專(zhuān)利名稱(chēng)：集落刺激因子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種集落刺激因子的制備方法，尤其是本發(fā)明涉及一種采用懸浮式細(xì)胞培養(yǎng)和層析技術(shù)制備含有多種活性成分的集落刺激因子的方法。
臨床上白細(xì)胞減少和功能低下癥，主要見(jiàn)于各種腫瘤病人因藥物化療和射線放療所致的骨髓造血功能抑制，骨髓移植和器官移植病人大劑量使用免疫抑制劑，治療方法主要采用血液成分輸血等綜合手段。從70年代末至今，國(guó)外學(xué)者紛紛致力于研究開(kāi)發(fā)治療白細(xì)胞減少癥的特效藥物，先后從小鼠等動(dòng)物和人體組織中分離具有集落刺激因子活性的生物物質(zhì)。現(xiàn)已能采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)多種集落刺激因子，并進(jìn)入治療應(yīng)用研究階段。集落刺激因子的藥用研究表明;為了恢復(fù)正常造血，常需設(shè)計(jì)與體內(nèi)環(huán)境相適應(yīng)的多種細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用的程序。現(xiàn)已用于臨床的粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF，粒細(xì)胞集落刺激因子G-CSF等均為基因重組技術(shù)生產(chǎn)的單一特定的CSF。其臨床療效不如多種細(xì)胞因子的聯(lián)合用藥，并常有發(fā)熱、過(guò)敏反應(yīng)等副作用，而在其生產(chǎn)工藝方法，為獲得高比活性的集落刺激因子，常采用高效液相層析或電泳等技術(shù)手段，使得集落刺激因子回收率大大降低(1.4-14%)，并常丟失原料中的其它生物活性組分。
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)上存在的問(wèn)題，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期深入的研究，發(fā)明了一種新的制備方法，用該方法制備的集落刺激因子含有多種生物活性成份，回收率高，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種集落刺激因子的制備方法，該方法采用懸浮式細(xì)胞培養(yǎng)和層析技術(shù)，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，回收率高，可達(dá)45-50%。制備的集落刺激因子產(chǎn)品含有多種生物活性物質(zhì)。
在本發(fā)明的方法中，采用人體組織為原料，所述的人體組織包括例如健康血員外周血(來(lái)源于血庫(kù));或無(wú)腦新生兒或引產(chǎn)胎兒胸腺和/或脾臟等(來(lái)源于醫(yī)院的計(jì)劃生育手術(shù)室)。在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，誘生并分離集落刺激因子產(chǎn)品，也可稱(chēng)為利白素(leupo)。在本發(fā)明的方法中，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)特別相似于人機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)環(huán)境，收獲的產(chǎn)品為人源性純天然生物制品，含有多種生物活性組分，其副反應(yīng)大大低于基因重組產(chǎn)品，能顯著改善藥物化療等所致的骨髓造血功能抑制，減輕藥物對(duì)骨髓的毒性反應(yīng)，提高白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，增加中性粒細(xì)胞活性氧生產(chǎn)能力，超化活性和吞噬殺菌能力。改善貧血和增加血小板計(jì)數(shù)，促進(jìn)造血干細(xì)胞集落形成。
