專利名稱：細(xì)胞的同步刺激和富集的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及刺激細(xì)胞的方法，尤其涉及富集和刺激細(xì)胞以使該細(xì)胞最大程度刺激的方法。本發(fā)明還涉及細(xì)胞組合物，包括具有特定表型特征的刺激T細(xì)胞。
背景技術(shù)：
許多細(xì)胞通過嵌入細(xì)胞表面膜脂質(zhì)筏中的受體進(jìn)行活化或調(diào)節(jié)。見K.Simons和D.Toomre，Nature Rev.131，2000。脂質(zhì)筏形成由配基結(jié)合活化的各受體的富集平臺。脂質(zhì)筏參與細(xì)胞的信號過程，包括變態(tài)免疫反應(yīng)中的免疫球蛋白E信號，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持重要地神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子信號，RAS信號，許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的核心，以及T細(xì)胞抗原受體(TCR)信號。
T細(xì)胞抗原受體(TCR)是一種多亞基免疫識別受體，它和CD3復(fù)合物相關(guān)，并與抗原呈遞細(xì)胞(APCs)表面的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類和II類蛋白質(zhì)呈遞的肽相結(jié)合。TCR與APC上抗原肽的結(jié)合，發(fā)生在T細(xì)胞和APC連接處的免疫突觸處，是T細(xì)胞活化中的重要事件。此外，資料表明，脂質(zhì)浮橋的群集對形成免疫突觸是必要的。Krawczyk等，Immunity 13(4)463-73，2000。
為維持T細(xì)胞活化，T淋巴細(xì)胞一般需要第二共刺激信號。共刺激一般對T輔助細(xì)胞產(chǎn)生足夠的誘導(dǎo)克隆擴(kuò)增的細(xì)胞因子水平是必需的。Bretscher，Immunol Today 1374，1992；June等，ImmunolToday15321，1994?；罨目乖蔬f細(xì)胞(APC)上B7家族配基(CD80(B7.1)或CD86(B7.2))中的成員與T細(xì)胞上的CD28結(jié)合時(shí)，出現(xiàn)主要的共刺激信號。
刺激某些T細(xì)胞亞群擴(kuò)增的方法，有可能產(chǎn)生多種在免疫治療中有用的T細(xì)胞組合物。通過有效刺激，增加T細(xì)胞的反應(yīng)性和數(shù)量，有助于成功的免疫治療。
各種用于擴(kuò)增人的T細(xì)胞的方法，主要依靠利用輔助細(xì)胞和/或外源生長因子，如白細(xì)胞介素-2(IL-2)?，F(xiàn)已將IL-2和抗CD3抗體聯(lián)用，以刺激T細(xì)胞增殖，主要是擴(kuò)增T細(xì)胞CD8+亞群。認(rèn)為，對于最佳T細(xì)胞活化、擴(kuò)增和T細(xì)胞再輸注后長期存活，兩種APC信號都是必需的。由于APCs相對短命，因此對于長期培養(yǎng)體系來說要求MHC相匹配的APCs作為輔助細(xì)胞，出現(xiàn)了明顯問題。因此，在長期培養(yǎng)體系中，必須連續(xù)不斷地由來源獲得和補(bǔ)充APCs。對于治療輔助細(xì)胞受到影響的免疫缺陷，要求重復(fù)供給輔助細(xì)胞是困難的。另外，治療病毒感染時(shí)，如果輔助細(xì)胞攜帶病毒，長期培養(yǎng)期間該細(xì)胞則可能污染全部的T細(xì)胞群體。
缺少外源生長因子或輔助細(xì)胞時(shí)，共刺激信號可以傳遞給T細(xì)胞群體，例如，通過將細(xì)胞暴露于附于固相表面，如小珠上的CD3配基和CD28配基。見C.June等(美國專利No.5,858,358)；C.June等WO 99/953823。雖然這些方法能夠獲得治療上有用的T細(xì)胞群體，但增中的T細(xì)胞制劑的強(qiáng)壯性和便利方面仍不理想。
另外，本領(lǐng)域現(xiàn)行方法尚未關(guān)注T細(xì)胞的短期擴(kuò)增，或獲得更強(qiáng)壯的T細(xì)胞群體及其益處，和/或特定的T細(xì)胞亞類/表型的擴(kuò)增。此外，擴(kuò)增T細(xì)胞的應(yīng)用局限于僅少數(shù)病狀。為獲得體內(nèi)的最大有效性，理論上離體或體內(nèi)產(chǎn)生的活化T細(xì)胞群體應(yīng)該處于可最大限度產(chǎn)生針對癌癥、傳染病或其它病狀的免疫應(yīng)答的狀態(tài)。本發(fā)明提供產(chǎn)生更多、更高度活化和更純T細(xì)胞的方法，該T細(xì)胞具有表面受體和產(chǎn)細(xì)胞因子特征，看來比其它擴(kuò)增方法更健康和自然。
此外，本發(fā)明提供任意靶細(xì)胞的表型定制細(xì)胞群體的組合物，包括T細(xì)胞群體和產(chǎn)生該群體的參數(shù)，也提供其它相關(guān)的益處。
發(fā)明概述
本發(fā)明一般提供刺激細(xì)胞的方法，尤其提供富集和刺激細(xì)胞以最大程度刺激該細(xì)胞的新方法。一方面，本發(fā)明提供通過T細(xì)胞的同步富集以及細(xì)胞表面成分連接來刺激T細(xì)胞群體的方法，包括提供至少其中一部分含有T細(xì)胞的細(xì)胞群體，將該細(xì)胞群體同表面相接觸，其中該表面上附著一種或多種因子，其與至少一部分T細(xì)胞的細(xì)胞表面成分相連接，并刺激至少該部分T細(xì)胞或其亞群，施加主要驅(qū)使T細(xì)胞富集以及T細(xì)胞表面成分連接的作用力，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞刺激。
在該方法的一個實(shí)施方案中，這種表面上附著第一因子，其與T細(xì)胞的第一細(xì)胞表面成分相連接；該表面或第二表面上具有第二因子，其連接該T細(xì)胞的第二成分，其中通過第一和第二因子的這種連接，誘導(dǎo)了該T細(xì)胞增殖。在相關(guān)實(shí)施方案中，該表面可能是生物相容性的、天然的或合成的，包含聚合物，包含膠原、純化的蛋白質(zhì)、純化的肽、多糖、氨基葡聚糖、或細(xì)胞外基質(zhì)成分。在某些實(shí)施方案中，該多糖選自脫乙酰殼多糖、藻酸鹽、葡聚糖、透明質(zhì)酸和纖維素，并且該聚合物選自聚苯乙烯、聚酯、聚醚、聚酐、聚烷基腈基丙烯酸酯(polyalkylcyanoacrylates)、聚丙烯酰胺、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚磷腈(polyphosphazenes)、聚乙酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)或聚氨基甲酸乙酯。在其它實(shí)施方案中，該聚合物還可以包含乳酸或共聚物。而在再其它實(shí)施方案中，該聚合物可能是一種共聚物，這種共聚物可以是多種已知的共聚物，而且可以包含乳酸和/或羥基乙酸(PLGA)。
至于生物相容性表面，該表面可以是生物可降解的或不能生物降解的。在相關(guān)實(shí)施方案中，不能生物降解的表面可以包含但并不局限于聚(二甲基硅氧烷)和/或聚(乙烯-乙酸乙烯酯)。此外，生物相容性表面可以包含但并不局限于膠原、金屬、羥基磷灰石、玻璃、鋁酸鹽、生物陶瓷材料、透明質(zhì)酸聚合物、藻酸鹽、丙烯酸酯聚合物、乳酸聚合物、羥基乙酸聚合物、乳酸/羥基乙酸聚合物、純化的蛋白質(zhì)、純化的肽、和/或細(xì)胞外基質(zhì)成分。
在另外的實(shí)施方案中，生物相容性表面與一種可植入的裝置有關(guān)。該可植入裝置可以是希望使用的任意一種可植入裝置，并可以包含支架、導(dǎo)管、纖維、中空纖維、貼片、或縫線。在相關(guān)的實(shí)施方案中，該表面可以是玻璃、二氧化硅、硅、膠原、羥基磷灰石、水凝膠、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍、或聚丙烯酰胺。另外的實(shí)施方案還包括，其中該表面包含脂類、平板、袋、桿、片、纖維、或網(wǎng)(mesh)。其它的實(shí)施方案包括，其中該表面是一種微粒，加之其中微粒包含小珠、微球、納米微粒、或膠體粒子。微粒和小珠的大小也可以選擇，可以有多種大小，包括其中小珠直徑為大約5納米到大約500微米。
在其它實(shí)施方案中，該方法所用的因子可以獨(dú)立地選自蛋白質(zhì)配基、天然配基、或合成的配基。此外，該因子也可能包含抗體、抗體片段、肽、多肽、糖肽、可溶性受體、類固醇、激素、有絲分裂原、抗原、超抗原、生長因子、細(xì)胞因子、凝集素、病毒蛋白質(zhì)、粘附分子或趨化因子。在特定的實(shí)施方案中，至少一種因子是抗體或抗體片段。在其它的實(shí)施方案中，第一因子是抗體及其片段，并且第二因子是抗體或其片段。自然應(yīng)理解第一和第二因子可以是或相同或不同的抗體。
在選擇的實(shí)施方案中，第一因子是抗-CD3抗體、抗-CD2抗體、或者抗-CD3抗體或抗-CD2抗體的抗體片段。另外選擇的實(shí)施方案包括，其中第二因子是抗CD28抗體或其抗體片段。另外的實(shí)施方案包括，其中第二因子包含CD28的天然配基，例如B7-1或B7-2。此外，可以使用其它的刺激因子。
在某些實(shí)施方案中，用于驅(qū)動細(xì)胞的作用力包括多種功能相似的力，并包括大于重力的作用力、液壓力、由跨膜壓產(chǎn)生的滲透力、離心力、或磁力。利用磁力時(shí)，一些實(shí)施方案利用磁鐵產(chǎn)生的磁力，在該磁鐵表面其磁場強(qiáng)度為大約200-大約12,000高斯。
另一個實(shí)施方案包括表面，其中該表面是順磁顆粒的表面。而在利用包括順磁顆粒表面在內(nèi)的表面的實(shí)施方案中，附著到該表面的因子可以是共價(jià)的、非共價(jià)的、靜電的、分子內(nèi)附著、或疏水性的。
在另外的實(shí)施方案中，將連接的T細(xì)胞與非連接的T細(xì)胞分開。而在其它的實(shí)施方案中，該T細(xì)胞改善免疫應(yīng)答的功能障礙。
可以與上述實(shí)施方案相結(jié)合的其它方面包括，例如通過同步的細(xì)胞表面成分連接以及T細(xì)胞聚集而刺激T細(xì)胞的方法，其包括提供包含T細(xì)胞的細(xì)胞群體，使所述細(xì)胞群體與表面相接觸，其中所述表面上附著有特異于細(xì)胞表面成分的一種或多種配基，施加作用力驅(qū)動T細(xì)胞和表面富集，以及將所述細(xì)胞溫育足夠長的一段時(shí)間，以獲得所要求的刺激。在相關(guān)的實(shí)施方案中，足以獲得所要求的刺激的時(shí)間，可以為1分鐘-10天，以及其間的所有整數(shù)值。在某些實(shí)施方案中，該時(shí)間范圍可能是大約1-8天，而在另外的實(shí)施方案中，該時(shí)間范圍可能是大約3-5天，或大約1-5天。在相關(guān)的實(shí)施方案中，溫育溫度可以是大約2-38℃。
能夠使用全部所述方法的另外的實(shí)施方案包括，其中的表面選自玻璃、二氧化硅、硅、膠原、羥基磷灰石、水凝膠、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍、葡聚糖、或聚丙烯酰胺或其中任意的混合物。此外，實(shí)施方案包括，在上述任何步驟之前或同時(shí)，將用表面富集的T細(xì)胞同非富集細(xì)胞分開。
在其它方面，提供了誘導(dǎo)T細(xì)胞體內(nèi)活化的方法，包括給予動物以順磁顆粒，所述顆粒上附著有可誘導(dǎo)T細(xì)胞活化的、T細(xì)胞表面成分特異的配基；在該動物分散區(qū)域施加磁場，并從而誘導(dǎo)與所述顆粒結(jié)合的T細(xì)胞在所述分散區(qū)域的定位和活化。
另一方面，提供包括通過同步的靶細(xì)胞集聚和靶細(xì)胞表面成分連接而刺激靶細(xì)胞群體的方法，包括提供細(xì)胞群體，其中至少一部分包含靶細(xì)胞，使所述細(xì)胞群體與表面相接觸，其中所述表面附著有一種或多種因子，使至少一部分所述靶細(xì)胞的細(xì)胞表面成分相連接并刺激至少所述部分靶細(xì)胞，施加主要驅(qū)使靶細(xì)胞集聚以及靶細(xì)胞表面成分連接的作用力，從而誘導(dǎo)靶細(xì)胞刺激。
在某些實(shí)施方案中，此處描述的方法利用附著了第一因子的表面，使靶細(xì)胞的第一細(xì)胞表面成分連接；該表面或第二表面附著第二因子，連接所述靶細(xì)胞的第二成分，其中所述第一和第二因子的連接誘導(dǎo)所述靶細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
如前所述，此表面可以包含多種組分，包括膠原、純化的蛋白質(zhì)、純化的肽、多糖、氨基葡聚糖、和/或細(xì)胞外基質(zhì)成分。特定實(shí)施方案中使用的一些多糖，可包含脫乙酰殼多糖、藻酸鹽、葡聚糖、透明質(zhì)酸、和/或纖維素。此外，如上提及并適用于所有方法的聚合物可以選自聚酯、聚醚、聚酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、聚乙酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、和/或聚氨基甲酸乙酯及其混合物。
在其它方面，提供了通過細(xì)胞表面成分連接以及靶細(xì)胞富集來刺激靶細(xì)胞的方法，包括提供包含靶細(xì)胞的細(xì)胞群體，使所述細(xì)胞群體與表面接觸，其中所述表面上附著了細(xì)胞表面成分特異的一種或多種配基，施加驅(qū)動靶細(xì)胞富集以及所述細(xì)胞在所述表面上富集的作用力，并將所述細(xì)胞溫育足夠時(shí)間，使達(dá)到所要求的刺激。
在相關(guān)實(shí)施方案中，靶細(xì)胞可以是T細(xì)胞、B細(xì)胞、或干細(xì)胞。
其它方面，提供了體內(nèi)誘導(dǎo)靶細(xì)胞刺激的方法，包括給予動物以順磁顆粒，所述顆粒上附著了可誘導(dǎo)靶細(xì)胞刺激的、靶細(xì)胞表面成分特異的配基；在該動物的分散區(qū)域施加磁場；并從而誘導(dǎo)在所述分散區(qū)域與所述顆粒結(jié)合的靶細(xì)胞的定位和刺激。
提供的其它方面還包括誘導(dǎo)攜有受體的細(xì)胞上受體極化的方法，包括提供細(xì)胞群體，將所述細(xì)胞群體與固相表面相接觸，其中所述固相表面附著了一種或多種對存在于至少部分所述細(xì)胞群體的細(xì)胞表面受體特異的配基，并施加驅(qū)動細(xì)胞富集及細(xì)胞表面受體連接的作用力。
其它方面包括誘導(dǎo)細(xì)胞表面分子富集的方法，包括提供具有靶細(xì)胞表面分子的細(xì)胞群體，使所述細(xì)胞群體與固相表面相接觸，其中所述固相附著了針對至少一種靶細(xì)胞表面分子的配基，施加驅(qū)動被靶向的細(xì)胞表面分子富集的作用力。
某些實(shí)施方案中的細(xì)胞群體包括淋巴細(xì)胞。
另外的某些實(shí)施方案中，受體或細(xì)胞表面成分的結(jié)合，引起細(xì)胞事件的下調(diào)或抑制。相關(guān)實(shí)施方案包括，其中受體結(jié)合引起細(xì)胞事件的上調(diào)或活化，其中可以包括例如受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明的另一個實(shí)施方案展望了驅(qū)動細(xì)胞表面成分富集或定位的作用力的應(yīng)用。
本發(fā)明另外的實(shí)施方案還提供了表型定制的靶細(xì)胞群體和/或包括T細(xì)胞成分的組分物。此外，提供了通過連接細(xì)胞表面成分使這些細(xì)胞活化的方法。還提供了誘導(dǎo)T細(xì)胞群體增殖的方法，包括使T細(xì)胞與固相表面接觸大約2小時(shí)-9天的一段時(shí)間，該固相表面上固定了第一因子和第二因子，其中對所述T細(xì)胞，第一因子提供活化信號，第二因子提供共刺激信號。
參照下列詳述和附圖，本發(fā)明所述的和其它方面顯而易見。
附圖簡述


圖1是第8天測量的、從大約0.5×109T細(xì)胞開始，經(jīng)過(XCELLERATEIITM)或不經(jīng)(XCELLERATE ITM)磁性富集和刺激的活化和擴(kuò)增T細(xì)胞總數(shù)的比較示意圖。
圖2是第8天測量的、經(jīng)過(XCELLERATE IITM)或不經(jīng)(XCELLERATEITM)磁性富集和刺激的活化和擴(kuò)增T細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)比較示意圖。
圖3是比較預(yù)先培養(yǎng)8天的、經(jīng)磁性富集和刺激(XCELLERATE IITM)或不經(jīng)磁性富集和刺激(XCELLERATE ITM)的T細(xì)胞再刺激后CD154表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果示意圖。
圖4是比較培養(yǎng)3天后經(jīng)過磁性富集和刺激的(XCELLERATE IITM)及不經(jīng)磁性富集和刺激(XCELLERATE ITM)的活化細(xì)胞CD154表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果示意圖。
圖5A-5B是經(jīng)過XCELLERATE ITM PBMC(5A)或冷凍和融化過的PBMC(5B)處理，以起始XCELLERATE ITM過程的T細(xì)胞活化和擴(kuò)增示意圖。
圖6A-6B是一個供體樣本(PC071)中，T細(xì)胞活化以后，在XCEllERATE I或IITM過程中CD25表達(dá)的時(shí)程分析示意圖。在第8天點(diǎn)上進(jìn)行再再刺激，以模擬體內(nèi)活化。圖6A描述CD4+細(xì)胞上CD25的表達(dá)，圖6B則描述CD8+細(xì)胞上CD25的表達(dá)。
