專利名稱：使用純化的抗原特異性抗體快速檢測肺炎鏈球菌的方法和材料的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種特異和靈敏的，可在15分鐘內(nèi)完成的免疫層析(“ICT”)試驗，用于檢測呈現(xiàn)肺炎鏈球菌感染臨床癥狀病人的體液，如尿或腦脊髓液中的肺炎鏈球菌。
背景肺炎鏈球菌(“S.pneumoniae”)是一種肺炎類疾病和其它下呼吸道感染(如支氣管炎)，和上呼吸道感染，如感染性中耳炎和鼻竇炎，以及播散性侵襲性感染，包括菌血癥和腦膜炎的致病生物體。當未被正確診斷和治療時，肺炎鏈球菌肺部感染會導致心包炎、膿胸、暴發(fā)性紫癜、心內(nèi)膜炎和至少一種關節(jié)炎，在每種病例中，肺炎鏈球菌都是致病生物體。這些肺部感染常常是菌血癥或腦膜炎的前驅(qū)。目前診斷和治療肺炎鏈球菌引起的肺炎仍在一定程度上是憑經(jīng)驗的。
在一個顯著的程度上憑經(jīng)驗，這是因為現(xiàn)行檢測肺炎鏈球菌的試驗是(1)費時、費力，需要儀器的輔助來閱讀結果，或(2)缺乏靈敏性和/或特異性。由于問題和缺乏靈敏度和/或特異性有關，所以醫(yī)生傾向于給肺炎型呼吸道感染病人開昂貴、廣譜抗生素處方，而不是足以治愈該感染的、對肺炎鏈球菌有特效的、較不昂貴的抗生素。這種和其它形式的濫用廣譜抗生素當然是今天眾所周知的、許多類型感染性細菌對原先高效抗生素的抗性增加而產(chǎn)生的醫(yī)學危機的主要原因。這種危機和對于至少某些病人憑經(jīng)驗診斷和治療而引起的潛在不良后果，是為什么需要檢測人體液中肺炎鏈球菌的可靠和快速的試驗的原因之一。
肺炎鏈球菌肺炎是一種嚴重疾病，估計每年僅在美國每1000個人中要發(fā)生1-5例。視患肺炎鏈球菌肺炎感染病人的年齡和健康狀況(基于無關因素)，該疾病在感染病人中引起的死亡率為4-30％。
嘗試診斷肺炎鏈球菌疾病，尤其是肺炎的最由來已久的方法，涉及對病人咳出的懷疑攜帶該病菌的痰進行革蘭氏染色和培養(yǎng)，隨后作生化鑒定的方法。該程序從開始到結束，需要約1-4天。已證明，這是一種不令人滿意的診斷方法，因為(1)存在于病人唾液中的其它細菌常常長得超過痰培養(yǎng)物，和(2)即使病人沒有該細菌引起的疾病癥狀時，肺炎鏈球菌也常常存在于人上呼吸道中。例如，估計美國30％的兒童都是肺炎鏈球菌的習慣性攜帶者。太多的成人中有肺炎鏈球菌寄居，而本身不進入疾病狀態(tài)。兒童和成人的攜帶率隨擁擠狀況和在冬天將增加。
已開發(fā)了協(xié)同凝集、乳膠顆粒凝集和對流免疫電泳方法來檢測痰標本中肺炎鏈球菌多糖莢膜抗原，這些方法是快速但未顯示可靠的靈敏度或特異性，可能是由于肺炎鏈球菌有83種血清型，每種的免疫原性和其它方面都可能不同。商業(yè)上開發(fā)的和用于這些試驗的多價抗血清含有針對所有83種肺炎鏈球菌血清型抗原的抗體，但盡管如此，它還是不能檢測出免疫原性較低的抗原血清型。該多價抗血清還顯示了和其它鏈球菌以及某些其它感染性細菌，如流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza)的交叉反應性。所以當這些試驗用于痰樣本時，可能同時隨機發(fā)生假陰性和假陽性反應。
已開發(fā)了幾種酶聯(lián)免疫試驗(“EIA”)，它們是基于檢測發(fā)現(xiàn)在所有肺炎鏈球菌血清型的肺炎球菌細胞壁都存在著的肺炎球菌C-多糖抗原。見例如，Parkinson,A.J.,Rabiego,M.E.,Sepulveda,C.,Davidson,M.和Johnson,C.,臨床微生物學雜志30:318-322(1992)。該C-多糖抗原是衍生自磷壁酸的、含有磷酸膽堿的多糖。這些EIA試驗具有可接受的特異性和靈敏度，即使常用于痰樣品檢測。然而，這些試驗每一種都要求在樣品收集后2-3個小時內(nèi)進行，而且要用主要在臨床實驗室中才可得到的儀器。另外，這些試驗必須由受過訓練的人員，或在其密切監(jiān)督下進行。
對痰樣品診斷肺炎鏈球菌感染的可靠性在對肺炎鏈球菌肺炎的診斷中常常不令人滿意，不僅是由于樣品可能被口腔中的其它細菌和/或固有的上呼吸道肺炎鏈球菌污染。而且痰往往很難收集，一旦開始對病人用藥，痰中存活的肺炎鏈球菌數(shù)目迅速下降。特別是，如果使用了攻擊肺炎鏈球菌微生物細胞壁的抗生素治療，痰中C-多糖抗原的存在將迅速變得難于檢測。當肺炎鏈球菌引起感染性中耳炎、腦膜炎和各種其它上述感染性疾病狀態(tài)時，痰樣品對診斷并無幫助。
對懷疑感染了肺炎鏈球菌的病人作血培養(yǎng)消除了伴隨痰樣品的污染問題。當在血清樣品中發(fā)現(xiàn)含有肺炎鏈球菌時，可能易于作出哪種細菌是疾病的致病原的診斷。該方法的不足是，所有被肺炎鏈球菌感染的肺炎病人只有20％產(chǎn)生菌血癥；因此，僅靠血樣來診斷肺炎鏈球菌引起的肺炎可能得到假陰性結果。
已發(fā)現(xiàn)尿樣是最可靠、最方便的用于檢測肺炎鏈球菌肺炎的樣品，因為它們是非創(chuàng)傷性獲得的；它們不會被口腔微生物菌叢污染；而且即使病人治療已開始，細菌也一直存在于尿中，雖然濃度水平穩(wěn)定下降。所以每日監(jiān)測病人尿樣，來評估處方治療的效力，可得到有用的信息。應注意不呈現(xiàn)疾病癥狀的肺炎鏈球菌人類攜帶者往往不存在足夠的病原體，因而他們的尿中不存在肺炎鏈球菌抗原。
一篇新近的文章描述了用EIA方法檢測腦脊髓液樣品，成功診斷了肺炎鏈球菌引起的腦膜炎。在該EIA中，使用了單克隆免疫球蛋白A抗磷酸膽堿抗體，以檢測C-多糖抗原。見Stuertz,K,Merx,I,Eiffert,H.,Schmutzhard,E.,Mader,M.和Nau,R.,36臨床微生物學雜志，2346-2348。獲得的結果和Yolken,R.H.,Davis,D.,Winkelstein,J.,Russell,H.和Sippel,J.E.,20臨床微生物學雜志802-805(1984)的結果(在一EIA中獲得，其中使用了兩種針對腦脊髓液中肺炎鏈球菌的抗體--一種針對肺球菌C-多糖抗原的馬抗體，結合于微量滴定板，和一種針對液相中多糖莢膜抗原的合并兔抗血清)比較，是令人滿意的。
發(fā)明簡述根據(jù)本發(fā)明，用蛋白質(zhì)含量低于約10％的分離和純化的C-多糖抗原，親和純化在兔中產(chǎn)生的、針對肺炎鏈球菌C-多糖抗原的抗體。
將這些親和純化的抗體與一種試劑偶聯(lián)，該試劑在與測試樣品中的肺炎鏈球菌C-多糖抗原、和固定在硝酸纖維素基質(zhì)上的親和純化的C-多糖抗體形成夾心時，可產(chǎn)生顏色反應。
在一次性使用的免疫層析試驗裝置中進行該試驗，而且不需要用儀器解釋結果。該試驗可由未受過實驗技術訓練的人輕易和成功的進行。
用于診斷肺炎鏈球菌肺炎的優(yōu)選試樣是病人尿，但該試驗也可用其它含有肺炎鏈球菌的體液樣品，包括血清和痰。用病人腦脊髓液作為試樣可容易的診斷肺炎鏈球菌引起的腦膜炎。
本發(fā)明首次提供了一種可在15分鐘內(nèi)進行，而且特異性和靈敏度和需要8-12倍時間或更長方能獲得結果的EIA試驗至少相等的肺炎鏈球菌試驗。該試驗易于進行，不需要特殊訓練、裝備、或儀器，并能迅速診斷肺炎鏈球菌引起的肺炎?？稍卺t(yī)生的辦公室中輕易進行，從而允許病人立即接受特別針對肺炎鏈球菌的治療方案。當然該試驗還能在臨床實驗室中進行，但也可在養(yǎng)老院、病人家中或任何懷疑流行肺炎鏈球菌肺炎或其它病理狀態(tài)的環(huán)境下方便的進行。
