專(zhuān)利名稱(chēng)：刺激神經(jīng)和腎生長(zhǎng)的RET配體(RetL)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼Ret配體(RetL)的核苷酸序列，以及通過(guò)用RetLDNA或蛋白處理細(xì)胞和哺乳動(dòng)物材料以刺激神經(jīng)和腎生長(zhǎng)的方法。發(fā)明背景目前關(guān)于細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和受體激活的研究的目的之一是使細(xì)胞生長(zhǎng)和存活過(guò)程的治療調(diào)節(jié)成為可能。這些過(guò)程決定多種醫(yī)學(xué)情況，例如器官衰竭，胎兒發(fā)育，和腫瘤生長(zhǎng)等等的結(jié)果。上述每種情況具有世界范圍內(nèi)的臨床重要性，并且有效治療方案有限。本發(fā)明的目的是提供促進(jìn)損傷組織再生或存活和治療涉及組織生長(zhǎng)發(fā)育異常的失調(diào)的組合物和方法。
組織遺失和最后階段器官衰竭每年影響全世界幾百萬(wàn)人口并且大量增加了醫(yī)療保健費(fèi)用。器官或組織遺失通常通過(guò)移植損獻(xiàn)者器官，通過(guò)外科手術(shù)重建或用機(jī)械裝置來(lái)治療。上述每種療法都有缺點(diǎn)。移植受到捐獻(xiàn)者缺乏的限制，外科手術(shù)重建會(huì)導(dǎo)致別的長(zhǎng)期問(wèn)題，機(jī)械裝置不能完成一個(gè)器官的所有功能，因而不能防止進(jìn)行性的退化。因此，存在真正的醫(yī)療需要以找到這些問(wèn)題新的解決方案。
影響細(xì)胞生長(zhǎng)，分化和/或存活的蛋白因子可能對(duì)治療含應(yīng)答細(xì)胞的器官失調(diào)有用。在這方面，人們對(duì)能與受體蛋白酪氨酸激酶(RPTK)家族的受體相互作用的因子或配體尤其有興趣。這些受體參與包括細(xì)胞生長(zhǎng)和分化及瘤發(fā)生的多種細(xì)胞過(guò)程。因而，能與這些受體相互作用的因子或配體可能在治療有組織損傷的某些器官失調(diào)中有用。另外，也可用于阻斷這些因子與它們的受體相互作用，以阻止腫瘤生長(zhǎng)。
Ret原癌基因編碼受體酪氨酸激酶。在包括外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)及腎臟的各種組織的發(fā)育過(guò)程中表達(dá)。存在于Ret缺陷型小鼠中的各種異?，F(xiàn)象表明Ret對(duì)于小腸神經(jīng)元分布及遷移到后腸，以及腎發(fā)育過(guò)程中輸尿管芽上皮的增殖和分枝具有關(guān)鍵作用(自然367,380-383,1994)。尋找Ret信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組分，Ret配體，成為人們重點(diǎn)研究的領(lǐng)域。發(fā)明概述本發(fā)明提供編碼RetL的分離純化DNA分子，含任何RetL的核苷酸序列，但尤其包括大鼠retL1 cDNA(SEQ ID NO:1)，人部分retL1 cDNA(SEQ ID NO:8)，人全長(zhǎng)retL1 cDNA(SEQ ID NO:10)，人retL2 cDNA(SEQ ID NO:12)，鼠retL3 cDNA(SEQ ID NO:16)，人部分retL3 cDNA(SEQ ID NO:18)，或人retL3 cDNA(SEQ ID NO:20)。本發(fā)明進(jìn)一步提供Ret L蛋白，具有包括大鼠RetL1(SEQ ID NO:2)，人部分RetL1(SEQID NO:9)，人全長(zhǎng)Ret L1(SEQ ID NO:1)，人RetL2(SEQ ID NO:13)，鼠RetL3(SEQ ID NO:17)，人部分RetL3(SEQ ID NO:19)或人RetL3(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括DNA序列，該序列包含HRL20克隆，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心編號(hào)97604，的插入DNA序列[人的部分retL1 cDNA(SEQ ID NO:8)]，或#230-5A-86-17克隆，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心編號(hào)98047，的插入DNA序列[大鼠的retL1 cDNA(SEQ IDNO:1)]。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在原核或真核宿主細(xì)胞中用分離純化的DNA分子穩(wěn)定表達(dá)的多肽產(chǎn)物具有至少部分RetL一級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象和生物活性；該DNA可以是a)包括大鼠retL1 cDNA，人的部分retL1 cDNA，人全長(zhǎng)retL1 cDNA，人retL2 cDNA，鼠retL3 cDNA或人retL3 cDNA；或者大鼠retL1 cDNA，人的部分retL1 cDNA，人全長(zhǎng)retL1 cDNA，人retL2 cDNA，鼠retL3 cDNA或人retL3 cDNA的互補(bǔ)鏈的DNA分子；b)在嚴(yán)格條件下能與a)中所述DNA分子或其片段雜交的DNA分子；或c)因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，能與a)、b)中所述DNA分子雜交的DNA分子。編碼人RetL的多肽片段或變體的具有Ret生物活性的分離純化DNA分子也在本發(fā)明之內(nèi)。
本發(fā)明任何重組DNA分子可以適當(dāng)?shù)嘏c調(diào)控序列相連。
包含了本說(shuō)明書(shū)其它地方所述的DNA分子或構(gòu)建體的載體和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也包括在本發(fā)明之內(nèi)。載體可以包含編碼RetL或RetL變體的DNA分子。
本發(fā)明包括用含編碼天然RetL或RetL變體的DNA分子的載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞。
本發(fā)明特別包括基本不含其它人類(lèi)蛋白的分離純化的人RetL。本發(fā)明也包括生產(chǎn)具有部分或全部RetL一級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象和生物活性的多肽產(chǎn)物的方法。此方法可以包括在合適的培養(yǎng)條件下，以允許表達(dá)這樣的多肽產(chǎn)物的方式培養(yǎng)用本發(fā)明任何DNA分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞，并回收RetL。本發(fā)明也包括在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)DNA的多肽產(chǎn)物。
本發(fā)明還包括水溶性或膜結(jié)合的蛋白，蛋白片段，變體和衍生物。在所選的實(shí)施方案中該蛋白具有包括大鼠RetL1；人部分RetL1，人全長(zhǎng)RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3的氨基酸序列，或這些序列之一的變體。在其它實(shí)施方案中，該蛋白是融合蛋白，包括與另一種分子或分子片段，如免疫球蛋白，毒素蛋白，可成像化合物或放射性核素融合的Ret或RetL。本發(fā)明也包括含RetL的嵌合分子。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括對(duì)本發(fā)明的RetL特異的單克隆抗體。這種抗體可與毒素，可成像化合物或放射性核素結(jié)合。本發(fā)明還包括產(chǎn)生對(duì)Ret特異的抗體的雜交瘤細(xì)胞系，包括AA.FF9,AA.HE3,AF.E9,BA.B1,BB.B6,AA.GE7,CD.F11,AH.E3,CD.G4,AG.E7,BD.G6,BH.G8，和這些雜交瘤細(xì)胞的亞克隆，以及這些雜交瘤細(xì)胞或其亞克隆產(chǎn)生的抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步包括促進(jìn)新生組織生長(zhǎng)，或促進(jìn)受治療者損傷組織存活的方法，包括給受治療者施用有效治療劑量的能與細(xì)胞的Ret相互作用的化合物，并由此誘導(dǎo)Ret的自身磷酸化，該化合物可以是RetL1,RetL2，或RetL3，全長(zhǎng)RetL的片段，或可與Ret結(jié)合的抗體。該化合物應(yīng)與有效治療劑量的第二種化合物如GDNF,neurturin，或GDNF相關(guān)分子同時(shí)注射。雖然用于這些方法的組織可以包括任何組織，但優(yōu)選的組織包括腎組織，神經(jīng)組織，心臟，胃，小腸，脊柱或肺。在一個(gè)實(shí)施方案中，RetL是可溶的RetL。這些方法的受治療者是人。
本發(fā)明的另一方法中，表達(dá)RetL的第一個(gè)細(xì)胞和第二個(gè)細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)用可溶性Ret蛋白或針對(duì)RetL的抗體與第一個(gè)細(xì)胞接觸抑制?？扇苄訰et蛋白可以是融合蛋白。
本發(fā)明也包括將毒素，可成像化合物，或放射性核素導(dǎo)向表達(dá)Ret的細(xì)胞的方法，包括用與毒素，可成像化合物或放射性核素偶聯(lián)的RetL融合蛋白或抗Ret抗體接觸細(xì)胞。該RetL可以是RetL1,RetL2或RetL3。另一種方法中，其中一步是使腫瘤細(xì)胞與RetL和毒蛋白或放射性核素的融合蛋白或偶聯(lián)了毒蛋白或放射性核素的Ret抗體接觸，從而抑制表達(dá)Ret的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。該細(xì)胞可以在受治療者體內(nèi)，該蛋白和偶聯(lián)的抗體被施用給受實(shí)驗(yàn)者。
本發(fā)明還包括將毒蛋白，可成像化合物，或放射性核素導(dǎo)向表達(dá)RetL的細(xì)胞的方法，包括用Ret與毒素，可成像化合物，或放射性核素的融合蛋白或偶聯(lián)了毒蛋白，可成像化合物，或放射性核素的RetL抗體與細(xì)胞接觸。另一個(gè)實(shí)施方案是抑制表達(dá)RetL的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括用Ret與毒素或放射性核素的融合蛋白或偶聯(lián)了毒蛋白，放射性核素的RetL抗體與腫瘤細(xì)胞接觸；該細(xì)胞可位于受治療者體內(nèi)，蛋白施用給受治療者。
本發(fā)明中所有方法使用的RetL都可以是RetL1,RetL2或RetL3，或者RetL1,RetL2,RetL3的變體或片段。
本發(fā)明還包括基因治療方法。一個(gè)實(shí)施方案是治療患Ret代謝紊亂的對(duì)象的方法，包括向受治療者施用含編碼RetL的DNA分子的載體，以及促進(jìn)受治療者新生組織生長(zhǎng)的方法，包括施用這樣的載體給受治療者。另一個(gè)實(shí)施方案包括促進(jìn)受治療者體內(nèi)損傷組織存活的方法，其中一步是向受治療者施用有效治療劑量的編碼RetL的載體。附圖簡(jiǎn)述

圖1是大鼠RetL的cDNA序列(SEQ ID NO:1)和推測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。核苷酸序列從SEQ ID NO:1序列的第201位堿基對(duì)延伸到第1700位堿基對(duì)，包含整個(gè)開(kāi)放閱讀框架。圖2A是人RetL1的部分cDNA序列(SEQ ID NO:8)和推測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。該序列是HRL20克隆，以編號(hào)97604保存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，的插入片段。圖2B是人RetL1的合成的全長(zhǎng)DNA序列(SEQ ID NO:10)和推測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。圖3A是人RetL1的核苷酸序列(上行序列)與鼠RetL1序列(下行序列)的比較，核苷酸之間的垂直線表示在該位點(diǎn)上是相同的，點(diǎn)表示在該位點(diǎn)有間隙。圖3B是人RetL的氨基酸序列(上行序列)與大鼠RetL1序列(下行序列)的比較。相應(yīng)氨基酸之間的垂直線表示殘基相同，點(diǎn)表示該殘基保守性取代。圖4A是在后腎間質(zhì)細(xì)胞和輸尿管芽細(xì)胞相互作用中Ret和RetL的可能作用的圖示。圖4B是從cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)染子中篩選表達(dá)RetL的克隆的方法圖示。通過(guò)估計(jì)這些轉(zhuǎn)染子與Ret/IgG融合蛋白或Ret/堿性磷酸酶融合蛋白的結(jié)合來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)染子中是否有RetL表達(dá)。圖5是表示構(gòu)建用于表達(dá)大鼠Ret/IgG融合蛋白的質(zhì)粒的圖示。圖6是表示構(gòu)建用于表達(dá)人Ret/IgG融合蛋白的質(zhì)粒的圖示。圖7是從DSW240克隆中得到的人retL2的cDNA序列(SEQ ID NO:12)和推測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)。含有位于25位到1416位核苷酸之間的蛋白閱讀框架。圖8是人RetL2的氨基酸序列(上行序列)與人RetL1序列(下行序列)的比較。氨基酸之間的垂直線表示該位置相同，點(diǎn)表示該位置留有間隙。圖9是鼠RetL3的cDNA序列(SEQ ID NO:16)和推測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。圖10是人RetL3的cDNA序列(SEQ ID NO:20)和推測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)。發(fā)明詳述序列登記號(hào)說(shuō)明書(shū)中提及的核苷酸和氨基酸序列已被賦予以下序列登記號(hào)。
SEQ ID NO:1-大鼠retL1 cDNA
SEQ ID NO:2-大鼠RetL1氨基酸SEQ ID NO:3-寡聚體kid-13SEQ ID NO:4-寡聚體kid-14SEQ ID NO:5-寡聚體kid-15SEQ ID NO:6-大鼠胞外ret cDNASEQ ID NO:7-大鼠胞外Ret氨基酸SEQ ID NO:8-人部分retL1 cDNASEQ ID NO:9-人部分RetL1氨基酸SEQ ID NO:10-人retL1 cDNASEQ ID NO:11-人RetL1氨基酸SEQ ID NO:12-人retL2 cDNASEQ ID NO:13人RetL2氨基酸SEQ ID NO:14-鼠部分retL3 cDNA(EST AA 50083)SEQ ID NO:15-鼠的部分RetL3氨基酸SEQ ID NO:16-鼠retL3 cDNASEQ ID NO:17-鼠RetL3氨基酸SEQ ID NO:18-人部分retL3 cDNASEQ ID NO:19-人部分RetL3氨基酸SEQ ID NO:20-人retL3 cDNASEQ ID NO:21-人RetL3氨基酸定義如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“RetL”是指任何能與Ret受體蛋白特異性相互作用的蛋白，并且當(dāng)它與Ret作用時(shí)可激發(fā)Ret形成二聚體和/或Ret酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生自身磷酸化。編碼RetL和Ret的DNA序列分別稱(chēng)為“retL”和“ret”。配體可以是可溶的或以與它要激發(fā)其自磷酸化的Ret分子位于同一細(xì)胞或不同細(xì)胞的膜結(jié)合的分子存在。在特定應(yīng)用或與Ret相互作用中，配體可能需要?jiǎng)e的分子來(lái)激發(fā)自身磷酸化。本發(fā)明的配體包括輔助受體或附屬的配體輔因子。本發(fā)明的配體進(jìn)一步包括抗Ret的單克隆抗體，該抗體可作為Ret拮抗物，激發(fā)Ret二聚體形成和自身磷酸化。配體也可用各種方法修飾，如摻入為融合蛋白的一部分，如與毒素或放射性核素結(jié)合。
對(duì)于“序列匹配”，是指將一種核苷酸或氨基酸的序列與另一種放在一起，以比較兩種序列的相關(guān)部分。此過(guò)程的一種方法的例子在Needleman等(分子生物學(xué)雜志48:443-453,1970)中給出。通過(guò)計(jì)算機(jī)程序如Align程序(DNAstar,Inc.)可方便地運(yùn)用此方法。在本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解同源或功能相同的序列包括保守半胱氨酸骨架中半胱氨酸殘基功能相同的排列，包括雖然改變了這些半胱氨酸線性排列但沒(méi)有實(shí)質(zhì)地?fù)p害蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)中半胱氨酸相互關(guān)系的氨基酸插入或缺失。因此，在計(jì)算所選的和引用的序列之間氨基酸序列的同源性或同一性水平時(shí)，忽略所選序列中的中間空隙和氨基酸插入。常用于建立蛋白質(zhì)同源性的一個(gè)特征是一種蛋白與另一種蛋白之間半胱氨酸殘基數(shù)目及位置的相似性。
對(duì)于“克隆”，是指用體外重組技術(shù)將特定基因或其它DNA序列插入載體分子。為了成功地克隆所需的基因，必須采用獲得DNA片段，連接片段到載體分子，將合成的DNA分子導(dǎo)入能在其中復(fù)制的宿主細(xì)胞，以及從受體宿主細(xì)胞中篩選含目的基因的克隆等的方法。
對(duì)于“cDNA”，是指通過(guò)RNA依賴(lài)型DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)的作用由RNA模板生成的互補(bǔ)或拷貝DNA。因此“cDNA克隆”就指在克隆載體中帶有的與所需RNA分子互補(bǔ)的雙鏈DNA序列。
