專利名稱：分離的結(jié)合mhci類和mhcii類分子的同ny－eso－1的氨基酸序列相關(guān)的肽及其應(yīng)用的制作方法
相關(guān)申請本申請是1998年4月17日提交的申請?zhí)?9/062,422的部分繼續(xù)申請，申請?zhí)?9/062,422為1997年9月15日提交的申請?zhí)?8/937,263的部分繼續(xù)申請，而后者又是1996年10月3日提交的申請?zhí)?8/725,182現(xiàn)在的美國專利＿＿＿號的部分繼續(xù)申請。所有這些申請均被引入作為參考。
發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及來自癌癥相關(guān)抗原的HLA結(jié)合肽。這些肽結(jié)合Ⅰ類和Ⅱ類MHC分子。
背景和現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)已完全確認(rèn)許多病理學(xué)狀態(tài)，如感染、癌癥、自身免疫病等都是以某些分子的不適當(dāng)表達為特征的。因此這些分子可作為特定病理學(xué)或異常狀態(tài)的“標(biāo)志物”。這些分子除了可作為診斷“靶標(biāo)”，即診斷這些異常狀態(tài)所必需鑒定的物質(zhì)外，它們還可作為用來產(chǎn)生診斷和/或治療劑的反應(yīng)物。其一個絕非限制性的實例是利用癌癥標(biāo)志物來產(chǎn)生特異性針對一種特定標(biāo)志物的抗體。還有另一非限制性的實例是利用與MHC分子形成復(fù)合物的肽來產(chǎn)生針對異常細胞的溶細胞性T細胞。
當(dāng)然，此類物質(zhì)的制備必需有用于產(chǎn)生這些物質(zhì)的反應(yīng)物來源。從細胞進行純化是進行該工作的一種辛苦而不可靠的方法。另一種優(yōu)選的方法是分離編碼一特定標(biāo)志物的核酸分子，隨后用分離的編碼分子來表達目的分子。
目前，兩種策略已被用于如在人類腫瘤中檢測此類抗原。這些被稱作遺傳學(xué)方法和生物化學(xué)方法。遺傳學(xué)方法由例如dePlaen等，美國國家科學(xué)院進展(Proc.Natl.Sci.USA)85:2275(1988)舉例說明，其被引入作為參考。在該方法中，將獲自一種腫瘤的一個cDNA文庫的數(shù)百份質(zhì)粒集合體轉(zhuǎn)染到受體細胞，例如COS細胞，或者測試了該特異性抗原表達的抗原陰性的腫瘤細胞系變體中。生物化學(xué)方法由例如引入作為參考的O.Mandelboim等，自然(Nature)369:69(1994)舉例說明，其基于對結(jié)合于腫瘤細胞MHC-Ⅰ類分子的肽的酸洗脫，及隨后的反相高效液相色譜(HPLC)。抗原性肽在它們結(jié)合抗原加工有缺陷的突變細胞系上的空MHC-Ⅰ類分子后被識別，并誘導(dǎo)同細胞毒性T淋巴細胞的特異性反應(yīng)。這些反應(yīng)包括CTL增殖的誘導(dǎo)、TNF的釋放以及靶細胞的裂解，可在MTT檢測法或51Cr釋放檢測法中測定。
這兩種對抗原進行分子確定的方法具有下述缺點第一，它們非常麻煩，耗時而且昂貴；第二，它們依賴于具有預(yù)定特異性的細胞毒性T細胞系(CTLs)的建立。
這兩種用于抗原的鑒定和分子確定的已知方法有其固有的問題，這一點已通過以下事實得到了最好的證實迄今為止這兩種方法在人體腫瘤中只成功確定了很少的幾種新抗原。見例如van der Bruggen等，科學(xué)(Science)254:1643-1647(1991)；Brichard等，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)178:489-495(1993)；Coulie等，實驗醫(yī)學(xué)雜志180:35-42(1994)；Kawakami等，美國國家科學(xué)院進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91:3515-3519(1994)。
此外，所述方法學(xué)有賴于目的癌癥類型已建立的永生細胞系的可用性。建立來自特定癌癥類型的細胞系是很難的，如Oettgen等，北美免疫學(xué)和過敏癥臨床(Immunol.Allerg.Clin.North.Am.)10:607-637(1990)所示。還已知一些上皮細胞癌在體外對CTL的易感性極低，防礙了常規(guī)檢測。這些問題促使本領(lǐng)域來發(fā)展用于鑒定癌癥相關(guān)抗原的其他方法。
Sahin等，美國國家科學(xué)院進展92:11810-11913(1995)描述了一個關(guān)鍵的方法，其引入作為參考。還可見美國專利5,698,396號以及1996年1月3日提交的申請?zhí)?8/479,328。所有這三篇文獻均引入作為參考?？傊?，該方法涉及cDNA文庫在原核宿主中的表達。(文庫均得自腫瘤標(biāo)本)。然后，為了檢測那些引發(fā)高滴度體液應(yīng)答的抗原，用已吸附并稀釋的血清對表達文庫進行免疫篩選。該方法被稱為SEREX方法(通過重組表達克隆進行的抗原血清學(xué)鑒定(“Serological identification of antigens by RecombinantExpression Cloning”))。該方法學(xué)已被用來證實以前鑒定的腫瘤相關(guān)抗原的表達，以及檢測新抗原。見上面參考的專利申請和Sahin等，同上，以及Crew等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志(EMBO J)144:2333-2340(1995)。
SEREX方法已被用于食管癌標(biāo)本，而且目前已經(jīng)鑒定出一種抗原，并分離和克隆了其編碼核酸分子。這是幾個專利申請的主題，其中一些被引入作為參考。已發(fā)現(xiàn)該抗原和其截斷形式同癌癥患者血清中的抗體發(fā)生反應(yīng)。還發(fā)現(xiàn)源自該分子的肽同MHC分子結(jié)合，激發(fā)溶細胞性T細胞和輔助性T細胞的應(yīng)答。在隨后的公開中可以看到本發(fā)明的這些特征。
附圖簡述

圖1顯示NY-ESO-1抗原的RNA在各種類型組織中的表達模式。
圖2顯示NY-ESO-1 mRNA的RNA印跡(Northem Blot)雜交分析，其在睪丸和細胞系SK-MEL-19中可檢測到，而在其它各種細胞和組織樣品中未檢測到。
圖3顯示對推導(dǎo)的NY-ESO-1氨基酸序列進行修飾的潛在位點。
圖4是NY-ESO-1的親水性曲線圖，其顯示在氨基末端的親水區(qū)和靠近羧基端較長的疏水片段。
圖5顯示利用各種HLA-A2陽性、NY-ESO-1陽性、雙陽性或雙陰性的細胞進行的CTL裂解研究的結(jié)果。
圖6提供資料確定HLA-A2為提呈SEQ ID NO:1衍生肽的提呈分子。
實施例1利用眾所周知的方法從快速冷凍的高分化或中分化的食管鱗狀細胞癌標(biāo)本中提取總RNA。關(guān)于此類方法見例如Chomzynski，分析生物化學(xué)雜志(J.Analyt.Biochem.)162:156-159(1987)。按照制造商的說明利用此RNA制備一個隨后被轉(zhuǎn)染到λZAP噬菌體載體中的cDNA文庫。然后將λZAP文庫轉(zhuǎn)染到大腸桿菌中，產(chǎn)生1.6×106個初級分離菌。
然后利用Sahin等，美國國家科學(xué)院進展92:11810-11813(1995)的SEREX方法，其被引入作為參考。簡言之，通過將自體血清和不含有食管癌細胞cDNA克隆的λZAP所轉(zhuǎn)染的大腸桿菌的裂解液相合并，從血清中去除抗大腸桿菌內(nèi)源性分子的抗體。
然后將清理過的血清稀釋，并同含有噬菌斑的硝酸纖維素膜混合。將噬斑室溫孵育過夜。隨后進行洗滌，然后將濾膜同堿性磷酸酶結(jié)合的山羊抗人FCγ二抗進行孵育，并通過同5-溴-4-氯-吲哚磷酸鹽和氮藍四唑一起孵育來顯色。發(fā)現(xiàn)了一共13個陽性克隆。
實施例2鑒定后，通過稀釋克隆和用人血清檢測將反應(yīng)性克隆亞克隆至單克隆化。然后利用制造商的說明，對這些克隆進行純化，體外切割，并轉(zhuǎn)換成pBK-CMV質(zhì)粒的形式。然后利用EcoRⅠ-XbaⅠ限制性作圖評價插入的DNA來確定不同的插入子。鑒定出8個不同的插入子，大小從大約500到大約1300個堿基對。利用ABI PRISM自動測序儀對克隆進行測序。
表1總結(jié)了結(jié)果。一個基因由4個重疊的克隆代表，另一個由3個重疊的克隆代表，而其余的6個基因都只由一個克隆代表。