本發(fā)明的試驗對出現(xiàn)疾病狀態(tài)，如中耳炎、支氣管炎或鼻竇炎時是重要的，因為一旦可確定這些疾病的任一是由于肺炎鏈球菌，而不是由其它感染性因子引起的，可立即開始合適的治療。小兒尤其易患中耳炎，因為他們的咽鼓管長度較短，直徑較小，因此早期檢測(如存在)出肺炎鏈球菌，將可很好的預防發(fā)生更嚴重的、或甚至威脅生命的疾病狀況。Norris等，兒科學雜志821-827(1966)和Hongeng等，130兒科學雜志No.5(1997年5月)的論文表明，患有鐮刀形紅細胞疾病的兒童非常容易感染肺炎鏈球菌，而肺炎鏈球菌敗血癥是這些人中最常見的感染性疾病，那些一旦感染了該病的兒童將有高得多的復發(fā)率和隨后的死亡率。顯然使用本發(fā)明的ICT試驗來常規(guī)檢驗這些病人的尿，將有助于減少對這些論文第二篇推薦的、不停頓使用青霉素作預防。
該試驗易于進行，能檢測尿中肺炎鏈球菌C-多糖抗原，提示該試驗應謹慎的在沒有相關感染明顯癥狀，報告感覺異常的病人中進行。確定肺炎鏈球菌有顯著足夠量存在，以至尿ICT試驗陽性的這類病人，預示很可能發(fā)展成更嚴重的感染--以及本發(fā)明新提出的在該疾病變得嚴重之前通過施用合適的治療，可能防止疾病發(fā)展。
附圖簡述本文

圖1和相關的圖1A、1B和1C顯示了典型ICT裝置，適合用于進行本文下面詳述的肺炎鏈球菌試驗。
發(fā)明詳述廣泛的說，可設計和配置本文所述的肺炎鏈球菌ICT試驗，在本領域公開的已知一次性ICT裝置上進行。優(yōu)選將它設計成將在包括診斷人呼吸道系統(tǒng)疾病的廣泛應用領域中，采用Howard Chandler的待批美國專利申請系列號07/706,639或其部分延續(xù)申請之一所公開類型的ICT裝置進行的試驗。所有上述申請被轉(zhuǎn)讓給Smith-Kline Diagnostics,Inc.但獨家授權給Binax,Inc.(它被賦予轉(zhuǎn)讓該申請的權利)。
優(yōu)選的裝置在其一區(qū)域中適當充滿了抗肺炎鏈球菌C-多糖抗原的抗原特異性多克隆抗體。將標記的抗原特異性抗體加到該裝置另一區(qū)域中。首先使懷疑含有肺炎鏈球菌的試樣和標記的抗原特異性抗體接觸，然后和樣品一起流到含有未標記的結合的抗原特異性抗體的該裝置區(qū)域，如果樣品中存在肺炎鏈球菌，通過接觸，已形成的標記的抗體C-多糖抗原偶聯(lián)物與固定的未標記的親和純化的抗體結合，從而產(chǎn)生可見的顏色反應。標記可以是任何本領域已知的、能在標記的抗體抗原復合物和結合的未標記抗體反應時產(chǎn)生可見顏色的物質(zhì)。這些標記包括各種極細的金屬顆粒、各種有機分子和各種分子組合，如酶和另一種產(chǎn)色分子的組合。在本發(fā)明中，膠態(tài)金顆粒組成了優(yōu)選標記。
設計試驗裝置最重要的在于，該試驗裝置發(fā)生反應的兩個部位每一處的抗體濃度應充分以確保試樣中存在的抗原被標記抗體捕獲，而標記的抗體/抗原易被樣品捕獲線處結合的抗體捕獲和固定。和本發(fā)明相關的實驗工作已顯示，對肺炎鏈球菌C-多糖抗原的活性抗體必須在試驗裝置兩部位的的每個部位都存在，在這種部位抗原抗體反應發(fā)生的濃度為表面面積每平方毫米7.7納克到385納克之間。如果要發(fā)生反應的部位抗原濃度低于7.7納克/平方毫米，可能會得到假陰性結果。
己知各種親和純化抗肺炎鏈球菌C-多糖抗原的抗體的方法。本文下面描述的是本發(fā)明優(yōu)選的，但也可用其它方法代替。然而應注意，本發(fā)明親和純化的抗體可以和Sjogren和Holme,102免疫學方法雜志93-100(1987)描述的親核純化抗體制劑明顯不同。這些作者描述了獲得含有17％蛋白質(zhì)的熱苯酚純化的肺炎鏈球菌C-多糖抗原，將其吸附到離子交換凝膠DEAE-Sepharose CL6B上。48小時培育后，將該制備物以中性pH7.2裝填入柱。據(jù)說該抗原和凝膠的結合效率大約60％。將抗體加到這些柱上，培育30分鐘，然后用0.5M NaCl的PBS溶液洗脫該柱。據(jù)知抗原從離子交換柱上滲漏是常常發(fā)生的。在該系統(tǒng)中，假設從凝膠上洗脫的產(chǎn)物是原位形成的抗體抗原復合物，而不是本發(fā)明的純化抗原制備物是合理的。應特別注意的是，在本發(fā)明中，含有少于10％蛋白質(zhì)的純化抗原與間隔分子，如BSA-肼偶聯(lián)物共價偶聯(lián)，然后將產(chǎn)生的標記的抗原偶聯(lián)配體與層析凝膠-(如實施例4的Formyl Spherilose)共價偶聯(lián)，然后填充柱。加入抗體并用強酸性緩沖液將抗體從柱上的固定抗原上洗脫下來。
本文優(yōu)選的抗體是通過用肺炎鏈球菌菌株R6(一種無莢膜的肺炎鏈球菌菌株，從美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC號39938獲得，在注射入動物前，加熱殺死細胞)常規(guī)注射家兔產(chǎn)生的。經(jīng)過一段合適時間后，對動物取血，獲得含有所需抗體的血清，然后純化?？捎闷渌槍Ψ窝祖溓蚓鶦-多糖抗原的抗體代替本文具體描述的那些，而不違背本發(fā)明。
首先，應測試該抗體與其它常見感染性細菌的交叉反應性。用ELISA法測試了本文所稱的優(yōu)選抗體的交叉反應性，測試的細菌如下弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freudii)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)，糞腸桿菌(Enterobacter faecalis)，鏈球菌B組Ⅲ型，大腸桿菌，腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)，古巴沙門氏菌(Salmonella cubana)，甲型副傷寒沙門氏菌(Samonella paratyphi A)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，鏈球菌B組Ⅱ型，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)，鏈球菌A組，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)，白色念珠菌(Candida albicans)，流感嗜血菌(Haemophilus influenza)，粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)，庫氏棒桿菌(Corynebacterium kutscheri)，惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，普通變形菌(Proteus vulgaris)，鳥腸球菌(Enterococcus avium)，鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)，產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，魯氏不動桿菌(Acinetobacter lwoffii)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeroginosa)，腐生葡萄球菌(Staphylococcus