肺炎鏈球菌抗原的含佐劑制劑的制作方法
【專利摘要】肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)疫苗的功效可通過肺炎鏈球菌糖抗原和/或蛋白質抗原佐以TLR激動劑(優(yōu)選TLR7激動劑)和不溶性金屬鹽(優(yōu)選鋁鹽)的混合物來得到增強。所述TLR激動劑通常吸附至所述金屬鹽。肺炎鏈球菌抗原也可吸附至所述金屬鹽。
【專利說明】肺炎鏈球菌抗原的含佐劑制劑
[0001] 本申請請求美國臨時申請61/607, 987和61/608,013(均于2012年3月7日提 交）的權益，這兩項申請的全部內容通過引用納入本文。

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明涉及有佐劑的來自肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae)的抗原（特 定蛋白質或糖抗原）以增加其免疫原性的領域。

【背景技術】
[0003] 現有肺炎球菌疫苗有兩種主要類型。對所有低于兩歲的幼兒給予肺炎球菌偶聯疫 苗（PCV)作為兒童疫苗接種計劃的部分，而對65歲或更年長的人和有高風險的人給予肺炎 球菌多糖疫苗（PPV)。一種7-價偶聯疫苗（PCV7，Prevnar，輝瑞公司（Pfizer))在2000年獲 得許可，并包含來自血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F的多糖，其為最常見的在北美幼兒中 引起侵入性肺炎疾病的血清型。PCV10(Synflorix,葛蘭素史克公司（GlaxoSmithKline)) 在2008/09于加拿大、澳大利亞和歐洲獲得使用許可，并包含PCV7血清型加血清型1、5和 7F。PCV13 (Prevnarl3,輝瑞公司）將血清型3、6A和19A添加至PCVlO血清型，并于2009 年在智利和歐洲獲得許可。PPV23(Pneumovax,默克公司（Merck))是多糖血清型1、2、3、4、 5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的 23 價制 劑。這些疫苗誘導針對包含在制劑中的特定肺炎球菌血清型的抗莢膜抗體，并且已顯示抵 御侵入性疾病（尤其是敗血癥和腦膜炎）的保護性。PPV23是無佐劑的，但所有偶聯疫苗包 括錯鹽佐劑。
[0004] 除了基于糖的那些組合物以外，包含肺炎鏈球菌（S. pneumoniae)蛋白質抗原的 疫苗是本領域已知的。參考文獻1和231描述了包含肺炎鏈球菌菌毛蛋白佐以鋁鹽佐劑的 保護性免疫原性組合物。
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供進一步的有佐劑免疫原性組合物以供針對肺炎鏈球菌的 保護，具體地，提供組合物，所述組合物優(yōu)于采用鋁鹽作為佐劑的那些。


【發(fā)明內容】

[0006] 發(fā)明人發(fā)現，肺炎鏈球菌疫苗的功效可通過肺炎鏈球菌抗原佐以TLR激動劑（優(yōu) 選TLR7激動劑，例如后文指出的化合物"K2")和不溶性金屬鹽（優(yōu)選鋁鹽）的混合物來得 到增強。所述TLR激動劑通常吸附至所述金屬鹽，如參考文獻2中公開的那樣。肺炎鏈球 菌抗原也可吸附至所述金屬鹽。在一些實施方式中，所述肺炎鏈球菌抗原是肺炎鏈球菌糖 抗原；在其它實施方式中，所述肺炎鏈球菌抗原是肺炎鏈球菌蛋白質抗原。
[0007] 第一方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i)TLR 激動劑、（ii)不溶性金屬鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原，其中所述TLR激動劑 是人TLR7的激動劑。
[0008] 第二方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i)TLR 激動劑、（ii)不溶性金屬鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原，其中所述不溶性金屬 鹽是鋁鹽。
[0009] 第三方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i)TLR 激動劑、（ii)不溶性金屬鹽、（iii)緩沖劑和（iv) -種或多種肺炎鏈球菌糖抗原。
[0010] 第四方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i)TLR 激動劑、（ii)不溶性金屬鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原，其中所述組合物的pH 是6?8,優(yōu)選是6?7。
[0011] 第五方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i)TLR 激動劑，（ii)不溶性金屬鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原，其中所述一種或多種 肺炎鏈球菌糖抗原中的至少一種偶聯至CRM197,并且任選地其中所述組合物不包含白喉類 毒素、破傷風類毒素和百日咳類毒素。
