專利名稱：高分子量的脫硫水蛭素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及凝血酶抑制劑領(lǐng)域，并描述了借助遺傳工程手段生產(chǎn)改性的水蛭素，具體指脫硫水蛭素(desulphatohirudin)突變蛋白的方法。本發(fā)明的另一目的是提供通過將所述水蛭素的2到4個(gè)單體結(jié)合起來，從而制備具生物活性的高分子量水蛭素的方法。
水蛭素是水蛭(如醫(yī)學(xué)上用的水蛭醫(yī)用水蛭)中天然產(chǎn)生的抗凝血?jiǎng)?。水蛭素等于是在N-末端富集疏水氨基酸并在C-末端富集極性氨基酸且含有三個(gè)二硫鍵并通常有抗凝活性的正起作用的多肽。大多數(shù)天然水蛭素的一個(gè)特征是在其分子的C-末端(Tyr63)有一個(gè)硫酸酪氨酸酯殘基。除去已知的水蛭素變異體HV1、HV2和HV3外，已報(bào)道實(shí)際上還存在其它水蛭素(參見，如M.Scharf et al.，F(xiàn)EBS Lett.255，105-110(1989))，從而支持了水蛭素作為一個(gè)同效抑制劑族的概念。
水蛭素，如水蛭素變異體1(HV1)，是凝血酶即絲氨酸蛋白酶的最有效并最了解的抑制劑，所述絲氨酸蛋白酶催化血液凝集作用的最后步驟(將酶原纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成可凝固的纖維蛋白)。水蛭素并不抑制血液凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的其它酶。與在傳統(tǒng)抗凝治療優(yōu)選的抗凝劑即肝素相反，水蛭素直接對(duì)凝血酶發(fā)揮其抑制作用，且與前者不同，并不是通過抗凝血酶Ⅲ起作用。純化水蛭素唯一的藥物學(xué)可檢測(cè)效果是抑制血液凝固并預(yù)防血栓形成。給狗靜脈內(nèi)施用水蛭素后，甚至以高劑量下也未觀察到副作用，如對(duì)心率、呼吸、血壓、血小板數(shù)量、纖維蛋白原和血紅蛋白的影響。在一系列的動(dòng)物模型中，已證明水蛭素在實(shí)驗(yàn)性血栓形成(由停滯或由注射凝血酶引起的)，內(nèi)毒素性休克以及DIC(彌散性血管內(nèi)凝血)中的有效性。從已完成的直接對(duì)比試驗(yàn)看，已證明水蛭素優(yōu)于肝素。
近年來，已經(jīng)在微生物宿主如大腸桿菌，特別是啤酒酵母中，克隆并表達(dá)了編碼水蛭素變異體的cDNA和合成基因。盡管這種表達(dá)產(chǎn)物在Tyr63沒有硫酸鹽單酯基團(tuán)-并因此而稱之為“脫硫水蛭素”一但結(jié)果它們表現(xiàn)出與天然硫酸化水蛭素基本相同的生物活性。
重組脫硫水蛭素的一種治療用特性是其在循環(huán)中的半衰期為約50分鐘，并因此會(huì)迅速?gòu)娜梭w內(nèi)排出。迅速排泄的原因是腎臟腎小球?qū)τ诜肿恿康陀?0000的物質(zhì)的過濾作用。由于這種迅速的排泄，脫硫水蛭素日劑量一般分成兩次或更多次施用。為得到更長(zhǎng)效凝血酶抑制劑的一種辦法是合成高分子量的水蛭素。在WO 91/08229中描述了水蛭素與聚二醇的軛合作用。由于聚二醇在分子大小和重量方面一般很不均一，因此，其與水蛭素的結(jié)合會(huì)產(chǎn)生不均一的混合物并且不容易施用規(guī)定劑量的水蛭素。在另一種方法中，將水蛭素與其它蛋白質(zhì)如白蛋白交聯(lián)(WO 92/05748)。這些軛合物表現(xiàn)出活性降低并且致免疫特性提高，因此不適于長(zhǎng)期施用。
在WO 91/09125中，描述了相對(duì)失活的融合蛋白，它們由凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)的酶激活，從而具有纖維蛋白溶解或凝塊形成抑制活性。
令人吃驚的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由脫硫水蛭素突變蛋白或脫硫水蛭素衍生物的二到四個(gè)殘基組成的軛合物具有顯著提高的血漿半衰期，即使其分子量低于約70，000的臨界值(見上文)，所述軛合物還令人驚異地末表現(xiàn)出有可檢測(cè)的提高的致免疫特性，沒有被與血液凝固有關(guān)的酶裂解并且活性末發(fā)生改變。由于血漿半衰期的提高，就有可能一次施用每日劑量的脫硫水蛭素。
本發(fā)明涉及一種實(shí)質(zhì)上由脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的兩至四個(gè)殘基組成的軛合物，其中所述軛合物不是融合蛋白，而且具有水蛭素活性的脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的殘基不是經(jīng)戊二醛或碳化二亞胺相連的。
術(shù)語“脫硫水蛭素”包括文獻(xiàn)中描述或由轉(zhuǎn)化的微生物菌株得到的所有脫硫水蛭素化合物，所述微生物菌株含有編碼脫硫水蛭素或其衍生物的DNA。上述脫硫水蛭素是例如脫硫水蛭素衍生物HV1、HV2和HV3(PA)，以及M.Scharf等人(FEBS Lett.(1989)，255，105-110)和EP-A-347376描述的其他水蛭素以及hirullin蛋白。應(yīng)理解具有水蛭素活性(即具有凝血酶抑制作用和/或凝血酶結(jié)合作用)的水蛭素衍生物或較短的片段也包括在術(shù)語“脫硫水蛭素”的范圍內(nèi)。上述片段和衍生物是例如C-末端截短的脫硫水蛭素，即在C-末端缺少最多達(dá)7個(gè)氨基酸的脫硫水蛭素。
可以通過連接其它反應(yīng)性基團(tuán)來修飾脫硫水蛭素或其活性片段或衍生物，其中，反應(yīng)性基團(tuán)對(duì)凝血酶活性有生物學(xué)影響。例如，可以將位于C-末端的脫硫水蛭素的凝血酶結(jié)合區(qū)與化學(xué)合成的凝血酶抑制劑結(jié)合。上述化學(xué)修飾的脫硫水蛭素衍生物的實(shí)例是水蛭素類似物(hirulogs)(WO 90/04642)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的軛合物實(shí)質(zhì)上由脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的兩個(gè)殘基組成。本發(fā)明所述軛合物的組分，即脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的殘基，可以是相同或不同的。
脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物直接或經(jīng)連接基團(tuán)相連。為了達(dá)到該目的，通常脫硫水蛭素的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選的是一個(gè))天然氨基酸被一個(gè)或多個(gè)能交聯(lián)的基團(tuán)(如帶有反應(yīng)性側(cè)鏈的氨基酸)替代。
本發(fā)明的目的之一是提供能形成軛合物的脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物，軛合物實(shí)質(zhì)上由所述脫硫水蛭素的兩到四個(gè)殘基組成。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，由選自Asp、Glu、Lys和Cys的氨基酸替代脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的一個(gè)或多個(gè)天然氨基酸。替代一個(gè)氨基酸是優(yōu)選的，更優(yōu)選的是由Cys替代一個(gè)氨基酸，最佳為由Cys替代脫硫水蛭素HV1中的Asp33可以通過在一個(gè)殘基的Asp或Glu與另一殘基中的Lys之間形成肽鍵，或優(yōu)選的在兩個(gè)Gys殘基之間形成二硫鍵來生產(chǎn)由兩個(gè)脫硫水蛭素殘基組成的軛合物。
在另一方法中，也可以經(jīng)連接基團(tuán)連接本發(fā)明軛合物的組分(脫硫水蛭素突變蛋白或脫硫水蛭素衍生物的兩到四個(gè)殘基)。在這方面，通過反應(yīng)性側(cè)鏈例如上述定義的導(dǎo)入氨基酸的反應(yīng)性側(cè)鏈，將脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物與有兩個(gè)或更多反應(yīng)性基團(tuán)(兩個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)是優(yōu)選的)的連接分子相連，所述反應(yīng)性基團(tuán)可與脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的反應(yīng)性側(cè)鏈反應(yīng)并形成共價(jià)鍵。所述連接分子是帶兩個(gè)或更多反應(yīng)性基團(tuán)例如-SH、-N3、-COOH、-COBr、-COCl、-NH2、-CHO、-CO-O-CO-、-CO-NH-CO-的分子。實(shí)例是N-5-疊氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亞胺、對(duì)-疊氮基吩嗪基溴、對(duì)-疊氮基苯基乙二醛、N-4-(疊氮基苯基硫代)苯鄰二甲酰亞胺、二(磺基琥珀酰亞氨基)辛二酸酯(suberate)、二(丁烯二酰亞氨基)已烷、二[2-(琥珀酰亞氨基氧羰基氧)乙基]砜、1，5-二氟-2，4-二硝基苯、4，4′-二異硫氰基-2，2′-二磺酸芪、己二亞胺酸二甲酯、庚二亞胺酸二甲酯、辛二亞胺酸二甲酯、二硫代二(琥珀酰亞氨基丙酸酯)、二琥珀酰亞氨基辛二酸酯、二琥珀酰亞氨基酒石酸酯、3′，3′-二硫代二丙亞胺酸二甲酯、4，4′-二硫代二疊氮基苯、3，3′-二硫代二(琥珀酰亞氨基丙酸酯)、乙基-4-疊氮基-1，4-二硫代丁亞胺酸酯、1-疊氮基-4-氟-3-硝基苯、N-羥琥珀酰亞氨基-4-疊氮基苯甲酸酯、甲基-4-疊氮基苯甲亞胺酸酯、間-順丁烯二酰亞氨基苯甲酰基-N-羥磺基-琥珀酰亞胺酯、N-羥琥珀酰亞氨基-4-疊氮基水楊酸、對(duì)-硝基苯基-2-重氮基-3，3，3-三氟丙酸酯、N-琥珀酰亞胺基(4-疊氮基苯基)-1，3′-二硫代丙酸酯、磺基琥珀酰亞胺基2-(間-疊氮基-鄰硝基苯甲酰氨基)-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯、N-琥珀酰亞氨基-6(4′-疊氮基-2′-硝基苯基-氨基)己酸酯、磺基琥珀酰亞氨基2-(對(duì)疊氮基水楊酰氨基)乙基-1，3′-二硫代丙酸酯、N-琥珀酰亞氨基(4-碘乙基)氨基苯甲酸酯、琥珀酰亞氨基4-(N-順丁烯二酰亞氨基乙基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯、琥珀酰亞氨基4-(對(duì)順丁烯二酰亞氨基苯基)-丁酸酯、N-琥珀酰亞氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、二[2-(磺基(sulfo)琥珀酰亞氨基氧-羰氧基)乙基]砜、二磺基琥珀酰亞氨基酒石酸酯、乙二醇二(磺基琥珀酰亞氨基琥珀酸酯)、間-順丁烯二酰亞基苯甲?；?N-羥磺基琥珀酸酯)、磺基琥珀酰亞氨基(4-疊氮基苯基二硫代)-丙酸酯、磺基琥珀酰亞氨基6-(4′-疊氮基-2′-硝基苯基氨基)已酸酯、磺基琥珀酰亞氨基(4-碘乙基)氨基苯甲酸酯、磺基琥珀酰亞氨基4-(N-順丁烯二酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯、磺基琥珀酰亞氨基4-(對(duì)-順丁烯二酰亞氨基苯基)丁酸酯和2-iminothiolane。