saphrophyticus)，耐久腸球菌(Enterococcus durans)，牛棒桿菌(Corynebaterium bovis)，奇異變形菌(Proteus mirabilis)，施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)，洋蔥白克霍爾德氏菌(Pseudomonas cepacia)，傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)，鏈球菌F組，鏈球菌B組1a型，類星形念珠菌(Candida stellatoides)，副血鏈球菌(Streptococcus parasanguis)，鏈球菌G組，鏈球菌C組，變異鏈球菌(Streptococcus mutans)，摩氏摩根氏菌(Morganellamorganii)，溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)，乙型流感嗜血菌，嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，丁型流感嗜血菌，陰道加德納氏菌(Gardnerella vaginalis)，緩癥鏈球菌(Streptococcus mitis)，副流感嗜血菌(Haemophilus parainfluenzae)，血鏈球菌(Streptococcus sanguis)和不能分型的流感嗜血菌。
發(fā)現(xiàn)僅有的明顯交叉反應性是和緩癥鏈球菌和金黃色葡萄球菌。前者，緩癥鏈球菌，是心內(nèi)膜炎的病原體，醫(yī)生可輕易的從臨床上將有其顯著癥狀的病人和肺炎鏈球菌肺部感染的病人區(qū)分開來。緩癥鏈球菌含有與肺炎鏈球菌相同的C-多糖抗原，而且兩者具有相同的引起心內(nèi)膜炎的能力。雖然肺炎鏈球菌通常僅在初期肺炎未受到適當治療的病人中引起該疾病，而且病人隨后可能發(fā)生菌血癥和/或心內(nèi)膜炎或其它病原性二次感染。相反，緩癥鏈球菌不是肺炎的病原體；緩癥鏈球菌引起的心內(nèi)膜炎通常不伴隨任何其它感染。因此，相信當需要時，可用本發(fā)明的試驗確認懷疑患緩癥鏈球菌引起的初期心內(nèi)膜炎病例。然而應注意的是，緩癥鏈球菌比肺炎鏈球菌在尿中要存在的可能性少，因此在該情況下血清試驗將更可能獲得可信的信息。
已知某些金黃色葡萄球菌菌株分泌蛋白A，一種非特異性蛋白，能不加區(qū)別的和IgG結合，因此能和所有抗體結合。可通過本領域熟知的其它簡單試驗輕易的確定或排除這些金黃色葡萄球菌物質(zhì)的存在。(如實施例9所示，無蛋白A的金黃色葡萄球菌菌株顯示對本發(fā)明的抗體無交叉反應性。)觀察到對流感嗜血菌的微量交叉反應，但相信這點交叉反應在檢測尿樣肺炎鏈球菌中不足以產(chǎn)生顯著問題。
下列實施例說明了親和純化本發(fā)明抗體的優(yōu)選模式，包括初步分離和純化用于抗體純化的抗原，從而得到抗原特異性多價抗體制備物。
實施例1-細菌生長條件在補充了20mM Hepes緩沖液的肺炎鏈球菌肉湯中培養(yǎng)肺炎鏈球菌菌株R6(ATCC No.39938)。每升肉湯具有下列組合物酪蛋白的胰酶消化物 17.0克葡萄糖 10.0克NaCl 5.0克大豆粉的木瓜蛋白酶消化物 3.0克酵母抽提物 3.0克K2HPO42.5克HEPES20mM該肉湯在26℃具有起始pH7.2±0.2。在15psi和121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘，放置冷卻。
將肺炎鏈球菌菌株R6(ATCC No.39938)的冷凍等分接種到5％綿羊血瓊脂平板上，使其生長。將平板上的生長物收集到更小等分的接種肉湯中，將該接種肉湯接種到三個燒瓶中，各含有1,700毫升補充的上述組合物的肺炎鏈球菌肉湯中，在37℃,5％CO2中攪拌但不通氣培養(yǎng)。當肉湯的pH下降到5.5以下(它的對數(shù)晚期)時，從溫箱中取出燒瓶，用0.1％疊氮化鈉殺死細胞，將pH調(diào)節(jié)到7.0以上，防止自溶。然后將燒瓶保藏在4℃過夜。翌日，8,000rpm離心各燒瓶中的懸液60分鐘。然后合并沉淀，13,000rpm再次離心30分鐘。記錄沉淀的濕重，將其儲藏在-20℃。
實施例2-分離含蛋白質(zhì)少于10％的肺炎鏈球菌C-多糖抗原將實施例1中生長、處理并儲藏的細胞室溫融化，將其懸浮在pH7.2的、含有0.2％疊氮化鈉的磷酸緩沖鹽溶液(“PBS”)中，比例為1.2毫升緩沖液比1克濕細胞，室溫放置兩天。
然后按每1克濕細胞11毫升0.1N的NaOH加到肺炎鏈球菌懸液(磷酸緩沖鹽中)中，得到pH12.34(用pH計測量)，約30℃培育45分鐘。然后用2N HCl將懸液pH調(diào)節(jié)到2.75(用pH計測量)，然后3,500rpm離心懸液25分鐘。然后分離上清液，用1N NaOH將其pH調(diào)節(jié)到7.0-7.1。該基本中性的上清液置于透析管(從Spectra/Por獲得，具有12,000到14,000的分子量截留值)中4℃對水透析兩日。在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮該透析上清液25-40倍。
按每克濕細胞加入0.20mg的蛋白酶K(購自Boehringer Mannheim)，混合物置于37℃3.5-4小時，然后室溫過夜至第二天。
用蛋白酶K消化后，在Spectra/Por的具有12,000-14,000的分子量截留值的透析管中4℃對水透析得到的上清液。然后將透析上清液分成12等份，各置于30毫升玻璃管中，和等體積的90％苯酚混合。密封試管，在熱水浴中68-72℃培育23分鐘，水平面比試管中的混合物平面稍高。不時用玻璃的Pasteur移液管攪拌各試管中的懸液制備肉眼看來更均勻的懸液。在該培育后，室溫放置懸液30分鐘，然后5,000rpm、15℃離心40分鐘。
接著，將各試管中的上方水相用玻璃針筒小心吸出；對于各試管，仔細測量該水相的體積，用等體積的新鮮水替換。再次進行68-72℃培育，然后5,000rpm、15℃離心40分鐘的步驟，再重復一次。
然后用玻璃針筒小心吸出各試管下面的苯酚相，剩下中間層(混合的水-苯酚)和上層(水)相在試管中。此時，將含有與合并的從試管中抽提的苯酚相體積比為10∶1的冷乙醇的燒瓶置于冰浴中。緩慢將苯酚相滴加到燒瓶中，一面充分攪拌。加入所有苯酚相后，繼續(xù)攪拌10-15分鐘，然后將混合物置于4℃的冰箱中，放置過夜，以形成C-多糖抗原沉淀。翌日，12,000rpm、4℃離心該混合物20分鐘。將產(chǎn)生的C-多糖抗原沉淀以每克濕細胞懸浮在0.4毫升水中，4℃對蒸餾水透析過夜，使用上述具有12,000-14,000截留分子量的Spetra/Por透析管。凍干得到的C-多糖抗原水溶液并稱重。用Lowry法評估其蛋白濃度；用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗在SDS-PAGE(12％凝膠)上檢查其成分并用ELISA檢查其C-多糖抗原活性。
該操作重復多次。發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌C-多糖抗原的總產(chǎn)量是每克肺炎鏈球菌R6菌株濕細胞1.2-1.4％，而其蛋白質(zhì)含量在約5-8％之間。