圖7A-7B是一個供體樣本(PC071)中，T細(xì)胞活化以后，在XCEllERATE I或IITM過程中CD154表達(dá)的時(shí)程分析示意圖。在第8天點(diǎn)上進(jìn)行再刺激，以模擬體內(nèi)活化。圖7A描述CD4+細(xì)胞上CD154的表達(dá)，圖7B則描述CD8+細(xì)胞上CD154的表達(dá)。
圖8A和8B是經(jīng)利用實(shí)施例IX闡述的方法用抗CD3和抗CD28共固定小珠刺激后，人外周血T細(xì)胞的生長示意圖。
圖9是經(jīng)抗CD3和抗CD28共固定小珠+/-10u/ml重組人IL-2+/-去除單核細(xì)胞進(jìn)行刺激以后，人外周血T細(xì)胞的生長示意圖。全部細(xì)胞在Baxter Lifecell瓶(300ml)中培養(yǎng)?！癝cale-up”是按比例放大到Baxter Lifecell 3L培養(yǎng)瓶中的300ml瓶培養(yǎng)情況(沒有IL-2/去除單核細(xì)胞)。
圖10是利用前向散射流式細(xì)胞術(shù)-時(shí)間曲線測定的細(xì)胞大小的動力學(xué)分析示意圖。
圖11A和11B是經(jīng)過抗CD3和抗CD28共固定小珠起始刺激以后，CD25隨時(shí)間表達(dá)的情況示意圖。圖11A代表CD4+細(xì)胞上CD25的表達(dá)曲線，圖11B則代表CD8+細(xì)胞上CD25的表達(dá)曲線。
圖12是在初級和次級刺激以后，利用前向散射流式細(xì)胞術(shù)隨時(shí)間測定的細(xì)胞大小變化示意圖。
圖13A和13B是在初級和次級刺激以后，CD25隨時(shí)間表達(dá)的情況示意圖。圖13A代表CD4+細(xì)胞上CD25的表達(dá)曲線，圖13B則代表CD8+細(xì)胞上CD25的表達(dá)曲線。
圖14A和14B是在次級刺激以后，CD154表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)圖，其中初級和次級刺激來源不同。圖14A代表CD4+細(xì)胞上CD154的表達(dá)曲線，圖14B則代表CD8+細(xì)胞上CD154的表達(dá)曲線。
圖15是次級刺激后樣本中擴(kuò)增的全部T細(xì)胞上CD137表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)圖。
圖16A和16B是在次級刺激以后，CD54表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)圖，其中次級刺激來源不同。圖16A表示CD4+細(xì)胞上CD54的表達(dá)曲線，圖16B則表示CD8+細(xì)胞上CD54的表達(dá)曲線。
圖17A-17D是表示一名B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病病人的T細(xì)胞，在經(jīng)過抗CD3和抗CD28偶聯(lián)的小珠次級刺激后，細(xì)胞表型以及CD154和CD137表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)圖。圖17A和17B表示經(jīng)過抗CD3和抗CD28偶聯(lián)小珠刺激后13天(17A)，以及經(jīng)過抗CD3和抗CD28偶聯(lián)小珠初級刺激后18天、次級刺激后7天(17B)的樣本中存在的CD4+和CD8+細(xì)胞。圖17C和17D是一名B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病病人的細(xì)胞，經(jīng)過次級刺激后，CD154和CD137表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)圖。
圖18A-18C是來自正常供體的T細(xì)胞，經(jīng)初級和次級刺激后，IL-2(18A)、γ-干擾素(IFN-)(18B)、和IL-4(18C)隨時(shí)間表達(dá)的示意圖。
圖19A-19B是經(jīng)過抗CD3和抗CD28偶聯(lián)小珠刺激以后，CD62L隨時(shí)間表達(dá)的示意圖。
圖20是經(jīng)抗CD3和抗CD28共固定小珠刺激以后，CD4或CD8細(xì)胞百分比示意圖。
圖21A-21B是用平均熒光強(qiáng)度表示的分別經(jīng)抗CD3和抗CD8共固定小珠刺激以及+/-利用實(shí)施例IX方法再刺激以后，CD25和CD154的表達(dá)情況的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)示意圖。
圖22A-22B是在經(jīng)抗CD3和抗CD28共固定小珠刺激以前，兼有CD4和CD8亞群(22A)或CD4富集的群體(22B)細(xì)胞中，與對照染色(例如，背景)比較，CD154染色情況的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果示意圖。
圖23A-23B是外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)抗CD3和抗CD28共固定小珠刺激以后，培養(yǎng)基中TNF-(23A)和IFN-(23B)的ELISA分析結(jié)果示意圖。
圖24A-24B是外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)抗CD3和抗CD28共固定小珠刺激以后，培養(yǎng)基中IL-4(24A)和IL-2(24B)的ELISA分析結(jié)果示意圖。
圖25是外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)抗CD3和抗CD28共固定小珠刺激以后，利用前向散射分析的T細(xì)胞的大小增加的示意圖。
圖26A-26L是CD62L表達(dá)(平均熒光強(qiáng)度，MFI)(26A)、CD49d(MFI)(26B)、CD25(MFI)(26C)、CD69(MFI)(26D)、CD154(MFI)(26E)、正向光散射(大小)(26F)、存活力(％有效通道)(26G)的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)的柱形圖；全部經(jīng)抗CD3和抗CD28共固定小珠刺激，并在第8天經(jīng)相同方法再刺激。圖26H-26L分別描述了在刺激后4和18小時(shí)的CD62L、CD69、CD49d、CD154、和CD25。
發(fā)明詳述
在陳述本發(fā)明之前，陳述下文將要使用的某些術(shù)語的定義，會對理解有所幫助。
此處所用術(shù)語″生物相容的″，是指對活細(xì)胞沒有明顯毒性的特性。
此處所用術(shù)語″刺激″，是指通過細(xì)胞表面成分的連接而誘導(dǎo)的初級應(yīng)答。例如，就受體而言，此種刺激必然伴有受體連接以及隨后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。就T細(xì)胞刺激而言，此種刺激是指T細(xì)胞表面成分的連接，在一個實(shí)施方案中隨后誘導(dǎo)了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，例如結(jié)合TCR/CD3復(fù)合物。此外，刺激事件可以活化細(xì)胞，并上調(diào)或下調(diào)分子的表達(dá)或分泌，例如下調(diào)TGF-B。因此，細(xì)胞表面成分的連接，即使無直接的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，也可引起細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重組或細(xì)胞表面成分結(jié)合，其中每種都可以增強(qiáng)、修飾或改變后續(xù)的細(xì)胞反應(yīng)。
此處所用術(shù)語″活化″，是指經(jīng)足夠的細(xì)胞表面成分連接以誘導(dǎo)顯著的形態(tài)變化后的細(xì)胞狀態(tài)。就T細(xì)胞而言，此種活化是指T細(xì)胞已經(jīng)充分刺激而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的狀態(tài)。T細(xì)胞的活化也可以誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，以及發(fā)揮調(diào)節(jié)或細(xì)胞溶解效應(yīng)物的功能。就其它細(xì)胞而言，此術(shù)語意指或上調(diào)或下調(diào)特定的物理化學(xué)過程。
此處所用術(shù)語″作用力″，是指人工或外部作用力，其施于待刺激細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞富集，并利用結(jié)合細(xì)胞表面成分的因子富集細(xì)胞。例如，術(shù)語″作用力″包括任何一種大于重力的作用力(即，除重力之外，并不僅僅是重力)，其可誘導(dǎo)細(xì)胞富集和/或細(xì)胞表面成分連接。此種作用力包括跨膜壓(例如過濾)、液壓力、電力、聲學(xué)作用力、離心力或磁力。理想地，所用作用力驅(qū)使目的靶細(xì)胞富集連接細(xì)胞表面成分的因子。在多種情況下，作用力可以是脈沖的，即作用與再作用(例如，磁力可以開關(guān)，脈沖順磁顆粒和細(xì)胞群體)。
此處所用術(shù)語″同步″，是指在附著有細(xì)胞表面成分結(jié)合因子的表面上富集細(xì)胞后，引起細(xì)胞互相之間以及細(xì)胞與表面因此與配基(即因子)之間富集。然而，使用術(shù)語″同步″并不排除上述靶細(xì)胞與附著有細(xì)胞表面成分結(jié)合因子的表面事先結(jié)合，因?yàn)楦患约斑M(jìn)一步配基結(jié)合在富集表面同時(shí)發(fā)生。例如，就T細(xì)胞活化而言，T細(xì)胞可暴露于諸如附著抗CD3和抗CD28抗體的順磁小珠的表面，隨后通過磁場富集。因此在這種情況下，雖然細(xì)胞和小珠具有事先接觸和連接，但在細(xì)胞富集期間發(fā)生了另外的連接。
此處所用術(shù)語″靶細(xì)胞″，是指欲通過細(xì)胞表面成分連接而刺激的任何細(xì)胞。
此處所用″抗體″，包括多克隆和單克隆抗體兩種；靈長類來源的(例如人源的)；鼠源的；鼠-人的；鼠-靈長類的；以及嵌合的；并可以是完整分子、其片段(諸如scFv、Fv、Fd、Fab、Fab’和F(ab)’2片段)、或完整分子和/或片段的多聚體或聚集物；可以是天然存在或通過諸如免疫、合成或遺傳工程生產(chǎn)的；此處所用″抗體片段″是指源自抗體的或與抗體相關(guān)的片段，其可與抗原結(jié)合，并且在一些實(shí)施方案中，它們可被衍生化以顯示促進(jìn)清除和吸收的結(jié)構(gòu)特征，例如通過摻入半乳糖殘基。這包括，例如F(ab)、F(ab)’2、scFv、輕鏈可變區(qū)(VL)、重鏈可變區(qū)(VH)、及其組合。
此處所用術(shù)語″蛋白質(zhì)″，包括蛋白質(zhì)、多肽和肽；可以是完整的分子、其片段或完整的分子和/或片段的多聚體或聚集物；可以是天然存在或通過諸如合成(包括化學(xué)的和/或酶學(xué)的)或遺傳工程生產(chǎn)的。
此處所用術(shù)語″因子″、″配基″、或″結(jié)合細(xì)胞表面成分的因子″，是指結(jié)合確定細(xì)胞群體的分子。該因子可以結(jié)合任何細(xì)胞表面成分，例如受體、抗原決定簇、或靶細(xì)胞群體上存在的其它結(jié)合位點(diǎn)。因子可以是蛋白質(zhì)、肽、抗體及其抗體片段、融合蛋白質(zhì)、合成分子、有機(jī)分子(例如小分子)等等。在本說明書中，以及就T細(xì)胞刺激而言，用抗體作為這種因子的典型實(shí)施例。
此處所用術(shù)語″結(jié)合細(xì)胞表面成分的因子″和″細(xì)胞表面成分″，用于配基/抗配基對的上下文中。相應(yīng)地，這些分子應(yīng)視為補(bǔ)體/抗補(bǔ)體分子對，表現(xiàn)為特異性結(jié)合，通常親合力比較高。
此處所用″共同刺激信號″，是指與原始信號，例如TCR/CD3連接相結(jié)合時(shí)，引起T細(xì)胞增殖的信號。
此處所用″配基/抗配基對″，是指補(bǔ)體/抗補(bǔ)體類分子，其表現(xiàn)為特異性結(jié)合，通常親合力比較高。典型的配基/抗配基對，酶/抑制劑、半抗原/抗體、凝集素/糖類、配基/受體、以及生物素/親和素或鏈親和素。在本發(fā)明說明書上下文中，受體和其它細(xì)胞表面成分是抗配基，而與其作用的因子(例如抗體和抗體片段)被認(rèn)為是配基。
此處所用″分離″，包括將一個組分從另一組分中基本純化出來的任何方法(例如經(jīng)過濾或磁性吸引)。
此處所用″靜止″，是指細(xì)胞沒有積極增殖的細(xì)胞狀態(tài)。
此處所用“表面”，是指能夠附著因子的任何表面，包括而不局限于金屬、玻璃、塑料、共聚物、膠體、脂類、細(xì)胞表面等等，基本上是能夠保持因子結(jié)合成附著其上的任何表面。
本發(fā)明一方面涉及驚人的發(fā)現(xiàn)，即誘導(dǎo)細(xì)胞富集以及細(xì)胞表面成分連接的作用力組合，引起該細(xì)胞激活高度增強(qiáng)。此處陳述的典型實(shí)施例中利用T細(xì)胞，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易推斷，本發(fā)明對任何希望有其細(xì)胞表面成分連接或聚集或者這種結(jié)合引起隨后的細(xì)胞信號事件(例如受體)的細(xì)胞類型都適用。雖然本發(fā)明希望不受理論約束，但有可能是通過利用包括脂質(zhì)筏和/或受體極化在內(nèi)的現(xiàn)象起作用。這些現(xiàn)象的相似之處在于，它們都表明或者通過包含細(xì)胞表面成分的脂質(zhì)筏聚集來啟動/增強(qiáng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，或者因受體在細(xì)胞的一個甚至幾個區(qū)域的定位(即極化)來增強(qiáng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，這種細(xì)胞表面成分的連接不僅引起T細(xì)胞意想不到地強(qiáng)烈活化和增殖，也可用于放大許多細(xì)胞類型的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。因而本發(fā)明能與可植入裝置聯(lián)用，用于誘導(dǎo)身體特定位置的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，本發(fā)明也可用于離體激活細(xì)胞，隨后輸給病人，并可用于通過放大信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號，來實(shí)質(zhì)性加強(qiáng)對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的研究，從而有助于篩選影響該轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的藥物(例如，與精神分裂癥、睡眠及其它神經(jīng)學(xué)適應(yīng)癥相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體；與變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞上的Fc片段受體)。相應(yīng)地，就T細(xì)胞而言，本發(fā)明提供了多種出乎意料的優(yōu)點(diǎn)，首先它不需要利用“ 未包裹”顆粒來分離去除單核細(xì)胞的步驟，而只需要較少的細(xì)胞轉(zhuǎn)移和較少試劑，從而簡化了T細(xì)胞擴(kuò)增，而在活化過程中提高了T細(xì)胞的活化水平，減少了處理細(xì)胞的時(shí)間和人力，降低了生產(chǎn)成本，提高了病人處理和給藥日程安排的靈活性。
本發(fā)明另一方面利用了有或沒有配基/因子結(jié)合的第一和第二或更多的表面。在本實(shí)施方案中，各種表面上可附著相同或不同的、用以結(jié)合靶細(xì)胞的細(xì)胞表面成分的因子。例如，順磁小珠上可附著靶細(xì)胞的受體的抗體，這種小珠可與包含靶細(xì)胞的細(xì)胞群體混合一起。另外，此細(xì)胞群體可混合第二或更多其上附著有相同或不同細(xì)胞表面成分結(jié)合因子的小珠。在誘導(dǎo)富集的作用力作用下，小珠和細(xì)胞匯集于小體積中，從而放大了信號。另一個實(shí)施例中，將附著有特異性針對糖類或其它非受體類細(xì)胞表面成分的因子的順磁小珠與包含靶細(xì)胞的細(xì)胞群體混合。然后用磁場使附著細(xì)胞的小珠移向另一個其上附著有受體連接因子的表面。這樣，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)因子位于第二表面上。再一個實(shí)施例中，與靶細(xì)胞的細(xì)胞表面成分結(jié)合的因子可以附著在一種顆粒上，該種顆粒大到足以滯留于其上可附著有配基的網(wǎng)或?yàn)V器上。
