專利名稱：長期穩(wěn)定的制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及G-CSF(粒性白細(xì)胞集落刺激因子)制劑，尤其涉及活性組分損失少及低甲硫氨酸-氧化的G-CSF含量的特別穩(wěn)定的G-CSF制劑。
背景技術(shù)：
G-CSF是一種分子量約為20,000的糖蛋白，它作用于嗜中性白細(xì)胞的前體細(xì)胞以促進(jìn)它們?cè)鲋澈头只墒臁?br> 通過培養(yǎng)患口腔基底癌病人的一種腫瘤細(xì)胞系，可提純出高純度的人G-CSF。目前，采用基因工程技術(shù)已成功地克隆了人G-CSF基因，可從徽生物或動(dòng)物細(xì)胞大量生產(chǎn)重組人G-CSF。我們也已將這種提純的G-CSF轉(zhuǎn)化為制劑產(chǎn)品，并作為抗感染藥供應(yīng)市場(chǎng)(日本專利2116515)。
G-CSF的用量極小，即含有0.1-1000μg(優(yōu)選5-500μg)G-CSF的制劑通?？晒┮粋€(gè)成年人每周給藥1-7次。但是，這種G-CSF易被安瓿、注射器等的壁吸附。G-CSF不穩(wěn)定，對(duì)環(huán)境因素如溫度、濕度、氧、UV射線等非常敏感，并可發(fā)生物理或化學(xué)變化包括締合、聚合或氧化，這將導(dǎo)致活性大大喪失。
因此，設(shè)計(jì)了多種配方以向市場(chǎng)提供穩(wěn)定的G-CSF制劑。例如，含有以下至少一種成分的制劑(a)選自蘇氨酸、色氨酸、賴氨酸、羥賴氨酸、組氨酸、精氨酸、半胱氨酸、胱氨酸和甲硫氨酸的至少一種氨基酸；(b)至少一種含硫的還原劑；或(c)至少一種抗氧劑(日本專利2577744)。也有含表面活性劑如聚山梨酯為穩(wěn)定劑的G-CSF制劑(日本專利申請(qǐng)146826/88)。
也有報(bào)道含有麥芽糖、棉子糖、蔗糖、海藻糖或氨基糖的G-CSF凍干制劑，它可以限制G-CSF在容器中的沉積從而抑制其化學(xué)變化(日本專利公開504784/96)。
市場(chǎng)上的一些產(chǎn)品，通常含有蛋白質(zhì)如人血清白蛋白或純化的明膠作為穩(wěn)定劑，用來抑制化學(xué)或物理變化。然而，添加這種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑也帶來了一些問題，例如，必需的且非常復(fù)雜的除去病毒污染的過程。
然而，在沒有這種蛋白質(zhì)的情況下，又可能產(chǎn)生Met(甲硫氨酸)-氧化的G-CSF，這就帶來了變質(zhì)的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種G-CSF制劑，它可更穩(wěn)定地長期貯存，并且Met-氧化的G-CSF的含量較低。
經(jīng)過仔細(xì)的針對(duì)上述目的的研究，我們完成了本發(fā)明G-CSF制劑，通過加入特定氨基酸聯(lián)用為穩(wěn)定劑，可使該制劑在長期貯存后仍含高剩余率的G-CSF，并且其中Met-氧化的G-CSF的含量較低。
因此，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定的G-CSF制劑，該制劑在25℃3個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，或在40℃2個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，或在50℃1個(gè)月的加速試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，或在60℃2周的加速試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，在50℃1個(gè)月或60℃2周的加速試驗(yàn)后Met-氧化的G-CSF為1％或更少。
本發(fā)明還提供含有一種或多種選自賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和天冬酰胺的氨基酸；一種或多種選自疏水性氨基酸的氨基酸；和甲硫氨酸的所述G-CSF制劑。
本發(fā)明提供所述G-CSF制劑，其中的疏水性氨基酸選自苯丙酸、色氨酸和亮氨酸。
本發(fā)明還提供含有一種或多種選自賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸的氨基酸；一種或多種選自苯丙氨酸、色氨酸和亮氨酸的氨基酸；和甲硫氨酸的所述G-CSF制劑。
本發(fā)明還提供含有苯丙氨酸、精氨酸和甲硫氨酸的所述G-CSF制劑。
本發(fā)明還提供基本上不含蛋白質(zhì)為穩(wěn)定劑的所述G-CSF制劑。
本發(fā)明還提供凍干制劑形式的所述G-CSF制劑。
本發(fā)明還提供另外含有甘露醇的所述G-CSF制劑。
本發(fā)明還提供另外含有表面活性劑的所述G-CSF制劑。