應注意的是，一般蛋白質(zhì)含量超過10％的C-多糖抗原制備物與蛋白質(zhì)含量少于10％的制備物相比，不能滿意的用于本發(fā)明。
實施例3一抗原BSA偶聯(lián)物的制備為了將純化的肺炎鏈球菌菌株R6的C-多糖抗原和層析柱偶聯(lián)，以親和純化兔抗-肺炎鏈球菌菌株R6的抗體，選擇了BSA-肼偶聯(lián)物。還可選擇和偶聯(lián)其它具有相似功能的已知物質(zhì)來執(zhí)行該偶聯(lián)功能。
如下制備了BSA-肼偶聯(lián)物將從Aldrich Chemical Co.獲得的二鹽酸肼溶解在水中，得到0.5M溶液。用無水NaOH將pH調(diào)節(jié)到5.2，加入Sigma Chemical Co.的無水牛血清白蛋白(“BSA”)，產(chǎn)生最終濃度為每毫升溶液25毫克BSA。BSA完全溶解后，加入一定量的N-(二甲基氨基丙基)-N1-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(購自Fluka Chmical Co.)，產(chǎn)生最終濃度為每毫升2.5毫克的溶液。室溫培育該反應混合物，持續(xù)攪拌過夜。翌日，4℃對蒸餾水充分透析。在Beckman DU640分光光度計上在280納米處測量偶聯(lián)物濃度(作為BSA濃度)。
為了將該偶聯(lián)物與肺炎鏈球菌菌株R6C-多糖抗原偶聯(lián)，程序如下將該抗原的無水制備物溶于蒸餾水，其量為每毫升1.1毫克。用稀HCl將溶液pH調(diào)節(jié)到5.0-6.0。用稀HCl處理濃度為23毫克/毫升的BSA肼偶聯(lián)物水溶液，將其pH調(diào)到4.0和5.0之間，然后將該溶液以體積比為約1∶6.65(重量比約3∶1)緩慢加到抗原溶液中。攪拌3分鐘后，將溶于100-200毫升蒸餾水的N-(二甲基氨基丙基)-N1-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(購自Fluka Chemical Co.)加到該反應混合物中，N-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與C-多糖抗原的重量比是約1-1.92。
室溫攪拌2小時后，用稀NaOH將得到的混合液pH調(diào)節(jié)到約9.0。繼續(xù)在室溫下攪拌該培養(yǎng)物1小時，然后4℃過夜。
實施例4-親和柱制備和抗體純化在實施例3的配體溶液中，加入稀HCl使其pH至7.0。選擇Isco Inc.的FormylSpherilose作為免疫吸附凝膠的基質(zhì)。用已知程序，如“Spherilose應用”，ISCO應用簡報78,28-35頁所述的，將C-多糖抗原的配體和該基質(zhì)偶聯(lián)。可用其它已知基質(zhì)和偶聯(lián)程序代替。
將凝膠填裝入柱，并用蒸餾水、0.2M pH2.5的甘氨酸-HCl溶液、3倍離子強度的pH7.2磷酸緩沖鹽水和常規(guī)強度的pH7.2 PBS洗滌，每種溶液用5-10凝膠柱體積。
然后用得到的活化柱親和純化抗體，從而產(chǎn)生了抗原特異性抗體，如下將針對熱殺死全細胞的肺炎鏈球菌菌株R6(ATCC號39938)的兔抗血清與無水NaCl混合，使NaCl最終濃度為0.5M,8,500rpm離心該混合物20分鐘，將上清液濾過棉花。將濾液加到親和柱上。用三倍強度的pH7.2磷酸緩沖鹽水和常規(guī)強度的pH7.2的磷酸緩沖鹽水從柱上洗滌除去未結合的成分。用0.2M pH2.5甘氨酸-HCl緩沖液從柱上洗脫出抗體。在Beckman分光光度計上280納米處監(jiān)測洗脫液，將含有抗體的組分合并在置于冰浴中的燒瓶內(nèi)。用pH9.0、0.5M NaH2PO4水溶液中和合并的組分。
在分光光度計上，用280納米處的吸光度值評估抗體的濃度。
對pH7.2的PBS透析抗體溶液，在從Amicon獲得的PM-10濾膜上濃縮，直到達到0.8-1.5mg/ml的抗體濃度。
發(fā)現(xiàn)從如此處理的每25毫升肺炎鏈球菌菌株R6的兔抗血清中可回收18-20毫克親和純化的抗體。
如在下一個實施例中所述，在肺炎鏈球菌C-多糖抗原特異性的ICT試驗中采用了這些親和純化的抗體。
實施例5-ICT置及其制備A．試驗裝置的制備如圖1所示，制備了一試驗裝置，它含有一裝有鉸鏈的紙板箱，箱上有一窗口，可同時觀察試驗結果和對照結果。該裝置有一凹槽，在槽中置有預制的塑料拭子孔，用于接受右側沾有樣品的拭子(在圖中標為1)。然后將圖1A中所示的外貼條貼在該裝置的整個右側。該外貼條上有兩個孔一下方的孔(在圖1A中標為B)中將插入飽和的拭子，而上方的(在圖1A中標為B)孔可將插入孔B的拭子推到該孔(A)中。外貼條和它的孔A和B的位置，和拭子孔共同操作，在試驗過程中可將拭子固定在恰當位置，并促進吸附的液體從拭子上排出。
如下所述，將一預裝配的測試條(圖1中標為C)插入凹槽(圖1中標為2)，并通過與凹槽底部粘合而固定。將圖1B中所示的外貼條置于左手側頂部。它上面有一個孔(圖1B中標為D)，當該裝置關閉進行試驗時孔D和右側的孔A相匹配。
將裝配好的該裝置保存于密封的、裝有干燥劑的袋中，直到使用。在密封和儲藏前，將一條略帶粘性的膠帶置于該裝置右半邊的外緣上。
B．測試條的構建和制備圖1C顯示了預裝配條的構建。它由一塊吸收材料的偶聯(lián)物紙墊構成，其中浸潤了金顆粒和如上所述的抗原特異性家兔抗-肺炎鏈球菌C-多糖抗原抗體的偶聯(lián)物。一塊橋梁紙墊Ahlstrom1281(未顯示)將該偶聯(lián)物紙墊和硝酸紙墊連接，它上面有一條與該偶聯(lián)物反應的樣品捕獲線，它是通過嵌入如上所述制備的一條抗原特異性的家兔抗-肺炎鏈球菌C-多糖抗原的抗體條建立的。硝酸纖維素紙墊還有一條下游對照線，通過用山羊抗-家兔免疫球蛋白(IgG)在板上劃線建立。沿著硝酸纖維素紙墊，該條帶終止于吸收紙墊，吸收紙墊起到液體貯器的作用。所有這些紙墊背面都用黏膠帶固定并置于裝置中。
偶聯(lián)物紙墊常用無紡聚酯或擠壓乙酸纖維素酯制備。為了制備用于該試驗的紙墊，將50納米直徑的金顆粒與如上所述制備的親和純化的家兔抗-肺炎鏈球菌C-多糖抗體偶聯(lián)。用已知的，如DeMay于Polak,J.M.和VanNorden,S.(編)，免疫化學現(xiàn)代方法和應用(Wright,bristol,England,1986)所述的方法實現(xiàn)了該偶聯(lián)。將偶聯(lián)金顆粒與干燥劑混合，該干燥劑由含有1.0％BSA、0.1％Triton X-100、2.0％Tween 20、6.0％蔗糖和0.02％疊氮化鈉的，pH8.0的5mM四硼酸鈉水溶液構成。對紙墊充分加熱，除去所有存在的液體，并儲藏在低濕度環(huán)境中，直到裝配測試條。這些紙墊及其處理是特別選定的，從而使紙墊能保持住干燥的偶聯(lián)物，并僅在隨后被樣品浸濕時才釋放它。
首先將一紙條親和純化的家兔抗-肺炎鏈球菌C-多糖抗體(用磷酸緩沖鹽水作載體溶液)嵌入硝酸纖維素紙墊的第一部分。這些抗體作為捕獲線。在裝配好的測試裝置第一部分的下游，紙墊的第二部分中，用溶于同一載體溶液的山羊抗一家兔IgG在該紙墊表面劃線，建立對照線。然后18-25℃干燥硝酸纖維素紙墊，以促使蛋白質(zhì)劃線條被紙墊永久吸收。
所用的吸水紙墊是可商品購得的以商品名Ahlstrom 939出售的纖維素材料。該紙墊不需要特殊處理。