對(duì)于“cDNA文庫(kù)”，是指含有cDNA片段插入的重組DNA分子的集合體，cDNA插入片段依賴(lài)RNA模板的來(lái)源包含了整個(gè)有機(jī)體或組織的mRNA分子的代表。這樣的cDNA文庫(kù)可以用技術(shù)人員已知的方法制備，舉例來(lái)說(shuō)，在Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，同上中描述。一般地，首先從有機(jī)體細(xì)胞中分離RNA，其基因組中含有所要克隆的特定基因。對(duì)于本發(fā)明的目的，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，特別是人的細(xì)胞系。另外，RNA也可以從來(lái)自動(dòng)物腫瘤，優(yōu)選地來(lái)自人腫瘤的腫瘤細(xì)胞中提取。因此，文庫(kù)可以從，例如人腎上腺瘤制備，但任何腫瘤都可以使用。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“DNA多樣性”是指在DNA的特定位點(diǎn)可以存在兩個(gè)或多個(gè)不同的核苷酸序列的情況。
“表達(dá)載體”包括能表達(dá)其中所含的DNA序列，即與能影響它們表達(dá)的其它序列適當(dāng)連接的編碼序列的載體。盡管沒(méi)有每次明確指出，但含有這些表達(dá)載體必須能在宿主有機(jī)體中以附加體或染色體的整合部分復(fù)制的意思。有效表達(dá)載體的一個(gè)有用的但非必須的元件是標(biāo)記編碼序列，該序列編碼使具有該蛋白的細(xì)胞有表型特征(例如四環(huán)素抗性)的蛋白，使得這些細(xì)胞可以容易地得到鑒別。總之，“表達(dá)載體”被賦予了功能性定義，當(dāng)它用于特定序列時(shí)任何能影響特定的所含基因編碼區(qū)表達(dá)的DNA序列都包括在此術(shù)語(yǔ)內(nèi)。這些載體經(jīng)常是以質(zhì)粒的形式，因此“質(zhì)?！焙汀氨磉_(dá)載體”經(jīng)常通用。但是，本發(fā)明預(yù)期包括其它形式的表達(dá)載體，包括噬菌體，它可以起到同樣的作用，并且會(huì)慢慢在本領(lǐng)域變得公知。
同樣，本發(fā)明中的任何一種蛋白的基因的“功能衍生物”是指基因的“片段”，“變體”和“類(lèi)似物”，它們?cè)诤塑账嵝蛄猩稀盎鞠嗨啤?，并且編碼具有相同活性的分子。
“GDNF相關(guān)分子”是指與GDNF或neurturin有至少40％同源性并且也能與RetL特異性結(jié)合的任何分子。
術(shù)語(yǔ)“基因”是指編碼多肽的多聚核苷酸序列。
對(duì)于“同源的”，是指當(dāng)提及多肽或DNA序列時(shí)，在所考慮的組合中基本上所有分子的一級(jí)分子結(jié)構(gòu)(即氨基酸或核苷酸序列)是相同的。
此處在提及探針，要檢測(cè)的寡聚體片段，寡聚體對(duì)照，非標(biāo)記封閉寡聚體和用于序列擴(kuò)增的引物時(shí)所用的術(shù)語(yǔ)“寡聚核苷酸”被定義為包含多于三個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。它的確切的大小依賴(lài)于許多因素，按順序依賴(lài)最終的功能或寡核苷酸的用途。
術(shù)語(yǔ)“探針”是指已知特性的能選擇性結(jié)合目的抗配體的配體。用于核酸時(shí)，術(shù)語(yǔ)“探針”是指含有與靶鏈互補(bǔ)堿基序列的核酸鏈。
“重組宿主細(xì)胞”是指用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。如此處定義的，由于轉(zhuǎn)化作用重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體或其修飾物而不是如未轉(zhuǎn)化宿主那樣產(chǎn)生很少的量，或更通常地，比可測(cè)量更少的量。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“限制性內(nèi)切酶”和“限制性酶”是指每一種在或接近特定核苷酸序列處切割雙鏈DNA的細(xì)菌酶類(lèi)。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性”(“RFCP”)是指在個(gè)體之間特定的限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度不同。
如果兩個(gè)分子的氨基酸序列基本相同，并且具有相似的生物活性，其中一個(gè)分子被稱(chēng)為與另一個(gè)分子“基本相似”。因此，只要二個(gè)分子具有相似活性，就認(rèn)為它們是如此處所用的術(shù)語(yǔ)變體，即使其中一個(gè)分子含有另一個(gè)分子中沒(méi)有的額外氨基酸殘基或者氨基酸殘基序列不同。正如此處所用的，當(dāng)一個(gè)分子含有另外的不是另一個(gè)分子正常的一部分的化學(xué)組分時(shí)，該分子稱(chēng)為另一分子的“化學(xué)衍生物”。這些組分可以提高分子的溶解度，吸收值，生物半衰期等。這些組分也可以選擇地降低分子的毒性，去除或減輕分子任何不需要的副作用等。能介導(dǎo)這些效應(yīng)的組分例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Mack出版公司，Easton,Penn.(1980)中公開(kāi)。
“載體”是指DNA片段可以插入或克隆到其中的來(lái)自質(zhì)粒或噬菌體的DNA分子。載體會(huì)包含一個(gè)或多個(gè)單酶切位點(diǎn)，能夠在特定的宿主或載體有機(jī)體中自主復(fù)制從而克隆的序列是可復(fù)制的。
“基本純”是指本發(fā)明的任何蛋白或編碼任何這樣蛋白的基因，基本上不含其它蛋白或基因，相應(yīng)地也不含任何一般可能在自然界中發(fā)現(xiàn)的其它污染物以及以自然界中未發(fā)現(xiàn)的形式存在的物質(zhì)。本發(fā)明的化合物本發(fā)明包括編碼RetL的cDNA，如大鼠retL1 cDNA，人部分retL1cDNA，人全長(zhǎng)retL1 cDNA，人retL2 cDNA，鼠retL3 cDNA或人retL3cDNA。另外，本發(fā)明的化合物包括含有上述序列的序列或這些序列之一的衍生物。本發(fā)明也包括載體、脂質(zhì)體和其它包含這些序列之一或這些序列之一的衍生物的載體工具。本發(fā)明也包括從大鼠retL1 cDNA，人部分retL1 cDNA，人全長(zhǎng)retL1 cDNA，人retL2 cDNA，鼠retL3 cDNA或人retL3 cDNA轉(zhuǎn)錄翻譯的蛋白，但不限于鼠RetL1，人部分Ret1，人全長(zhǎng)Ret1，人RetL2，鼠RetL3，或人RetL3，和它們的衍生物和變體。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括RetL的可溶性變體。可溶性變體缺少至少天然RetL的跨膜區(qū)部分。在一些例子中，可溶性變體缺少天然RetL的磷脂酰肌醇糖苷鍵?？扇苄宰凅w包括含有缺少磷脂酰肌醇結(jié)構(gòu)域的RetL衍生物的融合蛋白。
變體可以在氨基酸序列或在不涉及序列的方面，或二個(gè)方面同時(shí)與天然存在的RetL不同。當(dāng)一個(gè)或多個(gè)天然存在的RetL中的氨基酸被不同的天然氨基酸，氨基酸衍生物或非天然氨基酸取代時(shí)，產(chǎn)生氨基酸序列變體。特別優(yōu)選的變體包括天然存在的RetL，或天然存在的RetL的生物活性片段，它們的序列由于一個(gè)或多個(gè)保守的氨基酸替換與野生型序列不同，這些不同一般地對(duì)蛋白質(zhì)或肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和疏水性影響很小。變體也可以具有由于一個(gè)或多個(gè)非保守的氨基酸替換，缺失或插入而不同的序列，并且不失去RetL生物活性。保守的氨基酸替換典型地包括一個(gè)氨基酸替換另一個(gè)具相似特征的氨基酸，如下面幾組之間的取代纈氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰氨，谷氨酰氨；絲氨酸，蘇氨酸；賴(lài)氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸，賴(lài)氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
其它的保守的氨基酸替換可從下表中看出。并且還有其它的由Dayhaff在蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖表集中描述。
表1 保守的氨基酸替換
本發(fā)明中的其它變體是具提高了肽穩(wěn)定性的各種修飾的那些變體。這樣的變體包括，例如，在肽序列中的一個(gè)或多個(gè)非肽鍵(替換肽鍵)。也包括含不是天然存在的L-氨基酸殘基的變體，如D-氨基酸或非天然存在的或合成的氨基酸，如β或γ氨基酸和環(huán)狀變體。D-型代替L-型氨基酸摻入到多肽中可提高它對(duì)蛋白酶的抗性。見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利5,219,990。
本發(fā)明的肽也可以由諸如保守的或非保守的插入，缺失和替換的各種改變修飾，在它們的應(yīng)用中這樣的改變可能帶來(lái)某些優(yōu)點(diǎn)。剪接變體也特別地包括在本發(fā)明中。
除了基本上地全長(zhǎng)多肽外，本發(fā)明提供這些多肽的生物活性片段。如果RetL多肽或片段表現(xiàn)出天然存在的RetL的生物活性，那么它是具有生物活性的。這些生物活性包括特異性結(jié)合Ret的胞外區(qū)域的能力，其親合力至少是天然存在的RetL對(duì)Ret胞外部分親合力的50％，并優(yōu)選地與之相同。另一種生物活性是具有與導(dǎo)向天然存在的RetL上的抗原決定基的抗體結(jié)合的能力。
在其它的實(shí)施方案中，具有較低保守性的氨基酸替換的變體也可能導(dǎo)致所需的衍生物，例如通過(guò)引起電荷，構(gòu)象和其它生物特性的改變。這些替換可以包括，例如親水殘基替換成疏水殘基，半胱氨酸或脯氨酸殘基替換成另一種殘基，具小側(cè)鏈的殘基替換成具大側(cè)鏈的殘基，具凈正電荷的殘基替換成具凈負(fù)電荷的殘基。當(dāng)不能肯定地推測(cè)給定的替換的結(jié)果時(shí)，根據(jù)此處公開(kāi)的方法可以穩(wěn)定地分析這些衍生物以確定所需特性的存在或缺少。
一般地，期望引起Ret多肽功能特性改變的替換如下(ⅰ)疏水性殘基，例如，亮氨酸，異亮氨酸，苯丙氨酸或丙氨酸替換親水性殘基，例如，絲氨酸或蘇氨酸。(ⅱ)半胱氨酸殘基被任何其它殘基替換；(ⅲ)具帶正電側(cè)鏈的殘基，例如，賴(lài)氨酸，精氨酸或組氨酸被帶負(fù)電的氨基酸，例如谷氨酸或天冬氨酸替換；或(ⅳ)帶大側(cè)鏈的殘基，例如苯丙氨酸被不帶這樣的側(cè)鏈的殘基，例如甘氨酸替換。
在本發(fā)明范圍內(nèi)的變體包括在氨基酸序列上與大鼠RetL1(SEQ IDNO:2)，人部分RetL1(SEQ ID NO:9)，人全長(zhǎng)RetL1(SEQ ID NO:11)，人RetL2(SEQ ID NO:13)，鼠RetL3(SEQ ID NO:17)，人部分RetL3(SEQ ID NO:19)或人RetL3(SEQ ID NO:21)有至少60％同源性的蛋白質(zhì)和肽。更優(yōu)選地，序列同源性是至少80％，至少90％，或至少95％。為了確定同源性，比較的序列長(zhǎng)度一般是至少8個(gè)氨基酸殘基，通常至少20個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明的化合物變體也包括任何1)具有與本發(fā)明的RetL蛋白有至少40％同源性的氨基酸序列，和2)在置于與Ret序列的最佳匹配(如圖8中表示的Ret1和Ret2)之后，其半胱氨酸殘基至少有80％與本發(fā)明的RetL蛋白的半胱氨酸匹配。
正如可能置換支架的取代基一樣，也可能用具有相似特性的基因替換結(jié)合在支架上的功能基團(tuán)。這種修飾并不改變一級(jí)結(jié)構(gòu)。這些初始會(huì)是保守的，即替換基團(tuán)有與原始基因大致相同的大小，形狀，疏水性和電荷。非序列修飾可能包括，例如，天然存在的RetL的一部分的體內(nèi)或體外化學(xué)衍生物，以及乙酰化，甲基化，磷酸化，羧化或糖基化的改變。
本發(fā)明也包括與本發(fā)明的蛋白或蛋白片段特異性結(jié)合的試劑。這些試劑包括Ig融合蛋白和抗體(包括單鏈，雙鏈，F(xiàn)ab片段等，它們或者是天然的，人工的，原始的，或者是嵌合的)。這些試劑目錄的附加描述在PCT申請(qǐng)95/16709中，此處引用其說(shuō)明書(shū)作為參考。實(shí)驗(yàn)步驟總體策略圖4A和4B顯示了用來(lái)克隆RetL1的基本策略。我們的策略基于這樣一個(gè)前提，至少一種RetL在發(fā)育的腎的后腎間充質(zhì)中表達(dá)為膜蛋白(盡管該配體也可能以可溶性形式表達(dá)；圖4A)。RetL與輸尿管芽細(xì)胞上的Ret受體結(jié)合，激活酪氨酸激酶胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域并向核內(nèi)傳遞信號(hào)，從而按順序激活參與輸尿管芽生長(zhǎng)和分枝的基因。因此，含與人免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc部分或堿性磷酸酶(AP)融合的RET胞外區(qū)域的蛋白可用作克隆RetL策略的一部分(如圖4B所示)?？寺etL1用到的融合蛋白，表達(dá)文庫(kù)和其它試劑在下面描述。
我們首先分離出大鼠RetL1的cDNA，然后用它作為探針?lè)蛛x人RetL1的cDNA。隨后分離RetL2和RetL3的cDNAs。直接表達(dá)RetL配體的克隆所需試劑的制備1．分離編碼大鼠Ret胞外結(jié)構(gòu)域cDNA為鑒定出RetL1，構(gòu)建了與其它蛋白融合的含大鼠或人Ret胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，在一個(gè)實(shí)施例中與人IgG1的Fc區(qū)融合，在另一個(gè)實(shí)施例中與堿性磷酸酶融合。如圖4B所示兩種融合配偶體都可很容易的用來(lái)檢測(cè)表達(dá)配體的細(xì)胞。
由于編碼大鼠Ret的cDNA還沒(méi)有公開(kāi)，我們用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的方法分離編碼大鼠Ret受體胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA。我們比較了人(基因庫(kù)收錄號(hào)M5746和X15262)和鼠(基因庫(kù)收錄號(hào)X67812)ret的兩個(gè)核苷酸序列并根據(jù)兩個(gè)序列之間高度同源區(qū)域設(shè)計(jì)寡核苷酸引物。命名為kid-013的正向寡聚體(SEQ ID NO:3；包含基因庫(kù)序列X15262的150-169位核苷酸)選自人ret cDNA 5′端序列，與ATG啟始密碼子重疊。為了克隆在其5′端含一個(gè)NotⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)。所選的命名為kid-014(SEQ ID NO:4；包含基因庫(kù)序列M57464的1819-1839位核苷酸的互補(bǔ)序列)和kid-015(SEQ ID NO:5；包含基因庫(kù)序列X67812的1894-1914位核苷酸的互補(bǔ)序列)的兩個(gè)寡聚體分別選自對(duì)應(yīng)于人和鼠的編碼跨膜結(jié)構(gòu)域序列的cDNA的5′端。為了克隆，寡聚體kid-014和kid-015在它們的5′端含有另外的核酸，編碼一個(gè)SalⅠ限制酶位點(diǎn)。
從14天大鼠胚胎腎分離出總RNA，用寡聚脫氧胸腺嘧啶柱層析法純化mRNA。用AMV反轉(zhuǎn)錄酶從mRNA合成cDNA，用寡聚體kid-013和kid-015在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中使用Taq聚合酶將cDNA轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA并擴(kuò)增。在1％瓊脂糖凝膠中將PCR反應(yīng)樣品電泳以確定1942bp PCR產(chǎn)物的合成。剩余的PCR片段用NotⅠ和SalⅠ消化后克隆到事先用NotⅠ和SalⅠ消化過(guò)的pSAB132中。所得質(zhì)粒命名為pJC011。包含在質(zhì)粒pJC011的NotⅠ和SalⅠ位點(diǎn)之間的完整插入得到測(cè)序，證明為大鼠retL1胞外區(qū)域cDNA,SEQ ID NO:6。翻譯該序列揭示該大鼠RetL1胞外域的肽序列(SEQ ID NO:7)。因?yàn)橛糜赑CR的寡聚體選自人和小鼠的ret序列，所以可能所示為大鼠ret胞外域cDNA的核苷酸序列和所示為大鼠Ret的蛋白質(zhì)序列在kid-013和kid-015區(qū)域可能與天然的大鼠ret核苷酸和Ret肽序列不同。隨后從18天大鼠胚胎腎cDNA文庫(kù)分離ret cDNA克隆并且觀察在引物區(qū)域的一些核苷酸變化，結(jié)果是2個(gè)氨基酸改變。一個(gè)改變?cè)谛盘?hào)序列中(5位的精氨酸變成蘇氨酸)，一個(gè)改變鄰近胞外結(jié)構(gòu)域的末端(633位的谷氨酸變成丙氨酸)。這兩個(gè)變化應(yīng)該不影響配體結(jié)合。2．Ret/IgG融合蛋白與人IgG1的Fc部分融合的含大鼠(氨基酸殘基#1-637)或人(氨基酸殘基#1-636)的Ret受體的胞外域的融合蛋白得到制備。