優(yōu)選的連接分子特異性地與氨基酸的-SH基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，如二硫代化合物象二硫赤蘚糖醇、二硫蘇糖醇、二巰基苯、1，4-二硫代丁二醇、1，3-二硫代丙二醇、帶2個(gè)Cys的短氨基酸鏈或其他-SH交聯(lián)劑象二(順丁烯二酰亞氨基)己烷、間-順丁烯二酰亞氨基苯甲酰基-N-羥磺基琥珀酰亞胺酯、N-琥珀酰亞氨基(4-磺乙基)氨基苯甲酸酯、琥珀酰亞氨基4-(N-順丁烯二酰亞氨基甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯、琥珀酰亞氨基4-(對(duì)-順丁烯二酰亞氨基苯基)-丁酸酯、N-琥珀酰亞氨基3-2(2-吡啶二硫代)丙酸酯、間-順丁烯二酰亞氨基苯甲酰基-N-羥磺基琥珀酸酯。
氨基酸交換并因此與另一脫硫水蛭素或連接子粘接是在位于對(duì)于脫硫水蛭素活性非必需的區(qū)域內(nèi)發(fā)生的。脫硫水蛭素含兩個(gè)與α-凝血酶獨(dú)立位點(diǎn)結(jié)合的功能區(qū);一個(gè)與凝血酶催化位點(diǎn)結(jié)合的緊接的N-末端核心區(qū)(Chang et al.，J.Biol.Chem.(1990)，265，22159-22166)和一個(gè)與該酶的外位點(diǎn)(exosite)(纖維蛋白原識(shí)別位點(diǎn))互補(bǔ)的無序C-末端尾(Maraganore等人，J.Biol.Chem.(1989)，264，8692-8698)。通過C-末端區(qū)連接兩個(gè)單體是不理想的，因?yàn)樵搮^(qū)內(nèi)的幾乎每個(gè)氨基酸殘基對(duì)于脫硫水蛭素的完全有效性都是必需的(Chang，J.Biol.Chem.(1990)，265，22159-22166)。然而，在N-末端區(qū)內(nèi)，有一個(gè)位于表面并遠(yuǎn)離凝血酶結(jié)合位點(diǎn)的可彎曲環(huán)(殘基30到40，特別是殘基31-36)(Grütter et al.，EMBO(1990)，9，2361-2365)。改變脫硫水蛭素單體并連接脫硫水蛭素單體以形成本發(fā)明軛合物，優(yōu)選的是在該區(qū)的氨基酸殘基7到50之間、更優(yōu)選的是在殘基30到40，最佳在殘基31-36之間完成。最優(yōu)選的是脫硫水蛭素HV1，其中Asp33由Cys替代。因此，優(yōu)選的是在該區(qū)的氨基酸殘基7到50，更優(yōu)選的是殘基30到40之間，最佳是在殘基31到36之間連接脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的單體，或?qū)⒚摿蛩嗡赝蛔兊鞍谆蜓苌飭误w和連接基團(tuán)連接。
由于氨基酸交換，新修飾過的脫硫水蛭素鏈的折疊可能不同于未修飾脫硫水蛭素的折疊。若不能自發(fā)形成天然的脫硫水蛭素結(jié)構(gòu)，則可將分離的脫硫水蛭素變性并在適宜的條件下折疊成表現(xiàn)出凝血酶抑制活性的構(gòu)型。
已有大量申請(qǐng)報(bào)道了有關(guān)將細(xì)菌宿主中產(chǎn)生的單一蛋白質(zhì)，或者是以變性或非天然形式的單一蛋白質(zhì)進(jìn)行重折疊的方案。WO 88/8003以及Halenbeck，R.et al.，Biotechnologie(1989)，7，710-715描述了在大腸桿菌中表達(dá)之后，具有生物活性的人集落刺激因子-1(CSF-1)二聚體的形成。描述的方法包括首先在含脲或胍鹽酸鹽的促溶環(huán)境中，于還原條件下，溶解從內(nèi)含體中分離的CSF-1單體;通過逐步稀釋促溶劑完成重折疊;最好在氧化還原系統(tǒng)中氧化重折疊的分子。在WO88/8849中，公開了一種回收重組白細(xì)胞介素-2(IL-2)的方法，其特征在于用6M鹽酸胍在還原條件下使從refractile體中分離的IL-2變性，在Cu2+存在的情況下通過控制氧化作用氧化溶解的IL-2，然后通過降低溶液中變性劑的濃度來使氧化的IL-2重折疊。使用用于溶解的SDS和Cu2+作為完全還原蛋白質(zhì)的氧化促進(jìn)劑，使白細(xì)胞介素-2和干擾素-β重折疊(US-A-4572798)。在US-A-4620948中描述的分離重組refractile蛋白質(zhì)的方法涉及溶解蛋白質(zhì)的強(qiáng)變性劑;有利于正確折疊的還原條件以及在空氣或其它氧化劑存在的條件下為改變二硫鍵的變性劑替代。WO86/5809公開了通過使變性蛋白與固體基質(zhì)可逆性結(jié)合，然后稀釋變性劑使其逐步復(fù)性，從而使包括細(xì)胞色素C、卵清蛋白和胰蛋白酶抑制劑在內(nèi)的未折疊蛋白復(fù)性的方法。上述資料僅僅是大量有關(guān)折疊不同來源非天然蛋白質(zhì)的文獻(xiàn)中的代表。另一方面，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員知道不可能預(yù)期折疊實(shí)驗(yàn)成功與否。一般不報(bào)道不成功的實(shí)驗(yàn)。不能肯定任何報(bào)道折疊條件的人會(huì)用所給的變性蛋白質(zhì)如脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物做得很好?？紤]到事實(shí)上末修飾的脫硫水蛭素含6個(gè)Cys殘基，而脫硫水蛭素HV1(其中Asp33由Cys替代)每鏈含7個(gè)Cys殘基和大量的分子內(nèi)二硫鍵，它們對(duì)于活性是必需的，從其單體、變性或其它非天然形式生產(chǎn)具生物學(xué)活性的多聚和特別是二聚脫硫水蛭素是一個(gè)很困難的挑戰(zhàn)。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供將脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物展開并重新折疊成具生物學(xué)活性的多聚且特別是二聚體形式的方法，包括下列步驟·用促溶劑使上述脫硫水蛭素變性，·在重折疊條件下將脫硫水蛭素復(fù)性，且如果需要，·經(jīng)連接子，或直接連接脫硫水蛭素。
適宜濃度的促溶劑能夠有效地使蛋白質(zhì)變性，即通過其表面的改變，或者通過改變水合狀態(tài)，溶劑環(huán)境或水溶液中溶劑-表面的相互作用，從而改變相應(yīng)蛋白質(zhì)的立體構(gòu)型，這些是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。上述促溶劑或變性劑的實(shí)例包括濃度為約4-9M的脲、鹽酸胍、硫氰酸鈉，和以0.01到2%的濃度使用的洗滌劑，如SDS。另外，水溶液酸化至pH4以下或pH10以上的堿性條件以及升高溫度均會(huì)導(dǎo)致單體的變性。
術(shù)語“重折疊條件”指緩沖液條件，在其中變性單體可呈現(xiàn)與生物活性相關(guān)的構(gòu)型?？梢栽趐H約6-10的范圍內(nèi)使用常規(guī)緩沖液系統(tǒng)，如Tris、磷酸鹽、碳酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液。在重折疊條件下可促進(jìn)二硫鍵形成。上述條件包括，如存在增溶劑和使得巰基二硫化物對(duì)連續(xù)氧化和還原的氧化還原系統(tǒng)。緩沖液系統(tǒng)還可含適當(dāng)?shù)柠}。
適宜的增溶劑是洗滌劑，優(yōu)選的是溫和的洗滌劑，有機(jī)的，水可混溶的溶劑或磷脂或其混合物。
適宜的促使二硫化物形成的氧化還原系統(tǒng)是如以約1到100mM，最好是約1到10mM濃度的低分子量的巰基/二硫化物試劑組合如氧化和還原形式的谷胱甘肽、氧化和還原形式的二硫蘇糖醇、氧化和還原形式的β-巰基乙醇或β-巰基甲醇、Cys和其還原形式，以及胱胺和其還原形式。另外，可用約10到1000μg/ml濃度，最好50-200μg/ml濃度的硫氧還蛋白或二硫化物異構(gòu)酶代替低分子量的巰基/二硫化物系統(tǒng)。
可選擇的，為了進(jìn)一步促進(jìn)分子間和分子內(nèi)二硫化物形成，可將有效量的含Cu2+的氧化促進(jìn)劑(如CuCl2，Cu(NO3)2或鄰-菲咯啉/Cu2+復(fù)合物)或含F(xiàn)e3+離子的氧化促進(jìn)劑[如FeCl3或Fe2(SO4)3]加到重折疊緩沖液中。有效量指在合適的時(shí)間內(nèi)對(duì)于巰基的氧化所必需的最小量，它大約等于脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物中游離巰基的濃度，在所需二硫鍵的形成中將會(huì)涉及所述游離巰基基團(tuán)。優(yōu)選的量為0.001到100μM。
此外，存在或不存在氧化促進(jìn)劑的情況下，可將O2或空氣通入重折疊緩沖液。氧化反應(yīng)也可以利用I2或苯醌來完成。
對(duì)于脫硫水蛭素變異體1的情況，其中Cys替代了Asp33([Cys33]HV1)，通常在通過本身已知的方法分離脫硫水蛭素后，完成變性，折疊和二聚作用步驟以得到勻質(zhì)產(chǎn)物。通過例如在還原條件下加入鹽酸胍使開始分離的脫硫水蛭素變性，通過在堿性條件下除去鹽酸胍來重折疊，隨后[Cys33]HV1單體被氧化，同時(shí)二聚化形成[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚體。
Cys33單體和二聚體都是高活性的抗凝劑，并且其凝血酶抑制效力幾乎沒有區(qū)別(±3%)。這表明一個(gè)脫硫水蛭素二聚體與兩分子α-凝血酶結(jié)合。
對(duì)于合成連接子的情況，可通過本身已知的方法將重折疊的脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物單體與連接子粘接?？梢酝ㄟ^例如在“Protective Groups in Organic Chemistry”，Plenum Press，London，New York 1973，在“Methoden der organischen chemie”，Houben-Weyl，4th.Edition，Vol.15/1，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart 1974和在Th.W.Greene，“Protective Groups in Organic Synthesis”，John Wiley & Sons，New York 1981中描述的常規(guī)的保護(hù)基團(tuán)將不應(yīng)當(dāng)與連接子結(jié)合的反應(yīng)性氨基酸保護(hù)起來。保護(hù)基團(tuán)的特征是通過溶劑分解作用，還原作用或光解作用很容易將它們除去，也就是說不會(huì)發(fā)生不需要的副反應(yīng)。