如上所述，本發(fā)明提供了通過同步富集以及連接群體中細(xì)胞表面上的成分，來刺激細(xì)胞群體的方法。用結(jié)合細(xì)胞表面成分的因子(例如配基)，與細(xì)胞群體接觸，能夠刺激該細(xì)胞群體。配基可以在溶液中，也可附著在表面上。細(xì)胞表面成分(例如受體)的連接，通常可誘導(dǎo)特定的信號途徑。最近研究提示，為了發(fā)生信號傳導(dǎo)，包含必要受體的關(guān)鍵濃度的脂質(zhì)筏必須聚集。例如，可以促進(jìn)體內(nèi)或體外的筏聚集，方法為在順磁顆粒表面附著針對特定細(xì)胞表面成分的配基，將帶有配基的顆粒與細(xì)胞接觸，其后即刻或同時(shí)施加作用力，例如磁場以幫助連接的成分(如受體)極化，并在小體積內(nèi)富集細(xì)胞。應(yīng)用磁力富集細(xì)胞，以及利用其上附著可連接細(xì)胞表面成分的因子的表面來富集細(xì)胞，從而使細(xì)胞與配基的接觸更大，可加快并更有效活化。本發(fā)明的許多應(yīng)用是可能的，例如，如果細(xì)胞的受體數(shù)量少和/或功能缺陷，此方法足以在脂質(zhì)筏中富集這些受體，以克服這些缺陷，允許適當(dāng)?shù)男盘柣钚?。這種修正細(xì)胞表面組份的例子見于某些類型的白血病病人，其中在用因子，諸如抗CD3和抗CD28抗體，激活細(xì)胞表面成分之前，幾種正常的細(xì)胞表面標(biāo)志極低，如CD3/TCR復(fù)合物。利用因子(如抗CD3和抗CD28抗體)激活這些細(xì)胞群體，這些細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志回復(fù)到看來正常的水平，回輸給病人后，它們可提供更強(qiáng)的產(chǎn)物，用于癌癥治療。本發(fā)明的其它應(yīng)用中，可以有效地富集和活化細(xì)胞，包括誘導(dǎo)受體極化，從而達(dá)到最大的受體信號事件。這些應(yīng)用的用途廣泛，包括用于針對受體的篩選分析，或者通過在細(xì)胞表面聚集細(xì)胞筏來誘導(dǎo)活化，例如通過連接腫瘤細(xì)胞的Fas或類似分子誘導(dǎo)調(diào)亡。
在所述篩選分析的實(shí)施例中，能夠利用帶有G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞，使之與可與其相結(jié)合的因子接觸，這些因子結(jié)合在允許作用力誘導(dǎo)富集的表面上。相應(yīng)地，隨著受體筏聚集，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件將會被放大。這對一般實(shí)驗(yàn)中很低水平的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的研究是重要的，從而篩選藥物化合物，以抑制或設(shè)法修飾該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。
A.細(xì)胞群體的刺激
本發(fā)明的方法涉及通過引入結(jié)合細(xì)胞成分的配基或因子，刺激靶細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞事件。細(xì)胞與配基或因子的結(jié)合，可觸發(fā)信號途徑，繼而活化細(xì)胞內(nèi)特定的表型或生物學(xué)變化。細(xì)胞活化可以增強(qiáng)正常的細(xì)胞功能，或啟動異常細(xì)胞內(nèi)的正常細(xì)胞功能。此處所述方法提供了通過驅(qū)使細(xì)胞連同聯(lián)接細(xì)胞表面成分的配基或因子一起富集，來激活細(xì)胞。通過引入與第二種細(xì)胞表面成分連接的第二配基或因子，可以加強(qiáng)細(xì)胞激活，或激活特定的細(xì)胞事件。該方法可適用于細(xì)胞表面成分的連接將引發(fā)信號事件的任何細(xì)胞。本發(fā)明還提供了選擇或培養(yǎng)激活細(xì)胞的方法。所述的一般實(shí)施例是T細(xì)胞的活化，但本領(lǐng)域一般技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，該方法可適用于其它，細(xì)胞類型。例如，可激活和選擇的細(xì)胞類型包括成纖維細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞、造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞(CD34+細(xì)胞)、間充質(zhì)干細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、溶細(xì)胞性T細(xì)胞(CD8+細(xì)胞)、其它白細(xì)胞群體、多能干細(xì)胞、多種潛能干細(xì)胞、島細(xì)胞等等。相應(yīng)地，本發(fā)明也提供該方法學(xué)產(chǎn)生的細(xì)胞群體，以及具有顯著表型特征的細(xì)胞群體，包括具有特定表型特征的T細(xì)胞。
如上所述，本發(fā)明可以利用多種細(xì)胞類型。例如，可利用如B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、其它血細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、腺(內(nèi)分泌)細(xì)胞、成骨細(xì)胞(骨細(xì)胞等)、生殖細(xì)胞(如卵母細(xì)胞)、生殖器官內(nèi)層上皮細(xì)胞及其它細(xì)胞類型。細(xì)胞表面成分-配基對包括(但不排除其它)T細(xì)胞抗原受體(TCR)和抗CD3mAb、TCR和主要組織相容性復(fù)合物(MHC)+抗原、TCR和超抗原(如葡萄球菌腸毒素B(SEB)、中毒性休克綜合癥毒素(TSST)等等)、B細(xì)胞抗原受體(BCR)和抗Ig、BCR和LPS、BCR和特異性抗原(單價(jià)或多價(jià))、NK受體和抗NK受體抗體、FAS(CD95)受體和FAS配基、FAS受體和抗FAS抗體、CD54和抗CD54抗體、CD2和抗CD2抗體、CD2和LFA-3(淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-3)、細(xì)胞因子受體及其相應(yīng)細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體和抗細(xì)胞因子受體抗體、TNF-R(腫瘤壞死因子受體)家族成員及其抗體、TNF-R家族成員及其相應(yīng)配基、粘附/歸巢受體及其配基、粘附/歸巢受體及其抗體、卵母細(xì)胞或受精卵母細(xì)胞受體及其配基、卵母細(xì)胞或受精卵母細(xì)胞及其抗體、子宮內(nèi)層子宮內(nèi)膜上的受體及其配基、激素受體及其相應(yīng)激素、激素受體及其抗體、及其它。
受體與配基結(jié)合的本質(zhì)將導(dǎo)致或者受體的多聚化，或者受體的聚集/定位，以致于加速、改善或者改變信號或者細(xì)胞反應(yīng)，以賦予特殊的好處，例如細(xì)胞分裂、細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞遷移、提高的細(xì)胞間相互作用等。
以下提供兩個實(shí)施例，表明細(xì)胞表面成分的這種多聚化、聚集、或可控的重定位，如何具有實(shí)際的好處。
一個實(shí)施例中，由抗原和抗原呈遞細(xì)胞引起的正常T細(xì)胞激活，通常引起例如TCR筏富集、細(xì)胞骨架重組、″活化″信號的極化和細(xì)胞分裂。在體內(nèi)沒有″正?！錞細(xì)胞活化的情況下，利用如此處所述的人工方法，特別是通過加速的、受控的、和空間定位的連接TCR和CD28，可以促進(jìn)、改善、或反之影響上述功能。好處可以是改善體外細(xì)胞擴(kuò)增，產(chǎn)生可輸注的更多、更強(qiáng)的細(xì)胞，應(yīng)用于治療。其它好處可以是改善缺陷細(xì)胞(例如細(xì)胞表面上TCR密度低于正常)的受體″富集″。同樣地，可能有利于需要活化特異性T細(xì)胞群體的體內(nèi)應(yīng)用，例如在腫瘤位點(diǎn)活化腫瘤特異性T細(xì)胞。改善的受體富集和定位，能夠提供活化信號，而這種活化信號對于功能尚可的T細(xì)胞。另外，這種活化能夠用于抗原特異性T細(xì)胞難于獲得。關(guān)于這一點(diǎn)，能夠從腫瘤中分離T細(xì)胞，擴(kuò)增并輸注給病人。同樣，利用本方法能夠擴(kuò)增在體內(nèi)或體外與抗原接觸的T細(xì)胞。
另一個實(shí)施例中，改善了通過FAS途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡加速FAS多聚化、在靶細(xì)胞表面空間上定位″活化″的FAS、或者促進(jìn)累積的FAS連接(原本無法獲得)的能力，在體內(nèi)能夠提供明顯益處，特別是對于治療癌癥、自身免疫反應(yīng)、或移植物抗宿主病。例如，腫瘤細(xì)胞可能在體內(nèi)表達(dá)低水平FAS，宿主可能在腫瘤位點(diǎn)表達(dá)低水平的FAS-L(因?yàn)橐种菩约?xì)胞因子等等原因)。由于所述低水平，不能產(chǎn)生足夠的FAS信號，因而容許腫瘤存活和生長?？朔﨔AS/FAS配基缺陷的可能方法是，用FAS的單價(jià)或多價(jià)配基(FAS-L、抗體等等)結(jié)合順磁顆粒，來靶向腫瘤/腫瘤位點(diǎn)。在腫瘤位點(diǎn)(例如，黑素瘤、Kaposi氏肉瘤、鱗狀細(xì)胞頸癌等等)處施加強(qiáng)磁場，由于該順磁顆?？山Y(jié)合腫瘤細(xì)胞上的FAS，能夠空間定位在腫瘤位點(diǎn)處，適合于受體活化和/或T細(xì)胞活化及擴(kuò)增。伴隨信號極化的FAS富集增強(qiáng)，能提供足夠的信號，從而在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
本發(fā)明的一個特定的實(shí)施方案中，可以通過T細(xì)胞的同步富集及其表面連接來刺激T細(xì)胞群體。一方面，本發(fā)明在一種表面上共固定針對CD3和CD28的抗體。優(yōu)選的固定表面包括顆粒，以及某些方面包括小珠，例如順磁小珠。另一方面，本發(fā)明可利用結(jié)合TCR/CD3復(fù)合物并啟動初級刺激信號的任何配基，作為固定在表面上的初級活化因子。在本發(fā)明中，與CD28結(jié)合并啟動CD28信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、從而共刺激帶有CD3配基的細(xì)胞、并增強(qiáng)T細(xì)胞群體活化的任何配基是CD28配基，相應(yīng)地，是共刺激因子。再一方面，本發(fā)明施加作用力給T細(xì)胞以及抗CD3和抗CD28包被表面的混合物，以富集T細(xì)胞，從而使T細(xì)胞表面連接最大化。在一個特定的實(shí)施方案中，富集的作用力是磁力，抗CD3和抗CD28包被的表面是順磁小珠。本領(lǐng)域中有以富集方式集合細(xì)胞和配基的其它方法可供利用。刺激T細(xì)胞群體的該方法，提供了小珠-細(xì)胞和/或細(xì)胞-細(xì)胞的明顯接觸，誘導(dǎo)了T細(xì)胞意想不到的強(qiáng)活化和/或增殖。此外，本發(fā)明的方法改變了細(xì)胞表面標(biāo)志的特征，其中活化T細(xì)胞表達(dá)，與從病人中首次分離的T細(xì)胞相比顯示更為正常的表型和較少變化的終產(chǎn)物的細(xì)胞表面標(biāo)志。
1.初級信號
以下簡述引起離體T細(xì)胞刺激的生物化學(xué)事件。TCR/CD3復(fù)合物與抗原呈遞細(xì)胞上同MHC I類或II類分子一起呈遞的抗原之間的相互作用，啟動一系列生物化學(xué)事件，稱為抗原特異性T細(xì)胞活化。因此，通過刺激T細(xì)胞TCR/CD3復(fù)合物或刺激CD2表面蛋白質(zhì)，能夠?qū)崿F(xiàn)T細(xì)胞活化?？笴D3單克隆抗體可用于通過TCR/CD3復(fù)合物活化T細(xì)胞群體。許多抗人CD3單克隆抗體市場上可買到，例如可以由從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得的雜交瘤細(xì)胞制備的OKT3，以及單克隆抗體G19-4?？笴D2抗體的刺激形式同樣是已知并可得到的，用抗CD2抗體通過CD2的刺激，一般通過聯(lián)用至少二個不同的抗CD2抗體來實(shí)現(xiàn)。已知的抗CD2抗體的刺激組合，包括下列T11.3抗體與T11.1或T11.2抗體組合(Meuer等人，Cell 36897-906，1984)，以及9.6抗體(與T11.1抗體識別相同的表位)與9-1抗體組合(Yang等人，J.Immunol.1371097-1100，1986)。還可用與上述任何抗體結(jié)合同一表位的其它抗體?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備和鑒定其它抗體或抗體組合。
還可以通過其它機(jī)制傳遞初級活化信號給T細(xì)胞，例如，可利用的組合包括蛋白激酶C(PKC)活化劑，比如佛波酯(如乙酸肉豆蔻酸佛波醇)，以及鈣離子載體(例如離子霉素，它可提高細(xì)胞質(zhì)中鈣的濃度)，等等。利用此類因子可繞過TCR/CD3復(fù)合物，但將刺激信號傳遞給T細(xì)胞。其它充當(dāng)初級信號的因子包括天然及合成的配基。天然配基包括有或沒有呈遞肽的MHC。其它配基包括但不局限于肽、多肽、生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、糖肽、可溶性受體、甾類、激素、有絲分裂原如植物凝集素(PHA)、或其它超抗原。在本發(fā)明中，利用富集和刺激可以引起受體高度極化，以至于誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖不需要次級信號。
在其它實(shí)施方案中，利用本發(fā)明可以放大或分析任何種類的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。例如，可以利用本發(fā)明的富集方法刺激和測量G蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體。
2.次級信號
在T細(xì)胞中傳遞初級活化信號，似乎需要刺激TCR/CD3復(fù)合物或CD2分子，而T細(xì)胞表面上的許多分子，稱為輔助或共同刺激分子，涉及調(diào)節(jié)由靜止T細(xì)胞到轉(zhuǎn)化母細(xì)胞的轉(zhuǎn)變以及后續(xù)的增殖和分化。因而除初級活化信號之外，誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答需要次級共同刺激信號。這樣的一個共同刺激或輔助分子CD28被認(rèn)為可啟動或調(diào)節(jié)不同于任何通過TCR復(fù)合物刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
因此，為了在缺少外源生長因子或輔助細(xì)胞的情況下增強(qiáng)T細(xì)胞群體的活化和增殖，T細(xì)胞表面上的輔助分子例如CD28，用結(jié)合該輔助分子的配基刺激。一個實(shí)施方案中，通過T細(xì)胞群體與表面接觸(表面上附著有可結(jié)合CD3的配基和可結(jié)合CD28的配基)，使附屬分子CD28的刺激和T細(xì)胞活化同時(shí)發(fā)生。用例如抗CD3抗體進(jìn)行的T細(xì)胞的活化，以及CD28輔助分子的刺激，導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞選擇性增殖。
因此，本領(lǐng)域一般的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，包括抗DC28抗體或其能夠交聯(lián)CD28分子的片段或者CD28的天然配基在內(nèi)的任何因子，可用于刺激T細(xì)胞。用于本發(fā)明的典型抗CD28抗體或其片段包括，單克隆抗體9.3(IgG2a)(Bristol-Myers Squibb，Princeton，NJ)、單克隆抗體KOLT-2(IgG1)、15E8(IgG1)、248.23.2(IgM)、以及EX5.3D10(IgG2a)(ATCC HB11373)。典型的天然配基包括B7蛋白質(zhì)家族，例如B7-1(CD80)和B7-2(CD86)(Freedman等人，J.Immunol.1373260-3267，1987；Freeman等人，J.Immunol.1432714-2722，1989；Freeman等人，J.Exp.Med.174625-631，1991；Freeman等人，Science 262909-911，1993；Azuma等人，Nature 36676-79，1993；Freeman等人，J.Exp.Med.1782185-2192，1993)。此外，依照本發(fā)明，還可以利用天然配基的結(jié)合同系物，不論其是天然的還是通過化學(xué)或重組技術(shù)合成的。充當(dāng)次級信號的其他因子包括天然及合成的配基，因子可以包括但不局限于其它的抗體或其片段、肽、多肽、生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、糖肽、可溶性受體、甾類、激素、有絲分裂原如植物凝集素(PHA)、或其它超抗原。
本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，可以通過共同刺激其它的T細(xì)胞膜整合蛋白質(zhì)，來增強(qiáng)T細(xì)胞群體的活化。例如，T細(xì)胞整合素LFA-1與其天然配基ICAM-1的結(jié)合，可以增強(qiáng)細(xì)胞的活化。可以充當(dāng)T細(xì)胞共同刺激物的另一種細(xì)胞表面分子是VCAM-1(CD106)，其可與T細(xì)胞上的甚晚期抗原-4(very-late-antigen-4，VLA-4)結(jié)合。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以通過連接細(xì)胞表面成分和誘導(dǎo)該成分富集的因子的結(jié)合，繼而引起信號途徑活化，來刺激除T細(xì)胞以外的細(xì)胞。其它諸如此類的細(xì)胞表面成分包括但不局限于，GPI錨定的葉酸受體(CD59)、人IgE受體(FcεRi受體)、BCR、EGF受體、胰島素受體、ephrin B1受體、神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性中性粒細(xì)胞因子(glial-cell derived neutrophic factor，GNDF)、hedgehog、及其它連接膽固醇和棕櫚?；牡鞍踪|(zhì)、H-Ras、整合素、內(nèi)皮氧化氮合成酶(eNOS)、FAS、TNF受體家族成員、GPI錨定蛋白質(zhì)、雙重?；牡鞍踪|(zhì)例如Src激酶家族、異源三聚體G蛋白的α-亞基、以及細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)。