用于表達(dá)大鼠Ret/IgG融合蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程在圖5中扼要描述。為構(gòu)建編碼大鼠Ret/IgG融合蛋白的基因，用SalⅠ消化含大鼠Ret胞外域的質(zhì)粒pJC011(如上所述)，并把它與來(lái)自質(zhì)粒2-4的700bp SalⅠ片段連接以得到質(zhì)粒pJC012。這個(gè)SalⅠ片段含有來(lái)自質(zhì)粒pSAB144的部分人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域。質(zhì)粒2-4事先經(jīng)三方連接構(gòu)建經(jīng)PCR獲得含兔TGF-βⅡ型受體的胞外結(jié)構(gòu)域的NotⅠ-SalⅠ片段；來(lái)自pSAB144的含部分人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域的693bp SalⅠ-NotⅠ片段；經(jīng)NotⅠ酶切的pSAB132。如圖5所示，從2-4質(zhì)粒中可釋放出含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的700bp SalⅠ片段。用pJC102轉(zhuǎn)染入COS細(xì)胞，48小時(shí)后用蛋白-A sepharose層析柱從培養(yǎng)物中純化大鼠Ret/IgG融合蛋白。為了獲得合成大鼠Ret/IgG蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系，分離來(lái)自pJC012的含大鼠完整Ret/IgG融合蛋白的2612bp NotⅠ片段并將其克隆入表達(dá)載體pMDR901的NotⅠ位點(diǎn)。所得質(zhì)粒命名為pJC022。質(zhì)粒pJC022轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞以產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系。最高產(chǎn)量的細(xì)胞系適于懸浮培養(yǎng)。大鼠Ret/IgG CHO細(xì)胞系的典型產(chǎn)量為75mg/L。
用于表達(dá)人Ret/IgG融合蛋白的質(zhì)粒的構(gòu)建在圖6中扼要描述。為構(gòu)建編碼人Ret/IgG融合蛋白的基因，我們從M.Takahashi博士(病理學(xué)系，Nagoya大學(xué)，醫(yī)學(xué)院，Nagoya，日本)處得到含編碼人Ret受體的cDNA的質(zhì)粒。用寡聚體kid-013和kid-014從該質(zhì)粒上合成PCR片段。PCR片段經(jīng)Klenow處理后用NotⅠ消化以得到具NotⅠ粘端和平端的PCR片段。載體pGEM 11zf(+)事先用EcoRⅠ消化后用Klenow補(bǔ)平，再用NotⅠ酶切以獲得NotⅠ粘端和平端，從而將上述PCR片段克隆入經(jīng)上述步驟處理過(guò)的pGEM 11zf(+)中。所得質(zhì)粒命名為pJC013。在pJC013用NotⅠ完全酶解和SalⅠ部分酶解后分離1916bp的NotⅠ-SalⅠ片段，并將該片段與含部分人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域的來(lái)自pSAB144的693bp SalⅠ-NotⅠ片段連接；并與用NotⅠ酶切的pSAB132表達(dá)質(zhì)粒連接。所得質(zhì)粒命名為pJC015。pJC013中的插入片段得到測(cè)序并發(fā)現(xiàn)含有一個(gè)核苷酸的不同改變了人Ret胞外結(jié)構(gòu)域中一個(gè)氨基酸(基因庫(kù)序列M57464在812有一個(gè)C，而pJC013在相應(yīng)位置為T(mén)；這就導(dǎo)致了人Ret蛋白序列的氨基酸294位丙氨酸變成纈氨酸)。通過(guò)對(duì)質(zhì)粒pJC013定點(diǎn)突變使這個(gè)核苷酸糾正為基因庫(kù)序列M57464的特定的C殘基，從而得到質(zhì)粒pJC023。分離來(lái)自pJC023的含修復(fù)的核苷酸序列的585bp BstE2片段并將其克隆入質(zhì)粒pJC015中，其中含變異核苷酸的585bp BstE2片段已從pJC015去除。新的質(zhì)粒命名為pJC024。分離來(lái)自pJC024的含完整人Ret/IgG融合蛋白的2609bp NotⅠ片段并將其克隆入表達(dá)載體pMDR901的NotⅠ位點(diǎn)。所得質(zhì)粒命名為pJC025。將質(zhì)粒pJC025轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞以獲得穩(wěn)定細(xì)胞系。最高產(chǎn)量的細(xì)胞系適于懸浮培養(yǎng)。人Ret/IgG CHO細(xì)胞系的典型產(chǎn)量為6mg/L。
關(guān)于本發(fā)明的方法中使用的載體的構(gòu)建的細(xì)節(jié)在PCT申請(qǐng)94/01456和92/02056中給出，此處引用其說(shuō)明書(shū)作為參考。3．Ret/IgG融合蛋白的生物活性為了確定我們制備的Ret/IgG融合蛋白是否具有生物活性并因此可作為RetL克隆良好的篩選試劑，我們做了幾種器官培養(yǎng)的生物活性測(cè)定。器官培養(yǎng)分析包括在50ug/ml濃度的Ret/Ig融合蛋白存在時(shí)，在器官培養(yǎng)基中培養(yǎng)13-14天的大鼠胚胎腎。腎也在有IFA-3TIP/IgG或媒介緩沖液存在時(shí)培養(yǎng)。經(jīng)一定時(shí)期培養(yǎng)后，用熒光標(biāo)記的植物凝集素DolichosBiflorus凝集素(DB植物凝集素)對(duì)其中一些腎進(jìn)行染色，DB植物凝集素對(duì)來(lái)自輸尿管芽的上皮細(xì)胞集合管組織染色。既然Ret在輸尿管芽和其上皮衍生物中表達(dá)，那么這些“DB”陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)記著Ret陽(yáng)性細(xì)胞。這些提供了對(duì)胚胎腎生長(zhǎng)和發(fā)育中Ret/IgG融合蛋白粗略的評(píng)估。在有LFA-3TIP時(shí)培養(yǎng)的腎和在有大鼠Ret/IgG融合蛋白時(shí)培養(yǎng)的腎之間集合管的形態(tài)和生長(zhǎng)有顯著的不同。Ret/IgG處理的腎的集合管分枝明顯更少，并且典型地，總體更小。
從其它腎制備石蠟切片用于組織學(xué)觀察。用對(duì)照緩沖液或Ret/IgG處理胚胎腎，然后用蘇木素和伊紅染色。Ret/Ig處理的胚胎腎集合管比對(duì)照緩沖液處理的胚胎腎集合管的分枝更少。另外，Ret/IgG處理的腎有較少的集合小管。我們也觀察到人Ret/IgG融合蛋白的這種效應(yīng)。這些現(xiàn)象與融合蛋白阻斷間充質(zhì)與輸尿管芽之間的誘導(dǎo)信號(hào)一致。因此我們認(rèn)為該融合蛋白是克隆RetL的良好試劑。4．Ret/堿性磷酸酶融合蛋白受體/堿性磷酸酶(AP)融合蛋白已成功地用于鑒定和克隆c-kit的配體(細(xì)胞63:185,1990)，孤獨(dú)受體的eph家族成員配體(細(xì)胞79:157，1994)，以及最近用于克隆ob基因的產(chǎn)物leptin受體(細(xì)胞83:1263，1995)。構(gòu)建編碼大鼠Ret/AP融合蛋白的質(zhì)粒，在COS7細(xì)胞中于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中合成大鼠Ret/AP蛋白。接著得到平均表達(dá)10mg/L融合蛋白的穩(wěn)定NIH3T3細(xì)胞系。大鼠Ret/AP蛋白的SDS-PAGE分析表明它的大小與推測(cè)分子量一致，并且凝膠過(guò)濾分析表明它以二聚體形式合成。通過(guò)抗AP柱上親和層析得到部分純化。5．抗Ret抗體抗大鼠Ret/IgG融合蛋白的兔多克隆抗體得到制備。該抗體用于Western雜交，Ret陽(yáng)性細(xì)胞系的PACS分析以及胚胎腎切片的免疫組織化學(xué)分析。
一組抗大鼠Ret的倉(cāng)鼠單克隆抗體得到制備。與蛋白A sepharose偶聯(lián)的大鼠Ret/IgG融合蛋白用于免疫亞美尼亞倉(cāng)鼠。融合后得到316個(gè)克隆并篩選它們?cè)贓LISA分析中與大鼠Ret融合蛋白和/或人IgG結(jié)合的能力。11個(gè)克隆產(chǎn)生只結(jié)合大鼠Ret/IgG(和大鼠Ret/AP)，不結(jié)合人IgG的抗體。與人Ret的交叉反應(yīng)性用FACS分析；4個(gè)克隆產(chǎn)生能與Ret陽(yáng)性的人細(xì)胞系THP-1結(jié)合的抗體。下表概括了12個(gè)單克隆抗體的Ret結(jié)合特性。<
6．cDNA表達(dá)文庫(kù)我們從大鼠胚胎腎制備cDNA文庫(kù)，一個(gè)在CDM8載體中，利用SV40復(fù)制子擴(kuò)增，另一個(gè)在修飾的InVitrogen載體pCEP4中，利用EBV復(fù)制子擴(kuò)增。修飾的載體CH269已去除EBNA-1基因序列。EBNA-1蛋白與EBV復(fù)制子相互作用，但當(dāng)使用穩(wěn)定表達(dá)EBNA蛋白的細(xì)胞時(shí)，這個(gè)基因不需要在載體上。以CDM8為載體的文庫(kù)包含1.5×106個(gè)平均插入大小為1.18kb的克隆，而以CH269為載體的文庫(kù)包含大約1×106個(gè)平均插入大小為1.5kb的克隆。Ret配體RetL1的表達(dá)克隆A大鼠Ret配體RetL1的克隆1．Ret配體RetL1的表達(dá)克隆的最初嘗試嘗試了許多直接表達(dá)方法以克隆RetL1。所有這些方法都是基于圖4B中描述的概念。cDNA文庫(kù)中的cDNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞；有RetL1導(dǎo)入的細(xì)胞可以用Ret融合蛋白鑒定。盡管下述三種方法是不成功的，但獲得了重要的知識(shí)和技巧，它們?cè)诤髞?lái)的成功方法中使用。
a．用Ret/IgG淘選法-利用淘選法[Aruffo和Seed，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)84:8753-8757(1987)]，通過(guò)直接表達(dá)克隆，用大鼠Ret/IgG融合蛋白來(lái)分離RetL1。淘選法利用18天的大鼠胚胎腎cDNA文庫(kù)。利用DEAE-葡聚糖法將來(lái)自文庫(kù)的cDNA組(每組5,000-10,000 cDNAs)轉(zhuǎn)入COS細(xì)胞中。48小時(shí)后，細(xì)胞用EDTA從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)出，與融合蛋白一起溫育，接著在用抗人IgG1抗體覆蓋的平板上淘選。從貼壁細(xì)胞提取DNA并再轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，接著分離DNA用于第2輪淘選。第三輪淘選后我們看不到任何細(xì)胞結(jié)合，并且在將Hirt DNA轉(zhuǎn)化回大腸桿菌后，得到極少克隆。VCAM cDNA與抗VCAM單克隆抗體結(jié)合用于作為一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，可以以1∶100比例稀釋并仍可檢測(cè)到；表明我們的庫(kù)的大小可能太大。對(duì)第二輪淘選后獲得的一些克隆的分析，表明這些克隆存在重排和缺失。
b．使用Ret/IgG的制備FACS法-將來(lái)自18天大鼠胚胎，腎文庫(kù)(CDM8載體)的80,000cDNA轉(zhuǎn)入COS7細(xì)胞中并在使用大鼠Ret/IgG蛋白接著用熒光標(biāo)記的二抗的制備FACS中使用。收集較高的0.5％和0.9％的發(fā)熒光細(xì)胞并且用Hirt裂解法提取質(zhì)粒DNA。將DNA電擊回大腸桿菌中從0.5％的組中得到228個(gè)克隆，從0.9％的組中得到752個(gè)克隆。從細(xì)菌克隆提取DNA并進(jìn)行第二輪制備FACS。分析從第二輪結(jié)束時(shí)的細(xì)菌克隆提取的質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)含有較多的缺失和重排。
c．使用Ret/AP的比色檢測(cè)法用來(lái)自18天大鼠胚胎腎cDNA文庫(kù)(CDM8載體)的400個(gè)cDNA克隆組轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞并用Ret/AP蛋白和堿性磷酸酶比色底物染色。在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的陽(yáng)性信號(hào)。在一次試驗(yàn)中，重新分析5個(gè)可能陽(yáng)性的克隆，但均為陰性。
作為Ret/AP蛋白的對(duì)照，通過(guò)將人VCAM的前兩個(gè)結(jié)構(gòu)域融合到胎盤(pán)AP的N端制備VCAM/AP蛋白(VCAM與integrin VLA4結(jié)合，VLA4包括α-4和β-1兩條鏈)。瞬間轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞產(chǎn)生足夠的VCAM/AP蛋白用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)。把VCAM/AP蛋白跟與AP直接偶聯(lián)的VCAM/IgG及VCAM/IgG外加AP偶聯(lián)的二抗作比較，以評(píng)估它們檢測(cè)用α-4鏈cDNA轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞上VLA4的能力(COS細(xì)胞已表達(dá)β-1鏈)。結(jié)果表明盡管VCAM/AP蛋白能檢測(cè)到轉(zhuǎn)染細(xì)胞上的VLA4，但最好的檢測(cè)方法是通過(guò)將VCAM/IgG蛋白與AP偶聯(lián)的二抗結(jié)合進(jìn)行。d．方法學(xué)結(jié)論從這些初始克隆嘗試中可得到三個(gè)主要結(jié)論1)當(dāng)目的cDNA的豐度很低時(shí)，要求回收質(zhì)粒DNA用于下一輪(即淘選和制備FACS的方法)不合適，因?yàn)樵谶@些后續(xù)的循環(huán)中會(huì)出現(xiàn)重排和缺失?；赗et的表達(dá)低，有很好的理由猜想RetL1的表達(dá)也低。優(yōu)選的方法是以組轉(zhuǎn)染并用一種能鑒定出陽(yáng)性組的檢測(cè)方法。然后原始組可以被折分，不需要從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中回收瞬間表達(dá)的DNA。2)當(dāng)與第二種試劑偶聯(lián)時(shí)，Ret/IgG蛋白表現(xiàn)了比Ret/AP蛋白更好的檢測(cè)能力。3)使用VCAM/IgG對(duì)照蛋白(和AP偶聯(lián)的二抗)和α-4 intergrincDNA(稀釋入CDM8載體并轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明我們的檢測(cè)能力僅是大約1/1000(即組的大小不能超過(guò)1000個(gè)克隆)。為得到較高水平的敏感性，我們從以SV40復(fù)制子為基礎(chǔ)的載體(在COS細(xì)胞中表達(dá))改變?yōu)橐訣BV復(fù)制子為基礎(chǔ)的載體(在EBNA陽(yáng)性細(xì)胞系中表達(dá))。以EBV復(fù)制子為基礎(chǔ)的載體以附加體形式存在并且擴(kuò)增后不象以SV40復(fù)制子為基礎(chǔ)的載體對(duì)細(xì)胞有毒性。有很多證據(jù)表明在這些載體中基因可以高水平表達(dá)并且cDNAs可以稀釋得更稀得多(即高達(dá)1∶80,000)而仍可檢測(cè)到。2．篩選來(lái)自以EBV復(fù)制子為基礎(chǔ)的cDNA文庫(kù)的組用大鼠Ret/IgG融合蛋白篩選來(lái)自18天大鼠胚胎腎cDNA文庫(kù)(帶有EBV復(fù)制子的CH269載體中)的克隆組。在一次實(shí)驗(yàn)中，從該文庫(kù)產(chǎn)生256組，每組含5000個(gè)克隆。簡(jiǎn)要地，cDNA文庫(kù)的等分樣品經(jīng)稀釋?zhuān)?000個(gè)細(xì)胞鋪平板(256次)并使之生長(zhǎng)過(guò)夜。將克隆刮到培養(yǎng)基中一部分培養(yǎng)物用于該組的甘油保存(保存于-70℃)而一部分用于質(zhì)粒制備。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將來(lái)自256組的DNA分別轉(zhuǎn)染293/EBNA細(xì)胞(8×105/60毫米平板)。48小時(shí)后，細(xì)胞用HBHA緩沖液(0.5mg/ml BSA,0.1％NaN3,20mM HEPES(pH7.0)〕洗兩次，室溫下與20μg/ml大鼠Ret/IgG(于Tris鹽緩沖液中，另加1mM MgCl2和CaCl2)一起培養(yǎng)60-90分鐘。溫育后細(xì)胞用HBHA緩沖液洗四次，再用60％丙酮/3％甲醛/20mMHEPES(pH7.0)固定30秒。接著用HBS緩沖液[150mM NaCl,20mMHEPES(pH7.0)]洗兩次后，細(xì)胞與AP偶聯(lián)的二抗[羊抗人IgG Fc-γ-特異的F(ab′)2][Jackson免疫實(shí)驗(yàn)室；目錄號(hào)109-056-098；1∶5000稀釋度于Tris鹽緩沖液，(另加1mM MgCl2和CaCl2)中稀釋]一起在室溫下溫育60分鐘。然后細(xì)胞用HBS緩沖液洗兩次，并用含2X Pierce ImmunoPureR磷酸酶抑制劑(目錄號(hào)35002)的AP底物緩沖液[100mM Tris-HCl(pH9.5),100mM NaCl,5mM MgCl2)。洗兩次。最后一次洗放置15分鐘。然后在向含Pierce AP抑制劑的AP底物緩沖液中加入AP底物NBT(0.33mg/ml)和BCIP(0.17mg/ml)并與細(xì)胞一起溫育5-20分鐘。然后平板用水洗兩次。在解剖顯微鏡下觀察平板上紫色著色細(xì)胞的出現(xiàn)。
從256組的分析中，初次篩選鑒定出17個(gè)陽(yáng)性組。將每個(gè)陽(yáng)性組的DNA再轉(zhuǎn)染入293/EBNA細(xì)胞中并與一些附加的對(duì)照實(shí)驗(yàn)一起重復(fù)以上程序，以確定觀察到的著色是Ret/IgG特異的。17個(gè)陽(yáng)性組中僅有10組表現(xiàn)用Ret/IgG融合蛋白時(shí)著色而用另一種IgG融合蛋白不著色。3．#230組的拆分作為一個(gè)例子，上述陽(yáng)性組之一，命名為#230，拆分成更小的亞組以確定該組中介導(dǎo)與Ret/IgG融合蛋白結(jié)合的cDNA。來(lái)自#230組的甘油保存的600個(gè)細(xì)胞鋪平板(10次)并培養(yǎng)過(guò)夜。將這些平板上的克隆刮入培養(yǎng)液中十分之一的培養(yǎng)物用于甘油保存，剩余部分用于DNA提取。600個(gè)克隆的十個(gè)亞組命名為230-1A到230-5A和230-1B到230-5B。將這些亞組的DNA轉(zhuǎn)染入293/EBNV細(xì)胞，并且重復(fù)上述Ret/IgG融合蛋白染色程序。一個(gè)亞組#230-5A為Ret/IgG染色陽(yáng)性。