C．試劑盒制備如商品所售，裝配含有做好的測試條的該試驗裝置。在實施中，許多裝置和同等數(shù)量的拭子包裝在一起，這些拭子采用纖維狀Dacron，以及一瓶“試劑A”，裝試劑A的該瓶子有一適合滴加試劑A的瓶蓋。“試劑A”是2.0％Tween20,0.05％疊氮化鈉和0.5％十二烷基磺酸鈉的0.05MpH6.5檸檬酸鈉-磷酸鈉緩沖液的溶液。在各試劑盒中還包括了陽性和陰性對照。
實施例6-進行ICT試驗在實施中，將各裝置配備的拭子浸入液體樣品中，完全浸沒拭子頭。拭子的用途是作為液體生物學樣品，如尿、血液、淋巴液等，和環(huán)境學液體樣品中存在的不溶解固體、半固體和膠體的過濾器，在Norman Moore和Vincent Sy,1998年3月19日提交的待批申請?zhí)?9/044,677(隨后被轉(zhuǎn)讓給Binax,Inc.)的內(nèi)容中有所描述。將拭子插入該裝置底部的孔(圖1A的孔B)，并輕輕向上推，使拭子尖端在頂部孔(圖1A的孔A)中可見。將試劑A小管垂直倒置于孔B上方，緩慢滴加3滴試劑A。然后立即剝離該裝置右側邊緣的粘性帶，關閉該裝置，安全密封，從而將拭子孔中的拭子推入正對金偶聯(lián)物紙墊的拭子孔。15分鐘后，可在該裝置窗口讀到結果。陰性樣品-即不含肺炎鏈球菌C-多糖抗原的樣品一將在窗口上半部只顯示對照線。含有靶抗原的陽性樣品將顯示兩條線，下面的一條是病人(或樣品)線；甚至一條微弱的樣品線也表明樣品中存在的靶抗原。如果15分鐘后在窗口中還未出現(xiàn)任何線條，或僅在窗口下半部出現(xiàn)樣品線，則該試驗是無效的，必須重做。
使用上述程序，在前述ICT程序中以實施例5所述制備的裝置對146個來自疾病控制中心的病人尿樣測試。由于與肺炎鏈球菌感染有關的病人診斷是根據(jù)各種不同指標，包括血培養(yǎng)、革蘭氏染色、痰培養(yǎng)、自溶酶PCR和肺炎球菌自溶酶PCR，但沒有尿試驗結果，在我們的實驗室中每個樣品都用本文所述的ICT和ELISA測試了肺炎鏈球菌C-多糖抗原的存在。
進行ICT和ELISA試驗的人員未被告知疾病控制中心對這些尿樣是從診斷為肺炎鏈球菌感染陽性還是從陰性的病人中得到的。發(fā)現(xiàn)ICT和ELISA的結果在最低的程度上，在134個例子中靈敏度和特異性是基本相當?shù)?。然而要注意，某些例子中ELISA和ICT試驗的結果都和疾病控制中心提供的病人診斷不完全一致。據(jù)信，本領域認為這種培養(yǎng)結果的評價不足以作為診斷肺炎鏈球菌感染的基礎，并且不能提供任何關于給予病人何種藥物治療的信息、或不能提供相對于采集尿樣時間的開始治療的時間信息，這阻礙了對所有結果進行有意義的完全比較。
在134例中ICT和ELISA結果基本可比，從而肯定了本發(fā)明的15分鐘ICT試驗可提供對肺炎鏈球菌引起的感染的快速診斷和隨之早期制定最有效的病人治療方案的優(yōu)點。
實施例7-臨床試驗用實施例5所述制備的裝置，和實施例6第一段所述的ICT程序，在3個地點用特征明確的標本庫進行了臨床研究。包括住院和門診病人的273份尿樣品。在273個病人中，35個得出血培養(yǎng)陽性結果，238個得出血培養(yǎng)陰性結果(應注意的是，培養(yǎng)方法常常隨地方變化有很大的不同)。推測血培養(yǎng)陽性的病人尿樣是在采集血樣并開始施用抗生素24小時內(nèi)收集的。在血培養(yǎng)試驗陰性的238個病人的尿樣中，28個是從菌血癥病人收集的，4個是從膿胸病人收集的，53個是從肺炎病人收集的，而153是從患有尿道感染的病人收集的。
另外，在本發(fā)明與實施例5制備的裝置和實施例6所述ICT程序的試驗中，從患有未知感染的個人中收集了100個尿樣。這些人的血樣培養(yǎng)試驗陰性。
在血培養(yǎng)試驗中測試肺炎鏈球菌陽性的35個病人尿中，30個本發(fā)明試驗結果陽性，5個結果陰性。在病人的338個尿樣品中，血培養(yǎng)試驗均為陰性，100個被假定為陰性；在本發(fā)明試驗中21個陽性，317個測試陰性。計算出ICT試驗的靈敏度為86％，特異性是94％，準確率是93％。
應注意的是，尿肺炎鏈球菌ICT測試陽性，和血培養(yǎng)肺炎鏈球菌呈陰性結果的病人中，用其它試驗確定，患有尿道感染的病人中，5人有大腸桿菌感染，2人有陰溝腸桿菌感染，3人有乳桿菌感染，1人有斯氏普羅威登斯菌(Povidencia Stuartii)感染，1人有金黃色葡萄球菌感染，1人有鏈球菌(非甲非乙)感染，1人有鏈球菌(非丁)感染?；挤窝椎膬扇艘灿薪Y核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)感染，1人有堪薩斯分枝桿菌(Mycobacteriumkansasii)感染。1位菌血癥病人也有奇異變形菌(Proteus mirabilis)感染。4位未知感染的病人尿樣用本發(fā)明的ICT試驗測試為陽性。
實施例8-臨床試驗在7家醫(yī)院進行了試驗，6家在美國，1家在西班牙，評估了215位住院和出院病人(患有下呼吸道癥狀和敗血癥癥狀之一，或懷疑攜帶肺炎球菌)的尿樣。在這些試驗中，在實施例6的程序中使用了根據(jù)實施例5制備的裝置，將結果和對同一病人的血樣進行的血培養(yǎng)結果比較。未進行確定培養(yǎng)方法在參與的醫(yī)院之間的一致性。
血培養(yǎng)評估結果肺炎鏈球菌31個陽性和184個陰性。在31個血培養(yǎng)陽性的病人中，對尿樣進行本發(fā)明的ICT試驗顯示28個陽性和3個陰性。對于184個血培養(yǎng)結果陰性的病人，45個尿樣本發(fā)明ICT試驗為陽性，而139個病人尿樣測試為陰性。該測試中本發(fā)明試驗的靈敏度計算為90％，特異性為76％，準確率為78％。
必須結合與培養(yǎng)試驗有關的公知問題，以及約80％肺炎球菌感染病人不產(chǎn)生含有肺炎鏈球菌的血樣的可能性，來考慮實施例7和實施例8中本發(fā)明的ICT試驗獲得的結果。相信用本發(fā)明的試驗作進一步實驗，將令人可信的證明其特異性、靈敏度和準確率在實施例7和8中被低估了，因為使用了血培養(yǎng)實驗作為比較。
實施例9-進一步的交叉反應性試驗使用實施例5制備的裝置和實施例6的程序，測試了濃度為106-109CFU/ml的144種細菌。測試的各細菌在合適的瓊脂上生長，并在37℃,5％CO2培育過夜，檢查平板的純度，選擇良好分離的菌落用于測試。
在144種細菌中，僅一種一緩癥鏈球菌ATCC#49456，得出了陽性結果，從而是交叉反應性的。這是如上文預期的，因為已知緩癥鏈球菌含有本發(fā)明的試驗設計要檢測的C-多糖細胞壁抗原。
