專利名稱：使用集光多生色團檢測和分析多核苷酸－結(jié)合蛋白相互作用的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于樣品中多核苷酸的檢測和分析的方法、物品和組合物。
背景技術(shù)：
允許實時和高靈敏度多核苷酸分析的方法具有極大的科學(xué)和經(jīng)濟重要性。1，2，3其應(yīng)用包括醫(yī)學(xué)診斷、遺傳突變的鑒定、基因送遞監(jiān)控和特定的基因組學(xué)技術(shù)。4陽離子有機染料，例如溴化乙錠和噻唑橙，在插入雙鏈DNA(dsDNA)的溝時發(fā)光，并起直接DNA雜交探針的作用，但是缺乏序列特異性。5，6存在鏈特異性測定的能量/電子轉(zhuǎn)移生色團對，但是需要兩個核酸的化學(xué)標(biāo)記，或同一個變化的鏈的雙重修飾(例如分子信標(biāo))。7，8標(biāo)記兩個DNA位點的困難導(dǎo)致了低收率、高成本和單一標(biāo)記的雜質(zhì)，這些降低了檢測靈敏度。9本領(lǐng)域需要檢測和分析樣品中特定多核苷酸的方法、以及在這類方法中有用的組合物和制品。
發(fā)明概述提供檢測和測定樣品中靶多核苷酸的方法、組合物和制品。
在第一個實施方案中，將懷疑含有靶多核苷酸的樣品與聚陽離子多生色團及傳感器多核苷酸結(jié)合蛋白(PBP)接觸，所述PBP可以與靶多核苷酸結(jié)合。傳感器PBP包括信號生色團。不欲受理論束縛，相信在樣品中靶多核苷酸的存在下，可利用與結(jié)合到傳感器PBP的靶多核苷酸主鏈的靜電相互作用，將信號生色團引入陽離子多生色團附近(見

圖1)。信號生色團于是可以從激發(fā)的聚陽離子多生色團獲得能量，并發(fā)射可檢測光。由于出現(xiàn)在樣品中，所以靶多核苷酸可以得到分析，或可以在分析前或在分析同時得到擴增。
提供了解決方案，包括有利于進行本發(fā)明方法的試劑，以及含有這類試劑的試劑盒。該方法可用于多重設(shè)置中，在該設(shè)置中，使用多種不同的傳感器PBP以測定多種不同的靶多核苷酸。使用例如表面結(jié)合的聚陽離子多生色團，可選在表面進行該方法；該表面可以是傳感器。也可以以均一的形式提供該方法。在此描述的方法和物品可用作其他的檢測多核苷酸技術(shù)的替代。
附圖簡述圖1描述了本發(fā)明使用聚陽離子聚合物作為集光多生色團的方法。傳感器PBP(PBP-C*)包括信號生色團和對感興趣的靶多核苷酸的結(jié)合特異性。在與樣品中的靶多核苷酸接觸后，聚陽離子多生色團由于其與靶多核苷酸特有的相互作用而被引入信號生色團附近。然后多生色團的激發(fā)從信號生色團產(chǎn)生光發(fā)射。
圖2描述了在工作實施例中使用的Tat-C*(其中C*為熒光素)、TAR RNA和dTAR RNA的分子結(jié)構(gòu)。
圖3顯示聚合物1及Tat-C*的光譜。分別在380nm和480nm激發(fā)聚合物1和Tat-C*。測定條件為TRIS EDTA緩沖液(10mM)，pH＝7.4。
圖4顯示寡聚體1及Tat-C*的光譜。分別在365nm和480nm激發(fā)寡聚體1和Tat-C*。測定條件為TRIS EDTA緩沖液(10mM)，pH＝7.4。
圖5顯示寡聚體2及Tat-C*的光譜。分別在375nm和480nm激發(fā)寡聚體2和Tat-C*。測定條件為TRIS EDTA緩沖液(10mM)，pH＝7.4。
圖6顯示通過在365nm激發(fā)寡聚體1，Tat-C*在TAR RNA和dTAR RNA存在下的發(fā)射光譜。條件為TRIS EDTA緩沖液(10mM)中，pH＝7.4。關(guān)于寡聚體1的發(fā)射對光譜進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖7顯示通過在375nm激發(fā)寡聚體2，Tat-C*在TAR RNA和dTAR RNA存在下的發(fā)射光譜。條件為TRIS EDTA緩沖液(10mM)中，pH＝7.4。關(guān)于寡聚體2的發(fā)射對光譜進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖8顯示通過在380nm激發(fā)聚合物1，Tat-C*在TAR RNA和dTAR RNA存在下的發(fā)射光譜。條件為TRIS EDTA緩沖液(10mM)中，pH＝7.4。關(guān)于聚合物1的發(fā)射對光譜進行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖9顯示通過在365nm激發(fā)寡聚體1，SH3-C*和Tat-C*在TARRNA存在下的發(fā)射光譜。條件為TRIS EDTA緩沖液(10mM)中，pH＝7.4。關(guān)于寡聚體1的發(fā)射對光譜進行標(biāo)準(zhǔn)化。
發(fā)明詳述本文的DNA和RNA傳感器技術(shù)(包括“基因芯片”和“DNA芯片”)依賴于熒光標(biāo)簽(生光團)與DNA單鏈的共價附著。這些傳感器大多被迫依賴于分析物樣品的標(biāo)記，樣品間標(biāo)記反應(yīng)效率的變化導(dǎo)致不可避免的問題，使得需要復(fù)雜的交叉校準(zhǔn)。其他系統(tǒng)依賴于“分子信標(biāo)”途徑，從而需要生光團和猝滅劑與精確設(shè)計的序列的附著。
提供了多核苷酸分析方法，該方法包括將樣品與至少兩種成分接觸；(a)集光的發(fā)光多生色團系統(tǒng)，例如水溶性的綴合聚合物、半導(dǎo)體量子點(quantum dot)或樹枝狀結(jié)構(gòu)之類，以及(b)與發(fā)光信號生色團綴合的傳感器PBP(“PBP-C*”)。在多生色團的激發(fā)后，信號生色團C*光特征波長的發(fā)射顯示溶液中靶多核苷酸的存在。通過使用多個不同的傳感器PBP，每個具有不同的基本序列，和不同的信號生色團(PBPI-C1*，PBP2-C2*，PBP3-C3*，PBP4-C4*，等)，可以獨立檢測和測定多個不同的多核苷酸。
選擇集光生色團和信號生色團(C*)，以使兩個生色團的吸收譜帶具有最小重疊，并使兩個種類的發(fā)光發(fā)射光譜位于不同的波長。在水溶液中制備時，集光發(fā)光多生色團系統(tǒng)為正電荷的或陽離子的，優(yōu)選為聚陽離子的(例如聚陽離子綴合的聚合電解質(zhì))。選擇傳感器PBP和多生色團，以使其在不存在靶時具有最弱的相互作用。在加入能與傳感器PBP結(jié)合的靶多核苷酸后，靶多核苷酸與傳感器PBP形成復(fù)合物。由于靶多核苷酸為負電荷，所以使傳感器PBP與聚陽離子多生色團結(jié)合，從而允許能量經(jīng)例如Frester能量轉(zhuǎn)移機制從聚陽離子多生色團向信號生色團轉(zhuǎn)移。當(dāng)加入不與傳感器PBP結(jié)合的多核苷酸時，不發(fā)生多生色團和傳感器PBP之間的復(fù)合。因為在這類復(fù)合物不存在時，聚陽離子多生色團和信號生色團之間的平均距離對于有效的能量轉(zhuǎn)移而言太遠，所以僅有很少或沒有來自信號生色團的發(fā)射。全部方案用于檢測測試溶液中靶多核苷酸的存在。
除了描述的方法之外，本發(fā)明提供包括至少兩種成分的主要水溶液；(a)陽離子多生色團，以及(b)“傳感器PBP”(PBP-C*)，包括與信號生色團綴合的多核苷酸結(jié)合蛋白。
如實施例中所示例的，由諸如綴合聚合物之類的水溶性多生色團提供的光學(xué)放大可以用于檢測與PBP傳感器結(jié)合的多核苷酸。如此處所描述的，使用較高分子量的水溶性綴合聚合物或其他結(jié)構(gòu)作為聚陽離子多生色團，可以增強放大?？梢圆捎美脽晒鈾z測方法的便利的均一形式提供本發(fā)明。本方法可用于檢測擴增的靶多核苷酸，或者由于巨大的信號放大，作為單獨鏈測定，不需要多核苷酸擴增。
因此，本發(fā)明超過現(xiàn)有基因芯片技術(shù)的獨特優(yōu)點包括避免了在分析前通過生光團或生色團與多核苷酸的共價偶聯(lián)來首先標(biāo)記各待分析樣品的要求，其中多核苷酸包含于樣品中或從樣品衍生。這些偶聯(lián)方法在偶聯(lián)效率的重復(fù)性上具有固有的困難，并導(dǎo)致需要樣品間的交叉校準(zhǔn)。
