專利名稱：中性脂質(zhì)聚合物以及含中性脂質(zhì)聚合物的脂質(zhì)體組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PEG取代的中性脂質(zhì)聚合物及其在延長(zhǎng)脂質(zhì)體在血液中的循環(huán)時(shí)間方面的應(yīng)用。含這些脂質(zhì)聚合物的脂質(zhì)體與加有常規(guī)帶負(fù)電的PEG取代的磷脂的脂質(zhì)體相比較，它們具有相似的在血液的循環(huán)的循環(huán)時(shí)間。
相互參照的相關(guān)申請(qǐng)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/143810(1999年7月14日向美國(guó)專利和商標(biāo)局提出申請(qǐng))題為“中性脂質(zhì)聚合物與含中性脂質(zhì)聚合物的脂質(zhì)體組合物”中公開的全部?jī)?nèi)容已列入本文。這些申請(qǐng)是共同擁有的。
背景技術(shù)：
脂質(zhì)體可用于各種治療目的，具體地說，通過治療劑中的脂質(zhì)體制劑系統(tǒng)地給藥將治療劑攜帶至目標(biāo)細(xì)胞。有利的是，脂質(zhì)體——藥物制劑為改進(jìn)包括例如藥物受控釋放在內(nèi)的藥物釋放性能提供了可能性。為了使脂質(zhì)體達(dá)到目標(biāo)區(qū)域、目標(biāo)細(xì)胞或目標(biāo)位置，常常需要延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間。特別是對(duì)于那些不是靠近注射位置的目標(biāo)區(qū)域、目標(biāo)細(xì)胞或目標(biāo)位置來說，需要有長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間。例如當(dāng)脂質(zhì)體按系統(tǒng)地給藥時(shí)，理想的是用親水性物質(zhì)包覆脂質(zhì)體，例如用親水性聚合鏈(如聚乙二醇(PEG))包覆脂質(zhì)體以延長(zhǎng)脂質(zhì)體在血液循環(huán)中的循環(huán)時(shí)間。這類表面改性的脂質(zhì)體通常稱為“長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間的”或“空間穩(wěn)定的”脂質(zhì)體。
對(duì)脂質(zhì)體最常見的表面改性是連接PEG鏈，將分子量通常為約1000道爾頓(Da)-約5000Da的PEG鏈連接到由約5(摩爾)％脂質(zhì)構(gòu)成的脂質(zhì)體上(見例如Stealth Liposomes CRC Press，Lasic D.andMartin，F(xiàn).eds.，Boca Raton，F(xiàn)L(1995))，并參看此文所引文獻(xiàn))。這些脂質(zhì)體所顯示的藥物動(dòng)力學(xué)特征在于劑量與肝和脾單核吞噬細(xì)胞體系(MPS)對(duì)脂質(zhì)體吸收的下降無(wú)關(guān)，與表面未改性的脂質(zhì)體相比，顯著地延長(zhǎng)了脂質(zhì)體在血液循環(huán)中的循環(huán)時(shí)間，而表面未改性的脂質(zhì)體往往會(huì)很快地從血液中排出而在肝、脾中積累起來。
最常用的和可商購(gòu)的PEG取代的磷脂是以在極性端基團(tuán)上帶負(fù)電荷的磷脂酰乙醇胺(PE)，通常是DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)，為主要成分的。脂質(zhì)體上的表面負(fù)電荷在某些情況下是不利的，例如在與細(xì)胞的相互作用方面(例如參看Miller等的Biochemistiy，3712875-12883(1998))，及對(duì)可能會(huì)發(fā)生藥物泄漏的陽(yáng)離子藥物的釋放方面，(例如參看Webb等，Biochim，Biophys.Acta.1372272-282，(1998))。
因此，提供一種不帶電荷的、能有效地納入脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)中并能延長(zhǎng)脂質(zhì)體在血液循環(huán)中的循環(huán)時(shí)間的PEG衍生的脂質(zhì)會(huì)是有利的。理想的是，這類脂質(zhì)是低毒性、且易于制造的。
發(fā)明概述在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明包括含約1(摩爾)％-約10(摩爾)％中性脂質(zhì)聚合物的脂質(zhì)體組合物，其中中性脂質(zhì)聚合物以下式表示 式中R1和R2各自為含約8與約20個(gè)碳原子之間的烷基或鏈烯基鏈；n為約10與約300之間的數(shù)值；Z選自羥基、烷氧基、芐氧基、羧酸酯、磺酸酯、碳酸烷基或芳基酯、氨基和烷基氨基；以及L選自(i)-X-(C＝O)-Y-CH2-，(ii)-X(C＝O)-和(iii)-X-CH2-，其中X和Y各自選自氧、NH和直鏈。優(yōu)選的是該組合物包含約3(摩爾)％-約6(摩爾)％中性脂質(zhì)聚合物。