#230-5A組進(jìn)一步拆分以鑒定定該組中介導(dǎo)與Ret/IgG融合蛋白結(jié)合的cDNA。來(lái)自230-5A組甘油保存的細(xì)胞鋪平板并培養(yǎng)過(guò)夜。將這些克隆挑到7個(gè)96-孔Bioblocks中并培養(yǎng)過(guò)夜。從每一個(gè)96-孔Bioblocks產(chǎn)生含20個(gè)克隆的4個(gè)組和含16個(gè)克隆的一個(gè)組。這樣從七個(gè)Bioblocks可得到35個(gè)組，命名為230-5A-71到230-5A-105。從每個(gè)這樣的組中制備DNA并轉(zhuǎn)染入293/EBNA細(xì)胞，如上所述用Ret/IgG融合蛋白再分析。#230-5A-86組為陽(yáng)性。
回到Bioblock再折分#230-5A-86組并鑒定混和在一起形成這組的20個(gè)克隆。從二十個(gè)克隆提取DNA并分別轉(zhuǎn)染293/EBNA細(xì)胞，并如上所述對(duì)Ret/IgG再分析。#230-5A-86-17組為陽(yáng)性。4．#230-5A-86-17號(hào)克隆的特征通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)一步分析#230-5A-86-17號(hào)克隆(命名為retL-17或克隆17并以ATCC98047保存)。這個(gè)克隆的插入片段的全長(zhǎng)核苷酸序列為SEQ ID NO:1(大鼠retL1 cDNA)，圖1顯示了部分核苷酸序列。在這個(gè)核苷酸序列中，我們發(fā)現(xiàn)了編碼468個(gè)氨基酸的蛋白(RetL1)的閱讀框架。推測(cè)蛋白有信號(hào)肽序列，在24位氨基酸后有推測(cè)的切割位點(diǎn)[VonHeijne等，核酸研究，14:14683(1986)]。疏水C-末端表明該蛋白可能通過(guò)磷脂酰肌醇糖苷鍵與細(xì)胞相連。有三個(gè)推測(cè)的N-連接糖基化位點(diǎn)。這些性質(zhì)與Ret配體的預(yù)期特性一致。
通過(guò)在疏水C末端之前截?cái)嗷蛭覀兛梢员磉_(dá)出大鼠RetL1蛋白的可溶性截短形式。例如，通過(guò)在435位賴(lài)氨酸(大鼠RetL1)之后截除該氨基酸的上游也應(yīng)導(dǎo)致大鼠可溶性RetL1蛋白的表達(dá)?？扇苄源笫驲etL1蛋白可以表達(dá)其自身，也可以作為它與人免疫球蛋白，組氨酸標(biāo)記或被抗體識(shí)別的小抗原決定基的融合蛋白的一部分表達(dá)。B．人Ret配體RetL1的克隆在λgt10載體中的人胚胎腎cDNA文庫(kù)購(gòu)自Clontech(目錄號(hào)HL5004A)。來(lái)自噬菌體貯液的100萬(wàn)個(gè)噬菌斑形成單位在10個(gè)NuncTM平板上鋪板。在Schleicher和Schuell OptitranTM上重復(fù)進(jìn)行噬菌斑浸提。
用限制性內(nèi)切酶PvuⅡ消化大鼠RetL1質(zhì)粒，接著通過(guò)瓊脂糖凝膠分離對(duì)應(yīng)于大鼠RetL核苷酸序列(大鼠retL1 cDNA)的242-1582位核苷酸的1.34 kb片段以得到探針。該編碼區(qū)探針用隨機(jī)引物進(jìn)行32P標(biāo)記(Feinberg和Vogelstein,Anal.Biochem.137:266-267,1984)。濾紙?jiān)?00ml噬菌斑篩選PSB緩沖液(50mM Tris pH7.5,1M NaCl,0.1％焦磷酸鈉，0.2％PVP,0.2％Ficoll)中55℃雜交過(guò)夜，雜交液含10％硫酸葡聚糖，100ug/ml tRNA，和6.7×107CPM大鼠探針。用噬菌斑篩選緩沖液洗兩次，再用2X SSC/1％SDS于55℃洗兩次，并用增感屏于-70℃曝光顯影。
將兩次陽(yáng)性的克隆從主板挑到加明膠的SM(100mM NaCl,10mMSO4,50mM Tris,pH7.5)中。24個(gè)這樣的陽(yáng)性克隆經(jīng)噬菌斑純化。從純化的候選噬菌斑小量提取λDNA，并用NotⅠ酶切，在1％瓊脂糖凝膠上電泳和Southern印跡。用大鼠RetL1編碼區(qū)探針雜交Southern印跡。HRL20克隆含有最長(zhǎng)的插入片段(4.4kb)，與大鼠探針強(qiáng)烈雜交。從這個(gè)克隆已得到DNA序列(人部分retL1 cDNA；SEQ ID NO:8；圖2A)和推測(cè)的多肽序列(人部分RetL1蛋白；SEQ ID NO:9；圖2A)，確定它是人的同源物。這個(gè)克隆編碼包括編碼區(qū)3′端的大部分編碼區(qū)。
為得到人cDNA的5′端，從Clontech購(gòu)買(mǎi)人胎兒腎Marathon-ReadyTMcDNA試劑盒(目錄號(hào)7423-1)。合成反義寡核苷酸kid-155，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:8(人部分retL1 cDNA)62-81位核苷酸的互補(bǔ)鏈和kid-154，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:8(人部分retL1 cDNA)17-43位核苷酸的互補(bǔ)鏈。用AdvantageTMcDNA PCR試劑盒(Clontech目錄號(hào)8417-1)和MarathonTMcDNA試劑以及寡核苷酸kid-155或kid-154進(jìn)行PCR。第一輪PCR如下準(zhǔn)備35.5ul水；5.0ul 10XklenTaq緩沖液；1.0ul 10mMdNTP混和物；1.0ul 50XAdvantageTMklenTaq聚合酶混和物。把這些試劑加在一起混勻。接著加入5.0ul Marathon-ReadyTM胎兒腎cDNA；1.0ul 10uM AP1引物和1.5ul 6.4uM kid-155(終體積為50ul)。在Perkin-Elmer Cetus DNA高溫循環(huán)儀480上按以下循環(huán)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃1分鐘，1個(gè)循環(huán)；94℃30秒，55℃30秒，68℃4分鐘，30個(gè)循環(huán)。用第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行嵌套式PCR。首先，用TE將5ul PCR產(chǎn)物#1稀釋50倍(終體積為250ul)。嵌套式PCR反應(yīng)含有35.5ul水；5.0ul 10XklenTaq緩沖液，1.0ul 10mM dNTP混和物；1.0ul50X AdvantageTMklenTaq聚合酶混和物。把這些試劑如上混勻。再加入5.0ul稀釋的PCR產(chǎn)物#1；1.0ul 10uM AP2引物和1.Sul 6.9uM的kid-154。循環(huán)條件同上。大約為700bp的所得產(chǎn)物在1％低熔點(diǎn)膠上純化并用酚抽提。純化的DNA克隆λpZErOTM的EcoR5位點(diǎn)(Invitrogen目錄號(hào)K2510-01)。從大量分離物中獲得序列信息，包括名為HRL7G6和HRL7G8的克隆。
發(fā)現(xiàn)從HRL7G8克隆得到的序列與HRL20克隆(人部分retL1 cDNA)的序列重疊，并用于制備人RetL1全長(zhǎng)序列(人全長(zhǎng)retL1 cDNA)，如圖2B所示。從HRL7G8克隆得到的核苷酸序列代表人全長(zhǎng)retL1 cDNA的1-502位核苷酸；來(lái)自HRL20克隆的核苷酸序列代表人全長(zhǎng)retL1 cDNA的460-1682位核苷酸。用來(lái)自HRL7G6克隆的探針從人胚胎腎λgt10cDNA文庫(kù)中分離出另一cDNA克隆(GJ102)，通過(guò)對(duì)GJ102進(jìn)行測(cè)序核實(shí)了來(lái)自HRL7G8克隆的核苷酸序列。118-1497位核苷酸包括人全長(zhǎng)retL1 cDNA的蛋白閱讀框架。
圖2B也表示了人RetL1全長(zhǎng)氨基酸序列。如圖3A所示通過(guò)BESTF1T分析，人retL1 cDNA與大鼠retL1 cDNA有88.2％的同源性。多肽比較(圖3B)表明推測(cè)的人的肽序列與大鼠的有93.3％的同源性，97.2％的相似性。Ret配體RetL2的克隆A．人RetL2的克隆為了鑒定出相關(guān)蛋白(即同系物)，利用BLAST程序，用大鼠RetL1的肽序列檢索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。BLAST，或基本區(qū)域?qū)Ρ葯z索工具，利用Altschul等的方法(分子生物學(xué)雜志215:403-410,1990)來(lái)檢索待查序列與數(shù)據(jù)庫(kù)所有序列之間的相似性。待查序列與要檢索的數(shù)據(jù)庫(kù)可以是肽或核苷酸的任何組合。當(dāng)用大鼠RetL1肽序列檢索表達(dá)序列標(biāo)記(EST)核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，得到兩個(gè)重要的匹配序列。一個(gè)具GenBank收錄號(hào)R02249，來(lái)自人胎兒肝和脾混合cDNA文庫(kù)的229bp EST；另一個(gè)具GenBank收錄號(hào)H12981，來(lái)自人嬰兒腦cDNA文庫(kù)的521bp EST。這兩個(gè)EST在重疊區(qū)有99％的同源性，表明它們來(lái)自同一個(gè)cDNA。源于H12981 EST的寡核苷酸KID-228(GAA TGA CAA CTG CAA GAAGCT GCG CTC CTC；對(duì)應(yīng)于38-67位核苷酸和SEQ ID NO:12的534-563位核苷酸)，反義寡核苷酸KID-229(GTG TAC TCG CTG GGCACC CG；對(duì)應(yīng)于156-175位核苷酸的互補(bǔ)序列和SEQ ID NO:12652-671位核苷酸的互補(bǔ)序列)。
在OPTITRANTM濾紙上篩選來(lái)自clontech公司人胎兒肝5′突出(+)λgt10 cDNA文庫(kù)(目錄號(hào)HL5003a)的1×106噬菌斑形成單位。在400ml噬菌斑篩選緩沖液(50mM Tris pH7.5,1M NaCl,0.1％焦磷酸鈉，0.2％聚乙烯吡咯烷酮和0.2％Ficoll)中濾紙與32P標(biāo)記的KID-228和KID-32965℃雜交過(guò)夜，上述緩沖液含10％硫酸葡聚糖和100ug/ml tRNA及80pmole每種32p標(biāo)記的寡核苷酸。用2X SSC/1％SDS洗兩次，并用1XSSC/1％SDS洗兩次后，曝光顯影。11個(gè)重復(fù)陽(yáng)性被純化。來(lái)自每個(gè)這樣的克隆的DNA用限制性酶消化，瓊脂糖凝膠電泳和Southern雜交分析。濾膜與KID-228和KID-229雜交證實(shí)插入片段能與探針雜交。DSW240克隆的插入片段全部測(cè)序(人retL2 cDNA,SEQ ID NO:12)，結(jié)果在圖7中表示。
人retL2 cDNA的蛋白閱讀框架包含25-1416位核苷酸，它編碼464個(gè)氨基酸的蛋白(人RetL2；SEQ ID NO:13)，在圖7中表示。如圖8所示的，通過(guò)BESTFIT分析，人RetL2蛋白與人RetL1蛋白有49.1％的同源性和63.7％的相似性，與人RetL1一樣有暗示了信號(hào)肽序列的疏水N端和暗示了磷脂酰肌醇聚糖連結(jié)結(jié)構(gòu)域的疏水C端。另外，每個(gè)蛋白的31個(gè)半胱氨酸中有30個(gè)是保守的。B．證明RetL2是Ret的配體通過(guò)用含DSW240克隆的插入片段的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293/EBNA細(xì)胞并通過(guò)證明轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以結(jié)合可溶性Ret/IgG融合蛋白，表明RetL2是Ret的配體。
用NotⅠ切出DSW240的插入片段并克隆入表達(dá)質(zhì)粒載體CH269，CH269含有EBV復(fù)制子并允許在EBNA陽(yáng)性細(xì)胞系中高水平表達(dá)。進(jìn)行限制性酶切以鑒定具有正確插入方向的克隆。從具正確插入方向的克隆中制備質(zhì)粒DNA。
用脂質(zhì)體法將質(zhì)粒DNAs(retL2表達(dá)質(zhì)粒，retL1表達(dá)質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，含非相關(guān)蛋白的表達(dá)質(zhì)粒作為陰性對(duì)照)轉(zhuǎn)染293/EBNA細(xì)胞(在60mm平板上8×105細(xì)胞)。48小時(shí)后，細(xì)胞用HBHA緩沖液
洗兩次并與20ug/ml大鼠Ret/IgG一起在含1mM MgCl2和CaCl2的Tris鹽緩沖液中室溫下溫育60-90分鐘。溫育后，用HBHA緩沖液洗四次并用60％丙酮/3％甲醛/20mM HEPES(pH7.0)固定30秒。HBS緩沖液[150mM NaCl,20mMHEPES(pH7.0)]洗兩次后，細(xì)胞與AP偶聯(lián)的二抗[羊抗人IgG Fc-γ-特異的F(ab’)2](Jackson免疫研究實(shí)驗(yàn)室；目錄號(hào)109-056-098；1∶5000倍稀釋于含1mM MgCl2和CaCl2的Tris鹽緩沖液中)一起室溫下溫育60分鐘。然后用HBS緩沖液洗兩次，并用含2X Pierce Immuno Pure磷酸酶抑制劑(目錄號(hào)35002)的AP底物緩沖液[100mM Tris-HCl(pH9.5),100mM NaCl,5mM MgCl2)洗兩次。最后一次洗滌放置15分鐘。將AP底物NBT(0.33mg/ml)和BCIP(0.17mg/ml)加入含Pierce AP抑制劑的AP底物緩沖液中，并與細(xì)胞一起保溫5-20分鐘。平板用水洗兩次。解剖顯微鏡下觀察平板上紫色著色細(xì)胞的存在。紫色著色細(xì)胞的存在表明Ret融合蛋白已結(jié)合到細(xì)胞上，并且RetL2蛋白是Ret的配體。用retL1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后也可觀察到紫色著色細(xì)胞，而用陰性對(duì)照載體時(shí)觀察不到。Ret配體RetL3的克隆A．鼠RetL3用大鼠RetL1氨基酸序列檢索EST數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)鼠EST與Ret配體有同源性。兩個(gè)EST為AA049894和AA050083(為鼠部分retL3cDNA,SEQ ID NO:14)。以細(xì)菌穿刺物形式從Genome Systems Ins.獲得編碼這兩個(gè)EST的質(zhì)粒(目錄號(hào)#47591和#475497)。將穿刺物在LB氨芐抗性平板上劃線，從單菌落制備質(zhì)粒DNA。對(duì)這些質(zhì)粒中的插入片段進(jìn)行全長(zhǎng)序列測(cè)定。比較這兩個(gè)序列表明有1.4kb插入的AA049894包含在有1.9kb片段插入的AA050083中。來(lái)自AA050083的DNA序列的翻譯表明，它有一個(gè)從250位核苷酸到1242核苷酸的連續(xù)開(kāi)放閱讀框架(鼠部分RetL3；SEQ ID NO:15)。這個(gè)開(kāi)放閱讀框架與大鼠retL1的開(kāi)放閱讀框架有37.5％的同源性，與大鼠retL2的開(kāi)放閱讀框架有40.2％的同源性。但是該開(kāi)放閱讀框架在5′端并不編碼甲硫氨酸或信號(hào)肽序列。我們研究了這個(gè)區(qū)域上游的5′ORF，發(fā)現(xiàn)在翻譯起始必須的kozak保守序列附近有甲硫氨酸和為了表面表達(dá)和分泌的信號(hào)肽序列。這個(gè)ORF與下游ORF不在同一個(gè)框架內(nèi)，表明EST AA050083在它的5′端含有可能的突變，如插入，缺失，內(nèi)含子或克隆假象。
為獲得正確的5′端，我們應(yīng)用了Marathon RACE法。從Clontech購(gòu)買(mǎi)小鼠11天胚胎Marathon-ReadyTMcDNA(目錄號(hào)7458-1)和AdvantageTM試劑盒(目錄號(hào)8417-1)。合成反義寡核苷酸kid-366，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:14的847-866位核苷酸的互補(bǔ)序列；和kid-365，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:14的589-615位核苷酸的互補(bǔ)序列。用AdvantageTMcDNA PCR試劑盒(Clontech目錄號(hào)8417-1)結(jié)合MarathonTMcDNA試劑以及寡核苷酸kid-366進(jìn)行PCR反應(yīng)。第一次PCR反應(yīng)如下制備35.3ul H2O；5.0ul 10XklenTaq緩沖液；1.0ul 10mM dNTP混合物；1.0ul 50XAdvantageTMKlenTaq聚合酶混合物。把這些試劑加好混勻。然后加5.0ul Marathon-ReadyTM小鼠11天胚胎cDNA,1.0ul 10uM AP1引物和1.7ul 5.88uM Kid-366(終體積=50ul)。PCR在Perkin-ElmerCetus DNA熱循環(huán)儀480中按以下循環(huán)條件進(jìn)行94℃1分鐘，1個(gè)循環(huán)；94℃30秒，72℃4分鐘，5個(gè)循環(huán)；94℃30秒，70℃4分鐘，5個(gè)循環(huán)；94℃30秒，68℃4分鐘，25個(gè)循環(huán)。用第一次PCR反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行嵌套式PCR。首先，5μl PCR產(chǎn)物#1用TE稀釋50倍(終體積250ul)。嵌套式PCR反應(yīng)含35.5ul水；5.0ul 10XklenTaq緩沖液；1.0ul l0mM dNTP混合物；1.0ul 50XAdvantageTMKlenTaq聚合酶混合物。把這些試劑如上混勻。然后加入5.0μl PCR產(chǎn)物#1,1.0μl 10μm AP2引物和3.6μl 2.8μM Kid-365。循環(huán)條件同上。大約665bp的所得產(chǎn)物在1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上純化并用QiaexⅡ(Qiagen目錄號(hào)20021)抽提。用PRIME PCR CLONERTM克隆系統(tǒng)(5Prime-＞3Prime目錄號(hào)1-725029)將純化的DNA克隆入λpNoTA/T7TM。從多個(gè)分離物中得到序列信息，包括名為DSW252和DSW253的克隆。