對于可以關(guān)于靶多核苷酸查詢樣品的任何測定，此處描述的發(fā)明都是有用的。一般的測定涉及確定樣品中靶多核苷酸的存在或其相對量，或者測定可以為定量或半定量的。
本發(fā)明的方法都可以用多重形式進行。使用綴合到各自傳感器PBP上的不同的信號生色團，許多不同的傳感器PBP可用于檢測樣品中相應(yīng)的不同的靶多核苷酸。提供使用2、3、4、5、10、15、20、25、50、100、200、400或更多不同傳感器PBP的多種方法，這些傳感器PBP可以同時用于測定相應(yīng)的不同靶多核苷酸。
可以在基片上以及在溶液中進行本方法，盡管由于擴散問題預(yù)期溶液形式更為快速。因此可以采用例如在基片上的陣列形式進行測定，其中基片可以是傳感器。這可以通過將測定成分(例如傳感器PBP、聚陽離子多生色團或兩者)錨定或另外整合到基片上而實現(xiàn)。這些基片可以是玻璃、硅、紙、塑料表面，或用作光電轉(zhuǎn)換器的光電半導(dǎo)體(例如但是不限于銦摻雜的氮化鎵或聚合的聚苯胺等)表面。給定傳感器PBP的位置可以是已知的或以陣列形式確定，且陣列形式可以是可微編址的(microoddressable)或可毫微編址的(nanoaddressable)。
在對本發(fā)明進行更為詳細的描述之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限定于所描述的特定方法學(xué)、設(shè)備、方案或儀器，因為這類方法、設(shè)備、方案或儀器當(dāng)然是可變的。也應(yīng)理解，此處使用的術(shù)語學(xué)僅出于描述特定實施方案的目的，而無意限制本發(fā)明的范圍。
除非上下文另外明確指出，單數(shù)形式“一個(a)”、“一個(an)”和“該(the)”的使用包括復(fù)數(shù)涵義。因此，例如，“一個靶多核苷酸”的涵義包括許多靶多核苷酸，“一個信號生色團”的涵義包括許多這類生色團，“一個傳感器PBP”的涵義包括許多傳感器PBP等。另外，除非上下文另外明確指出，具體復(fù)數(shù)涵義的使用，例如“二”、“三”等，理解為大量的相同主題。
除非上下文另外明確指出，術(shù)語“連接的”、“附著的”以及“相聯(lián)的”在此可互換使用，且包括直接和間接連接、附著、相聯(lián)或綴合。在描述值范圍之時，應(yīng)當(dāng)理解，在所述范圍的上、下限之間的各居間整數(shù)值及其分數(shù)，連同這些值之間的各個子范圍也得以具體地公開。任何范圍的上、下限可以獨立包括于該范圍內(nèi)或從該范圍內(nèi)排除，且包括任一、無一或兩個界限的各范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。當(dāng)所討論的值具有固有界限時，例如組分可以以0至100％的濃度存在，或者水溶液的pH可以分布于1至14范圍內(nèi)，這些固有的界限得以具體公開。當(dāng)明確列舉值時，也應(yīng)理解，與列舉值約相等量或數(shù)量的數(shù)值也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，在此基礎(chǔ)之上的范圍也一樣。公開組合物時，該組合物成分的各亞組合物也得以具體公開，并在本發(fā)明范圍內(nèi)。反過來，公開不同成分或幾組成分時，其組合物也得以公開。當(dāng)發(fā)明的任何成分作為具有眾多替代物而進行公開時，發(fā)明的實施例也從而得以公開，在所述實施例中，各替代物單獨或與其他替代物組合被排除在外；多于一個發(fā)明成分可以具有這類排除物，且具有這類排除物的成分的所有組合物也由此得以公開。
除非另有定義或上下文另有說明，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的相同的涵義。在本發(fā)明的實踐或測試中，盡管可以使用與此處所描述的方法和材料相似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒ê筒牧?，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。
出于公開和描述引用文獻的特定材料和方法學(xué)的目的，將這里提及的所有出版物引入作為參考。在此討論的出版物僅僅由于其公開內(nèi)容早于本申請的提交日而提供。在此不能解釋為承認本發(fā)明不能依靠在先發(fā)明而具有早于所述公開內(nèi)容的權(quán)利。
定義在本發(fā)明的描述中，下列術(shù)語將得到使用，并旨在按照下文說明而定義。
術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在此可以互換使用，指任何長度的核苷酸的聚合形式，且可以包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、其類似物或其混合物。這些術(shù)語僅指分子的一級結(jié)構(gòu)。因此，該術(shù)語包括三、雙和單鏈脫氧核糖核酸(“DNA”)以及三、雙和單鏈核糖核酸(“RNA”)。該術(shù)語也包括經(jīng)例如烷基化和/或加帽修飾的多核苷酸及其未修飾形式。
無論經(jīng)過修飾或未修飾，靶核苷酸都應(yīng)當(dāng)具有聚陰離子主鏈，優(yōu)選糖磷酸酯主鏈，所述聚陰離子主鏈具有足夠的負電荷以與在此描述的方法中聚陽離子多生色團靜電相互作用，盡管其他力可以另外參與相互作用。在不存在靶時，傳感器PBP是與多生色團最小相互作用的多核苷酸結(jié)合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定合適的給定測定形式的結(jié)合條件；可調(diào)節(jié)的非限制性參數(shù)包括測定成分的濃度、pH、使用的鹽及其濃度、離子強度、溫度等。
更具體地，術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)；多核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA和mRNA，無論剪接或未剪接；作為嘌呤或嘧啶堿基N-或C-糖苷的任何其他形式的多核苷酸；以及含有磷酸或其他聚陰離子主鏈的聚合物；以及其他合成的序列特異性核酸聚合物，前提是所述聚合物以允許堿基配對和堿基堆積(例如見于DNA和RNA中)的構(gòu)型含有核堿基(nucleobase)。在術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”之間沒有對長度的有意區(qū)別，這些術(shù)語在此可以互換使用。這些術(shù)語僅指分子的一級結(jié)構(gòu)。因此這些術(shù)語包括，例如3’-脫氧-2’，5’-DNA、寡脫氧核苷酸N3’P5’氨基磷酸酯、2’-O-烷基取代的RNA、雙和單鏈DNA以及雙和單鏈RNA及其雜交體，所述雜交體包括例如DNA和RNA之間的雜交體，這些術(shù)語也包括已知的修飾類型，例如標(biāo)記、烷基化、“帽”、一個或多個核苷酸被類似物取代、核苷酸間修飾，例如具有負電荷連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、含有懸垂部分例如蛋白(包括酶(例如核酸酶)、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)的那些、具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)的那些、含有螯合物(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的那些、含有烷化劑的那些、具有修飾連接(例如α異頭核酸等)的那些、以及多核苷酸或寡核苷酸的未修飾形式。
