專利名稱：關(guān)于肽合成的方法以及組合物的制作方法
1．前言本發(fā)明首先涉及肽、尤其是T-20(也稱為“DP-178”；SEQ ID NO:1)和T-20樣肽的合成方法。該類方法利用固相和液相合成法合成和組合具體肽片段組，獲得目的肽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及作為所述目的肽(例如T-20)合成中的中間體的各個肽片段。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及可一起用來產(chǎn)生全長T-20和T-20樣肽的所述肽中間體片段組。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及純化肽(尤其是T-20和T-20樣肽)和純化用作主題肽合成中的中間體的各個肽片段的方法。
2．背景最近鑒定了大量的肽，它們具有抑制融合相關(guān)事件的能力、而更重要的是還具有有效的抗病毒活性。參見例如美國專利第5,464,933；5,656,480號和PCT公布號WO 96/19495T-20。因為這些肽將得到廣泛應(yīng)用，作為治療學(xué)，例如需要能夠大量合成該類肽。
盡管已有肽合成技術(shù)(參見例如Mergler等，1988,TetrahedronLetters 29:4005-4008；Mergler等，1988,Tetrahedron Letters 29:4009-4012；Kamber等(編輯)，“Peptides,Chemistry and Biology,ESCOM,Leiden,1992,525-526；和Riniker等,1993,Tetrahedron Letters 49:9307-9320)，但是目前沒有可用于大規(guī)模、經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)易于純化的肽如T-20和T-20樣肽的技術(shù)。
3．發(fā)明概述本發(fā)明首先涉及肽、尤其是T-20(也稱為“DP-178”；SEQ ID NO:1)和T-20樣肽的合成方法。該類方法利用固相和液相合成法合成和組合具體肽片段組，獲得目的肽。一般來說，本發(fā)明方法包括在固相支持體上合成T-20或T-20樣肽的具體側(cè)鏈保護(hù)肽片段中間體，在溶液中偶合所述保護(hù)片段，形成保護(hù)的T-20或T-20樣肽，然后將側(cè)鏈去保護(hù)，獲得最終的T-20或T-20樣肽。本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案包括合成具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的T-20肽。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用作所述目的肽(例如T-20)合成中的中間體的各個肽片段。本發(fā)明的肽片段包括但不限于具有下表1所示的氨基酸序列的肽片段表1
本發(fā)明更進(jìn)一步涉及用作目的肽合成中的中間體的具體肽片段組。本發(fā)明的各組肽片段包括但不限于下表2所示的1-20組。
表2T-20相應(yīng)的組別 氨基酸序列 編碼氨基酸序列1 YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO:4) 1-16EKNEQELLELDKWASLWNWF 17-36(SEQ ID NO:12)YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO:4) 1-16EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11) 17-26DKWASLWNWF(SEQ ID NO:18) 27-36YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO:4) 1-16EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11) 17-26DKWASLWNW (SEQ ID NO:17) 27-35YTSLIHSL (SEQ ID NO:2) 1-8IEESQNQ (SEQ ID NO:6) 9-15EKNEQELLELDKWASLWNWF 17-36(SEQ ID NO:12)YTSLIHSL (SEQ ID NO:2) 1-8IEESQNQ (SEQ ID NO:6) 9-15EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11) 17-26DKWASLWNWF(SEQ ID NO:18) 27-36YTSLIHSL (SEQ ID NO:2) 1-8IEESQNQ (SEQ ID NO:6) 9-15EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11) 17-26DKWASLWNW (SEQ ID NO:17) 27-35YTSLIHSL (SEQ ID NO:2) 1-8IEESQNQQ (SEQ ID NO:7) 9-16EKNEQELLELDKWASLWNWF17-36(SEQ ID NO:12)YTSLIHSL (SEQ ID NO:2) 1-8IEESQNQQ (SEQ ID NO:7) 9-16EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11) 17-26DKWASLWNWF(SEQ ID NO:18) 27-36YTSLIHSL (SEQ ID NO:2) 1-8IEESQNQQ (SEQ ID NO:7) 9-16EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11) 17-26DKWASLWNW (SEQ ID NO:17) 27-35
T-20相應(yīng)的組別氨基酸序列 編碼氨基酸序列10 YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO:4) 1-16EKNEQEL(SEQ ID NO:10) 17-23LELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:16) 24-3611 YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO:4) 1-16EKNEQEL(SEQ ID NO:10) 17-23LELDKWASLWNW (SEQ ID NO:15) 24-3512 YTSLIHSL (SEQ ID NO:2) 1-8IEESQNQ(SEQ ID NO:6) 9-15EKNEQEL(SEQ ID NO:10) 17-23LELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:16) 24-3613 YTSLIHSL (SEQ ID NO:2) 1-8IEESQNQ(SEQ ID NO:6) 9-15EKNEQEL(SEQ ID NO:10) 17-23LELDKWASLWNW (SEQ ID NO:15) 24-3514 YTSLIHSL (SEQ ID NO:2) 1-8IEESQNQQ (SEQ ID NO:7) 9-16EKNEQEL(SEQ ID NO:10) 17-23LELDKWASLWNWF (SEQ IDNO:16) 24-3615 YTSLIHSL (SEQ ID NO:2) 1-8IEESQNQQ (SEQ ID NO:7) 9-16EKNEQEL(SEQ ID NO:10) 17-23LELDKWASLWNW (SEQ ID NO:15) 24-3516 YTSLIHSLIEESQNQ(SEQ ID NO:3) 1-15QEKNEQELLELDKWASLWNWF 16-36(SEQ ID NO:9)17 YTSLIHSLIEESQNQ(SEQ ID NO:3) 1-15QEKNEQELLELDKWASLWNWF 16-36(SEQ ID NO:9)18 YTSLIHSLIEESQNQQEK (SEQ ID NO:5) 1-18NEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO:14) 19-3619 YTSLIHSLIEESQNQQEK (SEQ ID NO:5) 1-18NEQELLELDKWASLWNW (SEQ ID NO:13) 19-3520 YTSLIHSLIEESQNQQ (SEQ ID NO:4) 1-16EKNEQELLELDKWASLWNW 17-35(SEQ ID NO:19)
本發(fā)明的部分基礎(chǔ)是，本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)某些固相液相合成反應(yīng)的組合可高物料通過量和高產(chǎn)率地首次大規(guī)模生產(chǎn)高純度T-20和T-20樣肽。尤其是根據(jù)本發(fā)明的方法可以在1千克或1千克以上的規(guī)模合成T-20和T-20樣肽。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過選擇本發(fā)明的具體T-20肽片段用于固相合成時，可利用高效率的固相偶合技術(shù)而不必使用在固相合成中通常需要的3倍、4倍或甚至5倍的過量氨基酸和試劑。本發(fā)明方法在固相合成本發(fā)明的肽片段時僅使用約1.5倍量氨基酸。這種氨基酸和試劑用量的成本節(jié)約型降低使得本發(fā)明方法適用于大規(guī)模合成T-20和T-20樣肽。
此外，本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可以每克固相樹脂約0.8-1mmol載荷量固相合成某些肽片段。該載荷量明顯高于在固相肽合成中通常達(dá)到的每克樹脂0.25-0.4mmol的載荷范圍。而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在固相中采用超酸敏感型樹脂合成所選定的肽片段可產(chǎn)生非常高純度的肽片段。不必用色譜技術(shù)來純化按照本發(fā)明生產(chǎn)的肽片段；只需要使用前使所述肽片段進(jìn)行沉淀和/或研制步驟，或作為從所述樹脂直接獲得的肽片段使用。應(yīng)用超酸敏感型樹脂使本發(fā)明合成的保護(hù)肽可從該樹脂裂解，而不需要同時去除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。這可減少雜質(zhì)，并可使含有10個或10個以上氨基酸的肽以高純度合成。通過偶合按照本發(fā)明生產(chǎn)的高純度肽片段，從而在液相中根據(jù)本發(fā)明方法合成的T-20和T-20樣肽的雜質(zhì)類型主要包括未偶合的片段，而不是密切相關(guān)的類似物。因此，按照本發(fā)明生產(chǎn)的T-20和T-20樣肽較按照常規(guī)技術(shù)生產(chǎn)的肽純化容易得多。在下文第9和11部分中提供的實施例說明T-20全長肽的這類組合合成。第11部分中給出的實施例說明大規(guī)模合成和純化T-20和T-20中間體肽。所以，本發(fā)明的方法可以以1千克或1千克以上的規(guī)模生產(chǎn)T-20和T-20肽中間體。
本發(fā)明人還意外發(fā)現(xiàn)，用在堿性pH范圍可使用的高載荷量物質(zhì)，可純化本文所述的肽(如T-20和其它T-20樣肽)以及某些肽片段。因此，本發(fā)明更進(jìn)一步涉及純化肽、尤其是T-20和T-20樣肽和純化用作主題肽合成中的中間體的各個肽片段的方法。
3.1定義本文所用的氨基酸符號為常規(guī)符號，具體如下常見氨基酸縮寫氨基酸單字母符號常見縮寫甘氨酸 A Ala天冬酰胺 N Asn天冬氨酸 D Asp谷氨酰胺 Q Gln谷氨酸 E Glu組氨酸 H His異亮氨酸 I Ile亮氨酸 L Leu賴氨酸 K Lys苯丙氨酸 F Phe絲氨酸 S Ser蘇氨酸 T Thr色氨酸 W Trp酪氨酸 Y Tyr4．附圖簡述

圖1T-20四片段方法。該示下文9.1部分提供的實施例采用的流程，該流程以上表2所示第6組中間體肽片段為原料合成全長T-20。
圖2T-20四片段方法，途徑2。該示另一四片段流程，它偶合上表2所示的第6組肽中間體以合成全長T-20。
圖3T-20三片段方法。該示下文9.1部分提供的實施例采用的流程，該流程合成全長T-20。
圖4T-20三片段方法，途徑2。該示下文9.2、9.3、9.4和9.5部分提供的實施例采用的流程，該流程合成全長T-20。
圖5T-20兩片段方法。該示偶合上表2所示的第18組肽中間體以合成全長T-20的流程。
5．發(fā)明詳述5.1全長肽本發(fā)明涉及可用來合成稱為T-20或DP-178的肽的方法、肽片段、肽片段組。T-20是相當(dāng)于得自HIV-1LAI分離株的跨膜蛋白gp41的氨基酸殘基638-673并具有36個氨基酸的序列的肽(從氨基NH2末端到羧基COOH末端認(rèn)讀)NH2-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的方法、片段和片段組以及用于選擇所述片段和片段組的技術(shù)除了可用來合成T-20外還可用來合成T-20樣肽。本文所用術(shù)語“T-20樣”是指美國專利第5,464,933；5,656,480或PCT公布號WO 96/19495中所列舉的任何HIV或非HIV肽，其中每一文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。
除了本文所述T-20和T-20樣肽外，本發(fā)明的方法、片段和肽片段組還可用來合成具有修飾氨基和/或羧基末端的肽。以T-20為例，這類肽具有下式結(jié)構(gòu)X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z其中X代表氨基；選自芐氧羰基、丹?；褪宥⊙趸驶氖杷鶊F(tuán)；乙?；?；9-芴基甲氧基-羰基(FMOC)基團(tuán)；或選自脂質(zhì)-脂肪酸綴合物、聚乙二醇和碳水化合物的大分子載體基團(tuán)；而Z代表羧基；酰胺基；叔丁氧基羰基；對-硝基芐酯基或選自脂質(zhì)-脂肪酸綴合物、聚乙二醇和碳水化合物的大分子載體基團(tuán)。加入該“X”和“Z”基團(tuán)的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法用來合成具有其中X為乙酰基而Z為酰胺基的上式的肽。下文部分9中提供的實施例證明通過偶合下文部分5.2中所述的肽中間體成功合成T-20肽。在優(yōu)選的方法中，可用任何非硅基柱填料(用于使載荷能力最大)純化T-20和T-20樣肽和中間體，所述柱填料包括但不限于鋯基填料、聚苯乙烯基填料、聚丙烯基填料或其它聚合物基填料，它們在高pH(大于7)范圍下是穩(wěn)定的。例如Tosohaus(Montgomeryville,PA)銷售的具有寬pH值范圍的非硅基柱填料中包括pH值大于7的柱填料?？梢栽诘?、中或高壓色譜中使用由該材料填充的柱。參見例如下文部分10中給出的純化方法。
5.2肽中間體本發(fā)明包括但不限于具有上表1中所列具體氨基酸序列的T-20和T-20樣肽的肽片段中間體和表2所列的肽片段中間體組?？捎盟鲭闹虚g體、尤其是下表2所列的肽片段組生產(chǎn)T-20和T-20樣肽。
任何一種或多種表1或2所列的肽片段的氨基酸殘基側(cè)鏈可以用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)如叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(trt)和叔丁氧基羰基(Boc)保護(hù)。t-Bu基團(tuán)是氨基酸殘基Tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)和Asp(D)的優(yōu)選側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)；trt基團(tuán)是氨基酸殘基His(H)、Gln(Q)和Asn(N)的優(yōu)選側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)；而Boc基團(tuán)是氨基酸殘基Lys(K)和Trp(W)的優(yōu)選側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。
在合成表1所列的片段1、2、3和4期間，必須優(yōu)選用三苯甲基(trt)保護(hù)基保護(hù)組氨酸殘基側(cè)鏈。如果不對其進(jìn)行保護(hù)，則使用來從樹脂裂解肽片段的酸與組氨酸殘基產(chǎn)生不利反應(yīng)，導(dǎo)致所述肽片段的降解。
優(yōu)選用三苯甲基(trt)基團(tuán)保護(hù)本發(fā)明肽片段的谷氨酰胺殘基。然而，優(yōu)選不保護(hù)片段1-16和9-16羧基末端的谷氨酰胺殘基。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)1-16片段的羧基末端的谷氨酰胺殘基上保護(hù)基團(tuán)缺失有利1-16片段與17-36片段反應(yīng)，從而使偶合的片段僅約2％外消旋化。另外，如果需要任何本發(fā)明肽片段在有機(jī)溶劑中溶解性降低，則可以從所述片段的其它任何一個或多個谷氨酰胺殘基中去除三苯甲基保護(hù)基。
優(yōu)選保護(hù)本發(fā)明每個肽片段的所有天冬酰胺殘基。此外，優(yōu)選用Boc基團(tuán)保護(hù)色氨酸殘基。
根據(jù)上表1所列的肽化學(xué)式1-18的保護(hù)性肽片段包括但不限于下表3所列的化合物。
表3
上表3所列肽的任何一個或多個氨基酸殘基側(cè)鏈可用標(biāo)準(zhǔn)側(cè)鏈保護(hù)基如上述tBu、trt和Boc保護(hù)。采用下文5.4部分中所討論的一般技術(shù)代表性合成表3的肽見下文第7和第8部分。
5.3肽合成如上所述，本發(fā)明某些單個肽片段優(yōu)選用固相合成技術(shù)制備，而本發(fā)明其它肽優(yōu)選用組合的固相和液相合成技術(shù)制備，所述合成使本文所述的T-20或T-20樣肽的生產(chǎn)達(dá)成最大。然而，應(yīng)該知道本發(fā)明的肽片段可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)合成或制備。參見例如Creighton,1983,Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman andCo.,NY，該文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。
本發(fā)明肽可交替合成，使得一個或多個連接所述肽氨基酸殘基的鍵為非肽鍵。可用本領(lǐng)域熟知的反應(yīng)形成這些替代非肽鍵，包括但不限于所列舉但是僅為少數(shù)幾個的亞氨基、酯、酰肼、氨基脲和偶氮鍵。
在本發(fā)明又一實施方案中，包括上述序列的T-20和T-20樣肽可用存在于其氨基末端和/或羧基末端的另外的化學(xué)基團(tuán)合成，使例如所述肽的穩(wěn)定性、活性和/或溶解性提高。例如，可將疏水基團(tuán)如芐氧羰基、丹?；?、乙?；褪宥⊙趸驶尤胨鲭牡陌被┒?。同樣，可將乙?；?-芴基甲氧基-羰基置于所述肽的氨基末端。(參見上述T-20的“X”修飾)。另外，疏水基團(tuán)叔丁氧基羰基或酰胺基可加入所述肽的羧基末端。同樣，對硝基芐酯基可位于所述肽的羧基末端。(參見上述T-20的“Z”修飾)。引入這類修飾的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
進(jìn)一步，可合成T-20和T-20樣肽，以改變其立體構(gòu)型?？蓱?yīng)用所述肽的一種或多種氨基酸殘基的D-異構(gòu)體而不是常見L-異構(gòu)體。
更進(jìn)一步，本發(fā)明肽的至少一個氨基酸殘基可用一個公知的非天然氨基酸殘基取代。如上述的改變可用來提高本發(fā)明肽的穩(wěn)定性、活性和/或溶解性。
可合成另外含有共價連接到其氨基和/或羧基末端的大分子載體基團(tuán)的任何一種T-20或T-20樣肽。這類大分子載體基團(tuán)可包括例如脂質(zhì)-脂肪酸綴合物、聚乙二醇、碳水化合物或另外的肽。所以，上文所述的T-20“X”修飾可另外代表共價連接到肽的氨基末端的任何上述大分子載體基團(tuán)，優(yōu)選另外的肽基團(tuán)。同樣，上述T-20“Z”修飾可另外代表任何上述大分子載體基團(tuán)。
本發(fā)明的肽片段優(yōu)選用標(biāo)準(zhǔn)FMOC方案經(jīng)固相肽合成(SPPS)技術(shù)合成。參見例如Carpino等，1970,J.Am.Chem.Soc.92(19):5748-5749；Carpino等,1972,J.Org.Chem.37(22):3404-3409。在優(yōu)選的實施方案中，固相合成本發(fā)明的肽片段在超酸敏感型固相支持體上進(jìn)行，超酸敏感型固相支持體包括但不限于2-氯代三苯甲基氯樹脂(參見例如，Barlos等，1989,Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946)和4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸樹脂(參見例如，Seiber,1987,Tetrahedron Letters 28(49):6147-6150，和Richter等，1994,TetrahedronLetters 35(27):4705-4706)。2-氯代三苯甲基氯和4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸樹脂均購自Calbiochem-Novabiochem Corp.,San Diego,CA。
在此描述可用于固相肽合成的一般生產(chǎn)方法和樹脂裝載。例如通過下列技術(shù)可進(jìn)行樹脂裝載樹脂優(yōu)選超酸敏感型樹脂如2-氯代三苯甲基樹脂，將其裝載到反應(yīng)室。用氯化了的溶劑如二氯甲烷(DCM)洗滌樹脂。排干樹脂床，加入1.5當(dāng)量氨基酸和2.7當(dāng)量二異丙基乙胺(DIEA)的約8-10體積的二氯乙烷(DCE)溶液。應(yīng)該優(yōu)選用Fmoc保護(hù)氨基酸的N-末端，必要或合適的情況下應(yīng)該保護(hù)所述氨基酸的側(cè)鏈。所述混合物用氮氣鼓泡攪拌2小時。
值得注意的是，需要氯化了的溶劑來使所述2-氯代三苯甲基樹脂充分膨脹。盡管根據(jù)文獻(xiàn)資源DCE提供更高的載荷效率，但是可以用DCM代替，而載荷量幾乎沒有或沒有降低。