本發(fā)明還提供其中表面活性劑為聚氧乙烯脫水山梨糖醇烷基酯的所述G-CSF制劑。
本發(fā)明還提供其中表面活性劑為吐溫20和/或80的G-CSF制劑。
本發(fā)明還提供pH值為5-7的所述G-CSF制劑。
本發(fā)明還提供pH值為5.5-6.8的所述G-CSF制劑。
本發(fā)明還提供pH值為6.5的所述G-CSF制劑。
本發(fā)明還提供G-CSF產(chǎn)自CHO細(xì)胞的所述G-CSF制劑。
本發(fā)明還提供一種穩(wěn)定的G-CSF制劑，所述制劑在25℃3個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，或在40℃2個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，或在50℃1個(gè)月的加速試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，或在60℃2周的加速試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，其特征在于含有一種或多種選自賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和天冬酰胺的氨基酸；和一種或多種選自疏水性氨基酸的氨基酸；其中pH值為5-7。
本發(fā)明還提供一種穩(wěn)定的G-CSF制劑，所述制劑在25℃3個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，或在40℃2個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，或在50℃1個(gè)月的加速試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，或在60℃2周的加速試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，其特征在于含有一種或多種選自賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸的氨基酸；和一種或多種選自苯丙氨酸、色氨酸和亮氨酸的氨基酸；其中pH值為5-7。
本發(fā)明還提供pH值為6.5的上述兩種制劑中的任何一種G-CSF制劑。
本發(fā)明還提供一種抑制含有甲硫氨酸殘基的生理活性蛋白質(zhì)在甲硫氨酸殘基上氧化產(chǎn)生變體的方法，包括將甲硫氨酸加到含有所述蛋白質(zhì)的組合物中。
本發(fā)明提供所述方法，其中生理活性蛋白質(zhì)為細(xì)胞因子或生理活性肽。
本發(fā)明提供所述方法，其中生理活性蛋白質(zhì)為集落刺激因子或PTH。
本發(fā)明提供所述方法，其中生理活性蛋白質(zhì)為G-CSF、紅細(xì)胞生成素或PTH。
本發(fā)明提供所述方法，其中不存在作為穩(wěn)定劑的其它蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供所述方法，所述組合物含有具有甲硫氨酸殘基的生理活性蛋白質(zhì)，其中所述組合物為凍干或溶液形式。
本發(fā)明還提供含有具有甲硫氨酸殘基的生理活性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定組合物，其中還含有甲硫氨酸和一種或多種其它氨基酸。
本發(fā)明提供含有具有甲硫氨酸殘基的生理活性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定組合物，其中所述一種或多種的氨基酸選自賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和酪氨酸。
本發(fā)明提供含有具有甲硫氨酸殘基的生理活性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定組合物，其特征在于它不含其他蛋白質(zhì)為穩(wěn)定劑。
附圖簡(jiǎn)述

圖1為60℃加速試驗(yàn)2周后，用下述方法2測(cè)定的試樣34和36的色譜圖。
圖2為剛制備后及50℃加速試驗(yàn)1個(gè)月后，用下述方法2測(cè)定的試樣34-36的色譜圖。
圖3為用實(shí)施例6中方法測(cè)定的甲狀旁腺素溶液制劑的HPLC色譜圖(50℃下貯存3天)，這表明加入甲硫氨酸可抑制甲硫氨酸殘基的氧化。其中，中央最高峰對(duì)應(yīng)著未破壞PTH，而標(biāo)為Met-8和Met-18的峰分別對(duì)應(yīng)著在第8和18甲硫氨酸殘基氧化的PTH。