發(fā)現(xiàn)DSW252的序列與SEQ ID NO:14重疊，除了在SEQ IDNO:14序列的252位與253位核苷酸之間另外的T。在其它分離物DSW251和DSW253中也存在這個(gè)T。該附加堿基的插入糾正了ORF，從而得到一個(gè)編碼397個(gè)氨基酸的1191bp的ORF(從第一個(gè)甲硫氨酸算起)。這個(gè)ORF在常規(guī)翻譯起始保守序列(kozak)附近編碼一個(gè)甲硫氨酸，并包含表面表達(dá)/分泌的信號(hào)肽序列。
為得到能表達(dá)的全長(zhǎng)小鼠克隆，純化DSW252的NotⅠ-BamHⅠ 630bp片段和AA050083的1308bp BamHⅠ-NotⅠ片段并將它們連接入NotⅠ酶切的表達(dá)質(zhì)粒CH269。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue(Strategene目錄號(hào)200236)。所得轉(zhuǎn)化子用Qiawell Ultra小量制備法制備DNA。通過(guò)限制性酶酶切和凝膠電泳分析這些轉(zhuǎn)化子的正確大小和方向。這個(gè)構(gòu)建體命名為DSW254。將DSW254的插入全長(zhǎng)測(cè)序(鼠retL3；SEQ ID NO:16)，該ORF確定為編碼含397個(gè)氨基酸的蛋白(鼠RetL3；SEQ IDNO:17)。這些序列也在圖9中表示。RetL3的C末端為疏水性，并且暗含一個(gè)磷脂酰肌醇聚糖連接位點(diǎn)。B．人的RetL3為尋找適于克隆人RetL3的候選組織來(lái)源，我們用小鼠組織的Northern印跡方法來(lái)確定鼠RetL3的表達(dá)圖譜。在所有實(shí)驗(yàn)組織中，RetL3在心臟組織中的表達(dá)最高。從Clontech公司購(gòu)買(mǎi)在載體λgt10中的成人心臟cDNA文庫(kù)(目錄號(hào)HL3026a)。來(lái)自噬菌體貯液的一百萬(wàn)個(gè)噬菌斑形成單位在10個(gè)Nunc平板上鋪板。在Schleicher和SchuellOptitranTM濾紙上重復(fù)噬菌斑浸取。
通過(guò)用引物kid-366和kid-367進(jìn)行PCR制備探針，相應(yīng)于AA050083序列的397-420位核苷酸。PCR反應(yīng)體系如下配制10ul 10XPFU緩沖液，2.0ul 10mM dNTP混合物，72.1ul H2O,3.1ul13.2uM kid-367,6.8ul5.88μM kid-366,5.0ul 0.1ug/ul AA050083 DNA和2.0ul 2.5單位/ul PFU(Strategene目錄號(hào)600154)并混勻。在Perkin-Elmer Cetus DNA熱循環(huán)儀480上進(jìn)行PCR，條件如下94℃1分鐘，53℃1分鐘，72℃4分鐘，25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用酚，氯仿，異戊醇50∶49∶1抽提純化，接著經(jīng)過(guò)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳并用QiaexⅡ純化切下的片段。編碼區(qū)探針通過(guò)隨機(jī)引物延伸進(jìn)行32p標(biāo)記(Feinberg and Vogelstein)。濾膜在200ml含10％硫酸葡聚糖，100ug/ml tRNA和1.8×108CPM小鼠探針的噬菌斑緩沖液中65℃雜交過(guò)夜。用噬菌斑篩選緩沖液，2X SSC/1％SDS洗兩次，再用1XSSC/1％SDS 65℃洗2次，-70℃用增感屏曝光顯影。重復(fù)陽(yáng)性克隆經(jīng)噬菌斑純化。從純化的候選噬菌斑中小量提取的λDNA用EcoRⅠ消化，在1％瓊脂糖凝膠上電泳，并進(jìn)行Southern印跡。用小鼠探針雜交Southern印跡。GJ128克隆含1.3kb插入，與小鼠編碼區(qū)探針強(qiáng)烈雜交。從該克隆得到DNA序列(人部分retL3 cDNA；SEQ IDNO:18)和推測(cè)的肽序列(人部分RetL3；SEQ ID NO:19)，證實(shí)它是人的同源物。這個(gè)克隆編碼了大部分編碼區(qū)，包括編碼區(qū)的3′端。
為獲得含5′端的克隆，來(lái)自GJ128的1.3kb插入經(jīng)純化，32P標(biāo)記，用于篩選Clontech成人心臟文庫(kù)。在來(lái)自該文庫(kù)的2×106個(gè)噬菌斑中沒(méi)有得到含5′端的克隆。用相同的探針根據(jù)廠家提供的方法對(duì)成人組織mRNA印跡(Clontech目錄號(hào)7760-1,7759-1和7767-1)進(jìn)行Northern分析，表明人RetL3在成人脊髓，胃，心臟，胰臟，小腸，結(jié)腸，前列腺和睪丸中表達(dá)。用GJ128插入片段篩選Clontech成人脊髓cDNA文庫(kù)(目錄號(hào)5001a)。純化3個(gè)獨(dú)立克隆，對(duì)最長(zhǎng)的克隆GJ135進(jìn)行序列測(cè)定。GJ135的插入片段與GJ128插入片段重疊，可得到人全長(zhǎng)retL3 cDNA(SEQ ID NO:20)的組合序列，從而可確定人全長(zhǎng)RetL3(SEQ ID NO:21)。這些序列在圖10中表示。人RetL3與人RetL1和RetL2的同源性分別為34.3％和34.9％。與鼠RetL3的同源性為76.8％。本發(fā)明的化合物的治療用途天然的和變異的RetL，抗RetL抗體，抗Ret抗體，和Ret及RetL的融合蛋白在需要阻斷或激活Ret信號(hào)途徑，在細(xì)胞丟失或受損的患病的情況下可刺激腎和/或神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)或存活，或抑制生長(zhǎng)或殺死非需要細(xì)胞如表達(dá)Ret或RetL的腫瘤細(xì)胞的情況下可以有治療用途。
通常，本發(fā)明的結(jié)合Ret，誘導(dǎo)Ret二聚體形成和/或Ret自身磷酸化的化合物，可用于刺激Ret表達(dá)組織生長(zhǎng)或減少其損傷。本發(fā)明的化合物可用于刺激腎組織生長(zhǎng)和/或存活，維護(hù)腎功能，最大限度減少各種損害后對(duì)腎組織的損傷。可用本發(fā)明的化合物有效治療的特定情況包括急性腎衰竭，急性腎炎，慢性腎衰竭，腎病綜合癥，腎小管缺陷，腎移植，毒性損傷，缺氧損傷和創(chuàng)傷。腎小管缺陷包括遺傳性的或獲得性的，如多囊腎病，髓囊病和髓質(zhì)海綿腎。不限于這里列出的，而可包括一些其它腎臟失調(diào)(見(jiàn)，例如Harrison’s Principles of Internal Medicine，第13版，1994，此處引用作為參考)。
在其它的應(yīng)用中，本發(fā)明的基因和蛋白可在需要神經(jīng)生長(zhǎng)和再生的情況下用于治療。這包括任何涉及神經(jīng)退化的情況，如阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、圖雷綜合癥，肌萎縮晚期硬化，及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病，脫髓鞘病如多發(fā)硬化癥，細(xì)菌病如腦膜炎，膿腫或積膿，病毒病如HIV伴隨性脊髓病，朊病毒病包括克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病。也包括對(duì)神經(jīng)組織造成損傷的紊亂，或者由腫瘤浸潤(rùn)，創(chuàng)傷，或者由腦血管事件如出血或氣栓引起。顱神經(jīng)和脊髓疾病，包括涉及創(chuàng)傷，炎癥，充血或血管病因?qū)W的紊亂，以及影響自主神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂都特別地包括在內(nèi)。也包括發(fā)育性神經(jīng)紊亂，如智力遲鈍，孤獨(dú)癥，胎兒酒精綜合癥，唐氏綜合癥和大腦麻痹癥。本發(fā)明的化合物也可用于治療涉及周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的綜合癥。這些失調(diào)包括上述任何因子引起的那些，并特別包括菜姆病，HIV伴隨神經(jīng)病，多肌炎，肌肉營(yíng)養(yǎng)不良和重癥肌無(wú)力。
與大鼠RetL，人部分RetL1，人全長(zhǎng)RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3的蛋白，或這些蛋白的片段特異結(jié)合的本發(fā)明的抗RetL抗體和Ret融合蛋白在幾種方法中有用。這些化合物可在治療上用于抑制或阻斷Ret受體信號(hào)，如用于阻斷腫瘤生長(zhǎng)，這些腫瘤生長(zhǎng)依賴(lài)Ret信號(hào)傳導(dǎo)的活化。這些試劑也可與可檢測(cè)的標(biāo)記融合，如熒光性或放射性不透明物質(zhì)，施用給受治療者可使表達(dá)RetL的組織成像。這些試劑也可與諸如辣根過(guò)氧化物酶的物質(zhì)結(jié)合，其可用作免疫細(xì)胞化學(xué)染色以對(duì)組織切片上的Ret-陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)域進(jìn)行觀察?？梢赃@種方法單獨(dú)使用特定抗體，在特定抗體結(jié)合的位點(diǎn)可使用結(jié)合于可檢測(cè)的標(biāo)記上的抗免疫球蛋白抗體在夾心分析中觀察到。任何RetL的特異抗體也在對(duì)給定抗體的特異的底物定量免疫分析中有用。RetL的特異抗體也可結(jié)合于固體支持物上，如玻璃珠或平板，并可用于從溶液中移出配體以純化蛋白或從溶液中除去配體。每項(xiàng)這種技術(shù)對(duì)于免疫領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是常規(guī)操作。
本發(fā)明的其它方法包括通過(guò)Ret與抗Ret單克隆抗體接觸調(diào)節(jié)Ret-RetL信號(hào)傳導(dǎo)。依賴(lài)每個(gè)特異單克隆抗體與Ret相互作用的特征，這種單克隆抗體-Ret接觸的效應(yīng)可以是阻斷或刺激Ret信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化。某些單克隆抗體作為興奮劑與Ret相互作用，興奮劑單克隆抗體與Ret結(jié)合激發(fā)Ret二聚體形成和自身磷酸化。其它單克隆抗體作為Ret拮抗劑起作用。Ret與拮抗劑單克隆抗體相互作用阻止由其它RetL或由含RetL的復(fù)合物引起的Ret信號(hào)傳導(dǎo)的活化。
RetL和/或針對(duì)Ret或Ret融合蛋白的抗體可用于使表達(dá)Ret的組織成像，或?qū)τ诳筊etL抗體，可在上述免疫組織化學(xué)或制備方法中應(yīng)用。
包含RetL和/或抗Ret抗體的融合蛋白可用來(lái)抵抗表達(dá)Ret的癌和腫瘤進(jìn)行特異靶位點(diǎn)醫(yī)療。這樣的腫瘤可包括與Ret突變相關(guān)的幾種不同的腫瘤表型(N.Engl.J.Med.335:943-951,1996；自然367:319-320,1996；Trends Gen.12:138-144,1996)。抵抗表達(dá)RetL的腫瘤形成的治療干擾利用整合了Ret和/或抗RetL抗體的融合蛋白。通過(guò)抗體依賴(lài)的和補(bǔ)體依賴(lài)的由Fc結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的細(xì)胞溶解作用，抗Ret抗體或抗RetL抗體本身可以有效。通過(guò)將這種雜交配體和抗體作為抗腫瘤形成藥物，毒素和殺細(xì)胞放射性核素如釔90的傳送載體使用，可使它們更有效。使用異源偶聯(lián)抗體可將細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞，即對(duì)腫瘤表達(dá)的Ret或RetL的特異的抗體可與針對(duì)細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞如NK細(xì)胞或CTL上的表面蛋白誘導(dǎo)的抗體共價(jià)偶聯(lián)。
抗Ret抗體或RetL治療的一個(gè)例子是將蓖麻毒蛋白的毒性A鏈或修飾的蓖麻毒蛋白全長(zhǎng)形式(其不再能結(jié)合細(xì)胞)與RetL或針對(duì)在惡性細(xì)胞表面表達(dá)的Ret多肽誘導(dǎo)的抗體偶聯(lián)。在另一種實(shí)施方案中，毒素與Ret或抗RetL抗體偶聯(lián)以選擇性地定向并殺死RetL陽(yáng)性細(xì)胞，如表達(dá)RetL的腫瘤。通過(guò)阻斷蓖麻毒蛋白與針對(duì)大多數(shù)腫瘤形成細(xì)胞上表達(dá)的CD19抗原的單克隆抗體偶聯(lián)證明這種方法是成功的(Grossbard等，血液79:576,1992)。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，其它毒素同樣有用。這樣的毒素包括但不限于假單孢外毒素，白喉毒素，和皂草素。與已知的抗CD-19抗原方法相比，利用RetL或抗Ret抗體的該法應(yīng)該證明甚至更成功，因?yàn)镽et在非常有限的幾個(gè)組織中表達(dá)。
上述使用蓖麻毒素或其它毒素融合的方法同樣適用于RetL或抗Ret抗體的有毒偶聯(lián)物；它們可用于選擇性地錨定和殺死Ret陽(yáng)性細(xì)胞，如表達(dá)Ret的腫瘤細(xì)胞。
這種醫(yī)療的另一種方法是用放射性同位素標(biāo)記的RetL或抗Ret抗體。這種放射性標(biāo)記的化合物優(yōu)先將放射活性定位到表達(dá)Ret的細(xì)胞中的腫瘤位點(diǎn)，而正常組織中沒(méi)有。根據(jù)所用的同位素，結(jié)合于腫瘤細(xì)胞的放射性標(biāo)記的抗體發(fā)出的輻射也可能殺死鄰近不表達(dá)Ret的惡性腫瘤細(xì)胞。一系列放射性核素可以使用。發(fā)射β粒子的同位素(如，131Ⅰ)已成功地用于針對(duì)B-細(xì)胞淋巴瘤上CD20的單克隆抗體[Kaminski.等，N.Engl.J.Med.329:459(1993)；Press等，N.Engl.J.MeCl.329:1219(1993)]。發(fā)射β粒子的放射性核素產(chǎn)生的放射性輻射，具有跨幾個(gè)細(xì)胞直徑距離的殺腫瘤活性，允許抗原陰性細(xì)胞的根除和減小腫瘤中抗體或配體的非同源沉積后果。
發(fā)射α粒子的放射性核素也可使用。放射性核素標(biāo)記的RetL或抗Ret抗體產(chǎn)生的低劑量照射可能比傳統(tǒng)放射治療中外部施加的瞬間照射更有效。低劑量照射可能誘導(dǎo)某些細(xì)胞系凋亡(程序性細(xì)胞死亡)[Macklis等，Radiat.Res.130:220(1992)；Maklis等，Radiopharm.5:339(1992)]。
本發(fā)明的化合物以治療有效量用藥，此意味著產(chǎn)生醫(yī)療滿意結(jié)果或?qū)χ委煹奶囟ㄇ闆r產(chǎn)生影響的化合物量。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“受治療者(subject)”是用來(lái)指任何接受Ret配體或基因的哺乳動(dòng)物。預(yù)期用本發(fā)明的方法治療的特定受治療者包括人，以及非人靈長(zhǎng)類(lèi)，綿羊，馬，牛，山羊，豬，狗，貓，兔，豚鼠，倉(cāng)鼠，沙土鼠，大鼠和小鼠，以及來(lái)源于或來(lái)自這些宿主的器官，腫瘤和細(xì)胞。本發(fā)明的化合物在基因治療中的應(yīng)用將本發(fā)明的RetL基因?qū)胧軗p組織，刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞合成RetL，促進(jìn)表達(dá)Ret的細(xì)胞生長(zhǎng)和/或細(xì)胞存活。
在基因治療方法的特定實(shí)施方案中，可將RetL基因?qū)胨x的腎或神經(jīng)靶組織。RetL即可以穩(wěn)定表達(dá)并刺激Ret受體陽(yáng)性細(xì)胞生長(zhǎng)，分裂，分化和/或促進(jìn)細(xì)胞存活。另外，使用以病毒或非病毒為基礎(chǔ)的策略的一系列眾所周知的方法可將RetL基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)。
非病毒方法包括電穿孔法，用脂質(zhì)體膜融合，用DNA包被的微粒高壓轟擊，與磷酸鈣-DNA一起溫育，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和單細(xì)胞直接注射法。例如，RetL基因可通過(guò)磷酸鈣共沉淀法[Pillicer等，科學(xué)，209:1414-1422(1980)]；機(jī)械微注射和/或粒子加速[Anderson等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，77:5399-5403(1980)]；以脂質(zhì)體為基礎(chǔ)的DNA轉(zhuǎn)染(例如LIPOFECTIN介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，F(xiàn)efgner等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，84:471-477,1987；Gao and Huang,Biochem.Biophys.Res.Comm.,179:280-285,1991)；DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；電穿孔法(美國(guó)專(zhuān)利4,956,288)；或以多聚賴(lài)氨酸為基礎(chǔ)的方法(其中DNA被偶聯(lián)以轉(zhuǎn)運(yùn)DNA優(yōu)先地到肝臟的肝細(xì)胞中)(Wolff等，科學(xué)，247:465-468,1990；Curiel等，人類(lèi)基因治療3:147-154,1992)導(dǎo)入細(xì)胞。