[0012] 第六方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i)TLR 激動劑，（ii)不溶性金屬鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原，所述肺炎鏈球菌糖抗 原選自2?10種不同血清型，或12種或更多種不同血清型；并且可任選地，其中所述組合 物不包含白喉類毒素、破傷風類毒素和百日咳類毒素。
[0013] 第七方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i)TLR 激動劑，（ii)不溶性金屬鹽，和（iii)來自恰好11種不同血清型的肺炎鏈球菌糖抗原，限 制條件是所述11種不同血清型不是血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F。
[0014] 第八方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i)TLR 激動劑，（ii)不溶性金屬鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原，其中所述一種或多種 肺炎鏈球菌糖抗原中的至少一種直接偶聯至載體，優(yōu)選通過還原性胺化反應偶聯。
[0015] 第九方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i)TLR 激動劑，（ii)不溶性金屬鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原，其中所述一種或多種 肺炎鏈球菌糖抗原中的至少一種通過接頭（linker)偶聯至載體。
[0016] 第十方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含：（i)氫 氧化鋁佐劑；（ii)式（K)的TLR7激動劑；（iii)來自血清型1、5、6B、14和23F的肺炎鏈球 菌糖抗原，其中各糖偶聯至CRM197 ;其中所述TLR7激動劑和/或至少一種所述糖吸附至所 述氫氧化鋁佐劑。
[0017] 第^^一方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含：（i) 氫氧化鋁佐劑；（ii)式（K)的TLR7激動劑；（iii)僅來自血清型5的肺炎鏈球菌糖抗原，其 偶聯至CRM197 ;其中所述TLR7激動劑和/或至少一種所述糖吸附至所述氫氧化鋁佐劑。
[0018] 第十二方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含：(a) 包含吸附至不溶性金屬鹽的第一 TLR激動劑的佐劑復合物；(b)包含吸附至不溶性金屬鹽 的第二TLR激動劑的佐劑復合物；和（c)至少一種肺炎鏈球菌糖抗原，其中所述糖抗原優(yōu)選 吸附至所述金屬鹽。
[0019] 第十三方面中，本發(fā)明提供一種用于制備免疫原性組合物的方法，其中所述方法 包括：使TLR激動劑、不溶性金屬鹽和一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原混合。
[0020] 第十四方面中，本發(fā)明提供一種用于制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括 以下步驟之一 ：（i)將肺炎鏈球菌糖抗原和包含TLR激動劑與不溶性金屬鹽的混合物合并； (ii)將不溶性金屬鹽和包含TLR激動劑與肺炎鏈球菌糖抗原的混合物合并；或（iii)將 TLR激動劑和包含不溶性金屬鹽與肺炎鏈球菌糖抗原的混合物合并。
[0021] 第十五方面中，本發(fā)明提供一種用于制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括 如下步驟（i)制備TLR激動劑和可溶性鋁鹽的水性混合物；然后（ii)向該水性混合物添加 非鋁鹽以形成沉淀的鋁鹽，其吸附有TLR激動劑；和（iii)在步驟（i)、步驟（ii)和/或第 三步驟中添加一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原。本發(fā)明還提供通過該方法獲得的或可通過該 方法獲得的免疫原性組合物。
[0022] 第十六方面中，本發(fā)明提供一種制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括如下 步驟：混合（i)TLR激動劑和可溶性鋁鹽的水性混合物和（ii)肺炎鏈球菌糖免疫原的帶緩 沖水性混合物，其中，所述混合步驟導致吸附有所述TLR激動劑和所述免疫原的鋁鹽沉淀。 本發(fā)明還提供通過該方法獲得的或可通過該方法獲得的免疫原性組合物。