下列每種細菌都獲得了本發(fā)明試驗的陰性結果無硝不動桿菌(Acinetobacter anitratus)(ATCC#49136)，鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbaumanii)(ATCC#1906-T)，乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)(ATCC No.49466)，溶血不動桿菌(Acinetobacterhaemolyticus)(ATCC#19002)，腺病毒2和3(從疾病控制中心獲得的合并純培養(yǎng)樣品)，糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)(ATCC#6633)，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)(ATCC#3467)，粘膜炎布蘭漢氏球菌(Branhamella catarrhalis)(ATCC#25238-T)，皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)(從疾病控制中心獲得的純培養(yǎng)物，菌株號未知)，白色念珠菌(Candida albicans)(ATCC#e10231,14053和60193，每種分別測試)，類星形念珠菌(Candida stellatoides)(ATCC#11006)，弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreudii)(ATCC#375GT)，粗球孢子菌(Coccidiodes immitis)(疾病控制中心獲得的純培養(yǎng)物，菌株號未知)，庫氏棒桿菌(Corynebacteriumkutscheri)(ATCC#15677-T)，馬氏棒桿菌(Corynebacteriummatruchotii)(ATCC#14266-T)，假白喉棒桿菌(Corynebacteriumpseudodipheriticum)(ATCC#10700-T)，陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)(ATCC#1304-T,23355,35030和49141，每種分別測試)，鳥腸球菌(Enterococcus avium)(ATCC No.49462)，耐久腸球菌(Enterococcusdurans)(ATCC#49135)，屎腸球菌(Enterococcus faecalis)(ATCC#19433-T,29212,49477,49478,49149和51299，每種分別測試)，大腸桿菌(Escherichiacoli)(ATCC#23513,8739,23514,25922,35218,1173GT,35421和15669和一種未編號的樣本，各分別測試)，赫氏埃希氏菌(Escherichiahermannii)(ATCC#33650-T和4648GT，各分別測試)，吲哚金黃桿菌(Flavobacterium indologenes)(ATCC#49471)，腦膜炎金黃桿菌(Flavobacterium meningosepticum)(ATCC#49470)，陰道加德納氏菌(Gardnerella vaginalis)(ATCC#14018-T)流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)(ATCC#9006)，流感嗜血菌b(Haemophilus influenzae,b)(ATCC#9795和33533，每種分別測試)，流感嗜血菌c(ATCC#9007)，流感嗜血菌d(ATCC#9008)，流感嗜血菌e(ATCC#8142)，流感嗜血菌f(ATCC#9833)，流感嗜血菌NT(ATCC#49144,49247和49766，每種分別測試)，副流感嗜血菌(ATCC#3339Z-T，從疾病控制中心作為純培養(yǎng)物獲得)，莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capulatum)(從疾病控制中心獲得的兩種分離的純培養(yǎng)物，每種分別測試)，產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(ATCC#43086和49131,每種分別測試)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(ATCC#13882,13883-T和49472，每種分別測試)，嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)(ATCC#4356)，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)(ATCC#393)，加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)(ATCC#33323)，詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii)(ATCC#25258)，侵肺軍團菌(Leginellapneumophila)(ATCC#33152)，單核細胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenens)(ATCC#7644)，藤黃微球菌(Micrococcus luteus)(ATCC#9341和49732，各分別測試)，奧斯陸莫拉氏菌(Moraxella osloensis)(ATCC#15276)，摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)(ATCC#25830-T)，生殖道枝原體(Mycoplasma genitalium)(ATCC#33530，從疾病控制中心作為純培養(yǎng)物獲得)，人型枝原體(Mycoplasma hominis)(ATCC#27545，從疾病控制中心作為純培養(yǎng)物獲得)(Mycoplasma pneumoniase)(FH2型，從疾病控制中心作為純培養(yǎng)物獲得)灰色奈瑟氏菌(Neisseria cinerea)(ATCC#14685)，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrheae)(ATCC#8660,19424-T和27631，各分別測試)，乳糖奈瑟氏菌(Neisseria lactamica)(ATCC#23970-T)，腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)(ATCC#13077-T)，微黃奈瑟氏菌(Neisseriasubflava)(ATCC#49275)，皮諾卡氏菌(Nocardia farcinia)(從疾病控制中心作為純培養(yǎng)物獲得)，巴西副球孢子菌(Paracoccidiodes brasiliensis)(菌株#未知，從疾病控制中心作為純培養(yǎng)物獲得)副流感1型(菌株C39，從疾病控制中心作為純培養(yǎng)物獲得)，副流感2型(菌株號A47885，從疾病控制中心作為純培養(yǎng)物獲得)，奇異變形菌(Proteus mirabilis)(ATCC#7002和12453，各分別測試)，普通變形菌(Proteus vulgaris)(ATCC#13315-T和49132，各分別測試)，斯氏普羅威登斯菌(Providencia stuartii)(ATCC#49809)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC#15442和27853，各分別測試)，洋蔥伯克霍爾德氏菌(Pseudomonas cepacia)(ATCC#25416-T)，皮氏伯克霍爾德氏菌(Pseudomonas pickettii)(ATCC#49129)，惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)(ATCC#49128)，腐敗假單胞菌(Pseudomonas