如果需要導(dǎo)入遺傳工程方法編碼的氨基酸，可通過定點(diǎn)誘變改變脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的氨基酸序列。另外，用本身已知的方法，如將先經(jīng)遺傳工程方法合成的部分脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物固定到一個(gè)固相上，并將缺失的基團(tuán)加到固定的多肽上，而用化學(xué)方法合成攜帶有變化之處的至少部分脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物。
為了方便，不在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行脫硫水蛭素的修飾，即氨基酸的改變。代替的方法是最好經(jīng)定點(diǎn)誘變修飾編碼脫硫水蛭素的基因，以便由宿主表達(dá)所述的修飾基因，產(chǎn)生所需的脫硫水蛭素突變蛋白，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸由能與其他脫硫水蛭素或連接子形成鍵的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個(gè)氨基酸由Cys替代。
生產(chǎn)本發(fā)明脫硫水蛭素的方法包括，在適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)條件下，培養(yǎng)含編碼水蛭素突變蛋白的DNA序列的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述突變蛋白中一個(gè)或多個(gè)氨基酸由能與其它脫硫水蛭素或連接子形成結(jié)合鍵的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代;然后分離所述的脫硫水蛭素突變蛋白。
適宜的宿主細(xì)胞是例如細(xì)菌，如大腸桿菌或真核宿主細(xì)胞，如酵母，如啤酒酵母。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的宿主生物是啤酒酵母。
用本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)含上述DNA序列的宿主細(xì)胞，特別是酵母。
可以用本領(lǐng)域熟知的方法制備包括SEQ ID NO5和7所示序列的DNA。制備這些DNA的方法包括化學(xué)合成DNA，從然水蛭素基因中切除含不需要的氨基酸殘基密碼子的DNA部分，并用DNA片段替代之，在所述片段中已用編碼所需氨基酸殘基的脫氧核糖核苷酸三聯(lián)體密碼子取代了所述密碼子;或經(jīng)定點(diǎn)誘變，完成脫氧核糖核苷酸的取代。
DNA的化學(xué)合成是本領(lǐng)域熟知的并可利用常規(guī)技術(shù)。S.A.Narang(Tetrahedron(1983)，39，3)已描寫了適當(dāng)?shù)募夹g(shù)。特別是EP-A-146 785中描述的方法。
可用限制酶切除部分成熟水蛭素DNA。該方法的先決條件是在有待改變的密碼子附近有適當(dāng)?shù)南拗莆稽c(diǎn)。用核酸內(nèi)切酶裂解除去小的限制片段，該片段含有編碼不需要的氨基酸的密碼子。例如用化學(xué)合成法制備相應(yīng)的雙鏈DNA序列，其中使用編碼所需氨基酸的三聯(lián)體密碼子。以適當(dāng)?shù)姆较颍瑢NA片段與剩余的大片段連接以產(chǎn)生編碼脫硫水蛭素突變蛋白的雙鏈DNA序列。為了方便并便于處理水蛭素基因，后者最好包含在備有適當(dāng)連接子的較大DNA片段中，所述連接子使所述片段插入并克隆在克隆載體中。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)定點(diǎn)誘變制備具有與SEQ ID NO7一致的DNA序列的DNA。該方法是一種體外誘變方法，采用該方法可以改變克隆DNA區(qū)域內(nèi)的特定位點(diǎn)(參見，M.J.Zoller和M.Smith，Methods Enzymol(1983)，100，468;D.Botstein和D.Shortle Science(1985)，229，1193的綜述文章)。
將野生型水蛭素基因突變的方法的特征在于將單鏈野生型水蛭素基因或含有野生型水蛭素基因的單鏈DNA與一種寡脫氧核糖核苷酸引物雜交，所述引物與將被突變的(除導(dǎo)致突變的錯(cuò)配外的)水蛭素區(qū)域互補(bǔ)，用雜交的寡脫氧核糖核苷酸作為引物如經(jīng)PCR引發(fā)互補(bǔ)DNA鏈的合成，將所得的(部分)雙鏈DNA轉(zhuǎn)化到受體微生物菌株中，培養(yǎng)所述的微生物菌株并篩選含有帶修飾水蛭素基因的DNA的轉(zhuǎn)化體。
在優(yōu)選的形式中，使用與擴(kuò)增模板DNA所需序列的上游和下游核苷酸序列互補(bǔ)的兩種寡脫氧核糖核苷酸引物(1)和(4);使用彼此部分互補(bǔ)并均覆蓋突變位點(diǎn)的兩種內(nèi)引物(2)和(3)。PCR引物(1)和(3)與引物(2)和(4)在不同反應(yīng)中搭配使用以擴(kuò)增部分模板DNA和誘導(dǎo)突變。在第二個(gè)反應(yīng)中，將兩種產(chǎn)物混合并用引物(1)和(4)擴(kuò)增。
優(yōu)選的是在質(zhì)粒，如EP-A-143081或EP-A-340170中描述的質(zhì)粒中含有野生型水蛭素基因。為了完成誘變，最好是經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化從該質(zhì)粒中分離出水蛭素基因，得到含水蛭素基因及選擇性地含有與其相連的其他功能部分如啟動(dòng)子，信號(hào)肽DNA等，且具有粘性未端的雙鏈DNA，并經(jīng)PCR擴(kuò)增或與單鏈DNA噬菌體，如噬菌體M13的衍生物，如M13mp8或M13mp9的復(fù)制型(RF)的適宜限制片段相連，用雜交噬菌體載體轉(zhuǎn)變?nèi)靖惺軕B(tài)微生物，如Ca處理過的E.coli菌株細(xì)胞，然后從培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中分離含插入水蛭素基因的單鏈?zhǔn)删wDNA。錯(cuò)配的水蛭素(誘變的)寡脫氧核糖核苷酸引物與該模板雜交。
文獻(xiàn)中描述的一些方法取決于誘變引物沿環(huán)狀模板的酶促延伸，然后連接得到在新合成的鏈中，具有突變的共價(jià)閉合雙鏈環(huán)狀分子。由于這種方法一般效率低，因此，研制了一種改進(jìn)的方法(K.Norriset al.，Nucl.Acids.Res.(1983)，11，5103)，其中使用第二引物。對(duì)于M13噬菌體載體，優(yōu)選的是使用通用的M13定序引物(EP-A-225 286)。
含有編碼脫硫水蛭素突變蛋白的DNA序列的雜交載體本發(fā)明還涉及含有一個(gè)啟動(dòng)子和一種編碼人脫硫水蛭素突變蛋白的DNA序列的雜交載體，所述突變蛋白中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被一個(gè)或多個(gè)能與其他脫硫水蛭素或連接子(linker)成鍵的氨基酸所替代。所述DNA序列是在所述啟動(dòng)子的控制下。
本發(fā)明的雜交載體選自雜交質(zhì)粒和線性DNA載體，并且還根據(jù)用于轉(zhuǎn)化的宿主生物來選擇。
作為本發(fā)明最佳宿主生物的酵母的啟動(dòng)子得自酵母(特別是啤酒酵母)的基因組DNA。優(yōu)選的，將高效表達(dá)酵母基因的啟動(dòng)子用于表達(dá)脫硫水蛭素突變體。因此，可用TRP1基因，ADHI或ADHⅡ基因，酸性磷酸酶(PHO5)基因，CUP1基因，同種細(xì)胞色素C基因的啟動(dòng)子，或編碼糖酵解酶如TDH3，甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶(GAPDH)，GAPDH的短模型(GAPFL)是優(yōu)選的，3-磷酸甘油酸激酶(PGK)，已糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油酸變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，磷酸葡糖異構(gòu)酶，蔗糖酶和葡糖激酶基因的啟動(dòng)子，或編碼Q-或α因子的酵母配對(duì)信息素基因的啟動(dòng)子。本發(fā)明優(yōu)選的載體包含帶轉(zhuǎn)錄控制的啟動(dòng)子，通過改變生長(zhǎng)條件，可以打開或關(guān)閉這類啟動(dòng)子，如PHO5或CUP1基因的啟動(dòng)子。例如，僅通過提高或降低培養(yǎng)基中無機(jī)磷的濃度，就可使PHO5啟動(dòng)子阻遏或去阻遏。因此，可在酵母的指數(shù)生長(zhǎng)期阻遏啟動(dòng)子，只在最大細(xì)胞密度的早穩(wěn)定期打開(去阻遏)，以便由PHO5啟動(dòng)子控制基因的表達(dá)。通過將Cu2+陽離子加到培養(yǎng)基中，如以銅鹽的形式，就可打開CUP1啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的雜交載體中，啟動(dòng)子與突變水蛭素編碼區(qū)可操作地相連接，以便確保脫硫水蛭素突變蛋白的有效表達(dá)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，特別是如果用酵母作為宿主生物，則構(gòu)建體中應(yīng)包括信號(hào)序列。適宜的信號(hào)序列是有分泌的酵母基因產(chǎn)物的那些，如PHO5，蔗糖酶或α-因子信號(hào)序列或水蛭素信號(hào)序列。另外，在框架中將與酵母啟動(dòng)子天然相連的部分基因信號(hào)序列與部分水蛭素信號(hào)序列相連，可以構(gòu)建融合的信號(hào)序列。那些結(jié)合物是受歡迎的，即它們使得在信號(hào)肽和成熟水蛭素氨基酸序列間可進(jìn)行精確的裂解。構(gòu)建體中也可包括其他序列，如可以或不可以攜帶特定加工信號(hào)的原-或間隔-序列以利于前體分子的精確加工。還可產(chǎn)生含內(nèi)加工信號(hào)的融合蛋白，所述信號(hào)使得在體內(nèi)或體外完成適當(dāng)?shù)某墒旒庸ぁ?yōu)選的是，加工信號(hào)含Lys-Arg殘基，它可由位于高爾基膜上的酵母內(nèi)肽酶識(shí)別。關(guān)于成熟水蛭素基因的表達(dá)，基因產(chǎn)物進(jìn)入分泌途徑并被運(yùn)至胞質(zhì)中。如果可以做到通過細(xì)胞壁排到培養(yǎng)液中，則應(yīng)可能明顯地提高產(chǎn)率。不必破碎細(xì)胞還可使回收過程簡(jiǎn)單化。
優(yōu)選的，本發(fā)明的雜交載體還含有包括適當(dāng)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和polyA的基因3′-側(cè)序列。適宜的3′-側(cè)序列是例如那些與所用啟動(dòng)子天然相連的基因，或其他酵母基因，如PHO5基因的3′-側(cè)序列。