[0023] 第十七方面中，本發(fā)明提供一種用于制備無菌免疫原性組合物的方法，所述方法 包括如下步驟：合并（i)肺炎鏈球菌糖免疫原，和（ii)TLR激動劑和不溶性金屬鹽的無菌復 合物。該方法可包括例如如下步驟：(a)使TLR激動劑和不溶性金屬鹽混合，從而所述TLR 激動劑吸附至所述不溶性金屬鹽以形成所述復合物；和（b)對該復合物滅菌?；蛘?，該方 法可包括例如如下步驟：(a)對TLR激動劑的溶液或懸浮液滅菌，和（b)將所述滅菌的溶液 或懸浮液與無菌的不溶性金屬鹽合并；或通過如下步驟制備：(a)對不溶性金屬鹽滅菌，和 (b)將所述滅菌的不溶性金屬鹽和TLR激動劑的無菌溶液或懸浮液合并；或通過如下步驟 制備：合并（a) TLR激動劑的無菌溶液或懸浮液和（b)無菌不溶性金屬鹽。對所述TLR激動 劑溶液/懸液的滅菌可通過無菌過濾來實現。所述不溶性金屬鹽的滅菌可通過高壓滅菌來 完成。
[0024] 第十八方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑、（ii)不溶性金屬鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌蛋白質抗原，其中所述TLR 激動劑是人TLR7的激動劑。
[0025] 第十九方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑、（ii)不溶性金屬鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌蛋白質抗原，其中所述不 溶性金屬鹽是鋁鹽。
[0026] 第二十方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑、（ii)不溶性金屬鹽、（iii)緩沖劑和（iv) -種或多種肺炎鏈球菌蛋白質抗原。
[0027] 第二^^一方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑、（ii)不溶性金屬鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌蛋白質抗原，其中所述組 合物的pH是6?8,優(yōu)選是6?7。
[0028] 第二十二方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR7激動劑、（ii)不溶性金屬鹽，和（iii)如下至少兩種：
[0029] (a)包含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包含的氨基酸序 列⑴與SEQ ID NO:236有至少90%序列相同性，和/或（ii)由來自SEQ ID NO:236的至 少7個連續(xù)氨基酸的片段組成；
[0030] (b)包含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包含的氨基酸序 列⑴與SEQ ID NO:237有至少90%序列相同性，和/或（ii)由來自SEQ ID NO:237的至 少7個連續(xù)氨基酸的片段組成；和/或
[0031] (c)包含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包含的氨基酸序 列⑴與SEQ ID NO:238有至少90%序列相同性，和/或（ii)由來自SEQ ID NO:238的至 少7個連續(xù)氨基酸的片段組成；
[0032] 第二十三方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑、（ii)不溶性金屬鹽，和（iii)包含如下氨基酸序列的多肽：
[0033] A-(-X-L-In-B
[0034] 其中：各X是如第二十二方面中定義的第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸 序列；L是任選接頭氨基酸序列；A是任選N末端氨基酸序列；B是任選C末端氨基酸序列； η是2或更大的整數。
[0035] 第二十四方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含 (i) TLR激動劑、（ii)不溶性金屬鹽，和（iii)包含如下氨基酸序列的蛋白質抗原：SEQ ID N0:246、248、250、252、254 或 256。
[0036] 第二十五方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑、（ii)不溶性金屬鹽，和（iii)包含SEQ ID NO:318的氨基酸序列的多肽。