攪拌后，排干所述樹脂床，用DCM洗滌。用9∶1 MeOH∶DIEA溶液封端樹脂上的活性部位約20-30分鐘。排干樹脂床，用DCM洗滌4次，用氮氣吹掃干燥，獲得載荷樹脂。
Fmoc是氨基酸的N-末端的優(yōu)選保護(hù)基團(tuán)。根據(jù)裝載的氨基酸，可以保護(hù)或不保護(hù)其側(cè)鏈。例如當(dāng)載荷Trp時，應(yīng)該用Boc保護(hù)其側(cè)鏈。同樣，用trt可以保護(hù)Gln側(cè)鏈。然而當(dāng)在合成1-16肽片段的制備中載荷Gln時，則不應(yīng)該保護(hù)其側(cè)鏈。不必保護(hù)Leu的側(cè)鏈。
根據(jù)需要可從Sean或Genzyme獲得具有或沒有側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的用于裝載所述樹脂和肽合成的Fmoc保護(hù)氨基酸。作為上述方法的一個替代方法，可購買已經(jīng)裝載了合適氨基酸的樹脂。
在下文部分6中的實施例描述了典型的樹脂制備。
例如按照以下技術(shù)可實施固相肽合成技術(shù)將荷載樹脂加入所述反應(yīng)室，用溶劑優(yōu)選二氯甲烷(DCM；優(yōu)選約10體積)調(diào)節(jié)，同時氮氣攪拌約15分鐘，使所述樹脂珠膨脹。需要DCM來充分膨脹2-氯代三苯甲基樹脂。在反應(yīng)室中的所述樹脂體積因為樹脂珠膨脹而增加一倍或兩倍，所述活性部分未被折疊而易于進(jìn)行反應(yīng)。所述樹脂膨脹后，從反應(yīng)室排干溶劑。
用2等份20％哌啶的N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)溶液每次處理所述樹脂約10分鐘，從而達(dá)到從所述末端胺或樹脂去除Fmoc(9-芴基-甲氧基羰基)保護(hù)基。所需要的每等份的20％哌啶的NMP溶液的體積取決于正在進(jìn)行的反應(yīng)量。然后用等份NMP(約10體積)洗滌樹脂5-7次，以去除Fmoc副產(chǎn)物(即二苯并富烯和其哌啶加合物)和殘留的哌啶。
氯醌試驗可用來測定去除Fmoc副產(chǎn)物和殘留的哌啶是否完全。通過向約1mL丙酮中加入一滴氯醌的甲苯飽和溶液，從而制備氯醌試驗溶液。通過加入一滴DMP洗滌液至氯醌試驗溶液中，測試所述洗滌液。出現(xiàn)藍(lán)色或紫色表示存在仲胺，表明仍然存在Fmoc副產(chǎn)物和/或殘余哌啶。重復(fù)NMP洗滌直到不能觀察到藍(lán)色或紫色時為止。
同時，活化將加入所述樹脂的在所述序列中的后續(xù)氨基酸，以在其羧基末端進(jìn)行反應(yīng)。應(yīng)該用Fmoc保護(hù)每個氨基酸的胺末端。根據(jù)所加入的氨基酸，其側(cè)鏈可能保護(hù)或可能沒有保護(hù)。優(yōu)選用t-Bu保護(hù)tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)和Asp(P)的側(cè)鏈，用trt保護(hù)His(H)、Gln(Q)和Asn(N)的側(cè)鏈，用Boc保護(hù)Lys(K)和Trp(w)的側(cè)鏈。然而，如上所述，必須保護(hù)His的側(cè)鏈。而且優(yōu)選不保護(hù)片段1-16和9-16的羧基末端的Gln殘基的側(cè)鏈。Len或Ile的側(cè)鏈的保護(hù)不是必需的。
如下活化氨基酸。將Fmoc-保護(hù)的氨基酸(1.5eq)、1-羥基苯并三唑水合物(HOBT)(1.5eq)和二異丙基-乙胺(DIEA)(1.5eq)在室溫下溶解于NMP(約7.5體積)中。將所述溶液冷卻至0-5℃，然后加入O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基尿鎓(uronium)六氟代磷酸鹽(HBTU)(1.5eq)，接著攪拌5-15分鐘使其溶解。重要的是在低溫下進(jìn)行活化，以使所述氨基酸的外消旋化最小。HBTU是加入所述冷卻溶液中的最后試劑，因為活化和外消旋化不能在缺乏它的情況下發(fā)生。
將活化的氨基酸溶液加注到排干的樹脂中，用DCM(約2.5體積)洗滌。請注意，所述氨基酸的活化是在NMP中進(jìn)行，因為HBTU不溶于DCM中。然而此時向所述反應(yīng)物中加入DCM以保持所述樹脂珠的充分膨脹。用氮氣鼓泡攪拌所述反應(yīng)物約1小時。用如下所述的定性茚三酮試驗可監(jiān)測偶合完成情況。
為了用定性茚三酮試驗檢測所述反應(yīng)的完成情況，取出2-20mg樹脂樣品，用甲醇洗凈。向該樣品中加入3滴76％苯酚的乙醇溶液、4或5滴0.2mM KCN的吡啶溶液和3滴0.28M茚三酮的乙醇溶液。用乙醇將所述樣品稀釋至體積約0.5mL，并放置于約75℃的加熱塊中5-10分鐘。出現(xiàn)藍(lán)色或紫色表示存在游離胺，說明所述反應(yīng)仍未完成?？蛇M(jìn)一步將樣品稀釋至約3mL體積，以便更容易判定濃縮樣品中的顏色變化程度。
假如1小時后觀察到陽性茚三酮試驗，則再繼續(xù)進(jìn)行所述偶合反應(yīng)1小時。假如2小時后仍然存在陽性茚三酮試驗，則排干所述樹脂，在約10體積NMP中洗滌3次，用1當(dāng)量活化氨基酸重復(fù)所述偶合反應(yīng)。
如果在兩個偶合循環(huán)之間使所述樹脂儲存過夜，則可以排干樹脂床，在氮氣層下用DCM覆蓋?；蛘吲鸥蓸渲?，儲存在氮氣層下，然后在進(jìn)行下一個偶合循環(huán)之前用DCM洗滌液調(diào)適。如果所述完整片段準(zhǔn)備在裂解前儲存過夜，則所述樹脂應(yīng)該用DCM洗滌使其不含NMP，因為在NMP中可能發(fā)生明顯的Fmoc去保護(hù)。
在判定所述偶合反應(yīng)完成后，則排干樹脂，用3等份(約10體積)NMP洗滌。重復(fù)所述肽片段的后續(xù)單體的偶合循環(huán)。在最后一個偶合反應(yīng)后，用4等份(約10體積)NMP洗滌所述樹脂，然后用4等份(約10體積)DCM洗滌?？捎玫獨獯祾吒稍飿渲Y(jié)合肽。
按照例如以下技術(shù)可裂解并分離通過固相合成技術(shù)合成的肽用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)從樹脂上切除所述肽?？捎美?％或2％三氟乙酸(TFA)的DCM溶液或用1％和2％TFA的DCM溶液的組合切除所述肽。也可用乙酸(HOAC)切除所述肽。裂解所需要的具體裂解試劑、溶劑和時間將取決于所要裂解的特定肽。裂解后使所述裂解部分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)處理方法以分離所述肽。通常真空下濃縮合并的裂解部分，然后用溶劑如乙醇、甲醇或庚烷重構(gòu)。一般是加入水沉淀肽，并真空過濾收集所述肽?；蛘呖稍诜蛛x所述肽前研制所述產(chǎn)物。
在下文7.1-7.6部分給出的實施例介紹固相合成表1、2和/或3所示的肽中間體。
為了合成全長T-20肽，可將上表1的肽中間體偶合在一起產(chǎn)生T-20肽。例如可將表2所列的各組的肽中間體偶合在一起產(chǎn)生T-20全長肽。在第9部分給出了如此由中間體肽片段合成全長T-20的典型實例，并圖示于圖1-5中。在一些實施方案中，可采用四片段法合成T-20?！八钠畏ā焙铣墒侵敢院铣刹⒖捎霉滔嗪鸵合嗪铣杉夹g(shù)偶合成全長T-20肽的四個T-20中間體肽片段為原料的T-20合成方案。上表2所示的第5、6、8、9和12-15組中間體肽片段為優(yōu)選片段組。圖1和圖2圖示利用表2第6組肽中間體合成全長T-20的兩個四片段法。對于該片段組，值得注意的是在所述片段偶合過程中單獨引入氨基酸殘基36(T-20羧基1-末端氨基酸殘基)。在9.1部分給出的實施例中證實了示于圖1的最佳T-20合成方案。
在另外的實施方案中，可采用三片段法合成T-20。“三片段法”合成是指以合成并用固相和液相合成技術(shù)偶合為全長T-20肽的三個T-20中間體肽片段為原料的T-20合成方案。上表2所示的第2-4、7、10和11組中間體肽片段為優(yōu)選三片段組。圖3和圖4圖示利用表2第3組肽中間體合成全長T-20的兩個三片段法。對于該片段組，值得注意的是在所述片段偶合過程中單獨引入氨基酸殘基36(T-20羧基1-末端氨基酸殘基)。在下文的9.1部分給出的實施例證實了示于圖3的最佳T-20合成方案。在下文的9.2-9.5部分給出的實施例證實了示于圖4的最佳T-20合成方案。
在另外的實施方案中，可采用兩片段法合成T-20?！皟善畏ā焙铣墒侵敢院铣刹⒂霉滔嗪鸵合嗪铣杉夹g(shù)偶合為全長T-20肽的兩個T-20中間體肽片段為原料的T-20合成方案。上表2所示的第1和16-20組中間體片段為優(yōu)選片段組。圖5圖示利用表2第20組肽中間體合成全長T-20的兩片段法。對于該片段組，值得注意的是在所述片段偶合過程中氨基酸殘基(T-20羧基末端氨基酸殘基)單獨引入。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的液相肽合成技術(shù)合成本發(fā)明的肽中間體片段。在8.1-8.11部分給出的實施例描述表1、2和/或3所列的肽中間體的典型的液相肽合成法。例如Tosohaus(Montgomeryville,PA)銷售的具有寬pH范圍的非硅基柱填料中包括pH值大于7的柱填料。
6．實施例樹脂合成在本文6.1-6.3部分描述的實施例中，合成可與固相合成肽和本文所述的肽中間體一起使用的氯代三苯甲基樹脂。
6.1制備Fmoc-Trp(Boc)-2-氯代三苯甲基樹脂材料MW eq mmole g mL2-氯代三苯甲基氯樹脂 -- 1.0 25 25 -Fmoc-Trp(Boc)-OH -- 526.60 1.5 37.519.7二異丙基乙胺(DIEA) 129.251.7 42.55.5 7.4二氯乙烷(DCE) -- -- -- -- 250二氯甲烷(DCM) -- -- -- -- 6×2509∶1甲醇∶DIEA-- -- -- -- 200方法將2-氯代三苯甲基氯樹脂(25g,1eq.)加入500mL肽反應(yīng)室，用250mL DCM洗滌。排干樹脂床，加入Fmoc-Trp(Boc)-OH(1.5eq)和DIEA(1.7eq)的10體積DCE溶液。氮氣鼓泡攪拌該混合物2小時。
排干樹脂床，用250mL DCM洗滌。用200mL 9∶1 MeOH∶DIEA溶液對樹脂上的活性部分進(jìn)行20分鐘封端。排干樹脂床，用4×250mLDCM洗滌，用氮氣吹掃干燥，獲得34.3g載荷樹脂。
從樹脂分離Fmoc-氨基酸并相對于標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，從而進(jìn)行定量HPLC分析。HPLC分析所述物質(zhì)表明所述樹脂的載荷量為0.68mmol/g。
柱Phenomenox Jupiter C18；299_；5μ流速1mL/min檢測UV,260nm流動相A:0.1％TFA水溶液B:0.1％TFA的乙腈65％B等梯度保留時間～14分鐘
6.2制備Fmoc-Gln-2-氯代三苯甲基樹脂材料MW eq mmole g mL2-氯代三苯甲基氯樹脂 -- 1.0 25 25 --FmocGlnOH368.39 1.5 37.5 13.8--二異丙基乙胺(DIEA)129.25 1.7 42.5 5.5 7.4二氯乙烷(DCE) -- -- ---- 75N,N-二甲基甲酰胺 -- -- ---- 200(DMF)二氯甲烷(DCM) -- -- ---- 6×2509∶1甲醇∶DIEA-- -- ---- 200方法用FmocGlnOH(1.5eq)和DIEA(1.7eq)在75mL DCE和200mLDMF的混合物中的溶液重復(fù)在上文6.1部分給出的實施例中使用的方法。該反應(yīng)獲得33.8g載荷樹脂。推測所述樹脂的理論載荷為0.74mmol/g，并在以后使用該物質(zhì)。
6.3制備Fmoc-Leu-2-氯代三苯甲基樹脂材料 MWeqmmole g mL2-氯代三苯甲基氯樹脂 --1.0 250 250--FmocLeuOH353.42 1.5 375 132.5 --二異丙基乙胺(DIEA)129.25 1.7 425 55 75二氯乙烷(DCE) ---- -- -- 2000二氯甲烷(DCM) ---- -- -- 6×15009∶1甲醇∶DIEA ---- -- -- 1500方法將所述樹脂加入3L肽反應(yīng)室，用1.5 DCM洗滌。排干樹脂床，加入FmocLeuOH(1.5eq)和DIEA(1.7eq)的8體積DCE溶液。氮氣鼓泡攪拌該混合物2小時。
排干樹脂床，用1.5L DCM洗滌。用1.5L 9∶1 MeOH∶DIEA溶液對樹脂上的活性部分進(jìn)行封端30分鐘。排干樹脂床，用4×1.5LDCM洗滌，用氮氣吹掃干燥，獲得345g載荷樹脂。
從樹脂分離Fmoc-氨基酸并相對于標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，從而進(jìn)行定量HPLC分析。HPLC分析所述物質(zhì)表明所述樹脂的載荷量為0.72mmol/g。
柱Phenomenox Jupiter C18；299_；5μ流速1mL/min檢測UV,260nm流動相A:0.1％TFA水溶液B:0.1％TFA的乙腈溶液65％B等梯度保留時間～8分鐘7．實施例固相合成肽在下文7.1-7.6部分給出固相合成表1、2和/或3中所列的肽中間體的實例。
7.1制備片段Fmoc-AA(1-8)-OH(片段1b)結(jié)構(gòu)Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-OH(SEQ ID NO:2)
C93H122N10O15MW1619.06材料MW eq mmoleg mLFmoc-Leu-2-氯代三苯甲基樹脂 -- 1.0 15.6 20.0 --Fmoc-氨基酸*-- 1.5 23.4 ----1-羥基苯并三唑(HOBT)水合物*153.151.5 23.4 3.6--O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基尿鎓六氟代磷酸鹽(HBTU)*379.251.5 23.4 8.9--二異丙基乙胺(DIEA)*129.251.5 23.4 3.04.1N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)*---- -- --150二氯甲烷(DCM)*---- -- --5020％哌啶/NMP*---- -- --2×200用于沖洗的NMP*---- -- --200(每次洗滌)1％三氟乙酸(TFA)的DCM溶液 ---- -- --3000.5％TFA/DCM ---- -- --200哌啶 ---- -- --乙醇 ---- -- --110水---- -- --200+100*每個偶合循環(huán)理論產(chǎn)量25.3g預(yù)期收率80-90％實際產(chǎn)量20.0g方法向1L肽反應(yīng)室中加入20.0g Fmoc-Leu-2-氯代三苯甲基樹脂。在200mL(約10體積)DCM中用氮氣攪拌約15分鐘調(diào)節(jié)所述樹脂，膨脹樹脂圓珠，然后排干。
用2×200mL 20％哌啶的NMP溶液處理，每次10分鐘，達(dá)到從所述末端胺去除Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)。然后按陰性氯醌試驗測定，用200mL(約10體積)NMP洗滌所述樹脂5-7次，去除Fmoc副產(chǎn)物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和殘余哌啶。
同時活化所述序列中的后續(xù)氨基酸Fmoc-Ser(tBu)，以在其羧基末端反應(yīng)。將Fmoc-保護(hù)的氨基酸(1.5eq)、HOBT(1.5eq)和DIEA(1.5eq)在室溫下溶解于150mL(約7.5體積)NMP中。把該溶液冷卻至0-5℃，然后加入HBTU(1.5eq)，攪拌1-15分鐘溶解。將活化的酸溶液加入到排干的樹脂中，用50mL DCM洗滌(約2.5體積)。氮氣鼓泡攪拌所述反應(yīng)物1小時。用定性茚三酮試驗監(jiān)測偶合完成情況。在判定所述偶合反應(yīng)完成后，則排干樹脂，用3×200mL(1體積)NMP洗滌樹脂。
用Fmoc-保護(hù)的氨基酸His(trt)、Ile、Leu、Ser(tBu)、Thr(tBu)和Tyr(tBu)各1.5當(dāng)量，對所述肽片段后續(xù)單體重復(fù)該操作過程。在最后一個偶合反應(yīng)后，用4×200mL(10體積)NMP洗滌所述樹脂，然后用4×200mL(10體積)DCM洗滌。用氮氣吹掃干燥所述樹脂，獲得42g樹脂結(jié)合肽。
用300mL 1％TFA的DCM處理約2分鐘，然后用200mL 0.5％TFA的DCM處理，從21g樹脂裂解所述肽。將裂解部分收集到吡啶(與TFA體積比1∶1)上。合并裂解洗滌液，真空下濃縮至約50mL體積，然后用110mL乙醇重構(gòu)，同時繼續(xù)濃縮以去除殘余DCM至終體積約250mL。加入200mL水沉淀產(chǎn)物。室溫下攪拌該淤漿30分鐘。真空過濾收集所述固體，用約100mL水洗滌。風(fēng)干所述產(chǎn)物，獲得20.0g(70％)Fmoc-AA(1-8)-OH,95％HPLC純。
柱Phenomenox Jupiter C18流速1mL/min檢測UV,260nm流動相A:0.1％TFA水溶液B:0.1％TFA的乙腈溶液，在20分鐘內(nèi)梯度為80％B-99％B保留時間約23分鐘
7.2制備片段Fmoc-AA(9-15)-OH(片段5b)結(jié)構(gòu)Fmoc-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-OH(SEQ ID NO:6)C117H129N10O18MW 1963.39材料 MW eqmmoleg mLFmoc-Gln(trt)-2-氯代三苯甲基樹脂 -- 1.0 12.020.0 --Fmoc-氨基酸*-- 1.5 18.0-- --1-羥基苯并三唑(HOBT)水合物*153.151.5 18.02.8--O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基uronium六氟代磷酸鹽(HBTU)*379.251.5 18.06.8--二異丙基乙胺(DIEA)*129.251.5 18.02.33.1N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)*-- -- -- -- 150二氯甲烷(DCM)*-- -- -- -- 5020％哌啶/NMP*-- -- -- -- 2×200用于沖洗的NMP*-- -- -- -- 200(每次洗滌)用于裂解的DCM-- -- -- -- 160乙酸(HOAc) -- -- -- -- 20三氟乙醇 -- -- -- -- 20庚烷 -- -- -- -- 250+250+100甲基正丁基醚 -- -- -- -- 100異丙醇 -- -- -- -- 60水 -- -- -- -- 60+50*每個偶合循環(huán)理論產(chǎn)量23.6g 預(yù)期收率89-95％實際產(chǎn)量21.1g方法用20.0g Fmoc-Gln(trt)-2-氯代三苯甲基樹脂和Fmoc-保護(hù)氨基酸Asn(trt)、Gln(trt)、Ser(tBu)、Glu(tBu)、Glu(tBu)和Ile重復(fù)以上7.1部分中給出的實施例中所用的方法。
在最后一個偶合反應(yīng)后，用4×200mL(10體積)NMP洗滌所述樹脂，然后用4×200mL(10體積)DCM洗滌。
用200mL 8∶1∶1 DCM∶TFE∶HOAc處理2小時，然后用2×100mL DCM洗液洗滌，從樹脂裂解肽。合并洗脫液，真空下濃縮至約100mL體積，用250mL庚烷重構(gòu)，同時繼續(xù)濃縮以去除殘余DCM至終體積約250mL。從形成的雙相混合物分離庚烷層。加入250mL庚烷和100mL MTBE沉淀產(chǎn)物，然后在室溫下研制過夜，獲得需要稠度的物質(zhì)。真空過濾收集該固體，并用約100mL庚烷洗滌。再次加工所述產(chǎn)物，去除殘余乙酸。將經(jīng)過濾的固體在50℃下溶解于60mL異丙醇中。該溶液在冰浴中冷卻至0-5℃，然后快速滴加60mL水。在冰浴中攪拌研制淤漿產(chǎn)物約1小時。真空過濾分離所述固體，并用約50mL水洗滌。風(fēng)干所述產(chǎn)物，獲得21.1g(90％)Fmoc-AA(9-15)-OH,95％HPLC純。
柱Phenomenox Jupiter C18流速1mL/min檢測UV,260nm流動相A:0.1％TFA水溶液B:0.1％TFA的乙腈溶液，在20分鐘內(nèi)梯度為80％B-99％B保留時間約23分鐘7.3制備片段Fmoc-AA(1-16)-OH(片段3d)結(jié)構(gòu)Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH(SEQID NO:4)
C199H245N22O32MW3457.30材料 MWeq mmoleg mLFmoc-Gln-2-氯代三苯甲基樹脂 --1.0 24.132.5--Fmoc-氨基酸*--1.5 36.2 -- --1-羥基苯并三唑(HOBT)水合物*153.15 1.5 36.25.5 --O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基uronium六氟代磷酸鹽(HBTU)*379.25 1.5 36.213.7--二異丙基乙胺(DIEA)*129.25 1.5 36.24.7 6.3N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)*---- -- -- 200二氯甲烷(DCM)*---- -- -- 7520％哌啶/NMP*---- -- -- 2×250用于沖洗的NMP*---- -- -- 250(每次洗滌)1％三氟乙酸/DCM ---- -- -- 4×50吡啶 79.10 -- -- -- 4×0.5庚烷---- -- -- 150+50甲醇---- -- -- 50水 ---- -- -- 50+25*每個偶合循環(huán)理論產(chǎn)量48.9g 預(yù)期收率89-95％方法用32.5g Fmoc-Gln-2-氯代三苯甲基樹脂和所需要的Fmoc-保護(hù)氨基酸重復(fù)以上7.1部分中給出的實施例中所用的方法。按以上6.1部分給出的實施例中所述進(jìn)行所述反應(yīng)，只是如以上材料部分所示使用略微不同的溶劑體積。
在最后一個偶合反應(yīng)后，用4×250mL(8體積)NMP洗滌所述樹脂，然后用4×250mL(8體積)DCM洗滌。氮氣吹掃干燥所述樹脂，獲得97.4g結(jié)合肽。
