本發(fā)明在合同編號HR0011-14-C-0082的國防部高級研究計(jì)劃署的政府支持下完成。政府對本發(fā)明擁有某些權(quán)利。引言通過在易用系統(tǒng)中的擴(kuò)增和檢測對樣品制備物的整合對于核酸診斷而言仍然是明顯挑戰(zhàn)[1]。FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了多種系統(tǒng)作為用于近-POC應(yīng)用的“中等復(fù)雜”裝置[2]，包括賽沛公司(Cepheid)的GeneXpert平臺、納米球公司(Nanosphere)的Verigene平臺、BD公司的(Becton,DickinsonandCompany)BDMax系統(tǒng)、和利亞特公司(Liat)的“管中實(shí)驗(yàn)室(lab-in-a-tube)”一次性裝置。研究文獻(xiàn)普遍是病原體檢測技術(shù)和裝置的示例；然而，沒人能夠開發(fā)一種多重、自動化、集成的設(shè)置成接受原始生物樣品的“從樣品到結(jié)果”系統(tǒng)[3]。早期示例使用電泳分離和激光誘導(dǎo)的熒光來檢測從全血中擴(kuò)增并提取的病原體DNA的存在[4]。Xu等[5]在擴(kuò)增期間使用實(shí)時(shí)熒光讀取來檢測少至100個拷貝/μl。Ferguson等[6]通過在電催化緩沖液存在下電泳檢測與納米結(jié)構(gòu)的電極上的PNA探針雜交的病毒RNA，而Lam等[7]檢測經(jīng)擴(kuò)增的ssDNA與沉積在金電極上的氧化還原標(biāo)記的分子探針的雜交。Ferguson[6]證實(shí)獲得了等于10TCID50(組織培養(yǎng)感染劑量)的LOD，其比臨床效價(jià)值低4個數(shù)量級。Lam[7]證實(shí)獲得了1個細(xì)菌/μl的LOD，雖然在摻入的尿液樣品上進(jìn)行分析時(shí)使用100CFU/μl的濃度。2組使用橫向流夾心試驗(yàn)作為其核酸檢測的基礎(chǔ)[8,9]，并且FraunhoferInstitutesivD-平臺[10]使用模塊平臺。數(shù)十年來，國防部(DoD)已經(jīng)認(rèn)識到了對現(xiàn)場便攜式生物分析的需求。最初，這種需求是為了鑒定生物威脅；然而，隨著個性化醫(yī)療的進(jìn)步，除了環(huán)境監(jiān)測以外，DoD也認(rèn)識到常規(guī)健康狀態(tài)監(jiān)測的價(jià)值以及護(hù)理點(diǎn)(POC)診斷的可及性。事實(shí)上，DARPA有多種旨在監(jiān)測生物系統(tǒng)以允許快速介入的程序。然而，盡管已有數(shù)十年的投資，還沒有在需要地點(diǎn)進(jìn)行核酸加工的市售儀器。為了填補(bǔ)這項(xiàng)空缺，SRI已經(jīng)開發(fā)并且我們在此公開了一種進(jìn)行“從樣品進(jìn)入到答案輸出”分析的便攜式、集成、可快速重構(gòu)并且自動化的生物檢測系統(tǒng)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了用于通過多序列擴(kuò)增和同時(shí)雜交讀取對一組不同核酸序列進(jìn)行平行檢測的裝置、系統(tǒng)和方法。在一個方面中，本發(fā)明提供了一種自動化核酸分析系統(tǒng)，包括在微流體連通中的樣品裂解、擴(kuò)增、PCR和檢測模塊，其設(shè)置成通過多序列擴(kuò)增和同時(shí)微陣列雜交讀取來對不同核酸序列進(jìn)行平行檢測。在實(shí)施方式中，本發(fā)明提供系統(tǒng)，其中：檢測模塊包含微陣列檢測光學(xué)器件，其包含采用漸消波激發(fā)的微陣列掃描儀；檢測模塊包含自動化雜交處理器，其設(shè)置成通過溫度提供多重嚴(yán)謹(jǐn)性；和/或PCR模塊設(shè)置成在單次反應(yīng)中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR。在實(shí)施方式中，本發(fā)明提供系統(tǒng)，其中包括包含模塊的集成微流體卡和分析儀，所述分析儀包含設(shè)置用于接受卡的容器，設(shè)置用于操作卡的操作器，和設(shè)置用于電子控制操作器的控制器，該操作器包含流體致動器、PCR熱循環(huán)儀、和自動化雜交處理器以及微陣列檢測光學(xué)器件。在實(shí)施方式中，本發(fā)明提供系統(tǒng)，其還包括設(shè)置成含有并遞送試劑至裂解、純化、PCR和檢測模塊的試劑模塊。在實(shí)施方式中，本發(fā)明提供系統(tǒng)，其是：便攜的：小于1000in3并且小于10lbs；快速的：分析低于120分鐘；多重的：同時(shí)分析超過50種靶序列；和/或自動的：在樣品導(dǎo)入和結(jié)果展示之間不需要用戶介入。在實(shí)施方式中，本發(fā)明提供系統(tǒng)，其中：樣品包含蛋白質(zhì)分析物并且系統(tǒng)進(jìn)一步設(shè)置成用包含核酸序列的標(biāo)簽來標(biāo)記蛋白質(zhì)分析物；錨定的探針通過其空間位置限定序列；使用比被分析序列的數(shù)目少的引物對數(shù)來實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增；不同核酸序列是多物種/生物體的；PCR模塊包含金屬(例如，鋁)PCR反應(yīng)腔室；微流體連通包含經(jīng)設(shè)置用于去除氣泡的透氣膜，其中透氣膜在通道層之下，使得整個通道暴露于大氣壓中(在一個具體的實(shí)施方式中，該膜跨越所述卡，因?yàn)榕c單獨(dú)的片相比其更易于被制成層，雖然其僅在通道層之下起作用)；擴(kuò)增完全包含在耗材(例如，無開口管)中；和/或檢測是基于探針組而不是引物組(易于構(gòu)建新的測試)。在實(shí)施方式中，本發(fā)明提供系統(tǒng)，其設(shè)置成：在單個容器中擴(kuò)增(無樣品裂解)；接受并處理下述分析物樣品：血液、唾液、GI樣品、尿液、傷口拭子、脊椎穿剌、鼻拭子、獸醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)來源；通過試樣收集工具或運(yùn)輸介質(zhì)接受樣品；處理1-100ul的樣品體積；是模塊化的(模塊可互換以支持不同應(yīng)用)；能夠測量(通過通道尺寸和氣泡去除進(jìn)行)；和/或是單向或自封閉的(防止樣品交叉污染)。在實(shí)施方式中，本發(fā)明提供系統(tǒng)，包括包含模塊的集成微流體卡和包含外殼(盒)的分析儀，并且在外殼內(nèi)包括設(shè)置用于接受卡的容器，其中該分析儀：接合卡以進(jìn)行裂解、純化、PCT(擴(kuò)增和標(biāo)記)、和檢測；通過壓力(例如，樣品運(yùn)輸)、磁場(例如，樣品混合)、溫度(例如，擴(kuò)增、嚴(yán)謹(jǐn)性、雜交)和/或光(例如，雜交檢測)與樣品相互作用；和/或通過將漸消波與樣品偶聯(lián)來進(jìn)行檢測以實(shí)時(shí)觀察雜交和/或確定產(chǎn)生序列信息的可能堿基對錯配和動力學(xué)。在實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包括包含模塊的集成微流體卡(筒)的系統(tǒng)，其中該卡設(shè)置成：對疾病類型有特異性(例如，呼吸道疾病)；對患者類型有特異性(例如，小兒)；對病原體類型有特異性(例如，生物戰(zhàn)試劑)；對個體有特異性(例如，藥物基因組學(xué))；含有針對患者特異性信息的獨(dú)特標(biāo)識；用于一次性使用以保持無菌并最小化交叉污染；使用輥到輥(roll-to-roll)生產(chǎn)步驟產(chǎn)生；和/或來自聚碳酸酯底架、金屬箔PCR腔室、丙烯酸組分、可呼吸膜材料、和/或聚氨酯密封。在實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了功能性集成微流體顆粒分選儀的系統(tǒng)，如熒光-活化細(xì)胞分選儀(FACS)，其設(shè)置成提供用于顆粒或細(xì)胞比對的流體力學(xué)和/或慣性聚焦并且包含設(shè)置成用于分選的微孔電活性聚合物(EAP)致動器。EAPμ-分選儀可功能性集成或納入iMFC系統(tǒng)的顆粒-濃縮/分選模塊，并且設(shè)置成允許系統(tǒng)通過將大體積的稀釋顆粒濃度濃縮(例如，以每毫升幾個細(xì)胞存在于環(huán)境樣品中的細(xì)菌)或從許多細(xì)胞的背景中分選出選擇細(xì)胞(例如，從外周血單核細(xì)胞群中分選出活化T細(xì)胞)來增加操作區(qū)域(operationenvelop)。另外，微孔電活性聚合物致動器適于在分選時(shí)的交替應(yīng)用，包括細(xì)胞捕獲、流體混合和泵送，并且因此可獨(dú)立于對象自動核酸分析系統(tǒng)提供、設(shè)置和/或操作。本發(fā)明也提供了使用公開的系統(tǒng)通過多重序列擴(kuò)增和同時(shí)微陣列雜交讀取來平行檢測不同分析物核酸序列的方法。在另一個方面中，本發(fā)明提供了設(shè)置在流體通道周圍的高效微流體電活性聚合物(μEAP)致動器，其中施加于致動器的電壓脈沖誘導(dǎo)致動器在流體通道之間產(chǎn)生瞬時(shí)交叉流，其將流體通道內(nèi)的靶顆粒偏轉(zhuǎn)到新路徑上，其中該致動器包含封閉端流體腔室，其中腔室的一個或多個表面(例如，壁、底層、頂層)包含由介電彈性體的EAP層覆蓋的電極。單個uEAP致動器可與接受由致動器驅(qū)動的流體噴射的順應(yīng)腔室(即，“風(fēng)箱”)配對。該構(gòu)造僅需要一個工作致動器，但是其仍然生成交叉流。順應(yīng)腔室可僅是沒有電子連接的致動器之一，或者其可以是不同幾何形狀的腔室，如我們用于多通道/階段分選儀那樣。雖然主要用固體電極(例如，玻璃片上的氧化銦錫(ITO)電極)例示，電極也可以或另外包括流體，如相鄰?fù)ǖ乐械膶?dǎo)電性流體。在另一個方面中，本發(fā)明提供了多種這種設(shè)置在流體通道周圍并且彼此異步的致動器，其中施加到致動器的電壓脈沖誘導(dǎo)致動器在流體通道之間產(chǎn)生瞬時(shí)交叉流，其將流體通道內(nèi)的靶顆粒偏轉(zhuǎn)到新路徑上，其中各致動器包含封閉端流體腔室，其中腔室的表面是由介電彈性體的EAP層覆蓋的電極。在另一個方面中，多種致動器是一對設(shè)置成互相180°異步的致動器。在實(shí)施方式中：-腔室的多個表面包含由介電彈性體的EAP層覆蓋的電極；-流體通道設(shè)置成提供用于顆粒的水平比對的流體力學(xué)聚焦和用于垂直比對的慣性聚焦的組合；新路徑導(dǎo)向分選輸出；流體通道包含樣品輸入通道以及分選和未分選的輸出通道，和導(dǎo)向分選輸出通道的新路徑；流體通道設(shè)置成用于熒光檢測，其中在檢測靶顆粒之后，向μEAP致動器施加電壓脈沖；-EAP層是1-50(或2-25，或5-15μm厚)；彈性體是硅酮；-致動器設(shè)置成在多通道裝置中提供平行分選；-致動器設(shè)置成向多個輸出提供多階段系列分選；和/或-致動器經(jīng)功能性集成到標(biāo)記經(jīng)活化的顆粒分選儀中。本發(fā)明還提供了制造和使用致動器的方法，如包括施加電壓脈沖以誘導(dǎo)致動器在流體通道之間產(chǎn)生瞬時(shí)交叉流的步驟，該交叉流將流體通道內(nèi)的靶顆粒偏轉(zhuǎn)到新路徑上。本發(fā)明具體提供了所述實(shí)施方式的所有組合，如同其各自已詳盡單獨(dú)列出那樣。附圖的簡要說明圖1：分子診斷系統(tǒng)的物理構(gòu)造。圖2A和B：iMGC卡。圖2C：鼻拭子的輸入模塊。圖2D：TEC排列。圖2E：在PCR和檢測處理模塊周圍的iMFC卡的截面。圖2F：具有檢測孔、光柵和鉻的玻璃基材。圖2G：玻璃基材的側(cè)視圖，顯示光如何耦合到玻璃基材中。圖2H：玻璃基材的側(cè)視圖，顯示光如何通過玻璃基材內(nèi)的總內(nèi)部反射而傳播。圖2I：與微陣列相關(guān)的照相機(jī)系統(tǒng)和TEC的排列。圖3：將核酸結(jié)合到石英玻璃料的機(jī)制。圖4：透氣膜的體積控制。圖5A和5B：控制流的閥控制機(jī)制。圖6：iMFC卡的投影圖。圖7：氣動系統(tǒng)。圖8：裝置10的物理硬件的功能框圖。圖9：顯示μEAPFAC的通道布局的EAP微分選儀示意圖。圖10：7-μm綠色熒光顆粒的條紋圖。圖11：藻紅蛋白標(biāo)記的B細(xì)胞分選。圖12：將多重分選儀整合到雙通道裝置中。圖13：將多重分選儀整合到階段式分選裝置中。