同源性檢索揭示被稱為NY-ESO-2、3、6、7的克隆是已知的。見Elisei等，內(nèi)分泌研究雜志(J.Endocrin.Invest.)16:533-540(1993)；Spritz，等，核酸研究(Nucl.Acids Res.)15:10373-10391(1987)；Rabbits等，自然遺傳學(xué)(Nature Genetics)4:175-180(1993)；Crozat等，自然363:640-644(1993)；Genbank H18386和D25606。以前已經(jīng)顯示兩個克隆(NY-ESO-3和NY-ESO-6)表達于人體各種正常組織中。尚未發(fā)現(xiàn)譜系限制性的證據(jù)。NY-ESO-6(cDNA)似乎是FUS/TLS基因的3’-非翻譯部分。在此處未報告的實驗中，NY-ESO-6的測序和DNA印跡(Southem Blot)分析未顯示在腫瘤中易位或點突變的證據(jù)。4個克隆，即NY-ESO-1、4、5和8顯示同所檢索數(shù)據(jù)庫中的序列沒有明顯的同源性，因此對其進行進一步研究。
表1．用自體血清對從食管癌文庫中分離的基因進行免疫篩選基因 克隆編號 大小 DNA數(shù)據(jù)庫注釋NY-ESO-1E1-5b679bp 無明顯同源性表達于睪丸和卵巢中E1-114b 614bpE1-153c 670bpE1-50 679bpNY-ESO-2 E1-71a 605bp U1小核RNP1同系物 通過Ab篩選而克隆(甲狀腺
E1-140874bp炎患者)E1-31 750bpNY-ESO-3 E1-141b 517bp 結(jié)腸3’直接MboI (dbj D25606、gb H18638)未cDNA；成人腦cDNA 發(fā)表NY-ESO-4 E1A-10c 400bp 無明顯同源性 在正常組織中普遍表達NY-ESO-5 E1A-54670bp 無明顯同源性 表達于正常食管中NY-ESO-6 E1B-9b-1.2kb 人fus mRNA在脂肉瘤中易位t(12；16)NY-ESO-7 E1B-20f -1.0kb 人U1-70k sn RNP與NY-ESO-2不同(emblHSU17052、gbM22636)NY-ESO-8 E1B-20g -1.3kb 無明顯同源性 在正常組織中普遍表達實施例3進行研究來評價NY-ESO-1、4、5和8克隆的mRNA表達。為了進行這個研究，針對每個序列設(shè)計特異性寡核苷酸引物，以便可以擴增300-400個堿基對的cDNA片段，而且引物解鏈溫度可以在65-70℃的范圍內(nèi)。然后利用市售的材料和標(biāo)準(zhǔn)的方法進行反轉(zhuǎn)錄PCR。檢測了多種類型的正常和腫瘤細胞?？寺Y-ESO-4和NY-ESO-8是普遍存在的，因此沒有進行進一步研究。NY-ESO-5顯示在原發(fā)腫瘤和正常食管組織中高水平表達，提示其是分化標(biāo)志物。
在腫瘤mRNA和睪丸中發(fā)現(xiàn)表達NY-ESO-1，而在正常結(jié)腸、腎臟、肝臟或腦組織中則沒有表達。這種表達模式同其它腫瘤排斥抗原前體一致。
實施例4針對NY-ESO-1在一組更全面的正常和腫瘤組織中進行了上述RT-PCR檢測。表2、3和4顯示了這些結(jié)果。簡言之，NY-ESO-1被發(fā)現(xiàn)高表達于正常睪丸和卵巢細胞中。在正常子宮肌層中發(fā)現(xiàn)了少量的RT-PCR擴增而子宮內(nèi)膜中未發(fā)現(xiàn)，但是陽性結(jié)果并不一致。各種細胞類型的鱗狀上皮，包括正常食管和皮膚也均為陰性。
當(dāng)檢測無關(guān)細胞譜系的腫瘤時，11個黑色素細胞系中的2個表現(xiàn)出高表達，67個黑色素瘤樣品中的16個、33個乳腺癌樣品中的6個以及4個膀胱癌中的4個也是如此。在其它腫瘤類型中存在零星的表達。
表2在正常組織中NY-ESO-1的mRNA的分布組織 mRNA 組織mRNA食管 - 腎上腺-腦*- 胰腺 -胎腦 - 精囊 -心 - 胎盤 -肺 - 胸腺 -肝臟 - 淋巴結(jié)-脾臟 - 扁桃體-腎臟 - PBL -胃 - PBL，活化的# -小腸 - 黑色素細胞-結(jié)腸 - 甲狀腺-直腸 - 子宮 +/-**乳腺 - 睪丸 +皮膚 - 卵巢 +*來自不同部位的組織用IL-2和PHA測試**在部分樣品中弱陽性，通過RNA印跡分析為陰性表3在黑色素瘤和乳腺癌細胞系中NY-ESO-1的mRNA的分布細胞系NY-ESO-1mRNAMZ2-MEL3.1-MZ2-MEL2.2-SK-MEL-13 -SK-MEL-19 +SK-MEL-23 -SK-MEL-29 -SK-MEL-30 -SK-MEL-31 -SK-MEL-33 -SK-MEL-37 +SK-MEL-179-SK-BR-3 -SK-BR-5 -734B -MDA-MB-231-
表4在各種人類腫瘤中通過RT-PCR檢測NY-ESO-1 mRNA的表達腫瘤類型mRNA(陽性/總數(shù))腫瘤類型 mRNA(陽性/總數(shù))黑色素瘤25/77 卵巢癌 2/8乳腺癌 17/43 甲狀腺癌 2/5前列腺癌4/16 膀胱癌 9/13結(jié)腸癌 0/16 Burkitt淋巴瘤1/2膠質(zhì)瘤 0/15 基底細胞癌 0/2胃癌0/12 肌肉瘤 0/2肺癌5/17 其它肉瘤 0/2腎癌0/10 胰腺癌 0/2淋巴瘤*0/10 精原細胞瘤 0/1肝癌2/7脊髓瘤 0/1*非何杰金、非Burkitt型進行另一組實驗來確證是否可以通過ELISA來檢測在癌癥患者血清中抗NY-ESO-1抗體的存在。
具體如下，將在包被緩沖液(15mM Na2CO3、30mM NaHCO3、pH9.6,0.02％NaN3)中濃度1μg/ml的重組NY-ESO-1吸附至微孔板(每孔10μl)，然后4℃保存過夜。用磷酸鹽緩沖液洗板并用10μl/孔2％牛血清白蛋白/磷酸鹽緩沖液于4℃封閉過夜。洗滌后，將在2％牛血清白蛋白中稀釋的血清10μl/孔加入到孔中。室溫下孵育2小時后，洗板，并加入10μl/孔1∶1500稀釋的山羊抗人IgG-堿性磷酸酶結(jié)合物。將該溶液在室溫下孵育1小時，隨后洗滌并加入堿性磷酸酶的底物溶液(10μl/孔)。室溫放置25分鐘后，用熒光讀板儀讀取各孔。結(jié)果列于下面的表中Eso 1+/檢測總數(shù) ％癌癥患者黑色素瘤12/127 9.4卵巢癌4/32 12.5
肺癌 1/244.0乳腺癌2/267.7獻血者0/700為了確定腫瘤中NY-ESO-1的mRNA表達和對NY-ESO-1蛋白的抗體應(yīng)答之間是否相關(guān)，比較了來自62個黑色素瘤患者的資料。患者血清同NY-ESO-1蛋白有反應(yīng)的所有患者(即含有針對NY-ESO-1的抗體)也都有NY-ESO-1陽性的腫瘤，而NY-ESO-1陰性腫瘤的患者在他們的血清中未出現(xiàn)針對NY-ESO-1的抗體。缺乏該抗體的NY-ESO-1陽性患者占有一定比例。已知大約20-40％的黑色素瘤表達NY-ESO-1，而且只有NY-ESO-1陽性腫瘤的患者具有抗體，資料表明高比例的NY-ESO-1陽性腫瘤患者產(chǎn)生抗該蛋白的抗體，因此提示大規(guī)模檢測在診斷和對治療的反應(yīng)性中是有用的。
實施例5然后進行RNA印跡分析來研究NY-ESO-1轉(zhuǎn)錄子的大小，并證實組織表達模式。采用了Ausubel等，分子生物學(xué)最新方法(Current Protocols InMolecular Biology)(John Wiley和Sons,1995)的方法。具體的是，將每條泳道20μg的總RNA溶于含有甲酰胺和甲醛的緩沖液中，加熱至65℃，然后在含有3％甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上分離，隨后轉(zhuǎn)移質(zhì)硝酸纖維素膜上。然后利用32p標(biāo)記的探針進行雜交，隨后進行高嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌。最后的洗滌是用0.1×SSC、0.1％SDS、60℃洗滌15分鐘。
來自睪丸以及在前面的檢測中NY-ESO-1為陽性的一種黑色素瘤細胞系(SK-MEL-19)的RNA顯示出一條大約0.8-0.9kb的RNA轉(zhuǎn)錄子。一個食管癌樣品顯示出在0.4-0.9kb范圍內(nèi)的成片條帶(smear)，表明部分降解。來自所檢測的其它組織或細胞系的RNA顯示無轉(zhuǎn)錄子。
為了獲得編碼全長轉(zhuǎn)錄子的cDNA，利用噬斑雜交方法并以原始cDNA克隆作為雜交探針對食管癌cDNA文庫進行了再次篩選。當(dāng)篩選了3×105個克隆時，發(fā)現(xiàn)了6個陽性克隆。對3個最長的克隆進行了測序。開放閱讀框架分析顯示，所有3個克隆都含有整個編碼區(qū)和不同大小的5’-非翻譯區(qū)。最長的克隆長度為755個堿基對(不包括多聚A)，含有543個堿基對的編碼區(qū)，以及在5’末端53個非翻譯的堿基和在3’末端的151個非翻譯堿基。見SEQ ID NO:1(還有圖3)。