[0037] 第二十六方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含 (i)TLR7激動劑、（ii)不溶性金屬鹽，和（iii)包含如下組成的免疫原性組合物：(a)包 含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包含或由如下序列組成：SEQ ID NO: 335,或與SEQ ID NO: 335具有至少80%序列相同性的氨基酸序列，或與SEQ ID NO: 335 競爭結合針對SEQ ID NO:335產生的抗體的氨基酸序列，或SEQ ID NO:335的至少7個氨 基酸的片段；和/或（b)包含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包含或 由如下序列組成：SEQ ID N0:336,或與SEQ ID N0:336具有至少80%序列相同性的氨基酸 序列，或與SEQ ID NO:336競爭結合針對SEQ ID NO:336產生的抗體的氨基酸序列，或SEQ ID NO: 336的至少7個氨基酸的片段；和/或（c)包含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所 述第三氨基酸序列包含或由如下序列組成：SEQ ID N0:337,或與SEQ ID N0:337具有至少 80%序列相同性的氨基酸序列，或與SEQ ID NO:337競爭結合針對SEQ ID NO:337產生的 抗體的氨基酸序列，或SEQ ID NO: 337的至少7個氨基酸的片段；和/或（d)包含第四氨基 酸序列的第四多肽，其中所述第四氨基酸序列包含或由如下序列組成：SEQ ID N0:338,或 與SEQ ID N0:338具有至少80%序列相同性的氨基酸序列，或與SEQ ID N0:338競爭結合 針對SEQ ID NO:338產生的抗體的氨基酸序列，或SEQ ID NO:338的至少7個氨基酸的片 段；
[0038] 和/或（e)包含第五氨基酸序列的第五多肽，其中所述第五氨基酸序列包含或由 如下序列組成：SEQ ID N0:339,或與SEQ ID N0:339具有至少80%序列相同性的氨基酸序 列，或與SEQ ID N0:339競爭結合針對SEQ ID N0:339產生的抗體的氨基酸序列，或SEQ ID NO: 339的至少7個氨基酸的片段；和/或（f)包含第六氨基酸序列的第六多肽，其中所述第 六氨基酸序列包含或由如下序列組成：SEQ ID NO: 340,或與SEQ ID NO: 340具有至少80% 序列相同性的氨基酸序列，或與SEQ ID NO:340競爭結合針對SEQ ID NO:340產生的抗體 的氨基酸序列，或SEQ ID NO: 340的至少7個氨基酸的片段；優(yōu)選地，所述第一、第二、第三、 第四、第五和/或第六多肽包含50個或更少個、45個或更少個、40個或更少個、35個或更少 個、34個或更少個、33個或更少個、30個或更少個，或25個或更少個氨基酸殘基。
[0039] 第二十七方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑、（ii)不溶性金屬鹽，和（iii)包含如下氨基酸序列的多肽：
[0040] A-(-X-L-In-B
[0041] 其中：各X是如第二十六方面中所述的第一氨基酸序列、第二氨基酸序列、第三氨 基酸序列、第四氨基酸序列、第五氨基酸序列或第六氨基酸序列；L是任選的接頭氨基酸序 列；A是任選的N末端氨基酸序列；B是任選的C末端氨基酸序列；η是2或更大整數。例 如，η能提供2、3、4、5或6種不同氨基酸序列，并理想地包含來自兩種或三種不同RrgB進 化支的氨基酸序列。
[0042] 第二十六方面和/或第二十七方面的免疫原性組合物優(yōu)選包含兩種、三種、四種、 五種或六種不同的氨基酸序列，更優(yōu)選地來自兩種或三種不同RrgB進化支，例如，包含選 自第二十六方面中定義的如下兩組或更多組的至少一種氨基酸序列：(a)第一和第二氨基 酸序列；(b)第三和第四氨基酸序列；和（c)第五和第六氨基酸序列。
[0043] 第二十八方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含： ⑴氫氧化鋁佐劑；（ii)式⑷的TLR7激動劑；（iii)RrgB321 ;其中所述TLR7激動劑和/ 或RrgB321吸附至所述氫氧化鋁佐劑。
[0044] 第二十九方面中，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含： (a)包含吸附至不溶性金屬鹽的第一 TLR激動劑的佐劑復合物；(b)包含吸附至不溶性金屬 鹽的第二TLR激動劑的佐劑復合物；和（c)至少一種肺炎鏈球菌蛋白質抗原，其中所述蛋白 質抗原優(yōu)選吸附至所述金屬鹽。
[0045] 第三十方面中，本發(fā)明提供一種用于制備免疫原性組合物的方法，其中所述方法 包括：使TLR激動劑、不溶性金屬鹽和一種或多種肺炎鏈球菌蛋白質抗原混合。
[0046] 第三^^一方面中，本發(fā)明提供一種用于制備免疫原性組合物的方法，所述方法包 括以下步驟之一 ：（i)將肺炎鏈球菌蛋白質抗原和包含TLR激動劑與不溶性金屬鹽的混合 物合并；（ii)將不溶性金屬鹽和包含TLR激動劑與肺炎鏈球菌蛋白質抗原的混合物合并； 或（iii)將TLR激動劑和包含不溶性金屬鹽與肺炎鏈球菌蛋白質抗原的混合物合并。
[0047] 第三十二方面中，本發(fā)明提供一種用于制備免疫原性組合物的方法，所述方法包 括如下步驟（i)制備TLR激動劑和可溶性鋁鹽的水性混合物；然后（ii)向該水性混合物 添加非鋁鹽以形成沉淀的鋁鹽，其吸附有TLR激動劑；和（iii)在步驟（i)、步驟（ii)和/ 或第三步驟中添加一種或多種肺炎鏈球菌蛋白質抗原。一方面中，本發(fā)明提供一種通過第 三十二方面的方法獲得或可獲得的免疫原性組合物。
