專利名稱：大環(huán)雙官能螯合劑及其配合物和抗體共軛物的制備方法
已知官能化的螯合劑，或雙官能配位體能夠共價(jià)連接到對(duì)癌或腫瘤細(xì)胞的抗原決定基或抗原具有特性的抗體上。這種抗體/螯合劑共軛物的放射性核素配合物，可用于診斷和/或治療，作為運(yùn)送放射性核素到癌或腫瘤細(xì)胞的一個(gè)方法。請(qǐng)參見，例如，Moares等人，Anal.Biochem.142，68-78，(1984);和Krejcarek等人，Biochem.和Biophys.Res.Comm.77，581～585(1977)。
氨基羧酸螯合劑已被認(rèn)識(shí)和研究多年了。典型的氨基羧酸是次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、羥乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、反式-1，2-二氨基環(huán)己烷四乙酸(CDTA)和1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷四乙酸(DOTA)。許多以氨基羧酸為基礎(chǔ)的雙官能螯合劑已被提出和制備。例如DTPA的環(huán)二酐〔Hnatowich等人，Science220，613-615，(1983);美國(guó)專利4，479，930〕和DTPA的混合的羧基碳酸酐〔Gansow，美國(guó)專利4，454，106和4，472，509;Krejcarek等人，Biochem.和Biophys.Res.Comm.77，581-585，(1977)〕已被報(bào)導(dǎo)過(guò)。當(dāng)這些酐與蛋白質(zhì)偶聯(lián)時(shí)，偶聯(lián)是通過(guò)酰胺鍵的形成進(jìn)行的，這樣在二亞乙基三胺(DETA)的主鏈上原來(lái)五個(gè)羧基甲基基團(tuán)留下了四個(gè)〔Hnatowich等人，Int.J.Appl.Isot.33，327-332，(1982)〕。此外，美國(guó)專利4，432，907和4，352，751公開了雙官能螯合劑用于將金屬離子連接到“有機(jī)類如有機(jī)靶分子或抗體上”。如上所述，偶聯(lián)通過(guò)利用二氨基四乙酸二酐經(jīng)過(guò)一個(gè)酰胺基而獲得。酸酐的實(shí)例包括EDTA、CDTA、丙二胺四乙酸和苯-1，2-二胺四乙酸的二酸酐。一份最近的美國(guó)專利4，647，447公開了幾種由配位酸的陰離子形成的配合物鹽，可用于各種診斷技術(shù)。通過(guò)一個(gè)配位酸的羧酸基進(jìn)行共軛作用已有過(guò)論述，該作用通過(guò)酰胺鍵生成鍵合。
在J.of Radioanalytical Chemistry 57(12)，553-564(1980)中，Paik等人公開了P-硝基芐基溴在與封閉的二亞乙基三胺，即雙-(2-苯二(甲)酰亞氨基乙基)胺的反應(yīng)中的使用，該反應(yīng)隨后是解封閉步驟，并用氯代乙酸進(jìn)行羧基甲基化作用，生成N′-P-硝基芐基二亞乙基三胺N，N，N″，N″-四乙酸。另一方面，由于連接是通過(guò)氮原子進(jìn)行的，所以會(huì)得到四乙酸的衍生物。還討論了雙官能螯合劑的共軛作用和與銦的螯合。Eckelman等人，在J.of pharm.Sci.64(4)，704-706(1975)中講述了氮原子上的取代作用，在羧基甲基化作用前，使胺，如1，2-乙二胺或二亞乙基三胺，與適當(dāng)?shù)耐榛寤镞M(jìn)行反應(yīng)。這些化合物被提出來(lái)作為可能的放射藥學(xué)上的成像劑。
另一類以氨基羧酸官能度為基礎(chǔ)的雙官能螯合劑，在文獻(xiàn)中也有很清楚的記載。例如，Sundberg，Meares等人在J.of Med.Chem.17(12)，1304(1974)中，公開了EDTA的雙官能類似物。這些化合物的代表是1-(P-氨基苯基)-1，2-乙二胺四乙酸和1-(P-苯-重氮化)-1，2-乙二胺四乙酸。討論了通過(guò)對(duì)位取代基向蛋白質(zhì)的偶聯(lián)和放射性金屬離子向螯合基團(tuán)上的結(jié)合。在Biochemical and Biophysical Research Communications 75(1)，149(1977)和美國(guó)專利3，994，966和4，043，998中也公開了這些化合物。有一點(diǎn)很重要值得注意，即向EDTA結(jié)構(gòu)上連接芳香基團(tuán)是通過(guò)1，2-乙二胺主鏈上的一個(gè)碳原子。在美國(guó)專利4，622，420中公開了基于EDTA、HEDTA和DTPA的旋光活性的雙官能螯合劑。在這些化合物中，亞烷基團(tuán)將芳族基團(tuán)(其上含有為連接到蛋白質(zhì)上所需要的官能度)連接到多胺的碳原子上，多胺中含有螯合官能度。這類化合物的其它參考文獻(xiàn)包括Brechbiel等人，Inorg.Chem.25，2772-2781(1986)，美國(guó)專利4，647，447和國(guó)際專利公開號(hào)WO86/06384。
更為最近的，某些大環(huán)雙官能螯合劑和它們的銅螯合共軛物在診斷或治療上的應(yīng)用，已在美國(guó)專利4，678，667中，并被Moi等人，Inorg.Chem.26，3458-3463(1987)公開。氨基羧酸官能度向雙官能螯合分子的其余部分的連結(jié)，是通過(guò)環(huán)多胺主鏈的一個(gè)環(huán)碳進(jìn)行的。例如，一個(gè)連接基團(tuán)，其一端與環(huán)多胺的一個(gè)環(huán)碳相連著，其另一端也可連接一個(gè)能夠與蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的官能基團(tuán)。
同時(shí)值得注意的另一類雙官能螯合劑，包括這些化合物，其中這個(gè)分子的螯合部分，即氨基羧酸，是通過(guò)一個(gè)氮原子連接到一分子的其中含有能夠與蛋白質(zhì)反應(yīng)部分的官能基團(tuán)上。例如，Mikola等人在專利申請(qǐng)(國(guó)際公開號(hào)WO84/03698，
公開日期9/27/1984)中公開了一種雙官能螯合劑，該螯合劑是通過(guò)P-硝基芐基溴與DETA反應(yīng)，接著與溴代乙酸反應(yīng)生成氨基羧酸而制備的。其硝基被還原成相應(yīng)的胺基，然后再與二氯硫化碳反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成異硫氰酸根合基團(tuán)。這些化合物是能夠螯合鑭系元素的雙官能螯合劑，鑭系元素可以共軛到生物有機(jī)分子上而用作診斷劑。由于這個(gè)分子連接部分的連接，是通過(guò)氨基羧酸的多個(gè)氮中的一個(gè)氮原子進(jìn)行的，那么對(duì)于螯合作用就失去了一個(gè)可能的氨基羧酸基團(tuán)。因此制備的是含四個(gè)酸(不是五個(gè)酸)基團(tuán)的DETA-基礎(chǔ)上的雙官能螯合劑。在這一方面，這類雙官能螯合劑相似于那些通過(guò)酰胺基團(tuán)與蛋白質(zhì)相連而失去一個(gè)羧基螯合基團(tuán)的螯合劑。
最近，Carney、Rogers和Johnson公開了(關(guān)于單克隆抗體治癌的第三屆國(guó)際會(huì)議;San Diego，California-2/4～6/88)題為“體內(nèi)較高級(jí)組織不吸收銦-111標(biāo)記的抗體在裸露鼠樣品中共同施用銦-111和碘-125標(biāo)記的B72.3”和“在裸露鼠內(nèi)，螯合劑Denticity對(duì)銦-111標(biāo)記的B72.3免疫共軛生物分布的影響”的摘要。公開了與EDTA和DTPA雙官能螯合劑配合的銦-111的生物分布。芳香環(huán)向EDTA/DTPA部分的連接是通過(guò)乙酸酯的亞甲基進(jìn)行的。在最近的一次會(huì)議上，D.K.Johnson等人〔Florida Conf.on Chem.in Biotechnology，April26～29(1988)，Palm Coast，F(xiàn)L〕公開了EDTA和DTPA的雙官能衍生物，其中的P-異硫代氰酸根合芐基部分連在多個(gè)羧基甲基基團(tuán)之一的亞甲基碳上。以前，Hunt等人在美國(guó)專利4，088，747和4，091，088(1978)中，公開了以1，2-乙二胺二乙酸(EDDA)為基礎(chǔ)的螯合劑，其中，芳族環(huán)向EDDA部分的連接是通過(guò)亞烷基或乙酸酯的亞甲基進(jìn)行的。這些化合物已被論述可用作螯合劑，用來(lái)研究肝膽管的功能。優(yōu)選的金屬是锝-99m。銦-111和銦-113m也被認(rèn)為是有用的放射性核素，用于成像。
因而，提供一種不易離解，能迅速?gòu)恼麄€(gè)身體內(nèi)，除了所需的組織處外排除的，并與抗體共軛產(chǎn)生所需的結(jié)果的配合物將是很有利的。


圖1-7和15-21說(shuō)明了153Sm的生物分布，其施用方式是本發(fā)明的含153Sm的共軛物，抗體CC49-IgG用在本發(fā)明的共軛體中。在帶有LS174-T腫瘤的裸露鼠體上測(cè)定其生物分布。
圖8-14和22-28說(shuō)明了153Sm的生物分布，其施用方式是本發(fā)明的含153Sm的共軛物。本發(fā)明的共軛體用CC49-F(ab′)2作為抗體片段。在帶有LS174-T腫瘤的裸露鼠中測(cè)定其生物分布。
圖29-34說(shuō)明了以含177Lu(PA-DOTMA)的共軛物形式的177Lu的生物分布。該共軛物用CC49-IgG作抗體。在帶有LS174-T腫瘤的裸露鼠中測(cè)定其生物分布。
令人驚奇的是，本發(fā)明的配合物和/或共軛物比較穩(wěn)定(即不容易離解)，并且顯示了能從整個(gè)身體內(nèi)，除了所需組織處，被快速地排除。
本發(fā)明包括新的雙官能螯合劑的設(shè)計(jì)和合成，每種螯合劑含一個(gè)螯合官能度和一個(gè)以共價(jià)鍵結(jié)合于生物分子的化學(xué)活性基團(tuán)。本發(fā)明的組成部分還包括制備各種雙官能配位體(BFC)-金屬配合物的方法，以及將配合物連接到抗體上以制備適于診斷和/或治療應(yīng)用的放射性核素(如釤-153、镥-177和釔-90)標(biāo)記的抗體和/或片段的方法。
本發(fā)明直接公開了新型的雙官能螯合劑與金屬離子，尤其是具有稀土類化學(xué)性質(zhì)的“放射活性”金屬離子形成配合物。優(yōu)選的稀土類金屬離子包括La，Ce，Pr，Nd，Pm，Sm，Eu，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Yb，Lu，Y和Sc。優(yōu)選的放射性稀土類金屬離子包括153Sm，166Ho，90Y，149Pm，159Gd，140La，177Lu，175Yb，47Sc和142Pr。其它可令人感興趣的放射性金屬離子是47Sc，99mTc，186Re，188Re，97Ru，105Rh，109Pd，197Pt，67Cu，198Au，199Au，67Ga，68Ga，111In，113mIn，115mIn，117mSn和212Pb/212Bi。如此形成的配合物，可以連結(jié)(共價(jià)鍵合)到抗體或其片段上，用于治療和/或診斷的目的。該配合物和/或共軛物可被配制以供體內(nèi)或體外使用。配制的共軛物的優(yōu)選應(yīng)用是治療動(dòng)物體，尤其是人體內(nèi)的癌。
使用本發(fā)明的其中包括一個(gè)非放射性金屬的配合物和/或共軛物，診斷和/或治療病癥，如癌，也是可能的。這種使用是已知的，對(duì)于非放射性的金屬，用射頻可引起高溫(Jpn.KoKai ToKKyo Koho Jp 61，158，931)和熒光-免疫導(dǎo)向的治療(FIGS)〔K.Pettersson等人，Clinical Chemistry29，(1)，60-64(1983)和C.Meares等人，Acc.Chem.Res.17，202-209(1984)〕。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明公開了式(Ⅰ)的化合物 其中每個(gè)Q分別是氫或(CHR5)pCO2R;
Q1是氫或(CHR5)wCO2R;
每個(gè)R分別是氫、芐基或C1～C4烷基;
條件是Q和Q1的總和中至少兩個(gè)不是氫;
每個(gè)R5分別是氫或C1～C4烷基;
X和Y各自分別是氫或者可以與相鄰的X和Y生成另外的碳-碳鍵;
n是0或1;
m是包括0到10的整數(shù);
p＝1或2;
r＝0或1;
w＝0或1;
條件是當(dāng)X和/或Y生成另外的碳-碳鍵時(shí)，n僅是1，并且r和w的總和是0或1;
L是以共價(jià)鍵鍵合的連接基/間隔基，取代了與其相連的碳原子之一上的一個(gè)氫原子，該連接基/間隔基用下式表示
其中s是0或1的整數(shù);
t是包括0到10的整數(shù);
R1是一個(gè)親電或親核部分，其允許共價(jià)鍵合到抗體或其片段上，或者R1是一個(gè)合成的連接基，其可以連接到抗體或其片段上，或者R1是其前體;以及Cyc表示一個(gè)環(huán)脂族部分、芳族部分、脂雜環(huán)部分、或芳雜環(huán)部分，每個(gè)所說(shuō)的部分可任意地被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代，這些基團(tuán)不會(huì)干擾向抗體或抗體片段的連接。條件是當(dāng)s，t，m，r和n是0時(shí)，R1不是羧基;
或其藥學(xué)上可接受的鹽。
式(Ⅰ)化合物優(yōu)選的部分是R是氫;R5是氫或甲基;n是0;m是0到5;r是0;L是式(A)的化合物 其中R2選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合，脲氨基、硫代脲氨基、羧基、溴乙酰氨基和馬來(lái)酰亞胺組成的基團(tuán);
R3選自由C1～C4烷氧基、-OCH2CO2H、羥基和氫組成的基團(tuán);
R4選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合，脲氨基，硫代脲氨基、羧基、溴乙酰氨基和馬來(lái)酰亞胺基組成的基團(tuán);
條件是R2和R4不能兩者都是氫，但R2和R4中的一個(gè)必須是氫;
或其藥學(xué)上可接受的鹽。
當(dāng)本發(fā)明的共軛物是所需要的時(shí)，R2和R4必須不是硝基。當(dāng)R2或R4是硝基時(shí)，那么就要存在一個(gè)連接基部分(L)的前體。這個(gè)前體部分可以是任一部分，其為制備式(Ⅰ)化合物中R2或R4部分而形成，并且不連到抗體或抗體片段上。
本發(fā)明也公開了稀土類金屬離子配合物，特別是放射性中性的或帶電荷的稀土類金屬離子配合物，而且還公開了與上述的配合物和抗體或抗體片段所形成的共軛物。另外本發(fā)明也包括由本發(fā)明共軛物和藥學(xué)上可接受的載體組成的制劑，特別是藥學(xué)上可接受載體為液體的制劑。本發(fā)明也包括診斷或治療哺乳動(dòng)物體內(nèi)病癥特別是癌的方法。其方法包括將有效量的制劑施用于哺乳動(dòng)物體內(nèi)。
正如本文使用的，下面被說(shuō)明的術(shù)語(yǔ)具有這些含意對(duì)于R1，R2或R4的定義來(lái)說(shuō)，親電部分包括異硫氰酸根合、溴乙酰胺基、馬來(lái)酰亞胺基、亞氨酸酯、硫代鄰苯二甲酰亞胺、N-羥基琥珀酸酯、吡啶基二硫化物和苯基疊氮化物，但不只限于此;合適的親核部分包括羧基、氨基、酰(基)肼、脲氨基和硫代脲氨基，但不限于此;“合成的連接基”包括任一合成的有機(jī)或無(wú)機(jī)連接基，它們能共價(jià)鍵合到抗體或抗體片段上。優(yōu)選的合成連接基是可生物降解的合成連接基，其在病人血清中是穩(wěn)定的，但有可能在排除的器官內(nèi)裂解放射性同位素，例如可生物降解的肽或帶基團(tuán)的肽。親電部分的異硫氰酸鹽是優(yōu)選的，親核部分的氨基、脲氨基和硫代脲氨基是優(yōu)選的。有一點(diǎn)要合乎需要，即R1的性質(zhì)和/或位置要明顯地不干擾螯合反應(yīng)。
式(Ⅰ)中，術(shù)語(yǔ)“x-c-y”表示在相鄰碳原子之間任意存在有雙鍵和三鍵。不飽和鍵可以分別存在于包括0到10個(gè)碳原子的，如在式(Ⅰ)中用“m”術(shù)語(yǔ)所定義的鍵長(zhǎng)中。
正如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”指的是用乳腺的奶養(yǎng)育它們幼子的動(dòng)物，優(yōu)選的是溫血?jiǎng)游?，更?yōu)選的是人。“抗體”指的是任何多克隆的、單克隆的、嵌合抗體或雜抗體，優(yōu)選的是單克隆抗體;“抗體片段”包括Fab片段和F(ab′)2片段，以及具有朝著一個(gè)目的抗原決定基或多個(gè)抗原決定基特性的抗體的任何一個(gè)部分。當(dāng)用術(shù)語(yǔ)“金屬螯合物/抗體共軛物”或“共軛物”時(shí)，“抗體”部分意思是包括整個(gè)抗體和/或抗體片段，包括其半合成或遺傳工程變異體。
正如本文所使用的，“配合物”指的是本發(fā)明如式(Ⅰ)化合物與稀土類金屬離子，特別是放射性的稀土類金屬離子的配合物，其中至少一個(gè)金屬原子是螯合的或(多價(jià))螯合的;“放射性金屬離子螯合物/抗體共軛物”或“放射性金屬離子共軛物”指的是以共價(jià)鍵連接到抗體或抗體片段上的放射性金屬離子共軛物;當(dāng)“放射性”與“金屬離子”聯(lián)合使用時(shí)，指的是能放射粒子和/或光子的稀土類元素的一個(gè)或多個(gè)同位素，如153Sm，166Ho，90Y，149Pm，159Gd，140La，177Lu，175Yb，47Sc和142Pr;術(shù)語(yǔ)“雙官能配位體”、“雙官能螯合劑”和“官能化螯合”是可互換的，指的是具有能夠螯合金屬離子的螯合部分和以共價(jià)鍵連接于螯合部分的連接基/間隔基部分的化合物，該化合物可用來(lái)以共價(jià)鍵連接于抗體或抗體片段上。
正如本文所使用的，“藥學(xué)上可接受的鹽意思是無(wú)毒的，足以用于哺乳動(dòng)物的治療或診斷的式(Ⅰ)化合物的任何一種鹽。因此，根據(jù)本發(fā)明，這些鹽是有用的，即通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)，從有機(jī)的或無(wú)機(jī)酸制成的鹽。這些酸包括如硫酸，鹽酸、磷酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、乳酸、馬來(lái)酸、富馬酸、棕櫚酸、膽酸、棕櫚油酸、粘酸、谷氨酸、d-樟腦酸、戊二酸、乙醇酸、苯二甲酸、酒石酸、甲酸、月桂酸、硬脂酸、水楊酸、甲磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、安息香酸、肉桂酸和其它合適的酸。也包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)，從有機(jī)堿或無(wú)機(jī)堿，如銨、堿金屬離子、堿土金屬離子和其它類似離子制得的鹽。特別優(yōu)選的是式(Ⅰ)化合物的鉀、鈉、銨或其混合物的鹽。
當(dāng)然，式(Ⅰ)化合物的游離酸也可以使用，也可以是質(zhì)子化形式的化合物，如當(dāng)羧酸鹽被質(zhì)子化時(shí)，和/或氮原子即當(dāng)形成HCl鹽時(shí)。
優(yōu)選的式(Ⅰ)化合物包括那些其中Q1是氫，L用A式表示的化合物，如下式所示
其中每個(gè)Q分別是H或CHR5CO2R;
每個(gè)R分別是H、芐基或C1～C4烷基;條件是至少兩個(gè)Q必須不是氫;
m是包括0到5的整數(shù);
R2選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、羧基、溴乙酰胺基和馬來(lái)酰亞胺基組成的基團(tuán);
R3選自由C1～C4烷氧基、-OCH2CO2H，羥基和氫組成的基團(tuán);
R4選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合，脲氨基、硫代脲氨基、羧基、溴乙酰胺基和馬來(lái)酰亞胺基組成的基團(tuán);
每個(gè)R5分別是氫或C1～C4烷基;
條件是R2和R4不能兩者都是氫，但R2和R4中的一個(gè)必須是氫;
或其藥學(xué)上可接受的鹽。
在式(Ⅱ)中，當(dāng)R3和R4兩者都是氫時(shí)，化合物用下式表示 其中每個(gè)Q分別是氫或CHR5CO2R;
每個(gè)R分別是氫、芐基或C1～C4烷基;
條件是至少兩個(gè)Q必須不是氫;
m是包括0到5的整數(shù);
R2選自由硝基、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、羧基、溴乙酰胺基和馬來(lái)酰亞胺基組成的基團(tuán);
每個(gè)R5分別是氫或C1～C4烷基;
或其藥學(xué)上可接受的鹽。
在式(Ⅱ)中，當(dāng)R2是氫時(shí)，化合物用下式表示 其中每個(gè)Q分別是氫或CHR5CO2R;
每個(gè)R分別是氫、芐基或C1～C4烷基;
條件是至少兩個(gè)Q必須不是氫;
m是包括0到5的整數(shù);
R3選自由C1～C4烷氧基、-OCH2CO2H或羥基組成的基團(tuán);