具體實(shí)施方式及其實(shí)施例詳述本發(fā)明提供了便攜式廉價(jià)分子診斷系統(tǒng)，其能夠在沒有人介入的情況下產(chǎn)生結(jié)果-僅在輸入樣品和讀取結(jié)果中需要人介入。由于上述的各種技術(shù)，也非常迅速地產(chǎn)生結(jié)果。該系統(tǒng)包括接合稱為iMFC的一次性元件的方法。該方法和系統(tǒng)使得易于設(shè)置iMFC以運(yùn)行不同類型的測試，而不需要改變背后的硬件。最后，卡本身是模塊化的，易于改變用于運(yùn)行不同類型的測試。在一個方面中，本發(fā)明提供了獨(dú)立系統(tǒng)，其可獲取樣品作為輸入，進(jìn)行分子診斷步驟，并且顯示診斷測試的結(jié)果。一般而言，該步驟包括(i)提取和純化，例如，其中從輸入樣品中提取DNA樣品，該輸入樣品可以是血液、組織、尿液、唾液或其他體液；(ii)擴(kuò)增并標(biāo)記，例如，其中擴(kuò)增樣品的特定序列；(iii)雜交；(iv)嚴(yán)謹(jǐn)洗滌以去除與靶序列結(jié)合的不需要分子和(v)在完成鑒定步驟并鑒定特定序列處讀取。該系統(tǒng)一般包括稱為集成微流體卡(iMFC)的一次性元件和非一次性基本單元。集成微流體卡可通過界面方案耦合至基本單元?？赏ㄟ^控制形成卡結(jié)構(gòu)的部分的閥來實(shí)現(xiàn)iMFC中的流體流?？稍O(shè)計(jì)各卡來檢測并鑒定特定組的生物標(biāo)記物。在實(shí)施方式中，進(jìn)行樣品輸入和讀取之間的步驟而不需要任何人介入，該系統(tǒng)并不分裂樣品，該系統(tǒng)能夠鑒定至少1000個靶標(biāo)，該系統(tǒng)可在每次運(yùn)行中鑒定超過50個靶標(biāo)和/或在單個系統(tǒng)中實(shí)施所有測試步驟，和/或通過使用實(shí)時(shí)雜交，該系統(tǒng)能夠在雜交完成之前預(yù)測結(jié)果并且能夠提供與靶標(biāo)濃度相關(guān)的信息。圖1顯示了整個系統(tǒng)10。該系統(tǒng)包括單元基底20、單元蓋30和一次性集成微流體卡(iMFC)40?？ǖ脑O(shè)計(jì)是模塊，使得其可定制用于接受各種形式的樣品輸入，包括但不限于血滴、鼻拭子、痰液等，或定制用于進(jìn)行不同測試。一般而言，測試過程由首先選擇合適的卡，將樣品置于卡的輸入腔室中，將卡置于單元基底中，關(guān)上蓋并選擇合適的軟件運(yùn)行開始。一旦測試過程開始，不需要人介入。結(jié)果可顯示在以系統(tǒng)的部分集成的屏幕上，或者他們可被傳輸置外部裝置如計(jì)算機(jī)或智能手機(jī)。在測試完成之后，可處理卡并可選擇不同的卡用于下一次測試。這些步驟的順序可根據(jù)需要變化。一次性集成微流體卡?？ㄒ话銓⒍喾N功能合并在一張卡上，如裂解、純化、擴(kuò)增、標(biāo)記和檢測在典型的市售系統(tǒng)中，用多種儀器完成這些功能。我們實(shí)現(xiàn)了通過集成多種用于去除氣泡和準(zhǔn)確測量的技術(shù)和特征的功能合并、漸消場成像系統(tǒng)的整合、各種步驟中的反應(yīng)物和化學(xué)物的選擇以及快速擴(kuò)增和實(shí)時(shí)雜交等。將多功能合并到一張卡中能夠獲得CLIA豁免(CLIAwaiver)。圖2A顯示了卡的透視圖并且圖2B顯示了平面圖。圖2B也顯示了區(qū)域(虛線顯示)，其中卡內(nèi)可出現(xiàn)各種功能。例如，塊100可以是裂解塊，塊110可以是純化塊，塊120可以是發(fā)生聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)過程處，并且塊130可以是發(fā)生檢測處。含有測試樣品的流體以上述順序通過卡內(nèi)納入的通道從一個塊流向另一個塊。通過這些通道從一個塊流向另一個塊的流體流受到微型閥的控制，該閥可打開或關(guān)閉，取決于在閥處施加的壓力。裂解塊。樣品輸入也可在裂解塊中發(fā)生，圖2A和2B，塊100?？墒褂酶鞣N方法來輸入樣品，如使用血滴和鼻拭子。在一個實(shí)施方式中，卡直接接受用于收集樣品的工具。一般而言，在市售系統(tǒng)中，用于收集樣品的工具并不直接接合測試儀器。通過允許工具直接接合測試儀器，可消除污染和用戶誤差來源。因?yàn)榭ㄊ悄K，可改變裂解塊以接受各種輸入方法。參考圖2A和2B，元件102可以是接受樣品如血滴的輸入腔室。圖2C顯示了模塊化的優(yōu)勢，其中裂解塊設(shè)置成接受鼻拭子250作為輸入。對于使用血滴或鼻拭子的這兩種情況，卡40的背后設(shè)計(jì)可能是相同的；僅僅輸入模塊可能不同。除適應(yīng)各種輸入方法以外，裂解模塊可設(shè)置成進(jìn)行不同類型的裂解，如機(jī)械、化學(xué)或其他類型。參考圖2A和2B，裂解模塊顯示為具有珠磨器104，其包含填充珠的珠腔室和在珠腔室頂部固定的小電動馬達(dá)，其使珠互相碰撞。位于碰撞的珠之間的細(xì)胞裂解，使其內(nèi)容物釋放進(jìn)入裂解緩沖溶液中-機(jī)械裂解的示例。其他模塊可設(shè)置成進(jìn)行其他形式的裂解，并且這些模塊可具有比圖2A和2B中所示的不同或更少的腔室或子模塊。例如，能夠進(jìn)行化學(xué)裂解的模塊可具有代替珠磨器的另一個腔室，其中化學(xué)物(可能儲存在試劑模塊中并且在合適的時(shí)間進(jìn)入腔室)可與含有樣品的裂解緩沖溶液混合。因此，不同類型的裂解可適應(yīng)卡的相同基礎(chǔ)設(shè)計(jì)。為了起始裂解過程，使在試劑塊140中的裂解緩沖孔142中儲存的裂解緩沖溶液進(jìn)入腔室108。可通過控制微閥來實(shí)現(xiàn)控制卡內(nèi)流體流的方法。腔室108可在頂部具有透氣性裂口，使得當(dāng)液體接觸裂口時(shí)，由于腔室和大氣之間的壓力差，其被空氣封鎖，使得腔室中的空氣在其填充時(shí)流出。該裂口可由各種材料制成，如特氟隆(Teflon)。當(dāng)腔室108被填充時(shí)，可打開其與輸入腔室102之間的閥，使得緩沖溶液與輸入樣品混合。一旦裂解緩沖液和輸入樣品混合，打開輸入腔室102和珠磨器104之間的另一個閥使混合物進(jìn)入珠磨器。然后打開珠磨器頂部的電動馬達(dá)持續(xù)特定時(shí)間，之后打開珠磨器104和腔室106之間的閥并且溶液現(xiàn)在流入腔室106中。腔室106可預(yù)填充試劑，如鹽酸胍，在那里其與經(jīng)裂解的溶液混合。在與試劑的混合完成后，可打開腔室106和純化塊110之間的閥以將該混合物引向純化塊。鹽酸化使得樣品中的DNA與純化塊中基于二氧化硅的結(jié)構(gòu)結(jié)合，由此輔助純化過程。提供進(jìn)行不同類型裂解的能力、接受各種輸入方法和接受輸入方法的實(shí)際工具的構(gòu)造是有優(yōu)勢的特征，其可在裝置10中協(xié)同組合。純化塊。當(dāng)打開腔室106和純化塊之間的閥時(shí)，溶液與置于純化塊中的石英玻璃料接觸。玻璃料和盛放玻璃料的結(jié)構(gòu)在圖2A和2B中分別用112和114表示。玻璃料之間的溶液流示于圖3。該圖顯示了在玻璃料112周圍的卡的截面。該玻璃料可以是位于通道410中的形式，其可以夾在基底層400和頂蓋層430之間。基底層、頂蓋層形成盛放玻璃料的結(jié)構(gòu)114的部分。箭頭指示通道410內(nèi)的流體流。在來自腔室106的含有鹽酸胍的溶液中含有核酸的溶液將結(jié)合至玻璃料并在箭頭的方向上流動。在其流過玻璃料之后的溶液流將可被微閥引向流入殘留腔室或引向進(jìn)一步加工。因此，溶液中的DNA結(jié)合玻璃料，但不結(jié)合玻璃料的溶液其他組分如蛋白質(zhì)和脂質(zhì)流過玻璃料并且可被引導(dǎo)通過通道進(jìn)入殘留收集腔室114。在DNA結(jié)合步驟之后，進(jìn)行洗滌步驟。在乙醇儲器146中含有的乙醇允許流過玻璃料以進(jìn)行洗滌步驟從而洗去可能仍然與DNA結(jié)合的不需要的裂解物組分。然后允許乙醇干燥。純化過程中的下一步是使在洗脫緩沖液孔148中儲存的洗脫緩沖液在玻璃料上洗滌。該步驟使核酸與玻璃料解偶聯(lián)?，F(xiàn)在允許溶液進(jìn)入PCR處理塊120。在該步驟中，打開通向進(jìn)一步處理步驟(PCR處理)的閥，但關(guān)閉通向殘留腔室的閥。PCR塊。在純化塊之后，可優(yōu)選用如下所述的系統(tǒng)改動來實(shí)施聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。在由120表示的PCR塊中，并且可在如圖2A和2B中所示的多個步驟中進(jìn)行PCR。在來自純化步驟的洗脫洗滌完成之后，允許經(jīng)純化的含有核酸的溶液流入PCR主混合腔室122。在此，經(jīng)純化的溶液與凍干(冷凍干燥)的酶混合，該酶在主混合腔室結(jié)構(gòu)內(nèi)攜帶。在處理鏈中進(jìn)一步出現(xiàn)的擴(kuò)增步驟需要這些酶。主混合腔室可包含孔，其中可控制填充孔的溶液體積，允許精確體積溶液，并且避免或消除氣泡。各處理階段中的精確體積獲得結(jié)果精確性。在與酶的混合完成后，使溶液流入PCR引物腔室124，其中溶液與凍干引物混合。引物腔室也可以是孔，其中除了避免或消除在溶液中俘獲的氣泡以外，精確控制體積。在一些情況中可優(yōu)選分離包括混合主混合物和引物的混合步驟，因?yàn)檫@允許使用常用的主混合模塊并降低裝置的總體成本。另外，分成2個步驟也允許迅速展開試劑盒以測試出現(xiàn)的問題，例如，可能用不同引物制成多張卡，其可用于檢查不同靶分子的存在。引物(寡核苷酸)的凍干過程是迅速且簡單的，并且可在裝置10外部的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。因此，通過分離2個混合步驟，可改變卡以測試不同物質(zhì)，雖然如果優(yōu)選，也可在一個步驟中進(jìn)行混合過程。在與引物的混合完成之后，溶液流向PCR腔室126。在與常規(guī)市售方法(其中PCR腔室可由非金屬材料制成)不同的方法中，iMFC卡中的PCR腔室可由鈍化金屬制成，諸如但不限于鋁。金屬，尤其是鋁的使用是優(yōu)選的，因?yàn)槠湓试S在鋁腔室內(nèi)迅速控制溶液的溫度。通過使鋁腔室的頂部和底部緊密接觸熱電冷卻器(TEC)來實(shí)現(xiàn)這種迅速控制。通過將2個TEC放在PCR腔室之上或之下來得到PCR腔室和TEC之間的緊密接觸。PCR腔室上的TEC位于TEC外殼單元200內(nèi)的裝置10的蓋30上(圖1)。TEC210的面的形狀與PCR腔室126的形狀匹配使得當(dāng)關(guān)閉蓋時(shí)，TEC面可直接位于PCR腔室的上表面上。PCR腔室下的TEC簡單地放在單元基底20內(nèi)。圖2D顯示了PCR腔室如何夾在2個TEC220(具有TEC面210)和230(具有TEC面240，圖中不可見)之間。因此，TEC的這種排列與鋁PCR腔室的使用使得能夠?qū)CR混合物進(jìn)行快速溫度循環(huán)。已經(jīng)通過測量發(fā)現(xiàn)，這種組合允許溫度升高>15℃/s，精度±1℃。這種構(gòu)造然后直接導(dǎo)致縮短樣品輸入和結(jié)果輸出之間的時(shí)間。除了在由于使用鈍化鋁對溶液的快速溫度控制中獲得的優(yōu)勢以外，可實(shí)現(xiàn)另一個優(yōu)勢，即與PCR腔室使用非金屬材料所需的能量相比，需要較少的能量來加熱并冷卻溶液。較少能量直接轉(zhuǎn)換成需要較低總體能量以運(yùn)行裝置，能夠進(jìn)行任選的電池操作和場地便攜性?，F(xiàn)在參考圖2E解釋了PCR腔室126的另一個方面，其顯示了在PCR腔室和檢測塊130周圍的卡的截面。為了保留溶液的濃度，在進(jìn)行PCR過程時(shí)，應(yīng)該避免或最小化PCR腔室內(nèi)的捕獲的空氣。所述的頂部和底部截面PCR腔室可由鈍化鋁制成；因此，在此可能不使用透氣膜。因此，提供來自PCR腔室的輸出通道250，其導(dǎo)向儲器255進(jìn)而通過另一個通道257向大氣開放。因此，在腔室126填充溶液時(shí)，推出空氣并且流向大氣。在填充腔室126時(shí)，可關(guān)閉通道260中的閥。在填充過程器件，可也用溶液填充通道250和儲器255，其防止空氣返回腔室126。同時(shí)，由于通過6psi的恒定壓力驅(qū)動溶液，沒有發(fā)生從通道250或儲器255的回流。在填充腔室之后，開始PCR過程。在PCR過程結(jié)束時(shí)，擴(kuò)增并標(biāo)記所需的靶序列用于在檢測塊中檢測。檢測塊-一般說明。在PCR過程完成之后，參考圖2E，可打開通道260中的閥262，并且PCR腔室126中含有擴(kuò)增的組分(擴(kuò)增子)的溶液可流入混合腔室275。