長的ORF表明推導(dǎo)的NY-ESO-1蛋白序列為180個氨基酸。單個免疫陽性克隆含有編碼其中173個的序列。推導(dǎo)的分子量為17,995道爾頓。
分析顯示在N-末端部分有大量的甘氨酸殘基(前80個中有30，其余100個中有4個)。親水性分析表明在該分子的N-端一半中有親水性抗原序列，還有交替的疏水和親水序列，并以一個長的C端疏水性尾(152-172位氨基酸)結(jié)束，其后為一個短的親水性尾。該模式提示為跨膜蛋白。該分子存在數(shù)個潛在的N-十四酰化位點、3個磷酸化位點，但沒有N-糖基化位點。
實施例61995年從一名罹患惡性黑色素瘤的患者中建立了一個黑色素瘤細胞系“NW-MEL-38”。血清樣品、外周血淋巴細胞和腫瘤樣品均取自該患者，并凍存直至進行了本文所描述的工作。為了評價該患者體內(nèi)的抗腫瘤T細胞應(yīng)答，對患者進行HLA配型，為HLA-A1和HLA-A2。
為確定來自該患者的黑色素瘤是否表達NY-ESO-1，利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)從腫瘤標(biāo)本和NW-MEL-38細胞系中分離總RNA。然后，再利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)將各樣品的2μg總RNA用于進行cDNA合成。
然后利用下述引物5’-CACACAGGAT CCATGGATGCTGCAGATGCG G-3’(SEQ ID NO:2)和5’-CACACAAAGC TTGGCTTAGCGCCTCTGCCC TG-3’(SEQ ID NO:3)將cDNA進行RT-PCR實驗。這些引物應(yīng)該擴增SEQ ID NO:1的一個片段，其跨越271至599位核苷酸。
將擴增進行35個循環(huán)，利用60℃作為退火溫度。在1.5％瓊脂糖凝膠中通過溴化乙錠染色使PCR產(chǎn)物顯色。
結(jié)果說明，所述腫瘤和細胞系均表達SEQ ID NO:1。該細胞系和腫瘤樣品均用于隨后的實驗中。
實施例7然后將上述分離的cDNA分子用于制備重組蛋白。具體包括利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)對cDNA進行擴增，然后將其克隆到一種市售含有His標(biāo)簽的質(zhì)粒載體即pQE9中。在本文未詳細闡述的工作中，還利用了另一種載體，pQE9K。其與pQE9的不同之處在于pQE9K為卡那霉素抗性，而不是氨芐青霉素抗性。
將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株XL1-Blue中，并通過限制性作圖和DNA測序鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組蛋白的產(chǎn)生，并按照眾所周知的方法在Ni2+離子層析柱上純化該蛋白。當(dāng)通過15％SDS-PAGE和銀染分析時，該蛋白被鑒定為分子量約22千道爾頓的蛋白質(zhì)。這與由該蛋白的序列所推測的大小一致。還鑒定出該重組蛋白的2種其它形式。這些由在SEQ ID NO:1中所報道的氨基酸序列的10-180和10-121位氨基酸組成。在如上所進行的SDS-PAGE上，它們的分子量分別為大約14kD和20kD。
進行另外一組實驗來在桿狀病毒中表達NY-ESO-1。具體為通過用BamHⅠ和HindⅢ切割從pQE9載體中釋放NY-ESO-1 cDNA插入片段。然后將該插入片段亞克隆至用相同的酶切割過的市售桿狀病毒載體中。利用標(biāo)準(zhǔn)的方法確定陽性克隆，并轉(zhuǎn)染到Sf9受體細胞中。然后利用補充有10％胎牛血清的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(IPL-41)將重組病毒用于感染昆蟲細胞。所用的感染復(fù)數(shù)為20。如上所述確定重組蛋白的表達。在該載體中產(chǎn)生的重組蛋白攜帶一個His-標(biāo)簽，因此也按照上面所描述的，在Ni2+親和柱上對其進行純化。該蛋白由10-180位氨基酸組成，而且通過SDS-PAGE確定分子量為20kD。
然后制備了其它真核轉(zhuǎn)染子。為了進行該實驗，從如上所述pQE9載體中分離NY-ESO-1編碼序列，然后克隆至真核表達載體pcDNA3.1的BamHⅠ-HindⅢ位點中。接著，通過將COS-7細胞樣品同150ng上述質(zhì)粒和150ng含有HLA-A2.1的cDNA或HLA-A1的cDNA的質(zhì)粒pcDNA 1 Amp相接觸，而用該載體轉(zhuǎn)染COS-7細胞。利用了眾所周知的DEAE-葡聚糖氯奎方法。然后將細胞在37℃孵育48小時，之后在CTL刺激實驗中對它們進行檢測。具體地按照Traversari等，免疫遺傳學(xué)(Immunogenetics)35:145-148(1992)進行該實驗，其被引入作為參考。簡言之，將在補充有10％人血清的RPMI 100μl中的2500個CTLs(NW38-IVS-1，見實施例9，如下)和25U/ml的重組IL-2加入到含有COS-7轉(zhuǎn)染子的微孔中(20,000細胞/孔)。24小時后，從每孔中收集50μl的上清，并在一個標(biāo)準(zhǔn)的檢測，即一種利用MTT測定對WEHI 164克隆13細胞的細胞毒性的方法中測定TNF-α的水平。將陽性細胞用于蛋白質(zhì)印跡(Westem Blot)分析，其在隨后的實施例中進行了描述。
所用的CTL為CTL NW38-IVS-1，其按照引入作為參考的Knuth等，美國國家科學(xué)院進展81:3511-3515(1984)來制備。具體為，通過將105個自體NW38-MEL-1腫瘤細胞和取自受試者的106個外周血淋巴細胞合并來建立混合的T淋巴細胞培養(yǎng)。加入細胞因子IL-2，并在37℃將混合培養(yǎng)孵育一周。去除腫瘤細胞，加入一份新的5×104個腫瘤細胞及IL-2。該步驟每周重復(fù)一次，直到對51Cr標(biāo)記的NW-MEL-38細胞進行檢測時觀察到強的反應(yīng)。收集反應(yīng)T細胞并凍存直至在進一步實驗中使用。
實施例8然后利用上面所描述的血清樣品以及取自上面所描述的NW-MEL-38細胞系和上面所描述的COS-7轉(zhuǎn)染子的細胞裂解液及也是上面所描述的純化的重組蛋白來進行蛋白質(zhì)印跡分析。血清樣品取自患者治療過程中的各個時刻。結(jié)果無差別。
在這些檢測中，將1μg的重組NY-ESO-1蛋白或5μl每種類型細胞的裂解液稀釋于SDS中，并煮沸5分鐘，然后在15％的SDS凝膠中電泳。在向硝酸纖維素膜(0.45μm)上轉(zhuǎn)印過夜，并用3％BSA封閉后，將印跡同以1∶1000、1∶10,000和1∶100,000稀釋的血清或稀釋至1∶50的抗NY-ESO-1單克隆抗體(為陽性對照)進行孵育。單克隆抗體通過Chen等，美國國家科學(xué)院進展5915-5919(1996)來制備，其被引入作為參考并詳細描述如下。通過以2-3周的間隔將重組NY-ESO-1蛋白進行5次皮下注射對BALB/C小鼠進行免疫。免疫制劑包括在佐劑中的50μg的重組蛋白。第一次注射利用完全弗氏佐劑，其后利用不完全弗氏佐劑。從免疫的小鼠中取脾細胞，同小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0進行融合來產(chǎn)生雜交瘤。將代表性的雜交瘤E978用于制備mAb。
一旦產(chǎn)生了雜交瘤，便對它們進行克隆，并在微量滴定板上利用標(biāo)準(zhǔn)的固相ELISA篩選上清中的重組蛋白。按照Dippold等，美國國家科學(xué)院進展77:6114-6118(1980)進行該檢測，其被引入作為參考。利用重組的NY-ESO-1還設(shè)置一系列陰性對照。利用堿性磷酸酶標(biāo)記的1∶10,000稀釋的山羊抗人IgG對上述大腸桿菌所產(chǎn)生的結(jié)合重組蛋白的血清抗體進行顯色，然后利用NBT-磷酸鹽顯色。未轉(zhuǎn)染的COS-7細胞也被用做對照。取自一個健康個體的血清也用做對照。
在低至1∶100,000的血清稀釋度時發(fā)現(xiàn)針對重組蛋白的強反應(yīng)性，而且還有針對NW-MEL-38裂解液的反應(yīng)性。對于未轉(zhuǎn)染的COS-7細胞無反應(yīng)性，取自健康個體的血清也未顯示反應(yīng)性。