R4選自由硝基、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、羧基、溴乙酰胺基和馬來(lái)酰亞胺基組成的基團(tuán);
每個(gè)R5分別是氫或C1～C4烷基;
或其藥學(xué)上可接受的鹽。
另外優(yōu)選的式(Ⅰ)化合物包括那些其中至少一個(gè)Q是氫的化合物，用下式表示 其中每個(gè)Q分別是氫或CHR5CO2R;
Q1是氫或(CHR5)wCO2R;
每個(gè)R分別是氫、芐基或C1～C4烷基;
條件是Q和Q1的總和中至少兩個(gè)必須不是氫，而Q中之一是氫;
m是包括0到5的整數(shù);
w是0或1;
R2選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、羧基、馬來(lái)酰亞胺基和溴乙酰胺基組成的基團(tuán);
R3選自由C1～C4烷氧基、-OCH2CO2H、羥基和氫組成的基團(tuán);
R4選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合，脲氨基、硫代脲氨基、羧基、馬來(lái)酰胺基和溴乙酰胺基組成的基團(tuán);
每個(gè)R5分別是氫或C1～C4烷基;
條件是R1和R4不能兩者都是氫，但R2和R4中的一個(gè)必須是氫;
或其藥學(xué)上可接受的鹽。
其它優(yōu)選的式(Ⅰ)化合物包括那些其中Q1是CO2R(W＝0)的化合物，用下式表示 其中每個(gè)Q分別是氫或CHR5CO2R;
每個(gè)R分別是氫、芐基或C1～C4烷基;
條件是至少一個(gè)Q必須不是氫;
m是包括0到5的整數(shù);
R2選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合，脲氨基、硫代脲氨基、羧基、馬來(lái)酰亞胺基和溴乙酰胺基組成的基團(tuán);
R3選自由C1～C4烷氧基、-OCH2CO2H、羥基和氫組成的基團(tuán);
R4選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、羧基、馬來(lái)酰亞胺基和溴乙酰胺基組成的基團(tuán);
每個(gè)R5分別是氫或C1～C4烷基;
條件是R2和R4不能兩者都是氫，但R2和R4中之一必須是氫;
或其藥學(xué)上可接受的鹽。
一些優(yōu)選的式(Ⅵ)化合物是那些其中R3和R4兩者都是氫的化合物，用下式表示 其中每個(gè)Q分別是氫或CHR5CO2R;
每個(gè)R分別是氫、芐基或C1～C4烷基;
條件是;至少一個(gè)Q必須不是氫;
m是包括0到5的整數(shù);
R2選自由硝基、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、羧基、溴乙酰胺基和馬來(lái)酰亞胺基組成的基團(tuán);
每個(gè)R5分別是氫或C1～C4烷基;
或是藥學(xué)上可接受的鹽。
其它優(yōu)選的式(Ⅵ)化合物是那些其中R2是氫的化合物，用下式表示
其中每個(gè)Q分別是氫或CHR5CO2R;
每個(gè)R分別是氫、芐基或C1～C4烷基;
條件是至少一個(gè)Q必須不是氫;
m是包括0到5的整數(shù);
R3選自由C1～C4烷氧基、-OCH2CO2H和羥基組成的基團(tuán);
R4選自由硝基、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、羧基、馬來(lái)酰亞胺基和溴乙酰胺基組成的基團(tuán);
每個(gè)R5分別是氫或C1～C4烷基;
或其藥學(xué)上可接受的鹽。
本文描述的雙官能螯合劑〔用式(Ⅰ)-(Ⅷ)中任何一個(gè)表示的〕可用于螯合或(多價(jià))螯合稀土類金屬離子，特別是放射性的稀土類金屬離子，以生成金屬離子螯合物(這里也可稱為“配合物”)。由于可官能化部分的存在〔在式(Ⅰ)中用R1表示的〕，配合物可以連到官能化的載體，如官能化的聚合載體上，或優(yōu)選地，當(dāng)式(Ⅰ)的配合物，其中的L表示式A，R2和R4必須不是硝基時(shí)，配合物可以共價(jià)連接到蛋白質(zhì)或比較特殊的抗體或抗體片段上。因此，這里所描述的配合物(用式(Ⅰ)-(Ⅷ)中任一個(gè)表示的化合物與稀土類金屬離子，特別是放射性稀土類金屬離子進(jìn)行配合的產(chǎn)物)可以共價(jià)連接到一個(gè)抗體或抗體片段上，在此稱為“共軛物”。
本文中所描述的共軛物中可使用的抗體或抗體片段能夠用已知技術(shù)制備。高特異的單克隆抗體可以用已知的雜交技術(shù)制備，參見，例如，Kohler和Milstein〔Nature256，4.95-497(1975);和Eur.J.Immunol.6511-519(1976)〕。通常這樣的抗體有高特異的反應(yīng)活性。在放射性金屬離子共軛物中，可以使用直接抗任何目的抗原或半抗原的抗體。在放射性金屬離子共軛物中所用的優(yōu)選抗體是單克隆抗體，或其對(duì)目的抗原決定基有高特異性的片段。本發(fā)明中所用的抗體可以直接抗如腫瘤、細(xì)菌、真菌、病毒、寄生物、支原菌屬、分化和其它細(xì)菌膜抗原、病原體表面抗原、毒素、酶、變應(yīng)原、藥物和任何生物學(xué)活性分子。某些抗體或抗體片段的實(shí)例是CC-11，CC-46，CC-49，CC-49F(ab′)2，CC-83，CC-83F(ab′)2和B72.3〔對(duì)于CC-49，CC-83和B72.3抗體請(qǐng)參見D.Colcher等人，Cancer Res.48，4597-4603(Aug.15，1988)〕。雜種細(xì)胞線B72.3存放在美國(guó)類型培養(yǎng)標(biāo)本(ATCC)中，登記號(hào)為HB8108。在美國(guó)專利申請(qǐng)7-073，685中，(1987.7.15申請(qǐng))公開了各種CC抗體，它們可以通過(guò)NTIS獲得。其它鼠的單克隆抗體粘在TAG-72，一種連在抗原上的腫瘤，的抗原決定基上。比較全面的抗原目錄表可在美國(guó)專利4，193，983中找到，該專利在此列為參考文獻(xiàn)。本發(fā)明的放射性金屬離子共軛物對(duì)于診斷或治療各種癌癥是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明優(yōu)選的稀土類(鑭系元素或假鑭系元素)配合物用下式表示C〔Ln(BFC)〕(Ⅸ)其中Ln是稀土金屬(鑭系元素)離子，如Ce3+，Pr3+，Nd3+，Pm3+，Sm3+，Eu3+，Gd3+，Tb3+，Dy3+，Ho3+，Er3+，Tm3+，Yb3+和Lu3+，或假鑭系元素金屬離子如Sc3+，Y3+，和La3+，BFC表示雙官能螯合劑;C表示藥學(xué)上可接受的離子或?yàn)楸ＷC整個(gè)配合物呈中性而帶有足夠電荷的離子的基團(tuán)。如果BFC含有四個(gè)或更多陰電荷部分，那么C是陽(yáng)離子或陽(yáng)離子基團(tuán)，如H+，Li+，Na+，K+，Rb+，Cs+，Mg2+，Ca2+，Sr2+，Ba2+，NH+4，N(CH3)+4，N(C2H5)+4，N(C3H7)+4，N(C4H9)+4，As(C6H5)+4，〔(C6H5)3P＝〕2N+和其它質(zhì)子化的胺。如果BFC含有三個(gè)陰電荷部分，則C是不需要的。如果BFC含有兩個(gè)陰電荷部分，則C是陰離子，如F-，Cl-，Br-，I-，ClO-4，BF-4，H2PO-4，HCO-3，HCO-2，CH3SO-3H3C-C6H4-SO-3，PF-6，CH3CO-2和B(C6H5)-4本發(fā)明的共軛物，以及在某些情況下本發(fā)明的配合物，可以用來(lái)做制劑。制劑由式(Ⅰ)化合物與抗體和/或金屬離子和生理學(xué)上可接受的載體、賦形劑或媒介物所組成。例如，制劑可由生理學(xué)上可接受的載體和配合物(金屬離子+配位體)，共軛物(金屬離子+配位體+抗體)或(配位體+抗體)組成。制備這種制劑的方法是已知的。制劑可以是懸浮液、注射液或其它合適的制劑形式?？梢允褂蒙韺W(xué)上可接受的懸浮介質(zhì)，加或不加輔助劑。
本發(fā)明的制劑是含有與配位體配合的活性放射性核素的固體或液體形式。這些制劑可以是配套形式，在使用前適當(dāng)?shù)臅r(shí)間里，將兩個(gè)成分(即配位體和金屬、配合物和抗體，或配位體/抗體和金屬)進(jìn)行混合。無(wú)論是予混合形式還是配套形式，制劑通常需要藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的可注射組合物可以是懸浮液形式或溶液形式。在制備合適的制劑時(shí)，一般將會(huì)看到鹽的水溶解性大于酸的形式。在溶液形式時(shí)，配合物(或是所需的單獨(dú)成分)被溶于生理學(xué)上可接受的載體中。這些載體包括合適的溶劑、防腐劑如芐醇，如果需要，還包括緩沖劑。有用的溶劑包括如水、含水酒精、1，2-乙二醇和膦酸脂或碳酸酯。這種含水溶液含有不大于50%(體積比)的有機(jī)溶劑。
注射懸浮液是本發(fā)明的組合物，其需要-液態(tài)懸浮介質(zhì)作為載體，可加或不加輔助劑。懸浮介質(zhì)可以是如含水聚乙烯吡咯烷酮、惰性油如植物油或高精細(xì)礦物油、或含水的羧甲基纖維素。如果必須保持配合物為懸浮液形式，則可以從增稠劑如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和藻酸鹽中選擇合適的生理學(xué)可接受的輔助劑。很多表面活性劑可用作懸浮劑，如卵磷脂、烷基酚、聚環(huán)氧乙烷加合物、萘磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽和聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯。
在個(gè)別情況下，許多影響液體懸浮介質(zhì)的親水性、密度和表面張力的物質(zhì)會(huì)有助于注射懸浮液的制備，例如(聚)硅氧烷消泡劑、山梨糖醇和糖都是有用的懸浮劑。
“有效量”的制劑被用于治療。劑量將根據(jù)被治療的疾病而改變。雖然可用本發(fā)明制劑進(jìn)行體外診斷，但也期望著用本發(fā)明制劑進(jìn)行體內(nèi)診斷。本發(fā)明的共軛物和制劑也可以用于放射免疫導(dǎo)向外科(RIGS);然而，能用于此目的的其它金屬也包括99mTc，111In，113mIn，67Ga和68Ga。
本發(fā)明的一些螯合劑的其它應(yīng)用，可包括磁共振成像，例如，式(Ⅰ)的配合物，特別是式(Ⅵ)的配合物，與Gd+3一起為各種目的，如作為診斷試劑，連到聚合物載體上，然后通過(guò)選擇性提取方式除去鑭系元素金屬或假鑭系元素金屬離子。
本發(fā)明提供了螯合劑、配合物和抗體共軛物，與已知技術(shù)相比，其中一些具有較好的穩(wěn)定性、和/或改善了的生物分布、和/或能更迅速地從體內(nèi)排除。
一種合理的、一般的合成式(Ⅰ)所示的本發(fā)明近似12大環(huán)的雙官能螯合劑的方法，包括用一適當(dāng)?shù)挠H電試劑(例如任何適當(dāng)取代的α-鹵代羧酸酯)使大環(huán)游離堿(例如1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷)僅在一個(gè)氮原子上進(jìn)行單官能化反應(yīng)。這個(gè)親電試劑必須具有適當(dāng)?shù)倪B接基部分或被適當(dāng)保護(hù)的連接基部分，該部分要允許雙官能配位體共價(jià)連接到蛋白質(zhì)、抗體或抗體片段上。
從現(xiàn)有技術(shù)中已認(rèn)識(shí)到用來(lái)制備單一N-官能的多氮雜大環(huán)的烷基化技術(shù)，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品難以分離的混合物〔T.Kaden，Top.Curr.Chem.121，157-75(1984)〕。這個(gè)問(wèn)題通過(guò)已報(bào)導(dǎo)的方法，即使用大量過(guò)量的大環(huán)堿(相當(dāng)于親電試劑的5～10當(dāng)量)已被克服。過(guò)量的大環(huán)堿有助于單烷基化加合物的生成〔M.Studer和T.A.Kaden，Helv.Chim.Acta69，2081-86(1986);E.Kimura等人，J.Chem.Soc.Chem.Commun 1158-59(1986)〕。
生成單一N-官能的多氮雜大環(huán)的其它路線包括過(guò)長(zhǎng)的保護(hù)、官能化作用和脫保護(hù)步驟〔P.S.Pallavicini等人，J.Amer.Chem.Soc.109，5139-44(1987);M.F.Tweedle等人，Eur.Pub.Pat.Appln.No.0232-751〕。一個(gè)關(guān)于取代的苯基丙酮酸和胺的還原胺化作用的最近的報(bào)導(dǎo)，已由Abbott Labs發(fā)表，是最近的一次會(huì)議的摘要(D.K.Johnson等人，F(xiàn)lorida Conf.on Chem.in Biotechnology，April 26-29(1988)，Palm Coast，F(xiàn)L)。一種制備單一N-烷基化的多氮雜大環(huán)的方法被公開在序號(hào)為289，163，由W.J.Kr per，于1988，12，22申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)中。該方法是通過(guò)使用一種親電試劑與大約1至5當(dāng)量之間的適當(dāng)?shù)拇蟓h(huán)在一溶劑中進(jìn)行反應(yīng)，該溶劑將不促進(jìn)質(zhì)子的轉(zhuǎn)移。該公開內(nèi)容特提出作為參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明螯合物的一般合成路線已公開在后面的合成路線Ⅰ-Ⅳ中，包括適當(dāng)?shù)挠H電試劑與多氮雜大環(huán)在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中的反應(yīng)。適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑的例子是任何有助于溶解性的碳?xì)浠衔?，如乙腈、異丙醇、二氯甲烷、甲苯、氯仿、n-丁醇、四氯化碳、四氫呋喃、5%乙醇氯仿溶液，其中最好的是氯仿、二氯甲烷、n-丁醇、1，4-二惡烷和乙腈。各種化學(xué)計(jì)量的反應(yīng)物、溫度和濃度都可以使用?？梢允褂没瘜W(xué)計(jì)量差不多的大環(huán)和親電試劑，并以一步反應(yīng)生成相應(yīng)的單-N-烷基化產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度范圍從大約0℃到大約回流溫度，最好從0℃到25℃。反應(yīng)的時(shí)間是直到徹底完成大約1到24小時(shí)。
為了合成路線Ⅱ到Ⅳ的總的活力，一般需要利用取代的α-鹵酸酯。一個(gè)合適的途徑包括發(fā)生在酰鹵位上的溴化作用或氯化作用，例如，D.N.Harpp等人，J.Org.Chem.40，3420-27(1975)。這個(gè)途徑考慮到了鏈烷酸的全部α鹵化作用，甚至這個(gè)酸含有反應(yīng)活性的芐基基團(tuán)。對(duì)于取代的酰基鹵的一般方法，包括了有機(jī)酸與亞硫酰氯或硫酰氯的反應(yīng)，例如，E.Schwenk等人，J.Amer.Chem.Soc.70，3626-27(1944)。兩個(gè)方法都使用游離羧酸，它們?？蓮纳痰曩I到。
多氮雜大環(huán)，如1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷，可以用文獻(xiàn)中的方法制得，如T.J.Atkins等人，J.Amer.Chem.Soc.96，2268-70(1974)和T.J.Richman等人，Org.Synthesis 58，86-98(1978)。
單-N-官能的大環(huán)的羧甲基化作用，可以用溴乙酸衍生物和適當(dāng)?shù)膲A通過(guò)Desreux方法進(jìn)行〔J.F.Desreux，Inorg.Chem.19，1319-24(1980)〕。
所有制備本發(fā)明化合物所需要的起始原料，或者從商店中購(gòu)買，或是從已知文獻(xiàn)敘述的方法制得。
在下面的路線Ⅰ中，制備了Q1是氫的式(Ⅰ)化合物。雖然圖示僅說(shuō)明了一個(gè)化合物，但式(Ⅰ)中Q1是氫，r＝0或1，n＝0或1，及m＝0到10的其它類似部分也可以用這種方法制得。

在下述路線Ⅱ中，制備了Q1是氫的式(Ⅰ)化合物。雖然圖示僅說(shuō)明了一個(gè)化合物，但式(Ⅰ)中Q1是氫、r＝0或1，n＝0或1，及m＝0到10的其它類似部分也可以用這種方法制得。
路線Ⅱ
在下面的路線Ⅲ中，制備了Q1是CO2R的式(Ⅰ)化合物。雖然圖示僅說(shuō)明了一個(gè)化合物，但式(Ⅰ)中Q1是CO2R，包括m＝0到10，n＝0或1，及r＝0的其它類似部分也可以用這個(gè)方法制得。
路線Ⅲ
在下面的路線Ⅳ中，制備了Q1是(CHR5)wCO2R的式(Ⅰ)化合物。雖然圖示僅說(shuō)明了一個(gè)化合物，但式(Ⅰ)中，Q1是(CHR5)wCO2R，包括m＝0到10，n＝0或1，及r＝0的其它類似部分也可以用這個(gè)方法制得。
使用一種旋光活性的烷基化試劑能使非對(duì)映體減至最小，并簡(jiǎn)化了合成步驟。為了放射螯合作用及抗體共軛作用，需要分離出單一的能生成單一的、易純化的鑭系元素配合物的非對(duì)映體。
路線Ⅳ
在下面的路線Ⅴ中，制備了Q1是氫或(CHR5)wCO2R和R2是氫的式(Ⅰ)化合物。雖然圖示僅說(shuō)明了兩個(gè)化合物，但式(Ⅰ)中Q1是氫或(CHR5)wCO2R，Q是氫或(CHR5)pCO2R，r＝0或1，n＝0或1，w＝0或1，m＝0到10，p＝1或2，L表示式A，其中R3定義如前，R2和R4選自由氫、氨基、硝基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、馬來(lái)酰亞胺基、溴乙酰胺基和羧基組成的基團(tuán)的其它類似部分也可以用這個(gè)方法制得。
路線Ⅴ
親電試劑部分(式中的“R1”)也可以用現(xiàn)有技術(shù)中已知方法加以制備。這種方法可以在Acc.Chem.Res.17，202-209(1984)中找到。能夠制備其中R1是異硫氰酸根合部分(當(dāng)L＝式A時(shí)，R2或R4是異硫氰酸根合)的式(Ⅰ)化合物的方法，包括氨基螯合物(當(dāng)L＝式A時(shí)，R2或R4是氨基)與硫光氣反應(yīng)，該方法公開在序號(hào)為289，172，由M.J.Fazio等人于1988，12，23申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)中。該公開內(nèi)容特引為參考文獻(xiàn)。
放射性核素可以用幾種方法制備，在一核反應(yīng)器中，用中子轟擊一核素得到一放射性核素，例如Sm-152+中子→Sm-153+γ獲得放射性核素的另一個(gè)方法，是在一線性加速器或回旋加速器中，用粒子轟擊核素。此外還有另一種方法是從裂變產(chǎn)物的混合物中離析出放射性核素。獲得本發(fā)明中所用的核素的方法不是很嚴(yán)格的。
制備本發(fā)明的共軛物的方法是，首先形成配合物，然后與抗體或抗體片段連接。這樣，該方法包括制備或獲得配位體、形成與金屬的配合物，然后加到抗體上。另一方面，制備標(biāo)記的抗體共軛物的方法包括，首先將BFC共軛到抗體上，然后螯合，生成放射性核素-BFC標(biāo)記的Ab。生成本發(fā)明共軛形式的任何適當(dāng)方法，是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在下列實(shí)施例中，使用下列術(shù)語(yǔ)和條件，除非另有說(shuō)明。
一般實(shí)驗(yàn)質(zhì)鐠是用Finnigan TSQ質(zhì)鐠儀(Q′MS型)或VGEAB-MS高分辯質(zhì)鐠儀(用氙做快速原子轟擊，使用3∶1二硫蘇糖醇∶二硫赤蘚糖醇)做的。
1H和13C NMR譜圖是用Varian VXR-300，Bruker APC300，IBM/BruKer NR-80或JeolFx400分光計(jì)做的。所用譜圖均在30℃下做的，除非另有說(shuō)明。1H NMR是在300MHz，80MHz或400MHz(分別對(duì)應(yīng)于上面所列儀器)下做的。13C NMR是在75MHz，20MHz或100MHz(分別對(duì)應(yīng)于上面所列儀器)下做的。NMR的值為δ，此值相對(duì)于TMS(四甲基硅)或當(dāng)D2O為溶劑時(shí)相對(duì)于DSS(2，2-二甲基-2-硅雜戊烷-5-磺酸，鈉鹽)。
紅外光譜(IR)是用Nicolet 5SX FT/IR儀做的。
用于色譜法的大多數(shù)溶劑為Fisher HPLC級(jí)原料。乙酸銨是從Aldrich購(gòu)買的。用Barnstead NANO PureTM水過(guò)濾裝置提純水。有機(jī)化合物的制備色譜法既可通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)方法的標(biāo)準(zhǔn)重力色譜法，也可通過(guò)由C.W.Still等，J.org.Chem.43，2923-24(1978)所描述的閃色譜法來(lái)完成。使用下列溶劑體系溶劑體系組分1 CHCl3:CH3OH:濃縮的NH4OH2:2:1V:V:V2 CHCl3:CH3OH:濃縮的NH4OH12:4:1V:V:V.