在本發(fā)明另一方面，L是可水解的鏈，如氨基甲酸酯鏈、酯鏈或碳酸酯鏈。在本發(fā)明的再一方面，Z是羥基或甲氧基。優(yōu)選的R1和R2是無(wú)支鏈的。在一方面中，R1和R2都是硬脂基基團(tuán)(C17H35)。在另一方面中，n優(yōu)選是數(shù)值為約20與約115之間，以使PEG基團(tuán)的分子量為約1000Da與約5000Da之間。
本發(fā)明還提供一種通過在脂質(zhì)體中加入約1(摩爾)％-約10(摩爾)％如上式所示的中性脂質(zhì)聚合物而使含成胞脂質(zhì)的脂質(zhì)體延長(zhǎng)在血液循環(huán)中的循環(huán)時(shí)間的方法。本發(fā)明還提供以此式表示的脂質(zhì)聚合物。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1圖示的是制備氨基甲酸酯連接的不帶電荷的脂質(zhì)聚合物(本文稱為PEG-c-DS)的合成路線；圖2A-2D圖示的是制備醚、酯、酰胺和酮連接的、不帶電荷的脂質(zhì)聚合物的合成路線；圖3A-3C是分別含有3(摩爾)％PEG-c-DS(A)，5(摩爾)％PEG-DSPE(B)，或5(摩爾)％PEG-c-DS(C)的HSPC/Chol脂質(zhì)體在血液、肝和脾中的生物分布圖；圖4分別表示不含PEG的2∶1 HSPC脂質(zhì)體(以+表示)，即，無(wú)PEG，5(摩爾)％PEG-GSPE(以Δ表示)和5(摩爾)％PEG-c-DS(以O(shè)表示)在血液中的保留率曲線圖；以及圖5分別表示含5(摩爾)％PEG-c-DS(以O(shè)表示)和含5(摩爾)％PEG-DSPE(以□表示)的PHEPC脂質(zhì)體在血液中的保留率曲線圖。
本發(fā)明的詳細(xì)說明I規(guī)定本發(fā)明所采用的術(shù)語(yǔ)“中性”脂質(zhì)聚合物是指不帶電荷的即無(wú)離子特性的脂質(zhì)聚合物。
“成胞脂質(zhì)”是指具有憎水和極性端基團(tuán)兩部分的兩親脂質(zhì)。這類成胞脂質(zhì)例如磷脂能在水中自發(fā)地形成雙層胞狀結(jié)構(gòu)，或者能穩(wěn)定地納入脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)中，其中憎水部分是與內(nèi)部即雙層膜的一個(gè)憎水區(qū)域相接觸的，極性端基團(tuán)部分是向外部即膜的極性表面取向的。這類成胞脂質(zhì)通常包含一個(gè)或兩個(gè)憎水性?；鶡N鏈或甾族基團(tuán)，在極性端基團(tuán)上可存在化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)(如胺、酸、酯、醛或醇)。磷脂(例如磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)以及鞘磷脂(SM))就包括在這類脂質(zhì)中，其中兩個(gè)烴鏈的長(zhǎng)度通常在約14-約22個(gè)碳原子之間，并具有不同程度的不飽和度。其它成胞脂質(zhì)包括糖脂(例如腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂)和甾醇(如膽甾醇)。對(duì)于本文所述組合物來說，磷脂(如PC和PE)、膽甾醇及本文所述的中性脂質(zhì)聚合物都是優(yōu)選的組分。
“烷基”是指含有碳和氫的完全飽和的一價(jià)基，該烷基可以是支鏈的或直鏈的。烷基基團(tuán)的實(shí)例是甲基、乙基、正丁基、叔丁基、正庚基和異丙基?！暗图?jí)烷基”是指含約1個(gè)-約6個(gè)碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丁基、異丁基、叔丁基、異戊基、正戊基及異戊基。
“鏈烯基”是指含碳和氫的并含至少一個(gè)雙鍵的一價(jià)基，該一價(jià)基可以是支鏈的或直鏈的。
縮寫PEG聚乙二醇，mPEG甲氧基封端的聚乙二醇，Chol膽甾醇，PC磷脂酰膽堿，PHPC部分氫化的磷脂酰膽堿，PHEPC部分氫化的卵磷脂酰膽堿，HSPC氫化的大豆磷脂酰膽堿，DSPE二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，DSP或PEG-c-DS二硬脂酰(氨基甲酸酯連接的)PEG，APD1-氨基-2，3-丙二醇，DTPA二亞乙基四胺五乙酸，Bn芐基。