應(yīng)當(dāng)理解，此處使用的術(shù)語“核苷”和“核苷酸”將包括不僅含有已知嘌呤和嘧啶堿基而且含有其他經(jīng)過修飾的雜環(huán)堿的那些部分。這類修飾包括甲基化嘌呤或嘧啶、?；堰驶蜞奏せ蚱渌s環(huán)。修飾的核苷或核苷酸也可以包括在糖部分的修飾，例如其中的一個或多個羥基以鹵素、脂族基取代或官能化為醚、胺等。術(shù)語“核苷酸單位”旨在包括核苷和核苷酸。
另外，對核苷酸單位的修飾包括對分別與互補嘧啶或嘌呤形成氫鍵的嘌呤或嘧啶堿基上的官能團的重排、附加、取代或其他改變。結(jié)果產(chǎn)生的修飾核苷酸單位可以任選地與其他這樣修飾的核苷酸單位而非A、T、C、G或U形成堿基對?？梢哉喜蛔璧K多核苷酸功能的脫堿基位點；多核苷酸優(yōu)選不包括脫堿基位點。多核苷酸中的一些或全部殘基可以任選地以一種或多種方法修飾。
在允許胸苷的N3-H和C4-氧分別與腺苷的N1和C6-NH2之間、胞苷的C2-氧、N3和C4-NH2分別與鳥苷的C2-NH2、N’-H和C6-氧之間形成氫鍵的條件下，形成標(biāo)準(zhǔn)A-T和G-C堿基對。因此，例如，可以修飾鳥苷(2-氨基-6-氧-9-β-D-呋喃核糖嘌呤)形成異鳥苷(2-氧-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖嘌呤)。這類修飾產(chǎn)生不再與胞嘧啶有效形成標(biāo)準(zhǔn)堿基對的核苷堿基。然而，修飾胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖-2-氧-4-氨基嘧啶)形成異胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖-2-氨基-4-氧嘧啶)，產(chǎn)生了修飾的核苷酸，該核苷酸不與鳥苷形成有效堿基對，但是將與異鳥苷形成堿基對?？蓮腟igma Chemical Co.(St.Louis，MO)獲得異胞嘧啶；可以通過由Switzer等人(1993)Biochemistry 3210489-10496以及其中引用的參考文獻中描述的方法制備異胞苷；可以通過Tor等人(1993)J.Am.Chem.Soc.1154461-4467以及其中引用的參考文獻中的方法制備2’-脫氧-5-甲基-異胞苷；可以使用Switzer等人(1993)如上，以及Mantsch等人(1993)Biochem.145593-5601的方法，或通過Collins等人在美國專利No.5,780,610中描述的方法制備異鳥嘌呤核苷酸。可以通過Piccirilli等人，(1990)Nature 34333-37中描述的用于合成2，6-二氨嘧啶及其互補物(1-甲基吡唑啉(methylpyrazolo)-[4，3]嘧啶-5，7-(4H，6H)-二酮)的方法合成其他非天然堿基對。已知其他這類形成獨特堿基對的修飾的核苷酸單位，例如在Leach等人，(1992)J.Am.Chem.Soc.1143675-3683和Switzer等人如上中描述的那些。
“互補的”或“基本互補的”指雜交或核苷酸或核酸之間(例如傳感器多核苷酸結(jié)合蛋白和靶多核苷酸之間)的堿基配對的能力?；パa核苷酸通常為A和T(或A和U)、或C和G。當(dāng)一條鏈的堿基(進行最好的比對和比較，且具有插入或缺失)與另一條鏈堿基的至少約80％、通常至少約90％至95％、最優(yōu)選約98％至100％匹配時，稱兩條單鏈多核苷酸基本互補。
作為選擇，當(dāng)多核苷酸或PNA將在選擇性雜交條件下與其互補物雜交時，存在基本互補性。一般，當(dāng)在至少14至25個堿基的一段上具有至少約65％的互補性、優(yōu)選至少約75％、更優(yōu)選至少約90％互補性時，將出現(xiàn)選擇性雜交。見M.Kanehisa Nucleic Acids Res.12203(1984)。
“優(yōu)選結(jié)合”或“優(yōu)選雜交”指與樣品的另一種成分相比，結(jié)合對中一個成員與其結(jié)合配偶體增加的結(jié)合傾向。
雜交條件一般包括低于約1M的鹽濃度，更常見地低于約500mM、優(yōu)選低于約200mM。在肽核酸與多核苷酸之間雜交的情況下，雜交可以在含有很少或沒有鹽的溶液中進行。雜交溫度可以低至5℃，但是一般高于22℃，更常見高于約30℃，優(yōu)選超過約37℃。較長的片段對特異性雜交可能需要更高的雜交溫度。其他因素可能影響雜交的嚴格性，包括堿基組成和互補鏈長度、有機溶劑的存在和堿基錯配的程度，采用參數(shù)的組合比單獨任何一個的絕對測量值更為重要。其他可控制的雜交條件包括緩沖液類型和濃度、溶液pH、降低背景結(jié)合的封閉試劑(例如重復(fù)序列或封閉蛋白溶液)的存在及濃度、去污劑類型及濃度、增加多核苷酸相對濃度的分子諸如聚合物、金屬離子及其濃度、螯合劑及其濃度以及其他本領(lǐng)域已知的條件。
“多重化”在此指測定或其他分析方法，在這些方法中，可以同時測定多個分析物。
“任選的”或“任選地”意味隨后描述的事件或情形可能發(fā)生或可能不發(fā)生，且該描述包括某事件或情形出現(xiàn)的情況以及不出現(xiàn)的情況。
提供包括兩種成分的多核苷酸傳感器；(a)水溶性集光發(fā)光聚陽離子多生色團，例如綴合聚合物、寡聚體或樹枝狀分子；(b)傳感器多核苷酸結(jié)合蛋白或其結(jié)合片段，用發(fā)光信號生色團進行標(biāo)記(PBP-C*)。PBP-C*與靶多核苷酸的結(jié)合導(dǎo)致復(fù)合物的形成，該復(fù)合物具有足夠的負電荷以與聚陽離子多生色團相互作用。與陽離子集光分子的靜電(及疏水)相互作用使信號生色團(C*)與集光分子密切接近。集光分子在適當(dāng)頻率的激發(fā)引起能量向信號生色團的轉(zhuǎn)移。來自C*的發(fā)射證實了PBP-C*和靶多核苷酸之間的結(jié)合。如果傳感器-靶相互作用是特異性的，那么C*發(fā)射對應(yīng)于溶液中特定DNA或RNA序列的存在。
傳感器操作的示意圖顯示于圖1中。在水溶液中，陽離子集光分子(顯示為黑色)與探針PBP-C*(顯示為紅色)之間具有最小的相互作用。選擇PBP和集光分子，從而使它們在靶不存在時不發(fā)生顯著的相互作用。在加入含有多核苷酸的樣品后，可以發(fā)生兩種情況。情況A顯示信號PBP-C*與靶多核苷酸(藍色)結(jié)合的結(jié)果。在這些條件下，帶負電荷的DNA-PBP-C*或RNA-PBP-C*復(fù)合物通過與帶正電荷的集光綴合分子的多重靜電相互作用而結(jié)合。隨后發(fā)生的密切接近導(dǎo)致能量從集光綴合分子向PBP-C*的信號生色團的轉(zhuǎn)移，通過例如Frester能量轉(zhuǎn)移機制。10，11具有信號C*特征波長的光的發(fā)射顯示蛋白與RNA或DNA之間的識別。當(dāng)不與PBP-C*相互作用的多核苷酸(以綠色顯示)存在時，PBP-C*不與帶負電荷的大分子毗鄰，且陽離子集光分子和C*之間的距離對于能量轉(zhuǎn)移而言過大(情況B)。
我們使用下列成分作為特定的傳感器工作實施例(a)水溶性集光發(fā)光綴合分子，例如綴合聚合物和綴合寡聚體；(b)用發(fā)光信號生色團在N末端標(biāo)記的16殘基肽(Tat-C*)。選擇集光分子和信號生色團(C*)，從而使兩種種類的發(fā)光發(fā)射光譜位于不同波長，并使C*的吸收與集光種類的發(fā)射重疊。在添加TAR RNA后，信號肽Tat-C*與TAR RNA特異性結(jié)合。帶負電荷的TAR RNA/Tat-C*復(fù)合物然后與帶正電荷的集光綴合分子結(jié)合(情況A)。隨后發(fā)生的密切接近導(dǎo)致能量從集光綴合分子向Tat-C*的信號生色團的轉(zhuǎn)移。具有信號Tat-C*特征波長的光的發(fā)射顯示HIV TAR RNA的存在。當(dāng)使用不與Tat相互作用的RNA的時候，RNA與陽離子分子相互作用，然而，沒有向C*的能量轉(zhuǎn)移。
開發(fā)檢測1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的可靠技術(shù)具有重大的臨床重要性。12，13，14，15HIV感染的傳統(tǒng)檢測技術(shù)是檢測HIV抗體的ELISA試驗，在該試驗中將病毒抗原吸附到固相上。22，16將電泳分離與放射性同位素檢測偶聯(lián)的蛋白印跡也是此工作常用的。22，17這些技術(shù)的缺點包括復(fù)雜的儀器使用、測定所需的時間以及由于放射性探針的短半衰期和危險性質(zhì)引起的復(fù)雜性。檢測HIV病毒高度需要簡單、高靈敏度、特異性和實時的方法。