通過(guò)直接基因轉(zhuǎn)移法可將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。見(jiàn)例如Wolff等，“直接基因轉(zhuǎn)入駝鹿肌肉內(nèi)”，科學(xué)247:1465-68,1990。在一些情況下，載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染受歡迎。本領(lǐng)域任何已知的將多聚核苷酸序列插入載體中的方法都可使用。見(jiàn)Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，NY(1989)和Ausuabel等，分子生物學(xué)常規(guī)方法，J.Wiley&amp;Sons,NY(1992)，此處引用兩者作為參考。啟動(dòng)子活化可以是組織特異性的或者受代謝產(chǎn)物或施用物質(zhì)誘導(dǎo)的。這種啟動(dòng)子/增強(qiáng)子包括但不限于，天然RetL啟動(dòng)子，巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子[Karasuyama.等，J.Exp.Med.,169:13(1989)]；人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子[Gunning等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，84:4831(1987)]；小鼠乳腺瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列(MMTV LTR)中的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)啟動(dòng)子[klessig等，Mol.Cell.Biol.,4:1354(1984)]；Moloney鼠白血病病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列(MuLV LTR)[Weiss等，RNA腫瘤病毒，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，NY(1985)]；勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子[Yamamoto等，細(xì)胞，22:787(1980)]；SV40早期啟動(dòng)子[Bernoist and Chambon，自然，290:304(1981)]；單純皰疹病毒(HSV)胸腺嘧啶激酶啟動(dòng)子[Wagner等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，78:1441(1981)]；腺病毒啟動(dòng)子[Yamada等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，82:3567(1985)]。
RetL基因也可通過(guò)特定的病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞，這些載體在現(xiàn)已建立的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中使用。見(jiàn)例如，Madzak等，J.Gen.Virol.,73:1533-36,1992(乳多空病毒SV40)；Berkner等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:39-61,1992(腺病毒)；Hofmann等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)92:10099-10103,1995(桿狀病毒)；Moss等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:25-38,1992(痘病毒)；Muzyczka,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:97-123,1992(腺病毒伴隨病毒)；Margulskee,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:67-93,1992[單純皰疹病毒(HSV)和Epstein-Barr病毒(HBV)]；Miller,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:1-24,1992(逆轉(zhuǎn)錄病毒)；Brandyopadhyay等，Mol.Cell.Biol.,4:749-754,1984(逆轉(zhuǎn)錄病毒)；Miller等，自然，357:455-450,1992(逆轉(zhuǎn)錄病毒)；Anderson，科學(xué)，256:808-813,1992(逆轉(zhuǎn)錄病毒)，分子生物常用方法Section 9.10-9.14(Ausubel.等，編輯)，Greene PublishingAssociates,1989，引用所有這些文獻(xiàn)作為參考。
優(yōu)選的載體是DNA病毒，包括腺病毒(優(yōu)選以Ad-2或Ad-5為基礎(chǔ)的載體)，桿狀病毒，皰疹病毒(優(yōu)選以單純皰疹病毒為基礎(chǔ)的載體)，和細(xì)小病毒(優(yōu)選以“缺陷型”或非自主型細(xì)小病毒為基礎(chǔ)的載體，更優(yōu)選以腺病毒伴隨病毒為基礎(chǔ)的載體，最優(yōu)選以AAV-2為基礎(chǔ)的載體)。見(jiàn)例如Ali等，基因治療1:367-384,1994；美國(guó)專(zhuān)利4,797,368和5,399,346和以下討論的。
為轉(zhuǎn)染，例如RetL序列，根據(jù)一系列因素選擇特定的載體系統(tǒng)。一個(gè)重要因素是靶細(xì)胞群體的性質(zhì)。盡管逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已廣泛地被研究并用于許多基因治療應(yīng)用，但它們一般并不適用于轉(zhuǎn)染非分化細(xì)胞，而在癌癥治療中有用，因?yàn)樗鼈冎荒茉趶?fù)制細(xì)胞中整合與表達(dá)。由于它們能穩(wěn)定地整合到靶細(xì)胞基因組中，它們?cè)隗w外方法中有用而且很有吸引力。
腺病毒是真核DNA病毒，可被修飾以有效地將治療或報(bào)告轉(zhuǎn)化基因運(yùn)載到一系列細(xì)胞類(lèi)型中。能引起人類(lèi)呼吸性疾病的普通腺病毒2型和5型(Ad2和Ad5)，現(xiàn)已被發(fā)展用于假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)和膽囊纖維化(CF)的基因治療。Ad2和Ad5屬于與人惡性腫瘤無(wú)關(guān)的一種腺病毒亞型。不管處于那個(gè)分裂時(shí)期，腺病毒載體能將非常高水平的轉(zhuǎn)化基因運(yùn)載到幾乎所有細(xì)胞類(lèi)型中。在293細(xì)胞中(腺病毒轉(zhuǎn)化的互補(bǔ)人胚胎腎細(xì)胞系:ATCC CRL 1573)能很容易的獲得高滴度(1013噬菌斑形成單位/ml)的重組病毒，并可冷凍貯存很長(zhǎng)時(shí)間而無(wú)明顯丟失。在各種失調(diào)的動(dòng)物模型中已證實(shí)這種系統(tǒng)在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)補(bǔ)償遺傳性失衡的治療性轉(zhuǎn)化基因中的效力。見(jiàn)Y.Watanabe,Atherosclerosis,36:261-268(1986)；K.Tanzawa等，REBS Letters,118(1):81-84(1980)；J.L.Golasten等，New Engl.J.Med.,309(11983):288-296(1983)；S.Ishibashi等，J.Clin.Invest.,92:883-893(1993)；和S.Ishibashi等，J.Chin.Invest.,93:1889-1893(1994)，引用所有這些文獻(xiàn)作為參考。確實(shí)，編碼膽囊纖維化跨膜調(diào)節(jié)子(CFTR)的重組復(fù)制缺損腺病毒已批準(zhǔn)用于至少兩例人CF臨床試驗(yàn)。見(jiàn)例如J.Wilson自然，365:691-692(1993年8月21日)。人類(lèi)中存活腺病毒疫苗的大量經(jīng)驗(yàn)進(jìn)一步支持了重組腺病毒用于基因治療的安全性。
人類(lèi)腺病毒包含線性，約36kb的雙鏈DNA基因組，該基因組可分成100個(gè)圖譜單位(m.u.)，每個(gè)圖譜單位長(zhǎng)360bp。在基因組的每個(gè)末端的DNA含有短的反向末端重復(fù)(ITR)，是病毒DNA復(fù)制必須的。根據(jù)在病毒DNA合成起始前或后表達(dá)，這些基因產(chǎn)物排列為早期區(qū)(E1到E4)和晚期區(qū)(L1到L5)。參見(jiàn)Horwitz，病毒學(xué)，第二版，B.N.Fields編輯，Raven Press Ltd.,New York(1990)。
第一代重組子，復(fù)制缺陷型腺病毒已發(fā)展用于DMD和含全長(zhǎng)E1a和部分E1b區(qū)域缺失的其它遺傳性失調(diào)的基因治療。復(fù)制缺陷型病毒可以在293細(xì)胞中生長(zhǎng)，293細(xì)胞包含有功能的腺病毒E1a基因，可提供反式作用E1a蛋白。E1缺失病毒能在293細(xì)胞中復(fù)制和增殖侵染性的細(xì)胞，293提供E1a和E1b區(qū)基因產(chǎn)物互補(bǔ)。所得病毒侵染一些細(xì)胞類(lèi)型，并表達(dá)導(dǎo)入的基因(假設(shè)它帶有自己的啟動(dòng)子)，但不能在不含E1區(qū)DNA的細(xì)胞中復(fù)制，除非以非常高的感染復(fù)數(shù)侵染細(xì)胞。腺病毒有下列優(yōu)點(diǎn)它們有廣譜宿主范圍，能侵染休眠或終級(jí)分化的細(xì)胞如神經(jīng)元，表現(xiàn)出必需地非致癌性。腺病毒不整合到宿主基因組中。因?yàn)樗麄兇嬖谟谌旧w外，插入突變的危險(xiǎn)大大降低。Ali等，同上，于273。重組腺病毒(rAdV)有很高的滴度，病毒粒子相當(dāng)穩(wěn)定，表達(dá)水平高，能侵染廣譜的細(xì)胞。它們的天然宿主細(xì)胞是氣道上皮細(xì)胞，因此他們?cè)诜伟┑闹委熤杏杏谩?br> 桿狀病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化有一些優(yōu)點(diǎn)。桿狀病毒基因轉(zhuǎn)移可在復(fù)制和非復(fù)制細(xì)胞中進(jìn)行，并可在腎細(xì)胞，及肝細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，脾，皮膚和肌肉中進(jìn)行。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中桿狀病毒是非復(fù)制和非致病性的。人缺少能阻斷侵染的重組桿狀病毒抗體。另外，桿狀病毒能整合并轉(zhuǎn)導(dǎo)大片段的DNA插入。
腺病毒伴隨病毒(AAV)也已用于體細(xì)胞基因治療。AAV是小的，單鏈DNA病毒，有簡(jiǎn)單的基因組構(gòu)成(4.9kb)，使它成為基因工程的理想底物。兩個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼一系列的rep和cap多肽。Rep多肽(rep78,rep68,rep62和rep40)參與AAV基因組的復(fù)制，裝配和整合。Cap蛋白(VP1,VP2和VP3)形成病毒外殼。鄰近rep和cap開(kāi)放閱讀框架的5′和3′區(qū)是145bp的反向末端重復(fù)(1TRs)，前125bp能形成Y-型或T-型二級(jí)結(jié)構(gòu)。為改進(jìn)AAV載體，整個(gè)rep和cap結(jié)構(gòu)域可以被切除并用治療基因或報(bào)告基因代替。參見(jiàn)B.J.Carter，于細(xì)小病毒手冊(cè)，P.Tijsser編輯，CRC出版社，155-168頁(yè)(1990)。已表明ITRs代表了AAV基因組復(fù)制，裝配，包裝和整合必須的最小序列。
ANV生活史是雙相的，包括潛伏期和裂解期。在潛伏侵染期，AAV病毒粒子以包被的SSDNA進(jìn)入細(xì)胞，之后立即傳遞入核并且在此AAVDNA穩(wěn)定地整合入宿主染色體，不明顯需要宿主細(xì)胞分裂。在沒(méi)有輔助病毒時(shí)，整合的AAV基因組保持潛伏狀態(tài)，但能被激活和裝配。當(dāng)含AAV原病毒的細(xì)胞經(jīng)皰疹病毒或腺病毒第二次侵染激發(fā)時(shí)，生活史的裂解期開(kāi)始，皰疹病毒或腺病毒編碼輔助功能蛋白，能被AAV用于幫助它從宿主染色體的切割(B.J.Carter，同上)。侵染的親本SSDNA以rep依賴(lài)方式形成雙鏈復(fù)制形式(RF)DNAs。將裝配的AAV基因組包裝到預(yù)先形成的蛋白外殼中(直徑約20nM的正二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu))，隨著細(xì)胞裂解釋放侵染性病毒粒子，病毒粒子中包裝了+或-SSDNA。
腺病毒伴隨病毒(AAV)在基因治療方面有重要潛力。病毒粒子很穩(wěn)定并且重組AAV(rAAV)有“藥物樣”特征，其特征在于rAAV可通過(guò)沉淀或CsCl梯度條帶純化。它們是熱穩(wěn)定的并可凍干成粉末且可水化后恢復(fù)全部活性。它們的DNA穩(wěn)定整合到宿主染色體中，因此表達(dá)是長(zhǎng)期的。它們的宿主范圍廣并且AAV不引起任何可知的疾病，因此重組載體無(wú)毒性的。
一旦目的序列導(dǎo)入靶細(xì)胞后，可用常規(guī)的方法鑒定有用序列，如用與載體插入基因序列同源/互補(bǔ)序列為探針的核酸雜交。在另一種方法是，可用由表達(dá)載體導(dǎo)入靶細(xì)胞引起“標(biāo)記”基因功能(如胸腺嘧啶激酶活性，抗生素抗性等)的有無(wú)鑒定該序列。配方與給藥本發(fā)明的化合物可以用醫(yī)學(xué)上可接受的任何方法給藥?？砂ㄗ⑸洌?jīng)非腸胃途徑如靜脈內(nèi)，血管內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，皮下，肌肉內(nèi)，腫瘤內(nèi)，會(huì)陰內(nèi)，心室內(nèi)，表皮內(nèi)以及口部，鼻部，眼部，直腸或局部。通過(guò)貯積注射或可蝕性植入的持續(xù)釋放用藥也特別地包括在本發(fā)明中。特別考慮的是定向?qū)?，通過(guò)用導(dǎo)管傳遞到一個(gè)或多個(gè)動(dòng)脈中，如腎動(dòng)脈或供應(yīng)局部腫瘤的血管。
術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”是指一個(gè)或多個(gè)有機(jī)的或無(wú)機(jī)的，天然的或合成的成分，突變的原癌基因或突變的癌蛋白與它們結(jié)合促進(jìn)其施用。合適的載體包括無(wú)菌的生理鹽水，盡管其它已知的藥學(xué)上可接受的含水和不含水的等滲無(wú)菌溶液和無(wú)菌懸浮液已被本領(lǐng)域的一般熟練技術(shù)人員所熟知。在這方面，“載體”包括脂質(zhì)體和HIV-1 tat蛋白(參見(jiàn)Chen等，Anal.Biochem.,227:168-175,1995)及任何質(zhì)粒和病毒表達(dá)載體。“有效劑量”是指能減輕或延遲疾病過(guò)程，退化或損傷情況的量。有效劑量可在個(gè)體基礎(chǔ)上確定，部分基于待治病癥和想要達(dá)到的結(jié)果的考慮。有效劑量可由本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員權(quán)衡這些因素和使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。
脂質(zhì)體系統(tǒng)可以是單層載體，多層載體或穩(wěn)定極性層載體中的任一種，并可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備和給藥，例如根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利5,169,637,4,762,915,5,000,958或5,185,154的說(shuō)明。另外，為增加它們與脂質(zhì)體的結(jié)合，需要表達(dá)本發(fā)明的新的多肽以及其它所選擇的多肽如脂蛋白。例如用脂質(zhì)體包被的RetL治療人急性腎衰竭，可通過(guò)可利用脂質(zhì)體將RetL導(dǎo)入需要這樣治療的細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行。脂質(zhì)體可通過(guò)導(dǎo)道運(yùn)送到腎動(dòng)脈。重組的RetL蛋白例如通過(guò)免疫親和層析或其它常規(guī)方法從CHO細(xì)胞純化，然后與脂質(zhì)體混和并且高效摻到脂質(zhì)體中。在體外可檢測(cè)包被蛋白對(duì)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的任何影響。
本發(fā)明也考慮到，為提高它們的穩(wěn)定性和/或免疫原性，通過(guò)脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)將本發(fā)明的新的多肽施用給動(dòng)物。因?yàn)樵诮邮苤委煹膭?dòng)物中脂質(zhì)體可以通過(guò)吞噬細(xì)胞內(nèi)化，所以通過(guò)脂質(zhì)體來(lái)運(yùn)載新的多肽有特別的優(yōu)點(diǎn)。這些細(xì)胞在消化掉脂質(zhì)體膜后，將與引發(fā)強(qiáng)烈免疫反應(yīng)所必須的其它分子偶聯(lián)的多肽提呈到免疫系統(tǒng)。
本發(fā)明的任何一種新的RetL多肽可以以藥學(xué)上可接受的鹽的形式使用。能與本發(fā)明的多肽形成鹽的合適酸或堿已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括無(wú)機(jī)和有機(jī)酸和堿。
盡管上述發(fā)明已通過(guò)說(shuō)明和實(shí)施例的方式詳細(xì)描述，以便于理解清晰，但對(duì)一個(gè)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明范圍內(nèi)，如僅由附錄權(quán)利要求的范圍限定的，很明顯可以進(jìn)行一些改變和修飾。
序列表(1)基本信息(ⅰ)申請(qǐng)人Doherty,jodi(ⅱ)發(fā)明名稱(chēng)生物基因?qū)＠暾?qǐng)名稱(chēng)(ⅲ)序列數(shù)目21(ⅳ)聯(lián)系地址(A)地址Biogen,Inc.