實施例9上面描述了4種不同形式的NY-ESO-1，即在大腸桿菌中由SEQ IDNO:1產(chǎn)生的形式和由10-180位氨基酸組成的形式、由10-121位氨基酸組成的形式以及在上面所討論的桿狀病毒載體系統(tǒng)中表達的由10-180位氨基酸組成的形式。按照上面所描述的方法，將每種形式均用于ELISA。所有形式的蛋白質(zhì)均被發(fā)現(xiàn)與取自各種患者的抗體以及上面所討論的小鼠單克隆抗體有同等的反應(yīng)。
實施例10在檢測上面的COS-7轉(zhuǎn)染子時以及在本實施例所討論的檢測法中利用了一個溶細胞性T細胞系“NW38-IVS-1”。該“CTL”是通過利用腫瘤細胞系NW-MEL-38體外刺激上面所提到的外周血淋巴細胞而產(chǎn)生的。這是利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來進行的。
將CTL同NW-MEL-38(其為HLA-A1、A2陽性，而NY-ESO-1陽性)、兩種NY-ESO-1和HLA-A2陽性的同種異型細胞系(SK-MEL-37和MZ-MEL-19)、MHCⅠ類陰性的一個細胞系(SK-MEL-19)、HLA-A2陽性而NY-ESO-1陰性的一個細胞系(NW-MEL-145)、以及對照細胞系K562和植物血凝素刺激的自體母細胞一起用于細胞毒性檢測。利用了各種效應(yīng)/靶細胞比，并以51Cr標(biāo)記的靶細胞的裂解為測定參數(shù)。由圖5示之。
結(jié)果表明，CTL NW-38-IVS-1裂解自體細胞系NW-MEL-38以及HLA-A2和ESO-1均為陽性的同種異型細胞系。因此，CTL可與同種異型物質(zhì)反應(yīng)。見圖6。
實施例11由于患者NW38為HLA-A1和HLA-A2雙陽性，所以進行實驗來確定哪種MHC分子是提呈分子。
進行與上面所描述的對COS-7細胞的相同實驗，不同的是注意保證使HLA-A1 cDNA或HLA-A2 cDNA分別轉(zhuǎn)化而非一起轉(zhuǎn)化的共轉(zhuǎn)化子分離。這些結(jié)果顯示，CTL NW38-IVS-1只裂解含有NY-ESO-1和HLA-A2的COS-7轉(zhuǎn)染子。見圖6。該工作還證實CTL的特異性，因為在實施例9中所描述的NY-ESO-1陰性、HLA-A2陽性細胞中含有其它已知被加工成由HLA-A2分子提呈的肽的分子。
實施例12一旦提呈的MHC分子被確定為HLA-A2，便利用引入作為參考的由D’Amaro等，人類免疫學(xué)(Human Immunol)43:13-18(1995)和Drijfhout等，人類免疫學(xué)43:1-12(1995)所提出的模型篩選NY-ESO-1氨基酸序列來鑒定能與該基元相配的所有肽。利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)合成了由此所推斷的所有氨基酸序列的相應(yīng)肽，然后按照引入作為參考的Knuth等，美國國家科學(xué)院進展81:3511-3515(1984)將其用于細胞毒性檢測。特別地，利用了細胞系CEMX721.174.T2(此后為“T2”)，因為其不將抗原加工成MHC復(fù)合肽，因此使其非常適于進行本文所述的實驗類型。利用標(biāo)準(zhǔn)的方法用100μCi的Na(51Cr)O4對T2細胞樣品進行標(biāo)記，然后洗滌3次，隨后同10μg/ml的肽和2.5μg/ml的β2-微球蛋白孵育。室溫孵育1小時。然后以90∶1的效應(yīng)/靶細胞比加入反應(yīng)細胞(100μl的CTL NW38-IVS-1懸液)，并于37℃在有5％CO2的水飽和空氣中孵育4小時。然后將滴定板以200×g離心5分鐘，移取100μl上清，并測定放射活性。按照已知的策略確定51Cr釋放的百分比。發(fā)現(xiàn)肽SLLMWITQCFL(SEQ ID NO:4)、SLLMWITQC(SEQ IDNO:5)和QLSLLMWIT(SEQ ID NO:6)為三個最佳的CTL刺激物。在用NW-MEL-38和細胞系SK-MEL-37和MZ-MEL-19做靶標(biāo)時發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果，如上所示。
實施例13對由SEQ ID NO:1所編碼蛋白的氨基酸序列分析了對應(yīng)于HLA結(jié)合基元的肽序列。利用由Parker等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)142:163(1994)所教授的算法進行，其被引入作為參考。在隨后的表中給出了氨基酸序列、其可能結(jié)合的HLA分子以及在SEQ ID NO:1中的位置。所獲復(fù)合物應(yīng)引發(fā)溶細胞性T細胞應(yīng)答。這可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員按照，例如由引入?yún)⒖嫉膙an der Bruggen等，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol)24:3038-3043(1994)所教授的方法來確定。序列MHC/HLA分子 位置GPESRLLEFHLA-A1 82-90LLMWITQCFHLA-A3 158-166LMWITQCFLHLA-A3 159-167EPTVSGNILHLA-A24 125-133LQLSISACLHLA-A24 145-153GARGPESRLHLA-B7 79-87APRGPHGGAHLA-B7 60-68ESRLLEFYLHLA-B7 84-92APPLPVPGVHLA-B7 113-121FATPMEAELHLA-B7 96-104AADHRQLQLHLA-B7 139-147GARGPESRLHLA-B8 79-87ESRLLEFYLHLA-B8 84-92VPGVLKEF HLA-B35 118-126ESRLLEFYLHLA-B35 84-92GARGPESRLHLA-B35 79-87LEFYLAMPFHLA-B44 88-96PESRLLEFYHLA-B44 83-91AELARRSLAHLA-B44 102-110MEAELARRSHLA-B44 100-108QQLSLLMWIHLA-B52 154-162AQDAPPLPVHLA-B52 110-118LQLSISSCLHLA-B52 145-153ITQCFLPVFHLA-B52 162-170LLEFYLAMPF HLA-A1 87-96GPESRLLEFY HLA-A1 82-91PLPVPGVLLK HLA-A3 115-124RSLAQDAPPL HLA-A24 107-116APPLPVPGVL HLA-B7 113-122GARGPESRLL HLA-B7 79-88GPHGGAASLG HLA-B7 63-72APRGPHGGAA HLA-B7 60-69GPRGAGAARA HLA-B7 44-53TAADHRQLQL HLA-B8 138-147APPLPVPGVL HLA-B52 113-122QQLSLLMWIT HLA-B52 154-163LQQLSLLMWI HLA-B52 153-162KEFTVSFNIL HLA-B52 124-133實施例14進行進一步的實驗來確定其它相關(guān)的肽。在這些實驗中，利用了一個穩(wěn)定的腫瘤細胞系，即，MZ-MEL-19。該細胞系是利用由被引入作為參考的 等，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)187:265-269(1998)所描述的方法從一名被稱為MZ19的患者建立的。利用MZ-MEL-19和在上述實施例7以及上述Jager等的方法還建立了一種溶細胞性T細胞系，即，MZ2-MEL 19-IVS-1。該CTL以HLA-A2限制的方式裂解自體腫瘤細胞系。這可用標(biāo)準(zhǔn)方法確定。將上面由D’Amaro等所提出的模型用于鑒定在ESO-l中與HLA-A2結(jié)合基元相配的所有序列。用該方式確定了26個肽。利用標(biāo)準(zhǔn)的方法對所有這些肽進行合成、純化，并檢測完整性。然后合成肽，并在隨后的實驗中進行測試。利用了MZ19-IVS-1以及實施例12中所描述的T2細胞。SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的肽結(jié)合HLA-A2分子，并被CTLMZ19-IVS-1識別，隨后裂解這些細胞。該CTL還識別HLA-A2和十肽LLMWITQCFL(SEQ ID NO:7)形成的復(fù)合物，該十肽被發(fā)現(xiàn)位于SEQ IDNO:1的156-167位點處。
實施例15通過進一步的研究確定CD4+輔助T細胞是否識別MHCⅡ類分子和肽的復(fù)合物。