本發(fā)明最優(yōu)選實(shí)施方案用于本發(fā)明制劑的G-CSF包括任何高純度的人G-CSF。具體而言，它可衍生于天然來源或基因重組，只要它基本上具有與哺乳動(dòng)物的G-CSF特別是人G-CSF一樣的生物活性基因重組的G-CSF可與天然G-CSF具有相同的氨基酸序列，或在所述氨基酸序列中含有中間缺失、取代或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，只要它也具有所述的生物活性。本發(fā)明中的G-CSF可用任何方法制備，例如可用各種技術(shù)從人腫瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)物中提取和純化，或在大腸桿菌、酵母菌、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、C127等中采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)，然后再用各種技術(shù)提取和純化。優(yōu)選G-CSF在大腸桿菌、酵母菌或CHO中采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)，最優(yōu)選在CHO中采用基因重組生產(chǎn)。
本發(fā)明G-CSF制劑優(yōu)選基本上不含蛋白質(zhì)，如人血清白蛋白或純化明膠為穩(wěn)定劑。
與已知的G-CSF制劑相比，本發(fā)明G-CSF制劑非常穩(wěn)定，該制劑在25℃3個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的、優(yōu)選95％或更多的G-CSF，或在40℃2個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的、優(yōu)選95％或更多的G-CSF，或在50℃1個(gè)月的加速試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的、優(yōu)選95％或更多的G-CSF，或在60℃2周的加速試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的、優(yōu)選95％或更多的G-CSF，和或在50℃1個(gè)月或60℃2周的加速試驗(yàn)后含有1％或更少、優(yōu)選低于檢測(cè)限的Met-氧化的G-CSF。
本發(fā)明G-CSF制劑的一個(gè)實(shí)施例是一種G-CSF制劑，該制劑中含有一種或多種選自賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和天冬酰胺，優(yōu)選一種或多種選自賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸的氨基酸；一種或多種選自疏水性氨基酸，優(yōu)選選自苯丙氨酸、色氨酸和亮氨酸的氨基酸；和甲硫氨酸。
本發(fā)明G-CSF制劑的另一實(shí)施例是一種穩(wěn)定的G-CSF制劑，該穩(wěn)定制劑在25℃3個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，或在40℃2個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，或在50℃1個(gè)月的加速試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，或在60℃2周的加速試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，并且在50℃1個(gè)月或60℃2周的加速試驗(yàn)后檢測(cè)Met-氧化的G-CSF的含量為1％或更少，其特征在于含有一種或多種選自賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和天冬酰胺的氨基酸，優(yōu)選一種或多種選自賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸的氨基酸；一種或多種選自疏水性氨基酸，優(yōu)選選自苯丙氨酸、色氨酸和亮氨酸的氨基酸；和甲硫氨酸。其中pH值為5-7。
本發(fā)明所用氨基酸包括游離氨基酸及其鹽如鈉鹽、鉀鹽和鹽酸化物。本發(fā)明制劑可含有這些氨基酸的D-、L-和DL-變體，優(yōu)選為L-變體及其鹽。
根據(jù)所用氨基酸的類型，采用下述實(shí)驗(yàn)方法確定加入本發(fā)明制劑中的氨基酸的量的優(yōu)選范圍。通常，所加的最終劑量為0.001-50mg/ml。例如，優(yōu)選加入0.1-25mg/ml、更優(yōu)選1-20mg/ml的苯丙氨酸。優(yōu)選加入0.1-25mg/ml、更優(yōu)選1-20mg/ml的精氨酸，和優(yōu)選加入0.001-5mg/ml、更優(yōu)選0.01-4mg/ml的甲硫氨酸。
本發(fā)明制劑可含有等滲劑，例如，聚乙二醇；和糖類如右旋糖酐，甘露醇、山梨醇、肌醇、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖和棉子糖。優(yōu)選甘露醇。制劑中所加甘露醇的量為1-100mg/ml、更優(yōu)選5-60mg/ml。