B.T細(xì)胞群體的擴(kuò)增
一方面，本發(fā)明通過T細(xì)胞分離以及隨后刺激，完成T細(xì)胞的離體擴(kuò)增。本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，利用單個因子刺激T細(xì)胞。另一個實(shí)施方案中，用兩個因子刺激T細(xì)胞，一個誘導(dǎo)初級信號，第二是共同刺激信號。可用于刺激單個信號或初級信號的配基以及刺激第二信號的輔助分子，可以可溶形式、附著于細(xì)胞表面、或固定在此處所述表面上的方式使用。附著于表面的配基或因子充當(dāng)抗原遞呈細(xì)胞(APC)的″代用品″。優(yōu)選的實(shí)施方案中，初級和次級因子都共固定在表面上。在一個實(shí)施方案中，提供初級活化信號的分子，例如CD3配基，以及共同刺激分子，例如CD28配基，偶聯(lián)在同一表面，例如顆粒上。另外，如前所述，可以使用位于相同或不同的表面上的一個、兩個、或更多的刺激分子。
擴(kuò)增之前，從受實(shí)驗(yàn)者處獲得T細(xì)胞來源。術(shù)語″受實(shí)驗(yàn)者″意圖包括可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的活有機(jī)體(例如哺乳動物)。受實(shí)驗(yàn)者的實(shí)例包括人、狗、貓、小鼠、大鼠、及其轉(zhuǎn)基因物種?？梢詮脑S多來源獲得T細(xì)胞，包括外周血單核細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、脾組織、以及腫瘤。優(yōu)選地，通過單采血液成分術(shù)法或白細(xì)胞提取法從個體循環(huán)血中獲得細(xì)胞。單采血液成分術(shù)法的產(chǎn)物一般包含淋巴細(xì)胞，包括T細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、B細(xì)胞、其它有核白血球、紅血球、以及血小板。在一個實(shí)施方案中，用單采血液成分術(shù)法收集的細(xì)胞可以經(jīng)洗滌除去血漿部份，并放入適當(dāng)?shù)木彌_液或培養(yǎng)基中，以供后續(xù)加工步驟。本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞。另一個實(shí)施方案中，洗滌溶液缺鈣，并可以缺鎂，或可以缺許多、甚至所有二價(jià)陽離子。再者，令人驚訝的是，在沒有鈣的情況下，開始的活化步驟引起活化放大。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員當(dāng)易理解，可以利用本領(lǐng)域所共知的方法完成洗滌步驟，例如按照廠家說明書使用半自動化″連續(xù)流″離心機(jī)(如Cobe 2991細(xì)胞處理機(jī)，Baxter)。洗滌以后，可將細(xì)胞再懸浮于多種生物相容性的緩沖液中，例如，無鈣無鎂的PBS。替代地，可以除去單采血液成分術(shù)法樣本中不合需要的成分，而直接將細(xì)胞再懸浮于培養(yǎng)基中。
另一個實(shí)施方案中，通過溶解紅細(xì)胞、去除單核細(xì)胞，從外周血淋巴細(xì)胞中分離T細(xì)胞，例如通過PERCOLLTM梯度離心?？梢岳谜蚧蜇?fù)向選擇技術(shù)，進(jìn)一步分離特定的T細(xì)胞亞群，例如CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、和CD45RO+T細(xì)胞。例如，可以利用針對負(fù)向選擇細(xì)胞特有表面標(biāo)志的抗體組合，通過負(fù)向選擇富集T細(xì)胞群體。優(yōu)選的方法是，使用針對負(fù)向選擇細(xì)胞上存在的細(xì)胞表面標(biāo)志的單克隆抗體組合，通過負(fù)向的磁性免疫細(xì)胞附著或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞的分揀和/或選擇。例如，為通過負(fù)向選擇富集CD4+細(xì)胞，單克隆抗體組合一般包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、以及CD8的抗體。
就上述的單核細(xì)胞去除而言，可在離體擴(kuò)增之前，從血制品中去除單核細(xì)胞群體(即CD14+細(xì)胞)，可以通過多種方法，包括抗CD14包被的小珠或柱子，或者利用這些細(xì)胞的吞噬活性促進(jìn)去除。因此，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，利用了大小足以被吞噬性單核細(xì)胞吞沒的順磁顆粒。在某些實(shí)施方案中，順磁顆粒是市場上買得到的小珠，如DynalAS生產(chǎn)的商標(biāo)名為DynabeadsTM的產(chǎn)品，在這方面典型的DynabeadsTM有M-280、M-450、和M-500。一方面，利用包被″無關(guān)″蛋白質(zhì)(例如血清蛋白或抗體)的順磁顆粒，去除其它的非特異性細(xì)胞。無關(guān)蛋白質(zhì)和抗體包括那些不特異性針對待擴(kuò)增T細(xì)胞的蛋白質(zhì)和抗體或片段。在某些實(shí)施方案中，無關(guān)小珠包括包被有綿羊抗小鼠抗體、山羊抗小鼠抗體、和人血清白蛋白的小珠。
簡言之，這種單核細(xì)胞的去除是如下進(jìn)行的利用一種或更多種無關(guān)的或非抗體偶聯(lián)的順磁顆粒預(yù)先溫育經(jīng)聚蔗糖分離的全血或單采血液成分術(shù)的外周血(每批細(xì)胞(一般大約5×108-2×1010細(xì)胞)約1瓶或4×109小珠)在22-37℃溫育約30分鐘-2小時(shí)，繼之以磁性去除附著或吞噬了順磁顆粒的細(xì)胞?？衫帽绢I(lǐng)域應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)方法完成這種分離，例如，可利用任何磁力分離方法，包括多種商品化的方法(如DYNAL磁性顆粒富集器(DYNAL MPC)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所熟知的多種方法，包括流式細(xì)胞術(shù)分析CD14陽性細(xì)胞，在去除前后監(jiān)測，以保證必要的去除。
制備供刺激用T細(xì)胞的另一方法是，于洗滌步驟后冷凍細(xì)胞，不需要去除單核細(xì)胞的步驟。但愿不受理論約束，冷凍及隨后的融化步驟去除了細(xì)胞群體中的粒細(xì)胞和一定程度上的單核細(xì)胞，從而提供了更為均一產(chǎn)物。經(jīng)過洗滌步驟除去血漿和血小板后，將細(xì)胞懸浮在冷凍液中。許多冷凍液及其參數(shù)為本領(lǐng)域所共知并可在本文中應(yīng)用，方法之一包括，利用含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS、或其它合適的細(xì)胞冷凍劑，然后按每分鐘1℃的速率將細(xì)胞冷凍至-80℃，并保存在液氮貯罐的氣相中。
如此處所述，可以通過諸如接觸固定于表面上的抗-CD3抗體或抗CD2抗體，或者接觸連有鈣離子載體的蛋白激酶C活化劑(如苔蘚抑素)，來刺激細(xì)胞群體。利用結(jié)合輔助分子的配基，來共同刺激T細(xì)胞表面上的輔助分子。例如，在適于刺激T細(xì)胞增殖的條件下，用抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸CD4+細(xì)胞群體。同樣，可以利用抗CD3抗體和單克隆抗體ES5.2D8(ATCC)以及本領(lǐng)域所共知的其它方法刺激CD8+T細(xì)胞的增殖(Berg等人，Transplant Proc.30(8)3975-3977，1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9)1319-1328，1999；Garland等人，J.Immunol Meth.227(1-2)53-63；1999)。
可通過不同方案提供T細(xì)胞的初級刺激信號和共同刺激信號。例如，提供各信號的因子可在溶液中或與表面偶聯(lián)。與表面偶聯(lián)時(shí)，因子可能偶聯(lián)同一表面(即″順式″形式)或分開的表面(即″反式″形式)。或者，可能一個因子偶聯(lián)表面，另一個因子在溶液中。在一個實(shí)施方案中，提供共同刺激信號的因子結(jié)合細(xì)胞表面，提供初級的活化信號的因子處于溶液中或與表面偶聯(lián)。優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩個因子固定在小珠上，其或是相同的小珠，即″順式″，或是分開的小珠，即″反式″。例如，提供初級活化信號的因子是抗CD3抗體，提供共同刺激信號的因子是抗CD28抗體；并且兩個因子均以相等的分子數(shù)量共固定在相同的小珠上。在一個實(shí)施方案中，為了CD4+T細(xì)胞的擴(kuò)增和T細(xì)胞生長，每種抗體以1∶1比率與小珠結(jié)合。然而，用來刺激T細(xì)胞或其它靶細(xì)胞的顆粒與細(xì)胞的比率，可以使用1∶500-500∶1以及兩者之間的任何整數(shù)值。
正如本領(lǐng)域一般技術(shù)人員容易理解的，顆粒與細(xì)胞的比率取決于相對于靶細(xì)胞的顆粒大小。例如，小珠子只能結(jié)合幾個細(xì)胞，大珠子則能結(jié)合許多。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞與顆粒的比率為1∶100-100∶1以及其間的任何整數(shù)值，在另外的實(shí)施方案中，包含1∶9-9∶1以及其間的任何整數(shù)值的比率，也可以用來刺激T細(xì)胞。引起T細(xì)胞刺激的抗CD3和抗CD28偶聯(lián)小珠與T細(xì)胞的比率，如上所述可能不同，但某些優(yōu)選的數(shù)值至少包括1∶4、1∶3、1∶2、2∶1、3∶1、4∶1-6∶1，一個優(yōu)選的比率是至少2∶1(小珠/T細(xì)胞)。
使用某些方法時(shí)，在初始活化和刺激后，經(jīng)過大約12-14天的一段時(shí)間后將T細(xì)胞與刺激物分開，以維持T細(xì)胞群體的長期刺激可能是有利的。例如，利用諸如庫爾特計(jì)數(shù)器檢查T細(xì)胞大小或測量其體積，定期(例如每天)監(jiān)測T細(xì)胞增殖率。在這點(diǎn)上，靜止T細(xì)胞的平均直徑大約6.8微米，受到初始活化和刺激后，在存在刺激配基的情況下，第4天T細(xì)胞平均直徑會增加到超過12微米，大約第6天開始降低。T細(xì)胞平均直徑降到約8微米時(shí)，可以重新活化和再刺激T細(xì)胞，以誘導(dǎo)T細(xì)胞再次增殖?；蛘撸ㄟ^分析在活化的T細(xì)胞上誘導(dǎo)出現(xiàn)的細(xì)胞表面分子，諸如B7-1、B7-2，來監(jiān)測T細(xì)胞增殖速率和T細(xì)胞再刺激時(shí)間。
為誘導(dǎo)CD4+和/或CD8+T細(xì)胞群體的長期刺激，可能必需用刺激因子，諸如抗CD3抗體和抗CD28抗體或單克隆抗體ES5.2D8，多次重新活化和再刺激該T細(xì)胞，產(chǎn)生的CD4+或CD8+細(xì)胞群體數(shù)量增加到原始T細(xì)胞群體的大約10-1,000倍。利用本方法，有可能獲得大約100-100,000倍的T細(xì)胞。此外，如實(shí)施例XII所述，利用本發(fā)明方法擴(kuò)增的T細(xì)胞分泌高水平細(xì)胞因子(例如IL-2、IFN-γ、IL-4、GM-CSF和TNF-a)到培養(yǎng)上清液中。例如，與利用IL-2刺激相比，利用抗CD3和抗CD28共刺激而擴(kuò)增的CD4+T細(xì)胞，向培養(yǎng)基中分泌高水平的GM-CSF和TNF-a?？梢詮呐囵B(yǎng)上清液中純化這些細(xì)胞因子，或該上清液可以直接用于維持細(xì)胞培養(yǎng)。同樣，利用本發(fā)明方法擴(kuò)增的T細(xì)胞，連同培養(yǎng)上清和細(xì)胞因子，可注入體內(nèi)支持細(xì)胞生長。
一個實(shí)施方案中，利用共固定在小珠(3x28小珠)上的抗CD3和抗CD28抗體刺激T細(xì)胞足夠長的一段時(shí)間，使細(xì)胞回到靜止?fàn)顟B(tài)(低增殖或者不增殖)(約初始刺激后8-14天)。然后從細(xì)胞中除去刺激信號，洗滌細(xì)胞，回輸病人。利用本發(fā)明方法，可使刺激末期的細(xì)胞具有應(yīng)答抗原以及表現(xiàn)記憶樣表型的能力，呈現(xiàn)″超可誘導(dǎo)化″，如實(shí)施例所證明。因此，經(jīng)或外源性或輸注體內(nèi)后抗原再刺激，活化的T細(xì)胞表現(xiàn)為獨(dú)特表型特性的強(qiáng)應(yīng)答性特征，例如持續(xù)性CD154表達(dá)、細(xì)胞因子產(chǎn)生增加等等。
本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，細(xì)胞，例如T細(xì)胞，與因子包被的小珠混合，隨后分開小珠和細(xì)胞，然后培養(yǎng)該細(xì)胞。在選擇的實(shí)施方案中，培養(yǎng)之前不分離因子包被的小珠和細(xì)胞，而是共同培養(yǎng)。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通過施加作用力，首先富集小珠和細(xì)胞，引起細(xì)胞表面成分連接，從而誘導(dǎo)細(xì)胞刺激。
例如，當(dāng)T細(xì)胞是靶細(xì)胞群體時(shí)，通過使附著抗CD3和抗CD28的順磁小珠(CD3xCD28小珠)與制備的T細(xì)胞接觸，從而使細(xì)胞表面成分連接。一個實(shí)施方案中，將細(xì)胞(例如每毫升104-109T細(xì)胞)和小珠(例如1.5×109個CD3×CD28順磁小珠)在緩沖液中混合，優(yōu)選地是PBS(無二價(jià)陽離子例如鈣和鎂)。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員也容易理解可以使用任何細(xì)胞濃度。例如，樣品中靶細(xì)胞可能非常少，僅包含樣品的0.01％，或者全部樣本(即100％)包含目的靶細(xì)胞。因此，任何細(xì)胞數(shù)量都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
懸浮細(xì)胞的緩沖液可以是適于特定細(xì)胞類型的任何緩沖液。使用某些細(xì)胞類型時(shí)，緩沖液可以包含為維持處理期間細(xì)胞完整所必需的其它組分，例如1-5％血清。另一實(shí)施方案中，細(xì)胞和小珠可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中混合。通過例如旋轉(zhuǎn)、振蕩或任何一種混合方法，混合細(xì)胞和小珠1分鐘-幾個小時(shí)的時(shí)間。
然后靠作用力，例如置于磁場中，富集小珠和細(xì)胞的容器。除去培養(yǎng)基和未結(jié)合細(xì)胞，洗滌附著于小珠上的細(xì)胞，例如通過蠕動泵泵送，然后再懸浮于適合細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中。
本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，混合物可能培養(yǎng)幾個小時(shí)(大約3小時(shí))到14天，或兩者之間以小時(shí)計(jì)的任何整數(shù)值。本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，小珠和T細(xì)胞共同培養(yǎng)大約8天。另一個實(shí)施方案中，小珠和T細(xì)胞共同培養(yǎng)2-3天。適于T細(xì)胞培養(yǎng)的條件包括，適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(例如最低必需培養(yǎng)基、或RPMI培養(yǎng)基1640、或X-vivo 15(BioWhittaker))，其中可包含為增殖和存活所必需的因子，包括血清(例如胎?；蛉搜?、或白細(xì)胞介素-2(IL-2)?？股?，例如青霉素和鏈霉素，僅包含在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物中，在輸給受實(shí)驗(yàn)者的細(xì)胞培養(yǎng)物中不存在。在支持生長所必需的條件下，例如適當(dāng)?shù)臏囟?例如37℃)和氣體(例如空氣加5％CO2)，培養(yǎng)靶細(xì)胞。
以磁場作為富集作用力時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)前施加于細(xì)胞的磁場強(qiáng)度，可以是在磁性表面為200-12,000高斯。磁鐵的形狀和大小適應(yīng)于混合或細(xì)胞培養(yǎng)容器的大小和形狀，或者適應(yīng)于促進(jìn)或提高細(xì)胞-細(xì)胞接觸以及細(xì)胞富集的其它參數(shù)。通過在磁鐵和細(xì)胞混合物內(nèi)含的順磁小珠之間放置作為緩沖物質(zhì)或者隔離物的材料，可以擴(kuò)散磁力。通常認(rèn)為，強(qiáng)磁力是表面上至少7500高斯，而弱磁力是在表面上為2000-2500高斯范圍之內(nèi)。通過磁鐵施加給順磁小珠的近似磁力，取決于順磁小珠的體積和磁場強(qiáng)度，公式如下
Fmag＝(ν)(ψ)(B)dB/dx).