腫瘤細胞系MZ-MEL-19的配型為HLA-DR53陽性。因此，對NY-ESO-1利用Futaki等，免疫遺傳學(xué)42:299-301(1995)來篩選，其被引入作為參考，文中指出HLA-DR53的結(jié)合基元。一共28個肽理論上獨自可以結(jié)合HLA-DR53和抗原提呈細胞。
外周血淋巴細胞(“PBL”)分離自2個具有轉(zhuǎn)移的黑色素瘤的患者，他們的配型為HLA-DR53陽性。
利用標(biāo)準(zhǔn)的市售試劑進行配型。一個患者的配型為HLA-DRB1(等位基因1501-05、1601-1603、1605和0701)、HLA DRB4*(等位基因0101-0103)和DRB5*(等位基因0101)陽性，而第二個患者的配型為HLA-DRB1*(等位基因1401、1407、1408和0901)、HLA-DRB3*(等位基因0201-0203)和DRB4*(等位基因0101-0103)陽性。按照Bodmer等，人類免疫學(xué)34:4-18(1992)，其被引入作為參考，HLA-DRB4*的所有等位基因被稱為HLA-DR53。
用包被有適當(dāng)抗體的磁珠處理PBL來清除CD4+和CD8+T淋巴細胞。將其余的細胞以4×106個細胞/孔接種于24孔板中，并使其貼壁于孔塑料24小時。去除任何未貼壁的細胞，并將其余的細胞用做抗原提呈細胞。在用5μg/ml的抗γ干擾素抗體4℃包被過夜的96孔平底硝酸纖維素板中，用GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)刺激這些細胞5天。細胞以3.5×105個細胞/孔進行接種。
然后用4μg/孔的測試肽或2μg/孔的完整NY-ESO-1蛋白做為對照進行沖擊。
然后以1×105個細胞/孔加入CD4+T細胞，細胞懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)基和2.5ng/ml的IL-2中，終體積為100μl，其中RPMI 1640培養(yǎng)基中添加有10％人血清、L-天冬酰胺(50mg/l)、L-精氨酸(242mg/l)和L-谷氨酰胺(300mg/l)。
將混合物于37℃在水飽和的空氣中孵育48小時。然后，用0.05％的Tween 20/PBS溶液洗板6次，隨后以0.5μg/ml加入生物素化的抗γ干擾素抗體。將抗體在37℃孵育2小時，隨后用標(biāo)準(zhǔn)的試劑處理培養(yǎng)板1小時。加入底物3-乙基-9-氨基咔唑，并孵育5分鐘，陽性表現(xiàn)為紅色的斑點。每個孔中紅色斑點的數(shù)量表示CD4+T淋巴細胞的頻率，該CD4+T淋巴細胞識別肽和HLA-DR53的復(fù)合物或HLA-DR53和由重組NY-ESO-1所加工的肽的復(fù)合物。單用試劑(即單純CD4+細胞和單純?nèi)旧珓?進行測試作為對照。
發(fā)現(xiàn)下面的肽使CD4+T淋巴細胞致敏而釋放γ干擾素。
AADHRQLQLSISSCLQQLVLLKEFTVSGNILTIRLTPLPVPGVLLKEFTVSGNI(SEQ ID NOS:8-10)這3種肽與Futaki等的上述結(jié)合HLA-DR53的基元相配，其為Tyr、Phe、Trp或Leu的一個錨定殘基，隨后為Ala或Ser的三殘基下游。
發(fā)現(xiàn)其它結(jié)合HLA-DR53的肽。
這些肽為GAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEATVSGNILTIRLTAADHRQ(SEQ ID NOS:11-13)
上述的實施例描述了編碼一種食管癌相關(guān)抗原的核酸分子的分離。本文使用了“相關(guān)”，因為雖然該相關(guān)分子由食管癌所表達是清楚的，但其它癌也表達該抗原，例如黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和肺癌。
本發(fā)明涉及那些核酸分子，其編碼所述抗原，而且其在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下同參照序列SEQ ID NO:1雜交。本文所用的“嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件”指例如那些在美國專利5,342,774號中所定義的條件，即在65℃雜交18小時，隨后4次在2×SSC、0.1％SDS中洗滌1小時，最后在0.2×SSC、更優(yōu)選0.1×SSC,0.1％SDS中洗滌30分鐘，以及其他提供相同水平嚴(yán)謹(jǐn)度的條件和更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件。
本發(fā)明的一部分還為表達載體，其包括有與一個啟動子可操作連接(即“可操作地連接于”)的本發(fā)明的核酸分子。此類載體的構(gòu)建在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中是已知的，細胞的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染、制備編碼目的分子的真核細胞系或原核細胞系同樣也是已知的。在這種方式中可以選用的宿主細胞的實例是COS細胞、CHO細胞、酵母細胞、昆蟲細胞(例如，草地夜蛾)、NIH 3T3細胞等等。原核細胞，例如大腸桿菌和其它細菌也可使用。
本發(fā)明還有一部分為本文所描述的抗原，其為原始肽形式和翻譯后的修飾形式，以及由SEQ ID NO:1所編碼蛋白的至少10-121位氨基酸和最多10-180位氨基酸所組成的蛋白。該分子不經(jīng)任何翻譯后修飾便大到足以具有抗原性，因此當(dāng)同一種佐劑(或沒有它)聯(lián)合時，其以前體或翻譯后修飾的形式都可用作免疫原。如上所示，這些蛋白可以用來確定在樣品，例如血清或血液中是否存在抗體。利用該抗原制備的抗體，不論多克隆還是單克隆，以及產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，也均為本發(fā)明的一部分。這些抗體可作為完整分子或其部分用于治療或診斷，如下述。本發(fā)明還有一部分為反應(yīng)性片段，例如Fab、F(ab)2’和其它片段，以及嵌合體、人源化抗體、重組制備的抗體等等。特別優(yōu)選的是嵌合體，其中除了互補性決定區(qū)“CDR”以外的整個抗體是人的，而CDR是小鼠的。
本公開顯示，本發(fā)明的蛋白和核酸分子可用于診斷。本文所討論的SEREX方法學(xué)是以對一種病理學(xué)相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答為前提的。因此，可以通過例如檢測受檢者的一種體液標(biāo)本，如血清，同抗原本身的反應(yīng)性來檢測相關(guān)病理學(xué)。反應(yīng)性可以被認(rèn)為是該病理學(xué)可能存在的指征。因此，也可以通過任何本領(lǐng)域眾所周知而無需詳細說明的標(biāo)準(zhǔn)核酸雜交檢測法來檢測抗原的表達。也可用標(biāo)準(zhǔn)的免疫檢測法檢測針對受試分子的抗體。
SEQ ID NO:1的分析表明其中存在5’和3’非編碼區(qū)。本發(fā)明涉及那些分離的核酸分子，其包括至少編碼片段，即SEQ ID NO:1的54-593位核苷酸，而且其可能含有SEQ ID NO:1的1-53和/或594-747位核苷酸的任何一個或全部。
如上面所討論的，進一步的研究揭示這些分子也被加工成引發(fā)溶細胞性T細胞裂解的肽。實施例7顯示對HLA-A2分子如何進行這類基元分析。對于各種MHC或HLA分子的基元已有了大量的工作，其在此處是適用的。因此，本發(fā)明的另一方面為一種治療方法，其中將結(jié)合患者腫瘤細胞表面HLA分子的一個或多個肽，以它們足以結(jié)合MHC/HLA分子并激發(fā)T細胞對細胞的裂解的數(shù)量施予患者。上述HLA-A2分子的實例絕非該方法可利用的唯一類型。任何肽組合也可以使用，如其它HLA分子的那些肽，如上述?？梢詥为毣蚵?lián)合使用的這些肽，以及整個蛋白或其免疫反應(yīng)性部分可以根據(jù)受試者的需要利用任何標(biāo)準(zhǔn)的施藥形式，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、經(jīng)口、直腸、以及穿皮，施予受試者。標(biāo)準(zhǔn)的藥用載體、佐劑，如皂苷、GM-CSF和白細胞介素等也可以使用。此外，這些肽和蛋白可以同所列舉的材料一起制成疫苗，如同可與樹突狀細胞或提呈相關(guān)MHC/肽復(fù)合物的其它細胞一起配制一樣。這些肽還可以用于形成HLA/肽的多體復(fù)合物，例如那些由Dunbar等，現(xiàn)代生物學(xué)(Curr.Biol.)8:413-416(1998)，其被引入作為參考，其中將4種肽/MHC/生物素復(fù)合物連接至鏈親和素或親和素分子。此類復(fù)合物可用來鑒定和/或刺激T細胞前體。