本發(fā)明制劑還進(jìn)一步含有表面活性劑。典型的表面活性劑包括非離子表面活性劑，例如，脫水山梨醇脂肪酸酯如脫水山梨醇單辛酸酯、脫水山梨醇單月桂酸酯、脫水山梨醇單棕櫚酸酯；甘油脂肪酸酯如甘油一辛酸酯、甘油一豆蔻酸酯、甘油一硬脂酸酯；聚甘油脂肪酸酯如十甘油基一硬脂酸酯、十甘油基二硬脂酸酯、十甘油基一亞油酸酯；聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯如聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇三硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯如聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯；聚氧乙烯甘油基脂肪酸酯如聚氧乙烯甘油基單硬脂酸酯；聚乙二醇脂肪酸酯如聚乙二醇二硬脂酸酯；聚氧乙烯烷基醚如聚氧乙烯十二烷基醚；聚氧乙烯-聚氧丙烯烷基醚如聚氧乙烯-聚氧丙烯乙二醇醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯十六基醚；聚氧乙烯烷基苯基醚如聚氧乙烯壬基苯基醚；聚氧乙烯硬化蓖麻油如聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油(聚氧乙烯氫化蓖麻油)；聚氧乙烯蜂蠟衍生物如聚氧乙烯山梨醇蜂蠟；聚氧乙烯羊毛脂衍生物如聚氧乙烯羊毛脂；聚氧乙烯脂肪酰胺如HLB值為6-18的聚氧乙烯硬脂酰胺。
陰離子表面活性劑，例如，具有C10-C18烷基的烷基硫酸鹽如十六烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉、油基硫酸鈉；平均具有2-4個(gè)環(huán)氧乙烷(EO)摩爾數(shù)單位和C10-C18烷基的聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽，如聚氧乙烯十二烷基硫酸鈉；具有C8-C18烷基的烷基磺基琥珀酸酯鹽如十二烷基磺基琥珀酸鈉。
天然表面活性劑，例如，卵磷脂；甘油磷脂類；神經(jīng)鞘磷脂類如神經(jīng)鞘磷脂；含C12-18脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯。一種或多種上述表面活性劑可聯(lián)用加入本發(fā)明制劑中。
優(yōu)選表面活性劑為聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯，更優(yōu)選為吐溫20、21、40、60、65、80、81、85，最優(yōu)選為吐溫20和80。
典型地，加入本發(fā)明G-CSF制劑中的表面活性劑的量為0.0001-1重量份/每重量份G-CSF，優(yōu)選為0.01-5重量份/每重量份G-CSF，最優(yōu)選為0.2-2重量份/每重量份G-CSF。
本發(fā)明G-CSF制劑的pH值優(yōu)選為5-7，更優(yōu)選為5.5-6.8，更優(yōu)選為6-6.7，最優(yōu)選為6.5。
如有需要，本發(fā)明G-CSF制劑可進(jìn)一步含有稀釋劑、增溶劑、賦形劑、pH值調(diào)節(jié)劑、安撫劑、緩沖劑、含硫還原劑、抗氧劑等。例如，含硫還原劑包括N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、巰基乙酸及其鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽、和含巰基的化合物如含1-7個(gè)碳原子的硫代鏈烷酸?？寡鮿┌ó惪箟难?、二丁基(對(duì))甲酚、丁基羥基茴香醚、α-生育酚、醋酸生育酚、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸基棕櫚酸酯、L-抗壞血酸基硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊酯、沒食子酸丙酯或螫合劑如乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉、偏磷酸鈉。也可加入其它常規(guī)組分，例如無機(jī)鹽如氯化鈉。氯化鉀、氯化鈣、磷酸鈉、磷酸鉀、碳酸氫鈉；和有機(jī)鹽如檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、醋酸鈉。
本發(fā)明G-CSF制劑包括溶液劑、凍干制劑、噴霧干燥劑等。最優(yōu)選凍干制劑。
按已知溶液劑技術(shù)，將組分溶于含水緩沖劑如磷酸緩沖液(優(yōu)選為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉體系)和/或檸檬酸緩沖液(優(yōu)選為檸檬酸鈉緩沖液)，可制得本發(fā)明溶液制劑，或按標(biāo)準(zhǔn)方法經(jīng)凍干或噴霧-干燥制得溶液制劑。