II、中性脂質(zhì)聚合物本發(fā)明PEG取代的中性脂質(zhì)聚合物具有下列結(jié)構(gòu)式 式中R1和R2各自為含約8與約20個(gè)碳原子之間的烷基或鏈烯基鏈；n為約10與約300之間的數(shù)值；Z選自羥基、烷氧基、芐氧基、羧酸酯、磺酸酯、碳酸烷基或芳基酯、氨基和烷基氨基；以及
L選自(i)-X-(C＝O)-Y-CH2-。(ii)-X(C＝O)-和(iii)-X-CH2-，其中X和Y各自選自氧、NH和直鏈。
該類脂質(zhì)聚合物包括用來取代PEG-磷脂(例如PEG-DSPE)中的帶電荷的磷酸酯鏈的中性鏈(L)，該P(yáng)EG-磷脂常用于空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體中。中性鏈通常選自氨基甲酸酯、酯、酰胺、碳酸酯、脲、胺以及醚。可水解的或其它可斷裂的鏈例如氨基甲酸酯、碳酸酯和酯是優(yōu)選用于在體內(nèi)經(jīng)一定循環(huán)時(shí)間后需要除PEG鏈的場(chǎng)合中的。這一特征可用于在脂質(zhì)體到達(dá)其目標(biāo)后釋放藥物或可使藥物易為細(xì)胞吸收(Martin等人的美國(guó)專利5891468，Zalipsky等人的PCT公開No.WO98/18813(1998))。
連接在連接基團(tuán)上的PEG基團(tuán)的分子量?jī)?yōu)選為約1000 Da-約15000Da；這就是說n在約20與約340之間。更優(yōu)選分子量為約1000Da-約12000Da(n＝約20-約275)，而最優(yōu)選分子量為約1000Da-約5000Da(n＝約20-約115)。R1和R2通常包含約8個(gè)碳原子-約24個(gè)碳原子，優(yōu)選為約16-約20個(gè)碳原子。最優(yōu)選的是R1＝R2＝C17H35，因此COOR是硬脂?；鶊F(tuán)。
如上所述，將不帶電荷的脂質(zhì)加入脂質(zhì)體中會(huì)呈現(xiàn)顯著的優(yōu)點(diǎn)，例如降低包膠的陽(yáng)離子藥物的泄漏。此外，另一優(yōu)點(diǎn)是能更加靈活地調(diào)節(jié)脂質(zhì)體表面與目標(biāo)細(xì)胞間及RES間的相互作用(Miller等人Biochemistry，3712875-12883(1998))。PEG取代的合成N-脂?；拾贝家呀?jīng)用作空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體中的不帶電荷成分(Webb等人，Biochim，Biophys.Acta.1372272-282，(1998))，然而這些分子是復(fù)雜的，制備成本高，而且它們通常不僅不會(huì)擠入二酰基甘油磷脂雙層結(jié)構(gòu)，而且也不會(huì)擠入磷脂雙層結(jié)構(gòu)。
可采用標(biāo)準(zhǔn)合成方法制備脂質(zhì)聚合物。例如，氨基甲酸酯連接的化合物(L＝-O-(C＝O)-NH-CH2-)是按圖1所示步驟制備的使mPEG(甲氧基PEG)中的端羥基與氯甲酸對(duì)硝基苯酯反應(yīng)制得碳酸對(duì)硝基苯酯，然后使該產(chǎn)物與1-氨基-2，3-丙二醇反應(yīng)制成氨基甲酸酯中間產(chǎn)物，接著使二元醇的羥基基團(tuán)酰化而得到最后產(chǎn)物。一種以甘油代替1-氨基-2，3-丙二醇的類似合成反應(yīng)可用來制備碳酸酯連接的產(chǎn)物(L＝-O-(C＝O)-O-CH2-)。氨基甲酸酯連接的二硬脂酰脂質(zhì)聚合物和二二十酰脂質(zhì)聚合物的制備在實(shí)施例1中也有說明。
如圖2A所示，醚連接的脂質(zhì)聚合物(L＝-O-CH2-)是按下述步驟制備的使mPEG-OH的端羥基與氯化縮水甘油反應(yīng)，使得到的環(huán)氧化物水解，以及使得到的二元醇酰化。酯連接的脂質(zhì)聚合物(L＝-O-(C＝O)-或L＝-O-(C＝O)-CH2-)可按如圖2B步驟制備使mPEG-OH與甘油酸丙酮化合物(2，2-二甲基-1，3-二氧戊烷-4-羧酸)的活化衍生物或四碳同系物2，2-二甲基-1，3-二氧戊烷-4-乙酸的活化衍生物反應(yīng)，然后使二元醇脫保護(hù)和進(jìn)行?；?br> 采用mPEG-NH2(根據(jù)Zalipsky等人的PCT公開No.WO98/18813(1998)中所述方法制備的)代替mPEG-OH的相應(yīng)反應(yīng)可用來制備含有酰胺鏈、脲、或胺鍵(即L＝-NH-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-CH2-、-NH-(C＝O)-NH-CH2-或-NH-CH2-)的脂質(zhì)聚合物。