相似地，本發(fā)明設(shè)想一些療法，其中將編碼NY-ESO-1的核酸分子插入到載體例如基于腺病毒的載體中，使其能夠轉(zhuǎn)染到真核細胞例如人的細胞中。類似地，編碼這些肽中的一或多種的核酸分子可以插入到這些載體中，其隨后成為核酸為基礎(chǔ)的療法的主要組成部分。
這些檢測法中的任何檢測法也可以用于進展/消退研究。僅用上面提出的方法中的任何或所有方法監(jiān)測蛋白的水平、其表達等等就可以監(jiān)測涉及NY-ESO-1表達的異常過程。
應(yīng)該清楚的是這些方法也可以用于跟蹤一種治療方案的療效?；旧?，利用上面討論的檢測法中的任何方法可以獲得NY-ESO-1的基線值，施予給定的治療劑，然后監(jiān)測其后該蛋白的水平，觀察ESO-1水平的改變作為該治療方案療效的指標(biāo)。
如上所示，本發(fā)明特別涉及對NY-ESO分子的“整合”免疫應(yīng)答的識別。其一個分支為監(jiān)測癌癥治療過程的能力。在作為本發(fā)明的一個部分的此方法中，一個需要治療的受試者接受本文所描述的一類接種。這樣一種接種引起例如針對表面提呈HLA/肽復(fù)合物的細胞的T細胞應(yīng)答。應(yīng)答還包括一種抗體應(yīng)答，可能是通過T細胞對細胞的裂解使抗體激發(fā)蛋白釋放的結(jié)果。因此，通過監(jiān)測免疫應(yīng)答可以監(jiān)測疫苗的效果。如上所示，抗體滴度或T細胞數(shù)的升高可以當(dāng)作疫苗進展的一個指標(biāo)，反之亦然。因此，本發(fā)明的另一個方面為施藥后通過測定受試者中特異性針對疫苗本身或疫苗為其一部分的一個大分子的抗體水平來監(jiān)測疫苗效果的方法。
通過監(jiān)測接受疫苗的受試者的T細胞應(yīng)答也可測定疫苗的效果。多種檢測法可以用于測定這些體外刺激的T細胞中前體的頻率。這些包括，但不限于，鉻釋放檢測法、TNF釋放檢測法、IFNγ釋放檢測法、ELISPOT檢測法等等?？梢詼y定前體T細胞頻率的改變而且其與疫苗的效果相關(guān)。其它可以利用的方法包括MHC/肽的多體復(fù)合物的使用。此類復(fù)合物的一個實例是Dunbar等，現(xiàn)代生物學(xué)8:413-416(1998)(其被引入作為參考)的四聚HLA/肽-生物素-鏈親和素系統(tǒng)。
對在病理學(xué)狀態(tài)例如癌癥中所涉及的NY-ESO-1蛋白的鑒定也提示除了上面所討論的那些外的多種治療方法。上述實驗證實，抗體是應(yīng)答蛋白質(zhì)的表達而產(chǎn)生的。因此，本發(fā)明的另一個實施方案為通過施予抗體，如人源化抗體、抗體片段等等，對以NY-ESO-1蛋白的異?；虿徽Ｋ綖樘卣鞯臓顟B(tài)進行治療。這些抗體或片段可以連接有或標(biāo)記有適當(dāng)?shù)募毎种菩曰蚣毎拘栽噭?br> 也可施予T細胞。要注明的是，可以在體外利用免疫反應(yīng)細胞，例如樹突狀細胞、淋巴細胞或其它任何免疫反應(yīng)細胞誘導(dǎo)T細胞，并將其回輸?shù)酱委熓茉囌咧小?br> 要注明的是，T細胞和/或抗體的產(chǎn)生也可以通過施予細胞來完成，優(yōu)選經(jīng)處理使其具有不增殖性的細胞，所述細胞提呈與應(yīng)答相關(guān)的T細胞或B細胞表位，例如上面討論的表位。
治療方法還可以包括反義療法，其中將一種反義分子，優(yōu)選長度為10到100個核苷酸的反義分子，“單純”或者在一種促進其摻入細胞的載體，例如脂質(zhì)體中施予受試者，隨后抑制該蛋白的表達。此類反義序列也可以摻入到適當(dāng)?shù)囊呙缰?，例如病毒載體(如痘苗病毒)、細菌構(gòu)建體，例如已知BCG疫苗的變體等中。
本發(fā)明還有一個部分為肽，其可以是被定義為具有LLMWIT(SEQ IDNO:14)核心序列的九聚體、十聚體或十一聚體，其在第一個L殘基后具有至少一個額外的殘基，優(yōu)選為絲氨酸，且可以具有多達3個殘基，其中絲氨酸連接于L形成-SL-，而且在C-末端具有0-4個額外的氨基酸，其如上所示結(jié)合HLA-A2分子，從而引發(fā)CTL應(yīng)答。這些肽可通過施予HLA-A2陽性并在病理情況中表達NY-ESO-1的患者而用于治療，也可用于診斷，即確定的HLA-A2陽性細胞是否存在或者相關(guān)的CTL是否存在等等。
HLA-A2分子是MHCⅠ類分子，針對肽和Ⅰ類分子的復(fù)合物應(yīng)答的T細胞通常為CD8+細胞。另一亞群的T細胞，CD4+細胞，針對MHCⅡ類分子和肽的復(fù)合物應(yīng)答，而且在黑色素瘤患者中已檢測到由自體培養(yǎng)的樹突狀細胞提呈的針對重組NY-ESO-1的MHCⅡ類分子限制性CD4+T細胞應(yīng)答。特別地，在本文未描述的結(jié)果中，利用眾所周知的技術(shù)，使CD4+細胞從PBL或血清樣品中與其它細胞分離。然后將它們同用NY-ESO-1蛋白沖擊過的樹突狀細胞相混合。觀察到CD4+細胞的增殖，從另一個側(cè)面反映本文所討論的整合免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的另一方面為這些CD4+T細胞、結(jié)合MHCⅡ類分子的肽以及它們在治療中的應(yīng)用。
由SEQ ID NO:14的核心序列所定義的肽的實例為由SEQ ID NO:7所定義的肽。如所示的，該肽結(jié)合HLA-A2分子。因此，它是HLA-A2的“標(biāo)志物”，也是如上刺激CTL增殖的肽/MHC復(fù)合物的一個組分。
如實施例所示，ESO-1也被加工成與MHCⅡ類分子，特別是HLA-DR53形成復(fù)合物的肽。這些分子與上面Futaki等所描述的基元相配，即Tyr、Phe、Trp或Leu，隨后有3個氨基酸，之后為Ala或Ser。此類肽長度必需為至少18個氨基酸，而且優(yōu)選不超過25個氨基酸。它們優(yōu)選由18個氨基酸組成，例如SEQ ID NO:8、9、10、11、12和13。這些肽用于鑒定HLA-DR53陽性細胞。此外，諸如SEQ ID NO:8、9和10的肽可用來激發(fā)輔助T細胞的增殖，如實施例所示。上述關(guān)于MHCⅠ類限制性肽的所有應(yīng)用也可用于這些MHCⅡ類限制性肽。此外，由于對MHCⅠ類分子/肽復(fù)合物的免疫應(yīng)答不同于對MHCⅠ類分子/肽復(fù)合物的免疫應(yīng)答，所以可使兩類肽組合如在免疫組合物中，由此產(chǎn)生組合免疫應(yīng)答。因此，所述所有應(yīng)用可僅針對Ⅰ類分子限制性肽、也可僅針對Ⅱ類分子限制性肽、或者針對兩者的組合。
本發(fā)明的其它特征和應(yīng)用對于普通技術(shù)人員是清楚的，因此本文無需描述。
所用的術(shù)語和表述用作描述的而非限制的術(shù)語，而且無意利用這些術(shù)語和表述來排除所顯示和所描述特征或其部分的任何等價體，需承認(rèn)各種修飾都可能在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
序列表(1)一般信息(ⅱ)申請人Stockert,Elisabeth；Jager,Elke；Chen,Yao-Tseng；Scanlan,Matthew；Knuth,Alexander；Old,Lloyd J.(ⅱ)發(fā)明的標(biāo)題結(jié)合NY-ESO-1癌癥相關(guān)蛋白的抗體、其應(yīng)用、NY-ESO-1的截斷形式、以及由其衍生的HLA結(jié)合肽(ⅲ)序列數(shù)7(ⅳ)聯(lián)系地址(A)收信人Felfe&Lynch(B)街道第三大街805號(C)城市紐約市(D)州紐約(E)美國(F)郵編10022(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒介類型磁盤，3.5英寸，144kb容量(B)計算機IBM(C)操作系統(tǒng)PC-DOS(D)軟件WordPerfect(ⅵ)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)提交日期(C)分類(ⅶ)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/937,263(B)提交日期1997年9月15日(ⅶ)在先申請數(shù)據(jù)(C)申請?zhí)朥S 08/752,182(D)提交日期1996年10月3日(ⅷ)律師/代理人信息
(A)姓名Hanson,Norman D.