本發(fā)明穩(wěn)定的G-CSF制劑可采用非腸道途徑給藥如注射(皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射)或經(jīng)皮、粘膜、鼻腔、肺部給藥，但也可經(jīng)口服給藥。
本發(fā)明G-CSF制劑可包裝于密封的無菌塑料或玻璃容器中，使用前用純水(注射用滅菌水)溶解。
本發(fā)明制劑中G-CSF的量可根據(jù)所治疾病的種類、疾病的嚴(yán)重性、患者年齡或其它因素而確定，但一般采用1-1000μg/ml，優(yōu)選10-800μg/ml，更優(yōu)選為50-500μg/ml。
本發(fā)明制劑在臨床上非常有用，已發(fā)現(xiàn)它們可提高基于免疫應(yīng)答如病人抵抗力的保護(hù)功能；或者，當(dāng)他們與其它藥物如抗生素、抗菌劑或抗癌劑聯(lián)用于感染疾病或癌癥的化學(xué)療法時(shí)，可增強(qiáng)活性。因此，本發(fā)明制劑可與這些藥物聯(lián)合給藥。
如下述實(shí)施例所證實(shí)的，本發(fā)明G-CSF制劑在25℃3個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后，或在40℃2個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后，或在50℃1個(gè)月的加速試驗(yàn)后，或在60℃2周的加速試驗(yàn)后仍顯示出非常高的剩余率。而且，在50℃1個(gè)月或60℃2周的加速試驗(yàn)后只觀察到有少量的甲硫氨酸-氧化的G-CSF。本發(fā)明的G-CSF制劑在25℃3個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的、優(yōu)選95％或更多的G-CSF，或在40℃2個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的、優(yōu)選95％或更多的G-CSF，或在50℃1個(gè)月的加速試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的、優(yōu)選95％或更多的G-CSF，或在60℃2周的加速試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的、優(yōu)選95％或更多的G-CSF，在50℃1個(gè)月或60℃2周的加速試驗(yàn)后含有1％或更少、優(yōu)選低于檢測(cè)限的Met-氧化的G-CSF。
從下述實(shí)施例的結(jié)果可見，通過加入一種或多種選自賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和天冬酰胺的氨基酸，和一種或多種選自疏水性氨基酸的氨基酸，可提高本發(fā)明制劑在常溫長期貯存試驗(yàn)后G-CSF的剩余率；并且通過加入甲硫氨酸，可使Met-氧化的G-CSF的濃度低于檢測(cè)限。期望不受任何特定理論的約束，我們推測(cè)加入的甲硫氨酸代替了G-CSF的甲硫氨酸殘基被氧化，這樣就減少M(fèi)et-氧化的G-CSF量。
含有甲硫氨酸殘基的生理活性蛋白質(zhì)易于在甲硫氨酸殘基氧化產(chǎn)生生理活性較小的變體，當(dāng)向這種生理活性蛋白質(zhì)的細(xì)合物中加入甲硫氨酸時(shí)，即可防止所述生理活性蛋白在甲硫氨酸殘基氧化產(chǎn)生變體。當(dāng)所述生理活性蛋白質(zhì)組合物中不含其它蛋白質(zhì)為穩(wěn)定劑或所述蛋白質(zhì)組合物為凍干或溶液制劑時(shí)，最有可能在甲硫氨酸殘基氧化產(chǎn)生變體，因此加入甲硫氨酸似乎特別有效。
將其它一種或多種氨基酸加入本發(fā)明組合物中，可制得穩(wěn)定的含具有甲硫氨酸殘基的生理活性蛋白質(zhì)組合物，它可抑制所述生理活性蛋白質(zhì)在甲硫氨酸殘基氧化產(chǎn)生變體并抑制其分解、聚集等。
出于這種目的而加入的氨基酸包括賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和酪氨酸，優(yōu)選為組氨酸、精氨酸和苯丙氨酸。
本發(fā)明的生理活性蛋白質(zhì)包括。例如細(xì)胞因子如白介素(例如，IL-1至L-13)、集落刺激因子(例如，粒性白細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、粒性白細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、紅細(xì)胞生成素(EPO)干擾素(例如，IFN-α、β、γ)、腫瘤壞死因子(例如TNF-α、IFN-β)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、LIF(白細(xì)胞抑制因子)、制瘤素M(OSM)、移動(dòng)抑制因子(MGF)、趨化因子(例如，IL-8、LD78、MCP-1).