由病毒感染細胞以高水平表達HIV的反式激活反應(yīng)元件RNA序列(TAR)。18如此處所描述的，便利地實時監(jiān)控TAR RNA的能力為快速檢測HIV病毒的存在提供了可行方法。廣泛的研究證實，反式激活蛋白(Tat)以高度特異性和大約1nM的親和力與TAR RNA結(jié)合，形成穩(wěn)定并且明確定義的復(fù)合物。19，20，21Tat與TAR RNA的特異性結(jié)合由此觸發(fā)了使用此處描述之方法的臨床相關(guān)實時HIV檢測的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
工作實施例證實了全新的HIV生物光學(xué)傳感器，該傳感器將Tat肽和TAR RNA結(jié)合和折疊的特異性與綴合聚合物和寡聚體的巨大光學(xué)放大偶聯(lián)。HIV RNA傳感器包括兩個成分(a)水溶性集光發(fā)光綴合分子，例如綴合聚合物和綴合寡聚體；(b)用發(fā)光信號生色團在N末端標(biāo)記的16殘基肽(Tat-C*)。探針肽和發(fā)光綴合分子與TARRNA的結(jié)合引起復(fù)合物的形成，并引導(dǎo)能量從綴合分子向Tat-C*的轉(zhuǎn)移。具有信號Tat-C*特征波長的光的發(fā)射顯示HIV-1TAR RNA的存在。
如實施例中所證實，水溶性綴合分子的光學(xué)放大可以用于檢測HIV TAR RNA的存在。本發(fā)明可用于均一形式中，其中利用熒光檢測方法的簡便和特異性結(jié)合行為，并提供實時檢測TAR RNA的能力，其中特異性結(jié)合行為見于蛋白-多核苷酸相互作用，例如Tat-TARRNA相互作用。工作實施例中使用的Tat肽、TAR RNA和dTAR RNA的結(jié)構(gòu)顯示于圖2中(Tat-C*氨基酸以單字母編碼顯示)。
如Frester所顯示的22，偶極-偶極相互作用引起從供體生色團向受體生色團的遠程共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。能量轉(zhuǎn)移效率(E)與1/r6及重疊積分成比例，其中r為供體受體距離，如式1所示。
E∝1r6·o0∞FD(λ)ϵA(λ)λ4dλ---(1)]]>在此描述的方法中，能量轉(zhuǎn)移的距離要求受圖1中相互作用的控制。重疊積分表現(xiàn)了供體發(fā)射和受體吸收之間的光譜重疊23。在此作為示例，可以選擇傳感器的成分以使其光學(xué)性質(zhì)符合此要求。
樣品包括或懷疑包括靶多核苷酸的樣品部分可以是包括多核苷酸的任何生物材料來源，其中多核苷酸可以直接或間接從活生物(包括細胞、組織或流體)和該生物遺留的堆積物(包括病毒、支原體和化石)獲得。樣品可以全部或部分包括經(jīng)合成方法制備的靶多核苷酸。一般，以主要水性介質(zhì)獲得樣品，或者在其中分散樣品。樣品的非限制性實施例包括血液，尿液，精液，乳汁，痰，粘液，頰膜棉拭，陰道棉拭，直腸棉拭，吸出物，針吸活組織檢查，從例如外科或尸體剖檢獲得的組織切片，血漿，血清，脊髓液，淋巴液，皮膚、呼吸道、腸道和生殖泌尿道的外分泌物，淚液，唾液，腫瘤，器官，體外細胞培養(yǎng)成分樣品(包括但是不限于從細胞培養(yǎng)基中的細胞生長產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基、假定病毒感染的細胞、重組的細胞，以及細胞組分)和包括多核苷酸序列的重組文庫。
樣品可以是已知含有靶多核苷酸或其代替品的陽性對照樣品。也可以使用陰性對照樣品，盡管該樣品未預(yù)期含有靶多核苷酸，但懷疑其含有(通過一個或多個試劑的污染)靶多核苷酸、或另一種能夠產(chǎn)生假陽性的成分，且對其進行測試以證實沒有由用于給定測定的試劑的靶多核苷酸造成的污染，并確定給定的一組測定條件是否產(chǎn)生假陽性(即使樣品中不存在靶多核苷酸時也存在的陽性信號)。
樣品可以經(jīng)稀釋、溶解、懸浮、提取或另外處理，以溶解和/或純化任何存在的靶多核苷酸，或使其易于接觸用于擴增方案中的試劑或檢測試劑。樣品含有細胞時，可以裂解或透化細胞以釋放細胞中的多核苷酸?？梢允褂靡徊酵富彌_液裂解細胞，該緩沖液允許裂解后直接進行進一步的步驟，例如聚合酶鏈反應(yīng)。
靶多核苷酸以及由此產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物靶多核苷酸可以是單鏈、雙鏈或更高級的，且可以是線性或環(huán)形的。示例性單鏈靶多核苷酸包括mRNA、rRNA、tRNA、hnRNA、ssRNA或ssDNA病毒基因組，盡管這些多核苷酸可以含有內(nèi)在的互補序列及顯著的二級結(jié)構(gòu)。示例性雙鏈靶多核苷酸包括基因組DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA、dsRNA或dsDNA病毒基因組、質(zhì)粒、噬菌體和類病毒?？梢院铣芍苽浠驈纳飦碓醇兓卸嗪塑账帷？梢约兓卸嗪塑账嵋匀コ驕p少樣品的一種或多種不需要的成分，或濃縮靶多核苷酸。反之，當(dāng)靶多核苷酸對于特定測定而言過度濃縮時，可以將靶多核苷酸稀釋。
樣品收集及任選的核酸提取后，可以將包括靶多核苷酸的樣品的核酸部分進行一個或多個預(yù)反應(yīng)。預(yù)反應(yīng)可以包括體外轉(zhuǎn)錄(IVT)、標(biāo)記、斷裂、擴增和其他反應(yīng)?？梢栽跈z測和/或擴增前首先用反轉(zhuǎn)錄酶和引物處理mRNA，以產(chǎn)生cDNA；這可以使用純化的mRNA體外進行或原位進行，例如在固定到載玻片上的細胞或組織中。核酸擴增增加了例如靶多核苷酸這類目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。多種擴增方法適于使用，包括聚合酶鏈反應(yīng)方法(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、自動維持序列擴增(3SR)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、Qβ復(fù)制酶的使用、反轉(zhuǎn)錄、切口平移等。
靶多核苷酸為單鏈并將被擴增時，擴增的第一個循環(huán)形成與靶多核苷酸互補的引物延伸產(chǎn)物。如果靶多核苷酸為單鏈RNA，那么在第一次擴增中使用具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶，將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，且可以進行另外的擴增循環(huán)以復(fù)制引物延伸產(chǎn)物。當(dāng)然，必須設(shè)計PCR引物與其相應(yīng)模板中的區(qū)域雜交，所述模板將產(chǎn)生可擴增片段；因此，每個引物必須雜交以致其3’核苷酸與其互補模板鏈中的核苷酸配對，所述互補模板鏈定位于用于在PCR中復(fù)制該互補模板鏈的引物的3’核苷酸的3’。
通常通過以下方法擴增靶多核苷酸，即，將一條或多條靶多核苷酸鏈與引物和具有適當(dāng)活性的聚合酶接觸，來延伸引物，并復(fù)制靶多核苷酸，以產(chǎn)生全長互補多核苷酸或其較短部分?？梢允褂萌魏尉哂芯酆厦富钚?、可復(fù)制靶核苷酸的酶，包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、具有多于一類聚合酶活性的酶、以及不耐熱或熱穩(wěn)定的酶。也可以使用酶混合物。示例性酶包括DNA聚合酶例如DNA聚合酶I(“PolI”)、PolI的克列諾(Klenow)片段、T4、T7、SequenaseT7、SequenaseVersion 2.0 T7、Tub、Taq、Tth、Pfx、Pfu、Tsp、Tfl、Tli和火球菌屬(Pyrococcus)物種GB-D DNA聚合酶；RNA聚合酶例如大腸桿菌(E.coli)、SP6、T3和T7RNA聚合酶；以及反轉(zhuǎn)錄酶例如AMV、M-MuLV、MMLV、RNA酶H-MMLV(SuperScript)、SuperScriptII、ThermoScript、HIV-1和RAV2反轉(zhuǎn)錄酶。所有這些酶有商品供應(yīng)。具有多重特異性的示例性聚合酶包括RAV2和Tli(外切)聚合酶。示例性熱穩(wěn)定聚合酶包括Tub、Taq、Tth、Pfx、Pfu、Tsp、Tfl、Tli和火球菌屬物種GB-D DNA聚合酶。