因此，溶液與可儲存在試劑塊中的雜交緩沖液孔150中的雜交緩沖液混合。在其與PCR產(chǎn)物混合之前，測量來自雜交緩沖液的溶液。在混合腔室275中的混合過程完成之后，使溶液通過通道330流入檢測腔室325。檢測腔室325、混合腔室275、將溶液從腔室中輸入和輸出的通道都形成圖2B所示的檢測塊130的部分。接著，在檢測腔室內(nèi)，可使與雜交緩沖液混合的PCR產(chǎn)物流到DNA微陣列上。這出現(xiàn)在孔317中，如圖2F所示，其中盛放溶液的孔和微陣列315置于孔的底部。因此，對于這種構(gòu)造，溶液位于微陣列的頂部。圖2F顯示了DNA微陣列315的排列并且解釋了光如何偶聯(lián)到微陣列中，這種光形成用于讀取微陣列的光學(xué)系統(tǒng)的部分。DNA微陣列可含有在玻璃基材310上以網(wǎng)格圖案排列的多個探針。各探針可含有DNA(或RNA)的一條鏈，并且用于檢測樣品溶液中與該探針中的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的存在。如上所述，這些探針在玻璃基材310頂部以網(wǎng)格圖案放置。光通過在玻璃內(nèi)蝕刻的光柵305偶聯(lián)到玻璃基材中。參考圖2G，沿入射光306顯示光柵。入射光306可具有特定波長。由于存在光柵，入射光可以多種方向傳播；一些光可如307所示向右傳播，一些光可如308和309所示以特定角度傳播。光可以相對于光307的其他更陡的角度傳播，但在本文中忽略它們，因?yàn)樵诟附嵌鹊墓鈴?qiáng)度往往更低。通過熟知的光柵公式來確定光傳播的角度(對于不以直線轉(zhuǎn)播的光而言)?？赏ㄟ^調(diào)整入射光306的波長和對光柵圖案化來調(diào)整光308和309的角度。接著，為了將光偶聯(lián)到玻璃基材中，使用全內(nèi)反射的過程。這一概念如圖2H所示。在該圖中，忽略了直線傳播的光307和以一定角度傳播的光309。光308顯示為由光柵305的尺寸顯示的光束。因此，光308的光束由從光柵的左側(cè)邊緣發(fā)出的實(shí)線308L和從光柵的右側(cè)邊緣發(fā)出的虛線308R顯示。使用實(shí)線和虛線來區(qū)分光束的2個邊緣；沒有顯示其他差異。根據(jù)光束308的角度以及玻璃基材和周圍環(huán)境(基本是空氣)的折射率，可在標(biāo)為R1的玻璃基材區(qū)1的上表面上建立全內(nèi)反射。這種反射的光可到達(dá)玻璃基材的下表面并且可再次在區(qū)2(標(biāo)為R2)處全內(nèi)反射。因此，雖然全內(nèi)反射，光可在檢測孔317之后，微陣列315之下被導(dǎo)向。如前所述，微陣列316可位于監(jiān)測孔317的底部?，F(xiàn)在，光被導(dǎo)向微陣列的位置，產(chǎn)生稱為漸消場的另一種現(xiàn)象以在DNA微陣列中激發(fā)光敏分子。已知光學(xué)元件中，在發(fā)生全內(nèi)反射的邊界處，在邊界的另一側(cè)上建立漸消場。這些漸消場是近場現(xiàn)象并且強(qiáng)度在遠(yuǎn)離邊界處呈指數(shù)下降。然而，在非?？拷吔缣?，漸消場能夠激發(fā)光敏分子并且由于檢測孔317中的溶液位于邊界處或邊界附近，使用漸消場的檢測方法變得可能。回到圖2H，可以看到檢測孔位于封閉層320內(nèi)；該封閉層由鉻制成。鉻層也示于圖2F，在全部四個側(cè)面上的檢測孔周圍。包含鉻作為設(shè)計(jì)的部分，從而降低或消除從檢測孔的毗鄰處發(fā)出的散射光。通過在檢測孔上偶聯(lián)黑色塑料片327來進(jìn)一步去除錯誤光的可能性。也可使用除塑料以外的其他材料。光308的光柵設(shè)計(jì)和后續(xù)角度，玻璃基材的厚度，玻璃基材的折射率，光柵和檢測孔之間的距離是我們已經(jīng)針對該裝置優(yōu)化的參數(shù)并且提供了協(xié)同功能。另外，可選擇光308的角度，使得其不僅從區(qū)如R1和R2(基本從玻璃-空氣邊界)全內(nèi)反射，也從檢測孔的玻璃-溶液邊界全內(nèi)反射。檢測孔中溶液的反射率大約為1.33，而空氣的反射率約為1?？筛淖児鈻砰g距、光柵材料和基材率以使用不同波長激光。在一個實(shí)施例中，633nm波長光與750微米的融合二氧化硅基材上195nm間距的150nm氮化硅光柵聯(lián)用。光以10°發(fā)散偶聯(lián)到基材中。選擇光柵與微陣列之間的距離，使得微陣列位于對應(yīng)于全內(nèi)反射的整數(shù)的距離上?？筛鶕?jù)需要調(diào)整所有上述具體參數(shù)。例如，可使用其他光波長，其然后需要與上述不同的光柵間距。TEC可置于檢測孔317上以控制溶液溫度。最后，CCD相機(jī)360可置于微陣列底部，使得可在相機(jī)檢測器上形成微陣列的一對一圖像。相機(jī)系統(tǒng)拍攝微陣列上溶液的照片。照片顯示了在微陣列內(nèi)可能正發(fā)出熒光的區(qū)域。這種信息用于鑒定和檢測過程。本發(fā)明利用所述改善和調(diào)整的協(xié)同組合來實(shí)施檢測功能。檢測塊-質(zhì)量控制。除了鑒定樣品內(nèi)的靶序列以外，可使用微陣列來確保如上所述發(fā)生步驟(裂解、純化、酶和引物的混合等)?？稍诟鞑襟E處加入標(biāo)記物，并且可在微陣列內(nèi)光學(xué)測試標(biāo)記物的存在或缺失。因此，通過分析標(biāo)記物的存在或缺失，可實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制以鑒定測試是否可能沒有正確運(yùn)行或沒有正確運(yùn)行之處。檢測塊-全擴(kuò)增?？墒褂醚b置10來避免樣品裂解以測試各種核酸序列。樣品裂解通常用于市售系統(tǒng)；其要求樣品被分割成多個樣品，其中可測試各分割樣品的特定序列。由于原始樣品被分裂成多個樣品，這種方法由等于樣品分裂數(shù)量的因數(shù)降低了檢測限。與使用樣品分裂不同，我們進(jìn)行了稱為全擴(kuò)增的過程，由此可鑒定細(xì)菌或病毒物種內(nèi)的變異而不分裂樣品。這種類型的測試變得可能，因?yàn)槲锓N內(nèi)變體的DNA的一些部分可能是小的或相似的。在已知存在某些序列的情況下，然后可設(shè)計(jì)引物來鑒定變體。一般而言，PCR限于約20種不同引物組，這限制了一個市售系統(tǒng)可檢測的靶標(biāo)數(shù)量。我們的系統(tǒng)通過全擴(kuò)增克服了這種限制，其中PCR引物組靶向在許多生物體間共有的DNA序列，而引物之間的區(qū)域含有在生物體之間高度可變的DNA序列。全擴(kuò)增方法允許在微陣列上分化樣品類型，其中高度多重化是可能的。例如，冠狀病毒聚合酶基因的保守區(qū)允許用單個引物組擴(kuò)增6種不同的冠狀病毒血清型，而各血清型在微整列上可通過分析在引物組之間擴(kuò)增的可變區(qū)來區(qū)分。全擴(kuò)增的一個優(yōu)勢在于，需要比進(jìn)行PCR的一般市售裝置更少的引物。使用超過20種引物可導(dǎo)致稱為“引物二聚體”的現(xiàn)象，其中引物分子由于引物中一連串互補(bǔ)堿基的互相雜交，而我們的全擴(kuò)增過程允許使用更少的引物，因此產(chǎn)生有優(yōu)勢的構(gòu)造。檢測塊-實(shí)時(shí)雜交。在另一個有優(yōu)勢的構(gòu)造中，在裝置10內(nèi)實(shí)施實(shí)時(shí)雜交方法，其導(dǎo)致樣品輸入和結(jié)果輸出之間的時(shí)間縮短。在典型市售方法中，允許雜交繼續(xù)直至達(dá)到正在測試中的一種或多種樣品的穩(wěn)定濃度。相反，在裝置10中，進(jìn)行實(shí)時(shí)方法，其中在一種或多種樣品的濃度可能在雜交開始之后快速上升期間重復(fù)估計(jì)這一種或多種樣品的濃度。該技術(shù)是基于以下觀察，即來自CCD相機(jī)的信號強(qiáng)度可能與動態(tài)曲線方程的濃度相關(guān)，同上。使用動態(tài)模型，可監(jiān)測熒光信號相對于時(shí)間的增加。該信號可建模或擬合為指數(shù)形式，從中可估計(jì)時(shí)間常數(shù)。用對時(shí)間常數(shù)的估計(jì)，可估計(jì)分析物濃度。檢測塊-使用多階段溫度對照。在典型的市售雜交過程中，在雜交完成之后，進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌，以洗去未結(jié)合的探針。一般而言，通過改變鹽濃度來進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌，然而在裝置10中，可通過使用TEC改變樣品溫度同時(shí)保持恒定的鹽濃度來實(shí)現(xiàn)相似的效果。因此，在雜交完成并且拍攝最初的一組圖片之后，可升高TEC的溫度，使得可去除未結(jié)合分子中的一些。這允許一種對結(jié)果進(jìn)行檢查的優(yōu)選的方式，因?yàn)楦淖內(nèi)芤旱臏囟缺雀淖冸s交緩沖液的鹽濃度更容易。體積控制。測試過程需要精確體積，這可被填充腔室中存在的氣泡破壞。在一般的市售系統(tǒng)中，使用各種裝置如蠕動泵，但這些裝置的添加提高了裝置的復(fù)雜性和成本。我們的裝置提供了實(shí)現(xiàn)高精度和準(zhǔn)度(優(yōu)選10％或更低)并且低成本實(shí)施的體積控制。圖4顯示了填充腔室450和填充腔室周圍結(jié)構(gòu)的截面。填充腔室可位于底層490的頂部。腔室的側(cè)面顯示為460。流體可沿著箭頭480進(jìn)入腔室。可用虛線箭頭495標(biāo)記填充腔室的輸出。元件470可以是閥；如果其關(guān)閉，沒有沿虛線箭頭495出現(xiàn)流。透氣膜440可固定在所示填充腔室的頂部。關(guān)閉閥，流體可以480的方向流入填充腔室450。透氣膜可使捕獲的空氣排出，并且隨著填充腔室的填充，全部空氣被排出。由于腔室和大氣之間的壓力差，透氣膜沒有使任何空氣返回；因此，關(guān)閉閥470，可在填充腔室內(nèi)收集精確量的流體。填充腔室內(nèi)的體積精度可由腔室尺寸的精度決定，并且可使用熟知的技術(shù)控制腔室尺寸，諸如但不限于加工和蝕刻。透氣膜可由材料制成，諸如但不限于微孔聚丙烯。因此，用精確制成的腔室和透氣膜的組合，可實(shí)現(xiàn)精確且準(zhǔn)確的體積控制。填充腔室和膜一起位于iMFC卡內(nèi)的各種位置上。因此，例如，具有透氣膜的填充腔室可用于PCR主混合物腔室122和PCR引物腔室124。在這兩個具體位置上，凍干的化合物可作為團(tuán)塊位于腔室內(nèi)；因此，這些腔室內(nèi)的再水合過程可發(fā)正在體積控制的環(huán)境中。閥控制。圖5A和B顯示了如何控制iMFC卡內(nèi)的閥和流體流，包括流體流通道520和氣流通道540以及柔性膜530。圖5A顯示了2個額外箭頭550以顯示流體可流過流體流通道520。流體可在特定壓力如6psi下被泵送通過系統(tǒng)。如果膜530沒有變形，如圖5A所示，則通道520可允許流體自由流動。然而，如果向氣流通道施加更高的壓力如18psi，則膜可能變形，如圖5B所示，這可有效阻斷通過通道520的流動。因此，通過控制膜任意側(cè)上的壓力，可控制流過流體通道的流。下文描述了施加不同壓力的氣動系統(tǒng)。iMFC層。上述的iMFC卡可以是一次性的并且可由廉價(jià)材料制成，如聚碳酸酯、丙烯酸和聚對苯二甲酸乙二酯?？杀徽J(rèn)為是“母板”，其中可適應(yīng)不同分子，如卡可設(shè)計(jì)為具有多種不同的輸入類型以適應(yīng)不同輸入方法。不僅卡可適應(yīng)各種模塊，也可修改通道構(gòu)造以適應(yīng)不同診斷測試或從診斷測試中添加或減去步驟。因此，可設(shè)計(jì)各卡來適應(yīng)特定測試或測試組，而不需要改變背后的硬件。各卡可有一層或多層制成?？ǖ闹饕δ苤皇窃诤线m的時(shí)間上使流體從一個位置按路線通過卡中構(gòu)建的氣流通道和流體流通道系統(tǒng)到另一個位置上。其他功能包括但不限于測量流并且證明溫度控制的環(huán)境。圖6顯示了iMFC卡的所有層的復(fù)合“投影”圖像。一般而言，卡具有一個或多個通道，如600，使得流體可在這些通道中從一個位置流向另一個位置?？赏ㄟ^將槽切成卡內(nèi)層狀材料來形成通道。另外，卡也可具有一個或多個閥，如630，以及一個或多個通道或儲器，如620，其中可測量體積。一些層或?qū)拥牟糠挚捎赏笟饽そM成。卡可含有多個端口，如610。端口可形成硬件和卡之間的界面。使用這些端口來施加驅(qū)動壓力(以驅(qū)動流體)或閥壓力(以驅(qū)動閥)。這些端口的位置可對卡而言保持相同，這防止對改變背后硬件的任何需要。