·2H2O、0.84g/LEDTA、1g/LNa2PO4·2H2O。為了阻止沉淀，根據特定規(guī)程制備初始培養(yǎng)基：作為溶液順序添加KH2PO4、檸檬酸Fe(III)、礦物質溶液、Zn(CH3COO)2·2H2O和(NH4)2HPO4，至約二分之一終體積。在高壓蒸汽滅菌(121℃下20min)后，在用12.5％(v/v)氨水溶液調節(jié)pH至6.8之后/之前，加入葡萄糖、MgSO4·7H2O和卡那霉素(25mg/mL)的無菌溶液。加入無菌蒸餾水，調節(jié)生物反應器中的終體積(1L)。上述溶液分別被過濾(0.2μm)滅菌。補料溶液是12.5％(v/v)氨水溶液、硅氧烷止泡化合物synperonic止泡劑(Sigma，A-5551)和50％(w/v)葡萄糖。對于兩種培養(yǎng)物都提供50mL對數生長期的搖瓶培養(yǎng)物的接種。用來自新鮮劃線的VD瓊脂平板，并預先培養(yǎng)至對數后期(37℃，250rpm，8h)的所述全細胞催化劑的單菌落，接種VD培養(yǎng)基(50mL；10g/Lbacto酵母提取物，5g/L甘油，5g/LNaCl，4g/LNaH2PO4·2H2O，用1MNaOH調節(jié)pH至pH＝7.0)。接種時的初始方法參數如下：25℃，空氣流速1.5L/min(1.5VVM)，攪拌速度800rpm，pH6.8。在培養(yǎng)過程中，通過pO2/震蕩速率控制環(huán)路(pO2/agitationratecontrolloop)和pO2/空氣流比例控制環(huán)路(pO2/airflowrationcontrolloop)，保持溶解的氧濃度≥20％飽和，至生物過程結束時(接近0％)，而生物反應器的能力達到最大值(攪拌速度2000rpm，充氣3L/min)。在整個過程中，使用pH傳感器控制型外部泵，保持pH為6.8，所述泵在pH降至低于6.8時向生物反應器提供氨溶液脈沖。在耗盡初始培養(yǎng)基中存在的葡萄糖后，觀察到pO2和pH水平的明顯升高(進入方法約10-12h)。此時，開始用50％(w/v)葡萄糖補料，并手動調節(jié)至接近指數曲線(補料開始使用0.1mL/min，在24h周期結束時使用0.6mL/min)?？梢酝ㄟ^底物供應控制方法；當葡萄糖濃度保持在動態(tài)0時，葡萄糖溶液流控制了培養(yǎng)物的呼吸速率。以該方式可以成功的克服關于供氧和熱傳遞的技術限制。在補料期開始6小時后，通過添加0.1mMIPTG(SigmaAldrich，Germany)誘導大腸桿菌BL21(DE3)pET30/DeoC+Gcd培養(yǎng)物中的蛋白質DERA和Gcd表達。方法的總時長是34-42h，獲得了水平在150至200g/L之間的生物質濕重。將690mL大腸桿菌BL21(DE3)pET30a/DeoC+Gcd的高密度培養(yǎng)物保持在生物反應器中，以1300rpm攪拌。將溫度升高至37℃，提供充氣(1.0L/min)，并且制備32.67g乙酰氧基乙醛和100mL水稀釋的乙醛(37.00g)。分別加入MgCl2和PQQ至其終濃度為10mM和5μM，保持攪拌混合物10min，從而實現用PQQ完全重構Gcd酶。在35分鐘內，以恒定流速添加乙酰氧基乙醛的總量。如下表所述，在60分鐘的時間跨度內用可編程的泵向反應混合物連續(xù)添加乙醛溶液：時間[min]03060添加的乙醛溶液體積[mL]0.0060.0080.00流速[mL/min]2.0000.6670.000在反應過程中，使用12.5％(v/v)氨水溶液和生物反應器的傳感器依賴性pH校正功能，將pH保持在6.2。保持反應混合物3.5h，在此期間，用12.5％(v/v)氨水溶液維持pH在6.2。GC-FID分析顯示：在反應結束時，存在濃度為46.1g/L的乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯。3.5小時后終止反應，使用5M磷酸溶液將pH降低至4.0，將反應混合物的總體積轉移到普通玻璃容器中，其中加入200g/LNa2SO4，再用5M磷酸將pH校正為4.0，與800mL乙酸乙酯混合(1:1)，實施“總肉湯”抽提方法。收集有機相，并向水相中再加入800mL乙酸乙酯。整個方法重復5次。合并收集到的有機相級分，加入～150g無水硫酸鎂(為了從乙酸乙酯相中去除水)并將其濾出。然后，通過在40℃低壓蒸發(fā)去除溶劑。剩余物質(34.2g)是黃色至琥珀色油狀物，在RT下與蜂蜜類似，所述物質是使用1HNMR和GC-MS來分析的，所述1HNMR和GC-MS驗證了乙酸((2S,4R)-4-羥基-6-氧代四氫-2H-吡喃-2-基)甲基酯的結構，層析純度(GC-FID)為76.3％。兩步同時酶促反應的整體摩爾產率據計算為59.9％。參考文獻1.Achmann,S.等人，DirectdetectionofformaldehydeinairbyanovelNAD+-andglutathione-independentformaldehydedehydrogenase-basedbiosensor.Talanta75,786-91(2008).2.Adachi,O.等人，BiooxidationwithPQQ-andFAD-DependentDehydrogenases.ModernBiooxidation:Enzymes,ReactionsandApplications,Wiley-VCH,Weinheim1–41(2007).3.Adachi,O.等人，Newquinoproteinsinoxidativefermentation.BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-Proteins&Proteomics1647,10–17(2003).4.Ameyama,M.