L為-X-(C＝O)-的化合物，(其中X是O或NH)可通過活化的端羧基PEG(由端羥基PEG經(jīng)氧化，然后通過例如將羧基轉(zhuǎn)變成硝基苯基酯或使羧基與DCC反應(yīng)，以使羧基活化而制得)分別與1，2，3-丙三醇或1-氨基-2，3-丙二醇反應(yīng)來制備(圖2C)。酮基連接的化合物(即X是直鏈)可通過端醛基PEG(由端羥基PEG經(jīng)溫和氧化制得)與例如1-溴-2，3-丙二醇丙酮化物的格氏試劑的縮合(圖2D)，接著在非酸性條件下氧化成酮，再使丙酮化物水解成二元醇，然后，在每種情況下，使二元醇按常規(guī)進(jìn)行?；瞥?。
不是與甘油部分相連接的PEG低聚物端位置(α端，上述Z基團(tuán))通常是羥基或甲氧基，但可按照技術(shù)上已知方法經(jīng)官能化，以使各種分子易于與中性脂質(zhì)聚合物相連接，和/或使脂質(zhì)體以特定的細(xì)胞或組織為靶的用途或使藥物易于釋放。可連接的分子包括例如蛋白質(zhì)、肽、糖、抗體或維生素。實(shí)施例2和3說明了按照類似于上述合成路線，以商購(gòu)PEG低聚物來制備α-官能化的脂質(zhì)聚合物的步驟，其中PEG低聚物中的α端是經(jīng)諸如叔丁基醚或芐基醚的基團(tuán)取代的，這種基團(tuán)在分子的脂質(zhì)部分合成后易于轉(zhuǎn)變成羥基。就這種情況來說，通過使端基轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓釋?duì)硝基苯基酯而使端基活化。
III、脂質(zhì)體藥物動(dòng)力學(xué)。
在包含成胞脂質(zhì)的脂質(zhì)體中加入約1-約10(摩爾)％更優(yōu)選約3-約6(摩爾)％中性脂質(zhì)聚合物就可形成循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)的脂質(zhì)體。為了說明起見，加有約3-約5(摩爾)％的mPEG2000-DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)或氨基甲酸酯連接的脂質(zhì)聚合物(mPEG2000-c-DS)的脂質(zhì)體是按實(shí)施例4所述制備的，而其余的脂質(zhì)是由摩爾比為1.5∶1的HSPC和膽甾醇所組成。該脂質(zhì)體是加載有125I-tyraminylinulin標(biāo)志物的。將各次制備的試樣注入老鼠尾巴的靜脈中，然后如實(shí)施例4中所述在不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定試樣在組織中的分布。測(cè)得的血液、肝和脾中的脂質(zhì)體濃度列于表1-3中，并圖示于圖3A-3C中。數(shù)據(jù)顯示，含PEG-c-DS的脂質(zhì)體的藥物動(dòng)力學(xué)與含PEG-DSPE的脂質(zhì)體的藥物動(dòng)力學(xué)是極相似的。
表1血液中脂質(zhì)體分布
表2 肝中脂質(zhì)體分布
表3脾中脂質(zhì)體分布
對(duì)兩種PEG脂質(zhì)與不含PEG脂質(zhì)的對(duì)照配方的特性進(jìn)行了類似的比較研究。圖4顯示的是不含PEG脂質(zhì)(以+表示)，含5(摩爾)％PEG2000-DSPE(以Δ表示)或含5(摩爾)％PEG2000-c-DS(以O(shè)表示)的2∶1HSPC脂質(zhì)體在血液中的保留率。
還對(duì)含mPEG2000-c-DS∶PHPC∶Chol之摩爾比為5∶55∶40的脂質(zhì)體進(jìn)行了研究。脂質(zhì)體是通過加入銦-DTPA配合物進(jìn)行標(biāo)記的。測(cè)定血液中和各種組織中24小時(shí)內(nèi)保留的注入劑量的百分比。結(jié)果列于表4-6中。這些脂質(zhì)體通常顯示出循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)的藥物動(dòng)力學(xué)特性，四小時(shí)后注入劑量的平均保留率高于70％，24小時(shí)后高于30％。
表4 血液中銦的注射劑量的百分比
表5 24小時(shí)時(shí)組織中注射劑量的百分比
表6 24小時(shí)時(shí)組織中每克注射劑量的百分比
*每毫升注射劑量的百分比最后，比較含5(摩爾)％mPEG2000-c-DS或mPEG2000-DSPE和其余為PHEPC的脂質(zhì)體在給藥最多24小時(shí)后在血液中的保留百分比。如圖4所示，它們的藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)際是相同的，在24小時(shí)后保留率約為40％。
所有公開、專利和專利文件都列入本文供參考。已參照各個(gè)具體而優(yōu)選的實(shí)施方案和技術(shù)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說明。然而，應(yīng)當(dāng)指出，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)是可作許多變化和變更的。