[0048] 第三十三方面中，本發(fā)明提供一種制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括如 下步驟：混合（i)TLR激動劑和可溶性鋁鹽的水性混合物和（ii)肺炎鏈球菌蛋白質免疫原 的帶緩沖水性混合物，其中，所述混合步驟導致吸附有所述TLR激動劑和所述免疫原的鋁 鹽沉淀。本發(fā)明還提供通過第三十三方面的方法獲得或可獲得的免疫原性組合物。
[0049] 第三十四方面中，本發(fā)明提供一種用于制備無菌免疫原性組合物的方法，所述方 法包括如下步驟：合并（i)肺炎鏈球菌蛋白質免疫原和（ii)TLR激動劑和不溶性金屬鹽的 無菌復合物。優(yōu)選地，所述方法包括例如如下步驟：(a)使TLR激動劑和不溶性金屬鹽混合， 從而所述TLR激動劑吸附至所述不溶性金屬鹽以形成所述復合物；和（b)對該復合物滅菌。 或者，該方法包括如下步驟：(a)對TLR激動劑的溶液或懸浮液滅菌，和（b)將所述滅菌的 溶液或懸浮液與無菌的不溶性金屬鹽合并；或通過如下步驟制備：(a)對不溶性金屬鹽滅 菌，和（b)將所述滅菌的不溶性金屬鹽和TLR激動劑的無菌溶液或懸浮液合并；或通過如下 步驟制備：合并（a) TLR激動劑的無菌溶液或懸浮液和（b)無菌不溶性金屬鹽。對TLR激動 劑溶液/懸液的滅菌優(yōu)選通過無菌過濾來實現，并且/或者對不溶性金屬鹽的滅菌通過高 壓滅菌來實現。
[0050] 第三十五方面中，本發(fā)明提供在對象中產生免疫應答的方法，所述方法包括向該 對象給予任何方面中所述組合物的步驟。優(yōu)選地，該方法包括給予該對象兩個或更多個劑 量的任何方面中所述的組合物。
[0051] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供在對象中產生免疫應答的方法，所述方法包括給 予所述對象兩個或更多個劑量的任何前述方面中所述的組合物。
[0052] 在一些實施方式中，所述TLR激動劑是人TLR7的激動劑。優(yōu)選地，所述TLR激動 劑包括至少一個吸附部分，允許其吸附至不溶性金屬鹽；更優(yōu)選地，所述吸附部分是磷酸鹽 /酯或膦酸鹽/酯。
[0053] 在一些實施方式中，所述TLR激動劑具有說明書中定義的式（C)、（D)、（E)、（F)、 (G)、（H)、（I)、（II)、（J)或（K)。在一些實施方式中，所述TLR激動劑是參考文獻2中定義 的化合物1?102之一，或其藥學上可接受的鹽。在一些實施方式中，所述TLR激動劑是化 合物K2,或其藥學上可接受的鹽。
[0054] 在一些實施方式中，所述不溶性金屬鹽是鋁鹽，優(yōu)選是氫氧化鋁。在一些實施方式 中，所述鋁鹽的Al+++濃度是10-500 μ g/ml。
[0055] 在一些實施方式中，>80%的TLR激動劑吸附至不溶性金屬鹽。
[0056] 在一些實施方式中，所述一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原選自血清型1、2、3、4、5、 6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 / 或 33F。
[0057] 在一些實施方式中，所述組合物或方法包括血清型的5價組合，例如，來自血清型 1、5、6B、14和 23F。
[0058] 在一些實施方式中，所述組合物或方法包括血清型的7價組合，例如，來自血清型 4、 68、聽、14、18(：、19卩和23卩。
[0059] 在一些實施方式中，所述組合物或方法包括血清型的9價組合，例如，來自血清型 1、4、5、68、叭、14、18(：、19卩和23卩。
[0060] 在一些實施方式中，所述組合物或方法包括血清型的10價組合，例如，來自血清 型 1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F*23F。
[0061] 在一些實施方式中，所述組合物或方法包括11種血清型的組合。
[0062] 在一些實施方式中，所述組合物或方法包括血清型的12價組合，例如，來自血清 型1、4、5、68、7?、叭、14、18(：、19?和23?，優(yōu)選還包含血清型6六和19六 ；6六和22?;19六和22?; 6A 和 15B ;19A 和 15B ;或 22F 和 15B。
[0063] 在一些實施方式中，所述組合物或方法包括13價組合，例如，來自血清型1、3、4、 5、 6B、7F、9V、14、18C、19F 和 23F，還有血清型 19A 和 22F ;8 和 12F ;8 和 15B ;8 和 19A ;8 和 22F ;12F 和 15B ;12F 和 19A ;12F 和 22F ;15B 和 19A ;15B 和 22F 或 6A 和 19A。在一些實施 方式中，13種血清型的組合包含血清型1、3、4、5、6八、68、7?、叭、14、18(：、19、19?和23?，或1、 3、4、5、6六、68、7卩、叭、14、18(：、19六、19卩和23卩。