生理活性的肽例如胰島素、高血糖素、甲狀旁腺素(PTH)、胃泌素、選擇蛋白、縮膽囊素、腸抑胃肽、P物質(zhì)、胃動(dòng)素、脾多肽、神經(jīng)降壓肽、腸高血糖素、分泌胃泌素的肽、生長抑素-28、強(qiáng)啡肽、促生長激素神經(jīng)肽、香草環(huán)己酮、胰抑制素(pancreostatin)和zeopsin；生物酶如在活性中心含有甲硫氨酸殘基的酶(如蘋果酸脫氫酶)；及它們的變體。
本發(fā)明生理活性蛋白優(yōu)選為細(xì)胞因子或生理活性肽，更優(yōu)選為集落刺激因子如G-CSF或紅細(xì)胞生成素或PTH，更優(yōu)選為G-CSF、紅細(xì)胞生成素或PTH。
下面的實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不作任何限制。在本發(fā)明描述的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可能加以變化和修飾，但是這些變化和修飾也包括在本發(fā)明中。
實(shí)施例實(shí)驗(yàn)方法制備溶液劑并無菌過濾，其中所含各種組分的含量如下列表1和2所示，然后精密取1mL無菌包裝于小瓶中并凍干。凍干后，嚴(yán)密蓋上瓶蓋制備G-CSF凍干制劑。表1




每種情況中，均加入10mg苯丙氨酸(相當(dāng)于60mM)。氨基酸2的加入量等于60mM(與氨基酸1等摩爾)。

每種情況中，均加入10mg精氨酸(相當(dāng)于60mM)。氨基酸2的加入量等于60mM(與氨基酸1等摩爾)。
表2

將含有無菌制備的G-CSF的凍干制劑置于恒溫箱中60℃2周和1個(gè)月；50℃1、2和3個(gè)月；40℃2、4和6個(gè)月；和25℃3和6個(gè)月。
將加速和未加速試驗(yàn)的制劑用精密量取的1mL純水溶解，配制試樣供下面分析用。
用下列方法1測(cè)定每只小瓶中G-CSF的剩余率(％剩余)。同時(shí)用下列方法2測(cè)定Met-氧化的G-CSF的量。
方法1用C4反相柱(4.6mm×250mm，300埃)經(jīng)反相高效液相色譜測(cè)定每只小瓶中G-CSF的量，流動(dòng)相由純水、乙脯和三氟乙酸組成。進(jìn)樣量為5μgG-CSF，并用乙腈梯度洗脫，在215nm分光測(cè)定。
60℃2周和50℃1個(gè)月加速試驗(yàn)后，和60℃2周和1個(gè)月；50℃1、2和3個(gè)月；40℃2、4和6個(gè)月；和25℃3和6個(gè)月貯存后，用該法測(cè)定G-CSF的含量，并按面的方程式計(jì)算G-CSF的％剩余。

方法2用C4反相柱(4.6mm×25mm，300埃)經(jīng)反相高效液相色譜測(cè)定每個(gè)試樣中未破壞的G-CSF和Met-氧化的G-CSF的量，流動(dòng)相由純水、乙腈和三氟乙酸組成。用乙腈梯度洗脫G-CSF，在215nm分光測(cè)定。
用該法測(cè)定未破壞的G-CSF和Met-氧化的G-CSF峰面積，并按下面的方程式計(jì)算60℃2周和50℃1個(gè)月加速試驗(yàn)后Met-氧化的G-CSF含量。

實(shí)施例1pH值對(duì)G-CSF剩余率的影響按方法1中的方程式計(jì)算60℃2周和50℃1個(gè)月加速試驗(yàn)后按表1中不同pH值制備的試樣1和2中G-CSF的剩余率。結(jié)果見表3。
表3

如表所示，pH值為6.5的制劑比pH值為7.4更穩(wěn)定。
實(shí)施例2
各種氨基酸對(duì)G-CSF剩余率的影響(1)按表1所列氨基酸制備試樣3-6(含G-CSF100μg)和試樣7-10(含G-CSF250μg)，按方法1中的方程式計(jì)算60℃2周和50℃1個(gè)月加速試驗(yàn)后上述制劑中G-CSF的剩余率。結(jié)果見表4和5。
表4含100μg G-CSF的制劑

表5含250μg G-CSF的制劑

與不含氨基酸所制劑相比，單獨(dú)加入苯丙氨酸或精氨酸的制劑在任意G-CSF含量時(shí)均可改善穩(wěn)定性，但不夠顯著。同時(shí)加入苯丙氨酸和精氨酸，可顯著提高制劑的穩(wěn)定性。