(B)注冊號30,946(C)參考/案號LUD 5466.3(ⅸ)通訊信息(A)電話(212)688-9200(B)傳真(212)838-3884(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度752個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1ATCCTCGTGG GCCCTGACCT TCTCTCTGAG AGCCGGGCAG AGGCTCCGGA GCC 53ATG CAG GCC GAA GGC CGG GGC ACA GGG GGT TCG ACG GGC GAT GCT98Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala5 10 15GAT GGC CCA GGA GGC CCT GGC ATT CCT GAT GGC CCA GGG GGC AAT143Asp Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn20 25 30GCT GGC GGC CCA GGA GAG GCG GGT GCC ACG GGC GGC AGA GGT CCC188Ala Gly Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Aly Pro35 40 45CGG GGC GCA GGG GCA GCA AGG GCC TCG GGG CCG GGA GGA GGC GCC 233Arg Gly Ala Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala50 55 60CCG CGG GGT CCG CAT GGC GGC GCG GCT TCA GGG CTG AAT GGA TGC 278Pro Arg Gly Pro His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys65 70 75TGC AGA TGC GGG GCC AGG GGG CCG GAG AGC CGC CTG CTT GAG TTC 323Cys Arg Cys Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe80 80 90TAC CTC GCC ATG CCT TTC GCG ACA CCC ATG GAA GCA GAG CTG GCC 368Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala95 100 105CGC AGG AGC CTG GCC CAG GAT GCC CCA CCG CTT CCC GTG CCA GGG 413Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly110115 120GTG CTT CTG AAG GAG TTC ACT GTG TCC GGC AAC ATA CTG ACT ATC 458Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile125130 135CGA CTG ACT GCT GCA GAC CAC CGC CAA CTG CAG CTC TCC ATC AGC 503Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser140 145 150TCC TGT CTC CAG CAG CTT TCC CTG TTG ATG TGG ATC ACG CAG TGC 548Set Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys155160 165TTT CTG CCC GTG TTT TTG GCT CAG CCT CCC TCA GGG CAG AGG CGC 593Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg170175 180TAA GCCCAGCCTG GCGCCCCTTC CTAGGTCATG CCTCCTCCCC TAGGGAATGG646TCCCAGCACG AGTGGCCAGT TCATTGTGGG GGCCTGATTG TTTGTCGCTG GAGGAGGACG 706GCTTACATGT TTGTTTCTGT AGAAAATAAA ACTGAGCTAC GAAAAA752(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2CACACAGGAT CCATGGATGC TGCAGATGCG G 31(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構(gòu)型線性(xⅰ)序列描述SEQ ID NO:3CACACAAAGC TTGGCTTAGC GCCTCTGCCC TG 32(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構(gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu5 10(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(E)拓撲構(gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys5(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(F)拓撲構(gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp lle Thr5(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(G)拓撲構(gòu)型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7Leu Leu Met Trp Ile Thr權(quán)利要求
1.與MHCⅡ類HLA-DR53分子結(jié)合的分離的多肽，其包括至少18個，不超過25個氨基酸，所述的多肽具有至少一個HLA-DR53結(jié)合基元，所述的基元由4個氨基酸組成，其中第一個氨基酸為Tyr、Phe、Trp或Leu，而第四個氨基酸為Ala或Ser。
2.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述肽刺激對特異性于所述肽與HLA-DR53分子之復(fù)合物的CD4+細胞的識別和增殖。
3.權(quán)利要求1的分離的肽，其由18個氨基酸組成。
4.權(quán)利要求1的分離的肽，其選自SEQ ID NO:8、9、10、11、12和13。
5.權(quán)利要求4的分離的肽，其選自SEQ ID NO:8、9和10。
6.分離的溶細胞性T細胞，其特異性針對MHCⅡ類分子HLA-DR53和SEQ ID NO:8、9或10的復(fù)合物。
7.分離的復(fù)合物，其由MHCⅡ類分子HLA-DR53與權(quán)利要求1的多肽組成。
8.權(quán)利要求6的分離的復(fù)合物，其中所述的肽為SEQ ID NO:8、9、10、11、12或13。
9.包括權(quán)利要求1的分離的多肽和至少一種佐劑的組合物。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述的多肽為SEQ ID NO:8、9或10。
11.分離的核酸分子，其由編碼權(quán)利要求1的分離的多肽的核苷酸序列組成。
12.權(quán)利要求11的分離的核酸分子，其中所述的分離的多肽為SEQ IDNO:8、9、10、11、12或13。
13.表達載體，其包括權(quán)利要求11的分離的核酸分子，所述的核酸分子可操作地受限于一啟動子。
14.組合物，其包括由SEQ ID NO:8、9和10所定義的多肽中至少兩個組成的混合物。
15.權(quán)利要求14的組合物，其還包括一種佐劑。
16.表達試劑盒，其包括如下兩個獨立的部分，(ⅰ)分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1的分離的肽，以及(ⅱ)分離的核酸分子，其編碼HLA-DR53分子
17.重組細胞，其包含權(quán)利要求11的分離的核酸分子。
18.重組細胞，其包含權(quán)利要求13的表達載體。
19.刺激輔助性T細胞增殖的方法，其包括使含有T細胞的樣品接觸MHCⅡ類分子HLA-DR53與權(quán)利要求5的肽所形成的復(fù)合物，該復(fù)合物的用量足以刺激識別該復(fù)合物的輔助性T細胞增殖。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述的復(fù)合物位于細胞的表面。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述細胞是被施予這些細胞的受試者的自體細胞。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述的細胞為不能增殖的細胞。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述的細胞為一種重組細胞。
24.權(quán)利要求19的方法，其中所述的復(fù)合物處于游離的形式。
25.刺激輔助性T細胞增殖的方法，其包括將權(quán)利要求5的至少一種肽以一定量的施予HLA-DR53陽性受試者，所述肽的用量足以形成該肽和HLA-DR53的復(fù)合物，所述復(fù)合物足以刺激其特異性T輔助細胞增殖。
26.權(quán)利要求25的方法，其包括局部施予所述至少一種肽。
27.權(quán)利要求25的方法，其包括以組合物的形式施予所述至少一種肽，該組合物包括至少一種佐劑。
28.在受試者中刺激輔助性T細胞增殖的方法，其包括施予所述受試者一定量的多肽或蛋白，其氨基酸序列包括包括至少SEQ ID NO:8、9或10之一，所述多肽或蛋白的量足以被加工成至少一種由所述受試者的MHCⅡ類分子提呈的肽，其量足以形成MHCⅡ類分子與所述至少一種肽的復(fù)合物的足夠數(shù)量，該量足以刺激該復(fù)合物特異性T輔助細胞的增殖。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述受試者為HLA-DR53陽性。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述蛋白由SEQ ID NO:1編碼。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述多肽包括SEQ ID NO:8、9或10的多個拷貝。
32.在受試者中刺激輔助性T細胞增殖的方法，其包括施予所述受試者一定量的細胞，所述細胞轉(zhuǎn)染有(ⅰ)編碼NY-ESO-1的核酸序列和(ⅱ)編碼提呈NY-ESO-1肽的MHCⅡ類分子的核酸序列，其中所述肽由所述癌癥狀態(tài)的相關(guān)細胞提呈，其量足以緩解所述的癌癥狀態(tài)。