其中Fmag為磁力，ν為順磁小珠的體積，ψ為順磁小珠的磁化率(由制造商提供數(shù)值)，B為磁場強(qiáng)度，而(dB/dx)為場強(qiáng)梯度。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以獲得或測量公式右手邊的因子，以計(jì)算施加的磁力。
利用本發(fā)明方法刺激的細(xì)胞被激活，這可以由誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)志和/或增殖顯示。CD154是適合T細(xì)胞的這樣一種標(biāo)志，它是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，CD154的表達(dá)對放大免疫應(yīng)答非常有利。CD154與在許多B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、和一些內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的CD40分子相互作用。因此，CD154表達(dá)的這種意想不到的并驚人的增加，很可能引發(fā)更有效的T細(xì)胞成分。此處所述CD3+細(xì)胞的刺激提供了刺激后第1、2、3、或4天某些細(xì)胞表面標(biāo)志(例如CD154)的表達(dá)水平提高1.1-20倍的T細(xì)胞(見實(shí)施例5、表2和圖4)。經(jīng)過富集并刺激，T細(xì)胞上另一細(xì)胞表面標(biāo)志CD25的表達(dá)也高于培養(yǎng)前細(xì)胞或通過其它方法刺激的細(xì)胞(見表2)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可通過細(xì)胞表面成分連接而刺激的任何靶細(xì)胞，可以與因子包被的表面，例如小珠聯(lián)合。此外，因子包被的表面，例如小珠，可以在培養(yǎng)前、培養(yǎng)期間任一時(shí)間點(diǎn)、或培養(yǎng)結(jié)束時(shí)與細(xì)胞分開。另外，與靶細(xì)胞連接的因子包被的表面可以在培養(yǎng)前與未結(jié)合細(xì)胞分離，或者這些其它細(xì)胞也可以留在培養(yǎng)基中。一個實(shí)施方案中，培養(yǎng)之前不分開因子包被的小珠和靶細(xì)胞，而是共同培養(yǎng)。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通過施加作用力，首先富集小珠和靶細(xì)胞，引起靶細(xì)胞表面成分連接，從而誘導(dǎo)刺激及后續(xù)活化。
本發(fā)明也包括可增加靶細(xì)胞濃度的其它方法，例如與包被有初級和次級刺激分子的表面相結(jié)合的T細(xì)胞部份。除施加磁力外，可以施加其它大于重力的作用力，例如而不局限于離心力、跨膜壓、和液壓力。也可利用過濾進(jìn)行富集。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，可以利用其它作用力進(jìn)行富集，以加強(qiáng)因子包被的小珠與待刺激細(xì)胞間的接觸。因此，利用細(xì)胞表面成分與配基結(jié)合來富集細(xì)胞的任何方法都是足夠的，只要該富集作用能夠以大于重力或擴(kuò)散的方式將細(xì)胞和因子匯集在一起即可。
應(yīng)當(dāng)理解，在各個實(shí)施方案中，因子包被的表面可能是顆粒，例如與細(xì)胞混合并在磁場中富集在小體積中的小珠，從而將全部顆粒以及結(jié)合顆粒的細(xì)胞帶到明確而集中的區(qū)域之中。某些實(shí)施方案中，因子包被的表面可在暴露于靶細(xì)胞的30秒-4小時(shí)之內(nèi)，因作用力而富集。其它實(shí)施方案中該時(shí)間可能是1分鐘-2小時(shí)、或介于其間的所有整數(shù)。施加作用力于具有受體生成細(xì)胞的細(xì)胞群體(該細(xì)胞群體混合了附著有至少一種細(xì)胞表面配基的表面)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞受體極化，細(xì)胞表面分子富集。這種誘導(dǎo)細(xì)胞表面極化的方法可通過聚集包含脂類筏的細(xì)胞表面分子來增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)信號。這種聚集可以誘導(dǎo)引起細(xì)胞事件下調(diào)或抑制的信號途徑。或者，細(xì)胞表面分子的這種聚集可以引起細(xì)胞事件的上調(diào)或活化。
細(xì)胞事件包括，例如受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其可誘導(dǎo)或抑制包含凋亡在內(nèi)的特定途徑，或者誘導(dǎo)蛋白質(zhì)磷酸化，或者刺激或抑制生長信號。一個實(shí)施方案中，細(xì)胞可以是淋巴細(xì)胞，特別是T細(xì)胞，細(xì)胞表面配基可以是附著于表面例如顆粒上的抗CD3抗體；該顆粒可以是順磁小珠，施加的作用力是磁力。給淋巴細(xì)胞和順磁小珠抗CD3包被表面的混合物施加磁力，可引起T細(xì)胞CD3受體極化，其速度快于沒有外力的情況下。這種刺激T細(xì)胞的方法，促使T細(xì)胞免疫應(yīng)答途徑迅速活化，并促進(jìn)細(xì)胞增殖。
另一實(shí)施方案中，可以改變或定制暴露于刺激因子例如抗CD3/抗-CD28(即CD3xCD28)包被的小珠的時(shí)間，以獲得所需的T細(xì)胞表型。因?yàn)檩o助T細(xì)胞(TH)的擴(kuò)增能夠改善或者恢復(fù)全面的免疫應(yīng)答，故可能需要更多的輔助T細(xì)胞(TH)群體，一般是CD4+細(xì)胞，與CD8+細(xì)胞毒性或抑制性T細(xì)胞(Tc)相反。許多特定的免疫應(yīng)答是由CD8+抗原特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的，其可直接溶解或殺死靶細(xì)胞，但多數(shù)免疫應(yīng)答需要CD4+T細(xì)胞的幫助，其表達(dá)重要的免疫調(diào)節(jié)分子，例如GM-CSF、CD40L、和IL-2。當(dāng)優(yōu)選CD4介導(dǎo)的輔助時(shí)，此處所述的可保持或提高CD4∶CD8的比率的方法，是極其有利的。CD4+T細(xì)胞數(shù)量的增加可以提高輸給病人的細(xì)胞表達(dá)的CD40L量，潛在地改善了靶細(xì)胞的可見度(改善APC功能)。提高表達(dá)GM-CSF或IL-2(均主要由CD4+T細(xì)胞表達(dá))細(xì)胞的輸注數(shù)量，可以看到類似的效果?；蛘?，對于較少需要CD4輔助而希望增加CD8+T細(xì)胞數(shù)量的情況下，還可以利用此處所述XCELLERATE方法，例如在刺激和/或培養(yǎng)之前預(yù)先選擇CD8+細(xì)胞。在需要升高IFN-水平或者加強(qiáng)靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解作用時(shí)，可能存在這種情況。
為完成不同T細(xì)胞群體的分離，暴露于富集作用力的時(shí)間可以是可變的或者脈沖的。例如作用力是磁鐵時(shí)，可以改變暴露的磁鐵或者磁場強(qiáng)度，和/或改變擴(kuò)增時(shí)間，以獲得特定的目的表型。多種表型標(biāo)志的表達(dá)隨時(shí)間而改變；所以為獲得特定的T細(xì)胞群體，可以選擇特定的時(shí)間點(diǎn)。因此，根據(jù)待刺激的細(xì)胞類型，刺激和/或擴(kuò)增的時(shí)間可能是4周或更少、2周或更少、10天或更少、或者8天或更少(4周或更少包括從4周到1天(24小時(shí))的所有時(shí)間范圍)。一些實(shí)施方案中，刺激和擴(kuò)增可以進(jìn)行6天或更少、4天或更少、2天或更少，而在其它實(shí)施方案中，可以少到24小時(shí)或更少，優(yōu)選地4-6小時(shí)或更少(此范圍包括其間任何整數(shù)值)。T細(xì)胞刺激進(jìn)行的時(shí)間較短時(shí)，有可能不能顯著增加T細(xì)胞群體的數(shù)量，但是該群體會提供更強(qiáng)、更健康的活化T細(xì)胞，其可以繼續(xù)在體內(nèi)增殖，并更類似于正常的效應(yīng)T細(xì)胞集合。在對蛋白質(zhì)抗原的抗體反應(yīng)中T細(xì)胞輔助的獲得經(jīng)常是限制因素，因此能夠選擇性擴(kuò)增或選擇性輸注給受實(shí)驗(yàn)者以富集CD4+的T細(xì)胞群體，是非常有利的。這種富集群體的另外的好處顯然是，可識別B淋巴細(xì)胞呈遞的抗原的活化輔助T細(xì)胞會傳遞物理接觸和細(xì)胞因子產(chǎn)生兩種類型刺激信號，引起B(yǎng)細(xì)胞增殖和分化。
處于不同激活時(shí)間的T細(xì)胞可顯示不同的特征，例如，一般血液或經(jīng)單采血液成分的外周血單核細(xì)胞產(chǎn)物具有輔助T細(xì)胞群體(TH，CD4+)，其量大于細(xì)胞毒或抑制性T細(xì)胞群體(Tc，CD8+)。通過激活CD3和CD28受體離體擴(kuò)增T細(xì)胞而產(chǎn)生的T細(xì)胞群體，其在大約第8-9天前主要由TH細(xì)胞組成，而大約第8-9天以后，該T細(xì)胞群體包含的Tc細(xì)胞群體日益增多。因此，根據(jù)治療目的，用主要包含TH細(xì)胞的T細(xì)胞群體輸注給受實(shí)驗(yàn)者，是有利的。同樣，如果已分離到Tc細(xì)胞的抗原特異性亞群，則在更大程度上擴(kuò)增該亞群可能是有利的。
另外，除CD4和CD8標(biāo)志以外，其它表型標(biāo)志也差異顯著，但很大程度上可在細(xì)胞擴(kuò)增過程中再現(xiàn)。因而這種可再現(xiàn)性可以為特定目的而定制活化的T細(xì)胞產(chǎn)物。
這樣的一個實(shí)施例中，可隨時(shí)間再現(xiàn)性改變的重要表型標(biāo)志中有高親合力的IL-2受體(CD25)、CD40配基(CD154)、和CD45RO(通過優(yōu)先結(jié)合TCR，可提高TCR對抗原結(jié)合敏感性的分子)。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員容易理解，這種分子的重要性在于多種原因。例如，在容許T細(xì)胞迅速分裂的自分泌環(huán)路中，CD25構(gòu)成重要部分。CD154在下列過程中顯示關(guān)鍵作用激活抗原呈遞樹突狀細(xì)胞的成熟過程；活化B細(xì)胞用于產(chǎn)生抗體；調(diào)節(jié)TH細(xì)胞增殖；增強(qiáng)Tc細(xì)胞分化；調(diào)節(jié)TH細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌；以及激活共刺激配基，包括CD80、CD86、和CD154的表達(dá)。
細(xì)胞因子生成高峰位于離體擴(kuò)增過程的前幾天，相應(yīng)地，因?yàn)橐阎?xì)胞因子對于介導(dǎo)T細(xì)胞活化和功能以及免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)是重要的，所以這種細(xì)胞因子對開發(fā)治療性T細(xì)胞產(chǎn)物非常重要，其可在受到其它抗原攻擊時(shí)進(jìn)行重激活。在這方面重要的細(xì)胞因子，包括但不局限于IL-2、IL-4、TNF-、以及IFN-。因而，通過在擴(kuò)增的前幾天獲得T細(xì)胞群體，并輸注給受試驗(yàn)者，可以產(chǎn)生治療性有益效果，其中發(fā)生了進(jìn)一步的體內(nèi)T細(xì)胞活化和擴(kuò)增。
除前述細(xì)胞因子及標(biāo)志以外，在離體擴(kuò)增過程中，已知對介導(dǎo)T細(xì)胞活化和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)重要的粘附分子的表達(dá)也發(fā)生巨大且可再現(xiàn)的變化。例如，CD62L對于T細(xì)胞歸巢到淋巴組織以及運(yùn)送到炎癥位點(diǎn)是重要的。在某些疾病和傷害的情況下，在這些位點(diǎn)存在活化的T細(xì)胞可能是不利的。因?yàn)樵诨罨筝^早出現(xiàn)CD62L的下調(diào)，因此這樣的T細(xì)胞擴(kuò)增較短時(shí)段。相反，較長時(shí)段培養(yǎng)會產(chǎn)生具有高水平CD62L的T細(xì)胞群體，因而在其它優(yōu)選條件下將活化T細(xì)胞靶向到這些位點(diǎn)的能力更強(qiáng)。另一個表達(dá)隨時(shí)間變化的多肽例子是CD49d，它是一種粘附分子，其參與將淋巴細(xì)胞從血液運(yùn)送到炎癥位點(diǎn)的組織間隙。CD49d配基與CD49d的結(jié)合可使T細(xì)胞通過與VCAM-1或纖連蛋白配基的結(jié)合接受活化和增殖的共激活信號。粘附分子CD54(其參與T細(xì)胞-APC和T細(xì)胞-T細(xì)胞相互作用，以及到炎癥位點(diǎn)的歸巢)的表達(dá)也在擴(kuò)增過程中發(fā)生改變。因此，可在與目的標(biāo)志分布一致的選擇的時(shí)段內(nèi)激活T細(xì)胞，隨后收集并輸注。因此可定制T細(xì)胞群體，以表達(dá)據(jù)信可對預(yù)治療的適應(yīng)癥具有最大療效的標(biāo)志。
在各個實(shí)施方案中，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員理解，從細(xì)胞中去除刺激信號取決于所利用的表面類型。例如，如果利用順磁小珠，那么磁性分離是可用的選項(xiàng)。順磁小珠制造商的說明書(例如DYNAL Inc.，Oslo，Norway)詳述了分離技術(shù)。此外，如果該表面是大到足以與細(xì)胞分開的珠，則可以利用過濾。再有，市場上可買到多種輸血濾器，包括20微米和80微米輸血濾器(Baxter)。因此，只要小珠大于濾器的網(wǎng)尺寸，則這種過濾效率很高。相關(guān)實(shí)施方案中，小珠可以透過濾器，但細(xì)胞保留，因而使其分開。
盡管此處所述方法利用的抗體，可以從公共來源例如ATCC輕易獲得，但針對T細(xì)胞輔助分子以及CD3復(fù)合物的抗體可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生產(chǎn)。本發(fā)明方法所用抗體的產(chǎn)生方法為本領(lǐng)域所熟知，此處進(jìn)行了更詳盡的描述。
C.在表面上固定配基
如上所述，本發(fā)明方法優(yōu)選地利用結(jié)合表面的配基。該表面可以是具有結(jié)合其上或整合其中的配基的任何表面，并且是生物相容性的，即基本上對所要激活的靶細(xì)胞無毒。生物相容性表面可以是可生物降解的，或是不可生物降解的。表面可以是天然的或合成的，合成的表面可以是聚合物。表面可以包含膠原、純化的蛋白質(zhì)、純化的肽、多糖、糖胺聚糖、或細(xì)胞外基質(zhì)成分。多糖可以包括，例如纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、透明質(zhì)酸或藻酸鹽。其它聚合物包括聚酯、聚醚、聚酐、聚烷基腈基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、聚乙酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、或聚氨基甲酸乙酯。聚合物可以是乳酸或共聚物。共聚物可以包含乳酸和羥基乙酸(PLGA)。不可生物降解的表面可以包括，例如聚(二甲基硅氧烷)和聚(乙烯-乙酸乙烯酯)。生物相容性表面包括，例如玻璃(如生物玻璃)、膠原、金屬、羥基磷灰石、鋁酸鹽、生物陶瓷材料、透明質(zhì)酸聚合物、藻酸鹽、丙烯酸酯聚合物、乳酸聚合物、羥基乙酸聚合物、乳酸/羥基乙酸聚合物、純化的蛋白質(zhì)、純化的肽、或細(xì)胞外基質(zhì)成分。其它含有表面的聚合物包括玻璃、二氧化硅、硅、羥基磷灰石、水凝膠、膠原、丙烯醛、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍、或許多塑料或合成的有機(jī)聚合物等等。表面可以包含生物學(xué)結(jié)構(gòu)，例如脂質(zhì)體。表面可以是脂類、平板、囊、片、纖維、網(wǎng)、或顆粒形式。顆粒可包括膠體粒子、微球、納米微粒、小珠等等。各個實(shí)施方案中，可以利用市場上能買到的表面，例如小珠或其它顆粒(如Miltenyi顆粒，Miltenyi Biotec，德國；瓊脂糖小珠，Pharmacia FineChemicals，瑞典；DYNABEADSTM，Dynal Inc.，紐約；PURABEADSTM，Prometic Biosciences)。
使用的小珠可以是能夠?qū)崿F(xiàn)靶細(xì)胞激活的任何大小的小珠。一個實(shí)施方案中，小珠大小優(yōu)選地為大約5納米-500μm。因此，小珠大小的選擇取決于小珠適合的特定應(yīng)用。例如，如果小珠用于去除單核細(xì)胞，選擇小型的以促進(jìn)單核細(xì)胞攝入(例如直徑為2.8μm和4.5μm，或者可被吞噬的任何大小，如納米大小)；然而，若想要通過過濾分離小珠時(shí)，利用的小珠大小一般不小于50μm。此外，利用順磁小珠時(shí)，小珠大小一般為大約2.8μm-500μm，更優(yōu)選地為大約2.8-50μm。最后，可以選擇小到大約10nm的超順磁納米微粒。因此，從上述討論可輕易看出，事實(shí)上可以使用任何的顆粒大小。
利用本領(lǐng)域內(nèi)共知和可用的多種方法，可將因子附著或偶聯(lián)或整合到表面中。因子可以是天然配基、蛋白質(zhì)配基、或合成配基。附著可以是共價(jià)的或非共價(jià)的、靜電的、或疏水性的，可以利用多種附著方法進(jìn)行，包括例如化學(xué)的、機(jī)械的、酶的、或配基能夠激活細(xì)胞的其它方法。例如，針對配基的抗體首先附著于表面，或者親和素或鏈親和素附著于用于結(jié)合生物素?；浠谋砻?。針對配基的抗體可以通過抗獨(dú)特型抗體附著于表面。另一個例子包括利用蛋白A或蛋白G，或者其它非特異性抗體結(jié)合分子，其附著于結(jié)合抗體的表面?；蛘撸浠梢酝ㄟ^化學(xué)方法附著于表面，例如利用商品化的交聯(lián)劑(Pierce，Rockford，IL)交聯(lián)到表面，或者其它方法。某些實(shí)施方案中，配基共價(jià)結(jié)合到表面上。另外，一個實(shí)施方案中，將商品化的帶有環(huán)氧表面活性基團(tuán)的甲苯磺?；罨疍YNABEADSTM或DYNABEADSTM，按照廠家說明書，與目的多肽配基孵育。簡要地，這種條件一般包括在pH4-pH9.5的磷酸鹽緩沖液中、于4-37℃溫度范圍內(nèi)溫育。
一方面，因子例如某些配基可以是單起源或多起源的，可以是抗體或其片段，另一方面，應(yīng)用T細(xì)胞時(shí)，共刺激配基是B7分子(例如B7-1、B7-2)。通過上述的任何不同的附著方法，將這些配基與表面偶聯(lián)。可以從表達(dá)共刺激分子的細(xì)胞中分離用于偶聯(lián)表面的B7分子，或者利用如此處所述標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)及可產(chǎn)生和分離共刺激分子的表達(dá)系統(tǒng)，獲得B7分子。還可以利用在偶聯(lián)到細(xì)胞表面時(shí)保持觸發(fā)T細(xì)胞共刺激信號能力的B7分子的片段、突變體、或變異體。此外，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員應(yīng)知道，可用于活化和誘導(dǎo)T細(xì)胞亞群增殖的任何配基，同樣可以固定于小珠或培養(yǎng)容器表面或任何表面。再有，盡管優(yōu)選的方法之一是將配基共價(jià)連接到表面，但也可以利用第二單克隆抗體吸附或捕獲。例如，如果表面是小珠表面，附著于表面的特定配基的量可經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析輕易測定，或者如果表面是組織培養(yǎng)皿、網(wǎng)、纖維、囊，可通過酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)測定。
特定實(shí)施方案中，B7分子的刺激形式或抗CD28抗體或其片段與刺激TCR/CD3復(fù)合物的因子例如抗CD3抗體附著于相同固相表面。除抗CD3抗體之外，可以利用與模擬抗原信號的受體結(jié)合的其它抗體。例如，小珠或其它表面可以被抗CD2抗體和B7分子、特別是抗CD3抗體和抗CD28抗體聯(lián)合包被。