在本發(fā)明優(yōu)選的雜交質(zhì)粒中，其他的DNA序列攜帶酵母復(fù)制原點(diǎn)和酵母的選擇性遺傳標(biāo)記。轉(zhuǎn)化后，含酵母復(fù)制原點(diǎn)，如自主復(fù)制片段(Ars)的雜交質(zhì)粒在酵母細(xì)胞內(nèi)存在于染色體外，且自主復(fù)制直至有絲分裂。也可用含有與酵母2μ質(zhì)粒DNA同源的序列的雜交質(zhì)粒。這些雜交質(zhì)?？赏ㄟ^重組融合至已存在于細(xì)胞內(nèi)的2μ質(zhì)粒中或自主復(fù)制。2μ序列特別適于高頻轉(zhuǎn)化質(zhì)粒并產(chǎn)生高拷貝數(shù)。
另外，本發(fā)明優(yōu)選的雜交質(zhì)粒可包括作為存在于宿主酵母染色體上的基因(如PHO5基因或其與突變水蛭素編碼區(qū)相連的啟動(dòng)子)的一部分的DNA序列。由于同源序列，應(yīng)等于約20到100個(gè)脫氧核苷酸的長(zhǎng)度，整個(gè)質(zhì)?；蚱渚€性片段可經(jīng)重組被穩(wěn)定地?fù)饺胨拗魅旧w中。因此，增殖期間，子代細(xì)胞可保持導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)甚至沒有選擇壓力。
至于酵母的選擇性標(biāo)記基因，可以使用任何因標(biāo)記的表型表達(dá)而有利于轉(zhuǎn)化體篩選的標(biāo)記基因。適宜的酵母標(biāo)記具體地是那些表達(dá)的抗生素抗性，或者對(duì)于營(yíng)養(yǎng)缺陷型酵母突變體來說，是補(bǔ)充宿主缺陷的基因。相應(yīng)的基因賦予，如對(duì)抗菌的放線菌酮的抗性或在營(yíng)養(yǎng)缺陷型酵母突變體中，提供原養(yǎng)型，如URA3、LEU2、HIS3或TRP1基因。也可用與自主復(fù)制片段相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因作為標(biāo)記，如果被轉(zhuǎn)化宿主對(duì)于標(biāo)記所表達(dá)的產(chǎn)物是營(yíng)養(yǎng)缺陷型的。
有利地是，本發(fā)明雜交質(zhì)粒中的其他DNA序列還可包括細(xì)菌宿主，特別是E.coli的復(fù)制復(fù)原點(diǎn)和選擇性遺傳標(biāo)記。在酵母雜交質(zhì)粒中，有與E.coli復(fù)制原點(diǎn)和E.coli標(biāo)記存在有關(guān)的有用特征。首先，通過在E.coli中生長(zhǎng)和擴(kuò)增，可以得到大量的雜交質(zhì)粒，其次，利用以E.coli為基礎(chǔ)的全部克隆技術(shù)，很容易在E.coli中進(jìn)行雜交質(zhì)粒的構(gòu)建。E.coli質(zhì)粒，如pBR322等含有E.coli復(fù)制原點(diǎn)和賦予抗生素，如四環(huán)素和氨芐青霉素抗性的E.coli遺傳標(biāo)記，并且有利于作為酵母雜交載體的部分。
下文將含，如復(fù)制原點(diǎn)和酵母細(xì)菌宿主遺傳標(biāo)記(見上文)的其他DNA序列稱為“載體DNA”，并與酵母啟動(dòng)子和突變水蛭素編碼區(qū)一起形成本發(fā)明的雜交質(zhì)粒。
本發(fā)明優(yōu)選的雜交載體是用本領(lǐng)域已知的方法，如連接酵母啟動(dòng)子，突變水蛭素編碼區(qū)，酵母基因的3′側(cè)序列和以及選擇性地連接載體DNA而制備的。
為了制備雜交質(zhì)粒，可以使用便于做圖譜的有至少一個(gè)限制位點(diǎn)，優(yōu)選的兩個(gè)或更多限制位點(diǎn)的環(huán)狀載體DNA，如細(xì)菌質(zhì)粒DNA等(見上文)。最好是載體DNA已含有復(fù)制原點(diǎn)和酵母和/或細(xì)菌宿主標(biāo)記基因。用適當(dāng)?shù)南拗坪怂醿?nèi)切酶裂解載體DNA。將限制過的DNA與含酵母啟動(dòng)子的DNA片段及編碼脫硫水蛭素突變蛋白的DNA片段相連。在啟動(dòng)子與突變水蛭素編碼區(qū)連接之前或之后(或同時(shí))，均可以導(dǎo)入酵母或細(xì)菌宿主復(fù)制原點(diǎn)和/或標(biāo)記。在整個(gè)過程中，選擇限制和連接條件以便不干擾載體DNA和啟動(dòng)子的基本功能?？梢砸来螛?gòu)建或連接兩個(gè)含全部所需序列的DNA片段來構(gòu)建雜交載體。
可以用各種技術(shù)體外連接DNA片段，可以直接用T4 DNA連接酶連接由特定限制核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的平整末端(全部堿基配對(duì)的DNA雙螺旋)。更為常見地是，通過其單鏈粘性末端連接DNA片段并由DNA連接酶，如T4 DNA連接酶共價(jià)閉合。用另一類產(chǎn)生交錯(cuò)末端(在幾個(gè)核苷酸的距離內(nèi)，于不同點(diǎn)斷裂DNA雙螺旋的兩條鏈)的核酸內(nèi)切酶裂解DNA，可形成上述單鏈“粘性末端”。通過用末端轉(zhuǎn)移酶將核苷酸加到平整末端或交錯(cuò)末端(均聚尾)或簡(jiǎn)單地用適宜的核酸外切酶如入核酸外切酶切掉平整末端DNA片段的一條鏈，也可形成單鏈。生產(chǎn)交錯(cuò)末端的其他方法包括將化學(xué)合成的連接子DNA與平整末端的DNA片段相連，所述連接子DNA含有形成交錯(cuò)末端的核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，然后用相應(yīng)的核酸內(nèi)切酶消化所得的DNA。
將本發(fā)明雜交載體的組分，如酵母啟動(dòng)子，可選擇地包括信號(hào)序列，轉(zhuǎn)錄終止子，復(fù)制系統(tǒng)等的突變水蛭素結(jié)構(gòu)基因以預(yù)定的順序相連，以確保適當(dāng)?shù)墓δ?。通過共有的限制位點(diǎn)或合成的連接子分子連接這些組分以確保這些組分的適當(dāng)方向和順序。
用本領(lǐng)域熟知的方法加工線性DNA載體，如以一種方式將上述酵母啟動(dòng)子與突變水蛭素編碼區(qū)相連以便由所述的啟動(dòng)子控制突變水蛭素編碼區(qū)，然后得到含有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA片段的DNA，所述轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)得自酵母基因。
可以按上文詳述，即通過平整末端連接，通過粘性末端或通過化學(xué)合成的連接子DNA完成DNA片段的連接。
特別是，為了被有效地表達(dá)，必須根據(jù)含轉(zhuǎn)錄(酵母啟動(dòng)子)和轉(zhuǎn)譯功能(核糖體結(jié)合位點(diǎn))的序列適當(dāng)確定突變水蛭素基因的位置。首先，以適當(dāng)?shù)姆较?，將含啟?dòng)子的DNA片段與突變水蛭素編碼區(qū)相連。如果可能有兩個(gè)方向，則要經(jīng)常規(guī)限制分析確定正確的方向。通過用適當(dāng)?shù)南拗坪怂醿?nèi)切酶切割所需的基因，將含不正確定向的所需突變水蛭素基因的雜交載體重新定向，并將該基因與雜交載體片段重新連接。在任何情況下，通過將兩個(gè)DNA片段之一在其末端與不同的限制位點(diǎn)相連，避免不正確的方向。此外，應(yīng)以可進(jìn)行正確轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)和終止的方式構(gòu)建交載體。至于后者，應(yīng)優(yōu)選地在得自酵母染色體DNA或酵母2μ質(zhì)粒的DNA序列中完成轉(zhuǎn)錄。其次，必須建立適當(dāng)?shù)拈喿x框架。通常，在連接前已知或容易測(cè)定啟動(dòng)子區(qū)和突變水蛭素編碼區(qū)的核苷酸序列，以便在建立正確的閱讀框架時(shí)沒有問題。
如果需要在細(xì)胞質(zhì)中積累所表達(dá)的成熟脫硫水蛭素突變蛋白，必須，例如通過核酸外切酶，如Ba131消化除去選擇性地跟在啟動(dòng)子區(qū)之后和/或成熟突變水蛭素編碼區(qū)之前的信號(hào)序列或其部分。使酵母啟動(dòng)子與突變水蛭素編碼序列直接相連的優(yōu)選區(qū)是在主要的mRNA起始位點(diǎn)和與酵母啟動(dòng)子天然相連的基因的ATG之間。為了在該區(qū)域內(nèi)連接，成熟水蛭素編碼序列應(yīng)有其自己的轉(zhuǎn)譯起始ATG，或它具有的其他的合成寡核苷酸。也可以通過作為連接分子的合成寡脫氧核糖核苷酸，將酵母啟動(dòng)子與突變水蛭素編碼序列相連。因此，如果可能，可將啟動(dòng)子區(qū)限制在其3′-末端附近，以便它沒有預(yù)定數(shù)目的堿基對(duì)。類似地，可將突變水蛭素編碼序列在其5′-末端附近進(jìn)行限制切割。然后構(gòu)建合成的寡脫氧核糖核苷酸以便，通過連接寡脫氧核糖核苷酸而連接酵母啟動(dòng)子和突變水蛭素編碼序列時(shí)，保留包括ATG轉(zhuǎn)譯起始信號(hào)的丟失的堿基對(duì)，并且突變水蛭素編碼序列是在與ATG起始密碼子有關(guān)的適當(dāng)?shù)拈喿x框架內(nèi)。
如果只用一個(gè)脫硫水蛭素片段，則其生產(chǎn)取決于所述片段的長(zhǎng)度。通常，少于20個(gè)氨基酸的異源蛋白質(zhì)不能被以足夠的量表達(dá)并從象E.coli和啤酒酵母那樣的天然宿主中分離。可能的表達(dá)小蛋白質(zhì)，如脫硫水蛭素的羧末端片段的方法包括將框架中所需的小蛋白質(zhì)與另一種蛋白質(zhì)融合，因此產(chǎn)生一種融合蛋白。已經(jīng)研制了數(shù)種方法以便將所需的蛋白質(zhì)與其融合伙伴分離(Nishikawa et al.，Protein Engineering 1，487-492(1987);Gardella et al.，J.Biol.Chem.265，15854-15859，(1990);Altman et al.，Protein Engineering 4，593-600(1991))?？捎玫乃拗魇钦婢缃湍福瑑?yōu)選的是啤酒酵母，或細(xì)菌像E.coli。
適宜的內(nèi)源融合伙伴是高效表達(dá)的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的是蛋白質(zhì)如eglin，β-半乳糖苷酶，β-乳糖酶，E.coli中與色氨酸合成有關(guān)的幾種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)A或氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶。在啤酒酵母中，優(yōu)選地使用嵌合泛激素融合蛋白(Sabin et al.，Biotechnology7，705-709(1989))。