3 CHCl3:CH3OH:濃縮的NH4OH16:4:1V:V:V4 CHCl3:CH3OH:濃縮的NH4OH4:2:1V:V:V5 CHCl3:CH3OH:濃縮的NH4OH3:2:1V:V:V6 CHCl3:CH3OH:濃縮的NH4OH7:3:1V:V:V7鹽水(0.85%的NaCl蒸餾水溶液):濃縮的NH4OH4:1V:V8 CHCl3:CH3OH:濃縮的NH4OH4:4:1V:V:V業(yè)已報(bào)導(dǎo)，使用這些溶劑體系的Rf值和工業(yè)上另得的、正相、二氧化硅TLC板〔GHLF250微米，Analtech Inc.或Merck Kiesel凝膠60F254〕。使用Merck級(jí)60，即60 硅膠做制備柱色譜。
所有百分比均為重量百分比，除非另有說(shuō)明。
用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器(Buchi 461)和/或真空干燥箱在溫度大約為55-60℃下將一些固體干燥幾小時(shí)。此外，用Virtis型10-010自動(dòng)冷凍干燥機(jī)或Speed Vac TM濃縮機(jī)去溶劑。
釤-153和镥-177由Research Reactor，Missouri大學(xué)(Columbia，MO)生產(chǎn)。鐿-90從OaK Ridgo National Laboratory購(gòu)買。
通過(guò)改進(jìn)M.W.Brechbiel等，Inog.Chem.25，2772-2781(1986)的方法制備1-(4-異硫氰酸根合芐基)二亞乙基三胺-五乙酸(ScN-Bz-DTPA)，并在陰離子交換HPLC(Q-SepharoseTM)提純得到單一物種。所使用的一些化學(xué)物質(zhì)從指定的來(lái)源得到從Behring Diagnostics(La Jolla CA)購(gòu)買N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES)，游離酸和鈉鹽;從Fisher Scientfic購(gòu)買檸檬酸鈉(經(jīng)檢定);從Aldrich Chemicals購(gòu)買硫光氣;從Sigma Diagnostics購(gòu)買乙酸銨，乙酸鈉，乙二胺四乙酸(EDTA)和緩沖鹽水的磷酸鹽(PBS)。
所使用的HPLC柱為Hand-Packed Q-SepharoseTM(Pharmacia)1.5cm×25cm或2.5cm×25cm;從Du Pont Instruments購(gòu)買的ZorbaxTMBIO Series GF-250(9.4mm×25cm);從Separation Group(Hesperia，CA)購(gòu)買的VydacTM(Separations Group，Hesperia，CA的商標(biāo))蛋白質(zhì)C-4(4.6mm×25cm);從Pharmacia購(gòu)買的Mono-QTM和SP-SephadexTM(Pharmacia Biotechnology Products的商品名)。從Waters Associates(Milford，MA)購(gòu)買Sep-PakTM(Waters Associates的商品名)C-18過(guò)濾器從Isolab Inc.(AKron，OH)購(gòu)買SephadexTMG-25易處理的(2.2mt)從Amicon購(gòu)買CentriconTM-30(Amicon Division，W.R.Grace & Co.，Danrers，MA的商品名)微型濃縮機(jī)。
五個(gè)HPLC裝置用于分析和試樣的分離裝置Ⅰ由LKB2150泵，2152控制器，UV檢測(cè)器-LKB2238UV電線(Cord)，Berthold LB506A HPLC放射監(jiān)測(cè)器(International Berthold Group的產(chǎn)品)和Gilson餾分收集器201-202(Gilson International，Middleton，WI)所組成。
裝置Ⅱ裝備有自動(dòng)取樣器。WISP710B，兩個(gè)泵(510型)，自動(dòng)梯度控制器(Water Associates的產(chǎn)品)，Perkin-Elmer LC-75分光光度檢測(cè)器，Beckman型170放射性同位素檢測(cè)器和餾分收集器(Pharmacia的Frac100);
裝置Ⅲ由有一個(gè)Water660溶劑程序器的兩個(gè)Water M-6000A泵，Waters型481可變波長(zhǎng)檢測(cè)器和Waters數(shù)據(jù)模件所組成，也可使用準(zhǔn)備的ISCO餾分收集器;
裝置Ⅳ為裝備有可變波長(zhǎng)UV檢測(cè)器的Dionex BioLCTM裝置;和裝置Ⅴ帶有ISCO型2360梯度程序器的Water型590泵和Dionex可變波長(zhǎng)檢測(cè)器。
Sorvall RT6000B(Du Pont的致冷式離心機(jī))用于離心分離和濃縮，Speed Vac濃縮機(jī)(Savant Instruments Inc.，Hicksville，N.Y)用于除去揮發(fā)性溶劑。用CapintecTM放射性同位素校準(zhǔn)器(Capintec Inc.的商標(biāo))CRC-12，或通過(guò)Beckman Ls 9800(Beckman Instrument，Inc.，Irvine，CA)的液體閃爍，或用接觸面有3英寸厚的鉈漂移的碘化鈉完好晶體的(Canberra 35+)多通道分析儀進(jìn)行放射性測(cè)量。
在涉及配合物形式的實(shí)施例中，通過(guò)下面所指定的一般方法確定配合物的百分比。
通過(guò)陽(yáng)離子交換確定配合物的百分比用在水中溶脹的SP-SephadexTMC-25樹脂1至2ml裝填在10ml塑料柱。通過(guò)在柱頂部施加壓力除去過(guò)量的水。將試驗(yàn)溶液(15μl)加至樹脂頂部，然后用2ml4∶1(V∶V)等滲鹽水濃縮的NH4OH作為洗脫液。將洗脫液收集至計(jì)數(shù)管中。使用另外2ml洗脫液。在洗脫液收集至第二計(jì)數(shù)管后，在樹脂頂部施加空氣壓力使其干燥。將干燥過(guò)的樹脂轉(zhuǎn)至第三個(gè)計(jì)數(shù)管。用連接在Canberra多通道分析儀上的完好的NaⅠ計(jì)數(shù)器測(cè)量每個(gè)計(jì)數(shù)管的活性。作為配合物的金屬量用作在洗脫液中發(fā)現(xiàn)的總活性的百分率，在自由未配合狀態(tài)下的金屬量用作保留在樹脂中的總金屬的百分率。
通過(guò)離子交換除去未配合的金屬用0.5ml在水中溶脹的SP-SephadexTMC-25樹脂裝填在10ml塑料柱。將該柱在3，000rpm下離心4分鐘除去過(guò)量的水。將200-500μl體積的配合物溶液置于樹脂頂部，再將該管子在3，000rpm下離心4分鐘。未配合的金屬殘留在柱中，配合的金屬用溶劑洗脫。
釔配合物的制備通過(guò)制備3×10-4M釔水溶液(YCl3·6H2O，303.26g/mole;或Y(OAC)3，12.1%H2O)來(lái)制備配合物。加入放射性Y3+溶液(Oakridge National Laboratories)獲得所需的放射性水平。將10μl配位體溶液(為0.03M)加到990μl Y3+溶液中，得到配位體金屬的摩爾比為1∶1。為使配位體與金屬之比為10∶1，需使用10倍的配位體溶液的量。用幾微升的HCl或NaOH調(diào)節(jié)PH至7.4。然后用上面所給的陽(yáng)離子交換方法測(cè)驗(yàn)溶液的配合釔的量。
釤配合物的制備除了通過(guò)將Sm2O3(348.7g/mol溶于0.1M HCl中制備3×10-4M釤外，用上述釔配合物的制備方法制備釤配合物。以大約3×10-4M的0.1M HCl溶液的放射性Sm-153是從Missouri大學(xué)，Research Reactor，Columbia，Missouri得到的。
用于全文的一些術(shù)語(yǔ)定義如下。
術(shù)語(yǔ)匯編Conc.為濃縮的;
-OAC為乙酸根部分，-OCOCH3TLC為薄層色譜;
DIH2O為去離子NANO PureTM水;
NANO PureTM水為由Barnstead NANO PureTM水過(guò)濾裝置得到的純凈水;
環(huán)境溫度為室溫或大約20至大約25℃;
過(guò)夜為大約9至18小時(shí);
LC為液相色譜;
NBS為N-溴丁二酰亞胺;
MES為2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸;
HPLC為高性能液相色譜;
PBS為從Sigma購(gòu)買的用鹽水緩沖的磷酸鹽，含有120mM NaCl，2.7mM KCl和10mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4;
SP-SephadexTMC-25樹脂為有磺酸官能度的陽(yáng)離子交換樹脂，由Pharmacia.Inc.出售;
rpm＝每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)PD為氫氘化的PH;
DOTA＝1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸;
HEPES＝N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸;
BFC＝雙官能螯合劑;
CyCLen＝1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷;
PA-DOTA＝α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸;
PA-DOTMA＝α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸-4，7，10-三(甲基乙酸)BA-DOTA＝α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸;
OMe-BA-DOTA＝α-(5-氨基-2-甲氧苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸;
EA-DO3A＝1-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸;
DTPA＝二亞乙基三胺五乙酸;
SCN-Bz-DTPA＝1-(4-異硫氰酸根合芐基)二亞乙基三胺五乙酸;
EDTA＝乙二胺四乙酸;
螯合劑相當(dāng)于配位體;
配合物相當(dāng)于螯合物，例如;螯合劑連在合適的金屬離子上。
共軛意為螯合劑或配合物共價(jià)地連接在抗體或抗體的片段上;和抗體為CC-49，CC-83和B72.3和它們的片段如Fab和F(ab′)2。在上文中已給出了其它抗體。hybridom 細(xì)胞系B72.3保藏于American Type Culture Collection，入藏號(hào)為ATCC HB8108，其它稱為鼠科無(wú)性系的抗體結(jié)合在TAG-72抗原決定部位，與抗原有關(guān)腫瘤上。
通過(guò)下列大量實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，這些實(shí)施例僅為使用本發(fā)明的典型例子。
起始原料的制備實(shí)施例Ad，1-2-溴-4-(4-硝基苯基)-丁酸，甲酯的制備通氮?dú)庀聦?0.46g(0.05mol)的4-(4-硝基苯基)丁酸加到5ml四氯化碳和15ml(0.2mol)亞硫酰氯的溶液中。將溶液回流1小時(shí)開始有氯化氫氣體和二氧化硫氣體釋出。將溶于25ml四氯化碳和三滴48%溴化氫水溶液催化劑中的11.0g(0.06mol)N-溴丁二酰亞胺加到熱溶液中，注意溴氣的釋出，將深紅色溶液回流35分鐘，冷卻溶液，然后在攪拌下將溶液倒入100ml甲醇中。TLC分析(60∶40乙酸乙酯∶己烷V∶V)表明為新產(chǎn)物(Rf＝0.69，二氧化硅板)。用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器除去過(guò)量的溶劑，用二氯甲烷作洗脫劑通過(guò)閃硅膠墊板(1英吋×5英吋)過(guò)濾深紅色油液。蒸發(fā)溶劑得到清亮的油液，產(chǎn)量為15.43g，它為標(biāo)題產(chǎn)物∶起始丁酸衍生物的甲酯為85∶15的混合物。標(biāo)題產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(CDCl3)8.16(d)，7.38(d)，4.20(dd)，3.79(S)，2.88(m)，2.38(m);
13C NMR(CDCl3，75MHz)169.6，147.5，129.3，123.7，53.0，44.4，35.5，33.0。
實(shí)施例Bα-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-乙酸，1-甲酯的制備在通氮?dú)獠嚢柘拢谖宸昼妰?nèi)將2.07g(5.82mmol)d，1-2-溴-4-(4-硝基苯基)丁酸，甲酯(由實(shí)施例A的方法制備)加到攪拌的1.72g(10.0mmol)的1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的17ml用氯仿穩(wěn)定的戊烯溶液中。在大約25℃下將反應(yīng)混合物攪拌48小時(shí)。TLC(使用溶劑體系2，在Analtech硅膠板上)表明形成了標(biāo)題產(chǎn)物(Rf＝0.73)。將黃色氯仿溶液加至1英吋×16英吋閃色譜硅膠柱(用5%甲醇的氯仿溶液預(yù)洗脫)中，用250ml5%甲醇的氯仿溶液洗脫，接著用溶劑體系2洗脫。合并含有純標(biāo)題產(chǎn)物的餾分，蒸發(fā)得到2.15g(5.46mmol，94%)標(biāo)題產(chǎn)物，為淡黃色玻璃狀。用乙醚研制這種玻璃狀物的氯仿溶液得到分析純的白色粉末沉淀(mp＝156-159℃)，其結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(CDCl3)δ.14(d)，7.39(d)，3.71(s)，3.39(dd)，2.5-3.0(m)，2.08(m)，2.01(m);
13C NMR(CDCl3，75MHz)172.7，149.3，146.4，129.2，123.6，62.3，51.2，48.9，47.2，45.8，45.4，32.8，30.9。
實(shí)施例C2-溴-2-(4-硝基苯基)乙酸，甲酯的制備在通氮?dú)庀聦?duì)硝基苯乙酸(25.0g，0.14mol)和溶于無(wú)水苯(100ml)的亞硫酰氯(15.1ml，0.21mol)的混合物回流攪拌三小時(shí)。然后在真空下將混合物蒸發(fā)干燥。將殘余物溶于四氯化碳中并通氮?dú)饣亓鲾嚢?。在三天時(shí)間內(nèi)分小批加入溴(7.2ml，0.14mol)并回流混合物。冷卻反應(yīng)混合物并用甲醇(50ml，慢慢加入)驟冷?；?。通過(guò)用玻璃單環(huán)的六英吋柱減壓(BP＝168℃，在1.1mm下)蒸餾回收所得到的溴酯(27g，71%)，為黃色油狀物。標(biāo)題產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)由下列數(shù)據(jù)所證實(shí)1H NMR(COCl3)8.25(d)，7.81(d)，5.51(s)，3.86(s)。
實(shí)施例Dα-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸，1-甲酯的制備將含有能形成完全溶液的剛好足量的甲醇的354mg(2.068mmol)的1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的20ml乙腈溶液，一起加到529mg(2.068mmol)2-溴-2-(4-硝基苯基)乙酸，甲酯(由實(shí)施例C的方法制備)的20ml乙腈溶液中。將所得的粉紅色溶液攪拌1.5小時(shí)，然后在真空下于35℃將溶液濃縮至少體積。用硅膠色譜以20%(wt/v)NH4OAC/CH3OH洗脫純化粗的單酯四胺。純化過(guò)的單酯四胺以三乙酸鹽離析出來(lái)，然后轉(zhuǎn)化為自由胺。270mg的3ml水溶液在0℃用K2CO3水溶液(10%wt/wt)調(diào)PH為11。然后以10ml×5氯仿萃取該堿性溶液，合并氯仿層，然后用硫酸鈉干燥，濃縮得到160mg(產(chǎn)率42%)所要的單酯四胺，其結(jié)構(gòu)特征由NMR和快速原子轟擊質(zhì)譜(〔M+H〕+＝366)確證，和結(jié)構(gòu)特征是1H NMR(CDCl3)8.12(d)，7.44(d)，4.75(s)，3.76(s)，2.67-2.44(M);
13CNMR(CDCl3)171.5，147.6，144.0，130.0，124.0，67.0，49.8，47.9，46.0，46.9。
實(shí)施例EN-(2-甲氧基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的制備將含有2.1克2-甲氧基-5-硝基芐基溴(8.5mmol)的氯仿溶液(20ml)一次加到攪拌的含有2.9克1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(16.8mmol)的氯仿溶液(20ml)中。室溫?cái)嚢?小時(shí)后過(guò)濾反應(yīng)混合物，真空濃縮濾液，得到的殘余物進(jìn)行色譜分離(硅膠，溶劑體系3)。分離得到單烷基化產(chǎn)物，產(chǎn)率為79%(MP＝154-156℃)，和其結(jié)構(gòu)特征為13C NMR(CDCl3)162.47，140.63，127.92，125.49，124.53，109.91，55.88，53.25，50.90，47.18，45.45，45.29。
實(shí)施例FN-(2-羥基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的制備將2-羥基-5-硝基芐基溴(1.2g，7mmol)的二惡烷溶液(15ml)在連續(xù)攪拌下一次加到1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(2.3g，14mmol)的1，4-二惡烷溶液(20ml)中。在幾分鐘后，加入K2CO3(1g)并在室溫下連續(xù)攪拌1小時(shí)。然后過(guò)濾反應(yīng)混合物，真空濃縮濾液，得到的黃色半固體進(jìn)行硅膠柱色譜分離，用溶劑體系5洗脫。從也含有未反應(yīng)胺的僅余最后1/3亮黃色洗脫液中分離出所要的單烷基化產(chǎn)物。液縮后，用CHCl3(100ml)研制黃色油液，過(guò)濾除去起始原料CHCl3可溶性胺。然后分離出純的最終產(chǎn)物，為黃色固體(1.2g，55%);(MP＝142-145℃)，其進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)特征為13C NMR(D2O)25.04，25.28，26.83，31.80，36.54，101.88，107.22，110.92，111.80，115.26，159.99。
實(shí)施例G1-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的制備將4.00g(17.4mmol)1-(2-溴乙基)-4-硝基苯在通氮?dú)鈩×覕嚢柘掠?分鐘內(nèi)滴加到攪拌的3.50克(20.3mmol)1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的50ml用穩(wěn)定氯仿的戊烯溶液中。
在室溫下(大約25℃)繼續(xù)攪拌大約18小時(shí)，從溶液中沉淀出溴氫化胺晶體。將全部的反應(yīng)混合物加至閃色譜硅膠柱(1英吋×18英吋)中，用5%甲醇的氯仿溶液預(yù)洗脫;用200ml該溶液洗脫，接著用溶劑體系3洗脫。從所要的產(chǎn)物中分離出1.45g(9.7mmol)對(duì)硝基苯乙烯(Rf＝0.98;溶劑體系1)。然后分離出所要的單官能標(biāo)題產(chǎn)物(2.27g，7.06mmol，40.6%)，為橙黃色油液，存放則凝固(Rf＝0.73，溶劑體系1)。
從CHCl3/環(huán)己烷中再結(jié)晶標(biāo)題產(chǎn)物的試樣，表明其結(jié)構(gòu)特征如下MP＝146.5-148.5℃;
1H NMR(CDCl3)8.135(d，m)，7.395(d，m)，2.91(t)，2.77(t)，2.72(t)，2.50(t)，2.60(s);
13C NMR (CDCl3，75MHz)148.5，146.7，129.6，123.4，55.5，51.4，46.9，45.9，45.1，33.7。
實(shí)施例H1-(4-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的制備將3.5克(20.3mmol)1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷和1.7g(7.87mmol)對(duì)硝基芐基溴加到50ml氯仿中，在25℃下通氮?dú)鈹嚢杌旌衔?4小時(shí)。然后將溴氫化物的鹽的氯仿淤漿加至1英吋×17英吋的閃色譜硅膠柱中(溶劑體系3)。分離得到2.13g(6.93mmol)的標(biāo)題產(chǎn)物，為分析純的淡黃色固體，產(chǎn)率為88%(Rf＝0.58，溶劑體系3)，
MP＝128-129℃，其進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(CDCl3)8.19(d)，7.49(d)，3.69(s)，2.82(t)，2.70(t)，2.59(m);
13C NMR(CDCl3，73MHz)147.2，128.4，123.8，58.8，51.7，47.1，46.3，45.1。
(為了避免與后面的生物實(shí)施例號(hào)混淆，沒有實(shí)施例Ⅰ)實(shí)施例J1-(4-氨基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的制備將690mg(2.25mmol)的1-(4-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(由實(shí)施例H的方法制備)溶于10ml甲醇中。在該溶液中加入350mg10%鈀的碳催化劑。在25℃下用過(guò)量的氫氣吹洗該溶液。在45分鐘內(nèi)TLC表明已制備了標(biāo)題產(chǎn)物(Rf＝0.33，溶劑體系3)。用1英吋×16英吋閃色譜硅膠柱(溶劑體系3)進(jìn)行形成的標(biāo)題產(chǎn)物的色譜純化，得到480mg(77%)的標(biāo)題產(chǎn)物，為淡黃色清亮油液。
用無(wú)水氯化氫鼓泡通入游離堿的乙醇溶液從而將標(biāo)題產(chǎn)物的游離堿(103mg，0.37mmol)轉(zhuǎn)化為鹽酸化物鹽，所得的標(biāo)題產(chǎn)物的四鹽酸化物鹽，在用冷的乙醇洗滌和真空干燥后，得到產(chǎn)量為147mg(0.347mmol)，MP＝255-260℃(del)，其結(jié)構(gòu)特征為1H(D2O，PD＝1.9)
7.56(d)，7.47(d)，3.95(s)，3.28(t)，3.23(t)，3.09(t)，2.96(t);
13C NMR(D2O，PD＝1.9，75MHz)138.3，134.2，132.2，126.0，58.5，50.3，46.7，44.6，44.3。
實(shí)施例K2-甲氧基-5-硝基芐基腈的制備將2-甲氧基-5-硝基芐基溴(25g，101.6mmol)的乙醇(15ml)熱溶液在攪拌下分小批于70℃下加到氰化鈉(6g，121.9mmol)水溶液(5.3ml)中。然后將反應(yīng)混合物回流1.5小時(shí)，冷卻并過(guò)濾。濾餅用乙腈洗滌，真空蒸發(fā)濾液得2-甲氧基-5-硝基芐基腈(19.5g，100%)，為棕黃色固體。產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征為13C NMR(CDCl3)161.4，141.0，125.7，124.6，119.8，116.5，110.2，56.3，18.8。
實(shí)施例L2-甲氧基-5-硝基苯乙酸的制備將2-甲氧基-5-硝基芐基腈(19.5g)(由實(shí)施例K的方法制備)的濃鹽酸(20ml)的漿液回流3小時(shí)。冷卻后，過(guò)濾得到粗產(chǎn)物并用水洗滌。將固體溶于熱氫氧化鈉水溶液中并趁熱過(guò)濾。將此橙紅溶液冷卻并用鹽酸酸化。過(guò)濾沉淀，并用水洗，干燥得到2-甲氧基-5-硝基苯乙酸，為白色固體(15g，70%)。產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征為
13C NMR(CDCl3-CD3OD)172.8，162.5，140.7，126.2，124.7，124.1，109.7，55.8，35.0。
實(shí)施例Mα-溴-(2-甲氧基-5-硝基苯基)乙酸，甲酯的制備將亞硫酰氯(4.0ml，54.8mmol)加到2-甲氧基-5-硝基苯乙酸(2.266g，10.74mmol)(按實(shí)施例L的方法制備)的無(wú)水苯(50ml)漿液中。在燒瓶上裝置干燥管和冷凝器，將混合物回流2小時(shí)。將得到的黃色溶液真空濃縮至小體積，然后溶于無(wú)水四氯化碳中。加入溴(0.6ml，11.6mmol)，溶液在隔絕空氣濕度的條件下回流二天。反應(yīng)混合物濃縮至小體積，加入(50ml)甲醇。真空蒸發(fā)過(guò)量甲醇后得到的油滴用色譜法提純(硅膠，二氯甲烷-己烷4∶1)。得到標(biāo)題產(chǎn)物(2.339g，74%)，為黃色油液。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(CDCl3)8.45(dd)，8.15(dd)，6.95(d)，5.75(s)，3.99(s)，3.78(s)。