然而，可以任何方便的方式設(shè)計(jì)卡，并且可以任何方便的方式設(shè)置卡上的功能。這一方面使得卡多能，因?yàn)槠浣?jīng)設(shè)計(jì)用于進(jìn)行各種測試而不需要改變背后的硬件。氣動系統(tǒng)。氣動系統(tǒng)(圖7)負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)卡內(nèi)的流。氣動系統(tǒng)可具有可位于單元基底內(nèi)的泵。這種泵將積聚器(accumulator)中的空氣壓縮至所需的壓力，如16psi。該圖也顯示從積聚器到泵的反饋環(huán)，使得積聚器內(nèi)的壓力保持恒定。一條路徑從積聚器導(dǎo)向調(diào)控器，其中積聚器中的較高壓力被調(diào)低至較低壓力，如6psi。使用這種較低壓力來驅(qū)動整個系統(tǒng)內(nèi)的流體?？稍谡{(diào)控器的輸出處包括螺線管閥，以打開流體驅(qū)動。另一條來自積聚器的通路可通過一個或多個螺線管閥來控制閥的打開或關(guān)閉。因此，積聚器的較高壓力(16psi)可用于控制閥。如圖中所示，各螺線管閥可控制一個或多個閥。圖5A和5B顯示了如何通過流體通道和氣流通道的設(shè)計(jì)來控制流體流。在圖7的內(nèi)容中，流體通道可連接至“驅(qū)動”輸出，并且氣流通道可連接至“閥”輸出之一。氣動系統(tǒng)可以是硬件的部分；因此，可能不易于改變用于向流體流或閥控制提供壓力的一些路徑。然而，為了實(shí)現(xiàn)卡設(shè)計(jì)的靈活性，在相同位置上僅需要端口；這些端口是向流體驅(qū)動通道或向氣流通道提供壓力以驅(qū)動閥的原因。這些端口在圖6中表示為610。因此，通過要求卡在相同位置處有端口，可使用相同硬件單元，但是卡本身可設(shè)計(jì)用于不同目的。硬件。如圖1所示，所述的測試系統(tǒng)可構(gòu)建成一次性盒，包括單元基底20和單元蓋30?？稍诨缀蜕w內(nèi)物理構(gòu)造各種功能和能力。圖8顯示了硬件的功能框圖。硬件可包括處理器和能源如電池。處理器可接合其他元件如TEC、電動馬達(dá)、光學(xué)系統(tǒng)、氣動系統(tǒng)、顯示器和通信系統(tǒng)。關(guān)于顯示系統(tǒng)，裝置10可具有可顯示信息或結(jié)果的屏幕。關(guān)于通信系統(tǒng)，單元10可通過任意合適的通信方法如以太網(wǎng)和藍(lán)牙接合外部計(jì)算機(jī)?？墒褂檬熘募夹g(shù)來實(shí)施這些顯示器和通信子系統(tǒng)。圖8也顯示，卡可在機(jī)械上接合子系統(tǒng)中的一些，如TEC，電動馬達(dá)等。由虛線顯示這些接合。本發(fā)明的實(shí)施方式包括：1.一種模塊診斷裝置、系統(tǒng)或方法，其檢測一大組(>6，>10，>20或>50)核酸序列而無需任何人介入來進(jìn)行測試過程，除了出于注射或插入樣品和讀取結(jié)果的目的以外。2.本文所述的裝置、系統(tǒng)或方法，其中將裂解、純化、PCR和雜交步驟整合到一個系統(tǒng)中，并且其中在一次性卡中進(jìn)行這些步驟。3.本文所述的裝置、系統(tǒng)或方法，其中一次性卡可含有模塊，使得通過改變該模塊，可構(gòu)造卡用于不同測試。4.本文所述的裝置、系統(tǒng)或方法，其中可在來自多種來源的樣品中檢測分析物，包括，例如：血液、唾液、GI樣品、尿液、傷口拭子、脊椎穿剌、鼻拭子、獸醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)來源。5.本文所述的裝置、系統(tǒng)或方法，其中用于收集樣品的工具可直接輸入卡中。6.本文所述的裝置、系統(tǒng)或方法，其中通過稱為全擴(kuò)增的過程而不是樣品分裂來進(jìn)行PCR過程的擴(kuò)增步驟。7.本文所述的裝置、系統(tǒng)或方法，其中檢測步驟使用微陣列。8.本文所述的裝置、系統(tǒng)或方法，其中微陣列包括對照，其驗(yàn)證測試過程的各步驟是否適當(dāng)發(fā)生。9.本文所述的裝置、系統(tǒng)或方法，其中檢測步驟使用實(shí)時(shí)雜交方法，其基于動態(tài)模型來預(yù)測樣品的濃度，其中減少了讀取時(shí)間。10.本文所述的裝置、系統(tǒng)或方法，其中在鈍化金屬鍍覆腔室中進(jìn)行PCR過程，使得可通過將金屬鍍覆腔室放在TEC附近或與TEC接觸來迅速控制腔室內(nèi)的溫度，優(yōu)選其中使用的金屬是鋁。11.本文所述的裝置、系統(tǒng)或方法，其中通過使用與透氣膜偶聯(lián)的通道或腔室來測量溶液體積，使得在填充通道或腔室時(shí)，空氣被排出透氣膜；因此，可最小化或去除由于在測量的體積中有空氣而造成的誤差。12.本文所述的裝置、系統(tǒng)或方法，其中氣動系統(tǒng)通過施加不同壓力驅(qū)動流體和控制閥來控制流體流。其他實(shí)施方式及其實(shí)施例詳述公開了便攜式系統(tǒng)，其可分析多種樣品中的核酸序列內(nèi)容物。該系統(tǒng)能夠獲取多種原始樣品(診斷或環(huán)境)并且在獨(dú)立單元中通過微陣列進(jìn)行核酸提取、純化、擴(kuò)增、標(biāo)記和序列分析。該系統(tǒng)是自動且快速的，以允許由非熟練實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的使用者對樣品進(jìn)行現(xiàn)場分析。在實(shí)施方式中：該系統(tǒng)包括(1)可重復(fù)使用的硬件平臺和(2)決定待進(jìn)行的試驗(yàn)的耗用集成微流體卡(iMFC)；該系統(tǒng)小(<150，<250，或400in3)、質(zhì)量輕(<3，5或10lb)、快速、并且使用直觀?？芍貜?fù)使用硬件控制并提供氣動、壓力調(diào)節(jié)、溫度控制、激光控制和最后微陣列成像；耗用的iMFC包含卡，其進(jìn)行樣品裂解、純化、PCR和檢測并且容納所有需要的干試劑；和/或iMFC還包含試劑儲存元件，其分開盛放所有液體試劑，從而不破壞干試劑的完整性。在實(shí)施方式中，該系統(tǒng)提供：易于使用：對于非熟練操作者現(xiàn)場使用而言易于操作并且結(jié)果理解簡便；設(shè)置成臨床實(shí)驗(yàn)室改善修改(CLIA)豁免認(rèn)證的；和/或提供沒有使用者介入的樣品輸入到結(jié)果輸出的能力。配置性：iMFC是模塊，能夠儲存主要iMFC并且連接分開的、快速產(chǎn)生的、較低成本的模塊，其限定終端產(chǎn)物試驗(yàn)功能性；由于主要iMFC保持相同，該系統(tǒng)在新威脅出現(xiàn)時(shí)提供新試驗(yàn)的即時(shí)開發(fā)。試驗(yàn)靈活性；樣品類型(從耐寒(hardy)孢子到易于破壞的哺乳動物細(xì)胞)和/或分析物類型(DNA、RNA和蛋白質(zhì))的靈活性?？芍圃煨院统杀荆篿MFC和模塊組件是可使用低成本注塑或先進(jìn)制造激光轉(zhuǎn)化過程制造的；高速激光轉(zhuǎn)化和精確層疊使得能在接近50英尺/分鐘的生產(chǎn)速率下制造具有小至125μm的圖案和小于50μm的公差的iMFC；舊注塑技術(shù)和先進(jìn)激光轉(zhuǎn)化技術(shù)的組合允許以低于$10/卡批量產(chǎn)生復(fù)雜的一次性筒。在實(shí)施方式中，我們的系統(tǒng)從原始樣品輸入到結(jié)果輸出是完全自動化的，和/或可設(shè)置成允許多重分析類型。在實(shí)施方式中，我們的系統(tǒng)提供便攜式生物分析平臺以檢測核酸，一般是DNA或RNA，如微生物，一般是細(xì)菌、病毒或真菌檢測，和通過mRNA和蛋白質(zhì)檢測的健康監(jiān)測，以及細(xì)胞選擇和濃縮。在實(shí)施方式中，該系統(tǒng)由2個元件組成：(1)可重復(fù)使用的硬件平臺和(2)決定待進(jìn)行的試驗(yàn)的耗用集成微流體卡(iMFC)。在實(shí)施方式中，我們的系統(tǒng)證明可適應(yīng)多種應(yīng)用：細(xì)菌試劑檢測。我們的DNA檢測iMFC以與實(shí)驗(yàn)室流程相似的方式運(yùn)行：裂解、DNA純化、DNA擴(kuò)增和標(biāo)記、以及雜交。我們的各步驟的微流體技術(shù)方法在下文中著重指出。使用二氧化硅珠和低成本一次性電動馬達(dá)來完成裂解，用于對從耐寒孢子到哺乳動物細(xì)胞的樣品類型的強(qiáng)力裂解。我們通過使DNA結(jié)合至石英玻璃料、洗去雜質(zhì)、并在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)即用溶液中洗脫來純化DNA。我們的DNA純化模塊和過程允許在約5分鐘內(nèi)在沒有使用者介入的情況下在前6μl中洗脫高DNA濃度。相反，用于孢子裂解和DNA純化的實(shí)驗(yàn)室平臺方法在7個步驟上耗費(fèi)30分鐘并且需要實(shí)驗(yàn)室離心。我們在2個定制熱電冷卻器(TEC)之間的鋁壁腔室中進(jìn)行DNA擴(kuò)增。TEC和鋁腔室允許TEC和PCR混合物之間的快速傳熱。我們已經(jīng)在12分鐘內(nèi)證明與大腸桿菌O104:H4病原體相關(guān)的兩種基因(AGG和STX2)的PCR雙螺旋并且已經(jīng)檢測到低至10個基因組拷貝。我們使用定制DNA微陣列和光學(xué)系統(tǒng)來雜交DNA。使用光柵將光偶聯(lián)至玻璃板并且保持限于全內(nèi)反射。使用表面上的漸消波來激發(fā)與其在微陣列表面上的互補(bǔ)物雜交的靶序列。使用漸消波使我們能實(shí)時(shí)觀察雜交。使用定制光繼電器和CCD來對微陣列表面進(jìn)行成像。我們可驗(yàn)證對多種潛在生物戰(zhàn)劑的多重檢測并建立我們的試驗(yàn)和硬件平臺的接受者操作者特征(ROC)曲線。病毒RNA檢測。除我們使用單逆轉(zhuǎn)錄/PCR混合物以外，我們用于檢測病毒RNA的技術(shù)方法與我們進(jìn)行DNA檢測的方法相同。對于流感病毒H3N2和H1N1，我們已經(jīng)在不到30分鐘內(nèi)證明了單主混合物逆轉(zhuǎn)錄和PCR?，F(xiàn)場便攜能力可直接利用從DARPA的預(yù)測程序獲得的信息并且允許對導(dǎo)致在家養(yǎng)動物群中潛在大流行的病毒群突變的早期檢測。mRNA檢測。我們能使用相同的軟件解決mRNA分析，更新iMFC以允許使用聚-T珠進(jìn)行mRNA捕獲并對微陣列進(jìn)行實(shí)時(shí)成像以捕獲動態(tài)數(shù)據(jù)。使用動態(tài)測量使我們能夠在剛好達(dá)到平衡之前就確定各分析物的濃度，從而減少了一般驅(qū)動基因表達(dá)分析的雜交時(shí)間。我們在需要地點(diǎn)快速分析血液樣品mRNA的能力利用了預(yù)測健康和疾病程序(PredictingHealthandDiseaseprogram)中投資的DARPA。蛋白質(zhì)檢測。我們可將蛋白質(zhì)-結(jié)合事件轉(zhuǎn)導(dǎo)成核酸讀取，從而使我們的相同平臺具有同時(shí)測試核酸和蛋白質(zhì)的能力。血漿蛋白質(zhì)濃度指示健康狀態(tài)或環(huán)境接觸。我們已經(jīng)開發(fā)了4-宿主-響應(yīng)蛋白質(zhì)面板，其指示離子化輻射接觸；用于其他環(huán)境接觸診斷的類似面板也可集成到平臺中。我們使用與mRNA檢測相同的珠捕獲微流體模塊來捕獲珠上的蛋白質(zhì)分析物。用針對特定蛋白質(zhì)分析物的抗體代替聚-T寡核苷酸來官能化珠。用寡核苷酸標(biāo)記的二抗用作傳統(tǒng)免疫試驗(yàn)的報(bào)告分子。一旦夾心試驗(yàn)經(jīng)過嚴(yán)謹(jǐn)洗滌，使用與DNA檢測相同的模塊來擴(kuò)增、標(biāo)記和雜交報(bào)告寡核苷酸。我們把這種方法稱為“微球-免疫-PCR”(MSiPCR)。細(xì)胞選擇和濃縮。我們的前端模塊允許使用微流體電活化(EAP)聚合物細(xì)胞分選儀進(jìn)行特定細(xì)胞選擇和濃縮，這與實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的熒光活化細(xì)胞分選儀(FACS)類似。該模塊通過濃縮大體積的稀釋細(xì)胞濃縮物(一些細(xì)菌細(xì)胞/ml)或從許多細(xì)胞的背景中分選出選擇細(xì)胞(從全部外周血單核細(xì)胞中僅分選出活化的T細(xì)胞)增加系統(tǒng)操作區(qū)域。在該模塊中，我們使用流體力學(xué)和/或慣性聚焦來排列細(xì)胞，并且然后基于熒光觸發(fā)使用EAP致動器來分選。