D.因子
本發(fā)明意圖利用的因子包括蛋白質(zhì)配基、天然配基、和合成配基?？梢越Y(jié)合細(xì)胞表面成分、并在一定條件下引起連接和聚集、導(dǎo)致信號發(fā)生的因子包括而不局限于植物凝集素(例如PHA、扁豆植物凝集素、伴刀豆凝集素A)、抗體、抗體片段、肽、多肽、糖肽、受體、B細(xì)胞受體和T細(xì)胞受體的配基、細(xì)胞外基質(zhì)成分、類固醇、激素(例如生長激素、皮質(zhì)甾類、前列腺素、甲狀腺素、細(xì)菌成分(例如脂多糖)、有絲分裂原、抗原、超抗原及其衍生物、生長因子、細(xì)胞因子、病毒蛋白質(zhì)(例如HIV gp-120)、粘附分子(例如L-選擇素、LFA-3、CD54、LFA-1)、趨化因子和小分子。因子可以分離自天然來源，例如細(xì)胞、血液產(chǎn)品和組織，或分離自體外增殖的細(xì)胞，或重組方法，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法制備。
一方面，本發(fā)明在需要激活T細(xì)胞時(shí)，可利用的因子包括能夠結(jié)合CD3/TCR復(fù)合物、CD2、和/或CD28，并分別啟動活化或增殖的配基。相應(yīng)地，術(shù)語配基包括作為細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的″天然″配基的蛋白質(zhì)(例如針對CD28的B7分子)，以及人工配基，例如細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的抗體?？梢园凑諅鹘y(tǒng)方法生產(chǎn)這些抗體及其片段，例如雜交瘤方法以及重組DNA和蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)。有用的抗體和片段可以來源于包括人在內(nèi)的任何物種，或者是具有多個物種序列的嵌合蛋白質(zhì)形式。
可以利用本領(lǐng)域熟知的方法產(chǎn)生針對配基的特異性抗體、多克隆抗血清、或單克隆抗體。也可以生產(chǎn)按目的特性設(shè)計(jì)的抗體，例如基因工程化免疫球蛋白(Ig)或者Ig片段。例如，作為說明而不是限制，抗體可以包括重組IgG，其是嵌合的融合蛋白，含有至少一個來源于第一哺乳動物物種的可變(V)區(qū)結(jié)構(gòu)域，以及至少一個來源于第二不同的哺乳動物物種的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。最常見的是，嵌合抗體含有鼠的可變區(qū)序列以及人的恒定區(qū)序列。通過將補(bǔ)體決定區(qū)(CDRs)(來源于鼠抗體，賦予與抗原結(jié)合的特異性)，移植入人源V區(qū)結(jié)構(gòu)區(qū)域以及人源恒定區(qū)，可以使這樣的鼠/人嵌合免疫球蛋白“人源化”。該分子片段可通過蛋白水解消化，或任選地，通過蛋白水解消化后二硫鍵溫和還原和烷基化，或者通過重組基因工程技術(shù)產(chǎn)生。
如果抗體特異性地結(jié)合配基，其親合常數(shù)Ka大于或等于約104M-1，優(yōu)選地大于或等于約105M-1，更優(yōu)選地大于或等于約106M-1，更加優(yōu)選地大于或等于約107M-1，則定義抗體為″免疫特異性″的。利用常規(guī)方法，例如Scatchard等人描述的方法(Ann.N.Y.Acid.Sci.USA 51660，1949)，或者通過表面胞質(zhì)團(tuán)共振(BIAcore，Biosensor，Piscataway，NT，參見Wolff等人，Cancer Res.，532560-2565，1993))，很容易測定結(jié)合配偶體或抗體的親合力。
通常利用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的多種技術(shù)中的任何一種制備抗體(參見，例如Harlow等人，AntibodiesA Laboratory Manual，1988，Cold Spring Harbor Laboratory)。這樣的一個技術(shù)中，用配基作為抗原免疫動物，以產(chǎn)生多克隆抗血清。適合的動物包括兔、綿羊、山羊、豬、牛，并可以包括較小的哺乳動物物種，例如小鼠、大鼠和倉鼠。
免疫原可以包含表達(dá)配基的細(xì)胞、純化的或者部分純化的配基多肽或變異體或其片段、或配基肽。可以通過蛋白水解斷裂、或者化學(xué)合成產(chǎn)生配基肽?？梢园凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，通過分析配基的初級、二級、或三級結(jié)構(gòu)選擇用于免疫的肽，以確定更有可能在宿主動物中產(chǎn)生抗原反應(yīng)的氨基酸順序(參見，例如Novotny，Mol.Immunol.28201-207，1991；Berzoksky，Science 229932-40，1985)。
制備免疫原可包括，配基多肽或變異體或其片段、或肽共價(jià)偶聯(lián)另一個免疫原性蛋白質(zhì)，例如匙孔血藍(lán)素或牛血清白蛋白。此外，可在佐劑中乳化肽、多肽、細(xì)胞(參見Harlew等人，AntibodiesALaboratory Manual，1988 Cold Spring Harber Laboratory)。按照動物物種的優(yōu)選方案，通常在第一次注射以后，動物接受一次或多次加強(qiáng)免疫。通過對動物定期取血，分離血清，并免疫測定分析血清，例如Ouchterlony分析，監(jiān)測免疫應(yīng)答，以評定特異性抗體的滴度。一旦確定了抗體滴度，對動物定期取血，積累多克隆抗血清。然后從該抗血清中純化可特異性結(jié)合配基多肽或肽的多克隆抗體，例如通過蛋白質(zhì)A或者偶聯(lián)合適固體支持物的配基多肽或肽的親合層析。
可以利用如Kohler和Milstein的技術(shù)(Nature，256495-497，1975；Bur.J.Immunol.6511-5I9，1976)及其改進(jìn)的技術(shù)，制備特異性結(jié)合配基多肽或片段或其變異體的單克隆抗體?？梢援a(chǎn)生永生化真核細(xì)胞系雜交瘤，生產(chǎn)對配基多肽或變異體或其片段具有所需特異性的抗體。用如上所述制備的配基免疫原，免疫動物，例如大鼠、倉鼠、或優(yōu)選地小鼠?？赏ㄟ^將從免疫動物獲得的淋巴樣細(xì)胞，最通常是脾細(xì)胞，與藥物致敏的骨髓瘤細(xì)胞融合配偶體，優(yōu)選地與該免疫動物同源的融合配偶體相融合，使其永生化。用膜融合促進(jìn)劑，例如聚乙二醇或非離子型去污劑使脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞結(jié)合幾分鐘，然后低密度接種于支持雜交瘤細(xì)胞、而非骨髓瘤細(xì)胞生長的選擇培養(yǎng)基中。優(yōu)選的選擇培養(yǎng)基是HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脫氧核苷)。經(jīng)過足夠時(shí)間，通常約1-2周后，觀察細(xì)胞集落。分離單個集落，并檢驗(yàn)細(xì)胞產(chǎn)生的抗體對配基多肽或變異體或其片段的結(jié)合活性。優(yōu)選可生產(chǎn)對配基抗原具有高親合力和特異性的抗體的雜交瘤。本發(fā)明涵蓋生產(chǎn)特異性結(jié)合配基多肽或變異體或其片段的單克隆抗體的雜交瘤。
可以從雜交瘤培養(yǎng)的上清液中分離單克隆抗體。另一種生產(chǎn)鼠單克隆抗體的方法是將雜交瘤細(xì)胞注射到同源小鼠的腹膜腔。小鼠產(chǎn)生包含該單克隆抗體的腹水液。通過常規(guī)技術(shù)，例如層析法、凝膠過濾、沉淀、或萃取，從抗體中除去污染物。
可以通過多種技術(shù)生產(chǎn)人單克隆抗體。方法包括而不局限于，Epstein Barr病毒(EBV)轉(zhuǎn)化人外周血細(xì)胞(參見美國專利No.4,464,456)，體外免疫人B細(xì)胞(參見例如Boerner等人，J.Immunol.14786-95，1991)，融合免疫的攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞以及融合免疫的攜帶插入酵母人工染色體(YAC)的免疫球蛋白基因之轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞(參見例如美國專利No.5,877,397；Bruggemann等人，Curr.Opin.Biotechnol.8455-58，1997；Jakobovits等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.764525-35，1995)，或從人免疫球蛋白V區(qū)噬菌體文庫中分離。
可以產(chǎn)生本發(fā)明所用的嵌合抗體和人源化抗體。嵌合抗體具有至少一個來源于第一種哺乳動物物種的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，以及至少一個來源于第二種不同的哺乳動物物種的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(參見例如Morrisen等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA，816851-55，1984)。最通常的是，可通過將編碼至少一個來源于非人單克隆抗體的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(例如來源于小鼠、大鼠、或倉鼠單克隆抗體的可變區(qū))的多聚核苷酸序列克隆進(jìn)包含編碼至少一個人恒定區(qū)的序列的載體中，構(gòu)建嵌合抗體。(參見例如Shin等人，Methods Enzymol.178459-76，1989；Walls等人，Nucleic Acids Res.212921-29，1993)。人恒定區(qū)的選擇取決于針對特定抗體所希望的效應(yīng)器功能。本領(lǐng)域已知的另一產(chǎn)生嵌合抗體的方法是同源重組(美國專利No.5,482,856)。優(yōu)選地，將載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)嵌合抗體。
非人/人嵌合抗體可以進(jìn)一步遺傳工程改造為″人源化″抗體。這樣的抗體具有多個來源于非人哺乳動物物種免疫球蛋白的CDRs、至少一個人可變結(jié)構(gòu)區(qū)域、以及至少一個人免疫球蛋白恒定區(qū)。與非人單克隆抗體或嵌合抗體比較，人源化產(chǎn)生的抗體結(jié)合親合力降低。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用一種或多種策略設(shè)計(jì)人源化抗體。
在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選使用抗體的抗原結(jié)合片段。這樣的片段包括Fab片段或F(ab’)2片段，其可以分別利用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶進(jìn)行蛋白水解消化而制備。通過親合層析使抗原結(jié)合片段與Fc片段分離，例如利用固定化的蛋白質(zhì)A，或者固定化的配基多肽或變異體或其片段。產(chǎn)生Fab片段的另一方法包括溫和還原F(ab’)2片段，隨后烷基化(參見例如Weir，Handbook of Experimental Immunology，1986，Blackwell Scientific，Boston)。
上述任何Ig分子的非人、人、或人源化的重鏈和輕鏈可變區(qū)，可以構(gòu)建為單鏈Fv(sFv)片段(單鏈抗體)。參見例如Bird等人，Science242423-426，1988；Huston等人，Proc.Nat！.Acad.Sci.USA855879-5883，1988。通過框架內(nèi)連接編碼sFv的多聚核苷酸序列和編碼多種效應(yīng)器蛋白質(zhì)的多聚核苷酸序列，可產(chǎn)生多功能融合蛋白質(zhì)。這些方法為本領(lǐng)域已知，并公開于例如EP-B1-0318554、美國專利No.5,132,405、美國專利No.5,091,513、以及美國專利No.5,476,786。
特異性與配基多肽或變異體或其片段結(jié)合的抗體的其它選擇方法，是通過噬菌體展示(參見例如Winter等人，Annul.Rev.Immunol.12；433-55，1994；Burton等人，Adv.Immunol.57191-280，1994)。可以在可篩選與配基多肽或變異體或其片段特異性結(jié)合的Ig片段(Fab、Fv、sFv、或其多聚體)的噬菌體載體中，建立人或鼠的免疫球蛋白可變區(qū)基因組合文庫(參見例如美國專利No.5,223,409；Huse等人，Science 2461275-81，1989；Kang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884363-66，1991；Hoogenboom等人，J Molec.Biol.227381-388，1992；Schlebusch等人，Hybridoma 1647-52，1997及其引用的參考文獻(xiàn))。
細(xì)胞群體
如上所述，本發(fā)明適用于帶有希望連接的細(xì)胞表面成分的任何細(xì)胞類型。在這方面，利用本發(fā)明方法可以增強(qiáng)許多細(xì)胞信號事件。這樣的方法可以用于離體環(huán)境中的治療應(yīng)用，以活化和刺激輸入病人的細(xì)胞，或者用于體內(nèi)，以誘導(dǎo)靶細(xì)胞群體的細(xì)胞信號事件。然而，仍如上所述，此處提供的一般實(shí)施例是指T細(xì)胞，但決不限于此。
關(guān)于T細(xì)胞，此處所述各種擴(kuò)增方法產(chǎn)生的T細(xì)胞群體可以具有取決于應(yīng)用條件的多種特定表型特征。這樣的表型特征包括提高CD25、CD154、IFN-、和GM-CSF的表達(dá)，以及改變CD137、CD134、CD62L、和CD49d的表達(dá)。能夠區(qū)別控制這些成分的表達(dá)是非常重要的。例如，通過接觸抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、以及甚至白血病B細(xì)胞或淋巴瘤)上表達(dá)的CD40分子，在″定制的T細(xì)胞″表面高水平表達(dá)CD154，會加強(qiáng)抗原呈遞和免疫功能。當(dāng)前許多公司應(yīng)用這樣的策略，通過抗體或重組CD40L連接CD40。此處所述方法允許以更生理學(xué)的方式例如通過T細(xì)胞傳遞相同的信號。通過定制T細(xì)胞活化(XCELLERATE)方法增加分泌IFN-的能力，能夠幫助促進(jìn)產(chǎn)生TH1型免疫應(yīng)答，它對抗腫瘤和抗病毒反應(yīng)是重要的。與CD154類似，增加GM-CSF表達(dá)可以提高APC功能，特別是通過促進(jìn)APC祖細(xì)胞成熟為功能更強(qiáng)的APC，例如樹突狀細(xì)胞。改變CD137和CD134的表達(dá)，可以影響T細(xì)胞對凋亡信號表現(xiàn)抗性或敏感的能力?？刂普掣?歸巢受體的表達(dá)，例如CD62L和/或CD49d，可以決定輸入的T細(xì)胞歸巢到淋巴器官、感染位點(diǎn)、或腫瘤位點(diǎn)的能力。
本發(fā)明另一方面提供了于擴(kuò)增前去除了CD8+或CD4+細(xì)胞的T細(xì)胞群體或組合物。一個實(shí)施方案中，利用針對CD8+標(biāo)志的抗體去除CD8+細(xì)胞。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員能夠輕易確定用于從樣品中去除CD8+或CD4+細(xì)胞的或反之富集CD8+或CD4+細(xì)胞含量的多種特定方法。關(guān)于富集CD4+細(xì)胞，本發(fā)明的一個方面集中在當(dāng)激活已去除Tc(CD8+)細(xì)胞的T細(xì)胞群體時(shí)，識別極強(qiáng)的CD154表達(dá)分布。如上所述，CD154是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，其表達(dá)非常有利于放大免疫應(yīng)答。因此，增強(qiáng)CD154表達(dá)很可能產(chǎn)生更有效的T細(xì)胞組合物。
可以通過多種方法監(jiān)測本發(fā)明T細(xì)胞群體的表型特性，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞術(shù)方法和ELISA方法。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員容易理解，此處所述的細(xì)胞刺激方法可以在多種環(huán)境(即容器)中實(shí)現(xiàn)。例如，這樣的容器可以是培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)袋、或能夠容納細(xì)胞的任何容器，優(yōu)選無菌環(huán)境。本發(fā)明的一個實(shí)施方案還利用了生物反應(yīng)器。例如，目前幾個廠家制造的裝置，可用于細(xì)胞生長并可與本發(fā)明方法聯(lián)合使用。參見例如CeldyneCorp.，Houston，TX；Unisyn Technologies，Hopkinton，MA；Synthecon，Inc.Heuston，TX；Aastrom Biosciences，Inc.Ann Arbor，MI；Wave Biotech LLC，Bedminster，NJ。此外，包括這種生物反應(yīng)器的專利包括美國專利號6096,532；5,985,653；5,888,807；5,190,878，此處引入作為參考。
使用方法
除如上所述方法之外，可以在許多情況下應(yīng)用通過此處所述方法刺激和/或活化的細(xì)胞。關(guān)于T細(xì)胞的一般實(shí)施例，此處所述方法可以用于選擇性擴(kuò)增CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、或CD45RO+T細(xì)胞群體，以供治療傳染性疾病、癌癥、以及免疫治療之用。因而可以產(chǎn)生獨(dú)特表型的T細(xì)胞群體，其就抗原反應(yīng)性而言是多克隆的，但就CD4+或CD8+而言基本上是均一的。另外，本方法可用于擴(kuò)增足夠量的T細(xì)胞群體，允許重建個體的全部CD4+或CD8+T細(xì)胞群體(個體的淋巴細(xì)胞群體大約1011)。產(chǎn)生的T細(xì)胞群體還可以經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)導(dǎo)并用于免疫治療，或者可用于感染物的體外分析方法。例如，可從罹患癌癥個體獲得腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞群體，激活其T細(xì)胞，增殖到足夠數(shù)量。產(chǎn)生的T細(xì)胞群體可以經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)導(dǎo)，使之表達(dá)腫瘤壞死因子(TNF)或其它蛋白質(zhì)，并輸給該個體。
本發(fā)明CD4+T細(xì)胞群體的一項(xiàng)特定應(yīng)用是，治療個體的HIV感染。HIV長期感染最后引起CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著下降。這種下降隨后導(dǎo)致深度免疫缺陷狀態(tài)，病人表現(xiàn)出對一系列危急生命的機(jī)會感染敏感。補(bǔ)充CD4+數(shù)量到正常水平，可以期望明顯修復(fù)免疫功能。因此，此處所述方法提供了選擇性擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞到足夠數(shù)量的辦法，以便在HIV感染病人中重建該群體。長期刺激期間還必需避免T細(xì)胞感染，或者希望能使T細(xì)胞對HIV感染永葆抗性。有許多技術(shù)可以使T細(xì)胞或者對HIV感染有抗性，或在感染個體的T細(xì)胞恢復(fù)之前不能產(chǎn)生病毒。例如，CD4+T細(xì)胞在擴(kuò)增之前，與一個或多個抗逆轉(zhuǎn)錄病毒因子一起培養(yǎng)，以抑制HIV復(fù)制或病毒產(chǎn)生(例如，針對逆轉(zhuǎn)錄酶和/或病毒結(jié)構(gòu)的其它組分的藥物，參見例如Chow等人Nature 361650-653，1993)。