在17.7-g規(guī)模，用2×190mL 1％TFA的DCM處理1-2分鐘，然后用1×120mL DCM處理，從樹脂裂解樹脂結(jié)合肽。將裂解部分收集到吡啶(與TFA體積比1∶1)上。合并裂解所述部分和洗滌液，真空下濃縮至約50mL體積，然后用200mL甲醇復(fù)制。繼續(xù)濃縮以去除殘余DCM至終體積約50mL。加入250mL水沉淀產(chǎn)物，并在室溫下攪拌約30分鐘。真空過濾收集該固體，并用約50mL水洗滌。風(fēng)干所述產(chǎn)物，獲得12.8g(84％)。再加工所述產(chǎn)物以去除吡啶鹽。將過濾后的固體在室溫下溶解于150mL甲醇中。于室溫下加入200mL水沉淀所述產(chǎn)物。真空過濾分離所述產(chǎn)物，并用約50mL水洗滌。風(fēng)干該物質(zhì)，獲得12.8g(84％)Fmoc-AA(1-16)-OH。
柱Phenomenox Jupiter C18流速1mL/min檢測UV,260nm流動相A:0.1％TFA水溶液B:0.1％TFA的乙腈溶液，在20分鐘內(nèi)梯度為75％B-99％B保留時間約25分鐘7.4制備片段Ac-AA(1-16)-OH(片段3c)結(jié)構(gòu)Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH(SEQ IDNO:4)
C186H237N22O31MW3274.76材料MW eq mmole g mLFmoc-Gln-2-氯代三苯甲基樹脂 -- 1.024.1 32.5--Fmoc-氨基酸*-- 1.536.2 -- --1羥基苯并三唑(HOBT)水合物*153.15 1.536.2 5.5 --O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基uronium六氟代磷酸鹽(HBTU)*379.25 1.536.2 13.7--二異丙基乙胺(DIEA)*129.25 1.536.2 4.7 6.3N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)*-- -- ---- 200二氯甲烷(DCM)*-- -- ---- 7520％哌啶/NMP*-- -- ---- 2×250用于沖洗的NMP*-- -- ---- 250(每次洗滌)1％三氟乙酸/DCM -- -- ---- 4×50吡啶 79.10 -- ---- 4×0.5庚烷 -- -- ---- 150+50甲醇 -- -- ---- 50水-- -- ---- 50+25*每個偶合循環(huán)理論產(chǎn)量48.9g 預(yù)期收率85-90％方法用32.5g Fmoc-Gln-2-氯代三苯甲基樹脂和所需要的Fmoc-保護(hù)氨基酸和以上材料部分所示的溶劑體積，重復(fù)以上7.1部分中給出的在最后一個偶合反應(yīng)后，用4×250mL(8體積)NMP洗滌所述樹脂，然后用4×250mL(8體積)DCM洗滌。氮氣吹掃干燥所述樹脂，獲得97.4g結(jié)合肽。
在10-g規(guī)模，用乙酸酐和吡啶(各5eq)的100mL 3∶1 NMP∶DCM乙?；鰳渲Y(jié)合肽30分鐘，然后用2×25mL DCM洗滌。用3×50mL 1％TFA的DCM，然后用2×50 DCM洗液從樹脂裂解所述肽。將裂解部分收集到吡啶(與TFA體積比1∶1)上。合并裂解分離部分和洗滌液，真空下濃縮至約100mL體積，然后用分批加入的3×50mL庚烷重構(gòu)，同時繼續(xù)該濃縮以去除殘余DCM至終體積約150mL。最初沉淀的產(chǎn)物具有一定的粘稠度，但可在0-5℃的冰浴中攪拌研制約30分鐘成為可過濾的固體。真空過濾收集固體，并用約50mL庚烷洗滌。再加工該產(chǎn)物以去除吡啶鹽。將過濾后的固體在室溫下溶解于50mL甲醇中。在冰浴中將所述溶液冷卻至0-5℃，然后快速滴加50mL水。在冰浴中攪拌研制作為粘性固體的最初沉淀的物質(zhì)約1小時至可過濾稠度。真空過濾分離產(chǎn)物，并用約25mL水洗滌。風(fēng)干該產(chǎn)物，獲得7.0g(90％)Ac-AA(1-16)-OH。隨后如上所述再加工該產(chǎn)物獲得6.2g(89％收率)96％HPLC純的物質(zhì)。
柱ZorbaX LP C8,100_,20μ流速1mL/min檢測UV,220nm流動相A:0.1％TFA水溶液B:含有0.05％TFA的1∶1ACN∶IPA，在20分鐘內(nèi)梯度為80％B-99％B保留時間約15分鐘7.5制備片段Fmoc-AA(17-26)-OH(片段10b)結(jié)構(gòu)Fmoc-Glu(tBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(tBu)-Gln(trt)-Glu(tBu)-Leu-Leu-Glu(tBu)-Leu-OH(SEQ ID NO:11)
C127H167N13O25MW2275.82材料MW eq mmoleg mLFmoc-Leu-2-氯代三苯甲基樹脂 -- 1.0 19.525.0--Fmoc-氨基酸*-- 1.5 30.0 -- --1-羥基苯并三唑(HOBT)水合物*153.151.5 30.04.6 --O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基uronium六氟代磷酸鹽(HBTU)*379.251.5 30.011.4--二異丙基乙胺(DIEA)*129.251.5 30.03.9 5.2N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)*---- -- -- 200二氯甲烷(DCM)*---- -- -- 7520％哌啶/NMP*---- -- -- 2×250用于沖洗的NMP*---- -- -- 250(每次洗滌)1％三氟乙酸/DCM ---- -- -- 3×400吡啶 79.10 -- 150 -- 3×4乙醇，變性---- -- -- 300水---- -- -- 300*每個偶合循環(huán)理論產(chǎn)量44.4g 預(yù)期收率90-105％實際產(chǎn)量46.9(105％)方法用25.0g Fmoc-Leu-2-氯代三苯甲基樹脂、所需要的Fmoc-保護(hù)氨基酸和以上材料部分所示的溶劑體積，重復(fù)以上7.1部分中給出的實施例中所用的方法。
在最后一個偶合反應(yīng)后，用4×250mL(10體積)NMP洗滌所述樹脂，然后用4×250mL(10體積)DCM洗滌。
用3×400mL(約15體積)的1％TFA的DCM，然后用1×200mL(7.5體積)DCM從樹脂裂解肽。將裂解部分收集到吡啶(與TFA體積比1∶1)上，然后分析裂解液和洗滌液的產(chǎn)物含量。合并含產(chǎn)物所述部分，真空濃縮至約100mL體積，然后用300mL乙醇重構(gòu)。繼續(xù)該濃縮以去除殘余DCM至終體積約250mL。向該攪拌溶液加入300mL水沉淀產(chǎn)物。真空過濾收集固體，并用約50mL水洗滌。風(fēng)干該產(chǎn)物，獲得46.4g(105％)97％HPLC純的Fmoc-AA(17-26)-OH。
柱Phenomenox Jupiter C18流速1mL/min檢測UV,260nm流動相A:0.1％TFA水溶液B:0.1％TFA的乙腈，在20分鐘內(nèi)梯度為75％B-99％B保留時間約25分鐘7.6制備片段Fmoc-AA(27-35)-OH(片段16b)結(jié)構(gòu)Fmoc-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-OH(SEQ ID NO:17)
C121H148N14O24MW 2182.61材料MW eq mmoleg mLFmoc-Trp(Boc)-2-氯代三苯甲基樹脂-- 1.0 22.4 33.0 --Fmoc-氨基酸*-- 1.5 33.6 -- --1-羥基苯并三唑(HOBT)水合物*153.15 1.5 33.6 5.1--O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基uronium六氟代磷酸鹽(HBTU)*379.25 1.5 33.6 12.7 --二異丙基乙胺(DIEA)*129.25 1.5 33.6 4.35.8N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)*-- -- -- -- 225二氯甲烷(DCM)*-- -- -- -- 7520％哌啶/NMP*-- -- -- -- 2×250用于沖洗的NMP*-- -- -- -- 250(每次洗滌)三氟乙醇 -- -- -- -- 30用于裂解的DCM -- -- -- -- 240乙醇，變性 -- -- -- -- 300,100水 -- -- -- -- 300,1501％三氟乙酸(TFA)的DCM -- -- -- -- 2×250吡啶 79.10 -- -- -- 2×2.5*每個偶合循環(huán)理論產(chǎn)量48.9g 預(yù)期收率85-90％方法用33.0g Fmoc-Trp(Boc)-2-氯代三苯甲基樹脂、所需要的Fmoc-保護(hù)氨基酸和以上材料部分所示材料，重復(fù)以上7.1部分中給出的實施例中所用的方法。
在最后一個偶合反應(yīng)后，用4×250mL(7.5體積)NMP洗滌所述樹脂，然后用4×250mL(7.5體積)DCM洗滌。
用300mL(約10體積)8∶1∶1 DCM∶TFE∶HOAc溶液處理2小時從樹脂裂解肽。排干樹脂，并用2×250mL DCM洗滌。合并裂解溶液和洗滌液，并濃縮至約50mL體積，然后用250mL乙醇重構(gòu)。在冰浴中攪拌冷卻溶液至0-5℃。向該攪拌溶液加入125mL水沉淀產(chǎn)物。真空過濾收集固體，并用約50mL水洗滌。風(fēng)干該產(chǎn)物，獲得32.0g(65.4％)95％HPLC純的Fmoc-AA(27-35)-OH。
用2×250mL 1％TFA的DCM溶液處理所述樹脂，然后用100MLDCM洗滌樹脂。將裂解部分以與TFA體積比1∶1收集到吡啶上。濃縮合并的洗脫液和水至約50mL體積。向該溶液中加入100mL乙醇后再加入150mL水。真空過濾產(chǎn)物淤漿獲得第二收獲產(chǎn)物10.7g(21.9％)(95％HPLC純)，獲得的合并總收獲率為87.3％。因為其更有效而體積較小，所以優(yōu)選1％TFA/DCM裂解。柱Phenomenox Jupiter C5,300_,5μ流速0.75mL/min檢測UV,260nm流動相A:0.05％TFA水溶液B:0.1％TFA的1∶1 IPA∶MeOH，在10分鐘內(nèi)梯度為70％B-97％B保留時間約25分鐘8．實施例液相合成肽片段在下文的8.1-8.11部分中提供液相合成表1、2和/或3所列的肽中間體的實例。
8.1通過偶合谷胺酰胺的對硝基芐酯(OPNB)與Fmoc-AA9-15OH制備片段Fmoc-AA9-16OPNB結(jié)構(gòu)Fmoc-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB(SEQ ID NO:7)
C129H141N13O22MW2227.65材料MWeq mmoleg mLFmocAA9-15OH 1963.3919.719 --HBrGlnOPNB(BaChem.#509709) 362.19 1.1 10.6 3.85 --HOAT 1361.1 10.6 1.45 --HBTU 379.25 1.1 10.6 4.04 --EtPr2N(d=0.755) 129.25 2.1 20.3 2.62 3.48NMP -- ---- -- 2000.5N HCl -- ---- -- 250乙酸乙酯 -- ---- -- 250己烷 -- ---- -- 250理論產(chǎn)量21.5g 預(yù)期收率90-105％方法將FmocAA9-15OH(在以上7.2部分中合成)、HBrGlnOPNB、HOAT和EtPr2N合并在一個含有磁性攪拌棒的1L圓底燒瓶中，并加入NMP(200mL)。將生成的溶液置于氮氣氛下，并攪拌冷卻至0-5℃。向該冷卻溶液中加入HBTU。在0-5℃下攪拌該溶液15分鐘，去除冰浴，繼續(xù)攪拌2.5小時(注釋1)。
將反應(yīng)化合物冷卻至0-5℃，并加入0.5N鹽酸水溶液(250mL)，沉淀所保護(hù)的肽。真空過濾收集固體，并在過濾瓶中干燥獲得24g粗品FmocAA9-16OPNB。將該固體溶解于乙酸乙酯(250mL)中，經(jīng)硫酸鎂(10g)干燥，過濾并濃縮至100mL體積。將該溶液冷卻至0-5℃，加入己烷(250mL)沉淀所述肽。真空過濾收集固體，并干燥獲得21.5g FmocAA9-16OPNB，收率100％,91-94％HPLC純(注釋2)。注釋1．用薄層層析(TLC)進(jìn)行生產(chǎn)過程控制90/10氯仿/乙醇
UV，碘檢測Rt FmocAA9-15OH0.46Rt FmocAA9-16OPNB 0.572．Phenomenox JupiterC5,5μ,300A0.75mL/min,260nmA水/0.05％TFAB50％IPA/MeOH/0.05％TFA，在10分鐘內(nèi)70-97％B,97％B8分鐘。
保留時間13.3分鐘8.2制備鹽酸HAA9-16OPNB片段結(jié)構(gòu)HCl H-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB(SEQ ID NO:7)C144H132ClN13O20MW 2041.02材料 MWeqmmoleg mLFmocAA9-16OPNB 2227.65 19.43 21--哌啶 -- ---- --10THF -- ---- --190甲基叔丁基醚(MTBE)-- ---- --250己烷 -- ---- --350甲醇 -- ---- --1500.5NHCl -- ---- --1002-丙醇-- ---- --50理論產(chǎn)量19.2g預(yù)期收率85-105％方法在一個含有磁性攪拌棒的1L圓底燒瓶中加入FmocAA9-16OPNB(在以上8.1部分中合成)和20∶1四氫呋喃/哌啶。將生成的溶液在氮氣氛下于室溫攪拌60分鐘(注釋1)。加入己烷(350mL)沉淀所述肽。從粘性固體傾析所述溶劑。用MTBE(200mL)在室溫下研制固體18小時。真空過濾收集固體，干燥獲得18.9g HAA9-16OPNB(注釋2)。
將所述固體溶解于甲醇(150mL)中，攪拌冷卻至0-5℃。加入0.5N鹽酸水溶液(100mL)沉淀所述肽。真空過濾收集固體，用水(50mL)然后用2-丙醇(50mL)洗滌，干燥獲得17.7g鹽酸HAA9-16OPBN，收率92％,92A％HPLC純(注釋3)。注釋1．用HPLC進(jìn)行生產(chǎn)過程控制Phenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.75mL/min,260nmA水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分鐘內(nèi)70-97％B,97％B8分鐘保留時間FmocAA9-16OPNB,13.3分鐘；HAA9-16OPNB,10.7分鐘2．此時分離的HAA9-16OPNB含有痕量哌啶和芐基富烯哌啶加合物。在與RAA1-8OH偶合前均去除。3．Phenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.75mL/min,260nmA 水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分鐘內(nèi)80-100％B,100％B5分鐘保留時間HAA9-16OPNB,7.2分鐘TLC條件90/10二氯甲烷/乙醇UV，碘檢測
Rf:HAA9-16OPNB,0.648.3通過液相偶合片段AcAA1-8OH和HAA9-16OPNB制備片段AcAA1-160PNB結(jié)構(gòu)Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB(SEQ ID NO:4)C194H246N23O34MW3427.43材料 MWeq mmoleg mLAcAA1-8OH 1440.861.3 0.130.186 --鹽酸HAA9-16OPNB 2041.021 0.100.204 --HBTU379.25 1.1 0.110.042 --HOAT136.1 1.1 0.110.015 --EtPr2N129.25 2.1 0.210.027 0.036DMF ---- -- --4.5DMSO ---- -- --0.5水---- -- --7MTBE ---- -- --3.5理論產(chǎn)量0.38g 預(yù)期收率85-105％方法在25mL含有磁性攪拌棒的圓底燒瓶中加入AA1-80H(在以上7.1部分中合成)、鹽酸HAA9-16OPNB(在以上8.2部分中合成)和HOAT。將所述固體溶解于含有EtPr2N的9∶1 DMF∶DMSO(5mL)，然后在氮氣氛下冷卻至0-5℃(注釋1)。向冷卻的溶液中加入HBTU。在0-5℃攪拌反應(yīng)混合物15分鐘，然后溫?zé)嶂潦覝兀贁嚢?0分鐘(注釋2)。加入水(7mL)從所述溶液中沉淀肽。真空過濾收集固體，用水(10mL)洗滌，并干燥獲得0.36g粗品AcAA1-16OPNB。在室溫下用MTBE(3.5mL)研制所述固體1.5小時，真空過濾收集，并干燥獲得0.335g AcAA1-16OPNB，收率88％,82％HPLC純(注釋3)。注釋1．重要的是在冷卻至0-5℃和加入HBTU之前所有固體在溶液中。2．生產(chǎn)過程控制，TLC,HPLCPhenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.75mL/min,260nmA 水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分鐘內(nèi)80-100％B,100％B 5分鐘。保留時間HAA9-16OPNB,7.2分鐘(Ac1-8OH在260nm的吸光度為0)。
保留時間AcAA1-16OPNB,12.45分鐘TLC條件90/10氯仿/乙醇UV,碘檢測Rf:HAA9-16OPNB,0.64Rf:Ac1-8OH,0.35Rf:Ac1-16OH,0.483．Phenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.75mL/min,260nmA 水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分鐘內(nèi)70-97％B,97％B 8分鐘保留時間Ac1-16OPNB,16.4。
8.4通過液相偶合片段FmocAA1-8OH和鹽酸HAA9-16OPNB制備片段FmocAA1-16OPNB結(jié)構(gòu)Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB(SEQ ID NO:4)C207H253N23O34MW3607.49材料 MWeqmmoleg mLFmocAA1-8OH 1620.921 7.84 12.7 --鹽酸HAA9-16OPNB 2041.021 7.84 16.0 --HBTU 379.25 1.2 9.42 3.57 --HOAT 136.1 1.2 9.42 1.28 --EtPr2N(d=0.755) 129.25 2.5 19.6 2.55 3.36DMF-- -- -- -- 25010％氯化鈉/水(重量/體積) -- -- -- -- 450甲醇 -- -- -- -- 200水 -- -- -- -- 100理論產(chǎn)量28.3g 預(yù)期收率85-100％方法在1L含有磁性攪拌棒的圓底燒瓶中加入FmocAA1-8OH(在以上7.1部分中合成)、鹽酸HAA9-16OPNB(在以上8.2部分中合成)、HOAT和DMF(250mL)。向所述溶液中加入EtPr2N。將該溶液冷卻至0～5℃并加入HBTU。在0-5℃攪拌反應(yīng)混合物15分鐘，然后溫?zé)嶂潦覝?，再攪?0分鐘(注釋1)。將反應(yīng)混合物冷卻至0-5℃，并加入10％氯化鈉/水(200mL)沉淀所述肽。真空過濾收集固體，用水(50mL)洗滌，并干燥獲得27g粗品FmocAA1-16OPNB。將該固體溶解于甲醇(200mL)中，并加入氯化鈉水溶液(10％重量/體積，300mL)的攪拌溶液中。真空過濾收集固體，用水(50mL)洗滌，干燥獲得26gFmocAA1-16OPNB，收率92％,90A％HPLC純(注釋1)。注釋1．生產(chǎn)過程控制，HPLCPhenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.75mL/min,260nmA水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分鐘內(nèi)80-100％B,100％B 5分鐘。保留時間HAA9-16OPNB,7.2分鐘，F(xiàn)mocAA1-8OH,7.9分鐘。保留時間FmocAAl-16OPNB,14.5分鐘8.5制備片段H-AA1-16OPNB結(jié)構(gòu)H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB(SEQ IDNO:4)C192H243N23O32MW3384.41材料MW eq mmoleg mLFmocAAl-16OPNB3607.491 0.281.0--哌啶 -- -- -- --0.6二氯甲烷 -- -- -- --11.4己烷 -- -- -- --45理論產(chǎn)量0.94g 預(yù)期收率90-105％方法在50mL含有磁性攪拌棒的圓底燒瓶中加入FmocAA1-16OPNB(在以上8.4部分中合成)、二氯甲烷(11.4mL)和哌啶(0.6mL)。將該溶液在室溫氮氣氛下攪拌90分鐘(注釋1)。將己烷(45ml)加入反應(yīng)混合物中，并經(jīng)真空蒸餾將所述溶劑體積減少至25mL。真空過濾收集生成的固體，干燥獲得0.96g HAA1-16OPNB，收率102％。HLPC分析所述固體表明72A％HAA1-16OPNB和18A％富烯和哌啶-富烯加合物。注釋1．Phenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.8mL/min,260nmA 水/0-05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分鐘內(nèi)80-100％B,100％B 5分鐘。
保留時間FmocAA1-16OPNB,14.1分鐘保留時間HAA1-16OPNB,11.6分鐘保留時間富烯和哌啶-富烯加合物，5.5和4.8分鐘。
8.6通過乙酰化HAA1-16OPNB的N-末端制備片段Ac-AA1-16OPNB結(jié)構(gòu)Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB(SEQ IDNO:4)