因此，本發(fā)明的方法的特征在于，在無(wú)菌條件下，將人體組織制成細(xì)胞懸浮液;在含有誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中將細(xì)胞懸浮液進(jìn)行體外誘導(dǎo)和懸浮培養(yǎng)制成培養(yǎng)液，誘導(dǎo)和培養(yǎng)的條件為CO2濃度5-10%(體積)，溫度94-96%，溫度36.5-37.5℃，在恒溫下培養(yǎng)3-7日;將所述培養(yǎng)液相繼進(jìn)行超濾濃縮，鹽析，透析，得到蛋白溶液a;用陰離子交換樹(shù)脂將蛋白溶液a進(jìn)行離子交換層析，獲得蛋白溶液b;將蛋白溶液b用伴刀豆蛋白A-瓊脂糖凝膠進(jìn)行親和層析，得到蛋白溶液C;將蛋白溶液C用透析袋透析，截留分子量大于10000道爾頓，得到含有多種活性成份的集落刺激因子。
在本發(fā)明的方法中，人體組織包括例如健康血員外周血(來(lái)源于血站或血庫(kù))，無(wú)腦新生兒或引產(chǎn)胎兒胸腺和/或脾臟等(來(lái)源于醫(yī)院計(jì)劃生育手術(shù)室)。
本發(fā)明方法的具體實(shí)施步驟如下一、人外周血白細(xì)胞及無(wú)腦新生兒或引產(chǎn)胎兒胸腺和/或脾臟細(xì)胞懸浮液制備1、外周血白細(xì)胞懸浮液制備在中心血站或醫(yī)院血庫(kù)，選擇符合標(biāo)準(zhǔn)的健康獻(xiàn)血員，按下述方法制備白細(xì)胞(1)血液成分自動(dòng)分離器單采法。
(2)沉降單采法。
可參見(jiàn)《輸血技術(shù)手冊(cè)》肖星甫主編，四川科技出版社，1992，178頁(yè)，《臨床血液學(xué)》沈迪主編，人民衛(wèi)生出版社，1991，896頁(yè)。
2、無(wú)腦新生兒或引產(chǎn)胎兒脾臟和/或胸腺細(xì)胞懸浮液制備在無(wú)菌條件下摘取無(wú)腦新生兒或引產(chǎn)胎兒的胸腺和/或脾臟，撕碎后經(jīng)100目不銹鋼絲網(wǎng)揉擦過(guò)濾。收集過(guò)濾的細(xì)胞，加入Hank′s溶液，離心(大約1000-3000轉(zhuǎn)/分，5-20分鐘)后，棄去上清液，沉淀細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基制成單個(gè)細(xì)胞懸浮液。
二、細(xì)胞體外誘導(dǎo)和懸浮培養(yǎng)用上述方法獲得的白細(xì)胞或胸腺和/或脾臟細(xì)胞，經(jīng)錐蘭染色確定細(xì)胞活性≥70%，用選自下述之一的培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)RPMI-1640，改良伊格培養(yǎng)基MEM，D-改良伊格培養(yǎng)基DMEM(此三種均為美國(guó)的Gibco公司生產(chǎn))，三種均為完全培養(yǎng)基;添加組分及濃度范圍為HEPES25-50mM，谷氨酰胺2-10mM，毒霉素100-200μg/ml，鏈霉素100-200μg/ml，以及包括下述組分及含量的誘導(dǎo)劑氯化鋰1-10mM，植物血凝集-P 1-10μg/ml，脂多糖0.1-1μg/ml，AB+型人血清2-5%(重量)，PH值為7.2-7.6。其中mM為毫摩爾，M為摩爾，上文或下文中也都如此表示，除非另有說(shuō)明。
用上述完全培養(yǎng)基調(diào)整白細(xì)胞濃度至3-5×106/ml，胸腺和/或/脾臟細(xì)胞濃度1.5-3×106/ml，在無(wú)菌條件下灌裝培養(yǎng)瓶，在溫度36.5-37.5℃，CO2濃度5-10%(體積)，溫度94-96%條件下恒溫誘導(dǎo)和培養(yǎng)3-7日。