(B)街道14 Cambrige Center(C)城市Cambrige(D)州名MA(E)國(guó)家USA(F)郵政編碼02142(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(ⅵ)目前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)遞交日1997年5月7日(C)分類(lèi)(ⅶ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/999,999(B)遞交日1996年1月1日(ⅷ)律師/代理人信息(A)名稱(chēng)levine,leslie M(B)登記號(hào)35,245(C)文件/著錄號(hào)A008 PCT CIP
(ⅸ)電信信息(A)電話617-679-2400(B)傳真617-679-2838(2)關(guān)于SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度3616個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類(lèi)型cDNA(ⅲ)假擬否(ⅳ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵CDS(B)位置257..1660(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GCGGCCGCAG GTTGGGTCGG AACTGAACCC CTGAAAGCGG GTCCGCCTCC CGCCCTCGCG60CCCGCCCGGA TCTGAGTCGC TGGCGGCGGT GGGCGGCAGA GCGACGGGGA GTCTGCTCTC 120ACCCTGGATG GAGCTGAACT TTGAGTGGCC AGAGGAGCGC AGTCGCCCGG GGATCGCTGC 180ACGCTGAGCT CTCTCCCCGA GACCGGGCGG CGGCTTTGGA TTTTGGGGGG GCGGGGACCA 240GCTGCGCGGC GGCACC ATG TTC CTA GCC ACT CTG TAC TTC GCG CTG CCA 289Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro1 5 10CTC CTG GAT TTG CTG ATG TCC GCC GAG GTG AGT GGT GGA GAC CGT CTG 337Leu Leu Asp Leu Leu Met Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu15 20 25GAC TGT GTG AAA GCC AGC GAT CAG TGC CTG AAG GAA CAG AGC TGC AGC 385Asp Cys Val Lys Ala Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser30 35 40ACC AAG TAC CGC ACA CTA AGG CAG TGC GTG GCG GGC AAG GAA ACC AAC 433Thr Lys Tyr Arg Thr Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn45 50 55TTC AGC CTG ACA TCC GGC CTT GAG GCC AAG GAT GAG TGC CGT AGC GCC 481Phe Ser Leu Thr Ser Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys Arg Ser Ala60 65 70 75ATG GAG GCC TTG AAG CAG AAG TCT CTG TAC AAC TGC CGC TGC AAG CGG 529Met Glu Ala Leu Lys Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Cys Lys Arg80 85 90GGC ATG AAG AAA GAG AAG AAT TGT CTG CGT ATC TAC TGG AGC ATG TAC 577Gly Met Lys Lys Glu Lys Asn Cys Leu Arg Ile Tyr Trp Ser Met Tyr95 100 105CAG AGC CTG CAG GGA AAT GAC CTC CTG GAA GAT TCC CCG TAT GAG CCG 625Gln Ser Leu Gln Gly Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro110 115 120GTT AAC AGC AGG TTG TCA GAT ATA TTC CGG GCA GTC CCG TTC ATA TCA 673Val Asn Ser Arg Leu Ser Asp Ile Phe Arg Ala Val Pro Phe Ile Ser125 130 135GAT GTT TTC CAG CAA GTG GAA CAC ATT TCC AAA GGG AAC AAC TGC CTG 721Asp Val Phe Gln Gln Val Glu His Ile Ser Lys Gly Asn Asn Cys Leu140 145 150 155GAC GCA GCC AAG GCC TGC AAC CTG GAC GAC ACC TGT AAG AAG TAC AGG 769Asp Ala Ala Lys Ala Cys Asn Leu Asp Asp Thr Cys Lys Lys Tyr Arg160 165 170TCG GCC TAC ATC ACC CCC TGC ACC ACC AGC ATG TCC AAC GAG GTC TGC 817Ser Ala Tyr Ile Thr Pro Cys Thr Thr Ser Met Ser Asn Glu Val Cys175 180 185AAC CGC CGT AAG TGC CAC AAG GCC CTC AGG CAG TTC TTC GAC AAG GTT 865Asn Arg Arg Lys Cys His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val190 195 200CCG GCC AAG CAC AGC TAC GGG ATG CTC TTC TGC TCC TGC CGG GAC ATC 913Pro Ala Lys His Ser Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp Ile205 210 215GCC TGC ACC GAG CGG CGG CGA CAG ACT ATC GTC CCC GTG TGC TCC TAT 961Ala Cys Thr Glu Arg Arg Arg Gln Thr Ile Val Pro Val Cys Ser Tyr220 225 230 235GAA GAA CGA GAG AGG CCC AAC TGC CTG AGT CTG CAA GAC TCC TGC AAG1009Glu Glu Arg Glu Arg Pro Asn Cys Leu Ser Leu Gln Asp Ser Cys Lys240 245 250ACC AAT TAC ATC TGC AGA TCT CGC CTT GCA GAT TTT TTT ACC AAC TGC1057Thr Asn Tyr Ile Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys255 260 265CAG CCA GAG TCA AGG TCT GTC AGC AAC TGT CTT AAG GAG AAC TAC GCA1105Gln Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser Asn Cys Leu Lys Glu Asn 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(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類(lèi)型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCTCGTC GCA 33(2)關(guān)于SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類(lèi)型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCGCATC ACA 33(2)關(guān)于SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1926個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類(lèi)型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵CDS(B)位置10..1920(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:GCGGCCGCC ATG GCG AAG GCG ACG TCC GGC GCC GCA GGG CTG GGG CTG 48Met Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Gly Leu470 475 480AAG CTG TTT TTG CTG CTG CCG CTA CTG GGA GAA GCC CCG CTG GGT CTC 96Lys Leu Phe Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Glu Ala Pro Leu Gly Leu485 490 495TAC TTC TCA AGG GAT GCT TAC TGG GAG AGG CTG TAT GTG GAC CAG CCA 144Tyr Phe Ser Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Arg Leu Tyr Val Asp Gln Pro500 505 510GCT GGC ACA CCT CTG CTC TAT GTC CAT GCC CTA CGG GAT GCC CCT GGA 192Ala Gly Thr Pro Leu Leu Tyr Val His Ala Leu Arg Asp Ala Pro Gly515 520 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(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Met Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Gly Leu Lys Leu Phe1 5 10 15Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Glu Ala Pro Leu Gly Leu Tyr Phe Ser20 25 30Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Arg Leu Tyr Val Asp Gln Pro Ala Gly Thr35 40 45Pro Leu Leu Tyr Val His Ala Leu Arg Asp Ala Pro Gly Glu Val Pro50 55 60Ser Phe Arg Leu Gly Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Tyr Arg Thr Arg Leu65 70 75 80His Glu Asn Asp Trp Ile His Ile Asp Ala Gly Thr Gly Leu Leu Tyr85 90 95Leu Asn Gln Ser Leu Asp His Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ser Ile Arg100 105 110Asn Gly Gly Phe Pro Leu Leu Thr Val Phe Leu Gln Val Phe Leu Gly115 120 125Ser Thr Ala Gln Arg Glu Gly Glu Cys His Trp Pro Gly Cys Ala Arg130 135 140Val Tyr Phe Ser Phe Ile Asn Asp Thr Phe Pro Asn Cys Ser Ser Phe145 150 155 160Lys Ala Arg Asp Leu Cys Thr Pro Glu Thr Gly Val Ser Phe Arg Ile165 170 175Arg Glu Asn Arg Pro Pro Gly Thr Phe Tyr Gln Phe Arg Met Leu Pro180 185 190Val Gln Phe Leu Cys Pro Asn Ile Ser Val Lys Tyr Lys Leu Leu Glu195 200 205Gly Asp Gly Leu Pro Phe Arg 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NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1223個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類(lèi)型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵CDS(B)位置1..1038(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:CTG CTG GAG GAT TCC CCA TAT GAA CCA GTT AAC AGC AGA TTG TCA GAT 48Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu Ser Asp640 645 650ATA TTC CGG GTG GTC CCA TTC ATA TCA GTG GAG CAC ATT CCC AAA GGG 96Ile Phe Arg Val Val Pro Phe Ile Ser Val Glu His Ile Pro Lys Gly655 660 665AAC AAC TGC CTG GAT GCA GCG AAG GCC TGC AAC CTC GAC GAC ATT TGC 144Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala Cys Asn Leu Asp Asp Ile Cys670 675 680 685AAG AAG TAC AGG TCG GCG TAC ATC ACC CCG TGC ACC ACC AGC GTG TCC 192Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr Ile Thr Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser690 695 700AAC GAT GTC TGC AAC CGC CGC AAG TGC CAC AAG GCC CTC CGG CAG TTC 240Asn Asp Val Cys Asn Arg Arg Lys Cys His Lys Ala Leu Arg Gln Phe705 710 715TTT GAC AAG GTC CCG GCC AAG CAC AGC TAC GGA ATG CTC TTC TGC TCC 288Phe Asp Lys Val Pro Ala Lys His Ser Tyr Gly Met Leu Phe Cys 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(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵CDS(B)位置118..1497(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:GGGCGGCCAG AGCAGCACAG CTGTCCGGGG ATCGCTGCAT GCTGAGCTCC CTCGGCAAGA60CCCAGCGGCG GCTCGGGATT TTTTTGGGGG GGCGGGGACC AGCCCCGCGC CGGCACC 117ATG TTC CTG GCG ACC CTG TAC TTC GCG CTG CCG CTC TTG GAC TTG CTC 165Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu350 355 360CTG TCG GCC GAA GTG AGC GGC GGA GAC CGC CTG GAT TGC GTG AAA GCC 213Leu Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys Ala365 370 375AGT GAT CAG TGC CTG AAG GAG CAG AGC TGC AGC ACC AAG TAC CGC ACG 261Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr380 385 390CTA AGG CAG TGC GTG GCG GGC AAG GAG ACC AAC TTC AGC CTG GCA TCC 309Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu Thr Asn Phe Ser Leu Ala Ser395 400 405 410GGC CTG GAG GCC AAG GAT GAG TGC CGC AGC GCC ATG GAG GCC CTG AAG 357Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lys415 420 425CAG AAG TCG CTC TAC AAC TGC CGC TGC AAG CGG GGT ATG AAG AAG GAG 405Gln Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg 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NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1878個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型
(ⅱ)分子類(lèi)型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵CDS(B)位置205..1242(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:CGCGGCGCCC AGCGCAGGCA GAGCGCTGTC GCATCCCGGG CGTCCACCCG CCATGGGGCT60CTCCTGGAGC CCGCGACCTC CACTGCTGAT GATCCTGCTA CTGGTGCTGT CGTTGTGGCT 120GCCACTTGGA GCAGGAAACT CCCTTGCCAC AGAGAACAGG TTTGTGAACA GCTGTACCCA 180GGCCAGAAAG AAATGCGAGG CTAA TCC CGC TTG CAA GGC TGC CTA CCA GCA 231Ser Arg Leu Gln Gly Cys Leu Pro Ala465 470CCT GGG CTC CTG CAC CTC CAG TTA AGC AGG CCG CTG CCC TTA GAG GAG 279Pro Gly Leu Leu His Leu Gln Leu Ser Arg Pro Leu Pro Leu Glu Glu475 480 485TCT GCC ATG TCT GCA GAC TGC CTA GAG GCA GCA GAA CAA CTC AGG AAC 327Ser Ala Met Ser Ala Asp Cys Leu Glu Ala Ala Glu Gln Leu Arg Asn490 495 500 505AGC TCT CTG ATA GAC TGC AGG TGC CAT CGG CGC ATG AAG CAC CAA GCT 375Ser Ser Leu Ile Asp Cys Arg Cys His Arg Arg Met Lys His Gln Ala510 515 520ACC TGT CTG GAC ATT TAT TGG ACC GTT CAC CCT GCC CGA AGC CTT GGT 423Thr Cys Leu Asp Ile Tyr Trp Thr Val His Pro Ala Arg Ser Leu Gly525 530 535GAC TAC GAG TTG GAT GTC TCA CCC TAT GAA 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(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵CDS(B)位置41..1231(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:CGCAGGCAGA GCGCTGTCGC ATCCCGGGCG TCCACCCGCC ATG GGG CTC TCC TGG 55Met Gly Leu Ser Trp350AGC CCG CGA CCT CCA CTG CTG ATG ATC CTG CTA CTG GTG CTG TCG TTG103Ser Pro Arg Pro Pro Leu Leu Met Ile Leu Leu Leu Val Leu Ser Leu355 360 365TGG CTG CCA CTT GGA GCA GGA AAC TCC CTT GCC ACA GAG AAC AGG TTT151Trp Leu Pro Leu Gly Ala Gly Asn Ser Leu Ala Thr Glu Asn Arg Phe370 375 380GTG AAC AGC TGT ACC CAG GCC AGA AAG AAA TGC GAG GCT AAT CCC GCT199Val Asn Ser Cys Thr Gln Ala Arg Lys Lys Cys Glu Ala Asn Pro Ala385 390 395TGC AAG GCT GCC TAC CAG CAC CTG GGC TCC TGC ACC TCC AGT TTA AGC247Cys Lys Ala Ala Tyr Gln His Leu Gly Ser Cys Thr Ser Ser Leu Ser400 405 410 415AGG CCG CTG CCC TTA GAG GAG TCT GCC ATG TCT GCA GAC TGC CTA GAG295Arg Pro Leu Pro Leu Glu Glu Ser Ala Met Ser Ala Asp Cys Leu Glu420 425 430GCA GCA GAA CAA CTC AGG AAC AGC TCT CTG ATA GAC TGC AGG TGC CAT343Ala Ala Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Leu Ile Asp Cys Arg Cys His435 440 445CGG CGC 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(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1271個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類(lèi)型cDNA”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵CDS(B)位置2..946(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:C GGC TAC TGT GAA ACA CCT CAA CTC AGG AAC AGC TCT CTG ATA GGC 46Gly Tyr Cys Glu Thr Pro Gln Leu Arg Asn Ser Ser Leu Ile Gly400 405 410TGC ATG TGC CAC CGG CGC ATG AAG AAC CAG GTT GCC TGC TTG GAC ATC 94Cys Met Cys His Arg Arg Met Lys Asn Gln Val Ala Cys Leu Asp Ile415 420 425TAT TGG ACC GTT CAC CGT GCC CGC AGC CTT GGT AAC TAT GAG CTG GAT142Tyr Trp Thr Val His Arg Ala Arg Ser Leu Gly Asn Tyr Glu Leu Asp430 435 440GTC TCC CCC TAT GAA GAC ACA GTG ACC AGC AAA CCC TGG AAA ATG AAT190Val Ser Pro Tyr Glu Asp Thr Val Thr Ser Lys Pro Trp Lys Met Asn445 450 455 460CTC AGC AAA CTG AAC ATG CTC AAA CCA GAC TCA GAC CTC TGC CTC AAG238Leu Ser Lys Leu Asn Met Leu Lys Pro Asp Ser Asp Leu Cys Leu Lys465 470 475TTT GCC ATG CTG TGT ACT CTC AAT GAC AAG TGT GAC CGG CTG CGC AAG286Phe Ala Met Leu Cys Thr Leu Asn Asp Lys Cys Asp Arg Leu Arg Lys480 485 490GCC TAC GGG GAG GCG TGC TCC GGG CCC CAC TGC CAG CGC CAC GTC TGC334Ala Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Pro His Cys Gln Arg His Val Cys495 500 505CTC AGG CAG CTG CTC ACT TTC TTC GAG AAG GCC GCC GAG CCC CAC GCG382Leu Arg Gln Leu Leu Thr Phe Phe Glu Lys Ala Ala Glu Pro His Ala510 515 520CAG GGC CTG CTA CTG TGC CCA TGT GCC CCC AAC GAC CGG GGC TGC GGC430Gln Gly Leu Leu Leu Cys Pro Cys Ala Pro Asn Asp Arg Gly Cys Gly525 530 535 540GAG CGC CGG CGC AAC ACC ATC GCC CCC AAC TGC GCG CTG CCG CCT GTG 478Glu Arg Arg Arg Asn Thr Ile Ala Pro Asn Cys Ala Leu Pro Pro Val545 550 555GCC CCC AAC TGC CTG GAG CTG CGG CGC CTC TGC TTC TCC GAC CCG CTT 526Ala Pro Asn Cys Leu Glu Leu Arg Arg Leu Cys Phe Ser Asp Pro Leu560 565 570TGC AGA TCA CGC CTG GTG GAT TTC CAG ACC CAC TGC CAT CCC ATG GAC 574Cys Arg Ser Arg Leu Val Asp Phe Gln Thr His Cys His Pro Met Asp575 580 585ATC CTA GGA ACT TGT GCA ACA GAG CAG TCC AGA TGT CTA CGA GCA TAC 622Ile Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cys Leu Arg Ala Tyr590 595 600CTG GGG CTG ATT GGG ACT GCC ATG ACC CCC AAC TTT GTC AGC AAT GTC 670Leu Gly Leu Ile Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe Val Ser Asn Val605 610 615 620AAC ACC AGT GTT GCC TTA AGC TGC ACC TGC CGA GGC AGT GGC AAC CTG 718Asn Thr Ser Val Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg Gly Ser Gly Asn Leu625 630 635CAG GAG GAG TGT GAA ATG CTG GAA GGG TTC TTC TCC CAC AAC CCC TGC 766Gln Glu Glu Cys Glu Met Leu Glu Gly Phe Phe Ser His Asn Pro Cys640 645 650CTC ACG GAG GCC ATT GCA GCT AAG ATG CGT TTT CAC AGC CAA CTC TTC 814Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ala Lys Met Arg Phe His Ser Gln Leu Phe655 660 665TCC CAG GAC TGG CCA CAC CCT ACC TTT GCT GTG ATG GCA CAC CAG AAT 862Ser Gln Asp Trp Pro His Pro Thr Phe Ala Val Met Ala His Gln Asn670 675 680GAA AAC CCT GCT GTG AGG CCA CAG CCC TGG GTG CCC TCT CTT TTC TCC 910Glu Asn Pro Ala Val Arg Pro Gln Pro Trp Val Pro Ser Leu Phe Ser685 690 695 700TGC ACG CTT CCC TTG ATT CTG CTC CTG AGC CTA TGG TAGCTGGACT 956Cys Thr Leu Pro Leu Ile Leu Leu Leu Ser Leu Trp705 710TCCCCAGGGC CCTCTTCCCC TCCACCACAC CCAGGTGGAC TTGCAGCCCA CAAGGGGTGA 1016GGAAAGGACA GCAGCAGGAA GGAGGTGCAG TGCGCAGATG AGGGCACAGG AGAAGCTAAG 1076GGTTATGACC TCCAGATCCT TACTGGTCCA GTCCTCATTC CCTCCACCCC ATCTCCACTT 1136CTGATTCATG CTGCCCCTCC TTGGTGGCCA CAATTTAGCC ATGTCATCTG GTGCCTGTGG 1196GCCTTGCTTT ATTCCTATTA TTGTCCTAAA GTCTCTCTGG GCTCTTGGAT CATGATTAAA 1256CCTTTGACTT AAAAA 1271(2)關(guān)于SEQ ID NO:19的信息