下列實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1A mPEG2000-c-DS(mPEG-氨基丙二醇二硬脂酰；α-甲氧基-ω-2，3-二(硬脂酰氧基)丙基氨基甲酸酯聚(環(huán)氧乙烷))的合成將mPEG2000(20克，10摩爾)溶液在甲苯(50毫升，120℃)中共沸干燥。上述溶液的溫度達(dá)到25℃后，用氯甲酸硝基苯酯(3.015克，15摩爾)處理，隨后用TEA(2.01毫升，15摩爾)處理。使混合物反應(yīng)1.5小時(shí)，過濾產(chǎn)生的TEA鹽，脫除溶劑后得到mPEG2000-氯甲酸硝基苯酯粗制品。向mPEG2000-氯甲酸硝基苯酯添加氨基丙二醇(3克，30摩爾)的乙腈(50毫升)溶液，在室溫下攪拌該混合物過夜。以過濾方法除去不溶物后，再以蒸發(fā)方法脫除溶劑。產(chǎn)物在異丙醇中重結(jié)晶兩次。產(chǎn)率13.7克，65％。1HNMR(300兆赫，DMSO-D6)δ3.23(s，OCH3，3H)、3.65(s，PEG，180H)、4.05(t，氨基甲酸酯CH2，2H)、4.42(t，1°OH，1H)、4.57(d，2°OH，1H)。
將產(chǎn)物mPEG2000氨基丙二醇(2.3克，1.08摩爾，2.17毫當(dāng)量OH)溶于甲苯(30毫升)中并進(jìn)行共沸干燥，除去約10毫升溶液。將溶液冷卻至室溫，用移液管加入吡啶(4毫升，20％)，接著添加硬脂酰氯(1克，4.3摩爾)，立即形成白色沉淀。將反應(yīng)混合物在120℃下回流過夜后再冷卻，當(dāng)反應(yīng)燒瓶的溫度達(dá)到約40℃時(shí)，以過濾去除吡啶鹽，蒸發(fā)濾液。得到的產(chǎn)物(PEG2000-c-DS)用異丙醇(2×30毫升)重結(jié)晶兩次進(jìn)行提純并在P2O5上真空干燥。
產(chǎn)率2.26克，80％，TLC(氯仿∶甲醇，90∶10)；mPEG氨基丙二醇Rf＝0.266，PEG-c-DS，Rf＝0.533，1HNMR(300兆赫，DMSO-D6)，δ0.89(t，CH3，6H)，1.26(s，CH2，56H)，1.50(2t，2CH2，4H)，2.24(t，CH2CH2C＝O，4H)，3.23(s，OCH3，3H)3.50(s，PEG，180H)、4.00(dd，APD的CH2，1H)、4.02(t，CH2OC＝O-N，2H)、4.20(dd，APD的CH2，1H)、4.98(m、CHOC(O)，1H)、7.34(m，NH，1H)。
以相同的步驟，用分子量為750、5000和12000的mPEG聚合物制備mPEG-c-DS。通過1H-NMR和質(zhì)譜法鑒定產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。用MALDI(MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization)測(cè)定的分子量如下對(duì)應(yīng)物 MALDI法測(cè)定的分子量mPEG(750)-c-DS 1426mPEG(2000)-c-DS2892mPEG(5000)-c-DS5816mPEG(12000)-c-DS 12729實(shí)施例1B PEG-c-DE(mPEG氨基丙二醇二二十烷酰基；α-甲氧基-ω-2，3-二(二十烷酰氧基)丙基氨基甲酸酯聚(環(huán)氧乙烷))的合成在100毫升圓底燒瓶中，置入溶于甲苯(20毫升)中的二十烷酸(500毫克，1.6毫摩爾)，再用移液管添加草酰氯(147微升，1.68毫摩爾)。然后向該攪拌著的混合物添加1％DMF，一旦加入DMF，就有氣體放出。必須避免任何物體與該氣體接觸。10分鐘后，蒸發(fā)甲苯，然后再加入20毫升甲苯，并蒸發(fā)除去任何過量的草酰氯。蒸余物再溶解于10毫升甲苯中，然后向該甲苯溶液加入上面制備的mPEG-氨基丙二醇(1.19克，0.56毫摩爾)，在燒瓶上裝上回流冷凝器并回流該混合物過夜。經(jīng)TLC分析(甲醇和氯仿，9∶1)顯示，反應(yīng)已完全。待反應(yīng)混合物冷卻后，過濾出不溶物，取出濾液并干燥。產(chǎn)物用異丙醇經(jīng)三次重結(jié)晶純化并在P2O5上經(jīng)真空干燥。產(chǎn)率1.0毫克，70％。1HNMR(360兆赫，DMSO-D6)δ0.89(t，CH3，6H)，1.26(s，CH2，脂質(zhì)的66H)，1.50(t，2CH2，4H)，2.24(t，CH2CH2C＝O，4H)，3.23(s，OCH3，3H)，3.50(s，PEG，180H)，4.00(dd，APD的CH2，1H)，4.05(t，CH2CH2C+O，4H)，3.23(S，OCH3，3H)，3.50(S，PEG，180H)，4.00(dd，APD的CH2，1H)，4.05(t，CH2OC＝O-N，2H)，4.20(dd，APD的CH2，1H)，4.98(m，CHOC(O)，1H)，7.34(m，NH，1H)ppm.