我們已經(jīng)證明了該技術(shù)以超過25000個細(xì)胞/秒的速度進(jìn)行分選的潛力?；€手持式分析儀硬件平臺提供了支持對微生物DNA樣品進(jìn)行iMFC處理所需的所有必要硬件致動。使用者通過計(jì)算機(jī)USB端口與硬件平臺交互。一旦將iMFC插入硬件并且關(guān)上蓋，使用者選擇針對所需試驗(yàn)的特定處理腳本。在啟動腳本之后，手持式器件在沒有使用者交互下運(yùn)行，直至完成。在運(yùn)行期間，將圖像從手持式器件轉(zhuǎn)移到主PC，其中它們被分析。在運(yùn)行完成之后，分析和結(jié)果將展示在屏幕上由使用者檢查。硬件設(shè)計(jì)成在小型便攜式裝置中進(jìn)行細(xì)胞裂解、純化、擴(kuò)增和檢測，優(yōu)先用小于1ft3的總體積，優(yōu)選小于200in3。在一個實(shí)施方式中，硬件尺寸在4.75in深x6.25in寬x5in高，總體積為148in3。在iMFC上，通過正壓控制膜閥和液體流體流。啟動子系統(tǒng)在定制丙烯酸歧管上集中，其與手持式分析儀(HHA)中的所有啟動組件連接并且使這些組件的輸出沿途徑到iMFC上的輸入端口。這種歧管含有積聚器以將一定體積的空氣保持在規(guī)定的壓力下(18psi)，該壓力適于iMFC上的微流體閥膜致動。使用單個螺線管來在試驗(yàn)加工器件的任何時(shí)間上觸發(fā)通向iMFC的驅(qū)動壓力。這種驅(qū)動壓力端口通過壓力調(diào)控器(固定至集成歧管中)沿路徑運(yùn)行，使得對于任何給定HHA，驅(qū)動壓力可在0-10psi中調(diào)節(jié)。表1顯示了基線系統(tǒng)中的功能性組件及其目的以及實(shí)施。支持?jǐn)U增(PCR)和檢測模塊的硬件在下文詳細(xì)描述為基線iMFC說明的部分。第二列列出了功能性組件的目的并且最后一列列出了在硬件平臺上實(shí)施的用于實(shí)現(xiàn)所需能力的我們的技術(shù)方法。表1.基線iMFC和iMFC模塊耗用的iMFC包含(1)進(jìn)行樣品裂解、純化、PCR和檢測并容納所有所需干試劑的卡和(2)分開盛放試劑儲存元件以不損壞干試劑完整性。因?yàn)閕MFC以模塊模式設(shè)計(jì)-即，在通用卡上組裝應(yīng)用特異性模塊-可通過簡單互換模塊來容易并快速開發(fā)用于新應(yīng)用的iMFC。這種通用性特征消除了重新設(shè)計(jì)、開發(fā)和制造新卡，最復(fù)雜組件的需要。一旦制成，相同的卡可用于廣泛的應(yīng)用，從而降低了成本和開發(fā)時(shí)間。微流體卡。該卡采用正壓力驅(qū)動流并且有三個功能性層組成，其含有(1)流體通道，(2)22個控制流體流的膜閥，和(3)用于從流體通道去除氣泡的裂口。這些功能性層一起包含9個層疊層，其周圍是2個注塑的部件。7個模塊預(yù)固定的卡上，4個在上表面(裂解模塊，純化濾器，PCR主混合物腔室，和引物腔室)并且3個在下表面(PCR腔室，攪拌棒混合腔室，和檢測腔室)。固定至檢測腔室的是光學(xué)波導(dǎo)芯片，其含有DNA微陣列以感測感興趣的靶標(biāo)。試劑塊。當(dāng)使用者啟動程序時(shí)，手持式硬件中的可膨脹囊狀物將試劑塊擠壓到尖銳物上以穿透箔密封，其進(jìn)而釋放液體試劑。使用正壓力驅(qū)動流，空氣進(jìn)入試劑塊中的各腔室并且驅(qū)動流體試劑通過輸出通孔并進(jìn)入卡?？ㄉ系目蓧嚎s墊圈防止試劑塊-卡界面處的流體或空氣泄漏。表2列出了可儲存在試劑塊中用于DNA分析的液體。設(shè)計(jì)用于不同應(yīng)用(mRNA或蛋白質(zhì)分析)的卡將具有不同試劑。試劑塊也包含廢料儲器，其含有吸收材料以收集流過卡的試劑。試劑塊優(yōu)選含有生物試驗(yàn)分析所需的單預(yù)包裝模式的所有液體試劑。表格列出了目前用于DNA分析的試劑。緩沖液名稱連同緩沖液的目的和精確化學(xué)配方。試劑塊是一般目的，并且所需的試劑將根據(jù)由iMFC進(jìn)行的生物試驗(yàn)而變化。我們的技術(shù)方法是使用相同的包裝，但用不同試劑填充以支持RNA病毒檢測、mRNA檢測和蛋白質(zhì)檢測的新試驗(yàn)?zāi)芰?。?.裂解。在從試劑塊中釋放液體之后，自動化程序中的下一步是裂解。裂解模塊，其可以操控甚至孢子樣品，由3個腔室組成：樣品腔室，珠磨腔室(用于孢子裂解)，和結(jié)合劑腔室。在來自試劑塊的裂解緩沖液流入樣品腔室之后，打開電動馬達(dá)使裂解緩沖液與樣品混合。混合的樣品然后流入珠磨腔室中，其中第二電動馬達(dá)運(yùn)行3分鐘以攪拌玻璃珠并且通過珠磨使孢子樣品裂解。裂解的樣品然后進(jìn)入結(jié)合劑腔室，其中鹽酸胍和硫酸氫鈉(結(jié)合劑)的固體混合物在樣品中溶解以促進(jìn)下一步驟中DNA與純化濾器結(jié)合。作為對該方法概念的證明，我們獲得了從通過裂解模塊裂解的枯草芽孢桿菌孢子樣品的裂解效率。孢子代表了最難裂解的情況。對于非孢子應(yīng)用，珠磨腔室可用無電動馬達(dá)的腔室模塊替換以簡化設(shè)計(jì)并降低成本。純化。我們在開發(fā)用于微流體DNA純化的技術(shù)方法中面臨幾大挑戰(zhàn)。例如，我們需要開發(fā)一種復(fù)制需要7個步驟和30分鐘以及離心步驟以成功裂解并純化孢子樣品的實(shí)驗(yàn)室過程的方法。另外，我們需要在前6μL部分中洗脫DNA。在實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中，一般在較大體積(例如，20μL)中洗脫純化的DNA，并且然后使用較小體積等分試樣(1-3μL)用于PCR擴(kuò)增。在這種情況中，DNA混合并且因此洗脫速率在整個20μL上平均化。微流體方法幾乎不包括混合，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的流是層疊的；因此，最高濃度的洗脫DNA需要在第一部分中。表3.我們使用我們的裂解模塊進(jìn)行了枯草芽孢桿菌孢子裂解的三次重復(fù)。下面以從107個孢子的起始母液的百分比顯示了結(jié)果(基于活力計(jì)數(shù))。對照是Claremount珠磨裝置。我們的微流體結(jié)果與使用實(shí)驗(yàn)室吸頭和試管的對照相當(dāng)?？莶菅挎邨U菌樣品編號基于107的活力計(jì)數(shù)輸入的裂解后回收(％)148.4231.6318.6平均32.9對照39.6在iMFC上，在裂解后，樣品流過純化模塊，DNA結(jié)合至濾器，并且剩余裂解樣品的內(nèi)容物流向廢料儲器。然后來自試劑塊的洗滌緩沖液流過濾器以去除殘留雜質(zhì)并且也收集在廢料儲器中?？諝獯颠^純化模塊以干燥濾器，之后是來自試劑塊的洗脫緩沖液(在第一部分中實(shí)現(xiàn)顯著洗脫的關(guān)鍵方面是洗脫緩沖液pH)，其在流過時(shí)，從濾器中去除純化的DNA制備用于PCR。表4表示在微流體卡上純化的大腸桿菌樣品的三個重復(fù)的數(shù)據(jù)并且比較了這些結(jié)果與來自標(biāo)準(zhǔn)純化濾器的那些。在各種情況中，很明顯，最高濃度來自第一部分。各部分表示約6μl的洗脫液中的DNA。表4.我們使用我們的iMFC方案重復(fù)了大腸桿菌樣品純化的3個重復(fù)。我們開發(fā)了方案以洗脫第一部分中的大部分DNA，因?yàn)槭褂靡话銓?shí)驗(yàn)室平臺方法，我們將沒有機(jī)會收集整個洗脫并用吸頭只選擇一部分。結(jié)果清楚地表明，最大濃度來自前6-μl部分。PCR擴(kuò)增和標(biāo)記。攜帶來自濾器的純化的DNA，洗脫緩沖液填充PCR主混合物腔室，其含有凍干的主混合物。然后，再水合的主混合物流入引物腔室并且使干燥的引物再水合。我們分離引物和主混合物是為了重復(fù)使用通用PCR主混合物模塊。寡核苷酸的凍干是快速的，并且這種方法使我們能夠支持快速開發(fā)試劑盒來測試出現(xiàn)的威脅。在再水合步驟之后，樣品和主混合物以及引物一起進(jìn)入PCR腔室，在其中然后擴(kuò)增樣品DNA。兩個關(guān)鍵特征使我們能夠完成快速PCR：(1)鋁PCR模塊表面和(2)新TEC組件，其可以±1℃的精度升溫>15℃/s。PCR模塊夾在2個TEC組件之間。PCR主混合物盛放在由2個25-μm鋁壁封閉的1-mm-高丙烯酸腔室中。PCR腔室的鋁表面使得能夠向TEC組件或從TEC組件向液體PCR混合物快速導(dǎo)熱。作為比較，50-μm-厚的塑料使升溫塑料降低約3倍。SRI設(shè)計(jì)并測試定制TEC組件。我們已經(jīng)轉(zhuǎn)變了用于制造的RMTltd設(shè)計(jì)。定制SRI組件結(jié)合散熱器、TEC、反饋傳感器(熱敏電阻器)、和傳感器周圍的氮化鋁(AlN)熱器。校正各熱敏電阻器傳感器以允許HHA補(bǔ)償任何傳感器制造錯誤公差。作為對我們的PCR系統(tǒng)概念的證明，我們產(chǎn)生了針對與2011年德國爆發(fā)的大腸桿菌O104:H4病原體相關(guān)的聚集粘附菌毛(AGG)和志賀毒素(STX2)基因的雙鏈PCR試驗(yàn)?；谠诒l(fā)剛開始之后由BGI上傳的序列分析選擇獨(dú)特區(qū)域的引物和探針。采用使用臺式設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)來建立針對AGG和STX2靶標(biāo)優(yōu)化的探針選擇和引物優(yōu)化。一旦建立，將試驗(yàn)轉(zhuǎn)變?yōu)镾RI微流體PCR系統(tǒng)。由于SRIPCR系統(tǒng)利用針對熱傳導(dǎo)和溫度均勻以及用于快速溫度循環(huán)的新熱敏電阻器驅(qū)動的TEC設(shè)計(jì)優(yōu)化的鋁PCR腔室的優(yōu)點(diǎn)，含有用于鈍化鋁腔室的佐劑的定制的主混合物制劑允許在16分鐘內(nèi)對AGG和STX2靶標(biāo)進(jìn)行雙鏈擴(kuò)增。結(jié)果提供了40個PCR循環(huán)(95℃變性步驟，62℃退火以及73℃延伸)的覆蓋。各循環(huán)持續(xù)21秒進(jìn)行40個循環(huán)，總共14分鐘的PCR熱循環(huán)。剩余時(shí)間用于最初變性和尿嘧啶-DNA糖苷酶(UNG)處理。我們的定制主混合物含有dUTP作為擴(kuò)增的部分，并且UNG步驟確保在硬件平臺的不同使用之間沒有污染。我們在5個不同輸入拷貝數(shù)(10，50，100，500，和1000)上測試了16-分鐘PCR并且同時(shí)針對AGG和STX2基因?qū)U(kuò)增因數(shù)進(jìn)行定量。另外，我們使用12-分鐘PCR方案測試了500拷貝輸入并且觀察到循環(huán)時(shí)間從21s/循環(huán)降低至15s。同樣，使用2分鐘UNG處理和初始變性，循環(huán)時(shí)間只有10分鐘。表5顯示了針對擴(kuò)增子標(biāo)準(zhǔn)物的巢式PCR以對各樣品中的擴(kuò)增子進(jìn)行定量并確定擴(kuò)增因數(shù)的結(jié)果?？傮w上，對于模塊PCR，我們的擴(kuò)增范圍是1.6x109至3.4x1011。另外，已經(jīng)用SRI模塊雜交系統(tǒng)檢測了用模塊PCR系統(tǒng)生成的擴(kuò)增子。表5.模塊PCR樣品的定量結(jié)果。結(jié)果顯示，所有樣品在雜交中有>3.4nM的擴(kuò)增子，其高于1-nMLOD。檢測。為了檢測特定靶標(biāo)的存在，將擴(kuò)增的樣品與光學(xué)波導(dǎo)芯片上的微陣列雜交。為了促進(jìn)雜交，首先向擴(kuò)增的樣品中加入來自試劑塊的SSPE緩沖液。采用2個測量腔室來實(shí)現(xiàn)樣品與SSPE緩沖液的最優(yōu)比例。SSPE和PCR混合，然后被推入檢測腔室中，其在光學(xué)波導(dǎo)芯片上的微陣列上孵育樣品。在5分鐘的溫度控制的雜交之后，使用我們的定制TEC組件，其他SSPE緩沖劑流入檢測腔室以洗去樣品并且去除未雜交的擴(kuò)增子，之后升高溫度以去除交叉雜交或與錯誤探針非特異性結(jié)合的任何擴(kuò)增子。最后，使用定制的照射、收集和成像光學(xué)塊對DNA微陣列進(jìn)行成像。光學(xué)塊設(shè)計(jì)成單獨(dú)的子組件，其包括激光照射和微陣列雜交成像所需的所有東西?？稍诎惭b到HHA中之前預(yù)排列和調(diào)整光學(xué)塊。一旦進(jìn)行了這種預(yù)排列，在安裝時(shí)不需要進(jìn)一步調(diào)整。激光照射光學(xué)元件由線-生成激光二極管模塊和轉(zhuǎn)向鏡組成。激光照射的靶標(biāo)是微陣列芯片上的光柵。