C194H246N23O34MW3427.43材料MW eq mmoleg mLHAA1-16OPNB 3384.41 1 0.280.95--乙酸酐(d=1.08) 102.09 3 0.840.086 0.080吡啶(d=0.978)79.13 0.840.670.068DMF -- -- -- --10水-- -- -- --30MTBE -- -- -- --10己烷 -- -- -- --10理論產(chǎn)量0.96g 預(yù)期收率80-100％方法在50mL含有磁性攪拌棒的圓底燒瓶中加入HAA1-16OPNB(在以上8.5部分中合成)、DMF(10mL)、乙酸酐和吡啶。將該反應(yīng)混合物在室溫氮氣氛下攪拌60分鐘(注釋1)。加入水(20mL)沉淀所述肽。真空過濾收集固體，用水(10mL)洗滌，干燥獲得0.87g AcAA1-16OPNB。為了去除殘余富烯和哌啶富烯加合物，在室溫下用1∶1MTBE/己烷(20mL)研制所述固體4.5小時。真空過濾收集固體，干燥獲得0.82g AcAA1-16OPNB，收率85％，高于90A％HPLC純(注釋1)。注釋1．生產(chǎn)過程控制，HPLCPhenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.8mL/min,260nmA 水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分鐘內(nèi)80-100％B,100％B 15分鐘。保留時間HAA1-16OPNB,11.6分鐘保留時間AcAA1-16OPNB,12.1分鐘TLC,10％乙醇的二氯甲烷UV，碘檢測RfAcAA1-16OPNB,0.698.7在存在His(trt)下從AcAA1-16OPNB選擇性去除對硝基芐基保護(hù)基團(tuán)制備片段AcAA1-16OH結(jié)構(gòu)Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH(SEQID NO:4)C187H241N22O32MW 3276.4材料 MW eq mmoleg mLAcAA1-16OPNB3424.861 0.23 0.80--10％Pd/C,Degussa,50％水 ---- -- 0.30--甲酸銨 63.06 15 3.5 0.22--DMF ---- -- -- 15水 ---- -- -- 120乙酸乙酯 ---- -- -- 100己烷 ---- -- -- 44甲醇 ---- -- -- 10飽和氯化鈉水溶液 ---- -- -- 5MTBE ---- -- -- 4理論產(chǎn)量0.76g預(yù)期收率70-85％方法在25mL含有磁性攪拌棒的圓底燒瓶中加入AcAA1-16OPNB(在以上8.6部分中合成)和DMF(10mL)。向該溶液中加入甲酸銨水溶液(0.5mL)，然后加入濕的披鈀炭(Degussa,10％,50％水)。將該淤漿在室溫氮氣氛下攪拌120分鐘(注釋1)。使該淤漿通過一個緊密裝填的C鹽床過濾到90mL水中。用DMF(5mL)洗滌濾餅。用乙酸乙酯(100mL)洗滌水懸浮液。然后濃縮乙酸乙酯至20mL體積(注釋2)。加入己烷(40ml)完成所述沉淀，從固體傾析所述溶劑。將所述固體溶解于甲醇(10mL)中，加入4∶1水/飽和氯化鈉水溶液(25mL)沉淀所述肽。真空過濾收集固體，用水(10mL)洗滌，干燥獲得0.62gAcAA1-16OH。用50％MTBE/己烷(8mL)在室溫下將所述固體研制15小時，收集固體，干燥獲得0.59g AcAA1-16OH，收率77％，90A％HLP純(注釋3)。注釋1．生產(chǎn)過程控制，HPLC80/20二氯甲烷/乙醇UV,碘檢測Rf:AcAA1-16OPNB,0.90Rf:Ac1-16OH,692．隨著所述溶劑體積的減少可以開始沉淀AcAA1-16OH。3．Phenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.8mL/min,260nmA 水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分鐘內(nèi)80-100％B,100％B 5分鐘。
保留時間AcAA1-16OH,10.73分鐘8.8通過液相偶合FmocAA27-35OH與HPheNH2制備片段FmocAA27-36NH2結(jié)構(gòu)Fmoc-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2(SEQ ID NO:18)C130H159N16O24MW 2329.64材料 MWeq mmolegmLFmocAA27-35OH 2182.611 18.440.2 --HPheNH2162.21 1.222.13.6HBTU 379.25 1.222.18.4HOAT 136.1 1.222.13.0EtPr2N(d=0.755) 129.25 2.138.75.0 6.6DMF 500理論產(chǎn)量42.8g預(yù)期收率90-105％方法在2L含有磁性攪拌棒的圓底燒瓶中加入FmocAA27-35OH(在以上7.6部分中合成)、HOAT、HpheNH2和DMF(500mL)。加入EtPr2N，將該溶液冷卻至0-5℃，然后加入HBTU。將反應(yīng)混合物在0-5℃攪拌15分鐘，然后溫?zé)嶂潦覝?，再攪?0分鐘(注釋1)。將該溶液冷卻至0-5℃，加入水(500mL)沉淀所述肽。真空過濾收集固體，用水(100mL)洗滌，干燥獲得43g FmocAA27-36NH2，收率100％，93A％HLPC純(注釋2)。注釋1．生產(chǎn)過程控制，TLC88/12二氯甲烷/甲醇UV，碘檢測Rf:FmocAA27-35OH,0.49Rf:FmocAA27-36NH2,0.632．Phenomenex Jupiter,C18,5μ,300A1.0mL/min,260nmA 水/0.1％TFAB ACN在20分鐘內(nèi)75-99％B,99％B 5分鐘。保留時間29.4分鐘8.9制備片段H-AA(27-36)-NH2結(jié)構(gòu)H-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-NH2(SEQ ID NO:17)C115H148N16O22MW 2106.56材料MW eqmmole g mLFmocAA(27-36)-NH22328.8 1.09.3 21.7--哌啶 85.155.046.6 4.04.6二氯甲烷(DCM) -- -- -- -- 100水-- -- -- -- 2×100甲基叔丁基醚(MTBE)-- -- -- -- 100+30理論產(chǎn)量19.6g 預(yù)期收率85-95％方法在250mL配有磁性攪拌器和氮氣層的圓底燒瓶中加入在以上8.8部分中合成的Fmoc-片段、二氯甲烷(約5體積)和哌啶。將所獲得的溶液在室溫下攪拌1.5小時(注釋1)。
用2×100mL水洗滌所述溶液。分離各層，真空濃縮有機(jī)層至約原體積的一半。分批加入2×50mLMTBE，同時繼續(xù)濃縮以去除DCM至出現(xiàn)大量沉淀和終罐體積約150mL時為止。
在0～5℃冰浴中攪拌并冷卻所述產(chǎn)物淤漿約1小時。真空過濾分離固體，用2×15mL MTBE洗滌。風(fēng)干所述產(chǎn)物，獲得17.6g(89.6％)H-AA(17-36)NH2,95％HPLC純(注釋2)。注釋1．HPLC監(jiān)測反應(yīng)完成情況柱Phenomenox Jupiter C18；300_；5μ流速1mL/min檢測UV,260nm流動相A:0.1％TFA水溶液B:0.1％TFA的乙腈在20分鐘內(nèi)的梯度為75％B-99％B保留時間約18分鐘2．在處理中都有效去除了Fmoc副產(chǎn)物和二苯并富烯及其哌啶加合物；但是，所述物質(zhì)在投入使用前應(yīng)進(jìn)行使用試驗。如果所述物質(zhì)不能通過使用試驗，則通過溶解所述固體于DCM(5體積)中重復(fù)所述處理步驟，然后繼續(xù)上述的方法。
8.10通過液相偶合FmocAA17-26OH與HAA27-36NH2制備片段FmocAA17-36NH2結(jié)構(gòu)Fmoc-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2(SEQ ID NO:12)C242H313N29O46MW 4364.38材料 MW eq mmole g mLFmocAA17-26OH 2275.821 9.5 21.6HAA27-36NH22106.561 9.5 20HOAT 136.1 1.211.4 1.55HBTU 379.25 1.211.4 4.33EtPr2N(d=0.755) 129.25 2 19.0 2.46 3.25DMF 400水6002-丙醇1100理論產(chǎn)量41.5g預(yù)期收率80-85％方法在2L含有磁性攪拌棒的圓底燒瓶中加入FmocAA17-26OH(在以上7.5部分中合成)、HAA27-36NH2(在以上8.9部分中合成)、HOAT和DMF(400mL)。加入EtPr2N，將該攪拌溶液在氮氣氛下冷卻至0-5℃，加入HBTU。將反應(yīng)混合物在0-5℃攪拌15分鐘，然后溫?zé)嶂潦覝?，再攪?.5小時(注釋1)。向該反應(yīng)混合物中加入水(500mL)沉淀所述肽(注釋2)。攪拌所生成的淤漿45分鐘，真空過濾收集固體，用水(100mL)洗滌并干燥。將所述固體返回含有磁性攪拌棒的2L圓底燒瓶中，加入60℃2-丙醇(1.1L)。在所述淤漿冷卻至室溫的同時在氮氣氛下攪拌(過夜)。真空過濾收集固體，干燥獲得37.5gFmocAA17-36NH2，收率90％,95.5A％HLPC純(注釋1)。注釋1．生產(chǎn)過程控制，HPLCPhenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.75mL/min,260nmA 水/0.05％TFA
B 50％IPA/MeOH/0.05％ TFA在10分鐘內(nèi)80-100％B,100％B 25分鐘。
保留時間FmocAA17-26OH,8.2分鐘，HAA26-36NH2,8.4分鐘保留時間FmocAA17-36NH2,13.3分鐘2．當(dāng)加入水時將所述反應(yīng)混合物溫?zé)嶂?8℃。8.11制備片段H-AA(17-36)-NH2結(jié)構(gòu)H-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-NH2(SEQ ID NO:19)C227H303N29O44HCl材料 MW eq mmole g mLFmocAA(17-36)-NH24364.361.05.2 22.5 --5N NaOH(ag) -- -- -- --55四氫呋喃(TFH) -- -- -- --1701N HCl -- -- -- --13飽和氯化鈉(水溶液) -- -- -- --2×55庚烷-- -- -- --3×25+50,200+50理論產(chǎn)量21.6g 預(yù)期收率95-100％方法向配有空氣攪拌器和氮氣層的250mL圓底燒瓶中加入在以上8.10部分中合成的Fmoc-片段、THF(約7.5體積)和5 N NaOH(約2.5體積)。將所獲得的兩相溶液在室溫下攪拌10-15分鐘(注釋1)。
分離各層，用1N HCl將有機(jī)相調(diào)節(jié)至pH2-3。然后用2×55mL(2.5體積)飽和鹽水溶液洗滌所述溶液(注釋2)。分離各層，在15-20℃真空下濃縮有機(jī)層至約1/2原體積。分批加入3×25mL庚烷，同時繼續(xù)濃縮以去除THF至出現(xiàn)大量沉淀和終罐體積約100mL時為止(注釋2)。
在室溫下攪拌所述產(chǎn)物淤漿約2小時。真空過濾分離固體，用約50mL庚烷洗滌。風(fēng)干所述產(chǎn)物，獲得21.0g(97.5％)H-AA(17-36)NH2。
可進(jìn)行再加工去除殘余的二苯并富烯副產(chǎn)物。在200mL庚烷中于室溫下淤漿所述產(chǎn)物3小時。過濾所述物質(zhì)，用約50mL庚烷洗滌，風(fēng)干獲得產(chǎn)物20.8g(96.6％)，超過95％HPLC純。注釋1．HPLC監(jiān)測反應(yīng)完成情況柱ZorbaxLPC8；1OOA；2011流速1mL/min檢測UV,260nm流動相A:0.1％TFA水溶液B:0.1％TFA的1∶1 ACN∶IPA在20分鐘內(nèi)的梯度為80％B-99％B保留時間約18分鐘2．所述固體最初沉淀為仍可攪拌的蠟狀膠，進(jìn)一步濃縮研制為可過濾固體。
9．實施例合成全長T-20肽在下文9.1-9.5部分給出的是利用所述肽中間體片段生產(chǎn)全長T-20肽的實施例。
在本部分給出的實施例證實成功聯(lián)用固相和液相合成技術(shù)由肽中間體片段生產(chǎn)全長T-20肽。
9.1通過液相偶合AcAA1-16OH與HAA17-36NH2制備片段AcAA1-36NH2在此描述的合成路線代表最好的圖1和3圖解的T-20四片段法。在其中AcAA1-16OH通過固相技術(shù)合成的情況下，采用圖1的方法，在其中AcAA1-16OH通過液相技術(shù)合成的情況下，采用圖3的方法。注意在此合成的T-20全長肽具有在其氨基末端具有乙?；揎?即“X”)而在其羧基末端具有酰胺修飾(即“Z”)的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。結(jié)構(gòu)Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2(SEQ ID NO:1)C414H543N51O74MW7411.95材料 MW eq mmoleg mLAcAA1-1OH 3276.410.240.79鹽酸HAA17-36NH24178.56 10.241.0HOAT 136.1 1.1 0.260.036HBTU 379.251.0 0.950.25EtPr2N(d=0.755) 129.252.8 0.670.087 0.115DMF 20水 25飽和氯化鈉 5MTBE 10己烷 10理論產(chǎn)量1.77g 預(yù)期收率85-100％方法在100mL含有磁性攪拌棒的圓底燒瓶中加入AcAA1-16OH(在以上7.4部分通過固相技術(shù)或在以上8.7部分通過液相技術(shù)合成)、HOAT、DMF(20mL)，然后加入EtPr2N(0.074mL)。在氮氣氛下將溶液冷卻至0-5℃，加入HBTU。在0-5℃攪拌溶液15分鐘，加入鹽酸HAA17-36NH2(在上文8.11部分中合成)，再加入0.041mlEtPr2N。去除冷卻浴，攪拌反應(yīng)混合物2小時(注釋1)。加入水(25mL)和飽和氯化鈉水溶液(5mL)沉淀所述肽。真空過濾收集固體，用水(10mL)洗滌，干燥獲得1.74g粗品AcAA1-36NH2(注釋2)。在室溫下用MTBE/己烷研制所述固體2.5小時，真空過濾收集固體，干燥獲得1.70g產(chǎn)物，收率96％,92A％HPLC純。注釋1．生產(chǎn)過程控制，HPLCPhenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.8mL/min,260nmA 水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分鐘內(nèi)80-100％B,100％B 15分鐘。保留時間AcAA1-16OH,11.8分鐘。保留時間HCl HAA17-36NH2,12.7分鐘。保留時間AcAA1-36NH2,22.9分鐘。2．水流出物產(chǎn)生非常精細(xì)的沉淀。可能需要兩次過濾。
9.2通過液相偶合FmocAA1-16OH與HAA17-36NH2制備片段FmocAA1-36NH2(T-20)在本部分給出的實施例證實成功聯(lián)用固相和液相合成技術(shù)由肽中間體片段生產(chǎn)T-20肽。在此描述的合成路線特別代表圖4描述的至該圖中合成FmocAA1-36NH2時的T-20三片段法，。結(jié)構(gòu)Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2(SEQ ID NO:1)C427H551N51O75MW7593.01材料 MW eq mmole g mLFmocAA1-16OH 3453.89 1 0.12 0.41鹽酸HAA17-36NH24174.88 1 0.12 0.50HOAT 136.1 1.250.15 0.020HBTU 379.251.250.15 0.057EtPr2N(d=0.755) 129.252.5 0.30 0.039 0.051DMF 10水182-丙醇14理論產(chǎn)量0.91g預(yù)期收率85-100％萬法在25mL含有磁性攪拌棒的圓底燒瓶中加入FmocAA1-16OH(在以上7.3部分中合成)、HCl HAA17-36NH2(在以上8.11部分中合成)、HOAT、DMF(10mL)，然后加入EtPr2N。在氮氣氛下將溶液冷卻至0-5℃，加入HBTU。在0-5℃攪拌反應(yīng)混合物15分鐘，然后溫?zé)嶂潦覝夭嚢?.5小時(注釋1)。加入水沉淀肽，真空過濾收集固體并干燥。用2-丙醇(14mL)在室溫下研制所述固體15小時，然后加入水(3mL)從所述溶液分離所需要的產(chǎn)物。真空過濾所述固體，干燥獲得0.80g FmocAA1-36NH2，收率88％,85A％HPLC純。注釋1．生產(chǎn)過程控制，HPLCPhenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.8mL/min,260nmA 水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分鐘內(nèi)80-100％B,100％B 15分鐘。
保留時間FmocAA1-16OH,11.4分鐘。
保留時間HCl HAA17-36NH2,12分鐘。
保留時間FmocAA1-36NH2,20.4分鐘。
TLC,9/1二氯甲烷/乙醇UV,碘檢測Rft:FmocAA1-36NH2,0.719.3制備片段HAA1-36NH2(T-20)在本部分給出的實施例證實成功聯(lián)用固相和液相合成技術(shù)由肽中間體片段生產(chǎn)T-20肽。在此描述的合成路線特別代表圖4描述的至該圖中合成H-AA1-36NH2時的T-20三片段法。結(jié)構(gòu)H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Ieu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2(SEQ ID NO:1)C412H541N51O73MW7370.94材料 MW eqmmoleg mLFmocAA1-36NH27593.011 0.105 0.80哌啶 0.5DMF 9.5水20飽和氯化鈉水溶液 5MTBE 5己烷 5理論產(chǎn)量0.77g 預(yù)期收率85-95％方法
在25mL含有磁性攪拌棒的圓底燒瓶中加入FmocAA 1-36NH2(在以上9.2部分中合成)、DMF(9.5mL)和哌啶(0.5mL)。在室溫氮氣氛下攪拌該溶液2小時(注釋1、2)。加入水(20ml)和飽和氯化鈉水溶液(5mL)沉淀所述保護(hù)肽。真空過濾收集固體，干燥獲得0.77g污染有富烯和哌啶-富烯加合物的HAA1-36NH2。在室溫下用50％MTBE/己烷研制所述固體15小時，去除富烯和哌啶-富烯加合物。真空過濾固體，干燥獲得0.73g HAA1-36NH2，收率95％,90A％HPLC純。注釋1．生產(chǎn)過程控制，HPLCPhenomenex Jupiter,C5,5μ,300A0.8mL/min,260nmA 水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分鐘內(nèi)80-100％B,100％B15分鐘。保留時間FmocAA1-36OH,20.4分鐘。保留時間HCl HAA1-36NH2,19.9分鐘。保留時間富烯和哌啶-富烯加合物，5分鐘。TLC,9/1二氯甲烷/乙醇UV,碘檢測Rt:FmocAA1-36NH2,0.712．所述產(chǎn)物和原料在TLC或反相HPLC上完全分開。通過觀測富烯和哌啶-富烯加合物跟蹤產(chǎn)物組成。9.4通過N-末端乙酰化HAA1-36NH2制備片段AcAA1-36NH2(T-20)在本部分給出的實施例證實成功聯(lián)用固相和液相合成技術(shù)由肽中間體片段生產(chǎn)T-20肽。在此描述的合成路線特別代表圖4描述的至該圖中合成Ac-AA1-36NH2時的T-20三片段法。結(jié)構(gòu)Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2(SEQ ID NO:1)C414H543N51O74MW7411.95材料 MW eq mmole gmLHAA1-36NH27370.94 1 0.096 0.71乙酸酐(d=1.08) 102.093 0.29 0.0290.027吡啶(d=0.978)79.1 6 0.58 0.0460.046DMF 10水 17.5飽和氯化鈉水溶液 7.5理論產(chǎn)量0.71g預(yù)期收率85-100％方法在25mL含有磁性攪拌棒的圓底燒瓶中加入HAA1-36NH2(在以上9.3部分中合成)、DMF(10mL)、吡啶(0.046mL)和乙酸酐(0.027mL)(注釋1)。在室溫氮氣氛下攪拌該溶液4小時(注釋2)。加入水(7.5ml)和飽和氯化鈉水溶液(5mL)沉淀所述保護(hù)肽。真空過濾收集固體，用水(10mL)洗滌，干燥獲得0.65g AcAA1-36NH2，收率91％,90A％HPLC純(注釋3)。注釋1．對于該反應(yīng)也可以用二氯甲烷作溶劑。2．生產(chǎn)過程控制，HPLCPhenomenex Jupiter,C5,5μ,300A
0.8mL/min,260nmA 水/0.05％TFAB 50％IPA/MeOH/0.05％TFA在10分鐘內(nèi)80-100％B,100％B 15分鐘。
保留時間HAA1-36OH,23.3分鐘。