實(shí)施例2 經(jīng)叔丁基-O-PEG-O-琥珀酰亞胺制備叔丁基-O-PEG-氨基丙二醇A、叔丁基-O-PEG-O-琥珀酰亞胺將購(gòu)自Polymer Labs的叔丁基-O-PEG-2000(10克，5毫摩爾)溶于120毫升甲苯中并進(jìn)行共沸干燥，脫除約20毫升溶劑，水分收集在DeanStark分水器中。
將溶液冷卻至室溫，并添加光氣(15毫升)。使混合物在室溫下反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸除溶劑，然后再添加約50毫升甲苯，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸去溶劑。將蒸余物溶于干燥甲苯(30毫升)和二氯甲烷(10毫升)中，然后向該溶液添加N-羥基琥珀酰亞胺(1.7克，14.8毫摩爾)和三乙胺(2.1毫升，14.9毫摩爾)，使混合物在室溫下反應(yīng)過夜，此后經(jīng)TLC分析表明，反應(yīng)已經(jīng)完全。
從反應(yīng)混合物過濾出鹽，經(jīng)蒸發(fā)除去溶劑，固體用異丙醇經(jīng)兩次重結(jié)晶在P2O5上干燥。產(chǎn)率9.2，85％。1HNMR(COCl3，360兆赫)，δ1.25(s，t-Bu，9H)，2.82(s，CH2CH2，4H)，3.60(s，PEG，180H)，4.45(t，CH2OCONH，2H)ppm。
B、叔丁基-O-PEG-氨基丙二醇向氨基丙二醇(300毫克，3.2毫摩爾)的DMF(10毫升)溶液添加叔丁基-PEG-OSc(5克，2.29毫摩爾)，然后使反應(yīng)過夜。全部NHS酯消耗后，得到的混合物在TLC上出現(xiàn)一個(gè)斑點(diǎn)。
將預(yù)先洗過的酸性離子交換樹脂(1克)加到反應(yīng)混合物中，30分鐘后經(jīng)過濾濾去。除去溶劑后得到的殘留物用200毫升異丙醇重結(jié)晶。收集固體并在P2O5上干燥。產(chǎn)率4.2克，85％。1HNMR(D6-DMSO，360兆赫)δ1.25(s，t-Bu，9H)，3.68(s，PEG，180H)，403(t，CH2OCONH，2H)，4.43(t，1°OH，1H)，4.55(d，2°OH，1H)，6.98(t，NH，1H)ppm。
實(shí)施例3 碳酸對(duì)硝基苯酯-PEG-c-DS的制備A、Bn-O-PEG-碳酸硝基苯酯(NPC)將購(gòu)自Shearwater Polymers(Huntsville，LA，5克2.41毫摩爾)的Bn-O-PEG-2000溶于120毫升甲苯中并進(jìn)行共沸干燥，脫除約20毫升溶劑，水分收集在Dean Stark分水器中。將溶液冷卻至室溫，并在減壓下蒸去溶液中剩余的溶劑。
將蒸去溶劑后的蒸余物溶解于30毫升二氯甲烷/乙酸乙酯(60∶40)中，添加氯甲酸對(duì)硝基苯酯(729毫克，3.6毫摩爾)和三乙胺(1毫升，7.2毫摩爾)。使反應(yīng)在4℃下進(jìn)行8-16小時(shí)。該方法雖可消除碳酸雙PEG酯的形成，但會(huì)降低反應(yīng)效率。在GF硅膠板上出現(xiàn)紫外可見斑點(diǎn)說明反應(yīng)已完成。
反應(yīng)混合物用預(yù)先洗過的酸性和堿性離子交換樹脂處理30分鐘，然后過濾和干燥。產(chǎn)物用異丙醇重結(jié)晶后在P2O5上干燥。產(chǎn)率4.4克，80％。
B、Bn-O-PEG-氨基丙二醇向氨基丙二醇(260毫克，1.9毫摩爾)的DMF(10毫升)溶液添加如上制備的Bn-O-PEG-NPC(4.3克，2.9毫摩爾)，使反應(yīng)進(jìn)行5小時(shí)。全部Bn-O-PEG-NPC消耗后，反應(yīng)混合物在TLC硅膠板(氯仿∶甲醇∶水為90∶18∶2)上出現(xiàn)一個(gè)斑點(diǎn)。
反應(yīng)混合物用預(yù)先洗過的酸性離子交換樹脂5克處理30分鐘，然后過濾和干燥。產(chǎn)物用異丙醇重結(jié)晶后在P2O5上干燥。產(chǎn)率3.8克，91％。
C、Bn-O-PEG-c-二硬脂酰將Bn-O-PEG-氨基丙二醇(3克，1.36毫摩爾)、硬脂酸(1.94克，6.79毫摩爾)與作為催化劑的DPTS(4-(二甲氨基)吡啶鎓4-甲苯磺酸鹽)(408毫克，1.36毫摩爾)在室溫下攪拌20分鐘。用移液管添加二異丙基碳二亞胺(1.28毫升，8.16毫摩爾)，然后使混合物反應(yīng)過夜。TLC(氯仿∶甲醇，90∶10)顯示二元醇已完全參與反應(yīng)。
將堿性離子交換樹脂(5克)添加到反應(yīng)混合中，搖動(dòng)30分鐘后，過濾出樹脂，使濾液干燥。干燥的產(chǎn)物經(jīng)異丙醇(100毫升)重結(jié)晶，在P2O5上干燥。產(chǎn)率4克，80％。