實(shí)施例Nα-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷，1-乙酸，甲酯將α-溴(2-甲氧基-5-硝基苯基)-乙酸(2.399g，7.89mmol)(按實(shí)施例M的方法制備)的氯仿(10ml)溶液加到攪拌的1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(2.72g，15.79mmol)的氯仿(50ml)溶液中。室溫下攪拌混合物2小時(shí)。然后將混濁的混合物在室溫下真空濃縮至小體積。通過(guò)色譜法(硅膠，溶劑體系3)提純粗產(chǎn)物，得到標(biāo)題化合物，為黃色固體(2.60g，83%)。其結(jié)構(gòu)特征為13C NMR(CDCl3)170.7，161.6，139.9，125.0，124.5，124.2，110.2，59.5，55.5，50.5，48.0，47.3，45.6，44.3，43.5實(shí)施例Od，1-2-溴-4-(4-硝基苯基)-丁酸異丙酯的制備使用Harpp等，J.Org.Chem 40，3420-27(1975)的方法，通氮?dú)鈱?-(4-硝基苯基)丁酸(21.0g，0.10mol)加到四氯化碳(10ml)和亞硫酰氯(30ml，0.4mol)的溶液中。將溶液回流1小時(shí)開始有氯化氫和二氧化硫迅速釋出。此時(shí)，加入N-溴丁二酰亞胺(22.0g，0.12mol)的四氯化碳(50ml)溶液，并將8滴48%溴化氫水溶液催化劑加到熱溶液中，注意溴的釋出，將此深紅色溶液再回流35分鐘。將溶液冷卻并在攪拌下倒至異丙醇(400ml)中。TLC分析(二氯甲烷，硅膠板)表明為新產(chǎn)物(Rf＝0.73)。除去過(guò)量溶劑，使用二氯甲烷作洗脫液用閃色譜硅膠墊板(3英吋×6英吋)過(guò)濾深紅色油液。真空下除去溶劑，將淡黃色液加至快速硅膠柱(3英吋×18英吋)中，用二氯甲烷洗脫得到25.0g(0.076mol)所題的溴酯產(chǎn)物，為清亮油液，產(chǎn)率為75%，異丙醇溶劑化物中含有少于5%的未溴化的酯，產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(CDCl3)8.16(d，2H)，7.38(d，2H)，5.05(t重峰，1H)，4.14(dd，1H)，2.88(m，4H)，2.39(m，4H)，1.29(d，6H);
13C NMR(CDCl3)168.7，147.7，129.3，123.8，69.9，45.1，35.6，33.0，21.5，21.2實(shí)施例Pα-〔3-(4-硝基苯基)丙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸，1-甲酯的制備將4.81g(換算成14.6mmol)的d，1-2-溴-4-(4-硝基苯基)-丁酸異丙酯(按實(shí)施例O的方法制備)在通氮?dú)獠嚢柘掠?分鐘內(nèi)加入3.137g(18.2mmol)Cyclen游離堿的30ml用氯仿穩(wěn)定的戊烯溶液中。在室溫下攪拌反應(yīng)溶液24小時(shí)。TLC分析(溶液體系2)表明已轉(zhuǎn)化為標(biāo)題所稱的單烷基化產(chǎn)物(Rf＝0.78，用水合茚三酮，碘和UV活性測(cè)定)。將黃色氯仿溶液加至1英吋×17英吋閃色譜硅膠柱中，用5%甲醇的氯仿溶液預(yù)洗脫，再用300ml此溶劑體系洗脫，接著用溶劑體系2洗脫得到含純標(biāo)題產(chǎn)物的餾分，合并這些餾分并蒸發(fā)得到4.85g(5.46mmol)標(biāo)題產(chǎn)物的游離堿，為淡色油液，產(chǎn)率為79%，其進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(CDCl3)8.15(d，2H)，7.40(d，2H)，5.07(P，1H)，3.35(dd，1H)，2.65-3.0(m，13H)，2.5-2.64(m，4H)，2.14(m，1H)，2.00(m，1H)，1.28(dd，6H);
13C NMR(CDCl3)171.6，149.5，146.5，129.2，123.6，68.1，62.7，49.2，47.5，45.9，45.7，32.9，31.0，22.1，22.0;
IR(CDCl3)cm-13231(N-H)，2978，2933，1721(酯羰基)，1601，1512，1458，1345，1107;
快速原子轟擊質(zhì)譜m/e422(M+H)+，408，392。
最終產(chǎn)物-配位體的制備實(shí)施例1α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，-甲酯，三乙酯的制備將700mg(1.91mmol)的α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸，1-甲酯(按實(shí)施例D的方法制備)溶于含有4.6g(33.3mmol)新鮮粉狀無(wú)水碳酸鉀的46ml乙腈中。將1.022g(6.12mmol)溴乙酸乙酯一次加到此懸浮液中，在室溫下攪拌四小時(shí)后，真空過(guò)濾懸浮液，用15ml乙腈再次洗滌濾餅，在38℃下真空蒸發(fā)濾液得到粗的標(biāo)題所稱的四酯，為紫色固體。然后用硅膠色譜法提純四酯，用5%C2H5OH/CHCL3洗脫，然后用溶劑體系3洗脫得到620mg(0.988mmol，52%)的所要產(chǎn)物。產(chǎn)物的特征可由快速原子轟擊質(zhì)譜(〔M+H〕+＝624)證實(shí)，并通過(guò)下列數(shù)據(jù)進(jìn)一步確證其結(jié)構(gòu)特征1H HMR(CDCl3)8.24(d)，7.45(d)，4.94(s)，4.35-4.10(m)，3.79(s)，3.75-1.84(m)，1.34-1.22(m)，13C NMR(CDCl3)174.3，173.8，173.6，171.5，147.6，138.9，131.5，123.4，64.8，61.5，61.4，60.2，55.4，55.0，53.1，52.9，52.7，52.4，51.9，51.7，48.8，48.3，44.9，19.1，14.1。
實(shí)施例2α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸的制備將300mg(0.478mmol)的α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，-甲基，三乙酯(按實(shí)施1的方法制備)溶于30ml6N HCl中，將混和物回流加熱過(guò)夜。在回流的終點(diǎn)，將溶液在70℃下真空濃縮得到黃色固體。將此固體溶于3ml水中，過(guò)濾，蒸發(fā)濾液得到253mg(0.378mmol，79%)的粗產(chǎn)物。用制備性TLC〔硅膠，在20%NH40AC/CH3OH(wt/v)中展開〕提純?cè)摦a(chǎn)物，產(chǎn)物的特征可由快速原子轟擊質(zhì)譜(〔M+H〕+＝526)證實(shí)，并通過(guò)下列數(shù)據(jù)進(jìn)一步確證其結(jié)構(gòu)特征
1H NMR(D2O)8.21(d)，7.42(d)，4.83(s)，3.83-2.19(m)，1.92(s);
13C NMR(D2O)175.0，173.6，171.8，167.0，166.3，146.9，138.3，130.1，123.0，62.2，54.0，53.0，52.2，50.4，97.3，46.8，44.8，42.8，20.0。
實(shí)施例3α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(BA-DOTA)的制備方法A用Adams催化劑(PtO2)和基本定量的氫氣進(jìn)行四酸(按實(shí)施例2的方法制備)的硝基的催化氫化得到標(biāo)題產(chǎn)物。產(chǎn)物的特征可由快速原子轟擊質(zhì)譜(〔M+H〕+＝496)和陰離子交換HPLC(在Q-SepharoseTM)證實(shí)，并通過(guò)下列數(shù)據(jù)進(jìn)一步確證其結(jié)構(gòu)特征1H NMR(D2O)8.12(d)，7.86(d)，5.66(s)，4.73-4.57(m)，4.27-3.78(m)，3.39-2.91(m);
13C NMR(D2O)176.54，176.52，176.46，141.1，128.9，120.9，112.5，65.0，55.9，55.7，53.6，49.7，49.5，49.3，45.7，45.4，44.9，44.6，41.4。
方法B此化合物合成的另一方法，是將實(shí)施例D的單酯四胺化合物轉(zhuǎn)化為-酸四胺化合物(6N HCl，回流過(guò)夜)，接著用溴乙酸含水的烷基化，然后將硝基還原成氨基(PtO2催化劑)得到上述等同的產(chǎn)物。
實(shí)施例4α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，-三乙酸的制備將2.0g(5.48mmol)的單酯三胺化合物(按實(shí)施例D的方法制備)溶于60ml的6NHCl中。將混合物加熱至95℃過(guò)夜(大約10小時(shí))，在75℃下真空濃縮混合物得到2.53g(5.11mmol，96%)的一酸四胺四鹽酸化物，為黃色固體。
將上述的-酸四胺四鹽酸化物(0.5g，1.0mmol，溶于15ml水中，用NaOH調(diào)PH為9。另外制備溴乙酸溶液(0.71g，5.13mmol)并將它加到-酸四胺水溶液中。再調(diào)溶液的PH至9，在反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)加入少量1.0N NaOH保持溶液的PH為9。一邊反應(yīng)中進(jìn)行攪拌，一邊在不同的時(shí)間除去等份試樣，用陰離子交換HPLC監(jiān)測(cè)烷基化的進(jìn)程。當(dāng)二烷基化產(chǎn)物的量(出現(xiàn)的三乙酸鹽的基總量)達(dá)到最大值時(shí)，將全部反應(yīng)混合物冷凍干燥得到黑色固體。用硅膠色譜法(用溶劑體系1)純化這個(gè)烷基化產(chǎn)品的混合物，接著用制備型陰離子交換色譜法(用0-100%的1M NH4OA(梯度洗脫)，然后用制備型TLC板(用溶劑體系4展開)，最后用硅膠色譜法(用溶劑體系4洗脫)提純烷基化產(chǎn)物的粗混合物。用這種徹底的純化方法得到30mg(0.06mmol，6.0%)的標(biāo)題產(chǎn)物，為黃色固體。產(chǎn)物的特征可由快速原子轟擊質(zhì)譜(〔M+H〕+＝468)和陰離子交換HPLC證實(shí)，并通過(guò)下列數(shù)據(jù)進(jìn)一步確證其結(jié)構(gòu)特征1H NMR(D2O)8.12(bs)，7.35(bs)，4.76(s)，3.57-3.44(M)，2.97-1.83(m)，1.80(s)。
13C NMR(D2O)181.75，180.68，179.00，175.37，147.70，141.22，133.08，123.53，68.44，59.72，56.00，52.80，49.96，49.29，47.86，45.36，44.26，42.78，42.25，23.72。
實(shí)施例5α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸五鹽酸化物和α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-三乙酸五鹽酸化物的制備。
按照實(shí)施例4所述方法制備烷基化產(chǎn)物的粗混合物。用硅膠柱以20%NH4OAC/CH3OH(wt∶v)洗脫進(jìn)行色譜分離粗混合物。合并由柱中得到的適宜餾分，蒸發(fā)至干燥。將含有大量NH4OAC的粗產(chǎn)物溶于80ml的NANO PureTM水中，冷凍干燥得到淺棕色固體。將該固體溶于20ml NANO PureTM水中，用PtO2作催化劑通H2，振蕩直到停止吸收氫氣。真空過(guò)濾分離催化劑，冷凍干燥濾液得到黃色固體。將該固體溶于3ml溶劑體系4，用溶劑體系4在硅膠上進(jìn)行色譜分離。匯集起來(lái)的餾分真空汽提，冷凍干燥得到779.6mg淺黃色固體。13C NMR和質(zhì)子NMR表明該產(chǎn)物內(nèi)兩種可能的幾何異構(gòu)體50/50的混合物。這種異構(gòu)體混合物與過(guò)量HCl接觸并冷凍干燥得到548，4mg(61%產(chǎn)率)的標(biāo)題產(chǎn)物。M.P.＞270℃。陰離子交換色譜(HPLC體系Ⅲ)顯示一大峰(＞94%純度);快速原子轟擊質(zhì)譜表明幾何異構(gòu)體的〔M+H〕+＝438。
實(shí)施例6α-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，1，4，7，10-四甲酯的制備將1.71g(12.34mmol)無(wú)水碳酸鉀在劇烈攪拌下加到1.43g(3.63mol)的α-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸，1-甲酯(按實(shí)施例B的方法制備)的40ml氬吹洗的乙腈溶液中。將1.78g(11.61mmol)的溴乙酸甲酯加到反應(yīng)混合物中，然后將反應(yīng)混合物在大約25℃下攪拌48小時(shí)。TLC分析表明形成了新產(chǎn)物(Rf-0.62，溶劑體系2)。將6.0g閃硅膠加到漿液中，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器除去乙腈。將得到的產(chǎn)物加至1英吋×16英吋硅膠柱中，用5%甲醇的氯仿溶液予洗脫，用大約400ml的所制備的溶液洗脫一些非極性雜質(zhì)和未反應(yīng)的烷基化劑。然后使用溶劑體系2，收集，合并，蒸發(fā)含產(chǎn)物的餾分(Rf＝0.62)得到2.1g(3.44mmol，95%)的標(biāo)題產(chǎn)物，為灰黃色玻璃體。1H NMR表明該產(chǎn)物為構(gòu)象或幾何異構(gòu)體的2∶1的混合物。
1H NMR(CDCl3，50℃)8.137(d)，8.128(d)，7.398(d)，7.385(d)，3.82(s)，3.76(s)，3.75(s)，3.74(s)，3.68(s)，1.5-3.52(m);
13C NMR(CDCl3，50℃ 75MHz)175.8，174.2，174.1，174.0，149.0，129.5，129.3，123.6，60.1，55.1，52.8，52.7，52.6，52.4，52.2，52.1，52.0，51.2，51.1，51.0，49.1，48.8，47.5，45.2，34.2，32.6。
實(shí)施例7α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，1，4，7，10-四甲酯將1.41g(2.31mmol)的α-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10四乙酸1，4，7，10-四甲酯(按實(shí)施例6的方法制備)通氮?dú)庀氯苡诤?00mg 10%鈀/碳催化劑25ml的甲醇中。在一大氣壓下用過(guò)量氫氣吹洗溶液三小時(shí)。TLC表明形成了水合茚三酮強(qiáng)陽(yáng)性的產(chǎn)物(RJ＝0.62，溶劑體系2)。通過(guò)硅藻土(Celite)過(guò)濾甲醇的催化劑漿液，蒸發(fā)溶劑得到標(biāo)題產(chǎn)物1.21g(2.08mmol，91%)，為白色固體玻璃狀(為2∶1的構(gòu)象異構(gòu)體的混合物)。通過(guò)閃色譜以10%甲醇的氯仿溶液洗脫從大量的異構(gòu)體中分離出小量的構(gòu)象或幾何異構(gòu)體，得到標(biāo)題產(chǎn)物，為灰白色粉末(MP＝89-95℃)，其結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(CDCl3，50℃)6.94(d)，6.89(d)，6.69(d)，6.66(d)，3.91(s)，3.80(s)，3.78(s)，3.74(s)，3.73(s)，3.72(s)，3.71(s)，1.5-3.5(m);
13C NMR(CDCl3，50℃，75MHz)176.1，174.0，173.9，172.2，170.4，169.6，144.2，144.1，130.6，130.5，129.5，129.1，115.9，115.8，62.6，58.7，55.1，54.3，52.7，52.5，52.3，52.2，52.1，52.0，51.9，51.8，51.7，50.2，50.0，47.3，44.7，32.8，31.8，30.0，25.2;
快速原子轟擊質(zhì)譜，m/e 602〔M+Na+〕，618〔M+K+〕+，〔624M+2Na+-H+〕+實(shí)施例8α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(PA-DOTA)的制備將1.5g(2.59mmol)的α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，1，4，7，10-四甲酯(按實(shí)施例7的方法制備的粗的2∶1混合物)溶于50ml濃鹽酸中。將反應(yīng)混合物在大約105℃下回流六小時(shí)。TLC分析(溶劑體系1)表明該酯(Rf＝0.88)轉(zhuǎn)化為標(biāo)題產(chǎn)物的鹽酸化物鹽(Rf＝0.43)。用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器除去過(guò)量溶劑，干燥得到的白色固體。得標(biāo)題產(chǎn)物的鹽酸化物鹽，產(chǎn)量為1.6g，其結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(D2O，PD＝1.0，90℃)7.48(d)，7.42(d)，2.8-4.3(m)，2.23(m)，2.03(m);
13C NMR(D2O，PD＝1.0，90℃，75MHz)176.4，174.9，171.6，144.7，132.9，132.8，130.4，125.7，61.7，56.8，56.0，53.7，53.1，51.6，47.9，34.3，37.6，快速原子轟擊質(zhì)譜m/e524〔M+H〕+，546〔M+Na〕+，568〔M+2Na+-H+〕+使用閃色譜法和溶劑體系1從標(biāo)題產(chǎn)物的鹽酸化物鹽中除去酯的任何微量的雜質(zhì)。該1.10g標(biāo)題產(chǎn)物的鹽酸化物鹽加至1英吋×23英吋閃蒸硅膠柱中，合并僅含標(biāo)題產(chǎn)物的混合銨鉀鹽的餾分得到580mg。HPLC分析表明產(chǎn)物在230和254nm區(qū)域純度大于98%面積。
快速原子轟擊質(zhì)譜，m/e562(M+K)+，584〔M+K++Na+-H+〕，600〔M+2K+-H+〕+。
實(shí)施例9α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-三乙酸，混合銨，鉀鹽的分離。
將含有四和三酸的粗溶液(2.05g)(按實(shí)施例8的方法制備，溶于少量的溶劑體系1中，并將溶液加至12英吋×3英吋的閃色譜硅膠柱中，用同樣溶劑預(yù)洗脫。收集含標(biāo)題產(chǎn)物(Rf＝0.63用溶劑體系1)的洗脫餾分，得到200mg的α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，10-三乙酸，混合銨鉀鹽。1H和13C NMR分析表明該三酸為對(duì)稱異構(gòu)體(1，4，10-三酸位置異構(gòu)體)1H NMR(D2O，PD＝0.5用DCl，T＝90℃)7.52(d)，7.46(d)，3.60(m)，3.54(m)，3.19(m);
13C NMR(D2O，PD＝0.5，T＝90℃)176.1，170.2，140.0，132.7，131.1，126.1，57.6，57.2，56.1，54.9，53.2，51.5，51.2，31.2。
快速原子轟擊質(zhì)譜，m/e466〔M+H+〕+，488〔M+Na+〕+，504〔M+K+〕+，526〔M+K++Na+-H++〕，542〔M+2K-H〕+實(shí)施例10α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，四甲酯的制備將溴乙酸甲酯(565μl，5.97mmol)加到攪拌的α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷，1-乙酸，甲酯(580mg，1.47mmol)(按實(shí)施例N的方法制備)和粉狀碳酸鉀(1.15g，8.32mmol)的乙腈(20ml)溶液的混合物中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。然后過(guò)濾混合物，真空濃縮濾液得一油液。用色譜法(硅膠，8%甲醇的二氯乙烷溶液)提純粗產(chǎn)物。得到標(biāo)題產(chǎn)物，為黃色固體(469mg，52%)，TLC Rf＝0.4(硅膠，10% CH3OH的CHCl3溶液)，產(chǎn)物的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)特征為13C NMR(CDCl3)173.2，172.6，161.2，139.1，125.1，124.6，120.5，110.7，57.0，55.6，53.5，52.6，51.3，50.8，46.8，46.0，44.0。
實(shí)施例11α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸的制備將α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，四甲酯(按實(shí)施例10的方法制備)的濃鹽酸(5ml，J.T.Baker ULTREX)溶液通氮?dú)饣亓?小時(shí)。然后真空濃縮溶液至干燥得到固體殘余物。用色譜法(硅膠，溶液體系6)提純?cè)摴腆w得到標(biāo)題產(chǎn)物，為灰白色固體(209mg)。將這種物質(zhì)轉(zhuǎn)化為四鹽酸化物鹽，其結(jié)構(gòu)特征為13C NMR(D2O-DCl，80℃)
171.0，166.9，161.2，139.0，125.5，119.3，110.7，56.8，54.5，52.7，51.0，49.2，49.0，46.3，42.9實(shí)施例12α-(2-甲氧基-5-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，四銨鹽將氧化鉑(20mg)加到α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(157mg)(按實(shí)施例11的方法制備)的水(20ml)溶液中。將此混合物在室溫下氫化1小時(shí)(1個(gè)大氣壓氫氣)。過(guò)濾后，用色譜法(硅膠，溶劑體系5)進(jìn)一步提純?cè)撐镔|(zhì)得到標(biāo)題化合物(141mg)，為灰白色的固體，其結(jié)構(gòu)特征為13C NMR(D2O-DCl)175.5，172.6，172.3，159.9，128.8，127.5，124.6，123.8，115.5，61.2，58.1，57.3，55.7，53.4，51.6，49.6，47.4。
實(shí)施例131-(4-氨基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-三乙酸，4，7，10-三甲酯的制備將100mg(0.236mmol)的1-(4-氨基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷四鹽酸化物鹽(按實(shí)施例J的方法制備)。260mg(1.88mmol)的碳酸鉀和108mg(0.708mmol)的溴乙酸甲酯在攪拌下加到4ml氬吹洗的乙腈中，將混合物在25℃下攪拌48小時(shí)。然后將含溶液的鹽加至1cm×4cm閃蒸硅膠柱中，用乙腈洗脫。合并含有所要產(chǎn)物的餾分，并用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器除去溶劑，得到65mg(0.132mmol，56%)的標(biāo)題產(chǎn)物，其進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(CDCl3)7.29(d)，6.75(d)，4.62(s)，4.20(寬s)，3.70(s)，3.69(s)，3.64(s)，3.62(t)，3.27(s)，3.06(t)，2.82(寬t)，2.79(寬t);
13C NMR(CDCl3，75MHz)171.4，171.0，148.4，132.8，117.5，115.0，55.9，55.3，54.7，53.1，51.7，51.4，50.6，50.5，47.4。
實(shí)施例141-(4-氨基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，鹽酸化物鹽的制備將42mg(0.085mmol)的1-(4-氨基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，4，7，10-三甲酯(按實(shí)施例13的方法制備)的2ml6N鹽酸溶液2小時(shí)內(nèi)加熱至80℃。TLC分析表明有幾種產(chǎn)物(對(duì)于所要的標(biāo)題產(chǎn)物來(lái)說(shuō)Rf＝0.60，溶劑體系1)，除去溶劑得到41mg粗標(biāo)題產(chǎn)物。