保留時間AcAA1-36NH2,22.7分鐘。3．所述產(chǎn)物和原料在TLC或反相HPLC上不能完全分開。9.5通過側(cè)鏈去保護(hù)AcAA1-36NH2制備T-20肽在本部分給出的實施例證實成功聯(lián)用固相和液相合成技術(shù)由肽中間體片段生產(chǎn)T-20肽。在此描述的合成路線特別代表圖4所示的T-20三片段法。結(jié)構(gòu)Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2(SEQ ID NO:1)C414H543N51O74MW4492.1材料 MW eq mmole g mLAcAA1-36NH27411.951 0.035 0.26三氟乙酸 2.25水15.1二硫蘇糖醇0.12MTBE 170乙腈 15理論產(chǎn)量157mg預(yù)期收率25-50％方法用氮氣對90∶5∶5(v/v/wt％)三氟乙酸/水/二硫蘇糖醇溶液脫氣，并冷卻至0-5℃。向該冷卻溶液中加入AcAA1-36NH2(在以上9.4部分中合成)。在0-5℃攪拌所述淤漿直到所述固體溶解(約5分鐘)，然后溫?zé)嶂潦覝?，攪?.5小時。將該溶液加入0-5℃MTBE(70mL)中沉淀所述肽。以2200rpm離心旋轉(zhuǎn)淤漿5分鐘，從所述固體傾析MTBE。將所述固體再懸浮于MTBE(50mL)中，以rpm離心旋轉(zhuǎn)5分鐘，傾析MTBE。重復(fù)該過程一次，然后將固體溶解于含有1％(體積)乙酸的1∶1水/乙腈(30mL)中，在室溫下保存24小時(注釋1)。將該溶液冷凍，然后用冷凍干燥器冷凍干燥獲得155mg粗品T-20。經(jīng)制備型HPLC純化產(chǎn)生55mg全長T-20肽，95A％HPLC純(注釋2)。注釋1．快速去除Trp(Boc)的tBu側(cè)鏈，留下TrpCOOH。在乙酸水溶液中于室溫下TrpCOOH的脫羧需要至少24小時。2．制備型HPLC2”YMC,120A,10μ,C18220nm,50mL/minA 水/0-1％TFAB ACN/0.1％TFA39-49％B/40分鐘10．實施例純化T-20肽在此給出的實施例描述可在整體上明顯增加肽純化的條件下純化T-20和T-20樣肽的方法。材料使用的柱20×30cm，裝填有Amberchrom CG-300S(Tosohaus；Montgomeryville,PA)35μm顆粒。緩沖液的制備緩沖液A=用氫氧化銨將pH調(diào)節(jié)至8.5的100mM乙酸銨。
緩沖液B=乙腈。1．用約6柱體積20％B平衡柱。2．將T-20以每克肽50-100mL 85％A/15％B溶解。用2M碳酸鉀調(diào)節(jié)pH至8-10。在T-20樣品中乙腈濃度不大于15-20％。3．T-20溶液以500mL/分鐘上柱，同時監(jiān)測柱壓力。4．T-20溶液上柱后，將3倍柱體積(10L)85％A/15％B溶液上柱，以洗出層析譜線。5．在303nm監(jiān)測柱洗出液，在整個上柱期間收集洗出液。在層析期間調(diào)整波長或衰減使峰值有一定高度。吸光度是波長和測量杯光程長度的函數(shù)。6．如下開始梯度操作(每小時變化1.6％B)，并在整個層析期間監(jiān)測壓力。
時間(分鐘) ％B 流速(mL/min)015 330788 36 3307．當(dāng)主峰開始洗出時收集10分鐘流分(3.3L)。所有T-20應(yīng)該用35％B洗脫。平均收集35-40個流分。將流分貯存于0-5℃直到進(jìn)行合并流分的測定時為止。8．收集流分直到檢測器吸光度小于0.1AU或在主峰洗出后達(dá)到主要拐點時為止。9．用分析型反相HPLC監(jiān)測每個流分的純度。結(jié)果T-20肽在pH大于7時溶解性更高。一般用于純化肽的柱載體是硅基載體，所以只能在低pH范圍使用，因為硅基支持物在較高pH范圍時趨向于溶解。
在此描述的方法使用在寬pH范圍(pH1-14)下穩(wěn)定的聚苯乙烯基樹脂載體。該方法顯著增加柱容量，T-20上樣量從10g增加到高達(dá)250-450g(對于8”直徑×30cm柱)。
11．實施例大規(guī)模合成和純化T-20肽載荷樹脂可以以1.2mmole/g原料樹脂或更高水平將FmocTrp(Boc)OH加樣到非?；顫姷?-CTC樹脂上。當(dāng)載荷水平高于每g原料樹脂1.1mmole FmocTrp(Boc)OH(＞0.72mmol/g載荷樹脂)時，對于片段的最后三個氨基酸難以獲得陰性茚三酮試驗。同樣，當(dāng)FmocLeuO-樹脂載荷量大于0.85mmole/g時難以構(gòu)建FmocAA17-26O-樹脂，而當(dāng)FmocGlnOH-樹脂載荷量大于0.75mmole/g時難以構(gòu)建AcAA1-16O-樹脂。
當(dāng)從銷售商獲得所述樹脂時，對每個將裝載的氨基酸用約1g2-CTC樹脂進(jìn)行應(yīng)用試驗。應(yīng)用試驗的目的是測定裝載時將使用的氨基酸量，以獲得所需要的載荷范圍。對于每一種使用具有0.5當(dāng)量過量DIEA的0.8、1.0和1.5當(dāng)量FmocGlnOH；1.0、1.2和1.5當(dāng)量FmocTrp(Boc)OH和0.8、1.0和1.5當(dāng)量FmocLeuOH(相對于樹脂的報告活性)。如果1mole FmocLeuOH不能載荷在1Kg2-CTC樹脂上，則不應(yīng)該從所述銷售商接受所述2-CTC。以下是描述裝載FmocLeuOH、FmocGlnOH和FmocTrp(Boc)OH的目的樹脂。
1.0-1.1mole FmocLeuOH可裝載到1Kg 2-CTC樹脂上。計及鹽酸損失量，裝載FmocLeuOH后的樹脂干重應(yīng)該1.32倍或1.35倍于原料樹脂的重量，測定的載荷量應(yīng)該為0.75-0.81mmole/g。
0.8-1.0mole FmocGlnOH可裝載到1Kg 2-CTC樹脂上。計及鹽酸損失量，裝載FmocGlnOH后的樹脂干重應(yīng)該1.27倍或1.33倍于原料樹脂的重量，測定的載荷量應(yīng)該為0.63-0.75。
0.9-1.1mole FmocTrp(Boc)OH可裝載到1Kg 2-CTC樹脂上。計及鹽酸損失量，載荷Fmoc Trp(Boc)OH后的樹脂干重應(yīng)該1.44-1.54倍于原料樹脂的重量，測定的載荷量應(yīng)該為0.63-0.72。
為了進(jìn)行準(zhǔn)確的重量增加分析，必須測定原料樹脂的干燥失重(LOD)。它不應(yīng)大于1％。如果殘余溶劑(或DIEA/HCl)在干燥期間未完全從所述樹脂去除(裝載后)，則所分離的量將較高，所測定的載荷量較低。然而，載荷的總摩爾數(shù)(質(zhì)量×測定的載荷量)應(yīng)該在上述范圍內(nèi)。對于任何所提及氨基酸來說，如果高端載荷水平(或者每Kg原料樹脂載荷的總摩爾數(shù))超過10％，則用少量氨基酸進(jìn)行使用試驗。這對FmocGlnOH特別重要。
11.1大規(guī)模制備Fmoc-AA(Boc)-2-氯代三苯甲基樹脂以下部分的目的是進(jìn)行大規(guī)模裝載適合制備大量肽的樹脂，以用于固相肽合成(SPPS)。用以下各種裝載所述樹脂F(xiàn)mocTrp(Boc)OH、FmocGln(Boc)OH和FmocLeu(Boc)OH。每種原料殘基裝載到約4Kg 2-CTC樹脂上。載荷的AA2-CTC(Kg)載荷量(Kg)取代(mmol/g)1載荷總摩爾數(shù)1FmocTrp(Boc)OH 3.7 4.493 0.56(0.56)2.52(2.52)FmocLeu(Boc)OH 2.2 2.436 1.07(0.647) 2.6(1.58)FmocGln(Boc)OH 3.65 3.856 0.55(0.52)2.12(2.0)1．第一個數(shù)是從相對于Fmoc-AA標(biāo)準(zhǔn)的基于重量的HPLC分析計算得數(shù)。括號內(nèi)的數(shù)值是計及原料2-CTC樹脂12％LOD的情況下由增加的重量計算出的數(shù)值。
原料2-CTC樹脂購自Colorado BioTech，所報告的載荷量為1.4meq/g。以3.7公斤2-CTC為原料，使用的標(biāo)準(zhǔn)裝載方法是1.5eqFmocTrp(Boc)OH、1.7eq DIEA的DCM(5體積)、室溫下2小時。這產(chǎn)生4.493Kg FmocTrp(Boc)O-樹脂，該樹脂具有在從所述樹脂裂解后通過FmocTrp(Boc)OH的重量基HPLC分析計算為0.56mmol/g(總計2.52摩爾)的載荷量。根據(jù)所述樹脂的重量增加，對于所制備的1.62摩爾總量，計算的載荷量為0.36mmol/g。然而如果計及原料2-CTC樹脂的12％LOD，則根據(jù)重量增加計算的載荷量對2.52摩爾總量同樣為0.56mmole/g，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足每4公斤樹脂4摩爾FmocTrp(Boc)OH的目標(biāo)載荷量。
采用標(biāo)準(zhǔn)載荷方法在兩次操作中由3.9Kg 2-CTC制備總量4.59Kg FmocLeuO-樹脂。
然而，所獲得的載荷量明顯低于預(yù)期載荷量。第一批在從所述樹脂裂解后根據(jù)重量基HPLC分析FmocLeuOH計算的載荷量為1.07mmol/g。這明顯是不可能的，因為計及原料2-CTC樹脂的12％LOD根據(jù)增加重量計算的載荷量為0.647mmole/g(500g)。對于1.577mole總載荷量的實際載荷量可能接近0.647mmole/g。
由1.7Kg 2-CTC制備的第二批FmocLeu-O-樹脂(2.154Kg)對于0.66mmole/g增加重量的載荷量具有的計算載荷量為0.68mmole/g。
用3.65Kg 2-CTC為原料，采用0.8eq FmocGlnOH和1eq DIEA的7體積的5/2DMF/DCM單批制備FmocGlnO-樹脂總量3.856Kg。根據(jù)重量基HPLC分析計算的取代對于2.12摩爾FmocGlnO-樹脂總量為0.55mmol/g。計及原料2-CTC樹脂的12％LOD，根據(jù)重量增加計算的載荷量對于2.0摩爾FmocGlnO-樹脂總量為0.52mmol/g。
一般來說，根據(jù)重量增加的載荷量應(yīng)當(dāng)大于或等于根據(jù)對所載荷的AA或去除的富烯的重量基HPLC分析計算的載荷量。所述原料2-CTC應(yīng)該小于1％LOD，分離的FmocAAO樹脂可能含有少量NMP、鹽和/或殘余FmocAAOH。
11.1.1大規(guī)模制備Fmoc-AA(Boc)-2-氯代三苯甲基樹脂的優(yōu)選方法FmcoTrp(Boc)OH和FmocLeuOH將空氣敏感型2-氯代三苯甲基氯樹脂(1eq,3.7Kg,5.18mole)加入SPPS室，用5體積DCM洗滌。排干溶劑，加入FmocTrp(Boc)OH或FmocLeu(Boc)OH(1.5eq)和DIEA(1.7eq)的DCM溶液(5體積)(注釋1)。攪拌淤漿2小時。排干溶劑，在所述樹脂上保留的活性部位用9∶1 MeOH∶DIEA(5體積)進(jìn)行末端封端30分鐘。排干溶劑，用6×5體積DCM洗滌樹脂。將樹脂干燥至恒重，然后取樣并分析載荷量(注釋2)。相同的方法用于裝載FmocLeuOH。FmocGluOH將空氣敏感型2-CTC(3.65Kg,1.4mmole/g)在氮氣氛下加入40LSPPS室，用DCM(5體積)洗滌。將FmocGlnOH(1.506Kg,0.8eq)、DMF(5體積)和DIEA(1.0eq)加入20L反應(yīng)器。排干SPPS室，加入DMF溶液(5體積)。用DCM(2體積)沖洗反應(yīng)器，將沖洗液加入SPPS室。在氮氣氛下在SPPS室中攪拌所述樹脂2小時，排干。在所述樹脂上保留的任何活性部位用9∶1 MeOH∶DIEA(5體積)進(jìn)行末端封端30分鐘。排干所述樹脂，用DCM(6×5體積)洗滌，并干燥至恒重(3.856Kg)。取樣樹脂并測試載荷量(注釋2)。注釋1．2-氯代三苯甲基氯樹脂對潤濕劑非常敏感。水封端所述樹脂，產(chǎn)生鹽酸。只要所述溶劑一干，則DCE和DCM之間幾乎沒有區(qū)別。2．通過從樹脂裂解Fmoc氨基酸并用定量(wt/wt)HPLC分析相對于標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，可以測定樹脂載荷量。
Phenomenex Jupiter C18,300A,Sm1mL/min,260nmA:0.1％TFA水溶液B:0.1％TFA的乙腈65％B，等梯度保留時間約8分鐘根據(jù)所述樹脂的重量增加確定載荷量可能不準(zhǔn)確，因為在干燥樹脂前使用的洗滌量可能不足以完全從樹脂去除NMP。計算如下(Fmoc-AA-OH-樹脂重量-2-CTC原料重量)/Fmoc-AA-OH-樹脂重量(所載荷AA的MW-鹽酸MW)據(jù)觀測，本發(fā)明的肽片段在DCM中的貯存時間(天)延長可明顯增加從樹脂的裂解。例如在制備FmocAA17-26OH過程中，兩次將部分構(gòu)建的片段在周末期間貯存在DCM中。在完成所述合成并從樹脂取出后，所獲得的FmocAA17-26OH收率為8％。懷疑在周末貯存期間在DCM中的痕量鹽酸從樹脂緩慢裂解部分構(gòu)建片段。
允許FmocAA17-26O-樹脂、AcAA1-16O-樹脂和FrmoAA27-35O-樹脂樣品在DCM和IPA中于室溫下貯存1周。用HPLC分析每一種的上清液。盡管未獲得定量結(jié)果，但是所有片段在DCM中基本上均從樹脂裂解，而在IPA中未觀察到裂解。如果部分構(gòu)建的片段需要貯存數(shù)天(一個周末內(nèi))，最好用NMP沖洗所述固體，排干樹脂床，讓其在氮氣氛下處于NMP飽和狀態(tài)下。
最后一次洗滌FmocLeuO-樹脂、FmocGlnO-樹脂、FmocTrp(Boc)O-樹脂、FmocAA17-26O-樹脂、AcAA1-16O-樹脂和FrmoAA27-35O-樹脂時用IPA代替DCM。將IPA飽和的FmocLeuO-樹脂、FmocGlnO-樹脂和FmocTrp(Boc)O-樹脂在40℃干燥。由在4℃干燥的載荷樹脂構(gòu)建FmocAA17-26O-樹脂、AcAA1-16O-樹脂和FrmoAA27-35O-樹脂。在完成所述合成時，用DOM然后用IPA洗凈樹脂結(jié)合片段。分離IPA飽和的樹脂結(jié)合片段，并在室溫和40℃干燥。從樹脂裂解所述片段，并用HPLC進(jìn)行分析。在片段純度方面未觀察到不同。在40℃干燥IPA飽和的樹脂結(jié)合片段不會影響所分離的片段的質(zhì)或量。
檢測與NMP/DCM相對的在DMF中SPPS的片段(在兩種溶劑體系中1g樹脂膨脹為5mL)。用DMF作溶劑、TBTU對HBTU作偶聯(lián)劑合成片段FmocAA27-35OH。分離獲得的FmocAA27-35OH得率為77％,85.5A％純。
片段FmocAA17-36NH2和AcAA1-36NH2的處理方案去除未偶聯(lián)的片段。在固相合成中在缺失部位乙酰化(封端)這些片段將保證所述缺失片段在液相偶聯(lián)中不發(fā)生偶聯(lián)。在合成FmocAA17-36NH2和AcAA1-36NH2中未偶聯(lián)的片段應(yīng)該在IPA和ACN處理中去除。
11.2大規(guī)模制備片段Ac-AA(1-16)-OH(片段3c)用SPPS大規(guī)模制備片段AcAA1-16OH，在兩次運行中由3.53KgFmocGlnOH-樹脂產(chǎn)生的樹脂結(jié)合片段總計為7.941Kg。在兩次運行中有點過高估計原料FmocGlnOH-樹脂的載荷量，根據(jù)重量基HPLC分析獲得載荷量值為0.55mmol/g，而不是計及原料2-CTC的12％LOD根據(jù)重量增加獲得的更準(zhǔn)確的0.52mmol/g。除了樹脂載荷量低于需要值外，在SPPS期間采用6％過量的每種氨基酸。
SPPS采用2.5當(dāng)量在所述樹脂上的第一種FmocGln(trt)OH和1.7當(dāng)量在所述片段中的每種后續(xù)氨基酸(以0.55mmol/g載荷量為標(biāo)準(zhǔn))。在8體積3∶1 NMP∶DCM中進(jìn)行所述偶合反應(yīng)。32個偶合反應(yīng)(包括乙?；?除了兩個外所有反應(yīng)將在2小時內(nèi)完成。所有洗滌都用5體積NMP進(jìn)行。
在3.4體積(以AcAA1-16O-樹脂的干重為標(biāo)準(zhǔn))1％TFA/DCM中于0-5℃洗滌樹脂-結(jié)合片段5-6次，每次洗滌5分鐘。將每次洗出液收集到1.36體積0.33 M碳酸氫鈉水溶液上，以中和TFA。合并三相洗出液，加入水(2體積)。蒸餾去除DCM，將可過濾沉淀留在碳酸氫鈉水溶液中。在蒸餾過程中，隨著DCM的最后去除，所述多相淤漿在崩解為(collapsing into)可過濾淤漿之前變粘呈奶油狀。將淤漿冷卻至0-5℃，用O.1N鹽酸將pH調(diào)節(jié)至3.0。在0-5℃攪拌淤漿1-2小時，過濾收集，洗滌并干燥。在余下的操作中收集固體，將其返回到所述反應(yīng)器中用水研制1-2小時，然后收集并干燥。
用1％TFA的DCM在4次操作中完成從所述樹脂裂解AcAA1-16OH。由純度為93-96A％的3.53Kg FmocGlnO-樹脂產(chǎn)生AcAA1-16OH總計為4.814Kg。根據(jù)由計及12％LOD原料2-CTC(理論值5.83Kg)重量增加測定的0.52mmol/g載荷量的總收率為83％。
AcAA1-16OH的鈉鹽不溶于DMF和NMP中，所以必需調(diào)節(jié)pH以質(zhì)子化羧基末端。水洗滌保證從產(chǎn)物去除三氟乙酸鈉。按重量/重量計非常微量的三氟乙酸鈉將干擾與HAA17-36NH2的液相偶合。
應(yīng)該在室溫下干燥該片段。觀測在40℃干燥濕的AcAA1-16OH的穩(wěn)定性研究表明，在3天內(nèi)降解約4％。有趣的是，該干燥固體在80℃下可穩(wěn)定24小時。
11.2.1大規(guī)模制備片段Ac-AA(1-16)-OH(片段3c)的優(yōu)選方法向40L肽反應(yīng)室加入樹脂結(jié)合的FmocGlnOH(1.53Kg,0.55mmol/g,0.84摩爾)。在氮氣下使樹脂在DCM(5體積)中攪拌調(diào)適15分鐘，然后排干。加入20％哌啶的NMP溶液(5體積)，在氮氣下攪拌懸浮液20分鐘。排干溶液，重復(fù)該過程。用5體積NMP洗滌樹脂5次，以按氯醌試驗測定除去二苯并富烯和哌啶(注釋1)。
在洗凈樹脂的哌啶的同時，將在所述序列中后續(xù)氨基酸(1.5eq)、HOBT(1.5eq)和DIEA(1.5eq)合并在NMP(6-7體積)中，并冷卻至0℃。向該冷卻溶液中加入HBTU(1.5eq)，攪拌該溶液10-15分鐘，以溶解HBTU。將活化氨基酸的冷卻溶液加入樹脂，然后用DCM(2.5體積)沖洗(注釋2)。在氮氣吹掃下攪拌懸浮液2小時，然后取出樹脂樣品進(jìn)行定性茚三酮試驗(注釋3)。如果茚三酮試驗陰性，則排干容器，用3×5體積NMP洗滌(注釋4)，用所述序列中的下一個氨基酸重復(fù)該循環(huán)。如果茚三酮試驗陽性，則再攪拌懸浮液1小時，并再測試。如果茚三酮試驗陰性，則進(jìn)行下一個循環(huán)。如果茚三酮試驗仍然陽性，再與1當(dāng)量氨基酸和試劑偶合。如果茚三酮試驗在1小時后為陽性，則用5當(dāng)量乙酸酐和5當(dāng)量吡啶的NMP(10體積)封端1小時。
在完成所述片段合成時，如上所述從最后的氨基酸去除Fmoc，并在乙酸酐和吡啶(各5eq)的3∶1 NMP∶DCM(10體積)溶液中攪拌所述樹脂20-30分鐘或直至茚三酮試驗為陰性。排干樹脂，用2×5體積NMP洗滌，用5體積DCM洗滌5次，干燥獲得3.49Kg AcAA1-16O-樹脂。
向40L SPPS反應(yīng)室加入干燥的樹脂結(jié)合的AcAA1-16(3.49Kg)。用6×3.4體積1％TFA/DCM從所述樹脂裂解樹脂結(jié)合肽(注釋7)。將每一裂解洗出液收集到1.36體積0.33M碳酸氫鈉水溶液上。合并雙相部分，用2體積水稀釋。減壓(15英寸汞柱，20℃)濃縮雙相混合物以去除DCM。在所述蒸餾期間再加入水(2體積)，根據(jù)需要持續(xù)攪拌(注釋6)。當(dāng)所述DCM被去除(數(shù)小時)時，將所述懸浮液冷卻至0℃并用1N鹽酸水溶液將pH調(diào)節(jié)至3。在0℃攪拌淤漿1小時并收集。將仍然潮濕的固體返回反應(yīng)容器，用水(7體積)研制去除殘留TFA和三氟乙酸鈉。真空過濾收集固體，并干燥至恒重(1.12Kg,95A％)。根據(jù)0.52mmol/g載荷量的AcAA1-16OH收率為86％(注釋7)。注釋1．向約1mL丙酮中加入1滴氯醌的甲苯飽和溶液，然后加入1滴流出物。出現(xiàn)藍(lán)色或紫色表示存在哌啶。隨著所述樹脂床高度的增加，將需要更大體積的NMP洗出哌啶。2．加入DCM保證所述樹脂充分膨脹。3．定量茚三酮試驗足以檢測偶合效率。取出2-20mg樹脂樣品用甲醇洗凈。向該樣品中加入3滴76％苯酚的乙醇、4滴0.2mM KCN的吡啶和3滴0.28M茚三酮的乙醇。用乙醇稀釋該溶液至0.5-1mL，并將該溶液置于75℃的加熱塊中5-10分鐘。藍(lán)色或紫色表示存在游離胺(陽性)。澄明或淡藍(lán)色為陰性結(jié)果。Protocol forQrantitative Ninhydrin Test References:Sarin,V.K.,Kent,S.B.H.,Tam,J.P.,&Merrifield,R.B.(1981)Analytical Biochem.ⅲ,147-157。4．如果所述樹脂將儲存過夜，用2×5體積NMP洗滌，排干并在氮氣下儲存。不能儲存在DCM下。這可使所述肽從樹脂裂解和導(dǎo)致明顯的重量減輕。5．在254nm經(jīng)TLC顯色測量各個流分的產(chǎn)物含量。在開始的5份洗出液中去除了主要產(chǎn)物。6．隨著DCM的去除，所述反應(yīng)物呈糖稀(marshmallow cream)稠度。
隨著繼續(xù)蒸餾，所述懸浮液逐漸成為固體淤漿。重要的是緩慢去除DCM以避免產(chǎn)物油的流出。7．Vydac C8,5μ,300A1mL/min,30℃,230nmA 1000∶1水/TFAB 800∶200∶1 IPA∶ACN∶TFA60-95％B/30分鐘保留時間13.1分鐘11.3大規(guī)模制備片段FmocAA(17-26)-OH(片段10b)在兩次相同規(guī)模的運行中，由2.4Kg FmocLeuO-樹脂制備的FmocAA17-26O-樹脂總量為5.3Kg。在四次相同規(guī)模的運行中由樹脂裂解5.3Kg FmocLeuO-樹脂，獲得3.184Kg FmocAA17-26OH，平均純度為94.4A％，收率為90％。
采用1.5當(dāng)量相對于載荷系數(shù)的各種氨基酸進(jìn)行所述反應(yīng)，導(dǎo)致對于每個偶合循環(huán)使用65％過量氨基酸。所有偶合反應(yīng)在2小時內(nèi)完成(茚三酮試驗陰性)。
用20％哌啶的NMP(5體積)去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)20分鐘，重復(fù)該過程。用5×5體積NMP洗滌液使哌啶從樹脂洗出。在8體積3∶1NMP∶DCM中進(jìn)行偶合反應(yīng)。排干偶合溶液，用3×5體積NMP洗滌液洗凈所述固體。用序列中的下一個氨基酸重復(fù)該循環(huán)。完成所述片段時，用2×5體積NMP、5×5體積DCM洗滌樹脂床，并干燥至恒重。
用數(shù)份1％TFA的DCM洗滌液從所述樹脂去除所述片段。不必冷卻1％TFA的DCM溶液，因為該片段在1％TFA/DCM(1％/天)中的穩(wěn)定性較AcAA1-16OH高得多。當(dāng)收集含有產(chǎn)物的酸性DCM洗出液時，用吡啶對其進(jìn)行中和。蒸餾合并的洗出液去除DCM，加入乙醇以保持溶液以及在蒸餾期間驅(qū)除殘留的DCM。在去除DCM(由去除的餾出液的溫度升高決定)后，加入水沉淀所述片段。真空過濾(少于60分鐘)收集固體。將仍然潮濕的固體轉(zhuǎn)移回反應(yīng)器，用80/20乙醇/水(5體積)在0-5℃研制60分鐘。真空過濾收集所沉淀的FmocAA17-26OH，用最小量80/20乙醇/水洗滌并干燥(真空，不加熱，10天)。11.3.1大規(guī)模制備片段FmocAA(17-26)-OH(片段10b)的優(yōu)選方法在40L SPPS反應(yīng)室中加入FmocLeuO-樹脂(1.2Kg,0.776摩爾)，然后加入DCM(5體積)以膨脹所述樹脂。需要DCM保證干燥的原料樹脂完全膨脹。攪拌懸浮液20-30分鐘，排干。加入20％哌啶的NMP溶液(5體積)，攪拌該溶液20分鐘。排干所述溶劑，重復(fù)所述過程。排干溶劑，用5×5體積NMP洗滌樹脂，以去除哌啶(注釋1)。