三、超濾濃縮及鹽析、透析收集上述細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)紗布過(guò)濾，離心(大約9000轉(zhuǎn)/分，大約10-30分鐘)，上清液經(jīng)超濾器超濾濃縮15至30倍，超濾膜截留的分子量范圍為10000至50000道爾頓，超濾器如德國(guó)產(chǎn)SarterieusⅡ型超濾器，在室溫下加入硫酸銨至大約75-90%飽和度，置1-5℃下輕輕攪拌過(guò)夜，次日離心(大約3000轉(zhuǎn)/分，大約10-30分鐘)，棄上清液，沉淀蛋白的濃度為500-600克/升，沉淀蛋白用無(wú)熱源蒸餾水溶解后裝入透析袋至1/2-1/3體積(透析膜截留的分子量大于10000道爾頓)，用無(wú)熱源蒸餾水透析至無(wú)NH4+，再用緩沖溶液A透析過(guò)夜，得到蛋白溶液a，其中緩沖溶液A是0.01M三羥甲基氨基甲烷·鹽酸，PH值為7.4，含0.01%(重量)聚乙二醇(其分子量為6000)，0.02%(重量)的疊氮鈉。
四、二乙基氨基乙基-瓊脂糖凝膠離子交換層析二乙基氨基乙基-瓊脂糖凝膠DEAE-Sepharose按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)活化、消毒處理后裝填層析柱，用緩沖液A平衡之，上述透析后的蛋白液a用緩沖液A洗柱至紫外監(jiān)測(cè)儀基線(OD280nm)平穩(wěn)。然后用緩沖液A補(bǔ)充氯化鈉至0.25M，進(jìn)行洗脫、收集洗脫下的蛋白溶液，得到蛋白溶液b。
五、伴刀豆蛋白A-瓊脂糖凝膠親和層析伴刀豆蛋白A-瓊脂糖凝膠ConA-Sepharose按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)活化，消毒處理后裝填層析柱用緩沖液B(緩沖液A補(bǔ)充氯化鈣1mM，氯化鎂1mM，氯化錳1mM，氯化鈉0.5M，PH7.4)平衡之。上樣DEAE-Sepharose洗脫蛋白液，用緩沖液B洗柱至紫外監(jiān)測(cè)儀基線(OD280nm)平穩(wěn)。然后用緩沖液B補(bǔ)充)α-甲基-D-甘露糖苷0.2M進(jìn)行洗脫，收集洗脫下的蛋白溶液，得到蛋白溶液C，將蛋白溶液C裝入透析袋，截留的分子量在10000至50000道爾頓之間，用無(wú)熱源蒸餾水透析24-48小時(shí)，得到產(chǎn)物，測(cè)定它是一組糖基化蛋白或多肽，含有GM-CSF，G-CSF，IL-1，IL-3，IL-6，EGF等多種細(xì)胞活性因子。
將上述產(chǎn)物在干燥箱中于冷凍條件下干燥，到基本干燥即可，冷凍的條件為溫度為0℃-60℃，時(shí)間為5-100小時(shí)，壓力為0.01-0.1托。由此得到蛋白制品。
為制備含有本發(fā)明所述的藥物組分，可將經(jīng)上述分離提純的蛋白制品，與適當(dāng)?shù)臒o(wú)活性且宜于制成藥物之載體相混合，適合的載體通常采用適于靜脈注射的D-甘露糖，在適宜濃度下(3-5%W)與蛋白制品混合，正壓過(guò)濾除菌后，冰凍干燥。
為了確定集落刺激因子活性，將純系BALB/C小鼠骨髓細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液。單個(gè)細(xì)胞可固相化于含胎牛血清的瓊脂半固體培養(yǎng)基中。當(dāng)存在有適當(dāng)集落刺激因子時(shí)，單個(gè)細(xì)胞便會(huì)增殖分化，形成和發(fā)展集落，可在顯微鏡下計(jì)數(shù)集落，并可提出單個(gè)集落進(jìn)行染色觀察(參見(jiàn)Burgess，A.W.Nice E.C酶學(xué)方法.第116卷，學(xué)術(shù)出版社.奧蘭多(1985).和Burgess.A.W生長(zhǎng)因子和干細(xì)胞 科學(xué)出版社，紐約(1984))。
用下述表1-2，

圖1-5說(shuō)明本發(fā)明產(chǎn)品的特性。
一、集落刺激因子對(duì)環(huán)磷酰胺介導(dǎo)的小鼠白細(xì)胞減少癥外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖1)和分類(lèi)計(jì)數(shù)(圖2)的效應(yīng)。