實(shí)施例151-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，4，7，10-三甲酯的制備將3.17g無(wú)水碳酸鉀在烈烈攪拌下加到2.24g(6.97mmol)的1-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10四氮雜環(huán)十二烷(按實(shí)施例G的方法制備)的75ml氬吹洗的乙腈溶液中。然后在5分鐘內(nèi)將3.20g(20.9mmol)溴乙酸甲酯滴加到此反應(yīng)混合物中。將反應(yīng)混合物通氬氣攪拌17小時(shí)。TLC分析表明起始原料(Rf＝0.73，溶劑體系1)轉(zhuǎn)化為新產(chǎn)物(Rf＝0.46，溶劑體系1)。將70ml氯仿加到溶液中，然后將有懸浮鹽的溶液加至1英吋×7英吋閃色譜硅膠柱中。用10%甲醇的氯仿溶液洗脫產(chǎn)物，得到2.95g標(biāo)題產(chǎn)物，為淡黃色油液，真空干燥該油液形成易碎的玻璃狀物(78%)，標(biāo)題產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(CDCl3)8.17(m，m)，7.4-7.66(m)，2.38-3.95(m)。
13C NMR(CDCl3，75MHz)171.5，171.2，146.7，144.5，130.3，123.9，56.0，55.2，53.5，53.4，52.6，51.9，51.8，50.6，48.1，29.5。
實(shí)施例161-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，4，7，10-三甲酯的制備將2.8g(5.18mmol)粗的1-〔2-(4-硝基苯基)乙基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，4，7，10-三甲酯(按實(shí)施例15的方法制備)溶于50ml甲醇中。10%鈀/碳催化劑(600mg)加入到在氮?dú)獯迪磾嚢柽^(guò)的溶液中。在氮?dú)夥罩蟹胖萌芤海缓笥脷錃?1atm，20-25℃)吹洗攪拌的溶液2.5小時(shí)。再用氮?dú)獯迪慈芤簬追昼?，通過(guò)硅藻土短床過(guò)濾除去催化劑。TLC分析(10%甲醇的氯仿溶液)表明為標(biāo)題產(chǎn)物(Rf＝0.14)。用氯仿從硅膠中洗脫標(biāo)題產(chǎn)物得到2.2g(4.33mmol，83%)，為白色玻璃狀，其結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(CDCl3)7.03(d，m)，6.63(d)，3.4-3.6(m)，2.7-3.2(m);
13C NMR(CDCl3，75MHz)171.4，171.2，145.6，129.7，125.6，115.5，55.9，54.4，54.3，53.0，52.8，51.8，51.6，50.3，47.8，28.6;
快速原子轟擊質(zhì)譜，m/e508〔M+H+〕+。
實(shí)施例171-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸鹽酸化物鹽(-EA-DO3A)的制備將850mg(1.69mmol)的1-〔2-4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，4，7，10-三甲酯(按實(shí)施例16的方法制備)溶于30ml濃鹽酸中。在70-80℃下攪拌溶液2.5小時(shí)，然后攪拌冷卻溶液至25℃，繼續(xù)攪拌大約18小時(shí)。減壓下(10mm，75℃)用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器除去溶劑。通過(guò)真空干燥(10-1mm，45℃)從所得的清亮油液中除去溶劑化物和過(guò)量的鹽酸。得到標(biāo)題產(chǎn)物，為白色固體，產(chǎn)量為890mg，(RJ＝0.46，溶劑體系2)，其進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(D2O，PD＝1.9，T＝90℃)7.50(d)，7.41(d)，4.26(s)，3.43-3.68(m)，3.0-3.3(m)13C NMR(D2O PD＝1.9，T＝90℃)176.7，170.9，139.8，133.0，131.2，125.9，57.5，57.1，55.4，54.4，52.7，51.0，50.6，31.3;
快速原子轟擊質(zhì)譜，m/e466(M+H+)，488〔M+Na+〕，510〔M+2Na+-H+〕+。
使用10cm Partisil-5 OD53 RACⅡ反相柱的HPLC分析表明區(qū)域性純度(254mm)大于92%。洗脫液為10%乙腈的0.05M PH＝7.0的磷酯鉀溶液。
實(shí)施例181-〔2-(4-異硫氰酸根合苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(SCN-EA-DO3A)的制備在通氮?dú)獠嚢柘聦?-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸鹽酸化物鹽(按實(shí)施例17的方法制備，106mg，0.21mmol)溶于2ml水中。慢慢加入碳酸氫鈉(105.6mg，1.26mmol)防止二氧化碳釋出起泡(所得PH＝8.0)。加入硫光氣(16.8μl，0.22mmol)并劇烈攪拌1小時(shí)后，TLC分析(20%乙腈水溶液)表明起始原料(Rf＝0.12)已轉(zhuǎn)化為標(biāo)題產(chǎn)物(Rf＝0.26)。用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器從粗產(chǎn)物中除去溶液得到130mg含氯化鈉的標(biāo)題產(chǎn)物。此物質(zhì)的紅外分析(KBr片)證實(shí)有異硫氰酸鹽的部分(SeN＝2150cm-1)存在。
實(shí)施例191-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，三乙酯的制備將496μl(4.5mmol)溴乙酸乙酯一次加到攪拌的含有395mg(1.12mmol)的1-〔2-(4-硝基苯基)-乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(按實(shí)施例G的方法制備)和1.5g(11mmol)K2CO3的5ml乙腈溶液中。在68℃下通氮?dú)饧訜?小時(shí)后過(guò)濾所得的懸浮液。用CH3CN(2×10ml)洗滌濾餅，濃縮濾液得到粗產(chǎn)物，為粘性油液，用30ml二乙酯研制油液，濃縮得到650mg(100%產(chǎn)率)的1-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，三乙酯，其結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(CDCl3)8.2(d)，7.6(d)，4.3(q)，2.6-3.8(m)，1.55(t);
快速原子轟擊質(zhì)譜〔M+H〕+＝588。
實(shí)施例201-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸的制備將59μl NaOH(50%wt/wt，3eq)加到200mg(0.35mmol)的1-〔2-4-硝基苯基)乙基〕-11，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，三乙酯(按實(shí)施例19的方法制備)的15ml水懸浮液中，在80℃下攪拌混合物6小時(shí)，然后將得到的均勻橙色溶液冷卻至室溫，并冷凍干燥得到褐色固體，使用線性梯度的0-10%HOAC水溶液通過(guò)HPLC(Q-SepharoseTM，HPLC體系Ⅲ)在60分鐘內(nèi)提純褐色固體得到(產(chǎn)率50%)水解了的產(chǎn)物1-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，其結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(D2O)8.22(d)，7.55(d)，3.60-3.90(m)，3.10-3.40(m)實(shí)施例211-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，(EA-DO3A)的制備將214mg(0.43mmol)的1-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(按實(shí)施例20的方法制備)和40mg10%Pd/C的50ml水溶液置于帕爾-氫化器中。振蕩該懸浮液直至停止吸收氫氣。過(guò)濾后，冷凍干燥水溶液得到197mg(98%)1-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，為棕黃色固體，其結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(D2O)7.35(d)，7.20(d)，3.10-3.70(m);
13C NMR(D2O)173.85，172.50，137.90，131.90，130.22，121.55，56.25，55.14，54.42，50.12，49.65，49.31，31.00實(shí)施例221-(2-甲氧基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，4，7，10-三甲酯的制備將1.6g溴乙酸甲酯(11mmol)一次加到含有1.0g的1-(2-甲氧基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(3mmol)(按實(shí)施例E的方法制備)的攪拌的乙腈溶液(20ml)中，1小時(shí)后加入碳酸鉀(0.3g)，在室溫下繼續(xù)攪拌12小時(shí)。然后過(guò)濾反應(yīng)混合物并真空濃縮濾液。得到的殘余物進(jìn)行色譜柱分離(硅膠，CH3CN/CH3OH，9∶1，V∶V)得到三酯，為白色固體，濃縮后產(chǎn)率為68%，其進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(CDCl3)8.19(d)，8.14(s)，7.18(d)，2.58-3.99(m);
13C NMR(CDCl3)
173.53，172.83，164.59，142.28，128.51，127.69，126.49，112.30，57.25，56.90，55.03，54.21，53.06，52.09，52.00，51.54，50.68，50.30，49.85，49.63，49.31，49.00，48.68，48.37，48.05，47.70，47.39。
實(shí)施例231-(2-甲氧基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸的制備將含有0.25g的1-(2-甲氧基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸4，7，10-三甲酯(0.45mmol)(按實(shí)施例22的方法制備)的6M鹽酸溶液(3ml)在100℃熱并攪拌24小時(shí)。冷卻至室溫后，加入5ml水，冷凍干燥水溶液得到棕黃色固體，接著進(jìn)行柱色譜分離(硅膠，溶劑體系5)得到三酸，產(chǎn)率為60%，為灰白色固體，MP＝228-230℃(dec)，其進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(D2O)8.18(d)，8.09(s)，7.12(d)，3.87(s)，2.10-3.60(m)13C NMR(D2O)180.45，179.80，163.66，140.22，128.60，126.24，122.66，111.50，59.91，59.06，56.44，52.75，50.92，48.84。
實(shí)施例241-(2-甲氧基-5-氨基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸的制備將50mg的1-(2-甲氧基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(按實(shí)施例23的方法制備)加到含50mgptO2的氮?dú)獯迪吹乃?50ml)溶液中。在帕爾彈中氫化1小時(shí)后，過(guò)濾溶液，冷凍干燥含水濾液得到苯胺衍生物，為棕黃色固體(95%產(chǎn)率)，MP＞240℃ dec，其他進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)特征為1H NMR(D2O)7.54(bs)，7.21(d)，7.09(d)，7.05(s)，6.88(s)，3.84(s)，3.78(s)，2.85-3.56(m);
13C NMR(D2O)180.59，179.77，153.38，124.16，124.03，122.82，120.18，113.68，112.43，59.06，57.02，55.96，53.67，50.52，50.08，49.70，49.04，48.32。
實(shí)施例251-(2-羥基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸的制備將溴乙酸(309mg，2.2mmol)和NaOH(3.5ml，≈1M)在室溫下攪拌加到1-(2-羥基-5-硝基芐基-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(200mg，0.62mmol)(按實(shí)施例F的方法制備)的水溶液(1ml)中。用LC(陰離子交換，Q-SepharoseTM)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程并通過(guò)加入所需的NaOH保持PH為大約8。12小時(shí)后冷凍干燥溶液，用硅膠以溶劑體系5洗脫進(jìn)行固體殘余物的(柱)色譜分離。濃縮主要的黃色餾分，并溶于H2O中，冷凍干燥得到所要的產(chǎn)物，為亮黃色粉末(150mg，49%);MP＝230-235℃(dec)，其進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為13C NMR(D2O)166.41，165.60，160.00，119.91，116.02，113.85，111.71，104。59，45.20，44.50，43.96，36.43。
實(shí)施例261-(2-羥基-5-氨基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸的制備將PtO2(130mg)加到1-(2-羥基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(200mg，0.4mmol)(按實(shí)施例25的方法制備)氬氣吹洗的水溶液(25ml)中，接著通入H2(帕爾氫化器)。在黃色全部消失后，用氬氣吹洗溶液并過(guò)濾。然后冷凍干燥水溶液得到產(chǎn)物(146mg，78%)為棕黃色固體實(shí)施例27α-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R.S)-乙酸-4，7，10-三(R-甲基乙酸)，1-異丙基(4，7，10-三甲酯(PN-DOTMA三甲異丙酯)的制備將1.15g(8.32mmol)無(wú)水碳酸鉀通氮?dú)獠×覕嚢柘录拥?.00g(2.37mmol)的α-〔3-(4-硝基苯基)丙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸，1-甲酯(按實(shí)施例P的方法制備)的35ml無(wú)水乙腈溶液中。然后加入旋光乳酸甲酯的α-苯磺酸鹽(1.79g，7.36mmol)S∶R＝98.2)，在室溫下攪拌混合物60小時(shí)。TLC分析表明形成了新產(chǎn)物(對(duì)于標(biāo)題的四酯，Rf＝0.71，溶劑體系2，對(duì)于三酯，Rf＝0.89)。將得到的懸浮碳酸鹽的溶液倒入40ml氯仿中，濾去沉淀的無(wú)機(jī)鹽。除去此濾液中的溶劑，用1英吋×16英吋閃色譜硅膠柱的溶劑體系2為洗脫液色譜分離粗橙色油液兩次，得到標(biāo)題產(chǎn)物，為自由和烷基化下產(chǎn)物，是四酯非對(duì)映體(1.00g，1.47mmol，62%產(chǎn)率)未拆分的混合物。
這種物質(zhì)的1H NMR分析表明其含有大約0.5當(dāng)量未反應(yīng)的苯磺酸鹽的衍生物。在60℃氯仿中這種物質(zhì)的NMR譜為不結(jié)合的1H NMR(CDCl3，60℃)7.9-8.1(m，2H)，7.2-7.4(m，2H)，5.06(m，1H)，3.4-4.0(m，9H)，1.7-3.4(m，20H)，1.0-1.7(m，15H);
IR(CDCl3)Cm-12980，2840，1725，1710(酯羰基)，1590，1510，1440，1340;
快速原子轟擊質(zhì)譜，m/e702〔M+Na+〕+，687。
實(shí)施例28α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R、S)-乙酸-4，7，10-三-(R-甲基乙酸)，1-異丙基-4，7，10-三甲酯;(PA-DOTMA三甲異丙酯)的制備將含有未反應(yīng)的α-〔3-(4-硝基苯基)丙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸，1-甲酯的α-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R，S)-乙酸-4，7，10-三-(R-甲基乙酸)，1-異丙酯-4，7，10-三甲酯(950mg，1.40mmol未校正)(按實(shí)施例27的方法制備)通氮?dú)馊苡诤?.0g10%鈀/碳催化劑的10ml的30%甲醇水溶液中。用過(guò)量的氫氣吹洗溶液7小時(shí)。此時(shí)TLC檢測(cè)表明有水合茚三酮試驗(yàn)為強(qiáng)陽(yáng)性的物質(zhì)形成(Rf＝0.62，溶劑體系2，Rf＝0.71為起始物質(zhì))。用硅藻土過(guò)濾甲醇的催化劑漿液，并蒸發(fā)溶劑得到800mg粗標(biāo)題產(chǎn)物，含有由苯磺酸酯附隨物質(zhì)氫解而得的苯磺酸(Rf＝0.09溶劑體系2)的清亮油液。用1英吋×8英吋閃色譜硅膠柱色譜分離粗油液，以10%甲醇的氯仿溶液洗脫淺黃色帶為空體積。再以溶劑體系2洗脫得到標(biāo)題產(chǎn)物(480mg)，產(chǎn)率52%，為未拆分的非對(duì)映和幾何異構(gòu)體的混合物。在1H NMR的芳香區(qū)域內(nèi)觀察到三個(gè)不同的ab四重峰1H NMR(CDCl3，30℃)6.63-8.0(m(四重峰)，4H)，5.07(m，1H，異丙基次甲基H)，3.53-3.9(m，在3.85，3.73，3.69和3.56處有四個(gè)單13H)，3.46(m，1H)，3.25(寬t，3H)，2-3.1(m，14H)，1.0-2.0(m，15H);
13C NMR(CDCl3，30℃)177.3，177，176.4，176.2，175.9，174.3，172.9，170.6，145.3，144.9，130.8，129.7，129.3，129.1，128.8，128.4，127.5，126.3，115.2，115.1，114.9，69.0，68.4，67.3，61.6，57.8，57.4，56.7，56.5，56.4，52.9，52.7，52.1，50.8，507，50.6，47.3，47.1，47.0，46.9，46.5，46.3，46.1，44.8，44.5，44.3，34.1，32.9，32.5，32.2，31.8，24.8，22.2，22.1，22.0，21.8，21.6，15.8，14.9，7.7，7.5，7.4，7.1;
IR(CDCl3)Cm-12960，2840，1720，1510，1450，1375;
快速原子轟擊質(zhì)譜，m/e672〔M+Na+〕+，686。
實(shí)施例29α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R，S)-乙酸-4，7，10-三(R-甲基乙酸)，(PA-DOTMA)的制備將α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R，S)-乙酸-4，7，10-三-(R-甲基乙酸)，1-異丙基-4，7，10-三甲酯(400mg，0.59mmol)(按實(shí)按例28的方法制備)的非對(duì)映的混合物溶于50ml6N濃鹽酸中，并回流30小時(shí)。TLC分析(溶劑體系1)表明酯(Rf＝0.98，溶劑體系1)轉(zhuǎn)化為兩個(gè)新斑點(diǎn)(Rf＝0.6，高非對(duì)映體和Rf＝0.54，低非對(duì)映體溶劑體系1，兩斑點(diǎn)UV，水合茚三酮和碘為陽(yáng)性)。用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器除去過(guò)量溶劑并干燥后，得到標(biāo)題產(chǎn)物的粗非對(duì)映體混合物(403mg)，為鹽酸化物鹽。將290mg(0.51mmol)粗鹽加至1×13Cm硅膠閃色譜柱中，以溶劑體系8洗脫進(jìn)行制備標(biāo)題產(chǎn)物分開的兩種非對(duì)映體。因?yàn)楦逺f非對(duì)映體從柱中首先洗脫，所以得到的高Rf非對(duì)映體(119mg，0.21mmol)的純度高于低Rf非對(duì)映體(90mg，0.16mmol)。
1H NMR為高Rf非對(duì)映體1H NMR(D2O，90℃，PD＝7.5)7.12(d，2H)，6.80(d，2H)，3.66(m，1H)，3.57(寬t，3H)，2-3.4(m，19H)，1.89(m，1H)，1.37(m，1H)，1.15(d，3H)，1.10(d，3H)，1.06(d，3H)13C NMR(D2O，90℃ PD＝7.5)184.4，184.2，184.0，183.3，135.9，132.6，131.7，119.1，78.2，69.0，61.7，61.5，61.1，57.4，54.1，49.7，49.6，48.2，47.7，47.2，34.8，33.8，9.6，9.1，9.0;
快速原子轟擊質(zhì)譜，m/e566〔M+H+〕+，588〔M+Na+〕+，604〔M+K+〕+，626〔M+K++Na+-H+〕+，642〔M+2K+-H+〕+。
最終產(chǎn)物的制備-配合物金屬配位體配合物可由下述的幾種方法制備。這些方法包括金屬和配位體的水溶液的混合，并調(diào)PH至所需值，配合是在含有鹽和/或緩沖劑以及水的溶液中進(jìn)行。有時(shí)發(fā)現(xiàn)加熱溶液得到的配合物產(chǎn)率比在室溫下進(jìn)行配合得到的產(chǎn)率高。在BFC的合成中使用污跡(work-up)表明也影響配合。
實(shí)施例30α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸銨鹽，釤(Ⅲ)配合物;Sm(BA-DOTA)的制備。
將少量試樣，53mg(0.094mmol)的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(按實(shí)施例3的方法制備)溶于100μl水中，然后在PH6-7下用3ml0.043MSm(OAC)3溶液(48.8mg，0.128mmol)處理。在100℃下加熱此溶液，通過(guò)陰離子交換HPLC測(cè)定配合的程度。當(dāng)通過(guò)陰離子交換色譜，HPLC體系Ⅲ，完成配合時(shí)，將配合物的溶液冷卻至室溫(大約25℃)，并冷凍干燥。用硅膠色譜(用溶劑體系1洗脫)，提純釤配合物。此方法得到標(biāo)題產(chǎn)物的產(chǎn)率為82%，這種配合物的特征由TLC，快速原子轟擊質(zhì)譜，陰離子交換HPLC證實(shí)，其進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)特征為1H (D2O)(T＝？)8.94，7.81，7.21，6.97，6.80，5.63，5.01，4.58，4.01，3.56，1.78，1.53，1.24，1.10，0.77，-2.80，-2.95，-3.21，-3.91;
13C NMR(D2O)190.3，184.9，181.4，146.8，1134.3，122.7，116.4，80.8，72.6，64.2，57.2，55.8，54.7，53.4，51.5，49.7，45.5，43.5，23.6(5太多的碳峰)實(shí)施例31α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備通過(guò)將Sm-153溶液加到SmCl3溶液中制備150μlSm-153(3×10-4M，0.1N鹽酸溶液)和600μlSmCl3(3×10-4M)的0.1N鹽酸溶液。然后加入5.0μl2.0M NaOAC，接著加入45μl的50mM配位體(按實(shí)施例3的方法制備)的HEPES緩沖液，用275μl的0.5m HEPES調(diào)溶液的PH至7。將此溶液分為每份50μl的兩份，在100℃下加熱1小時(shí)。
將溶液通過(guò)SP-SephadexTM陽(yáng)離子交換樹脂。使用以前描述的方法測(cè)定作為配合物的金屬百分比。結(jié)果表明對(duì)于加熱試樣配合物的金屬為99.6%，對(duì)于未加熱試樣為96.6%。
通過(guò)PH剖視圖確定螯合物的穩(wěn)定性金屬配位體配合物的穩(wěn)定性通過(guò)調(diào)它們的各種PH值并分析溶液中的配合物進(jìn)行測(cè)定。在低PH時(shí)，配位體的質(zhì)子化作用引起金屬的釋出，在高PH時(shí)，金屬氫氧化物與螯合物的形成競(jìng)爭(zhēng)。因此，在選擇惰性螯合物時(shí)，一種所需要的惰性螯合物，應(yīng)該在高和低PH值的條件下，仍然保持是一種螯合物。