實(shí)施例3各種氨基酸對(duì)G-CSF剩余率的影響(2)按表1所列氨基酸，制備試樣11-20(含苯丙氨酸作為氨基酸1，和賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺之一作為氨基酸2)，和試樣21-33(含精氨酸作為氨基酸1，和丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺之一作為氨基酸2)，按方法1中的方程式計(jì)算60℃2周和50℃1個(gè)月加速試驗(yàn)后上述制劑中G-CSF的剩余率。結(jié)果見表6和7。
表6

表7

可以觀察到，苯丙氨酸與賴氨酸、苯丙氨酸與組氨酸、苯丙氨酸與精氨酸、苯丙氨酸與天門冬氨酸、苯丙氨酸與谷氨酸、苯丙氨酸與蘇氨酸、或苯丙氨酸與天冬酰胺、或精氨酸與亮氨酸、精氨酸與色氨酸、或精氨酸與苯丙氨酸聯(lián)用，可顯著提高長期貯存的穩(wěn)定性。
實(shí)施例4
長期貯存試驗(yàn)制備含100μg或250μg G-CSF和10mg苯丙氨酸、10mg精氨酸和1mg甲硫氨酸的試樣。按方法1中的方程式計(jì)算60℃2周和1個(gè)月；50℃1、2和3個(gè)月；40℃2、4和6個(gè)月；和25℃3或和6個(gè)月貯存后上述二制劑中G-CSF的剩余率。結(jié)果見表8。
表8

1周2月兩種制劑均顯示優(yōu)良的G-CSF的剩余率。
實(shí)施例5所加氨基酸對(duì)Met-氧化的G-CSF量的影響按表2制備含不同量甲硫氨酸的色譜用試樣34-36(含固定量的苯丙氨酸和精氨酸、及0mg、0.1mg或1mg甲硫氨酸)，60℃2周加速試驗(yàn)后按方法2分析，結(jié)果見圖1；取一個(gè)色譜用試樣，分別于制備后和50℃一個(gè)月加速試驗(yàn)后立即按方法2分析，結(jié)果見圖2。
不含甲硫氨酸的試樣34在制備后和50℃一個(gè)月加速試驗(yàn)后立即可觀察到Met-氧化的G-CSF的含量，而加入0.1mg或更多甲硫氨酸的試樣在長期貯存后Met-氧化的G-CSF的含量被完全抑制。
按方法2中的方程式計(jì)算的Met-氧化的G-CSF的含量的結(jié)果見表9。
表9

N.D.低于檢測(cè)限。
因此，加入0.1mg或更多甲硫氨酸可完全抑制Met-氧化的G-CSF的形成。
實(shí)施例6含甲狀旁腺素的溶液制劑中加入甲硫氨酸抑制甲硫氨酸殘基的氧化制備含200μg/mL具有1-84個(gè)殘基甲狀旁腺素(縮寫為PTH)(按W09014415所述方法制備)的試樣37-39溶液，其它細(xì)分如下面表10，無菌過濾后精密取1mL無菌包裝于小瓶中，嚴(yán)密蓋上瓶蓋制備PTH溶液劑。
表10

將無菌制備的PTH溶液劑置于50℃恒溫箱中3天。
用C18反相柱(4.6mm×250mm，300埃)經(jīng)反相高效液相色譜測(cè)定每個(gè)試樣中PTH的量，流動(dòng)相由純水、乙腈和三氟乙酸組成。進(jìn)樣量為相當(dāng)于10μgPTH的量，用乙腈梯度洗脫P(yáng)TH，在215nm分光測(cè)定。
在這一試驗(yàn)系列中，在未破壞的PTH之前，檢測(cè)到了在8位和18位甲硫氨酸殘基被氧化的PTH，結(jié)果見圖3。色譜圖顯示，制劑中加入甲硫氨酸可抑制PTH在8位和18位甲硫氨酸殘基的氧化。同時(shí)還分發(fā)現(xiàn)。制劑中加入甲硫氨酸對(duì)甲硫氨酸殘基以外的其它化學(xué)分解反應(yīng)沒有影響。這表明，試劑中加入甲硫氨酸僅特異地抑制蛋白質(zhì)在甲硫氨酸殘基的氧化，而不影響其它化學(xué)分解反應(yīng)。
實(shí)用性本發(fā)明G-CSF試劑是穩(wěn)定的制劑，在長期貯存后具有非常高的G-CSF剩余率，并且可完全抑制G-CSF在甲硫氨酸殘基的氧化。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的G-CSF制劑，其中含有一種或多種選自賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和天冬酰胺的氨基酸；一種或多種選自疏水性氨基酸的氨基酸；和甲硫氨酸。