在表達(dá)并純化融合蛋白后，必須要從融合伙伴中取出所需的脫硫水蛭素的羧末端片段。如果在所需片段和融合伙伴間沒有天然的裂解位點(diǎn)，則一般利用將所需片段與融合伙伴連接并且含有裂解位點(diǎn)的連接子序列來完成，可用化學(xué)或酶方法選擇性地裂解所述位點(diǎn)。所述裂解位點(diǎn)包括，例如對(duì)溴化氰作用敏感的甲二磺?；ㄓ赡c激酶在Lys后裂解的四肽基Asp-Asp-Asp-Lys的肽鏈或任何其他對(duì)用酶，如V8蛋白酶、胰蛋白酶、肽酶yscα或yscF的特異性裂解敏感的裂解位點(diǎn)。
另外可利用肽合成儀合成方法生產(chǎn)短的片段。
如果用包括信號(hào)序列在內(nèi)的表達(dá)盒，經(jīng)酵母菌株生產(chǎn)脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物，則生產(chǎn)的脫硫水蛭素主要(即90%以上)分泌在培養(yǎng)液中?？梢杂贸Ｒ?guī)方法從中分離脫硫水蛭素。例如，第一步通常包括通過離心從培養(yǎng)液中分離細(xì)胞。經(jīng)聚乙烯亞胺處理以便除去大部分的非蛋白質(zhì)物質(zhì)，使所得的上清液富集脫硫水蛭素，并用硫酸銨使溶液飽和來沉淀蛋白質(zhì)。也可以用乙酸酸化(如0.1%，pH4-5)來沉淀宿主蛋白質(zhì)，如果存在的話。通過用正丁醇提取乙酸上清液可進(jìn)一步富集脫硫水蛭素。其他純化步驟包括，例如，脫鹽作用，層析加工，如離子交換層析，凝膠過濾層析，分配層析，HPLC，反相HPLC等。也可經(jīng)透析，根據(jù)電荷通過凝膠電泳或無載體電泳，根據(jù)分子大小利用適宜的Sephadex柱，通過親合層析，例如與抗體，特別是單克隆抗體，或者同與用于親合層析的適宜載體偶聯(lián)的凝血酶，或者用其他方法，特別是文獻(xiàn)中已知的那些來實(shí)現(xiàn)混合物各組分的分離。通常，只需幾個(gè)純化步驟就可得到基本上無污染的脫硫水蛭素產(chǎn)物。
可以用使用抗-脫硫水蛭素或抗-脫硫水蛭素抗體(如單克隆抗體)的試驗(yàn)，凝血酶試驗(yàn)(M.U.Bergmeyer(ed)，Methods in Enzymatic Analysis 1983，Vol Ⅱ.p.314-316，Verlag Chemie，Weinheim(FRG))或血液凝固試驗(yàn)(F.Markwardt et al.，Thromb Haemost.(1982)，47，226)來檢測(cè)分離和純化步驟中脫硫水蛭素的活性。也可用層析方法，如HPLC。
因此本發(fā)明的目的之一是提供一種用于本發(fā)明脫硫水蛭素的表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含以可操作方式連接至編碼信號(hào)肽的第一DNA序列上的一個(gè)啟動(dòng)子以及攜帶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的一個(gè)DNA序列，所述第一DNA序列在適當(dāng)?shù)拈喿x框架中與編碼所述脫硫水蛭素或衍生物的第二DNA序列相連接。
本發(fā)明的另一目的是提供一種生產(chǎn)基本上由2到4個(gè)脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物組成的脫硫水蛭素軛合物的方法，包括·例如通過在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)適宜的脫硫水蛭素來生產(chǎn)適宜的脫硫水蛭素單體，·分離脫硫水蛭素，·如果需要，保護(hù)反應(yīng)性氨基酸側(cè)鏈，·將脫硫水蛭素單體與適宜的連接子連接或例如經(jīng)二硫鍵直接連接兩個(gè)脫硫水蛭素單體。
藥物組合物根據(jù)本發(fā)明可獲得的新的脫硫水蛭素軛合物具有寶貴的藥理學(xué)特性并且與從水蛭中提取的單體脫硫水蛭素一樣，可用于預(yù)防或者，尤其是治療疾病。
與天然水蛭素一樣，本發(fā)明獲得的脫硫水蛭素軛合物是有效的凝血酶抑制劑。例如具有10-9M至10-13M的Ki值。該脫硫水蛭素軛合物對(duì)凝血酶具有絕對(duì)的專一性并且沒有顯示出與血凝固系統(tǒng)的其它蛋白酶具有相互作用。其毒性非常低。同樣，沒有觀察到超敏反應(yīng)或過敏反應(yīng)。由于脫硫水蛭素軛合物的血漿半衰期增長(zhǎng)，因此可以一次施用脫硫水蛭素的日劑量。
因而本發(fā)明制備的新的脫硫水蛭素軛合物與天然水蛭素相似可用于治療和預(yù)防血栓形成以及血栓栓塞，包括預(yù)防手術(shù)后的血栓形成，用于急性休克治療(例如用于濃毒性的或多外傷休克)，用于治療消耗性凝血病，以及在血透析，血分離和體外血循環(huán)中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，該組合物含有非強(qiáng)制性地與一種藥物學(xué)上可接受的載體和/或助劑相結(jié)合的治療有效量的至少一種本發(fā)明制備的化合物或其可藥用的鹽。
當(dāng)將這些組合物以例如非腸道途徑給藥時(shí)，如靜脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、皮下注射或肌內(nèi)注射時(shí)，它們特別適用于上述的適應(yīng)癥。
本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的新的化合物以及含有這些化合物的藥物組合物來預(yù)防和治療人體或動(dòng)物體，特別是預(yù)防和治療具有上面所述臨床癥狀的人體或動(dòng)物體，主要是用于抑制人或動(dòng)物體內(nèi)和體外的血液的凝固。
使用的劑量主要依據(jù)給藥的具體形式以及治療或預(yù)防目的而定。單份劑量的多少以及服藥方式最好是根據(jù)具體病例作單獨(dú)判斷來決定;為了該目的而需要對(duì)相關(guān)血液因子進(jìn)行測(cè)定的方法是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的。通常，就注射方法而言，本發(fā)明所述化合物的治療有效量為約0.005至約0.1mg/每公斤體重的劑量范圍。優(yōu)選的劑量范圍為約0.01至約0.05mg/每公斤體重。給藥途徑包括靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)或皮下注射。因此，對(duì)于用于非腸道途徑給藥的單劑量形式的藥物組合物，依據(jù)不同的給藥方式，每份劑量含有約0.4至約7.5mg本發(fā)明化合物。除活性成分外，這些藥物組合物通常含有一種緩沖劑，例如磷酸鹽緩沖劑，用于保持pH值在約3.5至7之間，還含有用于調(diào)節(jié)等滲性的氯化鈉，甘露醇或山梨醇。這些組合物可以是凍干形式或溶解的形式，對(duì)于溶液而言，含有一種抗菌的活性防腐劑例如0.2至0.3%4-羥基苯甲酸甲酯或乙酯更為有利。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例涉及一種含水制劑，該制劑含有水，至少一種本發(fā)明所述化合物，以及水不溶性鹽形式的鈣離子、鎂離子或鋅離子。
水不溶性鹽最好是一種硝酸鹽，因?yàn)樗鼈兪欠浅２蝗艿摹?br> 該制劑pH為4至11，優(yōu)選為5至9。金屬鹽濃度為100mM至600mM，優(yōu)選為100mM至300mM，最優(yōu)選為約150mM。如果其濃度高于能用的生理濃度，可將該制劑在使用前稀釋到生理濃度。本發(fā)明所述化合物的濃度為1-600mg/ml，優(yōu)選為20-80mg/ml。如果現(xiàn)存只有高濃度，則可在使用前稀釋到例如20-80mg/ml范圍內(nèi)。
水不溶性鹽的粒徑大小是10-30μm，優(yōu)選為10-20μm。
通過在本發(fā)明所述化合物的水溶液中就地沉淀水不溶性鹽而制備該制劑。例如，將所選擇的金屬(Ca、Mg或Zn)的氯化物與堿金屬磷酸鹽混合。然后如果合適可用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)所得制劑的pH值。對(duì)于該制劑優(yōu)選的金屬是鋅。
本發(fā)明的制劑還含有一種糖例如海藻糖、蔗糖，或者優(yōu)選的甘露糖醇。
除了上面描述的可直接用于治療人體或動(dòng)物體的組合物以外，本發(fā)明還涉及在人或動(dòng)物活體外治療用的藥物組合物，這些組合物主要用作為血液的抗凝固添加劑，該血液用于體外循環(huán)或治療(例如人工腎臟的體外循環(huán)或透析)，保存或修飾(例如血分離)。這樣的組合物，例如貯存原液或另一種劑量形式的組合物在組成上與上面介紹的注射用組合物相似;但是，活性成分的量或濃度較有利的是根據(jù)待處理的血液體積而定，或者更精確地是根據(jù)其凝血酶含量而定。關(guān)于這一點(diǎn)必須記住本發(fā)明的活性成分(游離形式)可使約5倍重量的凝血酶完全失活，并且在相對(duì)高劑量時(shí)也無生理毒性，并甚至在高濃度時(shí)也能快速地從血液循環(huán)中清除，從而在例如輸血期間沒有劑量過大的危險(xiǎn)。依據(jù)特定目的，合適的劑量為每升血液約0.01至約1.0mg的活性成分，但仍可超過該上限值而無危險(xiǎn)。
附圖簡(jiǎn)介在下面實(shí)施例部分參照附圖對(duì)本發(fā)明的各種實(shí)施方案進(jìn)行描述，其中

圖1 圖解說明Cys33HV1-Cys33HV1二聚體的重折疊過程。
如果沒有另外說明，所有DNA操作都是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法完成(例如Maniatis，T.et al，Molecular cloninga laboratory man-ual.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1982))。
實(shí)施例1質(zhì)粒pDP34/GAPFL-YHIR(CYS33)的構(gòu)建通過改變編碼脫硫水蛭素的核苷酸序列可以在酵母(啤酒酵母)中表達(dá)脫硫水蛭素-Cys33，一種在第33位氨基酸處由半胱氨酸替代天冬氨酸得到的重組脫硫水蛭素衍生物1突變體(HV1)(J.Dodtet al.，F(xiàn)EBS Lett.165(1984)，180-184)。為了得到該脫硫水蛭素突變體，使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法(“PCR方法方法和使用指南”M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky，T.J.White(eds).Academic Press，New York，1990)，在表達(dá)盒中用TGT替代GAC。TGT編碼Cys，因而導(dǎo)致表達(dá)出脫硫水蛭素-Cys33(Cys33HV1)。
使用下列PCR引物(SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，)