線-生成激光二極管以矩形圖案發(fā)出635nm的10-mW光束以激發(fā)用于觀察與微陣列的雜交的AlexaFluor647nm染料分子。線-生成二極管模塊具有在現(xiàn)成包裝(粘合有限公司(Coherent))中集成的聚焦和線-生成光學(xué)元件。微陣列成像光學(xué)元件包含折疊的1:1中繼鏡和干涉濾器。定制設(shè)計(jì)的中繼鏡是快速的(f/1.5)，從而最大光收集能力。其尺寸小(直徑12mm，并且長度<27mm)。中繼鏡設(shè)計(jì)成充分使光準(zhǔn)直進(jìn)入2個用于阻止激光激發(fā)光和散射光到達(dá)我們的單色CCD相機(jī)的干涉濾器(由介電堆疊件制成)。CCD芯片和電子元件直接連接至微陣列成像光學(xué)元件以降低噪音并最小化信號損失。CCD能夠有對微陣列成像而言充分讀取微陣列分析的速度(4幀/s)和足夠的信噪比，而不需要CCD冷卻。作為對光學(xué)系統(tǒng)概念的證明，我們將通過TEC組件和SRI鋁PCR腔室生成的PCR擴(kuò)增子雜交并且使用所述的光學(xué)系統(tǒng)讀取結(jié)果。測試的方案包括點(diǎn)樣的探針(如我們的快速DNA合成儀器所鑒定)，在37℃下機(jī)載孵育5分鐘，多次在從37℃增加至60℃的溫度下的嚴(yán)謹(jǐn)洗滌，和用于自動化圖像捕獲的光學(xué)包裝。我們用單一對照(A3)分析物雜交陰性對照，來自10拷貝的所得擴(kuò)增子進(jìn)入PCR，并且來自50拷貝的擴(kuò)增子進(jìn)入PCR。通過雜交陰性對照樣品和從AGG和STX2的單獨(dú)引物擴(kuò)增的樣品已經(jīng)證明了試驗(yàn)結(jié)果。雜交圖像證明，靶探針在10和50輸入模板的情況中都清晰可見，并且在A3對照情況中不存在。耗用的iMFC的低成本大量制造。我們開發(fā)了制造過程計(jì)劃來降低iMFC制造的成本用于大量生產(chǎn)。因?yàn)樽⑺艿挠糜诋a(chǎn)生部件的簡單廉價(jià)的方法，我們注塑了卡的上層和下層，以及裂解模塊和試劑塊。卡的其余層疊層以自動化卷制工藝制造，其中材料卷層疊在一起，激光切割，然后反繞到另一個卷上，全部都以快速管道方式在相同的設(shè)備系統(tǒng)上進(jìn)行。采用數(shù)百萬卡數(shù)量級的高生產(chǎn)量，成本可低至$10/卡。DNA檢測方法。我們的系統(tǒng)具有用全部針對擴(kuò)增子的可能探針在不到10小時(shí)內(nèi)進(jìn)行光刻合成寡核苷酸陣列的能力，因?yàn)槲覀兛稍诩s2周內(nèi)選擇合適的探針并且將平臺PCR試驗(yàn)轉(zhuǎn)移到我們的平臺中。如本文所示，我們已經(jīng)成功證明這種開發(fā)擴(kuò)增試驗(yàn)、將其轉(zhuǎn)化成iMFCPCR、以及選擇針對大腸桿菌O104:H4的探針的能力。病毒RNA檢測方法。RNA病毒檢測使用所有與DNA檢測相同的模塊，帶用于RNA病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的微流體試驗(yàn)。我們已經(jīng)使用可區(qū)分季節(jié)性和豬流感的試驗(yàn)證明了這種方法的概念。用于開發(fā)流感試驗(yàn)的方法是普遍的，并且可使用與選擇試劑RNA病毒相同的方法。為了鑒定流感，我們的第一步驟是鑒定可選擇性擴(kuò)增甲型流感病毒基質(zhì)基因的區(qū)段以及區(qū)分H1(豬)和H3(季節(jié)性)毒株的血凝素基因的部分的引物。我們的RT-PCR方案包括在42℃下的5分鐘逆轉(zhuǎn)錄(RT)步驟，其中反向引物退火至RNA靶標(biāo)并且引發(fā)第一DNA鏈的合成。2-分鐘逆轉(zhuǎn)錄酶失活和同時(shí)Taq聚合物“熱啟動”之后允許正向引物退火至第一DNA鏈并且合成第二DNA鏈。在這點(diǎn)上，進(jìn)行40個循環(huán)的PCR：95℃下的10-s變性，62℃下的20-s退火，和75℃下的5-s延伸。一旦在臺式設(shè)備上實(shí)現(xiàn)的良好擴(kuò)增，我們轉(zhuǎn)移到我們的模塊擴(kuò)增系統(tǒng)，其模擬我們的iMFC中的擴(kuò)增。由于該系統(tǒng)中的快速溫度升高，上述RT-PCR方案耗時(shí)不到33分鐘。首先使用凝膠電泳，然后在微陣列上評價(jià)RT-PCR產(chǎn)物。獲得了針對CA2009豬流感毒株(H1N1)和HK68季節(jié)性毒株H3N2(三重?cái)U(kuò)增)的基質(zhì)和血凝素基因的模塊擴(kuò)增的凝膠電泳結(jié)果。244bp擴(kuò)增子顯示甲型流感病毒基質(zhì)基因。H1毒株的血凝素?cái)U(kuò)增子是173個堿基度，而H3擴(kuò)增子是177個堿基對。與DNA微陣列上的序列特異性探針的雜交給出了H1和H3毒株的明確分化。在微陣列上實(shí)現(xiàn)靈敏和選擇性檢測的第一步是制備光刻合成的探針選擇芯片，其含有針對我們的感興趣靶標(biāo)的覆蓋整個擴(kuò)增子的20-25聚體探針。我們在不到一天內(nèi)合成針對感興趣擴(kuò)增子的全部可能探針的能力表明我們能憑經(jīng)驗(yàn)測試靈敏和特異性探針。接著，我們進(jìn)行對微陣列的雜交實(shí)驗(yàn)以選擇最靈敏和特異性的探針。鑒定了對易于區(qū)分H1和H3的探針的選擇；存在一些在2個擴(kuò)增子之間容易分化的擴(kuò)增子區(qū)。最好的探針可與胺修飾擬合用于在我們的手持式裝置中使用的環(huán)氧官能化的顯微載玻片或波導(dǎo)芯片上點(diǎn)樣。mRNA檢測方法。外周單核細(xì)胞(PBMC)的基因表達(dá)概況是監(jiān)測疾病狀態(tài)、環(huán)境接觸和感染的癥狀前階段診斷的有用方法。能夠進(jìn)行mRNA表達(dá)分析的我們的iMFC使用硬件平臺的稍加改變版本-額外TEC和增加的微陣列上的光照均勻性，并且可進(jìn)行：-PBMC選擇和裂解：使用用于從全血中純化PBMC的市售尺寸排阻濾器，和本文所述的細(xì)胞選擇器模塊。-mRNA純化：使用由聚-T寡核苷酸包被的微球從裂解的細(xì)胞中捕獲mRNA。-T7線性擴(kuò)增和標(biāo)記：使用現(xiàn)有PCR腔室用于T7擴(kuò)增和標(biāo)記以及市售試劑盒。-快速雜交：使用對雜交的動態(tài)測量來確定分析物濃度；將基因表達(dá)雜交所需的時(shí)間從多個小時(shí)降低到數(shù)分鐘。-T7擴(kuò)增利用現(xiàn)有的iMFCPCR模塊和市售試劑盒。mRNA純化。對于mRNA純化，我們使用可將mRNA雜交至聚T包被的珠，洗去污染物，并且然后從聚T珠釋放mRNA的微流體純化模塊。我們使用混合器，其將約5μm微球珠保持在溶液中并且使用新TEC來熔解在洗滌步驟之后從珠捕獲的mRNA。我們已經(jīng)測試了裝置來驗(yàn)證5-μm珠在風(fēng)箱混合腔室和濾器之間移動良好。我們也已經(jīng)證明流體可被加熱至約80℃以允許聚T:mRNA雙鏈變性?？焖匐s交。為了降低雜交時(shí)間并改善重復(fù)性，我們從動態(tài)速率參數(shù)推導(dǎo)濃度。在靶轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量與探針數(shù)相比過量的情況中，信號值對比時(shí)間應(yīng)該遵循動態(tài)曲線：Y＝C(1-e-rt),r＝koff+[A]kon在等式中，Y是背景扣除信號；koff和kon是取決于溫度、基因序列和探針移位的動態(tài)參數(shù)；[A]是溶液中靶基因的濃度；并且C是取決于包括光強(qiáng)度、探針密度、靶標(biāo)濃度和動態(tài)參數(shù)的多種因素的斜率因數(shù)。我們的探針選擇技術(shù)通過將等式與在多個濃度上的時(shí)間系列雜交信號來估計(jì)koff和kon?？蓛Υ孢@些估計(jì)并實(shí)時(shí)用于估計(jì)[A]。因?yàn)楣鈴?qiáng)度和探針合成密度的變化影響參數(shù)C而不是指數(shù)內(nèi)的變量，這種動態(tài)技術(shù)顯著改善了芯片間和同芯片上的復(fù)制可重復(fù)性。作為對概念的證明，我們已經(jīng)用動態(tài)速率方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從合成的25-堿基對寡聚體靶標(biāo)開始。一個探針針對A3對照標(biāo)記的寡核苷酸的動態(tài)響應(yīng)。各線表示針對不同濃度A3的響應(yīng)：50nM，100nM，300nM。使用非線性最小二乘擬合來估計(jì)各時(shí)間系列的參數(shù)C和r。然后，在多個濃度[A]下的實(shí)驗(yàn)顯示了r和[A]之間的仿射關(guān)系。我們鑒定了在r和[A]之間產(chǎn)生靈敏、可重復(fù)關(guān)系的條件。我們的數(shù)據(jù)顯示，該關(guān)系可出現(xiàn)在正確的方向上，對于[A]＝(50，100，300)nM，r＝(0.0031，0.0033，和0.0058)s-1。動態(tài)曲線擬合的另一個益處是，即時(shí)平衡值C證明好于動態(tài)速率r，擬合過程在短期噪音上平衡。我們以注意到測量動態(tài)參數(shù)的能力取決于iMFC使用漸消波僅激發(fā)熒光分子，該熒光分子結(jié)合至芯片表面，即時(shí)在靶標(biāo)溶液就位時(shí)也給出高信背比。蛋白質(zhì)檢測方法。一種擴(kuò)大iMFC平臺的檢測能力的方式是在微球免疫試驗(yàn)中包括蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，其使用用寡核苷酸標(biāo)記的抗體來在存在靶抗原時(shí)產(chǎn)生非線性可擴(kuò)增DNA靶標(biāo)，并且我們已經(jīng)基于SRI的證明的微球免疫-PCR試驗(yàn)(MSiPCR)用iMFC平臺開發(fā)了免疫試驗(yàn)?zāi)K。生物素化的靶標(biāo)特異性抗體偶聯(lián)到鏈霉親和素-包被的6-μm聚苯乙烯珠上用于靶抗原的初始捕獲。獨(dú)立的靶標(biāo)特異性抗體化學(xué)偶聯(lián)一個寡核苷酸用于對靶蛋白質(zhì)的二次捕獲事件。2個蛋白質(zhì)捕獲事件之間的廣泛洗滌洗去了任何未結(jié)合的靶標(biāo)以及游離偶聯(lián)物。然后使用特異性標(biāo)記的引物組和taqman探針來擴(kuò)增剩余的珠部分。擴(kuò)增的核酸信號隨后雜交至微陣列上用于檢測和讀取。我們已經(jīng)將臺式試驗(yàn)轉(zhuǎn)移到iMFC平臺中：我們的概念驗(yàn)證的iMFC平臺的模塊系統(tǒng)納入風(fēng)箱混合器用于洗滌和孵育步驟，以及濾器用于在核酸擴(kuò)增后捕獲珠。系統(tǒng)改進(jìn)?？筛淖児鈱W(xué)模塊以在微陣列光柵中提供更均一的圖案，并且使用532nm激發(fā)來改善檢測信噪比。從635nm切換到532nm激發(fā)光源的過程僅僅是改變光柵間距的問題。這種改變的光學(xué)塊由激光靶標(biāo)照射光學(xué)元件和微陣列成像光學(xué)元件同時(shí)組成。激光靶標(biāo)照射光學(xué)元件使用小的二極管泵送固態(tài)(DPSS)激光模塊，掃描聚焦光學(xué)元件，和2D掃描微型機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)鏡。DPSS激光模塊可輸出532nm的40-mW激光束用于激發(fā)Cy3染料分子?？墒褂镁劢构鈱W(xué)元件將光束聚焦到MEMS鏡上。2DMEMS鏡可掃描矩形上的點(diǎn)并且使光束瞄準(zhǔn)光柵。在從掃描鏡反射之后，光束射向掃描透鏡，其在光束進(jìn)入微陣列芯片上的光柵之前使光束準(zhǔn)直。該系統(tǒng)在整個光柵上，并且因此在整個微陣列上掃描相同激光點(diǎn)。這消除了來自線-生成光學(xué)元件的照射不均勻，其在強(qiáng)度上的變化可多達(dá)25％。掃描透鏡也使我們在光束進(jìn)入微陣列芯片光柵之前使光束準(zhǔn)直。我們用對新掃描技術(shù)方法的概念驗(yàn)證證明來驗(yàn)證。除了不同激發(fā)(532nm)和發(fā)射(570nm)波長的濾器以外，微陣列成像光學(xué)元件與本文的光學(xué)塊沒有變化。參考文獻(xiàn)1.Niemz,A.,T.M.Ferguson和D.S.Boyle,感染性疾病的護(hù)理點(diǎn)核酸測試(Point-of-carenucleicacidtestingforinfectiousdiseases).TrendsBiotechnol,2011.29(5):第240-50頁.2.Bissonnette,L.