[0064] 在一些實施方式中，對于各血清型，各糖的重量是0. 01-500 μ g/ml。在一些實施方 式中，其中有來自兩種或更多種血清型的糖時，糖的重量比為1:1。
[0065] 在一些實施方式中，所述免疫原性組合物包含來自一種血清型的肺炎鏈球菌糖抗 原，優(yōu)選選自血清型 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、 19F、20、22F、23F和/或33F，更優(yōu)選選自血清型1、5、6B、14或23F。
[0066] 在一些實施方式中，一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原偶聯至載體蛋白。在一些實施 方式中，所述載體蛋白是細菌毒素、類毒素或其突變體，優(yōu)選選自白喉、破傷風或流感嗜血 桿菌（H. influenzae)，優(yōu)選是白喉。優(yōu)選的載體是CRM197,其濃度優(yōu)選是55-60 μ g/ml。
[0067] 在一些實施方式中，有來自兩種或更多種不同血清型的肺炎鏈球菌糖抗原，并且 所述兩種或更多種糖抗原偶聯至相同類型的載體蛋白。在其它實施方式中，有來自兩種或 更多種不同血清型的肺炎鏈球菌糖抗原，并且所述兩種或更多種糖抗原偶聯至不同類型的 載體蛋白。
[0068] 在一些實施方式中，所述載體直接偶聯至所述糖，優(yōu)選通過所述糖和所述載體之 間的還原性胺化反應偶聯。在一些實施方式中，所述載體通過接頭偶聯至所述糖，所述接頭 優(yōu)選是己二酸接頭、羰基接頭、β -丙酰胺基接頭、硝基苯基-乙胺接頭、鹵?；u接頭、葡 糖苷接頭、6-氨基己酸接頭、ADH接頭或C4?C12接頭。
[0069] 在一些實施方式中，所述組合物或方法包含緩沖劑，優(yōu)選是組氨酸緩沖劑。優(yōu)選 地，所述組氨酸緩沖劑的濃度小于50mM組氨酸緩沖劑。
[0070] 在一些實施方式中，所述組合物或方法具有6?8的pH，優(yōu)選pH為6?7。
[0071] 在一些實施方式中，包含肺炎鏈球菌糖抗原的組合物或方法還包含肺炎鏈球菌蛋 白質抗原。在一些實施方式中，包含肺炎鏈球菌蛋白質抗原的組合物或方法還包含肺炎鏈 球菌糖抗原。
[0072] TLR激動劑
[0073] 本發(fā)明的組合物包括TLR激動劑，S卩，可使Toll樣受體促效的化合物。最優(yōu)選地， TLR激動劑是人TLR的激動劑。所述TLR激動劑能夠激活TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、 TLR6、TLR7、TLR8、TLR9或TLRll中的任何一種或多種；優(yōu)選其能夠激活人TLR7。
[0074] 化合物針對任何特定Toll樣受體的激動劑活性可通過標準試驗來測定。諸如茵 姆基因公司（Imgenex)和英沃金公司（Invivogen)的公司供應穩(wěn)定共同轉染了人TLR基因 和NF κ B的細胞系，以及合適的報告基因以供檢測TLR激活通路。其為靈敏的、寬工作范圍 動力學而設計，并且能夠用于高通量篩選。此類細胞系中通常存在一種或兩種特異性TLR 的組成型表達。也可見參考文獻3。本領域已知多種TLR激動劑，例如，參考文獻4描述了 某些脂肽分子是TLR2激動劑，參考文獻5?8各自描述了 TLR7的小分子激動劑種類，而參 考文獻9和10描述了用于治療疾病的TLR7和TLR8激動劑。
[0075] 本發(fā)明所用的TLR激動劑理想上包括至少一個吸附部分。TLR激動劑中所包括 的此類部分使其能夠吸附至不溶性金屬鹽（例如，通過配體交換或任何其它合適機制）并 改善其免疫學表現（參見，參考文獻2)。含磷的吸附部分是尤其有用的，所以吸附部分 可包含磷酸鹽（酯）、膦酸鹽（酯）、次磷酸鹽（酯）、亞磷酸鹽（酯）、次亞磷酸鹽（酯） (phosphinite)等。
[0076] 優(yōu)選地，所述TLR激動劑包括至少一個膦酸鹽（酯）基團。
[0077] 因此，在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的組合物包括含膦酸鹽（酯）基團的TLR7激 動劑。該膦酸鹽（酯）基團能夠使所述激動劑吸附至不溶性金屬鹽，例如吸附至鋁鹽。
[0078] 本發(fā)明可用的TLR激動劑可包括單一吸附部分，或可包括多于一個（例如，2?15 個）吸附部分。化合物通常會包含1、2或3個吸附部分。
[0079] 本發(fā)明可用的含磷TLR激動劑可由式（Al)表示：
[0080]

【權利要求】
1. 一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑、（ii)不溶性金屬 鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌（S. pneumoniae)糖抗原或蛋白質抗原，其中所述TLR 激動劑是人TLR7的激動劑。
2. -種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑、（ii)不溶性金屬 鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原或蛋白質抗原，其中所述不溶性金屬鹽是鋁鹽。