與模板DNA的核苷酸位置互補(bǔ)(1) 5'-TCGGTCGACGCTCTCCCTTATGCG-3' 7492-7494,1-21(2) 5'-TTGGGTTCTTGTGGTGAAAAGAACCAATGTG-3' 626-656(3) 5'-CTTTTCACCACAAGAACCCAAGATACACTTG-3' 646-616(4) 5'-GCCAAGCTTGGCTGCAGATTTTAATC-3' 1122-1100這些寡聚氧核苷酸引物與模板DNApJDB207/GAPFL-YHIR-YHIR(EP-A-340 170)SEQ ID NO5，的核苷酸序列(見上文)互補(bǔ)。引物(1)和(4)是用于擴(kuò)增模板DNA的上游和下游引物;引物(2)和(3)是互相部分互補(bǔ)的內(nèi)部引物，并且兩引物覆蓋了突變位點(diǎn)(底下劃線處)。在不同反應(yīng)中成對(duì)地使用引物(1)和(3)以及引物(2)和(4)以擴(kuò)增部分模板DNA并引入突變。兩種PCR產(chǎn)物都重疊覆蓋了突變區(qū)。在二級(jí)反應(yīng)中將產(chǎn)物混合并且用引物(1)和(4)擴(kuò)增。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR方法，將0.1mg質(zhì)粒pJDB207/GAPFL-YHIR(EP-A-340 170)模板DNA與各1mg的引物(1)和(3)分別混合或者與各1mg的引物(2)和(4)分別混合，以擴(kuò)增相應(yīng)的DNA片段，該標(biāo)準(zhǔn)方法包括30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在72℃進(jìn)行1分鐘合成DNA，在93℃進(jìn)行20秒分離DNA鏈，在50℃經(jīng)過20秒退火。利用酚萃取法純化該DNA片段，并用乙醇沉淀。
第二個(gè)重迭-延伸反應(yīng)包括第一次反應(yīng)(見上文)中擴(kuò)增的各0.1mg的PCR產(chǎn)物以及各1mg的PCR引物(1)和(4)。同樣擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)包括在72℃進(jìn)行1.5分鐘用于合成DNA，在93℃進(jìn)行20秒用于分離DNA鏈，以及在50℃進(jìn)行40秒用于退火。
用salⅠ和HindⅢ限制性切割擴(kuò)增的DNA片段。將1.1kb SalⅠ-HindⅢ片段克隆到SalⅠ，HindⅢ切割的pUC9載體(Sigma )。采用限制性切割分析法檢查幾個(gè)克隆并將一個(gè)正確克隆的插入片段進(jìn)行測(cè)序。該克隆的編碼序列含有編碼Cys33的TGT密碼子。
1.1kb SalⅠ-HindⅢ插入片段是脫硫水蛭素的表達(dá)盒，它包括pBR322的276bp SalⅠ-BamHⅠ片段，一個(gè)BamHⅠ/BglⅡ接頭以及在-5位的帶有EcoRⅠ接頭的194bp GAPFL啟動(dòng)子。該EcoRⅠ位點(diǎn)將啟動(dòng)子與PHO5信號(hào)序列以及[Cys33]HV1的編碼序列連在一起。3′端BamHⅠ位點(diǎn)后面與377bp PHO5轉(zhuǎn)錄終止子和一個(gè)HindⅢ位點(diǎn)相連接。
將1.1kb表達(dá)盒以SalⅠ平齊末端片段形式克隆到已用BamHⅠ(由Klenow聚合酶轉(zhuǎn)化為平齊末端)和SalⅠ切割的高拷貝數(shù)酵母表達(dá)載體pDP34(DSM 4473)上。將得到的質(zhì)粒稱作為pDP34/GAPFL-YHIR(CYS33)。在SEQ ID NO7和SEQ ID NO8中給出了Cys33HV1部分的序列以及相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列。
實(shí)施例2酵母轉(zhuǎn)化和發(fā)酵按照EP-A-341 215中公開的方法構(gòu)建啤酒酵母菌株TR1456。在兩個(gè)依次相連的實(shí)驗(yàn)中，以啤酒酵母H449菌株(DSM4413)作為起始材料，通過破壞其編碼基因KEX1和PRC1分別從H449菌株中除去兩個(gè)羧肽酶yscα和yscY。首先，破壞編碼yscα基因，KEX1。為此，用編碼KEX1基因的DNA片段(在該KEX1編碼區(qū)的中間插入了全長(zhǎng)的URA3基因)轉(zhuǎn)化H449菌株。篩選出尿嘧啶原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體并檢測(cè)其是否沒有yscα活性。接著，通過用含有一個(gè)被破壞的URA3基因的變體，ura3△5的質(zhì)粒(參見EP-A-341 215)進(jìn)行轉(zhuǎn)化而破壞在KEX1位點(diǎn)處插入的URA3基因。篩選出尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型轉(zhuǎn)化體，在下一個(gè)步驟中破壞其內(nèi)源的編碼羧肽酶yscY的PRC1基因?；旧习辞懊婷枋龅钠茐腒EX1的類似方式完成該試驗(yàn)。將最后得到的H449菌株的同系衍生物稱之為TR1456并且具有下列基因型 利用Hinnen et al.的轉(zhuǎn)化方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75(1978)1929-1933)用質(zhì)粒pDP34/GAPFL-YHIR(CYS33)轉(zhuǎn)化酵母菌株TR1456。按尿嘧啶選擇法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的單個(gè)酵母菌落稱作為啤酒酵母TR1456/pDP34/GAPFL-YHIR(CYS33)將轉(zhuǎn)化體在不含尿嘧啶的10ml基本培養(yǎng)基上發(fā)酵兩個(gè)連續(xù)的預(yù)培養(yǎng)期，在沒有選擇性的完全培養(yǎng)基中發(fā)酵進(jìn)行實(shí)際的生產(chǎn)操作。按EP-A-340 170描述的方法從培養(yǎng)肉湯中分離出粗制[Cys33]HV1。
實(shí)施例3Cys33HV1的制備，未折疊以及重新折疊按照生產(chǎn)天然水蛭素的方法(Meyhack et al.(1987)，Thromb.Res.Suppl.，Ⅶ33)在酵母中表達(dá)[Cys33]HV1并將其分泌到培養(yǎng)基中。通過離心除去細(xì)胞，并采用XAD-7樹脂吸附法，從上清中取出顯示有抗凝血酶活性的蛋白質(zhì)。用醋酸銨緩沖液(0.2M，pH8.5)洗脫活性蛋白質(zhì)混合物，并上樣到Q-Sepharose快流速離心交換柱上。使用在50分鐘內(nèi)由0%A(用甲酸將緩沖液pH調(diào)至5.0)變化至85%B(用甲酸將緩沖液pH調(diào)至3.0，并且含有0.5MNaCl)的甲酸銨緩沖液(25mM)梯度對(duì)該柱進(jìn)行洗脫。將顯示有抗凝血酶活性的組分收集在一起并冷凍至干燥。
在0.75ml的含有5M鹽酸胍(GdmCl)和0.1M二硫蘇糖醇的Tris-HCl緩沖液(0.5M，pH8.4)中，23℃將粗制[Cys33]HV1(4mg)還原2小時(shí)。將樣本傳遞過在50mM碳酸鈉緩沖液pH8.3中平衡的PD-10柱(pharmacia)。收集1.2ml經(jīng)還原/變性的樣本，并立即用同樣的碳酸鈉緩沖液稀釋至終濃度為1mg/ml(140mM)。折疊步驟是在23℃進(jìn)行的，并且通過用2倍體積的4%三氯醋酸將折疊樣本酸化，監(jiān)測(cè)時(shí)間進(jìn)程，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間收集折疊中間產(chǎn)物。
實(shí)施例4用HPLC法鑒定折疊中間產(chǎn)物的特性將[Cys33]HV1在50mM NaHCO3(pH8.3)中，23℃時(shí)重新折疊(見圖1)。按一定的時(shí)間進(jìn)程通過酸化而收集折疊中間產(chǎn)物并采用下列條件進(jìn)行HPLC分析柱用于肽和蛋白質(zhì)分析的Vydac D-18，5mm;
溶劑A含0.1%三氟醋酸的水;
溶劑B含0.1%三氟醋酸的乙腈/水(9∶1，V/V)。
梯度20分鐘內(nèi)24%變化至43%溶劑B線性。
檢測(cè)在214nm處。
在17.7分鐘內(nèi)洗脫經(jīng)還原/變性的(R)Cys33HV1。
“NM”是活性Cys33HV1單體(13.5分鐘)。
“ND”是Cys33HV1二聚體。
圖1中插圖是由相同HPLC條件分析的粗制[Cys33]HV1。
粗制產(chǎn)物的不均勻性是生物合成后的不正確折疊或純化過程中樣本破壞造成的。
在上面描述的條件下，用第一種速率常數(shù)0.05+/-0.01分鐘-1首先形成活性[Cys33]HV1單體(NM)(圖1)。隨后在二個(gè)活性[Cys33]HV1單體之間產(chǎn)生氧化作用并且產(chǎn)生二聚體。折疊高效率地進(jìn)行，并且產(chǎn)量高于85-90%。在pH高于8.3時(shí)，折疊反應(yīng)以更高速度進(jìn)行。
實(shí)施例5[Cys33]脫硫水蛭素單體和二聚體的特性采用二甲基氨基偶氮苯磺?；?dabsyl)氯化物方法(Chang et al.Anal.Biochem.(1991)，197，52-581測(cè)定氨基酸組成，該方法可直接確定二硫鍵的含量。利用一個(gè)Applied Biosystem Inc.470A蛋白質(zhì)測(cè)序儀分析氨基酸序列。使用公開描述的方法(Stone et al.Biochemistry(1986)，25，4622-4628;Chatrenet et al.J.Biol.Chem.(1992)，267，3038-3043)，根據(jù)其抑制消化的Chromozym TH(Boehringer Mannheim)中α-凝血酶的能力估測(cè)脫硫水蛭素衍生物的抗凝血酶活性。利用國(guó)產(chǎn)儀器以及激光解吸附離心化質(zhì)量分光光度法(Boernsen et al.Chimia(1990)，44，412-416)測(cè)得脫硫水蛭素的分子量是13916。
由氨基酸分析法證實(shí)[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚體不含有游離的Cys。
在1nm脫硫水蛭素以及1.5nMα-凝血酶濃度下檢測(cè)凝血酶抑制作用，在重量相等情況下，該二聚體顯示出基本上與野生型脫硫水蛭素具有相同抑制活性(82±5%)。
實(shí)施例6二聚體和單體是內(nèi)部可轉(zhuǎn)變的與脫硫水蛭素的三個(gè)內(nèi)部二硫鍵不同，由于非共價(jià)鍵相互作用，該二聚體的Cys33-Cys33鍵是不穩(wěn)定的。因此可以在溫和還原條件下選擇性地切割Cys33-Cys33鍵而不破壞活性中心區(qū)內(nèi)的三個(gè)二硫鍵。進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)是為了找到使二聚體定量轉(zhuǎn)變?yōu)閱尉垠w的最佳條件。在室溫下使用0.5至2.5mM的β-巰基乙醇可完成該試驗(yàn)。在更高濃度的β-巰基乙醇時(shí)，由于Cys6-Cys14，Cys16-Cys28以及Cys22-Cys39二硫鍵發(fā)生還原使單體快速分解。
實(shí)施例7適用于非腸道給藥的含有脫硫水蛭素二聚體的藥物組合物將實(shí)施例3的凍干的[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚體溶解于0.9%NaCl溶液中至終濃度為0.2mg/ml或2mg/ml。通過超濾(用0.22μm孔徑的膜)將這些溶液滅菌。