選擇適宜的反應(yīng)條件以允許靶多核苷酸的擴增，反應(yīng)條件包括pH、緩沖液、離子強度、一種或多種鹽的存在及濃度、反應(yīng)物和輔因子的存在及濃度，例如核苷酸和鎂和/或其他金屬離子(例如錳)、任選的助溶劑、溫度、包括聚合酶鏈反應(yīng)的擴增方案的熱循環(huán)特征；反應(yīng)條件可能部分依賴于使用的聚合酶和樣品的性質(zhì)。助溶劑包括甲酰胺(一般在約2至約10％)、甘油(一般在約5至約10％)和DMSO(一般在約0.9至約10％)。為了使假陽性的產(chǎn)生或擴增期間產(chǎn)生的假象最小化，可以在擴增方案中使用技術(shù)。這些包括“降落(touchdown)”PCR、熱啟動技術(shù)、嵌套引物的使用、或設(shè)計PCR引物使其在引物-二聚體形成事件中形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而不被擴增?？梢允褂眉铀貾CR的技術(shù)，例如離心PCR，其允許樣品中更強的對流，且包括快速加熱和冷卻樣品的紅外線加熱步驟?？梢赃M行一個或多個擴增循環(huán)?？梢允褂靡粋€引物的過量在PCR過程中產(chǎn)生一個引物延伸產(chǎn)物的過量；優(yōu)選地，過量產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物是將要檢測的擴增產(chǎn)物。許多不同的引物可以用于擴增樣品中不同的靶多核苷酸或特定靶多核苷酸的不同區(qū)域。
擴增的靶多核苷酸可以經(jīng)歷擴增后處理。例如，在有些情況下，為了提供更易于接近的片段，可能需要在雜交前使靶多核苷酸片段化。任何生產(chǎn)可用于所進行的測定中的大小的片段的方法都可以用于進行核酸的片段化；合適的物理、化學(xué)和酶學(xué)方法為本領(lǐng)域所公知。
可以在允許傳感器PBP與擴增產(chǎn)物在至少部分擴增循環(huán)期間結(jié)合的條件下進行擴增反應(yīng)。當(dāng)以此方式進行測定時，可以通過監(jiān)控擴增方案期間在雜交之后出現(xiàn)的、來自信號生色團的光發(fā)射的改變，來進行所述雜交的實時檢測。
聚陽離子多生色團已經(jīng)證實，集光多生色團系統(tǒng)由于其包括的多生色團而是有效的光吸收物。實例包括但是不限于綴合聚合物、綴合分子聚集體、通過側(cè)鏈與飽和聚合物附著的發(fā)光染料、半導(dǎo)體量子點和樹枝狀結(jié)構(gòu)。例如，可以將綴合聚合物上的每個重復(fù)單位視為起作用的生色團，量子點由許多原子組成，飽和聚合物可以在側(cè)鏈上由許多發(fā)光染料分子官能化，且可以合成含有許多共價結(jié)合的單獨生色團的樹枝狀聚合物(dendrimer)。生色團組件向固體支持物(例如聚合物珠或表面)上的附著也可以用于集光。
集光多生色團系統(tǒng)可以有效地將能量轉(zhuǎn)移給鄰近的發(fā)光種類(例如“信號生色團”)。能量轉(zhuǎn)移機制包括例如共振能量轉(zhuǎn)移(Frster(或熒光)共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET)、量子電荷交換(Dexter能量轉(zhuǎn)移)等。然而，這些能量轉(zhuǎn)移機制一般為相對短程的；即，集光多生色團系統(tǒng)與信號生色團的密切鄰近是有效能量轉(zhuǎn)移所必需的。在有效能量轉(zhuǎn)移的條件下，當(dāng)多生色團的整個吸收能力超出信號生色團時，例如，當(dāng)集光多生色團系統(tǒng)中單獨生色團的數(shù)目大時，出現(xiàn)信號生色團發(fā)射的放大；即，當(dāng)入射光(“泵光(pump light)”)的波長為被集光多生色團系統(tǒng)吸收的波長時，信號生色團的發(fā)射比信號生色團直接由泵光激發(fā)時更強。
綴合聚合物(CP)以不定域的電子結(jié)構(gòu)為特征，且可以用作化學(xué)和生物學(xué)靶的高反應(yīng)性光學(xué)報道分子。24，25因為有效綴合長度基本短于聚合物鏈的長度，所以主鏈含有大量密切臨近的綴合片段。因此，綴合聚合物對于集光有效，并通過Frster能量轉(zhuǎn)移使光學(xué)放大成為可能。26在帶有相反電荷的受體的存在下，水溶性CP表現(xiàn)出超乎尋常的熒光猝滅效率，且對生物識別事件的轉(zhuǎn)導(dǎo)具有特別的重要性。27，28在陽離子聚合電解質(zhì)和DNA之間自然發(fā)生的聚合物間復(fù)合已有描述，且主要是靜電力協(xié)同作用的結(jié)果。29，30，31芳香族聚合物單元和DNA堿基之間的疏水相互作用最近也得到了認識。32，33聚合電解質(zhì)/DNA相互作用的自由能由所用的參與種類的結(jié)構(gòu)結(jié)合溶液變量(例如pH、離子強度和溫度)進行控制。34這些相互作用的強度和特異性最近協(xié)同用于識別質(zhì)粒DNA的三級結(jié)構(gòu)。35用于本發(fā)明的多生色團為聚陽離子的，以致它們可以與靶多核苷酸靜電相互作用，從而依靠傳感器PBP和靶多核苷酸之間的結(jié)合將不帶電的傳感器PBP上的信號生色團引入能量接受附近區(qū)域。在描述的方法中，可以使用任何能吸收光、并將能量轉(zhuǎn)移到傳感器PBP上的信號生色團的聚陽離子多生色團?？梢允褂玫氖纠远嗌珗F包括綴合聚合物、飽和聚合物或以任何可行方式整合多個生色團的樹枝狀聚合物、以及半導(dǎo)體納米晶體(nanocrystal)(SCNC)。綴合聚合物、飽和聚合物和樹枝狀聚合物可以被制備以用于整合多個陽離子種類，或可以被衍生以用于在合成后賦予其聚陽離子性；半導(dǎo)體納米晶體可以通過向其表面添加陽離子種類而被賦予聚陽離子性。
在優(yōu)選的實施方案中，使用綴合聚合物作為聚陽離子多生色團。
示例性聚陽離子多生色團顯示如下，其中陽離子水溶性綴合分子為聚合物1(其中n＝2-100,000)、寡聚體1和寡聚體2。這種特定分子結(jié)構(gòu)并非關(guān)鍵的；可以使用任何水溶性陽離子集光分子。
聚合物1 寡聚體1 m＝1寡聚體2 m＝2
水溶性、陽離子、發(fā)光綴合分子的分子結(jié)構(gòu)。
其他實例顯示于聚合物3中，其中陽離子水溶性綴合分子為具有碘化物反荷陰離子的聚((9，9-雙(6’-N，N，N-三甲基銨)-己基)-芴亞苯基)(下面表示為聚合物3)。36該聚合物的特定大小并非關(guān)鍵的，只要能夠吸收光、并將能量轉(zhuǎn)移給引入鄰近的信號生色團即可?！皀”的一般值在2至約100,000范圍內(nèi)。這種特定分分子結(jié)構(gòu)并非關(guān)鍵的；可以使用任何具有相對高發(fā)光量子效率的水溶性陽離子綴合聚合物。
n＝2-100,000也可以使用水溶性綴合寡聚體作為聚陽離子多生色團。這類具有碘化物反荷離子的水溶性、陽離子、發(fā)光綴合寡聚體的實例顯示如下(在此表示為寡聚體4) 盡管較小的寡聚體4不顯示高分子量聚合物特征的巨大的信號放大，但這類較小的分子可用于解開結(jié)構(gòu)特性關(guān)系，所述結(jié)構(gòu)特性關(guān)系由于固有的多分散性和聚合物中發(fā)現(xiàn)的批次間變化而難于確定。另外，在水性介質(zhì)中，寡聚體例如4比其他聚合的對應(yīng)物更可溶，且預(yù)期疏水相互作用對于4不如對聚合物結(jié)構(gòu)重要。寡聚體組件因此可能為特定應(yīng)用所需。