3. -種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑、（ii)不溶性金屬 鹽、（iii)緩沖劑和（iv) -種或多種肺炎鏈球菌糖抗原或蛋白質抗原。
4. 一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑、（ii)不溶性金屬 鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原或蛋白質抗原，其中所述組合物的pH是6?8， 優(yōu)選是6?7。
5. -種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑，（ii)不溶性金屬 鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原，其中所述一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原中的 至少一種偶聯至CRM197,并且任選地，其中所述組合物不包含白喉類毒素、破傷風類毒素和 百日咳類毒素。
6. -種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑，（ii)不溶性金屬 鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原，所述肺炎鏈球菌糖抗原選自2?10種不同血 清型，或12種或更多種不同血清型；并且可任選地，其中所述組合物不包含白喉類毒素、破 傷風類毒素和百日咳類毒素。
7. -種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑，（ii)不溶性金屬 鹽，和（iii)來自恰好11種不同血清型的肺炎鏈球菌糖抗原，限制條件是所述11種不同血 清型不是血清型 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F*23F。
8. -種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑，（ii)不溶性金屬 鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原，其中所述一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原中的 至少一種直接偶聯至載體，優(yōu)選通過還原性胺化反應偶聯。
9. 一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含（i) TLR激動劑，（ii)不溶性金屬 鹽，和（iii) 一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原，其中所述一種或多種肺炎鏈球菌糖抗原中的 至少一種通過接頭偶聯至載體。
10. -種免疫原性組合物，其包含： (i) 氫氧化鋁佐劑； (ii) 式⑷的TLR7激動劑； (iii) 來自血清型1、5、6B、14和23F的肺炎鏈球菌糖抗原，其中各糖偶聯至CRM197; 其中，所述TLR7激動劑和/或所述糖中至少一種吸附至所述氫氧化鋁佐劑。
11. 一種免疫原性組合物，其包含： (i) 氫氧化鋁佐劑； (ii) 式⑷的TLR7激動劑； (iii) 僅來自血清型5的肺炎鏈球菌糖抗原偶聯至CRM197; 其中，所述TLR7激動劑和/或所述糖中至少一種吸附至所述氫氧化鋁佐劑。
12. -種免疫原性組合物，其包含：(a)包含吸附至不溶性金屬鹽的第一 TLR激動劑的 佐劑復合物；(b)包含吸附至不溶性金屬鹽的第二TLR激動劑的佐劑復合物；和（c)至少一 種肺炎鏈球菌糖抗原或蛋白質抗原，其中一種或多種所述糖抗原優(yōu)選吸附至一種或多種所 述金屬鹽。
13. 如權利要求1?9或12中任一項所述的組合物，其特征在于，所述一種或多種肺炎 鏈球菌糖抗原選自血清型 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、 19八、19卩、20、22卩、23卩和/或33卩。
14. 如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含5價血清型組合。
15. 如權利要求14所述的組合物，其特征在于，所述肺炎鏈球菌糖來自血清型1、5、6B、 14 和 23F。
16. 如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含7價血清型組合。
17. 如權利要求16所述的組合物，其特征在于，所述肺炎鏈球菌糖來自血清型4、6B、 聽、14、18(：、19?和23卩。
18. 如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含9價血清型組合。
19. 如權利要求18所述的組合物，其特征在于，所述肺炎鏈球菌糖來自血清型1、4、5、 68、聽、14、18(：、19卩和23卩。