D、HO-PEG-c-二硬脂酰采用兩種不同方法脫去Bn-O-PEG-c-DS的芐基基團(tuán)保護(hù)方法1氫解通過載持在碳上的鈀脫保護(hù)。向Bn-O-PEG-c-DS(218毫克，0.08毫摩爾)的5毫升甲醇溶液添加10％Pd/C(110毫克)和甲酸銨(107毫克，0.8毫摩爾)，使混合物在室溫下反應(yīng)過夜。在Celite上過濾濾去Pd/C，使濾液干燥。將干燥的殘留物溶于氯仿中，用飽和NaCl溶液洗滌氯仿溶液三次。收集氯仿相并用MgSO4干燥，然后濾除MgSO4并濃縮。固體產(chǎn)物經(jīng)叔丁醇冷凍干燥，得到的粉狀產(chǎn)物在P2O5上干燥。產(chǎn)率80％，175毫克。
方法2通過四氯化鈦脫保護(hù)。將Bn-O-PEG-c-DS(1.18克，0.43毫摩爾)的二氯甲烷(10毫升)溶液在冰浴中冷卻5分鐘。用經(jīng)烘箱干燥過的注射器將四氯化鈦(3毫升，21.5摩爾，過量的)轉(zhuǎn)移到密封的反應(yīng)燒瓶中。5分鐘后，移去冰浴，在室溫下過夜進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)。在GF硅膠TLC板上出現(xiàn)移動(dòng)距離較短的斑點(diǎn)(相對(duì)于原材料)表示脫保護(hù)反應(yīng)已完全。
將約40毫升氯仿加到反應(yīng)混合物中，然后將混合物轉(zhuǎn)移到含40毫升飽和NaHCO3的分液漏斗中。輕輕地?fù)u動(dòng)混合物(避免形成乳狀液)，收集氯仿層。如此重復(fù)萃取三次，收集氯仿相，并再用飽和NaHCO3萃取一次以確保完全除TiCl4。收集的氯仿相用MgSO4干燥，然后過濾和濃縮。
將上述得到的濃縮物溶于1毫升氯仿中并加到已準(zhǔn)備好的硅膠(200-400目，60埃)柱中。移動(dòng)相(氯仿)的極性是通過遞增2％的甲醇而增加，直到產(chǎn)物以10％甲醇/90％氯仿洗提。收集流出的產(chǎn)物并以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器脫除溶劑。固體經(jīng)叔丁醇冷凍干燥后在P2O5上干燥。產(chǎn)率70％，800毫克。
E、碳酸對(duì)硝基苯酯-PEG-c-DS反應(yīng)燒瓶、攪拌棒、注射器和原材料(HO-PEG-c-DS，按上述制備的)在反應(yīng)開始前都是經(jīng)仔細(xì)干燥的。
向HO-PEG-c-DS(1.2克，0.45毫摩爾)的10毫升二氯甲烷/乙酸乙酯(60∶40)溶液添加碳酸對(duì)硝基苯酯(136毫克，0.65毫摩爾)和三乙胺(188微升，1.35毫摩爾)。在4℃(以消除碳酸雙PEG酯的形成)下使反應(yīng)進(jìn)行8-16小時(shí)，以后，通過GF硅膠的TLC表明，反應(yīng)已完全。
反應(yīng)混合物用預(yù)先洗過的酸性和堿性離子交換樹脂處理30分鐘后過濾。使濾液干燥，所得固體用異丙醇重結(jié)晶。再使固體在P2O5上干燥。產(chǎn)率70％。1HNMR(D6-DMSO，360兆赫)，δ0.86(t，CH3，6H)，1.22(s，DS，56H)，1.48(m，CH2CH2(CO)，4H)，2.26(2xt，CH2OCONH，2H)，4.03和4.22(2xd，脂質(zhì)的CH2CH，2H)，4.97(M，脂質(zhì)的CHCH2)，6.98(t，NH，1H)，7.55％8.32(2xd，芳香，4H)ppm。
實(shí)施例4含PEG-DSPE和PEG-c-DS的脂質(zhì)體的制備和生物分布研究使按下列比例的HSPC∶Chol∶PEG脂質(zhì)混合物經(jīng)溶解和脫除溶劑而形成脂質(zhì)膜A58∶39∶3；PEG脂質(zhì)＝PEG-c-DSB57∶38∶5；PEG脂質(zhì)＝PEG-DSPEC57∶38∶5；PEG脂質(zhì)＝PEG-c-DS使膜在含140毫摩爾NaCl的25毫摩爾HEPES的新制備的125I-Tyraminylinulin中(PH7.4)水合，并擠壓形成直徑為100-105納米的脂質(zhì)體。使該脂質(zhì)體通過0.22微米Millipore(MilliporeCorporation，Bedford，MA)低蛋白結(jié)合的注射管端微孔過濾器過濾滅菌。進(jìn)行等分部分計(jì)數(shù)以確定125I的注入數(shù)。脂質(zhì)濃度是通過檢驗(yàn)脂質(zhì)體制品的磷酸酯含量來確定，脂質(zhì)體制品以滅菌緩沖液稀釋至最后濃度為2.5微摩爾/毫升。將0.2毫升稀釋過的脂質(zhì)體經(jīng)老鼠尾巴靜脈注入老鼠體內(nèi)以使每只老鼠接受0.5微摩爾磷脂。在不同的時(shí)間點(diǎn)，通過氟烷麻醉、頸部錯(cuò)位使老鼠死亡，取心臟血流和血液的血樣以及各種器官供125I計(jì)數(shù)試驗(yàn)。
權(quán)利要求