2.如權(quán)利要求1的G-CSF制劑，所述制劑在25℃3個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，或在40℃2個(gè)月的長期貯存試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，或在50℃1個(gè)月的加速試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，或在60℃2周的加速試驗(yàn)后仍剩余90％或更多的G-CSF，在50℃31個(gè)月的加速試驗(yàn)后或在60℃2周的加速試驗(yàn)后甲硫氨酸-氧化的G-CSF為1％或更少。
3.如權(quán)利要求1的G-CSF制劑，其中所述疏水性氨基酸選自苯丙氨酸、色氨酸和亮氨酸。
4.如權(quán)利要求1的G-CSF制劑，其中含有一種或多種選自賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸的氨基酸；一種或多種選自苯丙氨酸、色氨酸和亮氨酸的氨基酸；和甲硫氨酸。
5.如權(quán)利要求1的G-CSF制劑，其中含有苯丙氨酸、精氨酸和甲硫氨酸。
6.如權(quán)利要求1-5之一的G-CSF制劑，其中基本上不含蛋白質(zhì)作為穩(wěn)定劑。
7.如權(quán)利要求1-6之一的G-CSF制劑，為凍干制劑。
8.如權(quán)利要求1-7之一的G-CSF制劑，其中還含有甘露醇。
9.如權(quán)利要求1-8之一的G-CSF制劑，其中還含有表面活性劑。
10.如權(quán)利要求9的G-CSF制劑，其中所述表面活性劑為聚氧乙烯脫水山梨糖醇烷基酯。
11.如權(quán)利要求10的G-CSF制劑，其中所述表面活性劑為吐溫20和/或80。
12.如權(quán)利要求1-11之一的G-CSF制劑，其中pH值為5-7。
13.如權(quán)利要求12的G-CSF制劑，其中pH值為5.5-6.8。
14.如權(quán)利要求13的G-CSF制劑，其中pH值為6.5。
15.如權(quán)利要求1-14之一的G-CSF制劑，其中G-CSF產(chǎn)自CHO細(xì)胞。
16.一種凍干制劑形式的穩(wěn)定的G-CSF制劑，其中含有甲硫氨酸和其它一種或多種氨基酸，并且基本上不產(chǎn)生甲硫氨酸氧化的變體。
17.如權(quán)利要求16的G-CSF制劑，其中所述一種或多種的氨基酸為選自賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和酪氨酸。
18.如權(quán)利要求16或17的G-CSF制劑，其中基本上不含蛋白質(zhì)為穩(wěn)定劑。
19.一種抑制含有甲硫氨酸殘基的生理活性蛋白質(zhì)在甲硫氨酸殘基上氧化產(chǎn)生變的方法，包括將甲硫氨酸加到含有所述蛋白質(zhì)的組合物中，其中含有所述蛋白質(zhì)的所述組合物是凍干形式的。
20.如權(quán)利要求19的方法，其中所述生理活性蛋白質(zhì)為G-CSF、紅細(xì)胞生成素或PTH。
21.如權(quán)利要求19或20之一的方法，其中不存在作為穩(wěn)定劑的其它蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的G－CSF制劑，其中含有一種或多種選自賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和天冬酰胺的氨基酸；一種或多種選自疏水性氨基酸的氨基酸；和甲硫氨酸。本發(fā)明還涉及一種抑制含有甲硫氨酸殘基的生理活性蛋白質(zhì)產(chǎn)生甲硫氨酸殘基被氧化的衍生物的方法，其特征在于將甲硫氨酸加到含有該蛋白質(zhì)的組合物中。
文檔編號(hào)A61K47/26GK1879875SQ20061009237
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2000年2月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月1日
發(fā)明者佐藤泰 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社