putrefaciens)(ATCC#49138)，施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)(ATCC#17588-T)，合并的呼吸道合胞病毒(病毒株A2和ATCC#18573的合并樣本，從疾病控制中心作為純培養(yǎng)物獲得)，鼻病毒(ATCC#088和077，各從疾病控制中心作為純培養(yǎng)物獲得，各分別測試)，古巴沙門氏菌(Salmonella cubana)(ATCC#12007)，腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)(ATCC#13076-T)，甲型副傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi A)(ATCC#9150)，傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)(ATCC#6539)，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)(ATCC#13880-T)，多食鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium multivorum)(ATCC#35656)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC#12598,6538P,25923,29213,43300和49476，各分別測試)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(ATCC#12228,14990-T,49134和49461，各分別測試)，溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)(ATCC#29970-T)，腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)(ATCC#15305-T和49907，各分別測試)，木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosis)(ATCC#49148)，嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC#13637-T)，咽峽炎鏈球菌(Streptococcus anginosus)(ATCC#9895)，牛鏈球菌(Streptococcusbovis)(ATCC#49133)，甲型鏈球菌(ATCC#1357和19615，各分別測試)，乙型鏈球菌(ATCC#13813-T,12386,12400,12401,27591,12973,12403和31475，各分別測試)，丙型鏈球菌(ATCC#12388)，己型鏈球菌(ATCC#12392)，戊型鏈球菌(ATCC#12394)，變異鏈球菌(Streptolococcus mutans)(Shockman株)，副血鏈球菌(Streptococcus parasanguis)(ATCC#15909)，血鏈球菌(Streptococcus sanguis)(ATCC#10556-T)，陰道毛單胞菌(Trichomonasvaginalis)(ATCC#085和520，各分別從疾病控制中心作為純培養(yǎng)物獲得，并分別測試)。
實施例10-對健康和患病兒童的臨床實驗正在進行對健康和患病兒童的臨床實驗，至今尚未完成。初期的各地結果顯示，使用如實施例6中所述制備的裝置，并根據(jù)實施例7中所述程序，在3個診斷患有鼻竇炎的兒童中，2個的尿中檢測到了肺炎鏈球菌。相信，另一鼻竇炎病例(其中該兒童的尿測試為陰性)可能涉及一種不同的病原體。
在同樣的實驗中，用本發(fā)明的裝置和方法在具有明顯腦膜炎癥狀的兒童的腦脊髓液中檢測到了肺炎鏈球菌，使該兒童能得到迅速有效的治療處理。
實施例11-在腦膜炎病人的尿中檢測肺炎鏈球菌抗原讓兩個具有明顯腦膜炎臨床癥狀的病人住院。一個在入院前接受過抗菌藥治療，另一個沒有。從各人獲得腦脊髓液，并進行培養(yǎng)實驗。實驗結果是陰性的，血培養(yǎng)結果也一樣。
作為最后的診斷方法，在實施例6所述的程序中對從各病人獲得的尿樣使用了根據(jù)實施例5制備的裝置。在每一例中，尿樣測定肺炎鏈球菌C-多糖細胞壁抗原呈陽性。
這些初步結果強烈提示，可常規(guī)利用尿樣而不是腦脊髓液來測試肺炎鏈球菌引起的腦膜炎。如果進一步臨床實驗肯定了尿能夠代替腦脊髓液作為測試基質(zhì)，將對病人和醫(yī)務人員都有很大的好處。脊髓抽液(通過它獲得腦脊髓液)對病人來說是痛苦的，而且某種程度上還有危險。對于醫(yī)務工作者，脊髓抽液耗時而且要求對細節(jié)都集中注意力。
通常免疫化學領域的技術人員，尤其是從事免疫試驗的技術人員，將會知道有時其它材料、成分、其它程序步驟也可輕易的代替本文中具體推薦的那些。大量專利和非專利的文獻討論了可靠的一次性使用的免疫試驗測試裝置的設計和使用，該裝置可代替本文描述和推薦的優(yōu)選ICT裝置。不應將本發(fā)明局限于可替換試驗裝置、材料、成分或方法步驟，除非是權利要求限制的那些。
權利要求
1．一種從肺炎鏈球菌獲得蛋白質(zhì)低于10％的細胞壁C-多糖抗原的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)細菌一段必需的時間，以獲得所需量的樣品，并從中收集濕細胞沉淀形式的細菌細胞；(b)將濕細胞沉淀懸浮在堿性溶液中并混合；(c)用強酸將pH調(diào)節(jié)到酸性pH并離心；(d)分離步驟(d)的上清液，并將所述上清液pH調(diào)到大約中性；(e)用廣譜蛋白酶制備物消化上述產(chǎn)物，以破壞剩余蛋白質(zhì)；(f)用弱堿水溶液將pH調(diào)到堿性一側；(g)在用弱堿溶液平衡的分子排阻柱上分離出基本無蛋白的糖或多糖抗原；和(h)合并第一峰中洗脫出的物質(zhì)，將其pH調(diào)到約中性。
2．用權利要求1所述的方法獲得的，蛋白質(zhì)含量低于10％的細胞壁C-多糖抗原。
3．如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)的堿溶液含有每克所述濕細胞沉淀約20毫升0.1M氫氧化鈉水溶液。
4．如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中，將pH調(diào)到約3.0。
5．如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(f)中將pH調(diào)到約10-11之間。
6．如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(h)后，進行凍干步驟。
7．一種純化抗肺炎鏈球菌粗抗體的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)從肺炎鏈球菌分離出含蛋白質(zhì)低于10％的細胞壁C-多糖抗原；(b)將所述抗原和一種有兩端的間隔分子的一端偶聯(lián)，形成所述抗原和間隔分子的偶聯(lián)物；(c)將所述偶聯(lián)物與活化的層析柱偶聯(lián)；(d)在步驟(c)所述的柱上親和層析所述粗抗體，獲得純化的抗原特異性抗體；(e)從所述柱上洗脫純化的抗原特異性抗體。