1.一種包含約1(摩爾)％-約10(摩爾)％的中性脂質(zhì)聚合物和其余為成胞脂質(zhì)的脂質(zhì)體組合物，其中脂質(zhì)聚合物具有下列化學(xué)式 式中R1和R2各自為含約8與約24個(gè)碳原子之間的烷基或鏈烯基鏈；n＝約10-約300之間的數(shù)值；Z選自羥基、烷氧基、芐氧基、羧酸酯、磺酸酯、碳酸烷基或芳基酯、氨基和烷基氨基；以及L選自(i)-X-(C＝O)-Y-CH2-，(ii)-X-(C＝O)-和(iii)-X-CH2-，其中X和Y各自選自氧、NH和直鏈。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中X是氧，Y是氮。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中L是氨基甲酸酯鏈，酯鏈或碳酸酯鏈。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中L是-O-(C＝O)-N-CH2-(氨基甲酸酯鏈)。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中Z是羥基或甲氧基。
6.權(quán)利要求1的組合物，還包含約3(摩爾)％-約6(摩爾)％的中性脂質(zhì)聚合物。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中R1和R2各自為含約8-約24個(gè)碳原子之間的非支鏈烷基或鏈烯基鏈。
8.權(quán)利要求6的組合物，其中R1和R2各自是C17H35。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中n是約20與約115之間的數(shù)值。
10.一種延長(zhǎng)含有成胞脂質(zhì)的脂質(zhì)體循環(huán)時(shí)間的方法，該方法包括向含有成胞脂質(zhì)的脂質(zhì)體中加入約1(摩爾)％-約10(摩爾)％的具有下列化學(xué)式的中性脂質(zhì)聚合物 式中R1和R2各自為含約8與約24個(gè)碳原子之間的烷基或鏈烯基鏈；n＝約10-約300之間的數(shù)值；Z選自羥基、烷氧基、芐氧基、羧酸酯、磺酸酯、碳酸烷基或芳基酯、氨基和烷基氨基；以及L選自(i)-X-(C＝O)-Y-CH2-，(ii)-X(C＝O)-和(iii)-X-CH2-，其中X和Y各自選自氧、NH和直鏈。
11.權(quán)利要求10的方法，其中X是氧，Y是氮。
12.權(quán)利要求10的方法，其中L是氨基甲酸酯鏈、酯鏈或碳酸酯鏈。
13.權(quán)利要求12的方法，其中L是-O-(C＝O)-N-CH2-(氨基甲酸酯鏈)。
14.權(quán)利要求10的方法，其中Z是羥基或甲氧基。
15.權(quán)利要求10的方法，其中加入有約3(摩爾)％-約6(摩爾)％中性脂質(zhì)聚合物。
16.權(quán)利要求10的方法，其中n是約20與約115之間的數(shù)值。
17.一種具有下列結(jié)構(gòu)的中性脂質(zhì)聚合物 式中R1和R2各自為含約8與約24個(gè)碳原子之間的烷基或鏈烯基鏈；n＝約10-約300之間的數(shù)值；Z選自羥基、烷氧基、芐氧基、羧酸酯、磺酸酯、碳酸烷基或芳基酯、氨基和烷基氨基；以及L選自(i)-X-(C＝O)-Y-CH2-，(ii)-X-(C＝O)-和(iii)-X-CH2-，其中X和Y各自選自氧、NH和直鏈。
18.權(quán)利要求17的脂質(zhì)聚合物，其中X是氧、Y是氮。
19.權(quán)利要求17的脂質(zhì)聚合物，其中L是氨基甲酸酯鏈酯鏈或碳酸酯鏈。
20.權(quán)利要求19的脂質(zhì)聚合物，其中L是-O-(C＝O)-N-CH2-(氨基甲酸酯鏈)。
21.權(quán)利要求17的脂質(zhì)聚合物，其中R1和R2各自為含約8與約24個(gè)碳原子之間的非支鏈烷基或鏈烯基鏈。
22.權(quán)利要求21的脂質(zhì)聚合物，其中R1和R2各自是C17H35。
23.權(quán)利要求17的脂質(zhì)聚合物，其中Z是羥基或甲氧基。
24.權(quán)利要求17的脂質(zhì)聚合物，其中n是約20與約115之間的數(shù)值。
全文摘要
含PEG取代的中性脂質(zhì)聚合物的脂質(zhì)體具有與加有常規(guī)帶負(fù)荷的PEG取代的磷脂的脂質(zhì)體相類似的在血液循環(huán)中的循環(huán)時(shí)間。不帶電荷的脂質(zhì)體的采用還具有下述優(yōu)點(diǎn):改善了與細(xì)胞表面的相互作用,降低了帶電荷物質(zhì)具體說是陽(yáng)離子藥物從脂質(zhì)體中的泄漏。該脂質(zhì)聚合物的化學(xué)式如下。式中:R
文檔編號(hào)C08L91/00GK1360611SQ00810298
公開日2002年7月24日 申請(qǐng)日期2000年7月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月14日
發(fā)明者S·扎里普斯基 申請(qǐng)人:阿爾薩公司