傳感器PBP提供與待測靶多核苷酸結(jié)合的傳感器PBP。已知將信號生色團與傳感器PBP附著的化學(xué)方法。特定的傳感器PBP結(jié)構(gòu)，包括與生色團綴合的結(jié)構(gòu)，可以使用商業(yè)資源定做或化學(xué)合成。
在公開的方法中，可以使用任何能夠與感興趣的靶多核苷酸結(jié)合的蛋白。PBP的非限制性實例包括DNA結(jié)合蛋白，包括轉(zhuǎn)錄因子、剪接因子、多腺苷酸結(jié)合蛋白、染色質(zhì)成分、病毒蛋白、可以檢測病毒感染的蛋白、復(fù)制因子、以及參與細胞有絲分裂和/或減數(shù)分裂的蛋白。RNA-蛋白相互作用介導(dǎo)重要的細胞過程，包括轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、RNA剪接和翻譯。37，38，39，40許多致病性病毒，例如1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)41、細小核糖核酸病毒42和流感病毒43的復(fù)制周期依賴于特定的RNA-蛋白相互作用。對于醫(yī)學(xué)診斷和基因組研究中的效用，這類相互作用的特異性可以用作序列特異性傳感器的基礎(chǔ)。示例性多核苷酸結(jié)合蛋白包括鋅指蛋白、同源域蛋白、翼狀螺旋(叉頭(forkhead))蛋白、亮氨酸拉鏈蛋白、螺旋-環(huán)-螺旋蛋白、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋蛋白和組蛋白樣蛋白。
可以從細胞來源分離或可以體外產(chǎn)生PBP，例如通過體外轉(zhuǎn)錄/翻譯方法或通過完全合成方法。PBP可以是天然存在的蛋白、天然存在的蛋白的突變體、通過例如分子進化方法產(chǎn)生的隨機產(chǎn)生的蛋白、或懷疑具有未知結(jié)合特異性的多核苷酸結(jié)合蛋白。
監(jiān)控RNA/蛋白相互作用具有重要性的一個理由是，蛋白結(jié)構(gòu)可以作為抑制RNA功能的抗生素。一個實例是調(diào)節(jié)蛋白Rev與Rev反應(yīng)元件(RRE，病毒RNA的亞結(jié)構(gòu)域)的相互作用，所述Rev反應(yīng)元件對于人免疫缺陷病毒(HIV)復(fù)制是重要的。含有116個氨基酸的Rev通過誘導(dǎo)不完整剪接的病毒mRNA轉(zhuǎn)錄物在細胞質(zhì)中的累積而促進表達。蛋白/DNA結(jié)合和相互作用是重要的，因為這些事件調(diào)節(jié)DNA的多種功能及代謝。將展示這種特性的蛋白稱為序列特異性DNA結(jié)合蛋白。它們介導(dǎo)DNA復(fù)制、重組、鏈斷裂和轉(zhuǎn)錄。
用于工作實施例中的Tat肽易于使用固相方法合成，且可以通過HPLC純化，并且用MALDI-TOF質(zhì)譜和氨基酸分析進行表征。已知將信號生色團與肽附著以形成信號傳感器或PBP-C*的化學(xué)方法。44特定的實例是在N末端具有熒光素的Tat-C*?？梢酝ㄟ^商業(yè)來源定制特定的PBP-C*結(jié)構(gòu)。
其他可以使用的PBP的實例包括結(jié)合A型流感病毒RNA的基質(zhì)蛋白(M1，具有單字母編碼序列“DPNNMDKAVKLYRKLKR”)和結(jié)合前核糖體RNA的hnRNP U蛋白(單字母編碼“MRGGNFRGGAPGNRGGYNRRGN”)。例如，可在測定中使用M1檢測樣品中的流感病毒，與為HIV顯示的工作實施例相似。
信號生色團在此描述的用于本發(fā)明的生色團包括可以在合適的溶液中從激發(fā)的聚陽離子多生色團接受能量、并發(fā)射光的任何物質(zhì)。對于多重測定，可以使用具有可檢測的不同發(fā)射光譜的多種不同信號生色團。生色團可以是生光團或熒光團。一般的熒光團包括熒光染料、半導(dǎo)體納米晶體、稀土元素螯合物和綠色熒光蛋白。
示例性熒光染料包括熒光素、6-FAM、羅丹明、德克薩斯紅、四甲基羅丹明、羧基羅丹明、羧基羅丹明6G、羧基對甲氨基酚(carboxyrhodol)、羧基羅丹明110、Cascade Blue、Cascade Yellow、香豆素、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy-鉻、藻紅蛋白、PerCP(多甲藻素葉綠素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基熒光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-羅丹明)、HEX、熒光黃、Marina Blue、Oregon Green 488、OregonGreen 500、Oregon Green 514、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、AlexaFluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPYFL、BODIPYFL-Br2、BODIPY530/550、BODIPY558/568、BODIPY564/570、BODIPY576/589、BODIPY581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPYR6G、BODIPYTMR、BODIPYTR、其綴合物及其組合物。示例性稀土元素螯合物包括銪螯合物、鋱螯合物和釤螯合物。
本領(lǐng)域已知各種熒光半導(dǎo)體納米晶體(“SCNC”)；生產(chǎn)和利用半導(dǎo)體納米晶體的方法描述于1999年5月27日公布的PCT Publ.No.WO99/26299，發(fā)明人為Bawendi等人；1999年11月23日授予Weiss等人的USPN 5,990,479；以及Bruchez等人，Science 2812013，1998?？梢杂妹鞔_的峰發(fā)射波長以很窄的發(fā)射帶獲得半導(dǎo)體納米晶體，這允許在相同測定中使用大量不同的SCNC作為信號生色團，任選地與其他非SCNC型信號生色團組合。
術(shù)語“綠色熒光蛋白”指天然的水母(Aequorea)綠色熒光蛋白及突變形式，經(jīng)鑒定，所述突變形式展示改變的熒光特征，包括改變的激發(fā)和發(fā)射最大值以及不同形狀的激發(fā)和發(fā)射光譜(Delagrave，S.等人，(1995)Bio/Technology 13151-154；Heim，R.等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112501-12504；Heim，R.等人，(1995)Nature 373663-664)。Delgrave等人分離了具有紅移激發(fā)光譜的克隆的維多利亞水母(Aequorea victoria)GFP突變體。Bio/Teclinology13151-154(1995).Heim，R.等人報道了具有藍色熒光的突變體(Tyr66至His)(Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)USA 9112501-12504)。
基片對于那些在基片上進行的測定的變化，基片可以包括大范圍的材料，既可以是生物的、非生物的、有機的、無機的，也可以是這些的任何組合。例如，基片可以是聚合的L-B膜、官能化玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、修飾的硅、或大量凝膠或聚合物的一種，例如(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯((poly)vinylidenedifluoride)、聚苯乙烯、交聯(lián)的聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乳酸、聚乙醇酸(polyglycolicacid)、丙交酯-乙交酯共聚物(poly(lactide coglycolide))、聚酐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、乙烯-乙酸乙酯共聚物(poly(ethylene-co-vinyl acetate))、聚硅氧烷、聚合硅石、乳膠、葡聚糖聚合物、環(huán)氧聚合物、聚碳酸酯或其組合?？梢允褂脤?dǎo)電聚合物和光電導(dǎo)的材料。