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度315個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:Gly Tyr Cys Glu Thr Pro Gln Leu Arg Asn Ser Ser Leu Ile Gly Cys1 5 10 15Met Cys His Arg Arg Met Lys Asn Gln Val Ala Cys Leu Asp Ile Tyr20 25 30Trp Thr Val His Arg Ala Arg Ser Leu Gly Asn Tyr Glu Leu Asp Val35 40 45Ser Pro Tyr Glu Asp Thr Val Thr Ser Lys Pro Trp Lys Met Asn Leu50 55 60Ser Lys Leu Asn Met Leu Lys Pro Asp Ser Asp Leu Cys Leu Lys Phe65 70 75 80Ala Met Leu Cys Thr Leu Asn Asp Lys Cys Asp Arg Leu Arg Lys Ala85 90 95Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Pro His Cys Gln Arg His Val Cys Leu100 105 110Arg Gln Leu Leu Thr Phe Phe Glu Lys Ala Ala Glu Pro His Ala Gln115 120 125Gly Leu Leu Leu Cys Pro Cys Ala Pro Asn Asp Arg Gly Cys Gly Glu130 135 140Arg Arg Arg Asn Thr Ile Ala Pro Asn Cys Ala Leu Pro Pro Val Ala145 150 155 160Pro Asn Cys Leu Glu Leu Arg Arg Leu Cys Phe Ser Asp Pro Leu Cys165 170 175Arg Ser Arg Leu Val Asp Phe Gln Thr His Cys His Pro Met Asp Ile180 185 190Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cys Leu Arg Ala Tyr Leu195 200 205Gly Leu Ile Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe Val Ser Asn Val Asn210 215 220Thr Ser Val Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg Gly Ser Gly Asn Leu Gln225 230 235 240Glu Glu Cys Glu Met Leu Glu Gly Phe Phe Ser His Asn Pro Cys Leu245 250 255Thr Glu Ala Ile Ala Ala Lys Met Arg Phe His Ser Gln Leu Phe Ser260 265 270Gln Asp Trp Pro His Pro Thr Phe Ala Val Met Ala His Gln Asn Glu275 280 285Asn Pro Ala Val Arg Pro Gln Pro Trp Val Pro Ser Leu Phe Ser Cys290 295 300Thr Leu Pro Leu Ile Leu Leu Leu Ser Leu Trp305 310 315(2)關(guān)于SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1699個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類(lèi)型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵CDS(B)位置175..1374(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:TGTGGACGCG CGCTTCGGAG TTGGAGGGCG GCGCCCAGGA CCCTGGTGGG AGAGTGTGTG 60CGTCGCGCTG GAGGGCGGGA GGCGGGGGCG GGAGGTGCCG GTCGAGGGAG CCCCGCTCTC120AGAGCTCCAG GGGAGGAGCG AGGGGAGCGC GGAGCCCGGC GCCTACAGCT CGCC ATG 177MetGTG CGC CCC CTG AAC CCG CGA CCG CTG CCG CCC GTA GTC CTG ATG TTG 225Val Arg Pro Leu Asn Pro Arg Pro Leu Pro Pro Val Val Leu Met Leu320 325 330CTG CTG CTG CTG CCG CCG TCG CCG CTG CCT CTC GCA GCC GGA GAC CCC 273Leu Leu Leu Leu Pro Pro Ser Pro Leu Pro Leu Ala Ala Gly Asp Pro335 340 345CTT CCC ACA GAA AGC CGA CTC ATG AAC AGC TGT CTC CAG GCC AGG AGG 321Leu Pro Thr Glu Ser Arg Leu Met Asn Ser Cys Leu Gln Ala Arg Arg350 355 360AAG TGC CAG GCT GAT CCC ACC TGC AGT GCT GCC TAC CAC CAC CTG GAT 369Lys Cys Gln Ala Asp Pro Thr Cys Ser Ala Ala Tyr His His Leu Asp365 370 375 380TCC TGC ACC TCT AGC ATA AGC ACC CCA CTG CCC TCA GAG GAG CCT TCG 417Ser Cys Thr Ser Ser Ile Ser Thr Pro Leu Pro Ser Glu Glu Pro Ser385 390 395GTC CCT GCT GAC TGC CTG GAG GCA GCA CAG CAA CTC AGG AAC AGC TCT 465Val Pro Ala Asp Cys Leu Glu Ala Ala Gln Gln Leu Arg Asn Ser Ser400 405 410CTG ATA GGC TGC ATG TGC CAC CGG CGC ATG AAG AAC CAG GTT GCC TGC 513Leu Ile Gly Cys Met Cys His Arg Arg Met Lys Asn Gln Val Ala Cys415 420 425TTG GAC ATC TAT TGG ACC GTT CAC CGT GCC CGC AGC CTT GGT AAC TAT 561Leu Asp Ile Tyr Trp Thr Val His Arg Ala Arg Ser Leu Gly Asn Tyr430 435 440GAG CTG GAT GTC TCC CCC TAT GAA GAC ACA GTG ACC AGC AAA CCC TGG 609Glu Leu Asp Val Ser Pro Tyr Glu Asp Thr Val Thr Ser Lys Pro Trp445 450 455 460AAA ATG AAT CTC AGC AAA CTG AAC ATG CTC AAA CCA GAC TCA GAC CTC 657Lys Met Asn Leu Ser Lys Leu Asn Met Leu Lys Pro Asp Ser Asp Leu465 470 475TGC CTC AAG TTT GCC ATG CTG TGT ACT CTC AAT GAC AAG TGT GAC CGG 705Cys Leu Lys Phe Ala Met Leu Cys Thr Leu Asn Asp Lys Cys Asp Arg480 485 490CTG CGC AAG GCC TAC GGG GAG GCG TGC TCC GGG CCC CAC TGC CAG CGC 753Leu Arg Lys Ala Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Pro His Cys Gln Arg495 500 505CAC GTC TGC CTC AGG CAG CTG CTC ACT TTC TTC GAG AAG GCC GCC GAG 801His Val Cys Leu Arg Gln Leu Leu Thr Phe Phe Glu Lys Ala Ala Glu510 515 520CCC CAC GCG CAG GGC CTG CTA CTG TGC CCA TGT GCC CCC AAC GAC CGG 849Pro His Ala Gln Gly Leu Leu Leu Cys Pro Cys Ala Pro Asn Asp Arg525 530 535 540GGC TGC GGG GAG CGC CGG CGC AAC ACC ATC GCC CCC AAC TGC GCG CTG 897Gly Cys Gly Glu Arg Arg Arg Asn Thr Ile Ala Pro Asn Cys Ala Leu545 550 555CCG CCT GTG GCC CCC AAC TGC CTG GAG CTG CGG CGC CTC TGC TTC TCC 945Pro Pro Val Ala Pro Asn Cys Leu Glu Leu Arg Arg Leu Cys Phe Ser560 565 570GAC CCG CTT TGC AGA TCA CGC CTG GTG GAT TTC CAG ACC CAC TGC CAT993Asp Pro Leu Cys Arg Ser Arg Leu Val Asp Phe Gln Thr His Cys His575 580 585CCC ATG GAC ATC CTA GGA ACT TGT GCA ACA GAG CAG TCC AGA TGT CTA 1041Pro Met Asp Ile Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cys Leu590 595 600CGA GCA TAC CTG GGG CTG ATT GGG ACT GCC ATG ACC CCC AAC TTT GTC 1089Arg Ala Tyr Leu Gly Leu Ile Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe Val605 610 615 620AGC AAT GTC AAC ACC AGT GTT GCC TTA AGC TGC ACC TGC CGA GGC AGT 1137Ser Asn Val Asn Thr Ser Val Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg Gly Ser625 630 635GGC AAC CTG CAG GAG GAG TGT GAA ATG CTG GAA GGG TTC TTC TCC CAC 1185Gly Asn Leu Gln Glu Glu Cys Glu Met Leu Glu Gly Phe Phe Ser His640 645 650AAC CCC TGC CTC ACG GAG GCC ATT GCA GCT AAG ATG CGT TTT CAC AGC 1233Asn Pro Cys Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ala Lys Met Arg Phe His Ser655 660 665CAA CTC TTC TCC CAG GAC TGG CCA CAC CCT ACC TTT GCT GTG ATG GCA 1281Gln Leu Phe Ser Gln Asp Trp Pro His Pro Thr Phe Ala Val Met Ala670 675 680CAC CAG AAT GAA AAC CCT GCT GTG AGG CCA CAG CCC TGG GTG CCC TCT 1329His Gln Asn Glu Asn Pro Ala Val Arg Pro Gln Pro Trp Val Pro Ser685 690 695 700CTT TTC TCC TGC ACG CTT CCC TTG ATT CTG CTC CTG AGC CTA TGG 1374Leu Phe Ser Cys Thr Leu Pro Leu Ile Leu Leu Leu Ser Leu Trp705 710 715TAGCTGGACT TCCCCAGGGC CCTCTTCCCC TCCACCACAC CCAGGTGGAC TTGCAGCCCA 1434CAAGGGGTGA GGAAAGGACA GCAGCAGGAA GGAGGTGCAG TGCGCAGATG AGGGCACAGG 1494AGAAGCTAAG GGTTATGACC TCCAGATCCT TACTGGTCCA GTCCTCATTC CCTCCACCCC 1554ATCTCCACTT CTGATTCATG CTGCCCCTCC TTGGTGGCCA CAATTTAGCC ATGTCATCTG 1614GTGCCTGTGG GCCTTGCTTT ATTCCTATTA TTGTCCTAAA GTCTCTCTGG GCTCTTGGAT 1674CATGATTAAA CCTTTGACTT AAAA1699(2)關(guān)于SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度400個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型
(ⅱ)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:Met Val Arg Pro Leu Asn Pro Arg Pro Leu Pro Pro Val Val Leu Met1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Ser Pro Leu Pro Leu Ala Ala Gly Asp20 25 30Pro Leu Pro Thr Glu Ser Arg Leu Met Asn Ser Cys Leu Gln Ala Arg35 40 45Arg Lys Cys Gln Ala Asp Pro Thr Cys Ser Ala Ala Tyr His His Leu50 55 60Asp Ser Cys Thr Ser Ser Ile Ser Thr Pro Leu Pro Ser Glu Glu Pro65 70 75 80Ser Val Pro Ala Asp Cys Leu Glu Ala Ala Gln Gln Leu Arg Asn Ser85 90 95Ser Leu Ile Gly Cys Met Cys His Arg Arg Met Lys Asn Gln Val Ala100 105 110Cys Leu Asp Ile Tyr Trp Thr Val His Arg Ala Arg Ser Leu Gly Asn115 120 125Tyr Glu Leu Asp Val Ser Pro Tyr Glu Asp Thr Val Thr Ser Lys Pro130 135 140Trp Lys Met Asn Leu Ser Lys Leu Asn Met Leu Lys Pro Asp Ser Asp145 150 155 160Leu Cys Leu Lys Phe Ala Met Leu Cys Thr Leu Asn Asp Lys Cys Asp165 170 175Arg Leu Arg Lys Ala Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Pro His Cys Gln180 185 190Arg His Val Cys Leu Arg Gln Leu Leu Thr Phe Phe Glu Lys Ala Ala195 200 205Glu Pro His Ala Gln Gly Leu Leu Leu Cys Pro Cys Ala Pro Asn Asp210 215 220Arg Gly Cys Gly Glu Arg Arg Arg Asn Thr Ile Ala Pro Asn Cys Ala225 230 235 240Leu Pro Pro Val Ala Pro Asn Cys Leu Glu Leu Arg Arg Leu Cys Phe245 250 255Ser Asp Pro Leu Cys Arg Ser Arg Leu Val Asp Phe Gln Thr His Cys260 265 270His Pro Met Asp Ile Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gln Ser Arg Cys275 280 285Leu Arg Ala Tyr Leu Gly Leu Ile Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe290 295 300Val Ser Asn Val Asn Thr Ser Val Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg Gly305 310 315 320Ser Gly Asn Leu Gln Glu Glu Cys Glu Met Leu Glu Gly Phe Phe Ser325 330 335His Asn Pro Cys Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ala Lys Met Arg Phe His340 345 350ser Gln Leu Phe Ser Gln Asp Trp Pro His Pro Thr Phe Ala Val Met355 360 365Ala His Gln Asn Glu Asn Pro Ala Val Arg Pro Gln Pro Trp Val Pro370 375 380Ser Leu Phe Ser Cys Thr Leu Pro Leu Ile Leu Leu Leu Ser Leu Trp385 390 395 400
權(quán)利要求
1．分離純化的DNA分子，具有如大鼠retL1 cDNA，人部分retL1cDNA，人retL1 cDNA，人retL2 cDNA，鼠retL3 cDNA或人retL3 cDNA所示的核苷酸序列。
2．編碼大鼠RetL1，人部分RetL1，人全長(zhǎng)RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3的氨基酸序列的DNA分子。
3．分離純化的DNA分子，用于在原核或真核宿主細(xì)胞中安全表達(dá)多肽產(chǎn)物，該多肽產(chǎn)物至少具有大鼠RetL1，人部分RetL1，人全長(zhǎng)RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3的部分一級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象和生物活性，上述DNA選自下列DNA分子a)大鼠retL1 cDNA，人部分retL1 cDNA，人retL1 cDNA，人retL2cDNA，鼠retL3 cDNA，或人retL3 cDNA的DNA分子，或其互補(bǔ)鏈；b)在嚴(yán)格條件下與a)中所述的DNA分子或其片段雜交的DNA分子。c)因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，能與a)和b)中所述DNA分子雜交的DNA分子。
4．分離純化的DNA分子，至少具有與大鼠retL1 cDNA，人部分retL1 DNA，人retL1 cDNA，人retL2 cDNA，鼠retL3 cDNA或人retLcDNA80％的同源。
5．權(quán)利要求4的DNA，進(jìn)一步特征在于編碼具有大鼠RetL1，人部分RetL1，人全長(zhǎng)RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3的生物活性的蛋白。
6．根據(jù)權(quán)利要求1,2,3,4或5所述的重組DNA分子，適當(dāng)?shù)嘏c表達(dá)調(diào)控序列相連。
7．包含編碼大鼠Ret1，人部分RetL1，人全長(zhǎng)RetL1，人RetL2，鼠RetL3，人部分RetL3或人全長(zhǎng)RetL3的DNA分子的載體。
8．包含根據(jù)權(quán)利要求1,2,3,4或5的任意一項(xiàng)所述的DNA分子的具生物功能的質(zhì)?；虿《綝NA載體。
9．由包含編碼大鼠RetL1，人部分RetL1，人全長(zhǎng)RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3的DNA分子的載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞。
10．合成具有大鼠RetL1，人部分RetL1，人全長(zhǎng)RetL1，人RetL2，鼠RetL3，人部分RetL3或人全長(zhǎng)RetL1的部分或全部一級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象和生物活性的多肽產(chǎn)物的方法，該方法包括以允許這樣的多肽產(chǎn)物表達(dá)的方式，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，培養(yǎng)用根據(jù)權(quán)利要求1,2,3,4或5所述的DNA分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞，并回收大鼠RetL1，人部分RetL1，人全長(zhǎng)RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3。
11．根據(jù)權(quán)利要求10在真核或原核宿主細(xì)胞中表達(dá)DNA的多肽產(chǎn)物。
12．分離純化的大鼠RetL1，人部分RetL1，人全長(zhǎng)RetL1，人RetL2，鼠RetL3或人RetL3，基本上不含其它人類(lèi)蛋白質(zhì)。
13．具有包括大鼠RetL1，人部分RetL1，人全長(zhǎng)RetL1，人RetL2，鼠RetL3，人部分RetL3或人全長(zhǎng)RetL3的氨基酸序列的蛋白。
14．一種蛋白，該蛋白是大鼠RetL1，人部分RetL1，人全長(zhǎng)RetL1，人RetL2，鼠RetL3，人部分RetL3或人全長(zhǎng)RetL3的變體。
15．根據(jù)權(quán)利要求11,12,13或14所述的蛋白的可溶性變體。
16．含大鼠RetL1，人部分RetL1，人全長(zhǎng)RetL1，人RetL2，鼠RetL3，人部分RetL3或人全長(zhǎng)RetL3的IgG融合蛋白。
17．權(quán)利要求15的蛋白，該蛋白與毒素，可成像的化合物或放射性核素結(jié)合。
18．針對(duì)權(quán)利要求11,12,13，或14的蛋白的特異的單克隆抗體。
19．權(quán)利要求18的抗體，該蛋白與毒素，可成像的化合物或放射性核素結(jié)合。
20．產(chǎn)生針對(duì)大鼠RetL1，人部分RetL1，人全長(zhǎng)RetL1，人RetL2，鼠RetL3，人部分RetL3或人全長(zhǎng)RetL3的特異抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
21．權(quán)利要求20的雜交瘤產(chǎn)生的抗體。
22．在受治療者中促進(jìn)新組織生長(zhǎng)或促進(jìn)損傷組織存活的方法，包括給受治療者施用治療有效劑量的大鼠RetL1，人部分RetL1，人全長(zhǎng)RetL1，人RetL2，鼠RetL3，人部分RetL3或人全長(zhǎng)RetL3的多肽。
23．權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括給受治療者施用治療有效劑量的第二種多肽。
24．權(quán)利要求23的方法，其中第二中多肽是GDNF,neurturin或GDNF相關(guān)多肽。
25．權(quán)利要求22的方法，其中的組織是腎或神經(jīng)組織。
26．權(quán)利要求22的方法，其中的多肽是膜結(jié)合的。
27．權(quán)利要求22的方法，其中的多肽是可溶的。
28．權(quán)利要求27的方法，其中的多肽是融合蛋白。
29．權(quán)利要求22,23,24,25,26或27的方法，其中受治療者是人類(lèi)。
30．抑制表達(dá)RetL的細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)的方法，包括將細(xì)胞與抗RetL的抗體接觸。
31．在表達(dá)Ret的細(xì)胞中抑制信號(hào)傳導(dǎo)的方法，包括使細(xì)胞與可溶的Ret蛋白接觸。
32．權(quán)利要求31的方法，其中可溶的Ret蛋白是融合蛋白。
33．將毒素，可成像的化合物或放射性核素導(dǎo)向表達(dá)Ret的細(xì)胞的方法，包括使細(xì)胞與權(quán)利要求17的RetL融合蛋白接觸。
34．抑制表達(dá)Ret的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括使細(xì)胞與RetL和毒素或放射性核素的融合蛋白接觸。
35．權(quán)利要求30-34的任意一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞在受治療者體內(nèi)，蛋白施用給受治療者。
36．將毒素，可成像化合物或放射性核素導(dǎo)向表達(dá)RetL的細(xì)胞的方法，包括使細(xì)胞與偶聯(lián)了毒素，可成像化合物或放射性核素的抗RetL抗體接觸。
37．抑制表達(dá)RetL的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括使細(xì)胞與偶聯(lián)了毒素或放射性核素的抗RetL抗體接觸。
38．權(quán)利要求36或37的方法，其中細(xì)胞在受治療者體內(nèi)，偶聯(lián)的抗體施用給受治療者。
39．將毒素，可成像化合物或放射性核素導(dǎo)向表達(dá)RetL的細(xì)胞的方法，包括使細(xì)胞與Ret融合蛋白接觸，其中Ret融合蛋白包括Ret和毒素，可成像化合物或放射性核素。
40．權(quán)利要求39的方法，進(jìn)一步包括使細(xì)胞與GDNF,neuturin，或GDNF相關(guān)多肽接觸。
41．抑制表達(dá)RetL的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括使細(xì)胞與Ret和毒素或放射性核素的融合蛋白接觸。
42．權(quán)利要求39,40或41的方法，其中細(xì)胞在受治療者體內(nèi)，蛋白施用給受治療者。
43．治療患RetL代謝紊亂的對(duì)象的方法，包括給受治療者施用權(quán)利要求7或8的載體。
44．促進(jìn)受治療者體內(nèi)新組織生長(zhǎng)的方法，包括給受治療者施用權(quán)利要求7或8的載體。
45．權(quán)利要求44的方法，其中的組織是腎組織或神經(jīng)組織。
46．促進(jìn)受治療者體內(nèi)損傷組織存活的方法，包括給受治療者施用治療有效劑量的權(quán)利要求7或8的載體。
47．權(quán)利要求46的方法，其中的組織是腎組織或神經(jīng)組織。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼Ret配體(RetL9)的核苷酸序列以及通過(guò)用RetLDNA或蛋白處理細(xì)胞和哺乳動(dòng)物受治療者以刺激神經(jīng)和腎的生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明提供了分離純化的編碼RetL和DNA分子,含有任何RetL的核苷酸序列,特別包括鼠retL1 cDNA(SEQIDNO∶1),人部分RetL1cDNA(SEQIDNO∶8),人全長(zhǎng)retL1 cDNA(SEQIDNO∶10),人retL2cDNA(SEQIDNO∶12),鼠retL3 cDNA(SEQIDNO∶12)或人retL3cDNA(SEQIDNO∶16),人部分retL3 cDNA(SEQIDNO∶18)或人retL3 cDNA(SEQIDNO∶20)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了RetL蛋白,具有包括大鼠RetL1(SEQIDNO∶2),人部分RetL1(SEQIDNO∶9),人全長(zhǎng)RetL(SEQIDNO∶11),人RetL2(SEQIDNO∶13),鼠RetL3(SEQIDNO∶17),人部分RetL3(SEQIDNO∶19)或人RetL3(SEQIDNO∶21)的氨基酸序列。
文檔編號(hào)C07K14/72GK1232469SQ97195466
公開(kāi)日1999年10月20日 申請(qǐng)日期1997年5月7日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月8日
發(fā)明者M·薩尼科拉－納德?tīng)? C·赫辛, R·L·卡特 申請(qǐng)人:拜奧根有限公司