二、集落刺激因子對(duì)環(huán)磷酰胺介導(dǎo)的小鼠骨髓造血功能抑制的重建效應(yīng)(圖3)三、集落刺激因子對(duì)環(huán)磷酰胺注射小鼠體重和存活率的影響(表1)四、集落刺激因子對(duì)小鼠和人骨髓干細(xì)胞體外生長(zhǎng)和分化的刺激效應(yīng)(表2)五、集落刺激因子凝膠電泳和凝膠過(guò)濾色譜的分子量分布(圖4)六、本發(fā)明得到的制品(利白素)與G-CSF對(duì)小白鼠的治療對(duì)照(圖5)在進(jìn)行本發(fā)明的方法中，對(duì)儀器和材料要求1、一切與制品的接觸的工具，器皿等不污染熱原2、用于體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞活性≥70%3、生產(chǎn)所用各種化學(xué)藥品不低于分析純級(jí)，符合藥典規(guī)定下述實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，而無(wú)限制其范圍的作用。
實(shí)施例1用血液成分自動(dòng)分離器單采法或沉降單采法將人外周血制成白細(xì)胞懸浮液，經(jīng)錐蘭染色確定細(xì)胞活性大于70%，用完全培養(yǎng)基調(diào)整白細(xì)胞濃度至4×106/ml，所述的完全培養(yǎng)基是以RPML-1640為基料，還含有HEPES30mM，谷氨酰胺6mM，青霉素150μg/ml，鏈霉素130μg/ml，以及含下述組分的誘導(dǎo)劑氯化鋰5mM，植物血凝集-P5g/ml，脂多糖0.5μg/ml，AB+型人血清3%(重量)，完全培養(yǎng)基的PH值為7.4。在無(wú)菌條件下裝入培養(yǎng)瓶，在溫度為37.2℃，CO2濃度6%(體積)，溫度95%條件下恒溫誘導(dǎo)培養(yǎng)5天。收集上述細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)4層紗布過(guò)濾，離心(9000轉(zhuǎn)/分，大約15分鐘)，上清液經(jīng)超濾器超濾濃縮20倍。超濾膜截留的分子量范圍為10000-50000道爾頓，加入硫酸銨至80%飽和度，置4℃下輕輕攪拌過(guò)夜(大約12小時(shí))。次日離心(3000轉(zhuǎn)/分，15分鐘)，棄上清液，沉淀蛋白的濃度為561克/升(80%飽和度)，用無(wú)熱源蒸餾水溶解沉淀的蛋白之后裝入透析袋1/2-1/3體積(透析膜截留的分子量為大于10000道爾頓)，用無(wú)熱源蒸餾水透析至無(wú)NH4+，再用緩沖溶液A透析過(guò)夜，得到蛋白溶液a，其中緩沖溶液A為0.01M三羥甲基氨基甲烷·鹽酸，PH值為7.4，其中含有0.01%(重量)聚乙二醇(其分子量為6000)和0.02%(重量)疊氮鈉。
二乙基氨基乙基-瓊脂糖凝膠(DEAE-Sepharose)按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)活化，消毒處理后填裝層析柱，用緩沖溶液A平衡之，上述透析后的蛋白溶液a用緩沖溶液A洗柱至紫外監(jiān)測(cè)儀基線(OD280nm)平穩(wěn)，然后用緩沖液A補(bǔ)充氯化鈉至0.25M進(jìn)行洗脫，收集洗脫下的蛋白溶液，得到蛋白溶液b。
伴刀豆蛋白A-瓊脂糖凝膠(ConA-Sepharose)按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)活化，消毒處理后裝填層析柱用緩沖溶液B平衡之，緩沖液B是緩沖液A補(bǔ)充氯化鈣1mM，氯化鎂1mM，氯化錳1mM，氯化鈉0.5M，PH值為7.4。上述洗脫的蛋白液用緩沖液B洗柱至紫外監(jiān)測(cè)儀基線(OD280nm)平穩(wěn)，然后用緩沖液B補(bǔ)充α-甲基-D-甘露糖苷0.2M進(jìn)行洗脫，收集洗脫下的蛋白溶液，得到蛋白溶液C。將蛋白溶液C裝入透析袋，截面的分子量在10000至50000道爾頓范圍內(nèi)，用無(wú)熱源蒸餾水透析40小時(shí)，測(cè)定它是一組糖基化蛋白或多肽，含有GM-CSF，G-CSF，IL-1，IL-3，IL-6，EGF等多種細(xì)胞活性因子。