和M.G.Bergeron,通過護(hù)理點(diǎn)個性化醫(yī)療分子診斷技術(shù)的感染性疾病控制(InfectiousDiseaseManagementthroughPoint-of-CarePersonalizedMedicineMolecularDiagnosticTechnologies).JournalofPersonalizedMedicine,2012.2(4):第50-70頁.3.Foudeh,A.M.等，用于護(hù)理點(diǎn)診斷的病原體檢測的使用芯片上實(shí)驗(yàn)室裝置的微流體設(shè)計(jì)和技術(shù)(Microfluidicdesignsandtechniquesusinglab-on-a-chipdevicesforpathogendetectionforpoint-of-carediagnostics).LabChip,2012.12(18):第3249-66頁.4.Easley,C.J.等，具有樣品輸入-結(jié)果輸出能力的全集成微流體遺傳分析系統(tǒng)(Afullyintegratedmicrofluidicgeneticanalysissystemwithsample-in-answer-outcapability).ProcNatlAcadSciUSA,2006.103(51):第19272-7頁.5.Xu,G.等，用于快速流感病毒診斷的實(shí)時(shí)PCR和樣品制備的獨(dú)立一體筒(Aself-containedall-in-onecartridgeforsamplepreparationandreal-timePCRinrapidinfluenzadiagnosis).LabChip,2010.10(22):第3103-3111頁.6.Ferguson,B.S.等，在用于護(hù)理點(diǎn)診斷的微流體系統(tǒng)中對來自喉拭子樣品的H1N1流感病毒的遺傳分析(GeneticanalysisofH1N1influenzavirusfromthroatswabsamplesinamicrofluidicsystemforpoint-of-carediagnostics).JAmChemSoc,2011.133(23):第9129-35頁.7.Lam,B.等，30分鐘內(nèi)集成細(xì)胞裂解的無聚合酶鏈反應(yīng)的樣品至結(jié)果細(xì)菌檢測(Polymerasechainreaction-free,sample-to-answerbacterialdetectionin30minuteswithintegratedcelllysis).AnalChem,2012.84(1):第21-5頁.8.Chen,D.等，用于核酸分離、擴(kuò)增和檢測的集成獨(dú)立微流體盒(Anintegrated,self-containedmicrofluidiccassetteforisolation,amplification,anddetectionofnucleicacids).BiomedMicrodevices,2010.12(4):第705-19頁.9.Chen,Z.等，用于同時(shí)檢測口腔流體中的抗體和核酸的通用微流體裝置的開發(fā)(Developmentofagenericmicrofluidicdeviceforsimultaneousdetectionofantibodiesandnucleicacidsinoralfluids).BiomedResInt,2013.2013:第543294頁.10.Schumacher,S.等，用于護(hù)理點(diǎn)多參數(shù)分析的高度集成芯片上實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)(Highly-integratedlab-on-chipsystemforpoint-of-caremultiparameteranalysis).LabChip,2012.12(3):第464-73頁.本發(fā)明的實(shí)施方式包括：1.一種自動化核酸分析系統(tǒng)，包括在微流體連通中的樣品裂解、擴(kuò)增、PCR和檢測模塊，其設(shè)置成通過多序列擴(kuò)增和同時(shí)微陣列雜交讀取來對不同核酸序列進(jìn)行平行檢測。2.之前或之后權(quán)利要求的系統(tǒng)，其中：檢測模塊包含微陣列檢測光學(xué)元件，其包含采用漸消波激發(fā)和檢測的微陣列掃描儀；檢測模塊包含自動化雜交處理器，其設(shè)置成通過溫度提供多種嚴(yán)謹(jǐn)性；和/或PCR模塊設(shè)置成在單次反應(yīng)中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR。3.之前或之后權(quán)利要求的系統(tǒng)，包括包含模塊的集成微流體卡和分析儀，所述分析儀包含設(shè)置成接受卡的容器，設(shè)置成操作卡的操作器，和設(shè)置成電子控制操作器的控制器，該操作器包含流體致動器、PCR熱循環(huán)儀、和自動化雜交處理器以及微陣列檢測光學(xué)器件。4.之前或之后權(quán)利要求的系統(tǒng)，還包括設(shè)置成含有并遞送試劑至裂解、純化、PCR和檢測模塊的試劑模塊。5.之前或之后權(quán)利要求的系統(tǒng)，其是：便攜的：小于2000、1000或500in3并且小于50、25或10lbs；快速的：分析不到60、120、180或240分鐘；多重的：同時(shí)分析超過10、50、500種靶序列；和/或自動的：在樣品導(dǎo)入和結(jié)果展示之間不需要用戶介入。6.之前或之后權(quán)利要求的系統(tǒng)，其中：樣品包含蛋白質(zhì)分析物并且系統(tǒng)進(jìn)一步設(shè)置成用包含核酸序列的標(biāo)簽來標(biāo)記蛋白質(zhì)分析物；錨定的探針通過其空間位置限定序列；使用比被分析序列的數(shù)目少的引物對數(shù)來達(dá)到/實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增；不同核酸序列是多物種/生物體的；PCR模塊包含金屬(例如，鋁)PCR反應(yīng)腔室；微流體連通包含經(jīng)設(shè)置用于去除氣泡的透氣膜，其中透氣膜在通道層之下，使得整個通道暴露于大氣壓中(在一個具體的實(shí)施方式中，該膜跨越所述卡，因?yàn)榕c單獨(dú)的片相比其更易于被制成層，雖然其僅僅在通道層之下起作用)；擴(kuò)增完全包含在耗材(例如，無開口管)中；和/或檢測是基于探針組而不是引物組(易于構(gòu)建新的測試)。7.之前或之后權(quán)利要求的系統(tǒng)，其設(shè)置成：在單個容器中擴(kuò)增(無樣品裂解)；接受并處理血液、唾液、GI樣品、尿液、傷口拭子、脊椎穿剌、鼻拭子、獸醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)來源的分析物樣品；通過試樣收集工具或運(yùn)輸介質(zhì)接受樣品；處理1-100ul的樣品體積；是模塊化的(模塊可互換以支持不同應(yīng)用)；能夠測量(通過通道尺寸和氣泡去除進(jìn)行)；和/或是單向或自封閉的(防止樣品交叉污染)。8.之前或之后權(quán)利要求的系統(tǒng)，包括包含模塊的集成微流體卡和包含外殼(盒)的分析儀，并且在外殼內(nèi)包括設(shè)置用于接受卡的容器，其中該分析儀：接合卡以進(jìn)行裂解、純化、PCT(擴(kuò)增和標(biāo)記)、和檢測；通過壓力(例如，樣品運(yùn)輸)、磁場(例如，樣品混合)、溫度(例如，擴(kuò)增、嚴(yán)謹(jǐn)性、雜交)和/或光(例如，雜交檢測)與樣品相互作用；和/或通過將漸消波與樣品偶聯(lián)來進(jìn)行檢測以實(shí)時(shí)觀察雜交和/或確定產(chǎn)生序列信息的可能堿基對錯配和動力學(xué)。9.之前或之后權(quán)利要求的系統(tǒng)，包括包含模塊的集成微流體卡(筒)的系統(tǒng)，其中該卡設(shè)置成：對疾病類型有特異性(例如，呼吸道疾病)；對患者類型有特異性(例如，小兒)；對病原體類型有特異性(例如，生物戰(zhàn)試劑)；對個體有特異性(例如，藥物基因組學(xué))；含有針對患者特異性信息的獨(dú)特標(biāo)識；用于一次性使用以保持無菌并最小化交叉污染；使用輥到輥生產(chǎn)步驟產(chǎn)生；和/或來自聚碳酸酯底架、金屬箔PCR腔室、丙烯酸組分、可呼吸膜材料、和/或聚氨酯密封。10.之前權(quán)利要求的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)功能性集成微流體熒光-活化細(xì)胞分選儀(μFACS)，其設(shè)置成提供用于顆?；蚣?xì)胞比對的流體力學(xué)和/或慣性聚焦并且包含設(shè)置成用于分選的微孔電活性聚合物(EAP)致動器。11.一種包括使用之前權(quán)利要求的系統(tǒng)通過多重序列擴(kuò)增和同時(shí)微陣列雜交讀取來平行檢測不同分析物核酸序列的方法。其他實(shí)施方式及其實(shí)施例詳述：用于新護(hù)理點(diǎn)、便攜式和高度集成應(yīng)用的高效熒光活化分選(FACS)。高端市售FACS設(shè)備通過靜電偏轉(zhuǎn)在帶電液滴內(nèi)含有的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了10,000至40,000分選/s的分選速率[1,2]。它們可應(yīng)用于廣泛的應(yīng)用，例如，分離用于免疫療法的癌癥靶向T細(xì)胞，富集干細(xì)胞用于組織工程改造，和分離特定細(xì)胞用于操作或進(jìn)一步分析(例如，DNA測序、RNA表達(dá)和熒光原位雜交)。然而，它們的大且昂貴的設(shè)備，其需要專家級的操作者并且因此不適于護(hù)理點(diǎn)或便攜式應(yīng)用。另外，它們的整體性意味著它們不能容易地與其他儀器或過程集成。在解決這些限制的嘗試中，研究者已經(jīng)開發(fā)了許多微流體FACS變種。直到最近，這些裝置是緩慢的(比常規(guī)FACS慢超過1個數(shù)量級)，并且大多數(shù)難以制造或者不適于制造和實(shí)際應(yīng)用。隨著脈沖激光活化細(xì)胞分選(PLACS)的發(fā)展，本領(lǐng)域的微流體狀態(tài)增加至約10000個細(xì)胞/s，并具有高純度[3]。在PLACS中，使用通過快速膨脹和接觸血漿氣泡產(chǎn)生的流體噴射來分選細(xì)胞。雖然流體裝置是簡單、連接并且便攜的，該系統(tǒng)需要高重復(fù)率的脈沖激光，其是昂貴且大的。因此，PLACS無法解決規(guī)模和費(fèi)用上的挑戰(zhàn)。我們公開了基于EAP的流體致動的更簡單方法，其是響應(yīng)電刺激改變形狀的聚合物。它們已經(jīng)用于微流體裝置以改變通道的截面幾何形狀，生成用于電泳分離的小注射[4]，改變通道的流體阻力并且清除堵塞[5]。我們已經(jīng)開發(fā)了新的高效微流體EAP(μEAP)致動器并將其集成到微-FACS中。電活性聚合物致動。我們的流體致動器包括封閉端流體腔室，其中一個或多個表面包含EAP。在一個實(shí)施方式中，腔室的底面是用薄(約12μm)的介電彈性體(硅酮)的EAP層覆蓋的電極。概念上，硅酮向柔性電容那樣作用。其在向電極施加電壓時(shí)扭曲，增加腔室體積并且將流體抽入腔室中。當(dāng)增加電壓時(shí)，硅酮松弛并且將流體推離腔室。易于使用已證實(shí)的小規(guī)模制造技術(shù)來制造EAP致動器。為了產(chǎn)生致動器，我們使電極在氧化銦錫包被的載片上形成圖案，其變?yōu)榛?。我們?nèi)缓髮⒁粚游垂袒囊?guī)定在載片上結(jié)網(wǎng)并使其熱固化。為了產(chǎn)生通道層，我們使用常規(guī)軟光刻來模塑微流體通道。我們?nèi)缓笸ㄟ^將通道層與硅酮包被的載片對齊并等離子體結(jié)合來完成裝置。致動器與軟光刻的相容性意味著它們可易于集成到微流體裝置的大的現(xiàn)有文庫中。其也能夠進(jìn)行快速原型制造。這種裝置是廉價(jià)的，因?yàn)樗鼈儍H需要電壓源用于致動，并且制造方法適于低成本制造。在具體的示例中，我們制造了<1mm2的致動器，其證明10μs的響應(yīng)時(shí)間；然而，致動器尺寸也可以是微米級的(例如，小于1、10或100μm2)并且響應(yīng)時(shí)間可小于10、1、0.1μs，更短的響應(yīng)時(shí)間。它們的尺寸選項(xiàng)使得它們特別適于手持和集成應(yīng)用并用于平行操作。