33.權(quán)利要求32的方法，其還包括處理所述細胞使其具有不增殖性。
34.在受試者中刺激輔助性T細胞增殖的方法，其包括施予所述受試者一定量的基本上由不增殖的細胞所組成的試劑，所述的不增殖的細胞在其表面表達MHCⅡ類分子和ESO-1肽的非共價復(fù)合物。
35.治療罹患有一種癌癥狀態(tài)的受試者的方法，其包括向所述受試者施以一種抗體，該抗體可與相關(guān)于所述狀態(tài)的癌癥細胞表面所表達的ESO-1肽特異性結(jié)合，所述抗體與一種抗癌劑偶聯(lián)，其用量足以治療所述癌癥狀態(tài)。
36.在受試者中預(yù)防癌癥狀態(tài)發(fā)生的方法，其包括施予一定量的權(quán)利要求9的組合物，其用量足以在所述的受試者中預(yù)防所述的癌癥狀態(tài)發(fā)生。
37.在受試者中預(yù)防癌癥狀態(tài)發(fā)生的方法，其包括施予一定量的權(quán)利要求10的組合物，其用量足以在所述受試者中預(yù)防所述癌癥狀態(tài)發(fā)生。
38.在受試者中預(yù)防癌癥狀態(tài)發(fā)生的方法，其包括施予一定量的權(quán)利要求14的組合物，其用量足以在所述受試者中預(yù)防所述癌癥狀態(tài)發(fā)生。
39.在受試者中預(yù)防癌癥狀態(tài)發(fā)生的方法，其包括施予一定量的權(quán)利要求13的表達載體，其用量足以在所述受試者中預(yù)防所述癌癥狀態(tài)發(fā)生。
40.在受試者中預(yù)防癌癥狀態(tài)發(fā)生的方法，其包括施予一定量的權(quán)利要求15的組合物，其用量足以在所述受試者中預(yù)防所述癌癥狀態(tài)發(fā)生。
41.在受試者中預(yù)防癌癥狀態(tài)發(fā)生的方法，其包括施予一定量的權(quán)利要求17的重組細胞，其用量足以在所述受試者中預(yù)防所述癌癥狀態(tài)發(fā)生。
42.在受試者中篩查癌癥的方法，其包括檢測取自所述受試者的標(biāo)本的(ⅰ)MHCⅡ類分子和由SEQ ID NO:1所編碼蛋白質(zhì)衍生的肽的復(fù)合物，或者(ⅱ)特異性針對所述復(fù)合物的輔助性T細胞，其中(ⅰ)或(ⅱ)的存在表示在所述的受試者中癌癥存在的可能性。
43.權(quán)利要求42所描述的方法，其中所述的肽由SEQ ID NO:8、9或10所定義。
44.用于在受試者中診斷癌癥狀態(tài)的方法，其包括將所述受試者含有免疫反應(yīng)細胞的樣品與由編碼權(quán)利要求1的多肽的分離的核酸分子所轉(zhuǎn)染的細胞系相接觸，并確定所述被轉(zhuǎn)染的細胞系與所述免疫反應(yīng)細胞間的相互作用，該相互作用指示所述的癌癥狀態(tài)。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述的免疫反應(yīng)細胞為輔助性T細胞。
46.權(quán)利要求44的方法，其中所述的多肽由SEQ ID NO:8、9或10所定義。
47.測定癌癥狀態(tài)消退、進展或開始的方法，其包括對取自具有所述癌癥狀態(tài)的患者的樣品監(jiān)測一個參數(shù)，該參數(shù)選自(ⅰ)NY-ESO-1蛋白的衍生肽和MHCⅡ類分子的復(fù)合物，以及(ⅱ)特異性針對該復(fù)合物的輔助性T細胞，其中所述參數(shù)的量指示所述癌癥狀態(tài)的進展或消退或開始。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述的樣品為體液或滲出液。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述的樣品為組織。
50.權(quán)利要求47的方法，其包括將所述的樣品與特異性結(jié)合所述復(fù)合物的抗體相接觸。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述的抗體標(biāo)記有放射性標(biāo)記或酶。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述的抗體為單克隆抗體。
53.用于診斷癌癥狀態(tài)的方法，其包括檢測受試者樣品中針對NY-ESO-1所衍生的，與MHCⅡ類分子形成復(fù)合物的肽的特異性細胞，所述免疫反應(yīng)細胞的存在指示所述的癌癥狀態(tài)。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述的免疫反應(yīng)細胞為輔助性T細胞。
55.分離的肽，其由SEQ ID NO:7的氨基酸序列組成。
56.組合物，其包括權(quán)利要求55的分離的肽和一種佐劑。
57.組合物，其包括權(quán)利要求55的分離的肽和至少一種其它的肽，該其它肽的氨基酸序列在由SEQ ID NO:1所編碼的蛋白中可以找到，而且它可與MHC分子形成復(fù)合物。
58.權(quán)利要求57的組合物，其中所述的MHC分子為Ⅰ類分子。
59.權(quán)利要求57的組合物，其中所述的MHC分子為Ⅱ類分子。
60.權(quán)利要求57的組合物，其中所述的至少一種其它的肽由SEQ IDNO:4、5、6、8、9或10所定義。
61.分離的核酸分子，其由編碼權(quán)利要求55的分離的肽的核苷酸序列組成。
62.表達載體，其包括權(quán)利要求61的分離的核酸分子，其可操作地連接至一個啟動子。
63.權(quán)利要求55的分離的肽和HLA-A2分子所形成的復(fù)合物。
64.重組細胞，其包括權(quán)利要求61的分離的核酸分子。
65.重組細胞，其包括權(quán)利要求62的表達載體。
66.不增殖的細胞，在其表面表達權(quán)利要求63的復(fù)合物。
67.組合物，其包括權(quán)利要求66的不增殖的細胞和一種佐劑。
68.用于刺激溶細胞性T細胞增殖的方法，其包括接觸溶細胞性T細胞，所述的溶細胞性T細胞特異性針對權(quán)利要求55的肽與HLA-A2分子形成的復(fù)合物，所用的量足以刺激所述的溶細胞性T細胞增殖。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述的復(fù)合物是以組合物的形式施予。
70.權(quán)利要求68的方法，其包括以不增殖的細胞的形式施予所述的復(fù)合物，所述的細胞在其表面提呈該復(fù)合物。
71.用于刺激溶細胞性T細胞增殖的方法，其包括對HLA-A2陽性的細胞施予一定量的權(quán)利要求55的肽，所用的量足以產(chǎn)生刺激溶細胞性T細胞增殖所需足量的所述肽與HLA-A2分子的復(fù)合物。
72.權(quán)利要求71的方法，其包括施予包含在組合物中的所述肽，所述組合物中還包括一種佐劑。
73.權(quán)利要求71的方法，其中所述的組合物包括至少一種其它的肽。
74.分離的抗體或抗體的結(jié)合片段，其結(jié)合一種蛋白，所述的蛋白由分離的核酸分子編碼，所述的核酸分子的互補序列在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下同包括SEQ ID NO:1的54-593位核苷酸的核酸分子雜交。
75.權(quán)利要求74的分離的抗體，其中所述的抗體為單克隆抗體。
76.權(quán)利要求74的分離的抗體，其中所述的抗體為嵌合抗體。
77.權(quán)利要求76的分離的抗體，其中所述的嵌合抗體包括帶有小鼠CDR區(qū)的人源化抗體。
78.雜交瘤細胞系，其產(chǎn)生權(quán)利要求75的單克隆抗體。
79.用于在樣品中篩選癌癥的方法，其包括將所述樣品與權(quán)利要求74的分離的抗體相接觸，并確定所述抗體與靶的結(jié)合作為癌癥的指示物。
80.權(quán)利要求79的方法，其中所述的癌癥為黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌或淋巴瘤。
81.用于在樣品中確定抗癌癥相關(guān)抗原的抗體存在的方法，其包括將所述樣品與分離的蛋白相接觸，并確定其針對抗體的結(jié)合，從而確定所述樣品中抗癌癥相關(guān)抗原的抗體的存在，其中所述蛋白由包括SEQ ID NO:1的54-593位核苷酸的核酸分子所編碼。
82.用于確定癌癥狀態(tài)消退、進展或開始的方法，其包括監(jiān)測有所述癌癥狀態(tài)之患者的樣品中選自下組的參數(shù)(ⅰ)NY-ESO-1蛋白、以及(ⅱ)衍生自NY-ESO-1蛋白的肽，用可結(jié)合(ⅰ)或(ⅱ)的抗體實施監(jiān)測，其中所述參數(shù)的量指示所述癌癥狀態(tài)的進展、消退或開始。
83.權(quán)利要求82所述的方法，其中所述樣品為體液或滲出液。
84.權(quán)利要求82的方法，其中所述的樣品為組織。
85.權(quán)利要求84的方法，其中所述的抗體標(biāo)記有放射性標(biāo)記或酶。
86.權(quán)利要求84的方法，其中所述的抗體為單克隆抗體。
87.用于治療罹患有一種癌癥狀態(tài)的受試者的方法，其包括施予所述受試者一種抗體，其與相關(guān)于所述癌癥狀態(tài)的癌癥細胞表面所表達的NY-ESO-1蛋白或ESO-1衍生的肽特異性結(jié)合，所述的抗體與一種抗癌劑偶聯(lián)，其用量足以治療所述的癌癥狀態(tài)。
88.用于治療罹患有一種癌癥狀態(tài)的受試者的方法，其包括施予所述受試者一種特異性結(jié)合NY-ESO-1的抗體，所述抗體與一種抗癌劑偶聯(lián)，其用量足以治療所述的癌癥狀態(tài)。
89.分離的蛋白，其由含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的分離的核酸分子所編碼的蛋白的至少10-121位氨基酸和最多10-180位氨基酸組成。
90.權(quán)利要求89的分離的蛋白，其由10-121位氨基酸組成。
91.權(quán)利要求89的分離的蛋白，其由10-180位氨基酸組成。
92.權(quán)利要求89的分離的蛋白，其中所述的蛋白已糖基化。
93.免疫原性組合物，其包括權(quán)利要求89的分離的蛋白和一種載體。
94.用于測定樣品中針對癌癥相關(guān)抗原的抗體存在的方法，其包括將所述樣品與權(quán)利要求89的分離的蛋白相接觸，并確定對所述蛋白的結(jié)合來確定所述樣品中針對癌癥相關(guān)抗原的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)合MHCⅠ類和MHCⅡ類分子的肽。這些肽在不同的治療和診斷情況下是有用的。
文檔編號C07K16/00GK1303300SQ99806448
公開日2001年7月11日 申請日期1999年3月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月17日
發(fā)明者伊麗莎白·斯托克特, 埃爾克·賈格爾, 陳耀楨, 馬修·斯坎倫, 克努特·亞歷山大, 勞埃德·J·奧爾德, 阿利·格里, 格爾德·里特, 簡·W·德里奧特 申請人:路德維格癌癥研究院