去保護(hù)時，在機(jī)械攪拌下在20L圓底燒瓶中加入所述序列中的下一個氨基酸(1.95eq)、HOBT(1.95eq)、DIEA(1.95eq)和NMP(6體積)。攪拌溶液直至固體溶解，然后冷卻至0-5℃并加入HBTU(1.95eq)。攪拌溶液直至HBTU溶解或所述樹脂不含哌啶(無論哪個均是首要的)，然后加入到所述樹脂中。用DCM(2體積)洗滌反應(yīng)器，將該反應(yīng)轉(zhuǎn)移到SPPS反應(yīng)器。注意氨基酸和試劑的化學(xué)計量應(yīng)為1.5eq。
將所述樹脂懸浮于偶合溶液中并輕輕攪拌。2小時后，從SPPS反應(yīng)室取出樹脂樣品，進(jìn)行定性茚三酮試驗(注釋2)。如果茚三酮試驗陰性，則排干反應(yīng)器，用3×5體積NMP洗滌，用所述序列中的下一個氨基酸重復(fù)該循環(huán)(DCM膨脹僅用于加載第一個氨基酸序列)。
如果所述茚三酮試驗陽性，再攪拌所述懸浮液1小時，并再測試。如果茚三酮試驗陰性，則進(jìn)行下一個循環(huán)。如果茚三酮試驗仍然陽性，則用1當(dāng)量所述氨基酸和試劑再偶合。如果1小時后茚三酮試驗陽性，則用5當(dāng)量乙酸酐和5當(dāng)量吡啶的NMP(10體積)封端1小時。
在完成所述片段合成時，排干樹脂，用2×5體積NMP、5×5體積DCM洗滌，干燥獲得2.67Kg FmocAA17-26O-樹脂。
用5-6×1.7體積1％TFA的DCM從樹脂(1.33Kg)裂解FmocAA17-26OH，每次5分鐘。將1％TFA/DCM洗出液收集在含有吡啶(在所述洗出液中與TFA的體積比為1∶1)的燒瓶中。合并含有產(chǎn)物的洗出液(約14L)，蒸餾去除DCM至最小罐體積(約1/3原體積)。調(diào)節(jié)真空以維持罐溫度于15-25℃。加入乙醇(6.5體積)，繼續(xù)蒸餾直到去除DCM為止(根據(jù)餾出液的溫度確定，注釋3)。再調(diào)節(jié)真空維持罐溫度于15-20℃。終罐體積應(yīng)該為約8-10體積。將溶液冷卻至5-10℃，在30分鐘內(nèi)加入水(6.5體積)沉淀FmocAA17-25OH。真空過濾收集固體，用水(2-3體積)洗滌。為了去除殘余吡啶和/或鹽，將仍然潮濕的固體返回反應(yīng)器，加入預(yù)冷至0℃的80/20乙醇/水(5體積)。在0℃攪拌懸浮液60分鐘，真空過濾收集固體，用最小量80/20乙醇/水洗滌，干燥至恒重，獲得0.806Kg FmocAA17-26OH，收率90.6％,96A％純(注釋4)。注釋1．向1mL丙酮中加入1滴氯醌的甲苯飽和溶液，然后加入1滴流出物。出現(xiàn)藍(lán)色或紫色表示存在哌啶。2．定量茚三酮試驗足以檢測偶合效率。取出2-20mg樹脂樣品用甲醇洗凈。向該樣品中加入3滴76％苯酚的乙醇、4滴0.2mMKCN的吡啶和3滴0.28M茚三酮的乙醇。用乙醇稀釋該溶液至0.5-1mL，并將該溶液置于75℃的加熱塊中5-10分鐘。出現(xiàn)藍(lán)色或紫色表示存在游離胺(陽性)。澄明或淡藍(lán)色為陰性結(jié)果。3．在真空蒸餾DCM期間的頭餾分溫度為10-15℃。當(dāng)去除DCM時頭餾分溫度升高至35℃。4．Vydac C8,5μ,300A1mL/min,262nm,30℃A 1000∶1水/0.1％TFAB ACN/0.1％TFA80-99％B/20分鐘保留時間15.2分鐘11.4大規(guī)模制備片段Fmoc-AA(27-35)-OH(片段16b)由4.45Kg FmocTrp(Boc)O-樹脂合成FmocAA27-35OH總計4.694Kg。分兩批進(jìn)行固相合成，從所述樹脂裂解為4批。由一批產(chǎn)生的FmocAA27-35OH純度較另一批獲得的物質(zhì)低約5％。這是因為未鑒定的5A％雜質(zhì)，該雜質(zhì)在對FmocAA17-36NH2的加工過程中去除。裝載到樹脂上的FmocTrp(Boc)OH總量為2.5摩爾。按預(yù)期的約63％的樹脂載荷量進(jìn)行固相合成。所有的偶合反應(yīng)在第一個2小時檢測點完成。所述反應(yīng)和用于SPPS的沖洗體積和裂解與在合成FmocAA17-26OH中使用的相同。如上所述從所述樹脂裂解?？焖龠^濾(15分鐘)。90/10乙醇/水研制后干燥固體需要3天(真空，不加熱)。所述片段在40℃干燥是穩(wěn)定的。
11.4.1大規(guī)模制備片段Ac-AA(27-35)-OH(片段16b)的優(yōu)選方法向含有FmocTrp(Boc)-樹脂(1eq,2.2Kg,1.23摩爾)的SPPS室加入DCM(5體積)。攪拌懸浮液15分鐘并排干。加入20％哌啶的NMP溶液(5體積)，攪拌懸浮液10-15分鐘，以去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。重復(fù)該過程，用5-7×NMP(5體積)洗滌樹脂至氯醌試驗陰性(注釋1)。
將后續(xù)氨基酸(1.5eq)、HOBT(1.5eq)和DIEA(1.7eq)合并在NMP(6體積)中，然后冷卻至0-5℃(注釋2)。加入HBTU，攪拌溶解溶液10-15分鐘。將活化氨基酸溶液加入所述樹脂。用DCM(2體積)洗滌反應(yīng)器，然后加入到所述樹脂(注釋3)。在氮氣氛下攪拌懸浮液1-2小時。用定性茚三酮試驗監(jiān)測偶合完成情況(注釋4)。如果茚三酮試驗陰性，則排干容器，用3×5體積NMP洗滌，用所述序列中的下一個氨基酸重復(fù)該循環(huán)(所述DCM膨脹僅用于裝載第一個氨基酸)。
如果茚三酮試驗陽性，則再攪拌懸浮液1小時，并再測試。如果茚三酮試驗陰性，則進(jìn)行下一個循環(huán)。如果茚三酮試驗仍然陽性，再與1當(dāng)量所述氨基酸和試劑偶合。如果茚三酮試驗在1小時后為陽性，則用5當(dāng)量乙酸酐和5當(dāng)量吡啶的NMP(10體積)封端1小時。
在完成所述片段合成時，排干樹脂，用2×5體積NMP、5×5體積DCM洗滌，干燥獲得4.11Kg FmocAA27-35O-樹脂。
用6×1.7體積1％TFA的DCM從樹脂(2.05Kg)裂解所述片段，每次5分鐘。將1％TFA/DCM洗出液收集在含有吡啶(在所述洗出液中與TFA的體積比為1∶1)的燒瓶中。合并含有產(chǎn)物的洗出液，蒸餾(調(diào)節(jié)真空以維持罐溫度于約15℃)去除DCM至約原罐體積的一半。逐漸加入乙醇(5體積)，繼續(xù)蒸餾(調(diào)節(jié)真空以維持罐溫度于20℃)直到去除DCM為止(根據(jù)餾出液的溫度確定，注釋5)。罐體積應(yīng)該為約6-7體積。將混濁溶液冷卻至10-15℃，在30分鐘內(nèi)加入水(3.5體積)并快速攪拌，以沉淀FmocAA27-35OH。真空過濾收集固體(15分鐘)，用水(1體積)洗滌。為了去除殘余吡啶，將潮濕的固體返回反應(yīng)器，加入預(yù)冷至0℃的90/10乙醇/水(10體積)。在0-5℃攪拌淤漿60分鐘，真空過濾收集固體，用90/10乙醇/水(0.5體積)洗滌，干燥至恒重，獲得1.19Kg FmocAA27-35OH，收率89％,89.2A％純(注釋6)。
可通過用15體積9∶1乙醇/水研制所述固體并攪拌12小時，然后收集及干燥，再實施此方案。注釋1．向1mL丙酮中加入1滴氯醌的甲苯飽和溶液，然后加入1滴流出物。出現(xiàn)藍(lán)色或紫色表示存在哌啶。2．在室溫下加入較少量的試劑HBTU以促進(jìn)溶解。將HBTU加入預(yù)冷的溶液以使外消旋作用最小。3．在NMP中進(jìn)行活化，因為HBTU在DCM中不溶解。DCM用來洗滌反應(yīng)器，并加入樹脂以保持樹脂充分膨脹。4．定量茚三酮試驗足以檢測偶合效率。取出2-20mg樹脂樣品用甲醇洗凈。向該樣品中加入3滴76％苯酚的乙醇、4滴0.2mM KCN的吡啶和3滴0.28M茚三酮的乙醇。用乙醇稀釋該溶液至0.5-1mL，并將該溶液置于75℃的加熱塊中5-10分鐘。藍(lán)色或紫色表示存在游離胺(陽性)。澄明或淡藍(lán)色為陰性結(jié)果。5．在真空蒸餾DCM期間的頭餾分溫度為10-15℃。當(dāng)去除DCM時頭餾分溫度升高至35℃。6．VydacC8,5μ,300A1mL/min,262nm,30℃A 水/0.1％TFAB ACN/0.1％TFA80-99％B/20分鐘保留時間15.3分鐘11.5通過液相偶合FmocAA(27-35)-OH與HPheNH2大規(guī)模制備片段FmocAA(27-36)-OH在四次運行中由4.676Kg FmocAA27-35OH制備FmocAA27-36NH2總計5.226Kg。殘留偶合試劑或溶劑使收率大于100％。將其在下一階段中除去。
在該階段中在水排泄后固體粘著在反應(yīng)器壁上被認(rèn)為是一個重要問題。真空過濾分離粗制固體需要30分鐘。對于所述操作平均干燥時間(真空，不加熱)為8天。需要對在濾器上的所述固體加壓，以在過量的水進(jìn)入烘爐前將其除去。所述片段在40℃干燥是穩(wěn)定的，真空烘爐需要加熱。
用各批原料在0.5-1g規(guī)模進(jìn)行使用試驗，用來幫助確定質(zhì)量和均一性。薄層色譜法(TCL)和HPLC用來監(jiān)測原料向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。在片段FmocAA27-35OH中發(fā)現(xiàn)的主要雜質(zhì)是三氟乙酸(或其鹽)。在FmocAA27-35OH中存在的三氟乙酸與苯丙氨酸酰胺的活化和反應(yīng)是一個快速過程。少量苯丙氨酸酰胺可用來消耗存在的任何三氟乙酸。更重要的是關(guān)于所購買的苯丙氨酸酰胺的質(zhì)量問題。大多數(shù)銷售商銷售其鹽酸鹽。幾批苯丙氨酸酰胺鹽酸鹽產(chǎn)生在HPLC上與原料共洗脫的雜質(zhì)(5-15A％)。可用TLC從原料及產(chǎn)物分離雜質(zhì)。所述雜質(zhì)為由存在于苯丙氨酸酰胺的鹽酸鹽中的氯化銨產(chǎn)生的FmocAA27-35NH2。
11.5.1通過液相偶合FmocAA(27-35)-OH與HPheNH2大規(guī)模制備片段FmocAA(27-36)-OH向具有機(jī)械攪拌器的40L夾套式反應(yīng)器中加入FmocAA27-35OH(1eq,1.185Kg)、HOAT(1.1eq)、鹽酸HPheNH2(1.15eq)和DMF(12.5體積)。加入DIEA(2.1eq)，將溶液冷卻至0-5℃，加入HBTU(1.2eq)。在0-5℃下攪拌反應(yīng)混合物15分鐘，然后溫?zé)嶂潦覝兀贁嚢?0分鐘(注釋1,HPLC用于生產(chǎn)控制)。在用HPLC判定反應(yīng)完成后，在15-30分鐘內(nèi)加入水(12.5體積)，以沉淀肽。在室溫下攪拌淤漿15分鐘。真空過濾收集固體，用水(3體積)洗滌，干燥獲得FmocAA27-36NH2(1.357Kg，收率107％,87.1A％HPLC純(注釋2)。
可通過用15體積9∶1乙腈/水研制所述固體并攪拌12小時，收集以及干燥，再次加工所述反應(yīng)物。注釋1．生產(chǎn)過程控制，TLC88/12二氯甲烷/甲醇UV，碘檢測Rf:Fmoc AA27-35OH,0.49Rf:FmocAA27-36NH2,0.63Vydac C8,5m,300A30℃,1mL/min,262nmA 水/0.1％TFAB ACN/0.15 TFA80-99％B/20分鐘保留時間FmocAA27-35OH,15.8保留時間FmocAA27-36NH2,17.122．除非所分離的固體返回反應(yīng)器并用水研制，否則一般獲得的收率較理論值高。11.6由FmocAA(27-36)-OH大規(guī)模制備片段HAA(27-36)-OH在平均2步收率86.4％的四次運行中由5.221Kg FmocAA27-36NH2制備HAA27-36NH2總計3.897Kg。對所述運行觀測到的收率為74-97％，推測它反映從一次操作轉(zhuǎn)入下一操作步驟。
在該階段的處理及產(chǎn)品分離運行得非常好。如果在MTBE中留有適當(dāng)量的DCM，則可以增強(qiáng)所述產(chǎn)物的純化，所述固體的物理特性使得快速過濾和干燥。該產(chǎn)物分離過程已經(jīng)加入下文11.6.2部分中所述的新階段。
DCM是在對FmocAA27-36NH2去保護(hù)過程中用的溶劑。完成所述去保護(hù)時，用水洗滌有機(jī)溶液兩次以去除大部分過量哌啶，然后濃縮至1/3原體積。加入MTBE沉淀所述片段。繼續(xù)蒸餾去除大部分殘留DCM并結(jié)束沉淀所述片段。重要的是去除大部分DCM，以避免在沉淀中的重量損失。此外，重要的是留下部分DCM在MTBE中，以保證產(chǎn)物提純。二苯并富烯、哌啶/富烯加合物和殘留的哌啶可溶于MTBE。收集并干燥HAA27-36NH2。必要時，用MTBE第二次研制所述固體(12小時)去除可存在于HAA27-36NH2中的殘留二苯并富烯和更重要的哌啶/富烯加合物。用已烷研制可去除二苯并富烯但是不會去除哌啶/富烯加合物。從MTBE分離固體的干燥時間為1天。
因為HAA27-36NH2和相關(guān)雜質(zhì)在DCM/MTBE中的高溶解性，所以需要分析方法來準(zhǔn)確檢測溶劑交換的終點。已經(jīng)開發(fā)GC法分析MTBE中的DCM。當(dāng)在MTBE中的DCM含量低于6％時結(jié)束蒸餾。
11.6.1由FmocAA(27-36)-OH大規(guī)模制備片段HAA(27-36)-OH向配有機(jī)械攪拌器和溫度計的40L玻璃夾套式反應(yīng)器中加入FmocAA27-36NH2(1eq,1.356Kg)、DCM(5體積)和哌啶(0.2體積)。在環(huán)境溫度下攪拌溶液1.5小時(注釋1)。用(2×5體積)水洗滌有機(jī)溶液。通過蒸餾(約25mmHg，夾套溫度低于45℃以避免固體熔化)使有機(jī)層體積減少至1/3原體積。逐漸加入MTBE(5體積)至反應(yīng)容器中，同時繼續(xù)濃縮至出現(xiàn)大量沉淀而且所述罐體積約5體積時為止。當(dāng)DCM含量低于6％時停止溶劑交換。將淤漿冷卻至0-5℃，攪拌60分鐘，然后真空過濾收集(快速)。用MTBE(2×O.5體積)洗滌固體并干燥至恒重，獲得1.022Kg HAA27-36NH2，收率89.2％(2步)，91.1A％純(注釋1)。
可通過用MTBE(12.5體積)在23℃下研制13小時，然后真空過濾收集并干燥，再次加工所述反應(yīng)物。注釋1．用HPLC進(jìn)行生產(chǎn)過程的檢測(IPC)和純度檢測Vydac,C8,5,300A1mL/min,262nm,30℃A 水/0.1％TFAB ACN/0.1％TFA80-99％B/20分鐘保留時間FmocAA27-36NH2,16.5；HAA27-36NH2,8.4。
11.6.2通過液相偶合FmocAA(27-36)-OH和HPheNH2改進(jìn)制備片段HAA(27-36)-OH開發(fā)了組合11.5-11.6.1部分、直接采用FmocAA27-35OH至HAA27-36NH2的新方法。該新方法消除了與分離FmocAA27-36NH2和干燥時間長有關(guān)的問題。以下進(jìn)行詳細(xì)描述。新方法去除了所述合成途徑中的長干燥時間和分段。
向具有磁性攪拌器和氮氣入口的100mL圓底燒瓶中加入FmocAA27-35OH(5.0g,1eq)、HOAT(0.459,1.2eq)和Phe-NH2(0.389,1.2eq)。向所述燒瓶加入10體積NMP(50mL)和DIEA(0.45g,1.5eq)，并在氮氣氛下攪拌直到固體溶解為止。將溶液冷卻至0-5℃，然后加入HBTU(1.04g,1.2eq)。在0-5℃的氮氣氛下攪拌30分鐘。將反應(yīng)混合物溫?zé)嶂?0℃并繼續(xù)攪拌。加入HBTU后90分鐘進(jìn)行操作過程的檢測(IPC)(注釋1)。
在所述操作過程的檢測(IPC)表明反應(yīng)完成時，加入哌啶(1.379,7eq)至反應(yīng)混合物中，在氮氣氛下攪拌1.5小時。進(jìn)行IPC(注釋1)。如果Fmoc去除完成時，再攪拌30分鐘并進(jìn)行IPC。
結(jié)束時在不超過35℃的條件下，將反應(yīng)混合物以一定比率加入到5％乙酸水溶液(30體積)中。攪拌所生成淤漿1-2小時，真空過濾收集(注釋2)。用10體積(50mL)水洗滌固體。
將潮濕的固體返回所述反應(yīng)器中，加入20體積水(100mL)，在環(huán)境溫度下攪拌1-2小時。真空過濾收集固體，用10體積水(50mL)洗滌并干燥(注釋3)。
用MTBE(20體積)在環(huán)境溫度下研制所述干燥(注釋4)固體2-5小時，以去除二苯并富烯和二苯并富烯哌啶加合物。真空過濾收集固體并干燥至恒重，獲得4.55g(94.3％)HAA27-36NH2,85-90A％純(注釋1)。
在該方法中一般性除去Fmoc副產(chǎn)物(二苯并富烯和其哌啶加合物)，然而如果有必要重復(fù)加工，則于20℃在10體積MTBE中攪拌所述固體2-3小時，然后收集并干燥。注釋1．用反相HPLC進(jìn)行操作過程的檢測柱Vydac C8,300A,5μ,30℃流速1mL/min檢測UV,262nm流動相A．水/0.1％TFAB．乙腈/0.1％TFA方法在20分鐘內(nèi)80-99％B保留時間FmocAA27-36NH2(16.5min。HAA27-36NH2(8.4min)2．總過濾時間為10分鐘。3．潮濕的過濾餅必須返回反應(yīng)器，用水立即進(jìn)行洗滌，避免所述固體的油化或膠化。4．所述粗產(chǎn)物必須徹底干燥，以保證MTBE研制除去二苯并富烯副產(chǎn)物。11.7通過液相合成融合FmocAA(17-26)-OH與HAA(27-36)-OH大規(guī)模制備片段FmocAA(17-36)-OH在四次運行中由2.993Kg HAA27-36NH2和3.176KgFmocAA17-26OH制備FmocAA17-36NH2總計5.115Kg。平均收率84.3％。在水從反應(yīng)混合物流出后過濾粗品固體平均需要40-50分鐘。
在1-2g規(guī)模進(jìn)行使用試驗，測試在進(jìn)行偶合反應(yīng)之前將使用的片段和HBTU。根據(jù)使用試驗確定原料和試劑的化學(xué)計量。在使用試驗中還要記錄下原料的溶解性。渾濁溶液可表示在FmocAA17-26OH中存在鹽，并成為用水對片段進(jìn)行洗滌的根據(jù)。必不可少的是加入HBTU之前反應(yīng)混合物中所有組分都確實在溶液中，以確保原料完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物并且外消旋化和副產(chǎn)物形成最少。
通過用IPA沉淀顯著增加了從流出的水溶液中分離的粗品FmocAA17-36NH2的純度。FmocAA17-36NH2部分溶解于IPA。用約15體積預(yù)溫至60-70℃的95/5的IPA/水研制FmocAA17-36NH2，然后攪拌并在數(shù)小時內(nèi)冷卻至室溫，這可提高片段的純度。FmocAA17-26OH的原料以及哌啶酰胺和HAA27-36NH2的烯胺脲加合物可溶于95％IPA。延長用95％IPA在室溫下研制粗品FmocAA17-36NH2的時間對于去除雜質(zhì)不那么有效。已在60-70℃完成穩(wěn)定性研究。不把IPA溶液加熱至52℃以上似乎對所分離的產(chǎn)物的質(zhì)量影響最小。
11.7.1改進(jìn)通過液相合成融合FmocAA(17-36)-OH和HAA(27-36)-OH大規(guī)模制備片段FmocAA(17-36)-OH的優(yōu)選方法向配有機(jī)械攪拌器和氮氣入口的40L夾套式反應(yīng)器中加入FmocAA17-26OH(1eq.,0.770Kg)、HAA27-36NH2(1eq.,0.720Kg)、HOAT(1.5eq.)和DMF(12.5相對于FmocAA17-26OH的體積)。加入EtPr2N(1.5eq.)并在室溫下攪拌懸浮液直到固體溶解(肉眼觀察)。將溶液在氮氣氛下冷卻至0-5℃，加入HBTU(1-1.05eq)。在0-5℃攪拌反應(yīng)混合物直到HBTU溶解(肉眼觀察，約15分鐘)。將反應(yīng)混合物溫?zé)嶂?5℃并攪拌2小時(注釋1)。將DMF溶液冷卻至0-5℃，加入冷凍工藝水(12.5體積)，其加入速率使得溶液溫度不超過25℃。攪拌所得的淤漿1-24小時，真空過濾收集固體并用水(3×4體積)洗滌。在濾膜上干燥固體16-24小時至約2倍理論重量。將95/5異丙醇/水(25體積)加入所述40L反應(yīng)器并溫?zé)嶂?5℃?？焖贁嚢柘聦敫稍锏腇mocAA17-36NH2加入到所述IPA溶液。將該懸浮液溫?zé)嶂?2℃，然后攪拌12-16小時同時冷卻至室溫(注釋2)。真空過濾收集固體，用最小量IPA洗滌并干燥獲得1.261Kg FmocAA17-36NH2，收率85％,90.SA％HPLC純(注釋1)。可通過重復(fù)所述95/5 IPA/水的研制再加工所述反應(yīng)物。注釋1．生產(chǎn)過程控制和純度，HPLCVydac C8,5μ,300A1mL/min,262nm,30℃A 水/0.1％TFAB 80/20 IPA/ACN/0.1％TFA60-95％B/20分鐘保留時間HAA27-36NH2,6.73分鐘FmocAA17-26OH,10.67分鐘FmocAA17-36NH2,20.2分鐘2．在該溫度FmocAA17-36NH2將不能完全溶解于該體積中。收集固體前，停止攪拌并使固體沉淀。取出濾液樣品并進(jìn)行HPLC分析。如果濾液含有顯著量FmocAA17-36NH2，則在收集固體前冷卻至0℃。11.8由FmocAA(17-36)-OH大規(guī)模制備片段HAA(17-36)-OH在四次運行中由5.112Kg FmocAA17-36NH2制備的HAA17-36NH2總量為4.965Kg。所述分離產(chǎn)量和HPLC痕量表示存在二苯并富烯和可能的溶劑。由于用碳酸鉀除去二苯并富烯而不是哌啶，因此存在的二苯并富烯將不影響下一步偶合反應(yīng)，所以二苯并富烯的哌啶加合物在化學(xué)上不是問題。
存在數(shù)個與該過程有關(guān)的問題。在12體積DMF中進(jìn)行該反應(yīng)。除去Fmoc基團(tuán)的堿是1體積1.1M碳酸鉀，碳酸鉀不能與二苯并富烯形成難于除去的堿加合物。于室溫下在約90分鐘內(nèi)進(jìn)行去保護(hù)。