該無菌溶液可直接使用，例如用于靜脈給藥。
實(shí)施例8皮下給藥的水蛭素HV1和[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚體對(duì)大鼠體外血漿APTT的影響(APTT二激活部分凝血酶的時(shí)間)將[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚體溶解于鹽水中至濃度為4.5mg/ml，并將未經(jīng)修飾的水蛭素單聚體溶于鹽水中至濃度為3.0mg/ml(這些劑量選擇是基于體外結(jié)果而定，以便在1小時(shí)內(nèi)它們對(duì)APTT的影響相似)。將該溶液皮下注射到大鼠(1ml/kg)。在給藥后不同時(shí)間，通過心臟穿刺直至收集血液(2ml)到1/10體積的檸檬酸三鈉溶液(3.8%W/V)中并立即混合。將該抗凝固血液在2500g離心20分鐘，得到無血小板的血漿。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法在Instrumentation Laboratory ACL 300R血凝度計(jì)上檢測(cè)血漿樣本的APTT。該APTT測(cè)定方法利用了Instrumentation Laboratory鞣花酸檢測(cè)盒一將血漿(50μl)與鞣花酸激活劑(50μl)在37℃保溫5分鐘，然后加入氯化鈣溶液(50μl的25mM溶液)，并且自動(dòng)記錄獲取血漿凝塊的時(shí)間，當(dāng)血纖維蛋白網(wǎng)狀構(gòu)造形成時(shí)，用散射光光學(xué)方法測(cè)定該關(guān)鍵點(diǎn)(見表1) 該結(jié)果表示為對(duì)照的平均APTT值的倍數(shù)，并描述為平均值±該平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(n＝5)實(shí)施例9藥物組合物溶液A含有溶于水中的2.43M ZnCl2，和0.455M Na2HPO4，pH為2.5，用HCl調(diào)節(jié)pH。溶液B由0.6M NaOH，0.25M NaCl組成。通過將2份溶于水的[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚體的貯存液(80mg/ml)與1.05溶液A混合(比例為2∶1.05，V/V)而制備溶液C。將水，溶液B和溶液C分別按0.66∶0.1883∶0.4的重量比混合而制備藥劑。
利用CaCl2或MgCL2代替ZnCl2制備相似的混合物。
實(shí)施例10藥物組合物溶液A1含有溶于水中的165mM ZnCl2，2.11mM Na2HPO4以及37.8mM HCl。溶液B1含有0.6N NaOH。將[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚體(粉狀)加到31.7倍體積的溶液A1中，接著加入55倍體積的甘露醇溶液(198mM)，然后加入13.3倍體積的溶液B1。當(dāng)形成沉積時(shí)該溶液變得渾濁。該[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚體以每ml水中含20mg的濃度使用，不需要調(diào)節(jié)pH。
實(shí)施例11由[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚體抑制人凝血酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的檢測(cè)按照Wallace等人，Biochemistry(1989)，28，10079-10084描述的方法，在200μM D-Val-Leu-Arg-p硝基?；桨反嬖谙?，滴定抗2.0nM凝血酶的值而測(cè)出水蛭素濃度。
根據(jù)重量以及一個(gè)亞單位的分子量為7000，活性分子的反應(yīng)為0.97。結(jié)果證明二聚體的二個(gè)分子均是有活性的。
按照Stone et al.Biochemistry(1986)，25，4622-4628和Braun et al.Biochemistry(1988)，27，6517-6522描述的方法，由進(jìn)度曲線試驗(yàn)測(cè)定[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。對(duì)于每項(xiàng)測(cè)定，都在六個(gè)檢測(cè)試驗(yàn)中監(jiān)測(cè)從D-Phe-派可酸基-Arg-p-硝基?；桨沸纬傻膶?duì)-硝酸苯胺，這六個(gè)測(cè)試中的一個(gè)沒有抑制劑，其他測(cè)試有范圍從10-60pM的[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚體的不同濃度的抑制劑存在。底物濃度為100μM，而酶濃度是20pM。
動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定兩次，列于表2中的值代表測(cè)得數(shù)值的平均值。
表2抑制劑 參數(shù)108k1K1(M-1s-1) (pM)[Cys33]HV1-[Cys33]HV1二聚體 (0.51±0.03) 0.330±0.038HV1 (1.37±0.03) 0.237±0.006微生物寄存下列微生物菌株寄存于德國(guó)微生物收集中心(DSM)，Mascheroder Weg 1b，D-3300 Braunschweig(給出了寄存日期及保藏號(hào))釀酒酵母H4491988年2月18日寄存，DSM 4413;
大腸桿菌JM 109/pDP341988年3月14日寄存，DSM 4473;
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人(A)名稱CIBA-GEIGY AG(B)街道Klybeckstr.141(C)城市Basel(E)國(guó)家瑞士(F)郵編(ZIP)4002(G)電話+41 61 69 11 11
(H)傳真+41 61 696 79 76(I)電傳962 991(A)名稱UCP GENP-Pharma AG(B)街道Solothurnerstrasse 24(C)城市Kirchberg(E)國(guó)家瑞士(F)郵編(ZIP)3422(ⅱ)發(fā)明名稱高分子量水蛭素(ⅲ)序列數(shù)8(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release ＃1.0，Version ＃1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(Ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature
(B)位置1..24(D)其他資料/產(chǎn)品＝“合成的PCR產(chǎn)物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1TCGGTCGACG CTCTCCCTTA TGCG 24(2)SEQ ID NO2的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置1..31(D)其他資料/產(chǎn)品＝“合成的PCR引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2TTGGGTTCTT GTGGTGAAAA GAACCAATGT G 31(2)SEQ ID NO3的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)
(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置1..31(D)其他資料/產(chǎn)品＝“合成的PCR引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3CTTTTCACCA CAAGAACCCA AGATACACTT G 31(2)SEQ ID NO 4的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置1..26(D)其他資料/產(chǎn)品＝“合成的PCR引物”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4GCCAACTTG GCTGCAGATT TTAATC 26(2)SEQ ID NO 5的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1130個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單股
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置1..1130(D)其他資料/功能＝“pJDB207的起始1130核苷酸/GAPFL-YHIR(EP-A-340170)”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置1..276(D)其他資料/產(chǎn)物＝“pRB322的SalⅠ-BamHⅠ片段”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置277..284(D)其他資料/功能＝“BamHⅠ/BglⅡ連接子”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞啟動(dòng)子(B)位置285..478(D)其他資料/功能＝“GAPFL啟動(dòng)子”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置479..484(D)其他資料/產(chǎn)物＝“EcoRⅠ連接子”(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置488..538(D)其他資料/功能＝“PH05信號(hào)序列”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置539..733(D)其他資料/功能＝“水蛭素HV1”/標(biāo)準(zhǔn)名稱＝“HV1”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞終止子(B)位置737..1113(D)其他資料/標(biāo)準(zhǔn)名稱＝“PHO5終止子”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置1117..1122(D)其他資料/功能＝“M13克隆位點(diǎn)”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置734..736(D)其他資料/功能＝“轉(zhuǎn)譯終止子”/標(biāo)準(zhǔn)名稱＝“TAG”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5