8．用權利要求7所述的方法獲得的，針對肺炎鏈球菌細胞壁C-多糖抗原的抗原-特異性純化抗體。
9．一種用于親和純化肺炎鏈球菌粗抗體的層析柱，其特征在于，該柱通過一間隔分子偶聯(lián)了含蛋白質(zhì)低于10％的肺炎鏈球菌純化的C-多糖細胞壁抗原。
10．一種檢測液體中肺炎鏈球菌或其細胞壁C-多糖抗原存在的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)從肺炎鏈球菌細菌培養(yǎng)物中抽提出其含蛋白質(zhì)低于10％的細胞壁C-多糖抗原，(b)將所述抗原與一間隔分子偶聯(lián)，形成偶聯(lián)物，(c)將步驟(b)的偶聯(lián)物與層析親和柱偶聯(lián)，(d)用步驟(c)的層析親和柱純化肺炎鏈球菌的粗抗體，以產(chǎn)生純化的抗原-特異性抗體；和(e)用步驟(d)純化的抗體檢測液體中存在不存在肺炎鏈球菌或其C-多糖細胞壁抗原。
11．如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)的間隔分子是一蛋白質(zhì)分子。
12．如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)的間隔分子是肼和牛血清白蛋白的偶聯(lián)物。
13．如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述步驟(e)的液體是哺乳動物的天然液體。
14．如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述液體是人尿。
15．如權利要求13所述的方法，其特征在于，從顯示有肺炎類疾病的臨床癥狀的病人獲得所述液體。
16．如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述步驟(e)是免疫試驗過程。
17．如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述步驟(e)是免疫層析試驗過程。
18．如權利要求17所述的方法，其特征在于，將步驟(d)的純化的抗原特異性抗體的一部分和標記試劑偶聯(lián)，已知當所述抗體與對應的抗原反應時，該標記試劑顯示可見的顏色。
19．如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述標記試劑是極細的金屬顆粒金。
20．一種檢測肺炎鏈球菌或所述細菌的C-多糖細胞壁抗原的免疫層析試驗方法，其特征在于，該方法包括(a)使懷疑含有所述細菌或它們的抗原的液體樣品和含有一條濾紙材料的免疫層析試驗裝置接觸，該紙條具有(ⅰ)第一區(qū)帶，該區(qū)帶中充滿了以下二種物質(zhì)的偶聯(lián)物(1)一種標記試劑，它在抗體和它們相應的抗原性結合伙伴反應時，顯示可見的顏色變化，和(2)肺炎鏈球菌C-多糖細胞壁抗原的純化的抗原特異性抗體，所述抗體己通過一親和層析柱純化，所述親和層析柱上偶聯(lián)有純化的、含蛋白質(zhì)低于10％的肺炎鏈球菌C-多糖細胞壁抗原，(ⅱ)第二區(qū)帶，它結合有同樣純化的，非偶聯(lián)形式的抗原特異性抗體，該區(qū)帶配有一窗口，用于觀察顏色變化，(b)使所述樣品從側面沿所述測試紙帶，流到所述第一區(qū)帶，(c)使所述樣品和所述抗原特異性抗體與標記的偶聯(lián)物一起，從側面沿所述測試紙條流到所述第二區(qū)帶，和(d)從步驟(a)開始在大約15分鐘內(nèi)，通過所述窗口觀察是否在所述第二區(qū)帶中出現(xiàn)一條色帶，從而表明在樣品中存在肺炎鏈球菌或其細胞壁C-多糖抗原。
21．如權利要求20所述的方法，其特征在于，懷疑含有肺炎鏈球菌或其C-多糖細胞壁抗原的液體是哺乳動物來源的天然液體。
22．如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物來源的天然液體是人尿。
23．如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物來源的天然液體是血或血清。
24．如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物來源的天然液體是腦脊髓液。
25．如權利要求22所述的方法，其特征在于，在抗體與它們的相應抗原性結合伙伴反應時，顯示可見的顏色變化的所述標記試劑是極細的金屬。
26．如權利要求25所述的方法，其特征在于，所述標記試劑是極細的金顆粒。
27．如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述標記試劑是極細的金顆粒，而所述液體是人血或血清。
28．如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述標記試劑是極細的金顆粒，而所述液體是人腦脊髓液。
29．如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述標記試劑是極細的金顆粒，而所述液體是人尿。
30．一種用于檢測肺炎鏈球菌或其C-多糖細胞壁抗原的免疫層析試驗裝置，其特征在于，該裝置包含一條濾紙材料條，該濾紙材料條具有(ⅰ)第一區(qū)帶，該區(qū)帶中充滿了以下二種物質(zhì)的偶聯(lián)物(1)一種標記試劑，它在抗體和它們相應的抗原性結合伙伴反應時，顯示可見的顏色變化，和(2)肺炎鏈球菌C-多糖細胞壁抗原的純化的抗原特異性抗體，所述抗體已通過一親和層析柱純化，所述親和層析柱上偶聯(lián)有純化的、含蛋白質(zhì)低于10％的肺炎鏈球菌C-多糖細胞壁抗原，(ⅱ)第二區(qū)帶，它結合有同樣純化的，非偶聯(lián)形式的抗原特異性抗體，該區(qū)帶配有一窗口，用于觀察顏色變化。
全文摘要
公開了一種從肺炎鏈球菌獲得含蛋白質(zhì)低于10%的C－多糖細胞壁抗原的方法。將如此獲得的抗原和一間隔臂分子偶聯(lián),然后將后者的自由端和層析親和柱偶聯(lián)。然后利用該柱純化肺炎鏈球菌的粗抗體,從而產(chǎn)生抗原特異性的抗體。將這些抗體的一部分和標記試劑偶聯(lián),當抗體和它們嵌入免疫層析試驗裝置第一區(qū)帶中的抗原結合伙伴反應時,標記試劑顯示可見的顏色變化。這些抗體的另一部分和該裝置的觀察窗反應區(qū)帶結合。當液體樣品,如病人尿、腦脊髓液或血液被加到第一區(qū)上時,抗體和標記試劑的偶聯(lián)物和樣品沿濾紙材料的流動條流到反應區(qū),如果樣品含有肺炎鏈球菌或其細胞壁抗原,則標記的偶聯(lián)物、抗原和結合的抗體中形成了夾心,觀察到顏色的變化。如此進行的免疫層析試驗在約15分鐘內(nèi)完成。該試驗可快速可靠的診斷各種肺炎鏈球菌引起的疾病狀態(tài),如肺炎、支氣管炎、中耳炎、鼻竇炎、腦膜炎和當該細菌引起的初次肺部感染持續(xù)3－5日不消除時常見的二級疾病狀態(tài)。
文檔編號C07K1/14GK1324247SQ9981104
公開日2001年11月28日 申請日期1999年9月20日 優(yōu)先權日1998年9月18日
發(fā)明者N·J·穆爾, M·K·芬頓, V·A·庫奇納, E·V·莫洛科夫 申請人:比南股份有限公司