幾種方法可用于遺傳轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞，以產(chǎn)生抑制HIV感染或復(fù)制的分子。例如，在多個實(shí)施方案中，可以遺傳轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞，以產(chǎn)生transdominant抑制劑、″分子誘餌″、反義分子、或毒素。此方法進(jìn)一步詳述于美國專利申請?zhí)?8/253,751、08/253,964以及PCT公開號WO 95/33823，此處全文引入作為參考。
在希望給予受實(shí)驗(yàn)者以T細(xì)胞后上調(diào)免疫應(yīng)答的治療情況下(例如誘導(dǎo)應(yīng)答或增強(qiáng)現(xiàn)有應(yīng)答)，激活和擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞群體的方法非常有用。例如，本方法可用于增強(qiáng)對腫瘤相關(guān)抗原的T細(xì)胞應(yīng)答。受實(shí)驗(yàn)者的腫瘤細(xì)胞一般表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原，而可能不能刺激T細(xì)胞的共同刺激信號(例如，由于它們?nèi)鄙俟餐碳し肿拥谋磉_(dá))。因而，腫瘤細(xì)胞可以接觸體外的受實(shí)驗(yàn)者T細(xì)胞，按照本發(fā)明方法擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞，并將該T細(xì)胞回輸給受實(shí)驗(yàn)者。
因此，一個實(shí)施方案中，可以治療惡性腫瘤例如非何杰金氏淋巴瘤(NHL)和B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL)。初期研究利用擴(kuò)增T細(xì)胞在NHL中進(jìn)行過試驗(yàn)(參見Liebowitz等人Curr.Opin.Onc.10533-541，1998)，而本發(fā)明的T細(xì)胞群體提供獨(dú)特表型特征，其可通過提供增加的移入(可能通過刺激CD28信號提供)和反應(yīng)性，而顯著增強(qiáng)免疫治療的成功率。然而，B-CLL病人具有特別的困難，包括外周血中具有高白血病細(xì)胞負(fù)荷，但T細(xì)胞數(shù)量相對較低，并伴有普遍的T細(xì)胞免疫抑制。本發(fā)明的T細(xì)胞群體在治療這種疾病時(shí)能夠提供顯著改善的效能，特別是在聯(lián)合使用干細(xì)胞(CD34+)移植療法時(shí)。因此，利用抗CD3x抗CD28共固定小珠提高T細(xì)胞功能以及抗CLL T細(xì)胞活性，將是有利的。
例如，考慮到B-CLL病人T細(xì)胞上CD40配基即CD154表達(dá)缺陷已經(jīng)被認(rèn)為是該疾病主要的免疫學(xué)缺陷，本發(fā)明的T細(xì)胞群體重輸注后可以提供持續(xù)高水平的CD154表達(dá)，因而可有助于其治療。研究者報(bào)道，如同白血病B細(xì)胞表達(dá)CD80和CD86的能力一樣，CLL病人T細(xì)胞表達(dá)CD154的能力是有缺陷的。CLL中白血病B細(xì)胞無法足夠地表達(dá)CD28的配基，導(dǎo)致不能完全活化腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞，因此其可能代表了T細(xì)胞表觀耐受狀態(tài)的機(jī)理?；蛲ㄟ^可溶性抗CD40抗體或通過CD154轉(zhuǎn)導(dǎo)的白血病B細(xì)胞進(jìn)行的CLL B細(xì)胞上CD40的研究表明，似乎改正了CD80和CD86的表達(dá)缺陷，并上調(diào)了MHC在表面的表達(dá)。Kato等人，J Clin.Invest.1011133-1141，1998；Ranheim和Kipps，J.Exp.Med.177925-935，1993。用這種方法處理的細(xì)胞能刺激特異性的T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)。
隨著在本發(fā)明T細(xì)胞群體的表面上CD154表達(dá)的提高，這些T細(xì)胞可期望與自體B-CLL細(xì)胞相互作用，并將通過提高M(jìn)HC、CD80、和CD86的表達(dá)從而提高腫瘤的免疫原性。隨后這將引起強(qiáng)烈的抗腫瘤反應(yīng)。此外，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員容易理解，利用本發(fā)明離體擴(kuò)增的T細(xì)胞治療病人，可以聯(lián)合使用傳統(tǒng)的癌癥療法例如化學(xué)療法。在這方面，例如可以用藥物如氟達(dá)拉濱(fludarabine)或坎帕斯(campath)治療病人，繼之輸注本發(fā)明的T細(xì)胞群體或兩者同時(shí)。
或者，如此處所述刺激并擴(kuò)增T細(xì)胞，以誘導(dǎo)或增強(qiáng)對病原體的反應(yīng)性，例如病毒(如人類免疫缺陷性病毒)、細(xì)菌、寄生蟲和真菌。
本發(fā)明另外提供從T細(xì)胞混合群體中選擇性擴(kuò)增特定T細(xì)胞亞群的方法。特別是，本發(fā)明提供了特異性富集的T細(xì)胞群體，其具有更高比率的CD4+和CD8+雙陽性T細(xì)胞。
本發(fā)明另一個實(shí)施方案提供從CD4+T細(xì)胞群體中選擇性擴(kuò)增TH1細(xì)胞群體的方法。此方法中，利用抗CD28抗體，例如單克隆抗體9.3共同刺激CD4+T細(xì)胞，誘導(dǎo)分泌TH1特異性的細(xì)胞因子，包括IFN-γ，引起TH1細(xì)胞富集多于TH2細(xì)胞。
此處觀察到活化T細(xì)胞的表型特性在擴(kuò)增過程中隨時(shí)間變化，連同已證明T細(xì)胞可在幾小時(shí)之內(nèi)被活化的事實(shí)(Iezzi等人，Immunity889-95，1998)。相應(yīng)地，結(jié)合此處描述方法，本發(fā)明提供了短期內(nèi)擴(kuò)增T細(xì)胞群體的定制亞群的能力。一個實(shí)施方案中，此技術(shù)能夠使用于受實(shí)驗(yàn)者床邊、門診病人形式、或受實(shí)驗(yàn)者家中，與腎透析的使用類似。例如在一種方法或裝置中，通過與活化信號(例如抗CD3和抗CD28抗體，等等)接觸而溫育T細(xì)胞，并以連續(xù)流方式立刻或者在幾小時(shí)的擴(kuò)增期后返回到病人。一方面，這樣的擴(kuò)增技術(shù)能夠利用具有過濾器元件的隔離室，從而使3x28小珠或類似的包被微粒與連續(xù)流動的血液/富集的細(xì)胞混合。另一個實(shí)施方案中，裝置內(nèi)的固相表面可以包被或者直接(包括共價(jià)地)或者間接(例如鏈親和素/生物素等等)綴合抗體或者其它的組分，以刺激T細(xì)胞活化和擴(kuò)增。例如可利用一個連續(xù)的液體通路，從病人通過血液/細(xì)胞收集裝置，和/或包含兩個或更多固定抗體(例如抗CD3和抗CD28)或其它組分的一次性裝置，以在細(xì)胞返回受實(shí)驗(yàn)者之前刺激T細(xì)胞活化所需受體(固定于塑料表面或者可分離的微粒上)。這樣的系統(tǒng)可包括白細(xì)胞去除設(shè)備，其帶有一次性無菌裝置，與現(xiàn)有的廠家一次性裝置對接，或者改進(jìn)廠家一次性裝置(例如其上固定/包含抗體/活化組分的表面平臺位于在單采血液成分期間用于收集外周血單核細(xì)胞的袋子/容器內(nèi))。另外，該固相表面/表面平臺可以是可移去插件的一部分，該插件插在該裝置的一個腔內(nèi)，或者物理上存在于一個一次性元件內(nèi)。在上述關(guān)于連續(xù)流的另一個實(shí)施方案中，系統(tǒng)可以包括，利用血液收集裝置的小室或與病人流路串聯(lián)的孵化小室，在室溫或生理溫度下使細(xì)胞接觸活化組分。
另一個實(shí)施例中，血液直接從病人引入一個獨(dú)立的一次性裝置，該裝置包含兩個或更多固定的抗體(例如抗CD3和抗CD28)或其它組分，以在將細(xì)胞給予受實(shí)驗(yàn)者之前刺激T細(xì)胞活化所需受體(例如固定在塑料表面或者可分離的微粒上)。一個實(shí)施方案中，該一次性裝置可以包括經(jīng)合適管道連接的容器(例如，塑料袋或瓶子)，其適合于連接/對接注射器和無菌對接裝置。該裝置包含固定T細(xì)胞活化組分(例如抗CD3和抗CD28抗體)的固相表面；其可以是容器自身或插件的表面，一般是一個平面、蝕刻平面、不規(guī)則表面、多孔的墊片、纖維、臨床上可接受的/安全的含鐵液體、小珠、等等)。另外，使用獨(dú)立裝置時(shí)，受實(shí)驗(yàn)者可保持與該裝置連接，或者該裝置是與病人分離的。此外，該裝置可以在室溫下使用，或者利用便攜保溫箱在生理溫度下溫育。
由于采集和加工血液及其制品的裝置和方法眾所周知，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識此處提供的教導(dǎo)，可以容易地設(shè)計(jì)滿足上述需要的許多裝置，或者改造現(xiàn)有裝置。因此，這些裝置和方法并不局限于此處所述特定實(shí)施方案，而可包括能夠維持無菌和維持血液的流體形式(其中補(bǔ)體激活降低)的任何裝置或方法，并且其中可以固定或者在給予受實(shí)驗(yàn)者之前從血液或血液制品中分離T細(xì)胞活化所必需的組分(例如抗CD3和抗CD28抗體或其配基)。此外，如同本領(lǐng)域一般技術(shù)人員能夠容易理解的，許多血液制品能夠和此處所述裝置和方法一起使用。例如，該方法和裝置可用于在給予受實(shí)驗(yàn)者之前，從融化的低溫保存的全血、外周血單核細(xì)胞、其它低溫保存的血液來源細(xì)胞、或低溫保存的T細(xì)胞系中提供快速活化的T細(xì)胞。另一個實(shí)施例中，該方法和裝置可用于在給予受實(shí)驗(yàn)者之前，提高預(yù)先離體擴(kuò)增的T細(xì)胞產(chǎn)物活性，從而提供高度活化的T細(xì)胞產(chǎn)物。最后，正如容易理解的，上述方法和裝置可以用于自體或者受實(shí)驗(yàn)者和供體同時(shí)的異體細(xì)胞療法。
本發(fā)明的方法也可以同疫苗一起使用，以提高抗原的反應(yīng)性并增強(qiáng)體內(nèi)效果。此外，鑒于本發(fā)明擴(kuò)增的T細(xì)胞在體內(nèi)半衰期相對較長，通過攜帶所需的目的核酸序列，并有可能歸巢到癌癥、疾病、或感染位點(diǎn)，這些細(xì)胞能夠用作理想的基因治療載體。因此，本發(fā)明擴(kuò)增的細(xì)胞可以結(jié)合疫苗、一種或多種細(xì)胞因子、一種或多種治療用抗體、等等，投遞給病人。事實(shí)上，任何得益于更強(qiáng)T細(xì)胞群體的療法，都在此處所述使用方法的范圍之內(nèi)。
藥物組合物
靶細(xì)胞群體，例如本發(fā)明的T細(xì)胞群體，可以或單獨(dú)給藥，或結(jié)合稀釋劑和/或連同其它組分，例如IL-2或其它細(xì)胞因子或細(xì)胞群體，作為藥物組合物給藥。簡要地，本發(fā)明的藥物組合物可以包括例如此處所述的靶細(xì)胞群體，結(jié)合一種或多種藥物學(xué)或生理學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。這樣的組合物可包括緩沖液，例如中性緩沖液、磷酸鹽緩沖液等等；糖類，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質(zhì)；多肽、或氨基酸例如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑例如EDTA或谷胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；以及防腐劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物配制為靜脈內(nèi)給藥。
本發(fā)明的藥物組合物以適合于待治療(或預(yù)防)疾病的方式給藥。給藥的數(shù)量和頻率將由這樣的因素決定，如病人的狀況、以及病人疾病的類型和嚴(yán)重程度，雖然可以通過臨床試驗(yàn)確定適合的劑量。
本文引用的所有參考文獻(xiàn)，在此全文引入作為參考。此外，此處使用的全部數(shù)值范圍，明確地包括該范圍內(nèi)的全部整數(shù)值以及該范圍內(nèi)依特定的應(yīng)用選擇的特定數(shù)值。另外，提供以下實(shí)施例作為說明，而不是為了限制。
實(shí)施例I
T細(xì)胞刺激
此處所述的某些實(shí)驗(yàn)中使用稱為XCELLERATE ITM的方法。簡言之，該方法中，由外周血單核細(xì)胞(PBMC)單采血液成分產(chǎn)物制備XCELLERATED T細(xì)胞。從臨床病人收集以后，洗滌單采血液成分的的PBMC，然后與″未包被″的DYNABEADSM-450環(huán)氧樹脂T溫育。此時(shí)巨噬細(xì)胞例如單核細(xì)胞攝取小珠。溫育以后，通過MaxSep磁力分離器處理細(xì)胞和小珠，以除去小珠和附著于小珠的任何單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。在單核細(xì)胞去除步驟之后，取出包含總共5×108 CD3+T細(xì)胞的體積，產(chǎn)生1.5×109 DYNABEADSM-450 CD3/CD28 T，啟動XCELLERATETM過程(小珠與T細(xì)胞之比近似3∶1)。細(xì)胞和DYNABEADSM-450 CD3/CD28 T的混合物然后在37℃、5％CO2溫育大約8天，以產(chǎn)生XCELLERATED T細(xì)胞，用于首次輸注。低溫保存剩余的去除單核細(xì)胞的PBMC，直到第二次或另外的細(xì)胞產(chǎn)物擴(kuò)增(大約21天后)，到時(shí)融化、洗滌細(xì)胞然后取包含總共5×108 CD3+T細(xì)胞，產(chǎn)生1.5×109 DYNABEADSM-450 CD3/CD28T，啟動XCELLERATE過程，用于二次輸注。在37℃、5％CO2溫育≈8天期間，CD3+T細(xì)胞活化和擴(kuò)增。從Ortho.Biotech.(Raritan，NJ)獲得抗CD3 mAb(OKT3)，從Bristol-Myers Squibb(Stamford，Conn.)獲得抗CD28 mAb(9.3)。
利用上述稱為XCELLERATE IITM方法修改的方法，其中沒有利用單獨(dú)的單核細(xì)胞去除步驟，某些方法中，于初次接觸小珠之前冷凍細(xì)胞，并進(jìn)行進(jìn)一步富集和刺激(參見圖5A和5B)。此方法的一個版本是，通過單采成分的血液從供體或病人的循環(huán)血中獲得T細(xì)胞。單采成分的血液產(chǎn)物的組分一般包含淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、B細(xì)胞、其它有核細(xì)胞(白細(xì)胞)、紅細(xì)胞、以及血小板。一般的單采血液成分術(shù)產(chǎn)物包含1-2×1010個有核細(xì)胞。用無鈣、無鎂的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，以去除血漿蛋白質(zhì)和血小板。通過離心細(xì)胞并除去上清液，然后代之以PBS，完成洗滌步驟。利用半自動化″連續(xù)流″離心機(jī)完成該方法(COBS2991 System，Baxter)。處理期間細(xì)胞維持在封閉系統(tǒng)中。
可以通過去除未結(jié)合細(xì)胞，包括單核細(xì)胞，(富集活化細(xì)胞)，然后繼續(xù)刺激，以進(jìn)一步處理細(xì)胞。或者，洗滌的細(xì)胞可以冷凍、保存、及以后處理，于此證明了這可提高增殖強(qiáng)度以及去除粒細(xì)胞。一個實(shí)施例中，為冷凍細(xì)胞，將35ml細(xì)胞懸液置于帶有35ml冷凍液的250ml
Cryocyte冷凍袋中。35ml細(xì)胞懸液一般在PBS中包含3.5×109-5.0×109細(xì)胞。加入等量冷凍液(含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS)。細(xì)胞終濃度為50×106細(xì)胞/ml。Cryocyte袋可以包含的體積為30-70ml，細(xì)胞濃度為10-200×106細(xì)胞/ml。一旦Cryocyte袋充滿細(xì)胞和冷凍液，將袋子置于可控速率冰箱，冷凍細(xì)胞按1℃/分鐘降到-80℃。冷凍的細(xì)胞然后置于液氮貯存系統(tǒng)，直到需要。
從液氮貯存系統(tǒng)取出細(xì)胞，37℃融化。為去除DMSO，在COBE 2991System中用無鈣、無鎂的PBS洗滌融化的細(xì)胞。洗過細(xì)胞然后通過80微米濾網(wǎng)。
將融化的細(xì)胞以大約0.5×109 CD3+細(xì)胞置于包含100ml無鈣、無鎂PBS的1L Lifecell塑料袋中。PBS中包含1％-5％人血清。將1.5×109CD3xCD28小珠(Dynabeads M-450)也同細(xì)胞一起置于袋中(3∶1DYNABEADS M-450 CD3/CD28 TCD3+T細(xì)胞)。在室溫下1轉(zhuǎn)/分(顛倒轉(zhuǎn)動)以混合小珠和細(xì)胞，約30分鐘。包含小珠和細(xì)胞的袋子置于MaxSep磁力分離器(Nexell Therapeutics，Irvine，CAb)。在袋子和MaxSep之間放置塑料隔離物(厚度大約6mm)。(為提高磁場強(qiáng)度，可移去隔離物)。小珠及附著于小珠的任何細(xì)胞保留在磁鐵上，而泵走PBS和未結(jié)合細(xì)胞。
用細(xì)胞培養(yǎng)基(1升包含X-Vivo 15，BioWhittaker；以及50ml加熱滅活的混合人血清，20ml 1M Hepes，10ml 200mM L-谷氨酰胺，有或者沒有大約100,000 I.U.IL-2)，將CD3xCD28小珠和結(jié)合小珠的富集細(xì)胞沖洗到3LLifecell培養(yǎng)袋中。將CD3xCD28小珠和陽性選擇細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Lifecell袋中之后，加入培養(yǎng)基直到袋中含有1000ml。將含有細(xì)胞的袋子置于保溫箱(37℃和5％CO2)，讓細(xì)胞擴(kuò)增。
在每個第3天和第5天按1比4分開細(xì)胞。培養(yǎng)3天和8天后采集細(xì)胞，測量T細(xì)胞活化和增殖。在培養(yǎng)第3天，通過測量細(xì)胞大小、細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)水平、特別是CD25和CD154的表達(dá)，評定T細(xì)胞的活化。在第8天，讓細(xì)胞在MaxSep磁鐵上于重力作用下流動(近似150ml/分鐘)，以除去磁性顆粒，使用上述COBE裝置洗滌并富集細(xì)胞，并重懸浮于適于靜脈內(nèi)給藥的平衡電解質(zhì)溶液，例如Plasma-LyteA(Baxter-Healthcare)中。
如說明書所述，除了沒有進(jìn)行刺激和富集以及在刺激之前進(jìn)行單核細(xì)胞去除以外，XCELLERATE ITM涉及與以上所述相似的情況。
進(jìn)行XCELLERATE ITM和IITM方法兩者，并于培養(yǎng)8天后測量T細(xì)胞增殖。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)之前富集CD3+細(xì)胞時(shí)，擴(kuò)增的T細(xì)胞產(chǎn)量較高(參見表1)。另外，細(xì)胞群體具有90％以上的CD3+細(xì)胞。
表1.擴(kuò)增第8天的T細(xì)胞產(chǎn)量
在這方面進(jìn)行了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，描述了擴(kuò)增細(xì)胞的總數(shù)，以及9批無CD3+富集情況下刺激的細(xì)胞和5批有CD3+富集情況下刺激的細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。(參見圖1和2)。
通過在培養(yǎng)之前施加磁力富集細(xì)胞，有效地提高了CD3+細(xì)胞的純度以及CD154水平。(表2、圖3和4用用圖表方式描述了CD154的水平)。此外，比較T細(xì)胞群體暴露于不同強(qiáng)度磁鐵時(shí)的T細(xì)胞增殖，表明暴露于更強(qiáng)的磁鐵，導(dǎo)致CD3+細(xì)胞產(chǎn)量更大。(表2.)