(2)SEQ ID NO6的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度65氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..65(D)其他資料/注＝“水蛭素變異體(HV1)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6 (2)SEQ ID NO7的資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度195個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mat_peptide(B)位置1..195(D)其他資料/產(chǎn)物＝“[33-Cys]HV1)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7 (2)SEQ ID NO8的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度65氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..65(D)其他資料/注＝“[33-Cys]HV1)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8
權(quán)利要求
1.一種由具有水蛭素活性的脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的2-4個(gè)殘基組成的軛合物，其中該軛合物是非融合蛋白，并且具有水蛭素活性的脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的殘基不是通過戊二醛或碳化二亞胺連接的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軛合物，它由具有水蛭素活性的脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的兩個(gè)殘基組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軛合物，它由具有水蛭素活性的HV1、HV2或HV3(PA)脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的兩個(gè)殘基組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軛合物，它由具有水蛭素活性的脫硫水蛭素HV1突變蛋白或衍生物的兩個(gè)殘基組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軛合物，其中脫硫水蛭素或脫硫水蛭素衍生物直接相連接或通過一個(gè)連接基團(tuán)相連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軛合物，其中具有水蛭素活性的脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物中的兩個(gè)半胱氨酸直接相連或借助一個(gè)連接基團(tuán)相連。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軛合物，其中脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物借助于一個(gè)二硫鍵直接相連。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軛合物，其中兩個(gè)脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的單體，或脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物單體與該連接基團(tuán)，是在N-末端區(qū)相連接的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軛合物，其中兩個(gè)脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的單體，或脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物單體與連接基團(tuán)，是在氨基酸殘基7至50之間區(qū)域內(nèi)連接的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的軛合物，其中兩個(gè)脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的單體，或脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物單體與連接基團(tuán)，是在氨基酸殘基30至40之間的區(qū)域內(nèi)相連接的。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軛合物，其中含有的脫硫水蛭素中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被能夠交聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)所替代。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的軛合物，其中含有的脫硫水蛭素中，脫硫水蛭素的一個(gè)氨基酸被選自于Asp、Glu、Lys和Cys的一個(gè)氨基酸所替代。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的軛合物，其中含有的脫硫水蛭素中的一個(gè)氨基酸被Cys替代。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的軛合物，其中含有的兩個(gè)脫硫水蛭素HV1中的Asp33被Cys替代。
15.一種權(quán)利要求5所述的脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物，它具有水蛭素活性，并且能夠與另一個(gè)具有水蛭素活性的脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物交聯(lián)。
16.一種脫硫水蛭素HV1，其中Asp33由Cys替代(SEQ ID NO8)。
17.制備權(quán)利要求1所述軛合物的方法，該方法包括·在合適宿主中表達(dá)合適的脫硫水蛭素，·分離脫硫水蛭素，·如果必要，保護(hù)反應(yīng)性氨基酸側(cè)鏈，·將脫硫水蛭素連接到合適的連接子上或直接將兩個(gè)脫硫水蛭素連接在一起。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中脫硫水蛭素通過二硫鍵連接。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中脫硫水蛭素是未折疊的并且在分離后重新折疊。
20.使脫硫水蛭素變性和復(fù)性為生物學(xué)活性多聚或二聚形式的方法，該方法包括下列步驟·按上文中描述方法用促溶劑使脫硫水蛭素變性，·在重折疊的條件下，使脫硫水蛭素復(fù)性，·借助一連接子或直接將脫硫水蛭素相連接。
21.權(quán)利要求1所述化合物和常規(guī)載體在制備藥物組合物中的應(yīng)用。
22.一種藥物組合物，它含有一種由權(quán)利要求1所說脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的2-4個(gè)殘基組成的軛合物，或者含有所述化合物和與之組合的常規(guī)輔料，通常為載體和稀釋劑。
23.一種含水制劑，所述制劑含有水、權(quán)利要求1所說的一種化合物以及水不溶性鹽形式的鈣離子、鎂離子或鋅離子。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的制劑，其中所說的水不溶性鹽是一種磷酸鹽。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的制劑，其中所說的金屬鹽濃度是從100mM到600mM。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的制劑，其中權(quán)利要求1所述化合物的濃度為1-600mg/ml。
27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的制劑，其中所說的水不溶性鹽粒徑大小為10-30μm。
28.在人或動(dòng)物體的治療或預(yù)防方法中使用的權(quán)利要求1所述的一種軛合物。
29.用于抑制凝血酶的權(quán)利要求28所述的軛合物。
30.一種藥物組合物，包括治療有效量的至少一種權(quán)利要求1所述的軛合物或其可藥用的鹽，所述組合物在治療和預(yù)防血栓形成和栓塞的方法中使用。
31.一種表達(dá)載體。包括用于權(quán)利要求15所述的脫硫水蛭素的一種表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有以可操作方式連接到編碼信號(hào)肽的第一DNA序列上的一個(gè)啟動(dòng)子，該第一DNA序列又在正確的閱讀框架中連接到編碼所述脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物的第二DNA序列上;以及具有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的表達(dá)盒，其中所說的啟動(dòng)子是GAPFL或CUP1啟動(dòng)子。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的表達(dá)盒，其中所說的信號(hào)序列是PH05信號(hào)序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的表達(dá)盒，其中所說的脫硫水蛭素突變蛋白或衍生物是[Cys33]HV1(SEQ ID NO7)。
35.根據(jù)權(quán)利要求31所述表達(dá)盒，其中終止子是PHO5終止子。
全文摘要
本發(fā)明屬于凝血酶抑制劑領(lǐng)域，并且描述了經(jīng)修飾的脫硫水蛭素的制備，更具體地講是借助于遺傳工程手段制備脫硫水蛭素。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了使一種經(jīng)修飾的脫硫水蛭素變性并復(fù)性至具生物學(xué)活性的凝血酶抑制劑的方法以及使兩種或多種所述脫硫水蛭素結(jié)合形成更高分子量的凝血酶抑制劑的方法。
文檔編號(hào)C07K1/113GK1113389SQ94190578
公開日1995年12月13日 申請(qǐng)日期1994年7月23日 優(yōu)先權(quán)日1993年8月4日
發(fā)明者H·格羅森巴赫, J·Y·張, W·馬基 申請(qǐng)人:西巴-蓋爾基股份公司, Ucp.珍制藥公開股份有限公司