20. 如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含10價血清型組合。
21. 如權利要求20所述的組合物，其特征在于，所述肺炎鏈球菌糖來自血清型1、4、5、 6B、7F、9V、14、18C、19F 和 23F。
22. 如權利要求1-5、8、9或12-13中任一項所述的組合物，其特征在于，所述血清型組 合是11價組合。
23. 如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述血清型組合是12價組合。
24. 如權利要求23所述的組合物，其特征在于，所述12種血清型組合包含權利要求21 所述的10種血清型，還包含血清型6A和19A ;6A和22F ;19A和22F ;6A和15B ;19A和15B ; 或 22F 和 15B。
25. 如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述血清型組合是13價組合。
26. 如權利要求25所述的組合物，其特征在于，所述13種血清型的組合包含1、3、4、 5、6B、7F、9V、14、18C、19F 和 23F，還有血清型 19A 和 22F ;8 和 12F ;8 和 15B ;8 和 19A ;8 和 22F ; 12F 和 15B ; 12F 和 19A ; 12F 和 22F ; 15B 和 19A ; 15B 和 22F 或 6A 和 19A。
27. 如權利要求25或權利要求26所述的組合物，其特征在于，13種血清型的組合包 含血清型 1、3、4、5、6六、68、7卩、叭、14、18(：、19、19卩和23卩，或1、3、4、5、6六、68、7卩、9￥、14、18(：、 19A、19F 和 23F〇
28. 如權利要求1-5、8、9或12中任一項所述的組合物，其特征在于，所述免疫原性組 合物包含來自一種血清型的肺炎鏈球菌糖抗原，并且其中所述肺炎鏈球菌糖抗原選自血清 型 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 / 或 33F。
29. 如權利要求28所述的組合物，其特征在于，所述一種血清型選自血清型1、5、6B、14 或 23F。
30. 如前述權利要求中任一項所述的組合物，其特征在于，所述一種或多種肺炎鏈球菌 糖抗原偶聯至載體蛋白。
31. 如權利要求30所述的組合物，其特征在于，所述載體蛋白是細菌毒素、類毒素或其 突變體。
32. 如權利要求31所述的組合物，其特征在于，所述細菌毒素、類毒素或其突變體選自 白喉、破傷風或流感嗜血桿菌（H. influenzae)，優(yōu)選白喉。
33. 如權利要求32所述的組合物，其特征在于，所述毒素突變體是CRM197。
34. 如權利要求33所述的組合物，其特征在于，CRM197的濃度是55?60 μ g/ml。
35. 如權利要求28?31中任一項所述的組合物，其特征在于，所述載體直接偶聯至所 述糖，所述偶聯優(yōu)選通過所述糖和所述載體之間的還原性胺化作用。
36. 如權利要求28?31中任一項所述的組合物，其特征在于，所述載體通過接頭偶聯 至所述糖。
37. 如權利要求36所述的組合物，其特征在于，所述接頭是己二酸接頭、羰基接頭、 β -丙酰胺基接頭、硝基苯基-乙胺接頭、齒?；滏^、葡糖苷接頭、6-氨基己酸接頭、ADH 接頭或C4?C 12接頭。
38. 如前述權利要求中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含緩沖劑。
39. 如權利要求38所述的組合物，其特征在于，所述緩沖劑是組氨酸緩沖劑。
40. 如權利要求39所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含少于50mM的組氨酸緩 沖劑。
41. 如前述權利要求中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物的pH是6?8， 優(yōu)選pH是6?7。
42. 如前述權利要求中任一項所述的組合物，其特征在于，式（K)的TLR7激動劑是化合 物K2或其藥學上可接受的鹽。
43. 如前述權利要求中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含肺炎鏈球 菌蛋白質抗原。
44. 一種在對象中產生免疫應答的方法，所述方法包括給予所述對象如前述權利要求 中任一項所述的組合物的步驟。
45. 如權利要求44所述的方法，其特征在于，所述方法包括給予所述對象兩個或更多 個劑量的如前述權利要求中任一項所述的組合物。
【文檔編號】A61K33/42GK104519910SQ201380012938
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年3月7日 優(yōu)先權日:2012年3月7日
【發(fā)明者】S·布法力, P·科斯塔蒂諾, M·帕勞羅, D·歐哈根, R·拉普奧利, M·辛格 申請人:諾華股份有限公司