加入預(yù)冷至0℃的1∶1飽和氯化鈉水溶液∶水的溶液，以共沉淀所述片段和二苯并富烯。產(chǎn)生需要數(shù)小時(5-8)過濾的精細(xì)牛奶狀固體。分離后必須完全干燥(低于1％LOD)潮濕固體，以除去二苯并富烯雜質(zhì)。干燥需要10天(真空，不加熱)。干燥后，將所述固體返回所述反應(yīng)器，用3∶1庚烷∶MTBE(20體積)在環(huán)境溫度下研制18小時，以除去二苯并富烯。研制較短時間不能完全除去二苯并富烯，如果在所述固體上存在任意量的水，則不能除去二苯并富烯。如果二苯并富烯仍存在則可用3∶1庚烷∶MTBE(20體積)重復(fù)加工。
為了解決這些問題，開發(fā)以下新方法。將FmocAA17-36NH2(2.0g,1eq.)和庚烷(8體積)加入到配有磁性攪拌器、溫度控制器和回流冷凝器的100mL圓底燒瓶中。加入2體積MTBE(4mL)并將淤漿加熱至45-50℃(注釋1)。加入哌啶(10eq.)。在45-50℃氮氣氛下攪拌24-36小時(注釋2)。在45-50℃加熱過濾所述反應(yīng)混合物(注釋3)，然后用5體積(10mL)60∶40庚烷∶MTBE洗滌濾餅。注釋1．如果使MTBE逸出反應(yīng)器，由此改變庚烷∶MTBE比，將使反應(yīng)減慢，反應(yīng)溫度高于50℃可能使反應(yīng)固體膠化。在5小時內(nèi)主要去除Fmoc。2．用反相HPLC監(jiān)測反應(yīng)完成情況柱Vydac C8,300A,5μ,30℃流速1mL/min檢測UV,262nm流動相A．水/0.1％TFAB．80∶20 IPA∶ACN 0.1％TFA方法在30分鐘內(nèi)60-95％B3．熱過濾幫助除去二苯并富烯的哌啶加合物。11.8.1由FmocAA(17-36)-OH大規(guī)模制備片段HAA(17-36)-OH在室溫下將FmocAA17-36NH2(1eq,1.26Kg)和DMF(12體積)加入40L夾套式反應(yīng)器中。立即加入1.11M碳酸鉀水溶液(1體積，5eq)(注釋1)。在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物3.5小時(注釋2)。將反應(yīng)混合物緩慢加至預(yù)冷至0℃的1∶1飽和氯化鈉水溶液/水(10體積)的溶液中(約1-2小時)，其加入速率使得溶液溫度不超過10℃。真空過濾收集固體，用橡皮擋板將水從濾餅壓出(注釋3)。將濕濾餅轉(zhuǎn)移回反應(yīng)容器，并用水(10體積)研制(攪拌)1-2小時以除去殘留無機(jī)鹽。真空過濾收集固體，用橡皮擋板擠壓，然后轉(zhuǎn)移到真空烘箱干燥至恒重。用3∶1庚烷∶MTBE(20體積)在室溫下研制所述干燥固體(注釋4)至少14小時，以除去二苯并富烯。真空過濾收集固體，用庚烷(2體積)洗滌，干燥獲得1.20Kg HAA17-36NH2，收率99.5％,75A％純。HAA17-36NH2含有5A％二苯并富烯。通過重復(fù)所述庚烷∶MTBE研制再加工所述反應(yīng)物。注釋1．當(dāng)加入碳酸鉀水溶液時溶液變渾濁，但是繼續(xù)攪拌又變澄清。注意溫度升高4-5℃。2．HPLC用于IPC和純度測定Vydac C8,260nm1mL/min,262nm,30℃A 水/0.1％TFAB 80∶20 IPA/乙腈/0.1％TFA60-95％B/3O分鐘3．產(chǎn)物沉淀為細(xì)顆粒，導(dǎo)致過濾緩慢。4．所述物質(zhì)必須不含水以便庚烷有效除去二苯并富烯。
11.9通過液相合成由AcAA(1-16)-OH和FmocAA(17-36)-OH大規(guī)模制備片段AcAA(1-36)-OH用HOAT和DIEA將AcAA1-16OH溶解于DMF中，冷卻至0℃并加入HBTU。攪拌15分鐘或直到HBTU溶解為止，然后加入HAA17-36NH2。在不存在HAA17-36NH2的情況下預(yù)活化AcAA1-16OH是一種保護(hù)措施，后來發(fā)現(xiàn)并不是必要的。此外，證明將HAA17-36NH2溶解入含有活化AcAA1-16OH的0℃DMF溶液中在較大規(guī)模時速度緩慢。
在四次運行中由3.92Kg AcAA1-16OH和4.96Kg HAA17-36NH2制備的AcAA1-36NH2總量為6.972Kg，平均收率80.1％。在此期間的兩次操作平均收率為87％，而另兩次操作的平均收率為73％。
在1-2g規(guī)模進(jìn)行使用試驗，測試在進(jìn)行偶合反應(yīng)之前將使用的片段和HBTU。根據(jù)使用試驗確定原料和試劑的化學(xué)計量。在使用試驗中還要記錄下原料的溶解性。渾濁溶液可表示在AcAA1-16OH中存在鹽，并成為用水對片段進(jìn)行洗滌的依據(jù)。必不可少的是加入HBTU之前反應(yīng)混合物中所有組分都確實存在于溶液中，以確保原料完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物并且外消旋化和副產(chǎn)物形成最少。
將片段AcAA1-16OH和HAA17-36NH2以及試劑HOAT和DIEA溶解于DMF中，冷卻至0℃并加入HBTU。其中一次操作需要再加入等量的DIEA以拾取HAA17-36NH2上的HCl。從所述反應(yīng)混合物和水流出物(過濾時間10分鐘)中分離粗品產(chǎn)物。將仍然潮濕的固體返回含有預(yù)溫至55℃的乙腈的反應(yīng)器中，然后快速攪拌同時在3小時內(nèi)冷卻至35℃，然后冷卻至20℃過夜。將所述淤漿冷卻至0-5℃，再攪拌1-2小時，真空過濾收集固體。在該過程中，在55℃下AcAA1-36NH2幾乎成為溶液。隨著溶液的冷卻，AcAA1-36NH2從溶液中沉淀出來(油)。隨著溶液的冷卻，所述油固化甚至成為精致的白色固體。在該變化過程中，大量固體可能沉集到反應(yīng)器壁和攪拌軸上。其中大部分隨著在20℃攪拌淤漿過夜而脫落。收集固體后，將溶器裝以足量的水以掩沒任何粘著在反應(yīng)器或攪拌軸的固體。攪拌淤漿直到所有殘留的固體均脫離反應(yīng)器壁和攪拌軸(約1小時)，然后用作對所述濾餅的洗液。乙腈洗滌去除未反應(yīng)的原料和任何截短的小于20個氨基酸的片段。11.9.1通過液相合成由AcAA(1-16)-OH和FmocAA(17-36)-OH大規(guī)模優(yōu)選制備片段AcAA(1-36)-OH向反應(yīng)器中加入AcAA1-16OH(938g,1eq)、HAA17-36NH2(1.19Kg,1eq)、HOAT(1eq)、DMF(19體積，相對于AcAA1-16OH)和DIEA(1eq)。攪拌淤漿直到固體溶解，然后冷卻至0-5℃并加入HBTU(1.03eq)。在0-5℃攪拌溶液15分鐘或直到固體溶解，溫?zé)嶂?0℃并攪拌2小時。取樣反應(yīng)混合物進(jìn)行IPC(注釋1)。當(dāng)判定反應(yīng)完成時，以使得溶液溫度不超過35℃的速率加入水(19體積)(注釋2)。
攪拌淤漿1-24小時，然后真空過濾收集固體(10分鐘)，用水(2×3體積)洗滌。擠壓濾餅盡可能除去水。同時向反應(yīng)器中加入95％乙腈/水(30體積，相對于AcAA1-16OH裝料)，攪拌下溫?zé)嶂?5℃。
分批將潮濕的固體加入反應(yīng)器中以避免成塊。攪拌淤漿，同時在3小時內(nèi)冷卻至35℃，然后冷卻至20℃過夜。冷卻至0-5℃，攪拌2小時，停止攪拌并取樣溶液。
真空過濾收集固體。用90％乙腈/水(3.6體積)洗滌反應(yīng)器和管道(line)。
向反應(yīng)器中加入足量水以掩沒任何粘附在反應(yīng)器壁或攪拌軸上的固體(約30體積)。在環(huán)境溫度下攪拌直到固體不再粘附在反應(yīng)器壁和攪拌軸上(約1小時)。收集所述固體和其余部分并干燥至恒重(1.83Kg，收率86％)。
用90/10乙腈/水重復(fù)研制所述干燥固體。注釋1．IPC和純度測定，HPLCYMC ODS-A,150×4.6mm,5μ,120A1mL/min,260nm,30℃A 水/0.1％TFAB THF/0.1％TFA60-90％B/30分鐘，90-95％B/1分鐘，95％B/5分鐘。
AcAA1-16OH:6.37分鐘HAA17-36NH2:8.91分鐘AcAA1-36NH2:18.07分鐘2．如果在加入水期間溫度高于35℃，沉淀出的固體可能熔化，導(dǎo)致成塊和/或沉集在反應(yīng)器壁上。
11.10去保護(hù)AcAA(1-36)-OH的側(cè)鏈本實驗的目的是在沉淀中改變MTBE加入速率，以保持溫度小于20℃，而且還分離并脫羧粗品T-20固體(即除去溶液脫羧作用)。
在加樣到HPLC柱之前通過沉淀從ACN/水分離粗品固體T-20。用基于重量的HPLC分析檢測所述固體的T-20百分含量。
在90/5/5 TFA/水/二硫蘇糖醇中除去側(cè)鏈保護(hù)基后，將溶液冷卻至0℃并加入MTBE(45體積，相對于AcAA1-36NH2裝料)。這是保證完全沉淀T-20所需要的最小MTBE量?；旌蠒r溫度升高，最初的5體積必須緩慢加入以保持溫度低于20℃(約60分鐘)。隨著加入MTBE的增加，加入速率可以加快。在沉淀期間保持溫度低于20℃防止固體隨著從溶液沉淀出來而發(fā)生成塊。
目前的裂解/純化方法包括在適應(yīng)色譜純化的規(guī)模進(jìn)行去保護(hù)。將從去保護(hù)的混合物分離的粗品T-20的TFA鹽溶解于pH5乙腈/水中，過濾并靜置15小時以實現(xiàn)色氨酸吲哚的脫羧。在脫羧完成后，稀釋溶液并轉(zhuǎn)移到純化裝置(purifcation suite)準(zhǔn)備上柱。在稀釋期間，所述溶液總是變成霧狀，將該霧濁溶液泵入柱上。這使得固體沉積在柱的上端并在純化進(jìn)行期間逐漸消蝕柱效能。使T-20在pH5的乙腈/水中脫羧數(shù)小時，以形成幾乎不溶的聚集體。
已研制避免在溶液中脫羧的方法。將在室溫真空下對從MTBE沉淀中作為TFA鹽分離的粗品T-20進(jìn)行脫羧5-7天。發(fā)現(xiàn)在40℃真空下3天后完成脫羧。所分離固體的TFA含量為9％。所述物質(zhì)可在0℃保存長至1個月，損失1％(wt/wt)。
從MTBE分離T-20-TFA后可在乙醇/水(1∶9)與HOAc中進(jìn)行鹽交換。粗品T-20的乙酸鹽明顯更穩(wěn)定并可優(yōu)選。兩種分離方法中的任一種都將允許在較大規(guī)模進(jìn)行側(cè)鏈去保護(hù)，T-20將不暴露于用于脫羧的乙腈/水/HOAc條件，已知該條件引起聚集。去保護(hù)AcAA(1-36)OH的側(cè)鏈的新方法制備90/5/5 TFA/水/二硫蘇糖醇溶液(13體積)并用氮氣吹掃3分鐘。在環(huán)境溫度的氮氣氛下將AcAA1-36NH2分批加入到90/5/5 TFA/水/二硫蘇糖醇(13體積)中。一旦加入在溶液中，就在環(huán)境溫度下攪拌4小時，然后冷卻至0℃。為了沉淀T-20，緩慢滴加冷卻至0-5℃的MTBE(45體積)，開始時將溫度保持在20℃以下(加入時間約1-2小時)。真空過濾收集固體(注釋1)。立即用3×5體積MTBE洗滌反應(yīng)器、管道和濾餅。取出固體，取樣進(jìn)行t=0IPC(注釋2)，真空干燥5天或直到HPLC顯示無變化。注釋1．在該過濾過程中避免吸引空氣通入所述固體，因為所述去保護(hù)溶液是吸濕性的。在洗出TFA溶液前吸引空氣通入固體可產(chǎn)生粘性或油性固體。2．采用HPLC法TM2-0003-01(TFA法)。乙酸銨法(TM2-0006-01)不能分離各種羧化中間體。去保護(hù)AcAA(1-36)OH的側(cè)鏈在12次運行中去保護(hù)的AcAA1-36NH2總量為7.226Kg。僅制得6.972Kg AcAA1-36NH2，說明所述中間體是吸濕性的。將從MTBE流出物分離的固體溶解于10體積1∶1 ACN/水中，過濾并用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至3.5。加入乙酸(1.5體積％)(pH4.5-5)，在環(huán)境溫度下攪拌溶液15小時實現(xiàn)脫羧基作用。用25體積水稀釋溶液獲得總計為40體積的85/15水/ACN溶液。在所有情況下該溶液均為渾濁液，而且在部分情況下出現(xiàn)精細(xì)固體(聚集的T-20)。取樣進(jìn)行IPC，將所述溶液轉(zhuǎn)移到所述純化裝置。用wt/wt HPLC分析計算所述運行的粗品T-20產(chǎn)量。
在室溫下在90/5/5 TFA/水/DTT中4-5小時后完成AcAA1-36NH2去保護(hù)。在8小時時已發(fā)生顯著的降解(2％)。在5℃在相同混合物中，在8小時時去保護(hù)未完成，而是在23小時完成去保護(hù)。在室溫下5小時后與在5℃下23小時所獲得的粗品T-20的純度無差別。因為分離體積(約55體積)較反應(yīng)(去保護(hù))體積(13體積)大得多，所以必需將AcAA1-36NH2溶解在20L壇中的TFA溶液中，然后將該溶液轉(zhuǎn)移到40L反應(yīng)器中。
用MTBE沉淀達(dá)到從去保護(hù)混合物中分離粗品羧化型T-20(為TFA鹽)。沉淀所述肽需要的MTBE量3-4倍于去保護(hù)混合物的量。使用體積分兩次(或更少)的MTBE的裂解混合物使肽沉淀。MTBE加入所述裂解混合物使過濾固體容易，而把所述混合物加入MTBE產(chǎn)生難于過濾的精細(xì)沉淀。在MTBE加入TFA溶液期間溫度從5℃升高至40-45℃。溫度升高對所分離的粗品T-20的純度沒有影響(187/117,119)。在加入MTBE期間有部分成塊的固體。攪拌淤漿1-2小時以分散所述團(tuán)塊。在MTBE加入期間將溫度維持在20℃以下產(chǎn)生更好過濾的更均一的固體(196/31)。此后將控制加入MTBE速率。在氮氣氛下過濾收集粗品T-20。在洗出TFA之前，如果在過濾期間固體暴露于潮濕的空氣，所述固體將變粘。洗出TFA后，所述固體對空氣是穩(wěn)定的。操作方法在20L壇中制備90/5/5 TFA/水/二硫蘇糖醇溶液(13體積)，然后用氮氣吹掃3分鐘。分批加入AcAA1-36NH2(650g)以防止成塊。一旦所述固體在溶液中，將所述溶液轉(zhuǎn)移到70L反應(yīng)器中。用最小量90/5/5 TFA/水/二硫蘇糖醇洗滌所述壇和管道。在環(huán)境溫度下的氮氣氛下攪拌溶液4小時，然后冷卻至0-5℃。以使內(nèi)部溫度低于30℃的速率加入MTBE(45體積)。在氮氣流下真空過濾收集固體。用2×2體積MTBE洗滌反應(yīng)器、管道和固體，干燥至恒重(594g,70A％)。
將所述固體(594g)溶解于50％ACN/水(8體積，相對于AcAA1-36NH2裝料)并過濾。用50％ACN/水(2體積)洗滌所述容器和管道。用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)溶液pH至3.5-4.0，然后加入乙酸(0.18體積)將pH調(diào)節(jié)至4.9。在環(huán)境溫度下攪拌溶液15小時(IPC，注釋1)，然后用1M碳酸鉀調(diào)節(jié)pH至9-9.5。加入水(25體積)稀釋所述溶液成為85/15水/ACN。對生成的渾濁溶液取樣進(jìn)行wt/wt HPLC分析，并轉(zhuǎn)移到所述純化裝置。注釋1．方法TM2-0003-012．方法TM2-0006-0111.11純化HAA(1-36)-OH分為純化、冷凍干燥和包裝三個階段
％(wt／wt)=100-雜質(zhì)％-乙酸鹽％-水％-TFA％。在各批中的乙酸鹽含量為6-8％。
從6.97Kg AcAA1-36NH2分離的T-20總量為2.08Kg(凈重)。這表示AcAA1-36NH2的產(chǎn)率為49.3％。T-20的色譜純收率平均為55％。單獨運行的收率變化范圍為41-55％。最低的收率是因為柱或泵故障導(dǎo)致多次通過。一般來說，如果采用色譜法，收率范圍為50-55％。所分離的T-20的純度為93-95A％。
在純化期間檢查四個梯度，是為了比較目的在于最小化操作時間的方法1．15-22％ACN/60分鐘，22-36％ACN/525分鐘，330mL/分鐘。
2．16-26％ACN/60分鐘，26-40％ACN/525分鐘，330mL分鐘。
3．第二個三聯(lián)梯度(Second Trimeris gradient)。15-36％ACN1788分鐘，330mL/分鐘。
4．原三聯(lián)梯度(Origina Trimeris gradient),20-23％ACN/112分鐘，23-36％ACN/488分鐘，330mL/分鐘。
用Amberchrom樹脂(35cm床高)填充(軸向壓縮)20厘米(cm)柱。在溶液中對各批500-700g AcAA1-36NH2進(jìn)行去保護(hù)和脫羧。該規(guī)模產(chǎn)生含有約400g肽(約75A％T-20)的柱原料。所述原料溶液通常是混濁的并可能含有懸浮固體。用15％B以500mL/min將混濁溶液加樣在柱上。對于任何操作在柱加樣期間都沒有壓力產(chǎn)生。流速減少到330mL/min，在指定的時間內(nèi)運行特定梯度。收集流分，合并含有超過78％的T-20的流分(100-110L)，用水稀釋使乙腈含量約15-20％(約140L)。洗滌柱，然后用15％B平衡。將含T-20的溶液以900mL/min加樣回所述8英寸柱上。所述％B增加至50％，沖洗出柱的T-20約25L。
將所述溶液在1L鐘罩中冷凍并凍干成粉。所分離的T-20通常為92-94A％HPLC，并含有6-8％乙酸鹽和3-4％水。優(yōu)選方法將T-20的85/15水/乙腈溶液(27L)(pH9.2)以500mL/min泵入8英寸HPLC柱。在30分鐘內(nèi)流速降低至330mL/min(每5分鐘遞增30-40mL/min)。開始線性梯度，在600分鐘內(nèi)為20％B-36％B。收集流分直到吸光度低于0.2AUFS為止。用HPLC(注釋1)分析流分中的含量。用80％B以900mL/min洗滌柱10分鐘，然后降回至15％B并以900mL/min平衡。合并含有78A％以上的T-20的流分(113L)，用緩沖液(28.2L)稀釋使所述乙腈濃度為15-20％。以900mL/min將溶液泵至所述柱上。％B增至50％，以900mL/min將T-20從所述柱洗脫出約25L。T-20濃度約為9-10mg/mL。將溶液轉(zhuǎn)移至1L凍干罐中，冷凍并凍干獲得216.29T-20，收率54.9％,94.1A％純。注釋1．用HPLC分析流分的含量和純度。
YMC ODS-A,150×4.6mm,5μm,120A1mL/min,220nm,30℃A 70/30 50mMNH4OAc(pH7，用氫氧化銨調(diào)節(jié))ACNB 5:95 50mM NH4OAc(pH7，用氫氧化銨調(diào)節(jié))ACN0-15％B/50分鐘，15-100％B/2分鐘，100％B/3分鐘。
T-20保留時間29.0分鐘11.12肽的熱穩(wěn)定性進(jìn)行一系列試驗以特征鑒定所述中間體T-20片段的熱穩(wěn)定性。用水飽和T-20片段，過濾，然后置于密封容器中并暴露于高溫。在數(shù)個時間點收集樣品并用HPLC法分析獲得純度變化。用熱解重量分析法(TGA)也可特征鑒定干燥T-20片段的穩(wěn)定性。
除了AcAA1-16OH外所有片段均可以在40℃干燥3天。只在兩種片段FmocAA27-35OH(3％)和FmocAA27-36NH2(1.4％)中在80℃24小時后觀察到一般程度的降解。片段AcAA1-16OH開始為97A％純。在40℃3天后，它為93.4A％純并干燥。再在80℃24小時后，它仍然為93.9A％。應(yīng)該在環(huán)境溫度下干燥潮濕的AcAA1-16OH。
穩(wěn)定性研究的目的是確定所述片段是否可在40℃而不是在環(huán)境溫度下干燥。所述研究表明所述片段在40℃干燥是穩(wěn)定的。這將顯著降低干燥時間。
已完成在模擬其分離和純化的不同溶劑和溫度條件下檢測片段Ac(1-16)-OH、Fmoc(27-35)-OH、Fmoc(17-26)-OH、Fmoc(27-36)-NH2、Fmoc(17-36)-NH2、H(17-36)-NH2和Ac(1-36)-NH2的研究。所有片段在其分離和/或純化的溶劑體系中是穩(wěn)定的，用X表示穩(wěn)定性
時間中間體 儲存液 開始 1小時 6小時 1天 3天F(27-35)-OH9∶1 EtOH∶H2O,X X X X X40℃F(17-26)-OH80∶20 EtOH/H2O, X X X X X40℃F(27-36)-NH21∶1 NMP/H2O, X X X X X40℃Ac(1-16)-OH0.01M HCl,X X X X X5-10℃F(17-36)-NH295％IPA/H2O, X X X X X60-65℃50％H2O/NMP, X X X X X50℃90∶10 EtOH/H2O, X X X X X40℃H(17-36)-NH21.5∶1 H2O/DMF, X X X X X40℃Ac(1-36)-NH29∶1 CAN/H2O,X X X X X50℃50％H2O/NMP, X X X X X50℃85∶15 EtOH∶H2O, X X X X X70℃X=HPLC含量和雜質(zhì)、肉眼檢測外觀本發(fā)明范圍不限于本文所述的具體實施方案的范圍，所述具體實施方案僅用來說明本發(fā)明的各個方面，而且作用上等同的方法和組分均屬于本發(fā)明范圍。實際上，根據(jù)以上的描述和附圖，除了本文指明和描述的之外，對本發(fā)明進(jìn)行的各種改進(jìn)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。這類改進(jìn)屬于后附權(quán)利要求書范圍。
權(quán)利要求
1．合成下式肽的方法Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQIDNO:1)，該方法包括(a)使式Fmoc-EKNEQELLEL-COOH(SEQ ID NO:11)的側(cè)鏈保護(hù)肽與式NH2-DKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:18)的側(cè)鏈保護(hù)肽反應(yīng)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWE-NH2(SEQ ID NO:12)；(b)使在(a)中產(chǎn)生的肽的氨基末端去保護(hù)；(c)使在(b)中產(chǎn)生的肽與式Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)的側(cè)鏈保護(hù)肽反應(yīng)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)；(d)使在(c)中產(chǎn)生的肽的氨基末端修飾為乙酰修飾物；和(e)使(d)的側(cè)鏈保護(hù)肽的側(cè)鏈去保護(hù)，產(chǎn)生下式肽Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)。