實(shí)施例2制備過(guò)程和操作條件相同于實(shí)施例1，不同的是使用胸腺和/或脾臟細(xì)胞，細(xì)胞濃度為2.3×106/ml，培養(yǎng)是改良伊格培養(yǎng)基MEM，最終所得結(jié)果相同于實(shí)施例1。
以上對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兓蚋淖?，這都未超出本發(fā)明的范圍。

權(quán)利要求
1.一種制備含多種活性成分的集落刺激因子的方法，其特征在于，在無(wú)菌條件下將人體組織制成細(xì)胞懸浮液；在含有誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中將細(xì)胞懸浮液進(jìn)行體外誘導(dǎo)和懸浮培養(yǎng)，制成培養(yǎng)液；誘導(dǎo)和培養(yǎng)的條件為CO2濃度5-10%(體積)，濕度94-96%，溫度36.5-37.5℃，在恒溫下誘導(dǎo)和培養(yǎng)3-7日；將所述培養(yǎng)液相繼進(jìn)行超濾濃縮，鹽析，透析，得到蛋白溶液a；用陰離子交換樹(shù)脂將蛋白溶液a進(jìn)行離子交換層析，獲得蛋白溶液b，將蛋白溶液b用伴刀豆蛋白A-瓊脂糖凝膠進(jìn)行親和層析，得到蛋白液C；將蛋白溶液C用透析袋透析，截留分子量大于10000道爾頓，得到含有多種活性成份的集落刺激因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述細(xì)胞懸浮液是人外周血白細(xì)胞懸浮液，無(wú)腦新生兒或引產(chǎn)胎兒脾臟和/或胸腺細(xì)胞懸浮液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)劑是含有植物血凝素-P，脂多糖，氯化鋰和AB+人血清的誘導(dǎo)劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在超濾濃縮中超濾膜截留的分子量在10000至50000道爾頓范圍內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在制備蛋白溶液a時(shí)的透析中透析膜截留的分子量大于10000道爾頓。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞是人外周血白細(xì)胞，無(wú)腦新生兒或引產(chǎn)胎兒胸腺和/或脾臟細(xì)胞，所述細(xì)胞的活性大于70%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，從蛋白溶液C中透析截留的分子量在10000至50000道爾頓范圍內(nèi)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的陰離子交換樹(shù)脂是二乙基氨基乙基-瓊脂糖凝膠離子交換樹(shù)脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用懸浮式細(xì)胞培養(yǎng)和層析技術(shù)制備含多種生物活性成分的集落刺激因子的方法，本發(fā)明的特點(diǎn)是，將人體組織制成細(xì)胞懸浮液，經(jīng)體外誘導(dǎo)和培養(yǎng)，再經(jīng)超濾、鹽析、透析以及離子交換層析和糖蛋白親和層析，透析后制成含多種活性成分的集落刺激因子。該方法的優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，回收率高，制品療效好。
文檔編號(hào)C07K1/14GK1106461SQ9411879
公開(kāi)日1995年8月9日 申請(qǐng)日期1994年12月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月7日
發(fā)明者高志華, 李德全, 李正東 申請(qǐng)人:深圳時(shí)瑞科技有限公司