使用下列實(shí)施例中所描述的方法得到本發(fā)明的一些螯合在各種PH值下的惰性剖視圖，在某些情況下，將溶液通過(guò)陽(yáng)離子交換樹脂除去自由金屬。用稀釋的氫氧化鈉和鹽酸溶液調(diào)配合物溶液的PH為1至14。用以前所描述的方法測(cè)定作為配合物的百分比。
用同樣的方法制備幾種雙官能螯合物的共軛并調(diào)PH為2.8，4和6。使用放射探測(cè)器通過(guò)HPLC測(cè)定保存在溶液中的共軛的量。其結(jié)果列于實(shí)施例XX的生物學(xué)部分中。
實(shí)施例32α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性將由實(shí)施例30得到的加熱和未加熱試樣分為2×250μl等分試樣。用HCl調(diào)一份250μl等分試樣的PH值列于下表，用NaOHμl量調(diào)第二份250μl等分試樣得到所需PH值，一旦達(dá)到所需PH值，則除去25μl等分試樣，并用以前所述方法測(cè)定作為配合物的金屬的百分比，其結(jié)果如下
實(shí)施例33α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釔(Ⅲ)配合物的制備。
將10μl含有1.4mg/100μl的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(用實(shí)施例3的步驟制備)的溶液加入到100μl的摻有Y-90的Y(OAC)3(0.003μ)的溶液中。往該溶液中再加入500μl水，隨后加入125μl的NaOAC(0.5μ)溶液。265μl水加入到該溶液中使總體積達(dá)到1ml。將這一溶液分成等量的兩份。一份加熱到100℃一小時(shí)。用前面所述的陽(yáng)離子交換步驟來(lái)確定加熱和未加熱樣品中以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)。測(cè)試結(jié)果表明加熱和未加熱樣品中以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)分別為84%和4%。
實(shí)施例34α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，镥(Ⅲ)配合物的制備。
將α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸溶液(用實(shí)施例3的步驟制備)溶解到蒸餾水中，達(dá)到濃度為1.63mg/ml。
將氯化镥溶解到0.1NHCl中，制得濃度為3.9mg/ml(0.01μ)的氯化镥溶液。镥-177(0.3毫摩爾)用作示蹤劑。
將體積為30μl的0.01μ的镥溶液加入到2μl的Lu-177溶液中。加入適量的上述配位體，再加入HEPES緩沖液(0.1μ，PH＝7.6)使總體積達(dá)到1.0ml。所得溶液中配位體和镥的量為0.3毫摩爾。然后將該溶液加熱到100℃一小時(shí)，用前面所述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定作為配合物的Lu的百分?jǐn)?shù)為86%。
實(shí)施例35α-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
將7mg，(10.8微摩爾)的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物(用實(shí)施例30的步驟來(lái)制備)的樣品溶解到400μl水中。加入過(guò)量的硫光氣(50μl)，隨后再加入400μl CHCl3，兩相反應(yīng)在激烈攪拌下進(jìn)行30分鐘。這段時(shí)間結(jié)束時(shí)，水層用500μl CHCl3萃取4次，然后將水層凍干，定量地得到所需要的標(biāo)題產(chǎn)物。
紫外光譜顯示出這種化合物在272和282nm處有一譜帶。薄層色譜，硅膠，用75∶25(V∶V)的CH3CN∶H2O展開，給出Rf＝0.38。原料具有Rf＝0.19。紅外光譜顯示出-SCN在2100Cm-1處有伸張;快速原子撞擊質(zhì)譜，〔M+H+〕+＝687。
實(shí)施例36α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，銨鹽，釔(Ⅲ)配合物的制備。
將90mg(160毫摩爾)的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(用實(shí)施例3的步驟來(lái)制備)樣品溶解到1ml水中。向這個(gè)溶液中加入3ml含有51mg(192毫摩爾)的Y(OAC)3的水溶液。然后該反應(yīng)混合物，PH＝6-7，被加熱到100℃兩小時(shí)。然后所得溶液通過(guò)玻璃毛，并且凍干得到126mg的黃色固體。這種固體在硅膠上進(jìn)行色譜分離(溶劑體系1)，得到71mg(76%)的所需的配合物的產(chǎn)物。陰離子交換的分析表明，其與類似物釤配合物具有相同的保留時(shí)間，標(biāo)題產(chǎn)物的特征數(shù)據(jù)為13C NMR(D2O)180.8，180.5，179.9，146.1，133.4，122.0，116.1，74.9，56.3，55.8，55.4，55.1，54.8，52.2，46.0，44.0，23.6，1H NMR(D2O)6.90(d)，6.70(d)，4.40(s)，3.45-3.06(m)，2.71-2.10(m)，1.75(s)。
快速原子撞擊質(zhì)譜，〔M+H+〕+＝582。
實(shí)施例37α-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，鈉鹽，釔(Ⅲ)配合物的制備。
將α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釔配合物(用實(shí)施例36的步驟制備)的樣品(10mg，17μmole)溶解到400μl水中。向這種溶液中加入64μl硫光氣(過(guò)量)和400μlCHCl3，所得混合物激烈攪拌40分鐘。在這段時(shí)間內(nèi)分幾次少量加入固體NaHCO3以保持PH在8左右。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，分離出水層，用1ml CHCl3萃取4次，并且凍干。用薄層色譜和紫外光譜檢定標(biāo)題產(chǎn)物。
實(shí)施例38α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釔(Ⅲ)配合物，銨鹽的制備;NH4〔Y(PA-DOTA)〕。
通過(guò)一強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹脂(SP-SephadexTMC-25，Pharmacia)柱色譜將配位體α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(用實(shí)施例8的步驟制備)轉(zhuǎn)化成混合的質(zhì)子化了的銨鹽。該柱子呈質(zhì)子化了的形式，用蒸餾水洗滌。配位體的液縮的水溶液被用到柱子上，隨后用蒸餾水洗滌該柱子。用0.5M NH4OH將配位體從柱子上洗脫下來(lái)。洗脫液被濃縮至干。
將5ml Y(OAC)3·4H2O(0.0728g，0.215mmole)的蒸餾水溶液加入到溫?zé)岬?ml混合的質(zhì)子化了的銨鹽配位體(0.120g，0.215mmole)水溶液中。將溶液進(jìn)行回流并用0.1MNH4OH調(diào)PH到大約7.0?；亓饕恍r(shí)后，將溶液冷卻并濃縮至干。真空條件下，在大約105℃的油浴上加熱白色固體以除去過(guò)量的NH4OAC標(biāo)題產(chǎn)物(其含有大約一當(dāng)量的乙酸銨)的產(chǎn)量為0.142g(94%)，并且其特征數(shù)據(jù)如下13C NMR(D2O，88℃，75MHZ)23.8，27.6，35.4，49.6，55.0，56.2，56.9，57.1，65.7，68.0，121.7，132.6，138.8，180.7，181.4，182.0，183.1，快速原子撞擊質(zhì)譜，m/e610(正離子，〔M-+2H+〕+，)，608(負(fù)離子，M-)。
實(shí)施例39α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物，銨鹽的制備，NH4〔Sm(PA-DOTA)〕。
重復(fù)實(shí)施例38的步驟，用Sm(OAC)3·3H2O(0.082g，0.215mmole)代替Y(OAC)3·4H2O，制備出的標(biāo)題產(chǎn)物(其含有大約一當(dāng)量的乙酸銨)的產(chǎn)量為0.155g(94%)，其特征數(shù)據(jù)如下13C NMR(D2O，88℃，75MHz)23.5，27.2，35.6，50.5，54.5，56.0，57.2，57.9，69.5，71.5，122.3，133.0，139.7，181.2，188.4，189.3，190.9。
快速原子撞擊質(zhì)譜，m/e673(正離子，〔M-+2H+〕+，Sm同位素型式)，m/e671(負(fù)離子，M-，Sm同位素型式。)實(shí)施例40α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物，銨鹽的制備，NH4〔Sm(SCN-PA-DOTA)〕。
將10ml Sm(OAC)3·3H2O(27.9mg，381.56g/mole，73.1μ mole)的蒸餾水溶液和10ml含有42mg PA-DOTA，混合的銨一鉀鹽(632.97g/mole，66.4μmole)(用實(shí)施例8的步驟制備)的蒸餾水溶液混合，并在蒸汽浴上加熱。三十分鐘后，(用實(shí)施例41中描述的方法)通過(guò)HPLC測(cè)定形成〔Sm(PA-DOTA)〕的反應(yīng)已進(jìn)行完全。在分離漏斗中，通過(guò)搖動(dòng)使該溶液與20ml含有45.4mg CSCl2(114.98g/mole，395μmole)的氯仿溶液反應(yīng)。大約一分鐘后反應(yīng)進(jìn)行完全，這是通過(guò)HPLC測(cè)定的，并通過(guò)當(dāng)把該水溶液點(diǎn)樣到硅膠TLC板上時(shí)，用茚三酮(0.2%的乙醇液)陽(yáng)性測(cè)示結(jié)果消失來(lái)測(cè)定，(起始螯合物，〔Sm(PA-DOTA)〕測(cè)試呈陽(yáng)性)。除去氯仿層，水層用兩份20ml的氯仿洗滌。在氮?dú)饬飨?，并在室溫下通過(guò)加入100ml乙腈并蒸發(fā)使水層濃縮至干，得到標(biāo)題產(chǎn)物56mg。
快速原子撞擊質(zhì)譜，m/e715(正離子，〔m-+2H+〕+，Sm同位素型式)，m/e713(負(fù)離子，M-Sm同位素型式)。
實(shí)施例41Y3+與PA-DOTA的螯合速率的HPLC分析。
以在PA-DOTA合成中建立使用的函數(shù)形式來(lái)研究PA-DOTA與Y3+螯合的速率。通過(guò)HPLC用-Alltech EconosphereTMC18 100mm的柱子來(lái)監(jiān)測(cè)螯合度。采用的梯度是A)95∶5，PH6.0，0.05M NaOAC緩沖液CH3CN，B)30∶70，PH6.0，0.05M NaOAC緩沖液CH3CN，A到B用15分鐘。均用實(shí)施8的步驟制備的PA-DOTA·nHCl溶液(保留時(shí)間＝1.31分)和PA-DOTA混合的銨一鉀鹽溶液(保留時(shí)間＝4.55分)，被制備成1.6mm，PH6.0，0.5MNaOAC緩沖液。兩種溶液中每一種取一毫升(1.6μmole)與0.2ml(8μmole)的Y(OAc)3·4H2O溶液(40mm的，PH6.0的0.5M NaOAc緩沖液)反應(yīng)。通過(guò)在保留時(shí)間值為3.96分時(shí)的峰值的出現(xiàn)來(lái)確定螯合物的形成(通過(guò)與實(shí)施例38的樣品比較來(lái)證實(shí))。以下示出螯合形成的結(jié)果。
很明顯，BFC的純化方法對(duì)螯合速率有影響。
實(shí)施例42α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R·S)-乙-4，7，10-三-(甲基乙)酸，釤(Ⅲ)配合物，銨鹽的制備，NH4〔Sm(PA-DOTA)〕。
將Sm(OAC)3·3H2O的溶液(13.2mg在2ml蒸餾水中)加入到α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R·S)-乙-4，7，10-三-(甲基乙)酸的溶液(30mg在2ml的蒸餾水中)中去，(用實(shí)施例29的步驟制備，高Rf的非對(duì)映體)。該P(yáng)H為6.5的溶液在蒸汽浴上加熱，并用HPLC來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。加熱30分鐘后，溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上被濃縮至干，并在真空爐中干燥。
快速原子撞擊質(zhì)譜，m/e715(正離子，〔M-+2H+〕+，Sm同位素型式)，737(正離子，〔M-+H++Na+〕+，Sm同位素型式)，713(負(fù)離子，(M-)，Sm同位素型式)。
在下面的例子中，配合物溶液經(jīng)過(guò)一離子交換柱除去溶液中任何過(guò)量的游離金屬。不穩(wěn)定的體系將恢復(fù)平衡，且相同量的游離金屬將存在于溶液中。惰性體系將不會(huì)達(dá)到再平衡，且游離金屬的量會(huì)減少。這樣的話既使一配合物形成的產(chǎn)率并不高，令其通過(guò)一離子交換樹脂的純化作用也能形成一可用的穩(wěn)定的無(wú)非配合金屬的配合物。
實(shí)施例43α-(2-甲氧基-5-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
將5.8mg的α-(2-甲氧基-5-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(用實(shí)施例12的步驟制備)溶解在325μlNANOPureTM的水中制成濃度為3×10-2M的溶液。將一份10μl的這種溶液加入到990μl的摻有Sm-153的3×10-4M的溶液中。SmCl3(在0.1NHCl中)然后用NaOH調(diào)PH到7.0。這溶液被分成每份500μl的兩份，一份在100℃時(shí)加熱一小時(shí)，測(cè)試加熱和未加熱的兩個(gè)樣品，用前面所述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)。然后將該溶液通過(guò)SP-SephadexTM樹脂。用純化的樣品再測(cè)一次其配合程度。結(jié)果示于下表中
實(shí)施例44α-(2-甲氧基-5-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性。
實(shí)施例43中的加熱和未加熱的純化后的樣品分別都分成2×250μl的兩份。一份用HCl調(diào)節(jié)，另一份用NaOH調(diào)節(jié)，分別都達(dá)到下表中所表示的PH值。達(dá)到了欲期的PH值后，讓樣品保持10分鐘，用前面所述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的量。其結(jié)果示于下表中
實(shí)施例45α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備將7.9mg的α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(用實(shí)施例11的步驟制備)溶解在464μlNANO PureTM的水中制成濃度為3×10-2M溶液。將一份10μl的這種溶液加入到950μl的摻有Sm-153的3×10-4M的溶液中。SmCl3(在0.1NHCl中)然后用NaOH調(diào)PH到7.0。這種溶液被分成每份為500μl的兩份，一份在100℃加熱一小時(shí)。測(cè)示加熱和未加熱的兩個(gè)樣品，用前面所述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)。然后將這些溶液通過(guò)SP-SepnadexTM樹脂。然后采用前面描述的一般方法測(cè)定純化了的樣品的配合程度。其結(jié)果示于下表中
<p>實(shí)施例46α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性。
實(shí)施例45中的加熱和未加熱的經(jīng)純化的樣品分別被分成二份。一份用稀釋的HCl調(diào)節(jié)，另一份用NaOH來(lái)調(diào)節(jié)，使PH值達(dá)到下表中所示之值。欲期的PH達(dá)到后，將樣品保持10分鐘，然后用前面所述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的量。其結(jié)果示于下表中 實(shí)施例47α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
使0.0219M(100μl，2.195mmole)的α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸(用實(shí)施例4的步驟制備)的溶液與0.043M(25μl，1.075mmole)的Sm(OAc)3的溶液接觸。反應(yīng)混合物經(jīng)陰離子交換的HPLC處理(Q-SepharoseTM柱子，1cm×25cm，流速＝2ml/min，用0-1M的NH4OAc洗脫，梯度超過(guò)30分鐘)。一小時(shí)后，配合物(保留時(shí)間＝11.1分鐘)以77%的產(chǎn)率形成(面積百分比)，并且從配位體峰(保留時(shí)間＝15.5分鐘)可被完全分辨出來(lái)。標(biāo)題配合物已形成的進(jìn)一步的證據(jù)是由硅膠TLC(溶劑體系4)得到的，其中配位體有Rf＝0.59，配合物有Rf＝0.00。
實(shí)施例48α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
使0.022M(100μl，2.2μmole)的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸(用實(shí)施例5的步驟制備)溶液與0.043M(6.4μl，0.275mmole)的Sm(OAc)3溶液接觸。反應(yīng)混合物經(jīng)陰離子交換的HPLC處理(Q-SepharoseTM柱子，1cm×25cm，流速＝2ml/分鐘，用0-0.25M NH4OAc洗脫，梯度超過(guò)30分鐘)。40分鐘后，配合物(保留時(shí)間＝9.0分鐘)以66%的產(chǎn)率形成(面積百分比)，并且從配位體峰(保留時(shí)間＝18.5分鐘)可被完全分辨出來(lái)。
實(shí)施例49α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物和α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
將4.2mg的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸五鹽酸鹽和α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，10-三乙酸五氯化物(用實(shí)施例5的步驟制備)溶解在300μl NANOPureTM的水中制成濃度為3×10-2M的溶液。將一份10μl的該溶液加入到15μl的摻有Sm-153的2×10-2M的SmCl3(0.1NHCl液)中，通過(guò)加水使體積達(dá)到1ml。然后用NaOH調(diào)PH到7.0。該溶液被分成分別為500μl的兩份，一份在100℃時(shí)加熱一小時(shí)。
測(cè)示加熱和未加熱的兩個(gè)樣品，用前面描述的陽(yáng)離子交換的方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)。其結(jié)果表明對(duì)于加熱的和未加熱的樣品，其以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)分別為89%和96%。
實(shí)施例50α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物，和α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性。
將實(shí)施例49中的加熱的和未加熱的樣品都分成兩份。一份用HCl，另一份用NaOH調(diào)到PH到下表中所示出的PH值。一但達(dá)到所期望的PH，即將樣品保持10分鐘，然后用前面描述的陽(yáng)離子交換的方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)。下表中表示出了其結(jié)果
實(shí)施例51α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
將13μl 2×10-2M的α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸(用實(shí)施例4的步驟制備)溶液，15μl的SmCl3(0.02M 0.1NHCl)和2μl的Sm-153合并，用NANOPureTM水使體積達(dá)到1ml。用NaOH調(diào)PH到7.0。該溶液被分成各500μl的兩份，一份在100℃加熱一小時(shí)。測(cè)示加熱和未加熱的樣品用前面所述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明對(duì)于加熱的和未加熱的樣品，以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)分別為74%和42%。
實(shí)施例52α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性。
實(shí)施例51中的加熱的樣品被分成二份。一份用HCl調(diào)節(jié)，另一份用NaOH調(diào)節(jié)，使其PH值達(dá)到下表中所給出的PH值。予期的PH值達(dá)到后，將樣品放置十分鐘，用前面描述的陽(yáng)離子交換的方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的量。下表中給出了其結(jié)果 實(shí)施例531-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，镥(Ⅲ)配合物的制備。
將EA-DO3A(用實(shí)施例17中的步驟制備)固體溶解于水中制備成溶液。最終的濃度為0.01M。
將氯化镥溶解于0.1N HCl中制備成氯化镥溶液。最后的濃度為含氯化镥3.9mg/ml(0.01MLu)。镥-177被用作示蹤劑。
將30μl0.01M的Lu溶液加入到2μl的Lu-177溶液中。加入30μl的配位體溶液然后加入HEPES緩沖劑(0.1M，PH＝7.6)，使總體積達(dá)到1.0ml。最終的溶液對(duì)配位體和镥來(lái)說(shuō)是0.3mm。
用前面所述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定的以配合物形式存在的Lu的量為98%。
實(shí)施例541-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釔(Ⅲ)配合物的制備〔Y(EA-DO3A)〕。
通過(guò)強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹脂(SP-SephadexTMC-25，Pharmacia)柱色譜將配位體1-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(用實(shí)施例17的步驟制備)轉(zhuǎn)化成混合的質(zhì)子化了的銨鹽。色譜柱處于質(zhì)子化的形式，用蒸餾水洗滌。將濃的配位體水溶液加到柱中，隨后用蒸餾水洗滌柱子，用0.5M的NH4OH從柱子上將配位體洗脫下來(lái)。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將洗脫液濃縮至干，并在蒸空爐中將其干燥。
將10ml Y(OAc)3·4H2O(0.203g，338.101g/mole，0.600mmole)的蒸餾水溶液加到溫?zé)岬?0ml混合的質(zhì)子化了的銨鹽配位體(0.300g，499.615g/mole，0.600mmole)的蒸餾水溶液中。將該溶液進(jìn)行回流，并用0.1MNH4OH調(diào)PH到大約7.0?；亓魇宸昼姾?，將該溶液冷卻，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干。真空條件下，在大約105℃的油浴上通過(guò)加熱白色固體將過(guò)量的乙酸銨除去。得到標(biāo)題產(chǎn)物(其含有大約一當(dāng)量的乙酸銨)373mg(99%)，并由以下數(shù)據(jù)來(lái)確定
13C NMR(88℃，D2O，75MHz)24.4，28.4，51.2，56.5，57.2(2c)，57.7，67.2，67.6，120.5，132.3，135.2，182.1，182.5，183.0;
快速原子撞擊質(zhì)譜，m/e552(正離子，〔M+H+〕+)，m/e610(負(fù)離子，〔M+OAc-〕-)。
實(shí)施例551-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤配合物的制備〔Sm(EA-DO3A)〕。