基片可以是平面晶狀基片，例如基于硅石的基片(例如玻璃、石英等)，或在在例如半導(dǎo)體和微處理器工業(yè)中使用的晶狀基片，例如硅、砷化鎵、銦摻雜的GaN等，且包括半導(dǎo)體納米晶體。
基片可以采取光電二極管、光電傳感器(例如光電半導(dǎo)體晶片或光電薄膜半導(dǎo)體)或生物芯片的形式。單獨傳感器PBP在基片上的位置是可編址的；這可以以高密集形式進行，且所述位置可以是可微編址或可毫微編址的。
硅石氣凝膠也可以用作基片，并可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備。氣凝膠基片可以用作游離的固定基片，或用作另一種基片材料的表面涂層。
基片可以采取任何形式，一般為板、載玻片、珠子、丸、盤、顆粒、微粒、納米顆粒、鏈、沉淀物、任選地多孔凝膠、薄片、管、球、容器、毛細管、墊、切片、膜、芯片、多孔板或盤、光學(xué)纖維等。基片可以是任何剛性或半剛性形式?；梢院型蛊鸹虬枷碌膮^(qū)域，測定成分位于其上?？梢允褂檬熘募夹g(shù)將基片表面蝕刻，以提供所需的表面特征，例如管溝、v形溝、臺式結(jié)構(gòu)等。
基片表面可以由與基片相同的材料組成，或可以由不同材料制成，并且可以通過化學(xué)或物理方法與基片偶聯(lián)。這類偶聯(lián)表面可以由大量材料中的任何一種組成，例如聚合物、塑膠、樹脂。多聚糖、硅石或基于硅石的材料、碳、金屬、無機玻璃、膜或任何上面列舉的基片材料。表面可以是光學(xué)透明的，可以具有表面Si-OH官能團，例如在硅石表面可見的那些。
選擇基片和/或其任選的表面，以致為使用的合成和/或檢測方法提供合適的光學(xué)特征?；?或表面可以是透明的，以允許基片暴露于從多重方向施加的光?？梢砸苑瓷洹扮R”結(jié)構(gòu)提供基片和/或表面，來增加光的回收。
基片和/或其表面通常對其將被暴露的使用中的條件具有抗性，或經(jīng)過處理具有抗性，并且可以任選地在暴露于這類條件后、經(jīng)處理以去除任何抗性材料。
可以通過任何合適的方法，例如美國專利No.5,143,854、PCTPubl.No.WO92/10092、1990年12月6日提交的美國專利申請序號07/624,120(現(xiàn)已放棄)、Fodor等人，Science，251767-777(1991)以及PCT Publ.No.WO90/15070中描述的方法，將測定成分加工或附著在基片上。使用機械合成策略的陣列合成技術(shù)在例如PCTPublication No.WO93/09668和美國專利No.5,384,261中有描述。
更進一步的技術(shù)包括基于珠的技術(shù)，例如在PCT Appl.No.PCT/US93/04145中描述的那些，以及基于針的(pin based)方法，例如在美國專利No.5,288,514中描述的那些。
可應(yīng)用于傳感器PBP向基片附著的額外流體通道或點樣方法在1992年11月20日提交的美國專利申請序號07/980,523和美國專利No.5,384,261中得到描述。通過以下方法將試劑輸送給基片(1)在預(yù)定區(qū)域內(nèi)定義的管道內(nèi)流動，或(2)在預(yù)先確定的區(qū)域上“點樣”?？梢栽趯⒁Ｗo的基片部分上使用保護性涂層，例如親水或疏水涂層(依賴于溶劑性質(zhì))，有時與促進其他區(qū)域中由反應(yīng)物溶液進行濕潤的材料組合。在此方式中，另外防止流動溶液流出其指定的流動路徑。
一般的分配器包括微量吸移管(可選自動控制)、噴墨打印機、一系列管、歧管、吸移管陣列等，以致可以將多種試劑順序或同時輸送到反應(yīng)區(qū)域。
生色團的激發(fā)和檢測提供可激發(fā)聚陽離子多生色團、并且短于待測發(fā)射波長的波長的任何裝置都可以用于激發(fā)。激發(fā)源優(yōu)選不直接顯著激發(fā)信號生色團。源可以是寬波段紫外光源，例如帶有合適濾色片的氘燈；白光源的輸出，例如氙燈或氘燈經(jīng)過單色器析取所需波長；連續(xù)波(cw)氣體激光器、固態(tài)二極管激光器或任何脈沖激光器?？梢酝ㄟ^任何適宜的設(shè)備或技術(shù)檢測來自信號生色團發(fā)射的光；許多適宜的途徑為本領(lǐng)域已知。例如，熒光計或分光光度計可以用于檢測在多生色團的激發(fā)后，測試樣品是否發(fā)射具有信號生色團波長特征的光。
試劑盒也提供試劑盒，其包括用于進行本發(fā)明方法的試劑。在一個實施方案中，試劑盒包括與感興趣的靶多核苷酸結(jié)合的傳感器PBP、以及聚陽離子多生色團。傳感器PBP與信號生色團綴合。在樣品中存在靶多核苷酸時，傳感器PBP在與靶結(jié)合后被引入多生色團附近，所述靶與聚陽離子多生色團靜電結(jié)合。
試劑盒的成分通過盒子保持。使用試劑盒以進行本發(fā)明方法的說明書隨盒子提供，并且可以以任何固定介質(zhì)提供。說明書可以位于盒子內(nèi)或盒子外，且可以印刷于形成盒子的任何表面之內(nèi)或之外，這使得說明書易讀。試劑盒可以為多種形式，含有一種或多種不同的傳感器PBP的復(fù)合，所述傳感器PBP可以與相應(yīng)的不同靶多核苷酸結(jié)合。
實施例列舉下列實施例，以便為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供如何進行并使用本發(fā)明的完整描述，且無意限制被認為是本發(fā)明的范圍。進行了努力以保證所用數(shù)字的精確性(例如，量、溫度等)，但是一些實驗誤差和偏差需要解釋。除非另有說明，份為重量份，溫度為攝氏度，壓力為處于或接近大氣壓，且所有材料都有商業(yè)供應(yīng)。下面描述的TAR RNA和dTAR RNA寡核苷酸購買于Dharmacon Research Inc.(Lafayette，美國)。由熒光素在N末端修飾的多肽(Tat-C*和SH3-C*)由Sigma-Genosys(Texas，美國)定做。按照文獻中的描述制備聚合物1和寡聚體2。45在tris-EDTA緩沖液(10mM，pH＝7.4)中使用PTI Quantum Master熒光計進行所有熒光和FRET實驗，所述熒光計裝備有氙燈激發(fā)源。
實施例1聚合物1、Tat-C*的發(fā)射光譜和Tat-C*的吸收光譜顯示于圖3中。數(shù)據(jù)顯示聚合物1的發(fā)射和Tat-C*的吸收之間的極好重疊，保證了熒光共振能量轉(zhuǎn)移。
實施例2寡聚體1、Tat-C*的發(fā)射光譜和Tat-C*的吸收光譜顯示于圖4中。數(shù)據(jù)顯示寡聚體1的發(fā)射和Tat-C*的吸收之間的極好重疊，保證了熒光共振能量轉(zhuǎn)移。
實施例3寡聚體2、Tat-C*的發(fā)射光譜和Tat-C*的吸收光譜顯示于圖5中。數(shù)據(jù)顯示寡聚體2的發(fā)射和Tat-C*的吸收之間的極好重疊，保證了熒光共振能量轉(zhuǎn)移。
實施例4將Tat-C*探針([Tat-C*]＝1.0×10-8M)與等摩爾量的TAR RNA于室溫混合，并以同樣的方式與非特異性dTAR RNA混合。已知TARRNA中的突出結(jié)構(gòu)是Tat肽與TAR RNA結(jié)合的必要條件。46，47dTARRNA在結(jié)構(gòu)上與TAR RNA密切相關(guān)，缺少Tat結(jié)合所必需的三個基本的突出結(jié)構(gòu)。
在水中的寡聚體1([寡聚體1]＝8.0×10-8M)的添加以及隨后通過在365nm激發(fā)獲得的Tat-C*產(chǎn)生的熒光比較(圖6)顯示，Tat-C*/TAR RNA相對于非特異性Tat-C*/dTAR RNA對具有高10倍以上的強度比。這些FRET差異證實HIV TRA RNA傳感器對特定RNA的特異性。另外，熒光素發(fā)射比不存在寡聚體1時從在熒光素吸收最大值的直接Tat-C*激發(fā)獲得的高出25倍以上。能量轉(zhuǎn)移復(fù)合物中增加的Tat-C*發(fā)射顯示，光學(xué)放大由綴合寡聚體1提供。