2．合成下式肽的方法Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQID NO:1)，該方法包括(a)使式Fmoc-EKNEQELLEL-COOH(SEQ ID NO:11)的側(cè)鏈保護(hù)肽與式NH2-DKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:18)的側(cè)鏈保護(hù)肽反應(yīng)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)；(b)使在(a)中產(chǎn)生的肽的氨基末端去保護(hù)；(c)使在(b)中產(chǎn)生的肽與下式側(cè)鏈保護(hù)肽反應(yīng)Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Ac-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)；和(d)使(c)的側(cè)鏈保護(hù)肽的側(cè)鏈去保護(hù)，產(chǎn)生下式肽Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)。
3．合成下式肽的方法Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQID NO:1)，該方法包括(a)使下式側(cè)鏈保護(hù)肽的氨基末端去保護(hù)Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)；(b)使在(a)中產(chǎn)生的肽與下式側(cè)鏈保護(hù)肽反應(yīng)Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)；(c)使在(b)中產(chǎn)生的肽的氨基末端去保護(hù)；(d)使在(c)中產(chǎn)生的肽的氨基末端修飾為乙酰修飾物；和(e)使(d)的側(cè)鏈保護(hù)肽的側(cè)鏈去保護(hù)，產(chǎn)生下式肽Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)。
4．合成具有以下化學(xué)式的肽的方法Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQID NO:1)，該方法包括(a)使下式側(cè)鏈保護(hù)肽的氨基末端去保護(hù)Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)；(b)使在(a)中產(chǎn)生的肽與下式側(cè)鏈保護(hù)肽反應(yīng)Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)；和(c)使(b)的側(cè)鏈保護(hù)肽的側(cè)鏈去保護(hù)，產(chǎn)生下式肽Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)。
5．權(quán)利要求3或4的方法，其中式Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的側(cè)鏈保護(hù)肽用以下方法合成，該方法包括(a)使下式側(cè)鏈保護(hù)肽與HPheNH2反應(yīng)Fmoc-DKWASLWNW-COOH(SEQ ID NO:17)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-DKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:18)；(b)使在(a)中產(chǎn)生的肽的氨基末端去保護(hù)；和(c)使在(b)中產(chǎn)生的肽與下側(cè)鏈保護(hù)肽反應(yīng)式Fmoc-EKNEQELLEL-COOH(SEQ ID NO:11)，獲得下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)。
6．權(quán)利要求3或4的方法，其中式Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的側(cè)鏈保護(hù)肽用以下方法合成，該方法包括(a)使下式側(cè)鏈保護(hù)肽與HPheNH2反應(yīng)Fmoc-LELDKWASLWNW-COOH(SEQ ID NO:15)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-LELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:16)；(b)使在(a)中產(chǎn)生的肽的氨基末端去保護(hù)；和(c)使在(b)中產(chǎn)生的肽與下式側(cè)鏈保護(hù)肽反應(yīng)Fmoc-EKNEQEL-COOH(SEQ ID NO:10)，獲得下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)。
7．權(quán)利要求3或4的方法，其中式Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的側(cè)鏈保護(hù)肽用以下方法合成，該方法包括(a)使下式肽的氨基末端去保護(hù)Fmoc-DKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:16)；和(b)使在(a)中產(chǎn)生的肽與下式側(cè)鏈保護(hù)肽反應(yīng)Fmoc-EKNEQELLEL-COOH(SEQ ID NO:10)，獲得下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)。
8．權(quán)利要求3或4的方法，其中式Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的側(cè)鏈保護(hù)肽用以下方法合成，該方法包括(a)使下式側(cè)鏈保護(hù)肽與HPheNH2反應(yīng)Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNW-COOH(SEQ ID NO:19)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)。
9．權(quán)利要求1或3的方法，其中式Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-NH2(SEQ ID NO:4)的側(cè)鏈保護(hù)肽用以下方法合成，該方法包括(a)使下式側(cè)鏈保護(hù)肽的氨基末端去保護(hù)Fmoc-IEESQNQQ-NH2(SEQ ID NO:7)；(b)使在(a)中產(chǎn)生的側(cè)鏈保護(hù)肽與下式側(cè)鏈保護(hù)肽反應(yīng)Fmoc-YTSLIHSL-COOH(SEQ ID NO:2)，獲得下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-NH2(SEQ ID NO:4)。
10．權(quán)利要求2或4的方法，其中式Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)的側(cè)鏈保護(hù)肽用以下方法合成，該方法包括(a)使下式側(cè)鏈保護(hù)肽與HGlnOPNB反應(yīng)Fmoc-IEESQNQ-COOH(SEQ ID NO:6)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-IEESQNQQ-OPNB(SEQ ID NO:7)；(b)使在(a)中產(chǎn)生的側(cè)鏈保護(hù)肽的氨基末端去保護(hù)；(c)使在(b)中產(chǎn)生的側(cè)鏈保護(hù)肽與下式側(cè)鏈保護(hù)肽反應(yīng)Ac-YTSLIHSL-COOH(SEQ ID NO:2)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB(SEQ ID NO:4)；(d)使在(c)中產(chǎn)生的側(cè)鏈保護(hù)肽的羧基末端去保護(hù)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)。
11．權(quán)利要求1或3的方法，其中式Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)的側(cè)鏈保護(hù)肽用以下方法合成，該方法包括(a)使下式側(cè)鏈保護(hù)肽與HGlnOPNB反應(yīng)Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQ-COOH(SEQ ID NO:3)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB(SEQ ID NO:4)；和(b)使在(a)中產(chǎn)生的肽的羧基末端去保護(hù)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(SEQ ID NO:4)。
12．合成下式肽的方法Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQID NO:1)，該方法包括(a)使下式側(cè)鏈保護(hù)肽的氨基末端去保護(hù)Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:9)；(b)使在(a)中產(chǎn)生的肽與下式側(cè)鏈保護(hù)肽反應(yīng)Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQ-COOH(SEQ ID NO:3)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)；(c)使在(b)中產(chǎn)生的肽的氨基末端修飾為乙酰修飾物；和(d)使(c)的側(cè)鏈保護(hù)肽的側(cè)鏈去保護(hù)，產(chǎn)生下式肽Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)。
13．權(quán)利要求12的方法，其中式Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:9)的側(cè)鏈保護(hù)肽用以下方法合成，該方法包括(a)使下式側(cè)鏈保護(hù)肽與HPheNH2反應(yīng)Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNW-NH2(SEQ ID NO:8)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:9)。
14．合成下式肽的方法Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)，該方法包括(a)使下式側(cè)鏈保護(hù)肽的氨基末端去保護(hù)Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:14)；(b)使在(a)中產(chǎn)生的肽與下式側(cè)鏈保護(hù)肽反應(yīng)Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEK-COOH(SEQ ID NO:5)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)；(c)使在(b)中產(chǎn)生的肽的氨基末端修飾為乙酰修飾物；和(d)使(c)的側(cè)鏈保護(hù)肽的側(cè)鏈去保護(hù)，產(chǎn)生下式肽Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:1)。
15．權(quán)利要求14的方法，其中下式Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:14)的側(cè)鏈保護(hù)肽用以下方法合成，該方法包括(a)使下式側(cè)鏈保護(hù)肽與HPheNH2反應(yīng)Fmoc-NEQELLELDKWASLWNW-NH2(SEQ ID NO:13)，產(chǎn)生下式側(cè)鏈保護(hù)肽Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:14)。
16．權(quán)利要求1、2、3、4、12或14的方法，其中下式Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQID NO:1)的側(cè)鏈保護(hù)肽以約1千克或1千克以上的產(chǎn)量生產(chǎn)。
17．權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中下式Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的側(cè)鏈保護(hù)肽以約1千克或1千克以上的產(chǎn)量生產(chǎn)。
18．權(quán)利要求5的方法，其中下式Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的側(cè)鏈保護(hù)肽以約1千克或1千克以上的產(chǎn)量生產(chǎn)。
19．權(quán)利要求6的方法，其中下式Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的側(cè)鏈保護(hù)肽以約1千克或1千克以上的產(chǎn)量生產(chǎn)。
20．權(quán)利要求7的方法，其中下式Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的側(cè)鏈保護(hù)肽以約1千克或1千克以上的產(chǎn)量生產(chǎn)。
21．權(quán)利要求8的方法，其中下式Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:12)的側(cè)鏈保護(hù)肽以約1千克或1千克以上的產(chǎn)量生產(chǎn)。
22．權(quán)利要求9的方法，其中下式Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-NH2(SEQ ID NO:4)的側(cè)鏈保護(hù)肽以約1千克或1千克以上的產(chǎn)量生產(chǎn)。
23．權(quán)利要求10的方法，其中下式Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-NH2(SEQ ID NO:4)的側(cè)鏈保護(hù)肽以約1千克或1千克以上的產(chǎn)量生產(chǎn)。
24．權(quán)利要求11的方法，其中下式Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-NH2(SEQ ID NO:4)的側(cè)鏈保護(hù)肽以約1千克或1千克以上的產(chǎn)量生產(chǎn)。
25．權(quán)利要求13的方法，其中下式Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:9)的側(cè)鏈保護(hù)肽以約1千克或1千克以上的產(chǎn)量生產(chǎn)。
26．權(quán)利要求15的方法，其中下式Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH2(SEQ ID NO:14)的側(cè)鏈保護(hù)肽以約1千克或1千克以上的產(chǎn)量生產(chǎn)。
27．一組肽片段，它包括一組選自以下的肽片段(a)YTSLIHSLIEESQNQQ(SEQ ID NO:4),EKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:12)；(b)YTSLIHSLIEESQNQQ,(SEQ ID NO:4),EKNEQELLEL(SEQ ID N0:11),DKWASLWNWF(SEQ ID NO:18)；(c)YTSLIHSLIEESQNQQ(SEQ ID NO:4),EKNEQELLEL,(SEQ ID NO:11),DKWASLWNW(SEQ ID NO:17)；(d)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQ(SEQ ID NO:6),EKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:12)；(e)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQ(SEQ ID NO:6),EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11),DKWASLWNWF(SEQ ID NO:18)；(f)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQ(SEQ ID NO:6),EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11),DKWASLWNW(SEQ ID NO:17)；(g)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQQ(SEQ ID NO:7),EKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:12)；(h)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQQ(SEQ ID NO:7),EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11),DKWASLWNWF(SEQ ID NO:18)；(i)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQQ(SEQ ID NO:7),EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11),DKWASLWNW(SEQ ID NO:17)；(j)YTSLIHSLIEESQNQQ(SEQ ID NO:4),EKNEQEL(SEQ ID NO:10),LELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:16)；(k)YTSLIHSLIEESQNQQ(SEQ ID NO:4),EKNEQEL(SEQ ID NO:10),LELDKWASLWNW(SEQ ID NO:15)；(l)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQ(SEQ ID NO:6),EKNEQEL(SEQ ID NO:10),LELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:16)；(m)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQ(SEQ ID NO:6),EKNEQEL(SEQ ID NO:10),LELDKWASLWNW(SEQ ID NO:15)；(n)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQQ(SEQ ID NO:7),EKNEQEL(SEQ ID NO:10),LELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:16)；(o)YTSLIHSL(SEQ ID NO:2),IEESQNQQ(SEQ ID NO:7),EKNEQEL(SEQ ID NO:10),LELDKWASLWNW(SEQ ID NO:15)；(p)YTSLIHSLIEESQNQ(SEQ ID NO:3),QEKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO:8)；(q)YTSLIHSLIEESQNQ(SEQ ID NO:3),QEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:9)；(r)YTSLIHSLIEESQNQQEK(SEQ ID NO:5),NEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:14)；(s)YTSLIHSLIEESQNQQEK(SEQ ID NO:5),NEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO:13)；和(t)YTSLIHSLIEESQNQQ(SEQ ID NO:4)EKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO:19)。
28．一種選自下列肽的肽YTSLIHSL(SEQ ID NO:2)；IEESQNQ(SEQ ID NO:6)；IEESQNQQ(SEQ ID NO:7)；QEKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO:8)；EKNEQEL(SEQ ID NO:1O)；EKNEQELLEL(SEQ ID NO:11)；NEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO:13)；LELDKWASLWNW(SEQ ID NO:15)；LELDKWASLWNWF(SEQ ID NO:16)；DKWASLWNW(SEQ ID NO:17)；DKWASLWNWF(SEQ ID NO:18)；和EKNEQELLELDKWASLWNW(SEQ ID NO:19)
全文摘要
本發(fā)明首先涉及肽尤其是T－20(也稱為“DP－178”;SEQ IDNO:1)和T－20樣肽的合成方法。該方法利用固相或液相合成法合成和組合具體肽片段組,獲得目的肽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及作為所述目的肽(例如T－20)合成中的中間體的各個肽片段。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及可一起用來產(chǎn)生全長T－20和T－20樣肽的所述肽中間體片段組。
文檔編號C07K16/00GK1303299SQ99806431
公開日2001年7月11日 申請日期1999年3月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月23日
發(fā)明者M·C·康, B·布雷, M·利克蒂, C·馬德爾, G·梅魯特卡 申請人:特萊默里斯公司