重復(fù)實(shí)施例54的步驟，用Sm(OAc)3·3H2O(0.229g 381.531g/mole，0.600mmole)代替Y(OAc)3·4H2O，制備出標(biāo)題產(chǎn)物(其含有約一當(dāng)量的乙酸銨)408mg(99%)，并用以下數(shù)據(jù)來(lái)確定13C NMR(88℃，D2O，75MHz)23.8，27.9，51.4，57.5，58.1(3c)，68.7，73.4，120.3，132.2，134.7，185.0，186.8，192.1;
快速原子撞擊質(zhì)譜，m/e615(正離子，〔M+H+〕+，Sm同位素形式)，m/e673(負(fù)離子，〔M+OAc-〕-，Sm同位素型式)。
實(shí)施例561-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
將10μl1.48mg/100μl(0.03M)的1-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(用實(shí)施例20的步驟制備)的溶液加入到15μl摻有Sm-153的SmCl3溶液(0.02M的0.1NHCl溶液)中，加入NANO PureTM水使體積達(dá)到1ml。這種溶液被分成500μl的兩份，將一份在100℃加熱一小時(shí)，測(cè)試加熱和未加熱的樣品，用前面描述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明對(duì)于加熱的和未加熱的樣品，以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)分別為81%和43%。
實(shí)施例571-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性。
將實(shí)施例56的加熱的樣品分成兩份。一份用HCl調(diào)節(jié)，另一份用NaOH調(diào)節(jié)，以達(dá)到下表中所示出PH值。所期望的PH達(dá)到后，將樣品放置十分鐘，然后用前面所述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的量。下表中示出了其結(jié)果。
實(shí)施例581-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
將3μl4.65mg/100ml的1-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(由實(shí)施例20的步驟制備)溶液加入到15μl摻有Sm-153的SmCl3(0.02M的0.1N HCl溶液)溶液中。用NANOPureTM水使體積達(dá)到1ml。用NaOH將溶液的PH值調(diào)節(jié)到7.3。該溶液分成兩份，一份在100℃加熱一小時(shí)。測(cè)試加熱和未加熱的樣品，用前面描述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明加熱的和未加熱的樣品中以配合物形式存在的金屬百分?jǐn)?shù)分別為96%和93%。
實(shí)施例591-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性。
將實(shí)施例58的加熱的和未加熱的樣品均分成兩份。每一樣品的其中一份用HCl調(diào)節(jié)，另一份用NaOH調(diào)節(jié)以達(dá)到下表中示出的PH值。達(dá)到希望的PH值后，將樣品放置十分鐘，然后用前面描述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的量。下表中示出了其結(jié)果 實(shí)施例601-(2-羥基-5-硝基苯甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
將3.9mg1-(2-甲氧基-5-硝基苯甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(用實(shí)施例25的步驟制備)溶解在260μlNANOPureTM水中，制成3×10-2M的溶液。將一份10μl這種的溶液加入到15μl摻有10μl Sm-153的0.1N HCl溶液(3×10-4M)2×10-2M SmCl3的溶液(水溶液)中。加入965μl DI水使體積達(dá)到1ml。然后用NaOH調(diào)節(jié)PH到7.0。將這個(gè)溶液分成500μl的兩份，一份在100℃加熱一小時(shí)。測(cè)試加熱和未加熱的樣品，用前面描述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明加熱的和未加熱的樣品中以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)分別為71%和74%。
實(shí)施例611-(2-羥基-5-硝基苯甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH值穩(wěn)定性。
實(shí)施例60的加熱的和未加熱的樣品都被分成250μl的兩份。一份用HCl調(diào)PH，另一份用NaOH來(lái)調(diào)節(jié)PH值以達(dá)到下表中示出的PH值。達(dá)到期望的PH值后，將樣品放置十分鐘，然后用前面所描述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的量。結(jié)果示于下表中
實(shí)施例621-(2-羥基-5-氨基苯甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備將3.2mg的1-(2-羥基-5-氨基苯甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(用實(shí)施例26的步驟制備)溶解于100μl NANO PureTM水中制備成3×10-2M的溶液。將一份10μl的這種溶液(稀釋到20μl)加入到15μl摻有Sm-153的2×10-2M SmCl3(水溶液)的溶液中。加入950μl DI水和20μl 0.1N NaOH使體積達(dá)到1ml。這種溶液被分成500μl的兩份，一份在100℃加熱一小時(shí)。測(cè)試加熱的和未加熱的樣品，用前面所描述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)。當(dāng)被配合的金屬少于95%時(shí)，將該溶液通過(guò)SP-SephadexTM樹脂。再測(cè)定以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)。其結(jié)果示于下表中 實(shí)施例631-(2-羥基-5-氨基苯甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性將實(shí)施例62的加熱的和未加熱的經(jīng)色譜純化的樣品分別分成兩個(gè)250μl的份，一份用HCl調(diào)節(jié)，另一份用NaOH調(diào)節(jié)以達(dá)到表中所示的PH值。當(dāng)希望的PH值達(dá)到后，將樣品放置10分鐘，然后用前面描述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定以配合物形式存在的金屬的百分?jǐn)?shù)。下表中示出了其結(jié)果 我們已知道，在一些分子內(nèi)具有金屬螯合基團(tuán)如DTPA和反應(yīng)活性的連接基(芳胺)的雙官能螯合劑能夠共價(jià)連接到各種對(duì)癌或腫瘤細(xì)胞抗原決定基或抗原具有特性的直接的生物分子靶上。這種共軛物的放射性核素配合物在診斷和/或治療的應(yīng)用上是有效的，是輸送放射性核素到癌或腫瘤細(xì)胞上的一種手段?！矃⒖?，Meares等人，Anal.Biochem.142，68-78，(1984);也參看討論部分，P215-216，J.Protein Chem.，3(2)(1984)，Meares和Goodwin;最近的參考文獻(xiàn)是Meares，美國(guó)專利4，678，677，1987.7.7發(fā)行，Warshawsky等人，美國(guó)專利4，652，519，1987.3.24.發(fā)行，和Brechbiel等人，Inorg.Chem.，25，2772-2781(1986)〕?？梢韵胂蟮?，使用了放射活性的或發(fā)光的金屬的產(chǎn)物，也可被用于體外免疫檢定。
標(biāo)記抗體的應(yīng)用決定于一些因素，例如1)抗體的特性，2)在應(yīng)用條件下配合物的惰性或穩(wěn)定性(即，血清穩(wěn)定性)，3)標(biāo)記技術(shù)，即整個(gè)抗體可以具有同天然分子一樣的特性和免疫反應(yīng)性。
對(duì)于放射核素抗體共軛物用作診斷和/或治療試劑的效果，其配合物的穩(wěn)定性或惰性是極為重要的。動(dòng)力學(xué)的不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致不穩(wěn)定性，例如，在血清中，以及放射性核素從配合物上的離解作用。這樣，便降低了診斷和治療的效果。另外，也形成了對(duì)于正常組織的一般放射性損害的巨大潛在性〔Cole等人，J.Nucl.Med.，28，83-90(1987)〕。
放射性核素向抗體的結(jié)合可以采用兩種方法進(jìn)行，或者通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中已知的步驟使BFC連接到抗體上，然后在與抗體相配伍的條件下進(jìn)行放射性核素的螯合?；蛘撸瑢⒖贵w共軛到已成型的(室溫或高溫)金屬-BFC配合物上?！睲eares等人，Acc.Chem.Res.17，202-209(1984)〕。后面將提供實(shí)施例。
實(shí)施例ZA(比較例)1-(4-異硫氰酰苯甲基)-二亞乙基三胺五乙酸，釤-153配合物向CC-49的IgG和F(ab′)2的共軛;〔153Sm(SCN-Bz-DTPA)〕-IgG和〔153Sm(SCN-Bz-DTPA)〕-F(ab′)2片段。
通過(guò)將150μl153Sm的0.1N HCl溶液與9μl的1-(4-異硫氰酰苯甲基)二亞乙基三胺五乙酸混合，再向其中加入HEPES緩沖劑(0.5M，PH8.9，大約30μl)使PH達(dá)到約6，制備成1-(4-異硫氰酰苯甲基)二亞乙基三胺五乙酸，釤-153配合物〔153Sm(SCN-Bz-DTPA)〕。為了共軛，將22.5×10-9moles的CC-49的IgG或F(ab′)2(在50mmole HEPES中，PH8.5，蛋白質(zhì)濃度約為1×10-4M)與153Sm配合物混合，并加入碳酸鈉溶液(1.0M，12～15μl)調(diào)節(jié)PH到8.9。共軛作用在室溫(約25℃)下進(jìn)行大約3小時(shí)。153Sm配合物標(biāo)記的IgG或F(ab′)2被分離出來(lái)，并用與實(shí)施例Ⅻ中描述的相似方法進(jìn)行鑒定。
實(shí)施例Ⅰ和Ⅱ及對(duì)比例A-D雙官能螯合物的體內(nèi)篩選某些確定的稀土螯合物的穩(wěn)定性已在動(dòng)物體內(nèi)測(cè)試中得到了檢驗(yàn)。例如，Rosoff等人，在the International Journal of Applied Radiation and Isotopes 14，129-135(1963)中報(bào)告了具有放射活性的稀土螯合物在鼠體中對(duì)確定的氨基羧酸的分布情況。已發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)，“螯合劑與體內(nèi)成份(無(wú)機(jī)的和有機(jī)的)對(duì)稀土離子的競(jìng)爭(zhēng)決定了它的沉積和排泄”。強(qiáng)的稀土螯合物被認(rèn)為離解的很少而被排泄出來(lái)，而弱的或中等強(qiáng)度的螯合物離解迅速，被沉積在諸如肝臟等器官中。但是，放射性核素在肝臟中的濃度并不總是由于弱的配合物形成的，在一些情況下，是由于金屬螯合物對(duì)肝臟具有的親合性。事實(shí)上，螯合物早已被制備并用來(lái)評(píng)價(jià)肝臟的功能〔Fritzberg，Alan.R.，Raoliopharma CeuticalsProgress and Clinical Perspectives，Vol.1，1986;美國(guó)專利4，088，747和4，091，088〕。
實(shí)施例3化合物的釔和釤的螯合物的生物分布已被測(cè)定，且其在肝臟中的百分比劑量被用作在體內(nèi)的掩蔽方法來(lái)定性地評(píng)估螯合物的穩(wěn)定性。為比較，包括了NTA和EDTA的螯合物。作為對(duì)照，也注射了釤，以未螯合的氯化釤形式。
從Charles River實(shí)驗(yàn)室購(gòu)進(jìn)重量在150-200g的Sprague-Dawoey鼠。將這些動(dòng)物放在籠中，并隨意喂以水和食物。使用前讓這些動(dòng)物馴化至少五天。在注射配合物前，將動(dòng)物放在熱的燈下(15-30分鐘)，使其尾端靜脈膨脹。然后將動(dòng)物放在約束籠中，用酒精棉棍清潔其尾部，通過(guò)尾端靜脈向動(dòng)物注射(50-200μl)。注射后，動(dòng)物被放到另一籠中兩小時(shí)，在這之后，通過(guò)頸脫位使動(dòng)物死去，然后將動(dòng)物解剖，各部分用去離子水漂洗，輕拍至干，在一配衡的計(jì)量小瓶?jī)?nèi)稱重。制作出注射后的同一材料的至少三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，并以動(dòng)物的組織計(jì)數(shù)。劑量百分?jǐn)?shù)等于器官中的計(jì)數(shù)值除以標(biāo)準(zhǔn)中的計(jì)數(shù)值，乘以100(參看下表)。
表生物分布數(shù)據(jù) ＊配合物是按以下配位體/金屬的比例制備的，對(duì)實(shí)施例Ⅰ和Ⅱ?yàn)?∶1;對(duì)實(shí)施例A為5∶1，對(duì)實(shí)施例B和C為大約300∶1。
實(shí)施例Ⅲ和E用前面所述的方法制備1∶1的釔(摻有示蹤劑量的90Y)與實(shí)施例3中的配位體，即BA-DOTA，和EDTA(比較例E)的配合物，然后將幾份100μl的溶液轉(zhuǎn)移到離心分離管中。加入過(guò)量的Y(Ⅲ)，總體積的變化可以乎略，并且記錄時(shí)間。金屬加入一個(gè)半小時(shí)后，用前面描述的陽(yáng)離子交換方法測(cè)定配合物的百分?jǐn)?shù)，把這個(gè)結(jié)果與起始的配合物的量進(jìn)行比較。配合物百分?jǐn)?shù)與加入的金屬的比值能表示出配位體-金屬配合物的不穩(wěn)定性。表中給出了其結(jié)果。
表配合物的研究 實(shí)施例Ⅳ1-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤-153配合物的制備;〔153Sm(SCN-EA-DO3A)〕配合物向100μl153Sm的0.1N HCl溶液中加入5μl的SCN-EA-DO3A(5mM，在50mM HEPES中，PH8.2)(實(shí)施例18中制備)。該溶液在渦流混合器上混合，逐漸加入HEPES緩沖液(0.5M，PH8.9)(總共大約25μl)調(diào)節(jié)PH值到7左右。通過(guò)HPLC在GF-250柱上(HPLC體系Ⅰ)監(jiān)測(cè)螯合過(guò)程。得到大約50%的產(chǎn)率。
實(shí)施例Ⅴα-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物的制備;〔153Sm(PA-DOTA)〕配合物向150μl153Sm的0.1N HCl溶液(大約4.6mCi)中加入1μl的乙酸鈉(2.0M)和9μl的α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸混合的銨-鉀鹽(5mmole，在50mmole HEPES中，PH8.5，用實(shí)施例8的步驟制備)。機(jī)械振動(dòng)該混合物，并逐步滴加HEPES緩沖液(0.5M，PH8.9;加入大約31μl)到PH為7。然后在沙浴上于98℃加熱該溶液一小時(shí)。以上過(guò)程結(jié)束后，取5μl混合物在Mono-QTM柱上用HPLC體系Ⅱ進(jìn)行分析，用梯度溶劑體系來(lái)洗脫(0-15分鐘，從0至100%的B;其中A＝水，B＝1.0M乙酸銨和0.1mmole EDTA)。得到85-95%的產(chǎn)率，以153Sm計(jì)。這樣制備的α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物通過(guò)與相同的無(wú)放射活性的樣品的比較進(jìn)行鑒定，即通過(guò)它們各自的在Mono-QTM和GF-250柱子上的色譜行為。存在放射活性的配合物的進(jìn)一步證據(jù)是通過(guò)其向異硫氰酰衍生物的轉(zhuǎn)化和其后來(lái)的向抗體的螯合作用來(lái)確定的。配合物也可在不加熱(在環(huán)境溫度下)通過(guò)保溫6-18小時(shí)來(lái)制備，其產(chǎn)率為70-80%。
實(shí)施例Ⅵα-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物的制備;〔153Sm(SCN-PA-DOTA)〕配合物向?qū)嵤├踔械玫降姆磻?yīng)混合物中加入2μl的HEPES緩沖液(0.5M，PH8.9)，2μl的硫光氣和0.2ml的氯仿。激烈地機(jī)械振動(dòng)混合物2或3次，每次幾秒鐘。棄去氯仿層，留下主要含有所需產(chǎn)物的水層，并進(jìn)一步純化。采用HPLC，在GF-250柱子上用HPLC體系Ⅰ測(cè)出α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物的產(chǎn)率，以活性153Sm計(jì)，為85-90%。為了純化，讓水層經(jīng)過(guò)Sep-PakTMC-18柱體，并用90%的乙腈水溶液洗脫。棄去開始的300μl流出物，隨后出來(lái)的900μl的SCN-衍生物用HPLC在GF-250柱上檢定?；钚?53Sm的回收率優(yōu)于90%。然后將溶劑蒸發(fā)，歷時(shí)1.5-2小時(shí)，剩余物被用來(lái)向抗體螯合。
實(shí)施例Ⅶα-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物的制備;〔153Sm(BA-DOTA)〕配合物向200μl153Sm的0.1N HCl溶液中加入1μl的乙酸鈉(2.0M)和12μl的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(5mmole，在50mmole HEPES中，PH8.5)(用實(shí)施例3的步驟制備)。機(jī)械振動(dòng)該混合物，并逐漸滴加HEPES緩沖液(0.5M，PH8.9;加入大約38μl)使PH到7。然后將該溶液在沙浴上98℃下加熱一小時(shí)。結(jié)束后，取5μl的混合物在Mono-QTM柱上進(jìn)行分析(HPLC體系Ⅱ，用梯度溶劑體系洗脫0-15分鐘，從0至100%的B;其中A＝水;B＝1.0M乙酸銨和0.1mmole EDTA)。通常得到的產(chǎn)率以153Sm計(jì)為85-95%。該配合物也可用在室溫下將混合物保溫12-18小時(shí)的方法制備，其標(biāo)題產(chǎn)物的產(chǎn)率為80-90%。如此制備的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物通過(guò)與一個(gè)真正的樣品進(jìn)行比較，即比較它們?cè)贛ono-QTM柱上的色譜行為、向異硫氰酰衍生物的轉(zhuǎn)化作用和其后來(lái)向抗體的螯合作用來(lái)進(jìn)行檢定。
實(shí)施例Ⅷα-〔4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物的制備;〔153Sm(SCN-BA-DOTA)〕配合物向?qū)嵤├髦械玫降姆磻?yīng)混合物中加入2μl的HEPES緩沖液(0.5M，PH8.9)，2μl的硫光氣和0.2ml的氯仿。將混合物繳烈地機(jī)械振動(dòng)2或3次，每次幾秒鐘。棄去氯仿層，留下主要含有所需產(chǎn)物的水層。并進(jìn)一步純化?；?53Sm活性，用HPLC體系Ⅰ，通過(guò)HPLC在GF-250柱上分析，α-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物的產(chǎn)率為90%以上。為了純化，使水層經(jīng)過(guò)Sep-PakTMC-18柱體，并用90%的乙腈水溶液洗脫，棄去開始的0.3ml流出物，隨后出來(lái)的1.2ml是所需產(chǎn)物，回收率為86-93%。然后蒸發(fā)掉溶劑大約需2小時(shí)，剩余物被用來(lái)對(duì)抗體螯合。
實(shí)施例Ⅸ1-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤-153配合物向抗體的螯合;〔153Sm(SCN-EA-DO3A)〕-IgG螯合物使用的抗體是CC-49，-鼠科單克隆IgG，它可以結(jié)合到TAG-72，一個(gè)瘤締合抗原，的抗原決定基上。為了螯合，將187μl的抗體溶液(1.20×10-4M，在50mM HEPES中，PH8.5)與4.5×10-8moles的153Sm(SCN-EA-DO3A)(按照實(shí)施例Ⅳ中描述的方法制備)進(jìn)行混合，隨后加入碳酸鈉溶液(1.0M)，使PH值升到8.9。反應(yīng)在室溫下持續(xù)進(jìn)行2小時(shí)。結(jié)束后，在SepadaxG-25(2.2ml)一次應(yīng)用的柱子上用離心凝膠過(guò)濾法將153Sm標(biāo)記的IgG分離出來(lái)，并在GF-250柱子上用HPLC進(jìn)一步純化，用檸檬酸緩沖液(0.25M，PH7.4)洗脫。將含有標(biāo)記IgG的部分沉淀下來(lái)，用CentriconTM濃縮器進(jìn)行濃縮并交換(3×1)到PBS中。如此制備的153Sm標(biāo)記的IgG的放射性比度大約是0.16μ Ci/μg蛋白質(zhì)。通過(guò)HPLC(Sivakoff，S.I.，Biochrom1(1)，42-48(1986)〕和標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)方法，例如，十二烷基磺酸鈉聚丙酰胺凝膠電泳和放射自顯影法，及固相放射免疫測(cè)定法(RIA)〔參見David Colcher等人，Cancer Res.，43，736-742(1983)〕來(lái)鑒定〔153Sm(EA-DO3A)〕-IgG制備的定整性。
實(shí)施例X1-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤-153配合物向CC-49的片段F(ab′)2的螯合;〔153Sm(SCN-EA-DO3A)〕-CC-49的片段F(ab′)2使CC-49的F(ab′)2片段，根據(jù)Lamoyi和Nisonoff描述的方法，用酶水解方法制備〔E.Lamoyi和A.Nisonoff，J.Immunol.Methods，56，235-243(1983)〕〔225μl，1×10-4M于50mM HEPES中的溶液，PH8.5〕與2.9×10-8moles的153Sm(SCN-EA-DO3A)(用實(shí)施例Ⅳ中描述的方法制備)進(jìn)行混合。加入碳酸鈉(1.0M，大約5μl)使PH到8.9，讓反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行大約2.5小時(shí)。結(jié)束后，將153Sm標(biāo)記的片段分離出來(lái)，用實(shí)施例Ⅸ中描述的方法進(jìn)行檢定。
實(shí)施例Ⅺ(A和B)〔153Sm(EA-DO3A)〕-IgG和〔153Sm(EA-DO3A)-F(ab′)2在體內(nèi)的定位153Sm(EA-DO3A)標(biāo)記的IgG(實(shí)施例Ⅸ)和CC-49的F(ab′)2(實(shí)施例Ⅹ)的應(yīng)用可通過(guò)異種移植到無(wú)胸腺的鼠身上的人類腫瘤對(duì)標(biāo)記材料的吸收來(lái)證實(shí)。雌性無(wú)胸腺(Nu/Nu，CD1背景)鼠皮下接種(S.C.(0.1ml/源)以人類結(jié)腸癌細(xì)胞鏈，LS-174T(大約1×106個(gè)細(xì)胞/動(dòng)物)。接種后大約兩周，每一動(dòng)物都被通過(guò)尾部靜脈注射以大約2μCi(15-30μg)的在PBS中的153Sm標(biāo)記的抗體。在不同的時(shí)間間隔里，這些鼠都死去了。放血后，癌和選擇的組織被切下來(lái)并稱重。在一γ射線測(cè)定器中測(cè)定其放射性活性。測(cè)定在每一組織中的153Sm的每分鐘記數(shù)(CPM)，并被表示為CPM每克組織每一注射劑量剩以100(%注射劑量/克)。結(jié)果示于圖1～4和表ⅠA和ⅠB中。在研究中153Sm(SCN-Bz-DTPA)標(biāo)記的IgG和CC-49的F(ab′)2(實(shí)施例ZA)被作為比較例。結(jié)果示于表ⅠC和ⅠD中。