等人，Methodofenzymaticdeterminationofpyrroloquinolinequinone.Analyticalbiochemistry151,263-7(1985).5.AnthonyC,ZatmanLJ(1967)."Themicrobialoxidationofmethanol.TheprostheticgroupofthealcoholdehydrogenaseofPseudomonassp.M27:anewoxidoreductaseprostheticgroup".BiochemJ104(3):960–9.PMID6049934.PMID60499346.Anthony,C.Pyrroloquinolinequinone(PQQ)andquinoproteinenzymes.AntioxidantsandRedoxSignaling3,757–774(2001).7.Anthony,C.Thequinoproteindehydrogenasesformethanolandglucose.Archivesofbiochemistryandbiophysics428,2-9(2004).8.Cline,A.&Hu,A.Enzymaticcharacterizationandcomparisonofthreesugardehydrogenasesfromapseudomonad.JournalofBiologicalChemistry240,4493(1965).9.Cozier,G.E.,Salleh,R.A.&Anthony,C.CharacterizationofthemembranequinoproteinglucosedehydrogenasefromEscherichiacoliandcharacterizationofasite-directedmutantinwhichhistidine-262hasbeenchangedtotyrosine.BiochemicalJournal340,639(1999).10.D’Costa,E.J.,I.J.Higgins&A.P.F.Turner.1986.Quinoproteinglucosedehydrogenaseanditsapplicationinanamperometricglucosesensor.Biosensors.271-8711.Duine,J.A.Quinoproteins:enzymescontainingthequinonoidcofactorpyrroloquinolinequinone,topaquinoneortryptophan-tryptophanquinone.EuropeanJournalofBiochemistry200,271–284(1991).12.Durand,F.等人，DesigningahighlyactivesolublePQQ-glucosedehydrogenaseforefficientglucosebiosensorsandbiofuelcells.Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications402,750-4(2010).13.Gao,F.,Viry,L.,Maugey,M.,Poulin,P.,Mano,N.,Engineeringhybridnanotubewiresforhigh-powerbiofuelcells,Nat.Commun.1(2010),doi:10.1038/ncomms100014.GoodwinP.M,AnthonyC.,‘’Thebiochemistry,physisiologyandgeneticsofPQQandPQQ-containingenzymes,”Adv.Microb.Physiol.(1998)40:1-8015.GoosenN.等人,‘’AcinetobactercalcoaceticusGenesInvolvedinBiosynthesisoftheCoenzymePyrrolo-Quinoline-Quinone:NucleotideSequenceandExpressioninEscherichiacoliK-12,”JBacteriol.(1989)171:447-45516.Gupta,A.等人，Gluconobacteroxydans:itsbiotechnologicalapplications.Journalofmolecularmicrobiologyandbiotechnology3,445-56(2001).17.HaugeJG(1964)."Glucosedehydrogenaseofbacteriumanitratum:anenzymewithanovelprostheticgroup".JBiolChem239:3630–9.PMID14257587.PMID1425758718.Heller,A.和Feldman,B.,Electrochemicalglucosesensorsandtheirapplicationsindiabetesmanagement,Chem.Rev.108(2008),pp.2482–2505.FullTextviaCrossRef|ViewRecordinScopus|CitedByinScopus(77)19.HoelscherT.,GoerischH.,‘’KnockoutandOverexpressionofPyrroloquinolineQuinoneBiosyntheticGenesinGluconobacteroxydans621H,”JBacteriology(2006)188；21:7668-767620.Hommes,R.W.J.,Postma,P.W.,Neijssel,0.M.,Tempest,D.W.,Dokter,P.&Duine,J.A.(1984).Evidenceforaglucosedehydrogenaseapo-enzymeinseveralstrainsofEscherichiacofi.FEMSMicrobiolLett24,329-333.21.Igarashi,S.等人，MolecularengineeringofPQQGDHanditsapplications.Archiv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