這些示例性EAP致動器的快速響應(yīng)速率(<20μs)也表明它們>25,000個細(xì)胞/s的分選速率。該裝置是廉價(jià)的，因?yàn)樗鼈儍H需要電壓源來致動并且是使用低成本微制造技術(shù)構(gòu)建的。將硅酮用作聚合物使得能夠通過軟光刻將EAP致動器與微流體通道簡單集成。這使得能快速原型制造并具有規(guī)模放大到制造量級的潛力。EAPμFACS以手持式遞送與臺式FACS等同的通量。我們已經(jīng)優(yōu)化了EAPμFACS的性能并且將改進(jìn)的裝置納入與iMFC系統(tǒng)集成的細(xì)胞濃縮/分選模塊中。該模塊通過濃縮大體積的稀釋細(xì)胞濃縮物(例如，環(huán)境樣品中存在的細(xì)菌，一些細(xì)菌細(xì)胞/ml)或從許多細(xì)胞的背景中分選出選擇細(xì)胞(例如，從全部外周血單核細(xì)胞中分選出活化的T細(xì)胞)是系統(tǒng)增加操作包封。下文進(jìn)一步描述了微型分選器的實(shí)施方式。分選器設(shè)計(jì)。分選器進(jìn)行3個關(guān)鍵功能：比對、檢測和分選。我們的設(shè)計(jì)(例如，圖9)納入多重創(chuàng)新，包括將流體力學(xué)和慣性聚焦組合用于比對，和使用EAP致動用于快速分選。在常規(guī)細(xì)胞分選器中，使用同軸鞘流在水平和垂直上同時(shí)聚焦顆?；蚣?xì)胞，該同軸鞘流捏合緊密的樣品流。由于大多數(shù)微流體裝置是平面的，它們僅可在一個方向上聚焦顆粒(即，水平)；多層裝置也可垂直或縱向聚焦顆粒，但對于制造而言明顯更為復(fù)雜。在沒有垂直聚焦的情況下，顆?？稍谕ǖ赖母叨壬戏植?，導(dǎo)致速度上的變化并且重疊。在我們的設(shè)計(jì)中，我們通過流體力學(xué)聚焦在截面區(qū)中水平比對并且通過慣性聚焦在長“頸”中垂直比對。當(dāng)流體速度足夠高以對顆粒生成升力時(shí)出現(xiàn)慣性聚焦[6]。該組合使我們能在單層裝置中有效比對顆粒，這保持了我們的簡單制造方法。為了分選，我們首先使用熒光檢測顆粒，其中在檢測到靶標(biāo)顆粒之后，向一個或多個EAP致動器施加電壓脈沖。致動器產(chǎn)生瞬時(shí)交叉流，其將靶標(biāo)顆粒偏轉(zhuǎn)到新的路徑上，該路徑通道分選輸出，如圖9所示。圖9是顯示μEAPFAC的通道布局的EAP微分選儀示意圖。插圖顯示通道的主要功能。通過流體力學(xué)聚焦(左)完成水平比對，而通過惰性聚焦(中)實(shí)現(xiàn)垂直比對。最后，通過μEAP致動器(右)對靶標(biāo)顆粒進(jìn)行分選。延長接觸圖像顯示了來自未分選和分選的顆粒的條紋。流速為8μl/分鐘(107mm/s)，并且致動脈沖為400V下1ms。使用180°異步運(yùn)行的配對致動器通過使施加在流體上的力翻倍并且降低流體阻力顯著改善了性能，該阻力與通道長度成比例。用兩個致動器，一個“拉”而另一個“推”流體，并且流體僅沿著致動器之間的短距離移動(一般為約2mm)。相反，用單個致動器，流體移動發(fā)生在從致動器到裝置輸出(約30mm)。為了測試我們的μFACS裝置，我們使用檢測和控制系統(tǒng)，其由落射熒光顯微鏡、電荷耦合裝置(CCD)相機(jī)、光電倍增管、基于場-可編程-門控-陣列(FPGA)的數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)、和電壓放大器組成。初始顆粒分離證明。為了證明μEAP分選器的分離能力，我們通過在綠色熒光信號上門選并向EAP致動器施加620-V，500-μs脈沖分選了綠色(7μm)和紅色(5μm)熒光顆粒的混合物。流體流速為10μl/分鐘，其產(chǎn)生133mm/s的平均線速度。未分選的細(xì)胞沿著其默認(rèn)路徑通向廢料通道，而分選的細(xì)胞偏轉(zhuǎn)至通過分選通道排出的路徑(圖10)。我們從含有能分選和不能分選的2個流體輸出捕獲10-μl流體體積。在分離的手動細(xì)胞儀中對體積進(jìn)行成像?；诩?xì)胞儀的結(jié)果，我們估計(jì)100％的純度和93％的產(chǎn)率。致動器性能優(yōu)化。按照我們對概念的最初證明，我們啟動了對EAP流體致動器的設(shè)計(jì)研究以改善我們的分選通量。我們使用COMSOLMultiphysics來開發(fā)簡化的致動器機(jī)電模型。我們的結(jié)果顯示，大多數(shù)致動發(fā)生在裝置的周邊?；谶@些結(jié)果，我們開發(fā)了一定范圍的致動器設(shè)計(jì)并且憑經(jīng)驗(yàn)測試它們的性能。通過增加施加的電壓并改變致動器幾何形狀，我們能夠改善EAP致動器的性能。我們成功地用25-μs，800V脈沖以30μl/分鐘(400mm/s)的流速分選顆粒，這比我們最初的顆粒分離證明中使用的分選器有20倍的改善。細(xì)胞分選證明。為了證明μEAPFACS內(nèi)的細(xì)胞分離，我們用熒光標(biāo)記的B細(xì)胞制備小鼠淋巴細(xì)胞樣品。白細(xì)胞通過離心分離開并且然后在用藻紅蛋白-偶聯(lián)的B220抗體標(biāo)記之前固定。將樣品輸入FACS。圖11顯示了分選的B細(xì)胞的圖像。用100-μs，800-V脈沖，以11μl/分鐘(147mm/s)進(jìn)行分選。注意熒光裂口在中心最亮。因?yàn)闃?biāo)記的細(xì)胞比熒光顆粒明顯更暗，我們使用488-nm二極管激光來照射檢測區(qū)中的細(xì)胞，同時(shí)更暗的發(fā)光二極管(LED)燈提供了全視野照射。右側(cè)的亮點(diǎn)是通過污染纖絲在壁上捕獲的細(xì)胞。多分選器集成。由于其直接制造和與軟光刻的相容性，μEAP分選器能易于集成到更復(fù)雜的裝置中。為了顯示我們的EAP致動器的集成能力，我們開發(fā)了特征為多個獨(dú)立分選器的其他裝置。圖12顯示了雙通道裝置中的平行分選，其中延長時(shí)間接觸顯示了在平行通道中獨(dú)立分選的2種顆粒，并且圖13顯示了雙階段系列分選到多輸出中，其中延長時(shí)間接觸顯示由2個連續(xù)分選器分選到3個箱中的一個的2種顆粒-注：箱3是默認(rèn)(未分選)箱。類似地構(gòu)建更高級的多通道平行和多階段連續(xù)分選構(gòu)造。我們的微流體熒光活化細(xì)胞分選器(μFACS)提供了分選顆粒所需的所有功能：比對顆粒、檢測其熒光信號、基于熒光作出分選決定、然后適當(dāng)分選。證明的能力包括：用短至20μs的多種致動器脈沖長度的顆粒分選；用多致動器和單致動器構(gòu)造的分選；在多通道分選器中的獨(dú)立平行分選；在多階段分選器中的順序分選。微電活性聚合物(μEAP)分選器的益處包括：(a)通過簡單電輸入快速觸發(fā)分選(證明的20μsec分選)；(b)μEAP致動器與多種微制造技術(shù)相容；和(c)μEAP分選器易于集成、并行并且非常適于便攜規(guī)模的裝置。參考文獻(xiàn)[1]H.M.Shapiro，《實(shí)踐性流式細(xì)胞術(shù)》(PracticalFlowCytometry),JohnWiley&Sons,2003.[2]M.E.Piyasena和S.W.Graves,“流式細(xì)胞術(shù)與微流體和微制造的交叉(Theintersectionofflowcytometrywithmicrofluidicsandmicrofabrication),”LabonaChip,14,1044-1059,2014.[3]Y.Chen,T.-H.Wu,Y.-C.Kung,M.A.Teitell和P.-Y.Chiou,“3D脈沖的激光觸發(fā)的高速微流體熒光活化細(xì)胞分選器(3Dpulsedlaser-triggeredhigh-speedmicrofluidicfluorescence-activatedcellsorter),”Analyst,138,7308-7315,2013.[4]A.K.Price,K.M.Anderson和C.T.Culberson,“對在微流體電泳裝置上的集成電活性聚合物致動器的證明(Demonstrationofanintegratedelectroactivepolymeractuatoronamicrofluidicelectrophoresisdevice),”LabonaChip,9,2076-2084,2009.[5]C.Murray,D.McCoul,E.Sollier,T.Ruggiero,X.Niu,Q.Pei,D.DiCarlo,“用于使用聚合物致動器主動調(diào)節(jié)通道幾何形狀的電適應(yīng)微流體(Electro-adaptivemicrofluidicsforactivetuningofchannelgeometryusingpolymeractuators),”MicrofluidicsandNanofluidics,14,345-358,2013.[6]D.DiCarlo,D.Irimia,R.G.Tompkins和M.Toner,“在微通道中連續(xù)慣性聚焦、排序和分離顆粒(Continuousinertialfocusing,ordering,andseparationofparticlesinmicrochannels),”ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,104,18892-18897,2007.本發(fā)明的實(shí)施方式包括：1.設(shè)置在流通道周圍的高效微流體電活性聚合物(μEAP)致動器，其中施加于致動器的電壓脈沖誘導(dǎo)致動器在流通道之間產(chǎn)生瞬時(shí)交叉流，其將流通道內(nèi)的靶顆粒偏轉(zhuǎn)到新的路勁上，其中該致動器包含封閉端流體腔室，其中腔室的表面包含由介電彈性體的EAP層覆蓋的電極。2.如權(quán)利要求1所述的多個致動器，其設(shè)置在流通道周圍并且彼此異步的致動器，其中施加到致動器的電壓脈沖誘導(dǎo)致動器在流通道之間產(chǎn)生瞬時(shí)交叉流，其將流通道內(nèi)的靶顆粒偏移到新的路徑上，其中各致動器包含封閉端流體腔室，其中腔室的表面包含由介電彈性體的EAP層覆蓋的電極。3.如權(quán)利要求1所述的一對致動器，其設(shè)置在流通道周圍并且彼此異步180°的致動器，其中施加到致動器的電壓脈沖誘導(dǎo)致動器在流通道之間產(chǎn)生瞬時(shí)交叉流，其將流通道內(nèi)的靶顆粒偏移到新的路徑上，其中各致動器包含封閉端流體腔室，其中腔室的表面包含由介電彈性體的EAP層覆蓋的電極。4.之前或之后權(quán)利要求所述的致動器，其中腔室的多個表面包含由介電彈性體的EAP層覆蓋的電極。5.之前或之后權(quán)利要求所述的致動器，其中流通道設(shè)置成提供用于顆粒的水平比對的流體力學(xué)聚焦和用于垂直比對的慣性聚焦的組合。6.之前或之后權(quán)利要求所述的致動器，其中新路徑通向分選輸出。7.之前或之后權(quán)利要求所述的致動器，其中流體通道包含樣品輸入通道以及分選和未分選的輸出通道，和導(dǎo)向分選輸出通道的新路徑。8.之前或之后權(quán)利要求所述的致動器，其中流體道設(shè)置成用于熒光檢測，其中在檢測到靶顆粒之后，向μEAP致動器施加電壓脈沖。9.之前或之后權(quán)利要求所述的致動器，其中EAP層是1-50(或2-25，或5-15μm厚)。10.之前或之后權(quán)利要求所述的致動器，其中彈性體是硅酮。11.之前或之后權(quán)利要求所述的致動器，其設(shè)置成在多通道裝置中提供平行分選。12.之前或之后權(quán)利要求所述的致動器，其設(shè)置成在多通道裝置中提供多階段連續(xù)分選。13.之前或之后權(quán)利要求所述的致動器，其功能性集成到熒光活化的顆粒分選器中。14.一種使用之前權(quán)利要求的致動器的方法，包括以下步驟：施加電壓脈沖以誘導(dǎo)致動器在流體通道之間產(chǎn)生瞬時(shí)交叉流，該交叉流將流通道內(nèi)的靶顆粒偏傳到新路徑上。本發(fā)明包括所述具體和優(yōu)選實(shí)施方式的所有組合。應(yīng)理解，本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅用于說明目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解據(jù)此作出的各種修飾或改變，且它們包括在本申請的主旨和權(quán)益以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文引用的所有發(fā)表物、專利和專利申請，包括其中的引用通過引用全文納入本文以用于所有目的。當(dāng)前第1頁1 2 3