實(shí)施例Ⅻα-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物向抗體的共軛;〔153Sm(SCN-PA-DOTA)〕-IgG共軛物使用的抗體是CC-49，一鼠科單克隆IgG，其結(jié)合于TAG-72的抗原決定基，一個(gè)腫瘤締合的抗原。為了共軛，使178μl的抗體溶液(1.26×10-4M，在50mmole的HEPES中，PH8.5)與3.4×10-8moles的α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤配合物(用實(shí)施例Ⅵ中描述的步驟制備)進(jìn)行混合，隨后加入碳酸鈉溶液(1.0M，大約17μl)使PH值升到大約8.9。使反應(yīng)在室溫下持續(xù)2小時(shí)。結(jié)束后，用離心凝膠過(guò)濾法，在SephadexTMG-25(2.2ml)一次性應(yīng)用的柱子上，將153Sm標(biāo)記的IgG分離出來(lái)，并進(jìn)一步在GF-250柱子上用HPLC純化，用檸檬酸緩沖液(0.25M，PH7.4)洗脫。含有標(biāo)記IgG的部分被沉淀下來(lái)，用CentriconTM濃縮器濃縮并交換(3次)到PBS中。如此制備的153Sm標(biāo)記的IgG的放射性比度大約為0.16μCi/μg蛋白質(zhì)。采用HPLC和標(biāo)準(zhǔn)的生化方法如實(shí)施例Ⅸ中描述的來(lái)檢驗(yàn)α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物-IgG制備的完整性和一致性。
下面的實(shí)施例是制備標(biāo)記抗體共軛物的一種選擇方法，它包括先將BFC共軛到抗體上，然后再進(jìn)行螯合，生成放射性核素-BFC標(biāo)記的Ab。
實(shí)施例ⅫAα-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸-Ab CC49共軛物(IgG CC49-PA-DOTA)的制備;第二步與153Sm螯合形成153Sm標(biāo)記的抗體(IgG CC49-PA-DOTA-153Sm)153Sm(PA-DOTA)標(biāo)記的抗體可以通過(guò)下列步驟制備首先將BFC，例如，α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(SCN-PA-DOTA)，在PH8～9的條件下偶合到抗體上，然后在PH為6時(shí)，室溫下與153Sm螯合幾小時(shí)。
在一典型的實(shí)驗(yàn)中，CC-49在-Amicon濃縮器中(截去30K分子重量)被濃縮并經(jīng)三次交換進(jìn)入到碳酸鹽緩沖液中(50mM，PH9.1)使溶液中抗體濃度大于1.5×10-4M。向形成的共軛物中加入161μl含有25×10-9mole的IgG CC-49并混有5μl的SCN-PA-DOTA(5mM的濃度，在同樣的碳酸鹽緩沖液中，由實(shí)施例18的方法制備)的抗體溶液。使混合液在室溫下放置5小時(shí)，最后在5000轉(zhuǎn)/分的Sorvall RT離心機(jī)上，通過(guò)Amico濃縮器中的30K膜片過(guò)濾。濃縮液進(jìn)一步用2ml0.25M，PH值為7.4的DTPA的PBS溶液洗滌，并用MES緩沖液(20mM，PH5.8)洗滌5次(2ml每次)，每次洗滌時(shí)離心30分鐘。最后，PA-DOTA-IgG共軛物被濃縮到最小體積(大約100μl)，在GF-250柱上用HPLC分析證實(shí)其完整性。向純化了的共軛物中加入153Sm的0.1N HCl溶液(50μl)和20μl的MES緩沖液(1.0M，PH6)的在渦流混合器上混合后的混合液，并使其在室溫下放置過(guò)夜。結(jié)束后，未結(jié)合的153Sm的量，經(jīng)HPLC分析估計(jì)，是0.22BFC-Sm/抗體。153Sm與抗體的結(jié)合是通過(guò)與BFC的螯合來(lái)完成的，它是共價(jià)結(jié)合到抗體上的，通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其并不屬于非特性結(jié)合。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，IgG CC-49溶液，是在相同的條件下與153Sm混合液混合的，并根據(jù)相同的方法被分離出來(lái)，其沒有顯示出明顯量的153Sm與其結(jié)合。
實(shí)施例ⅩⅢα-〔2-(4-異硫氰酰苯基)-乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物向CC-49的片段F(ab′)2的共軛;〔153Sm(SCN-PA-DOTA)〕-F(ab′)2片段使CC-49的F(ab′)2片段〔根據(jù)E.Lamoyi等人，J.Immunol.Methods 56，235-243(1983)描述的方法，通過(guò)酶水解制備〕，(225μl的1×10-4M的溶液，在50mmoles HEPES中，PH8.5)與2.9×10-8moles的α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物(用實(shí)施例Ⅵ中描述的方法制備)進(jìn)行混合，加入碳酸鈉(1.0M，9μl)使PH值達(dá)到8.9左右，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行約2.5小時(shí)。分離出153Sm標(biāo)記的片段，并用實(shí)施例Ⅸ中描述的方法鑒定。其放射性比度大約是0.4μCi/μg。
實(shí)施例ⅩⅣ(A和B)α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物標(biāo)記的IgG和F(ab′)2的共軛物的體內(nèi)定位;〔153Sm(SCN-PA-DOTA)〕-IgG和〔153Sm(SCN-PA-DOTA)〕-F(ab′)2α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物標(biāo)記的IgG和CC-49的F(ab′)2(實(shí)施例Ⅻ和ⅩⅢ)的共軛物的應(yīng)用可通過(guò)異種移植到無(wú)胸腺鼠體內(nèi)的人類腫瘤對(duì)標(biāo)記材料的吸收來(lái)證實(shí)。用實(shí)施例Ⅺ中描述的方法測(cè)定生物定位。IgG的結(jié)果示于圖1-7，F(xiàn)(ab′)2的結(jié)果示于圖8-14中，以及表ⅡA和ⅡB中。
在研究中，153Sm(SCN-Bz-DTPA)與IgG和F(ab′)2共軛物標(biāo)記的材料(由實(shí)施例ZA制備)被用來(lái)作為比較，〔參見表ⅠC和ⅠD〕。
實(shí)施例ⅩⅤα-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物向抗體的共軛;〔153Sm(SCN-BA-DOTA)〕-IgG將CC-49的整個(gè)IgG(174μl，1.2×10-4M，在0.25M HEPES中，PH8.7)與2.0×10-8moles的α-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153(2.8mCi)(用實(shí)施例Ⅷ中的方法制備)進(jìn)行混合，隨后加入碳酸鈉溶液(1.0M，大約2μl)以保持PH大約為8.7。在室溫下讓反應(yīng)持續(xù)2.5小時(shí)。結(jié)束后，在SephadexTMG-25(2.2ml)一次性使用的柱子上用離心凝膠過(guò)濾法分離出153Sm標(biāo)記的IgG，并用HPLC在GF-250柱子上進(jìn)一步純化，用檸檬酸緩沖液(0.25M，PH7.4)洗脫。將含有標(biāo)記的IgG部分沉淀下來(lái)，利用CentriconTM濃縮器將其濃縮，并交換(3次)到PBS中。通過(guò)HPLC和標(biāo)準(zhǔn)的生化方法，如在實(shí)施例Ⅸ中描述過(guò)的，來(lái)驗(yàn)證釤-153標(biāo)記的IgG制備的一致性和完整性。
實(shí)施例ⅩⅥα-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物向CC-49的片段F(ab′)2的共軛;〔153Sm(SCN-BA-DOTA)〕-CC-49的F(ab′)2片段將CC-49的F(ab′)2(84μl，2.4×10-4M，在0.25M HEPES緩沖液中，PH8.7)，根據(jù)Lamoyi等描述的方法用酶水解制備，與2.1×10-8moles的α-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物(用實(shí)施例Ⅷ的方法制備)進(jìn)行混合，加入碳酸鈉(1.0M，大約2μl)使PH值到8.7，讓反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行大約2小時(shí)。結(jié)束后，分離出153Sm標(biāo)記的片段，并用實(shí)施例Ⅻ中描述的方法來(lái)鑒定。
實(shí)施例ⅩⅦ(A和B)α-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物標(biāo)記的IgG(實(shí)施例ⅩⅤ)和F(ab′)2(實(shí)施例ⅩⅥ)的體內(nèi)定位;〔153Sm(BA-DOTA)〕-IgG和〔153Sm(BA-DOTA)〕-F(ab′)2。
根據(jù)實(shí)施例ⅩⅣ或Ⅺ中描述的步驟來(lái)進(jìn)行體內(nèi)研究，結(jié)果示于圖1-14和表ⅢA和ⅢB中。
實(shí)施例ⅩⅧ(A和B)α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，177Lu-配合物標(biāo)記的IgG和F(ab′)2的體內(nèi)定位;〔177Lu(PA-DOTA)〕-IgG和〔177Lu(PA-DOTA)〕-F(ab′)2
根據(jù)實(shí)施例Ⅴ，Ⅵ，Ⅻ，和ⅩⅢ中描述的步驟，制備出標(biāo)題化合物，并進(jìn)行體內(nèi)研究，其結(jié)果示于表ⅣA和ⅣB中。
實(shí)施例ⅩⅨ(A和B)α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釔-90配合物標(biāo)記的IgG和F(ab′)2的體內(nèi)定位;〔90Y(PA-DOTA)〕-IgG和〔90Y(PA-DOTA)〕-F(ab′)2根據(jù)實(shí)施例Ⅴ，Ⅵ，Ⅻ，和ⅩⅢ中描述的步驟，制備標(biāo)題化合物，并進(jìn)行體內(nèi)研究，其結(jié)果示于表ⅤA和ⅤB中。
實(shí)施例ⅩⅩ〔153Sm(BFC)〕-CC-49-IgG和〔177Lu(BFC)〕-CC-49-IgG的體內(nèi)PH穩(wěn)定性將〔153Sm(BFC)〕-CC-49-IgG或〔177Lu(BFC)〕-CC-49-IgG放置在0.2M NaOAc緩沖液中，其PH值分別為6.0，4.0和2.8，且在室溫下，蛋白質(zhì)的濃度大約為5×10-6M，并有大約0.5配合物/抗體。在一定的時(shí)間間隔內(nèi)取樣，用HPLC(GF-250柱)分析活性153Sm或177Lu從蛋白質(zhì)上的離解作用。通常該研究要進(jìn)行5天，或直到有90%的放射性同位素都已離解。結(jié)果以每天放射性同位素的損失的初始速度來(lái)表示。結(jié)果證實(shí)了153Sm(PA-DOTA)，177Lu(PA-DOTA)，153Sm(BA-DOTA)和153Sm(OMe-BA-DOTA)與標(biāo)準(zhǔn)的〔153Sm(Bz-DTPA)〕配合物相比較，在酸性PH下具有很好的穩(wěn)定性。結(jié)果示于下表中。
配合物的這個(gè)較大的穩(wěn)定性也與153Sm和177Lu從人體和非目標(biāo)組織上(如腎、肝)較快速的排除有密切的關(guān)系。參看圖1-14。
實(shí)施例ⅩⅪ(A和B)α-(2-甲氧基-5-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物標(biāo)記的IgG和F(ab′)2的體內(nèi)定位;〔153Sm(MeO-BA-DOTA)〕-IgG和〔153Sm(MeO-BA-DOTA)〕-F(ab′)2根據(jù)實(shí)施例Ⅴ，Ⅵ，和Ⅻ中描述的方法制備標(biāo)題化合物，用實(shí)施例Ⅺ中的方法進(jìn)行體內(nèi)研究。結(jié)果示于表ⅥA和ⅥB中。
實(shí)施例ⅩⅫ153Sm(PA-DOTMA)配合物的制備向100μl的153Sm(0.3×10-3M，在0.01N HCl中;5mCi)中加入6μl的PA-DOTMA(用實(shí)施例29的方法制備的高Rf的非對(duì)映體;5mM，在Milli-QTM水中)，20μl的MES緩沖液(1.0M，PH6)和1μl的HEPES緩沖液(0.5M，PH8.7)。該溶液在渦流混合器上混合，且該混合物最終的PH值大約為6。在90℃下，將混合物加熱30分鐘后，通過(guò)HPLC在GF-250柱上分析其螯合效果，一般能得到90%或更好的產(chǎn)率。153Sm-PA-DOTMA配合物的檢定可以通過(guò)與非放射性活性的Sm配合物比較而得到。非放射性活性的配合物已在實(shí)施例42中分別被合成和鑒定過(guò)。
實(shí)施例ⅩⅩⅢ153Sm(SCN-PA-DOTMA)的制備向?qū)嵤├兄苽涞模⒁言谑覝叵吕鋮s了20分鐘的153SmPA-DOTMA配合物中加入10μl1%的硫光氣在90%的乙腈-水介質(zhì)中形成的溶液。將該混合物在渦流混合器上激烈地混合，并在室溫下放置5～20分鐘。反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行，并用HPLC分析來(lái)監(jiān)測(cè)。為了純化具有活性的153Sm配合物，用氯仿將其萃取3次(每次200μl)，使水層經(jīng)過(guò)預(yù)先用5ml的甲醇和5ml的MES緩沖液(20mM，PH5.8)處理的PRP柱體(PRP柱體＝Mini-CleanTM柱子。來(lái)自Alltech Associates，Deerfield，IL)。先用5ml的MES緩沖液和5ml的Milli-QTM水洗滌后，用900μl90%的乙腈將其萃取，回收了大約90%的活性153Sm，將開始的100μl棄去。減壓下在溫度低于40℃時(shí)將混合物蒸發(fā)至干，主要含有標(biāo)題產(chǎn)物的剩余物被用來(lái)對(duì)抗體進(jìn)行共軛作用。
實(shí)施例ⅩⅩⅣ153Sm(SCN-PA-DOTMA)對(duì)IgG和F(ab′)2CC49的共軛作用通常在一個(gè)CentriconTM濃縮器上(斷掉30K分子重量)將抗體濃縮，并交換到碳酸鹽緩沖液中(PH9.1或9.5，50mM)，使蛋白質(zhì)的濃度為1.5×10-4M或更大。為了共軛，將少量的碳酸鹽緩沖液，利用它使最終的蛋白質(zhì)濃度達(dá)1.5×10-4M，加入到153Sm(PA-DOTMA)的異硫氰酰衍生物中(實(shí)施例ⅩⅩⅡ中制備)，隨后濃縮抗體，與BFC-153Sm配合物等當(dāng)量。在渦流混合器上混合該混合物，使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)或直到有40～50%的153Sm結(jié)合到了抗體上，經(jīng)HPLC分析在GF-250柱子上表現(xiàn)出來(lái)。通過(guò)兩個(gè)串聯(lián)的離心凝膠過(guò)濾SephadexTMG-25柱(2.2ml)分離出標(biāo)記的抗體。標(biāo)記的抗體的免疫反應(yīng)性、完整性和一致性通過(guò)HPLC和前面所述的標(biāo)準(zhǔn)的生化技術(shù)來(lái)分析。
實(shí)施例ⅩⅩⅤ153Sm(PA-DOTMA)標(biāo)記的IgG和F(ab′)2CC-49的生物分布研究利用實(shí)施例Ⅺ中描述的相似方式進(jìn)行研究，結(jié)果示于表ⅦA和ⅦB中。參看圖15-28。
實(shí)施例ⅩⅩⅥ177Lu(PA-DOTMA)配合物的制備向30μl的177Lu(6×10-3M，在1.1N HCl中;4mCi)中加入36μl的PA-DOTMA(用實(shí)施例29的方法制備;5mM milli-QTM水溶液)。該溶液在渦流混合器中混合，加入115μl的MES緩沖液(1.0M，PH6.0)中和溶液使PH約為5.5～6。將該溶液在90℃時(shí)加熱30分鐘，使螯合率大于90%。讓混合物經(jīng)過(guò)預(yù)先用5ml的甲醇和5ml的MES緩沖液(20mM，PH5.8)處理的PRP柱體，用5ml的milli-QTM水洗滌柱體，用1000μl 90%的乙腈萃取絡(luò)合物，其占起始活性177Lu的78%(棄去開始的100μl的萃取液)。
實(shí)施例ⅩⅩⅦ177Lu(SCN-PA-DOTMA)的制備向?qū)嵤├鲋械玫降拇嬖谟?0%的乙腈中的177Lu(PA-DOTMA)配合物中加入6μl的10%硫光氣在90%的乙腈中形成的溶液。該溶液在渦流混合器上混合，20分鐘后，用HPLC分析異硫氰酸鹽衍生物的形成。一般地，該反應(yīng)是定量進(jìn)行的。在減壓條件下，溫度低于40℃時(shí)，蒸發(fā)1～2小時(shí)除去溶劑和過(guò)量的硫光氣，剩余物被用來(lái)與抗體進(jìn)行共軛作用。
實(shí)施例ⅩⅩⅧ177Lu(PA-DOTMA)對(duì)IgG CC-49的共軛作用將在碳酸鹽緩沖液(50mM，PH9.1)中的抗體IgG CC-49與在相同緩沖液中的等摩爾量的異硫氰酰衍生物(用實(shí)施例ⅩⅩⅦ中的方法制備)進(jìn)行混合，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行70分鐘，抗體濃度為1.5×10-4M，分離出標(biāo)記的抗體，并根據(jù)實(shí)施例ⅩⅩⅣ中描述的方法進(jìn)行鑒定。
實(shí)施例ⅩⅩⅨ177Lu(PA-DOTMA)標(biāo)記的IgG CC-49的長(zhǎng)期生物分布研究用177Lu標(biāo)記的抗體進(jìn)行長(zhǎng)期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，利用其半衰期長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)(161小時(shí))。根據(jù)實(shí)施例Ⅺ中描述的方式，該實(shí)驗(yàn)在Balb/C老鼠體中進(jìn)行三個(gè)多星期，結(jié)果示于表ⅧA中。參看圖29-34。
在圖中，下表中的點(diǎn)和數(shù)據(jù)，所用的符號(hào)是

*在帶有LS174-T腫瘤的裸體小鼠中。
**在Blab/C鼠中
*在帶有LS174-T腫瘤的裸體小鼠中**在Blab/C鼠中

















根據(jù)本文公開的發(fā)明說(shuō)明書和實(shí)例，本發(fā)明的其它具體實(shí)例對(duì)于那些熟練的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是明顯的，說(shuō)明書和實(shí)施例僅僅是作為例證，發(fā)明的真正范圍和實(shí)質(zhì)是由下面的權(quán)利要求書表示的。
權(quán)利要求
1.一種制備具有配位體、金屬離子和抗體或抗體碎片的共軛物的方法，該方法包括下列步驟中的任何一種步驟(A)將與一種La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Y或Sc金屬的離子配合的具有下式的配位體或其藥學(xué)上可接受的鹽 其中每個(gè)Q分別是氫或(CHR5)pCO2R；Q1是氫或CO2R；每個(gè)R分別是氫或C1-C4烷基；條件是Q和Q1總和中至少兩個(gè)必須不是氫，以及當(dāng)Q1是氫時(shí)，R3必須不是氫；每個(gè)R5分別是氫或C1-C4烷基；n是包括0到5的整數(shù)；p=1或2；R2是氫、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、馬來(lái)酰亞胺基、溴乙酰胺基或羧基；R3是C1-C4烷氧基、-OCH2CO2H基、羥基或氫；R4是氫、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、馬來(lái)酰亞胺基、溴乙酰胺基或羧基；條件是R2和R4不能兩個(gè)都是氫，但R2和R4中的一個(gè)必須是氫；與一種抗體或抗體碎片，在常規(guī)條件下，進(jìn)行反應(yīng)，使該配合物以共價(jià)鍵與該抗體或抗體碎片配合；或(B)將一種具有以共價(jià)鍵與一種抗體或抗體碎片結(jié)合的如步驟(A)中定義的配位體的化合物，在常規(guī)條件下，與一種La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Y或Sc進(jìn)行反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該金屬是153Sm、166Ho、90Y、149Pm、159Gd、140La、177Lu、175Yb、47Sc或142Pr。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中該金屬是153Sm、166Ho、177Lu和90Y。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該抗體或抗體碎片是一種單細(xì)胞系抗體或其碎片。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該抗體或抗體碎片是CC-49、CC-49F(ab′)2、CC-83、CC-83F(ab′)2或B72.3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該配位體是屬于式(ⅠA)其中Q1是氫。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中該配位體是屬于式(ⅠA)和R3是C1-C4烷氧基、-OCH2CO2H或羥基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該配位體是屬于式(ⅠA)其中Q1是CO2R。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該配位體屬于式(ⅠA)其中Q1是CO2R，R2是氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、馬來(lái)酰亞胺基、溴乙酰胺基或羧基。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該配位體是α-[2-(4-氨基苯基)乙基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R，S)-乙酸4，7，10-三-(R-甲基乙酸)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該配位體是α-[2-(4-異硫氰基苯基)乙基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R，S)-乙酸-4，7，10-三-(R-甲基乙酸)。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該配位體是α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該配位體是α-(4-異硫氰基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該配位體是α-[2-(4-氨基苯基)乙基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該配位體是α-[2-(4-異硫氰基苯基)乙基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該配位體是屬于式(ⅠA)其中Q1是CO2R，R4是氨基、異硫氰酸根合、脈氨基、硫代脲氨基、馬來(lái)酰亞胺基、溴乙酰胺基或羧基。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中該配位體是α-(2-甲氧基-5-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸、四氨鹽。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中該配位體是α-(2-甲氧基-5-異硫氰基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸、四氨鹽。
19.根據(jù)權(quán)利要求1步驟(A)的方法，其中該反應(yīng)條件包括應(yīng)用一種PH為8-9的緩沖溶液，在室溫下，進(jìn)行一段足以進(jìn)行共軛作用的時(shí)間，然后再將所得到的共軛物提純。
20.根據(jù)權(quán)利要求1步驟(B)的方法，其中該反應(yīng)條件包括應(yīng)用一種化合物的緩沖水溶液和金屬離子的水溶液并在室溫下攪拌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備式(IA)的一組官能化聚氨基羧酸鹽螯合劑的方法，該螯合劑可與稀土金屬離子形成配合物。該種以共價(jià)鍵與抗體或抗體片段連接的配合物可用于治療和/或診斷。本發(fā)明在癌癥治療領(lǐng)域中具有重大的意義。
文檔編號(hào)C07D257/02GK1109469SQ9411913
公開日1995年10月4日 申請(qǐng)日期1994年12月15日 優(yōu)先權(quán)日1988年6月24日
發(fā)明者羅伯特·C·鄭, 威廉·A·福代斯, 威廉·F·葛凱勒, 小威廉·J·克魯帕, 沙朗·包曼, 約瑟夫·R·加里希, 加里·基法, 肯尼思·麥克米倫, 賈米·J·西蒙, 戴維·A·威爾遜, 理查德·基思·弗蘭克 申請(qǐng)人:唐化學(xué)原料公司