實施例5將Tat-C*探針([Tat-C*]＝1.0×10-8M)與等摩爾量的TAR RNA于室溫混合，并以同樣的方式與非特異性dTAR RNA混合。在水中的寡聚體2([寡聚體2]＝6.O×10-8M)的添加以及隨后通過在375nm激發(fā)獲得的Tat-C*產(chǎn)生的熒光比較(圖7)顯示，Tat-C*/TAR RNA相對于非特異性Tat-C*/dTAR RNA對具有高15倍的強度比。這些FRET差異證實了本發(fā)明的HIV TRA RNA傳感器對特定RNA的特異性。另外，熒光素發(fā)射比不存在寡聚體2時從直接Tat-C*激發(fā)獲得的高出30倍以上。能量轉(zhuǎn)移復(fù)合物中增加的Tat-C*發(fā)射顯示，光學(xué)放大由綴合寡聚體2提供。
實施例6使用水溶性綴合聚合物1(平均n＝約15)作為集光生色團。將Tat-C*探針([Tat-C*]＝1.0×10-8M)與等摩爾量的TAR RNA于室溫混合，并以同樣的方式與非特異性dTAR RNA混合。將水中的聚合物1([聚合物1]＝4.8×10-7M)添加到Tat-C*和TAR RNA混合物中，引起Tat-C*的熒光(圖8)，該熒光具有比非特異性Tat-C*/dTAR RNA高15倍以上、比不存在聚合物1時從直接Tat-C*激發(fā)獲得的高1O倍的強度比。因此，可以實現(xiàn)顯著較高的FRET比率和相應(yīng)較高的靈敏度。1對于Tat-C*和TAR RNA混合物的滴定顯示，F(xiàn)RET比率隨1的濃度增加，直至1對TAR RNA的電荷比接近4∶1，此后發(fā)現(xiàn)FRET比率降低。對于寡聚體2觀察到了相似的模式。
實施例7也使用另一個用熒光素在N末端標(biāo)記的肽序列(SH3-C*；單字母編碼AKPRPPRPLPVAC)作為信號探針，該肽序列不能與TARRNA特異性結(jié)合。圖9([SH3-C*或Tat-C*]＝1.0×10-8M，[TARRNA]＝1.0×10-8M，[寡聚體1]＝8.0×10-8M)僅顯示在Tat-C*存在時的C*發(fā)射。這些FRET差異證明本發(fā)明的HIV TRA RNA傳感器依賴于Tat肽序列與TAR RNA的特異性相互作用。
盡管本發(fā)明參照優(yōu)選的實施方案得到一些詳細的描述，但按照此處的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以進行某些改變和修飾。相應(yīng)地，本發(fā)明僅受權(quán)利要求的限制。
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權(quán)利要求
1.測定方法，其包括提供懷疑含有靶多核苷酸的樣品；提供聚陽離子多生色團，所述聚陽離子多生色團與靶多核苷酸相互作用，并且在激發(fā)后能夠?qū)⒛芰哭D(zhuǎn)移給信號生色團；提供傳感器多核苷酸結(jié)合蛋白(PBP)，其可以與靶多核苷酸結(jié)合，所述傳感器PBP與信號生色團綴合；在如果存在靶多核苷酸，則傳感器PBP可以與靶多核苷酸結(jié)合的條件下，將樣品與傳感器PBP和多生色團在溶液中接觸；向溶液施加可以激發(fā)多生色團的光源；以及檢測光是否從信號生色團發(fā)射。
2.權(quán)利要求1的方法，其中多生色團包括選自飽和聚合物、綴合聚合物、樹枝狀聚合物和半導(dǎo)體納米晶體的結(jié)構(gòu)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中多生色團包括飽和聚合物。
4.權(quán)利要求2的方法，其中多生色團包括樹枝狀聚合物。
5.權(quán)利要求2的方法，其中多生色團包括半導(dǎo)體納米晶體。
6.權(quán)利要求2的方法，其中多生色團包括綴合聚合物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中綴合聚合物具有結(jié)構(gòu) 其中n＝2-100,000。
8.權(quán)利要求6的方法，其中綴合聚合物具有結(jié)構(gòu)
9.權(quán)利要求6的方法，其中綴合聚合物具有結(jié)構(gòu) 其中n＝2-100,000。
10.權(quán)利要求6的方法，其中綴合聚合物具有結(jié)構(gòu) 其中m＝1或2。
11.權(quán)利要求1的方法，其中樣品與接近1∶1電荷比的傳感器PBP和多生色團接觸。
12.權(quán)利要求1的方法，其中樣品在足夠量的有機溶劑的存在下與傳感器PBP和多生色團接觸，以降低傳感器PBP和多生色團之間的疏水相互作用。
13.權(quán)利要求1的方法，其中樣品與多種不同的傳感器PBP接觸，所述不同的傳感器PBP包括相應(yīng)不同的信號生色團，其中各個不同的傳感器PBP可以與相應(yīng)不同的靶多核苷酸選擇性結(jié)合。
14.權(quán)利要求1的方法，其中生色團為熒光團。
15.權(quán)利要求14的方法，其中熒光團選自半導(dǎo)體納米晶體、熒光染料和稀土元素螯合物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中熒光團為半導(dǎo)體納米晶體。
17.權(quán)利要求15的方法，其中熒光團為熒光染料。
18.權(quán)利要求17的方法，其中熒光染料為熒光素。
19.權(quán)利要求17的方法，其中熒光團為稀土元素螯合物。
20.權(quán)利要求1的方法，其中靶多核苷酸為DNA。
21.權(quán)利要求1的方法，其中靶多核苷酸為RNA。
22.權(quán)利要求1的方法，其中樣品包括單鏈靶多核苷酸。
23.權(quán)利要求1的方法，其中樣品包括雙鏈靶多核苷酸。
24.權(quán)利要求1的方法，其中靶多核苷酸通過擴增反應(yīng)生產(chǎn)。
25.多核苷酸傳感溶液，其包括與靶多核苷酸結(jié)合的傳感器多核苷酸結(jié)合蛋白(PBP)，所述傳感器PBP與信號生色團附著；聚陽離子多生色團，其可以與靶多核苷酸靜電相互作用，并且當(dāng)在傳感器PBP與靶多核苷酸結(jié)合后引入信號生色團附近時，在激發(fā)后能夠?qū)⒛芰哭D(zhuǎn)移給信號生色團。
26.測定樣品中靶多核苷酸的試劑盒，其包括傳感器PBP，其可以與靶多核苷酸結(jié)合；聚陽離子多生色團，其可以與靶多核苷酸靜電相互作用，并且當(dāng)在傳感器PBP與靶多核苷酸結(jié)合后引入信號生色團附近時，在激發(fā)后能夠?qū)⒛芰哭D(zhuǎn)移給信號生色團；保持傳感器PBP和多生色團的盒子；以及附隨所述盒子提供的說明書，其描述如何使用試劑盒的成分以測定樣品中的靶多核苷酸。
27.權(quán)利要求1的方法，其中從信號生色團發(fā)射的在閾值水平之上的光顯示靶多核苷酸存在于樣品中。
28.權(quán)利要求1的方法，其中從信號生色團發(fā)射的光的量經(jīng)過定量并用于測定樣品中靶多核苷酸的量。
29.權(quán)利要求12的方法，其中熒光團是綠色熒光蛋白。
30.權(quán)利要求1的方法，其中靶多核苷酸沒有擴增。
全文摘要
提供了測定樣品中靶多核苷酸的方法、組合物和物品。將懷疑含有靶多核苷酸的樣品與聚陽離子多生色團與傳感器PBP接觸，所述傳感器PBP可以與靶多核苷酸結(jié)合。傳感器PBP包括信號生色團，以從激發(fā)的多生色團吸收能量，并在靶多核苷酸存在時發(fā)射光。該方法可用于多重形式。也提供了試劑盒，該試劑盒包括進行這樣方法的試劑。
文檔編號C08G63/91GK1771335SQ200480009631
公開日2006年5月10日 申請日期2004年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月13日
發(fā)明者G·巴贊, B·劉, S·王 申請人:加州大學(xué)評議會