表2.比較利用弱和強(qiáng)磁鐵富集后的T細(xì)胞增殖和細(xì)胞表面標(biāo)志
表2.(續(xù))
進(jìn)行了另外5次實(shí)驗(yàn)，以比較XCELLERATE ITM和XCELLERATE IITM方法。按照這兩種方法活化并培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞，其培養(yǎng)第3天和第8天的細(xì)胞活化標(biāo)志(細(xì)胞大小、CD25表達(dá)、以及CD154表達(dá))如下表3和圖6-7所示。
表3.第3天的細(xì)胞活化標(biāo)志
表3中全部培養(yǎng)開始于冷凍/融化細(xì)胞。
表3和圖6-7的數(shù)據(jù)表明，XCELLERATE IITM方法所產(chǎn)生細(xì)胞，在第3天的細(xì)胞大小和CD25表達(dá)活化標(biāo)志平均起來相似，但一般較高，并隨刺激持續(xù)較高。然而，T細(xì)胞在第3天的CD154活化標(biāo)志，在XCELLERATEIITM方法中的比XCELLERATE ITM方法中的更高許多。另外，如上證明，XCELLERATE IITM方法產(chǎn)生的CD25和CD154水平，每個供體均一致高于其它方法。
實(shí)際上，在CELLERATE IITM方法第3天的CD154表達(dá)，比XCELLERATEITM更高許多。這些觀察表明，較之XCELLERATE ITM方法，XCELLERATEIITM方法中的T細(xì)胞處于較高的活化狀態(tài)?？梢灶A(yù)計(jì)，體內(nèi)給藥時(shí)會轉(zhuǎn)變?yōu)楦行У漠a(chǎn)物。
測定了5個病人標(biāo)本在培養(yǎng)第3天的CD3+細(xì)胞純度、CD4細(xì)胞/CD8細(xì)胞比率、以及細(xì)胞存活力。利用流式細(xì)胞術(shù)或臺盼藍(lán)染色，測量經(jīng)XCELLERATE ITM方法和XCELLERATE IITM方法的細(xì)胞表型和存活力，如下表4所示。
表4
*＝XCELLERATE.I方法中單核細(xì)胞去除以后，或者XCELLERATE.II方法中磁力富集以后，第0天的CD3+T細(xì)胞純度。
ψ＝XCELLERATE.I方法中單核細(xì)胞去除以后，或者XCELLERATE.II方法中磁力富集以后，第0天的CD4+∶CD8+T細(xì)胞比率。
實(shí)施例II
CD3+T細(xì)胞富集、單核細(xì)胞去除及粒細(xì)胞去除的效率
為了本研究目的，在Xcyte治療開發(fā)實(shí)驗(yàn)室接收到時(shí)，將新來的PBMC單采血液成分術(shù)產(chǎn)物洗滌、分開以及
1.對于XCELLERATE I方法，進(jìn)行單核細(xì)胞去除步驟，并且將去除CD14+單核細(xì)胞的PBMC冷凍保存于LN2冰箱的汽相中(如實(shí)施例I所述)。如實(shí)施例I所述，開始XCELLERATE I方法的當(dāng)天，融化去除CD14+單核細(xì)胞的PBMC，用DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T啟動XCELLERATE方法。在起始步驟時(shí)N＝5供體的CD3+T細(xì)胞富集、CD14+單核細(xì)胞去除和粒細(xì)胞去除的平均細(xì)胞組成和平均效率列于表5.1，每個供體個體的數(shù)據(jù)列于表5.2。
2.對于XCELLERATE II方法，PBMC單采血液成分術(shù)產(chǎn)物低溫保存于LN2冰箱的汽相中。如實(shí)施例I所述，開始XCELLERATE II方法的當(dāng)天，融化低溫保存的PBMC單采血液成分術(shù)產(chǎn)物，磁性富集CD3+T細(xì)胞，并用DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T啟動XCELLERATE II方法。在起始步驟時(shí)，N＝5供體的CD3+T細(xì)胞富集、CD14+單核細(xì)胞去除和粒細(xì)胞去除的平均細(xì)胞組成和平均效率，列于表5.1，每個供體個體的數(shù)據(jù)列于表5.2。
如表5.1和5.2所證明，在XCELLERATE II方法設(shè)置(configuration)中，綜合PBMC單采血液成分術(shù)產(chǎn)物的冷凍/融化，繼之以直接從融化的PBMC單采血液成分術(shù)產(chǎn)物中磁性富集CD3+T細(xì)胞，可以有效去除CD14+單核細(xì)胞和粒細(xì)胞(表5.1和表5.2)。XCELLERATEII方法去除CD14+單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的效率，和XCELLERATE I方法一樣好，另外好處在于不需利用另外的″未包被″DYNABEADS M-450 T試劑單獨(dú)去除步驟，并一致地引起較高的CD4/CD8比率。
表5.1在XCELLERATE I和XCELLERATE II設(shè)置方法的起始步驟，富集CD3+T細(xì)胞、去除CD14+單核細(xì)胞和去除粒細(xì)胞的平均(N＝5)效率
按照標(biāo)準(zhǔn)方法利用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞組成表5.2.在XCELLERATE I和XCELLERATE II設(shè)置方法的起始步驟，富集
CD3+T細(xì)胞、去除CD14+單核細(xì)胞和去除粒細(xì)胞效率的比較
按照標(biāo)準(zhǔn)方法利用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞組成
通過免去CD14+單核細(xì)胞去除步驟和相關(guān)試劑使該方法簡單化并合理化之外，在T細(xì)胞活化開始時(shí)，XCELLERATE IITM方法的磁性富集步驟也提供了較高純度的CD3+T細(xì)胞以及較高比率的CD3+CD4+∶CD3+CD8+T細(xì)胞(表5.1和表5.2)。
還比較了XCELLERATE ITM方法和XCELLERATE IITM方法的活化CD3+T細(xì)胞在第8天收獲之前的產(chǎn)量、純度、存活力以及組成。
如表5.3所示，XCELLERATE IITM方法的CD3+T細(xì)胞，在第8天收獲之前的平均產(chǎn)量、純度和存活力，較之XCELLERATE ITM方法明顯地得到改善。表5.3.XCELLERATE ITM方法和CELLERATE IITM方法的活化CD3+T細(xì)胞，
在第8天收獲前的產(chǎn)量、純度、存活力以及組成。
*＝CD3+CD4+∶CD3+CD8+T細(xì)胞的比率
同樣如表5.3所示，XCELLERATE IITM方法自始至終維持較高CD3+CD4+∶CD3+CD8+比率的T細(xì)胞。這可能由于磁性富集過程中優(yōu)先富集CD3+CD4+細(xì)胞(表5.1和5.2)。
″新來的″是指新來的新鮮、經(jīng)洗滌的單采血液成分的細(xì)胞。表5.2所列XCELLERATE ITM方法的起始細(xì)胞是已經(jīng)洗滌、去除單核細(xì)胞、和/或冷凍/融化的單采血液成分的細(xì)胞。表5.2所列XCELLERATE IITM方法的起始細(xì)胞是已經(jīng)洗滌并冷凍/融化的單采血液成分的細(xì)胞。
*＝CD3+CD4+∶CD3+CD8+T細(xì)胞的比率
表5.3表明，XCELLERATE IITM方法產(chǎn)生的細(xì)胞產(chǎn)物，較之XCELLERATE ITM方法更純(就％CD3+而言)。也就是說，XCELLERATE IITM方法的細(xì)胞產(chǎn)物，其平均(±標(biāo)準(zhǔn)誤差)CD3+細(xì)胞純度為96％±1％，而XCELLERATE ITM方法的細(xì)胞，其平均純度為93％±2％。
另如表5.3所示，XCELLERATE IITM方法維持較高比率的CD4/CD8細(xì)胞。新來的細(xì)胞其平均CD4/CD8細(xì)胞比率為2.2，XCELLERATE IITM方法的細(xì)胞產(chǎn)物，其CD4/CD8比率為1.8，而XCELLERATE ITM方法的細(xì)胞產(chǎn)物，其CD4/CD8比率為1.2。
表5.3數(shù)據(jù)還表明，XCELLERATE IITM方法產(chǎn)生的細(xì)胞產(chǎn)物，其平均存活力為98％，而XCELLERATE ITM方法產(chǎn)生的細(xì)胞產(chǎn)物，其平均存活力為97％。
實(shí)施例III
單核細(xì)胞去除
利用多種″無關(guān)的″(即，非抗體包被或非靶抗體包被)Dynal小珠，通過磁性去除，從T細(xì)胞制品中除去單核細(xì)胞(CD14+巨噬細(xì)胞)。將或經(jīng)ficol分離的全血，或單采血液成分的外周血，按小珠與細(xì)胞比率大致2∶1，與Dynal綿羊抗小鼠M-450小珠、或Dynal人血清白蛋白包被的小珠(M-450)、或者用Dynal環(huán)氧樹脂(M-450)小珠預(yù)先溫育，進(jìn)行去除。細(xì)胞和小珠于22-37℃溫育1-2小時(shí)，繼之以磁性去除那些附著于小珠或吞噬小珠的細(xì)胞。把剩余細(xì)胞與未處理細(xì)胞中一起置于培養(yǎng)基中。用流式細(xì)胞術(shù)鑒定去除前后細(xì)胞的表型特征。
實(shí)施例IV
流式細(xì)胞術(shù)設(shè)置
將Becton Dickinson FACSCALIBUR血細(xì)胞計(jì)數(shù)器用于收集和提交的全部數(shù)據(jù)。有經(jīng)驗(yàn)的操作者可以使用任何能夠進(jìn)行3色分析的流式細(xì)胞光度計(jì)，獲得相同的數(shù)據(jù)。例如，F(xiàn)ACSCAN、Vantage細(xì)胞分選儀、或其它BD產(chǎn)品能夠用于收集類似的數(shù)據(jù)。還有Coulter產(chǎn)品，例如Coulter Epic分選儀也行。
如下儀器設(shè)置可以用作儀器構(gòu)造一般指南，以收集數(shù)據(jù)，如本研究中所示。這些設(shè)置用于此處提供的實(shí)施例；然而，有經(jīng)驗(yàn)的儀器操作者可以并應(yīng)該修改這些設(shè)置，以適當(dāng)?shù)卣{(diào)整補(bǔ)償及探測器電壓。此外，使用帶有不同熒光標(biāo)記的不同檢測抗體，要求對特定儀器進(jìn)行個別調(diào)整，以給出最佳信號分離(電壓)及其它信道″流過″最小(例如，補(bǔ)償)。能熟練應(yīng)用補(bǔ)償對照、同型對照，并且對T細(xì)胞生物學(xué)具有一般了解的熟練流式操作者，將能重復(fù)以下提交的任何數(shù)據(jù)。
另外應(yīng)當(dāng)注意，許多的設(shè)置，特別是電壓設(shè)置，可能依該儀器激光效率而不同。例如，與新激光器相比，舊的激光器產(chǎn)生信號需要更多電壓。然而，無論用或多或少電壓獲得的數(shù)據(jù)，將反映相似的生物學(xué)形式。
用于FACSCALIBURTM(Becton Dickinson)的設(shè)置
檢波器/Amps
參數(shù) 探測器電壓Amp/Gain 方式
P1 FSC E00 1.30 Lin
P2 SSC 370 1.00 Lin
P3 FL1 610 1.00 Log
P4 FL2 550 1.00 Log
P5 FL3 520 1.00 Log
盡管電壓參數(shù)通常是常數(shù)，但為了獲得最大的信號分離，可以稍向上或向下調(diào)整P3、P4、和P5，并在對數(shù)形式信號強(qiáng)度的第一十位內(nèi)(0-10)或其附近維持一個陰性對照信號值。
閾值
一級參數(shù)FSC(前向散射)
數(shù)值52
二級參數(shù)沒有
補(bǔ)償
FL1-4.0％FL2
FL2-21.4％FL1
FL2-2.6％FL3
FL3-15.2％FL2
提供的設(shè)置接近于收集以下遞交的大部分?jǐn)?shù)據(jù)所用設(shè)置，可以改變該設(shè)置，所形成的關(guān)于刺激T細(xì)胞的數(shù)據(jù)應(yīng)該大致相等。在以上所列電壓下，一般可接受的補(bǔ)償范圍如下所示
FL1-FL2 0.4-4％
FL2-FL1 18-27％
FL2-FL3 2-8％
FL3-FL2 10-16％
必須由有經(jīng)驗(yàn)的流式細(xì)胞儀操作者確定具體的補(bǔ)償或電壓數(shù)值，以達(dá)到以下目標(biāo)
1)電壓介于陽性和陰性信號之間的信號分離最大化(例如，無表面抗原標(biāo)志對比低水平表面抗原對比高水平表面抗原)。
2)補(bǔ)償利用補(bǔ)償對照使信道間干擾(流過)最小。
電壓設(shè)置改變時(shí)，也改變補(bǔ)償設(shè)置。
實(shí)施例V
細(xì)胞增殖和存活力分析
利用標(biāo)準(zhǔn)的臺盼藍(lán)染色并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，測量細(xì)胞增殖和存活力。參見圖5A-5B。
實(shí)施例VI
活化標(biāo)志分析
在活化的T細(xì)胞上以瞬時(shí)方式表達(dá)CD154，已經(jīng)證明是T細(xì)胞通過APCs上CD40相互作用的要素。阻斷這兩個受體的相互作用，可以有效地改變并甚至關(guān)閉免疫應(yīng)答。在第3、5、和8天從細(xì)胞培養(yǎng)物中取部分通過CD3xCD28順磁小珠富集而刺激的T細(xì)胞，分析CD154的表達(dá)水平。與去除單核細(xì)胞但未同CD3xCD28順磁小珠溫育的T細(xì)胞(即在培養(yǎng)開始時(shí)未磁性富集該T細(xì)胞)，比較CD154的表達(dá)水平。利用抗CD3和抗CD28小珠通過磁性富集刺激的T細(xì)胞，在培養(yǎng)第三天的CD154表達(dá)水平，與培養(yǎng)開始時(shí)未受類似刺激的細(xì)胞相比，增加三倍，表明活化顯著。(參見圖4和7)。類似方法測量CD25水平，顯示較高的活化傾向(圖6)。
通常多次監(jiān)測標(biāo)志的表達(dá)。在這方面，使用抗人CD4(Immunotech，F(xiàn)ullerton，CA)、FITC偶聯(lián)的抗人CD11a(Pharmingen)、FITC偶聯(lián)的抗人CD26(Pharmingen)、FITC偶聯(lián)的抗人CD49d(Coulter)、FITC偶聯(lián)的抗人CD54(Pharnaingen和Becton Dickinson)、FITC偶聯(lián)的抗人CD95(Pharmingen)、FITC偶聯(lián)的抗人CD134(Pharmingen)、FITC偶聯(lián)的抗人CD25 Ab(Becton Dickinson，F(xiàn)ullerton，CA)、FITC偶聯(lián)的抗人CD69 Ab(Becton Dickinson)、FITC或PE偶聯(lián)的抗人CD154Ab(Becton Dickinson)、或者FITC或PE偶聯(lián)的IgG1同型對照Ab標(biāo)記細(xì)胞。用每種抗體2μl，在終體積30μl中，4℃標(biāo)記2×105細(xì)胞20分鐘，洗滌細(xì)胞并重懸于1％低聚甲醛(Sigma，St.Louis，MO)中。
可以通過多種方法比較細(xì)胞表面標(biāo)記分子的表達(dá)水平，因而其絕對值可能不同。但是，比較兩個數(shù)值時(shí)，則很容易計(jì)算出相對倍數(shù)數(shù)值。例如，由不同″活化″方法產(chǎn)生的T細(xì)胞上的CD154表達(dá)水平，能夠通過流式細(xì)胞術(shù)方法以相對準(zhǔn)確度測量。利用試劑，例如BectonDickinson的抗CD154-PE偶聯(lián)物(目錄#340477)，可以使處于靜止的或者活化狀態(tài)的T細(xì)胞染色，并利用為有經(jīng)驗(yàn)的流式細(xì)胞儀操作者所熟知的方法，計(jì)量這個(或其它)標(biāo)志的表達(dá)水平。此處所述為提高CD4+和CD8+T細(xì)胞上CD154表達(dá)的方法。如此處所述，通過在開始培養(yǎng)時(shí)同步刺激并富集T細(xì)胞，能夠使表達(dá)水平提高到超過利用標(biāo)準(zhǔn)3x28活化獲得的數(shù)值，水平增加大概20％到超過100％，這是利用流式細(xì)胞術(shù)(BDFACSCalibur以及如上所述抗體)測量平均熒光強(qiáng)度(MFI)得到的。例如，未刺激的CD4+T細(xì)胞可能是CD154陰性，并因而產(chǎn)生MFI數(shù)值為1-10。利用XCELLERATE ITM活化的情況下，在活化后第3天，CD4+T細(xì)胞上CD154的MFI值可能為20-40之間，而XCELLERATE IITM方法產(chǎn)生MFI值為60-200的CD154。就T細(xì)胞上表達(dá)的CD154分子的數(shù)量而言，這些不是絕對值，但足以確定表達(dá)提高的相對水平。因此，可以證實(shí)活化后1-4天內(nèi)，XCELLERATE IITM方法與XCELLERATE ITM方法相比，CD154水平提高大約1.1-20倍。
實(shí)施例VII
細(xì)胞因子分析
如上所述制備細(xì)胞。按照廠家說明書(Biosource International，Sunnyvale，CA)，ELISA測定多次刺激的細(xì)胞上清液中IL-2、IL-4、INF-γ或者TNF-a。
另一分析中，利用流式細(xì)胞術(shù)通過CD4 T細(xì)胞的胞內(nèi)染色測量IL-2。對于胞內(nèi)標(biāo)記IL-2或者IFN-γ，分析前首先與1ug/ml莫能星(Monensin)(Calbiochem)溫育4小時(shí)。隨后如上所述染色細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，利用Becton Dickinson胞內(nèi)染色試劑盒固定并透化，用PE偶聯(lián)的抗人IL-2Ab和FITC偶聯(lián)的抗人IFN-γ或者相應(yīng)的對照Abs，如廠家描述方法標(biāo)記細(xì)胞。在Becton Dickinson FACSCalibur流式細(xì)胞儀上，利用Cellquest軟件按照廠家規(guī)程(Becton Dickinson)完成數(shù)據(jù)獲取和流式細(xì)胞術(shù)分析。
與XCELLERATE ITM相反，利用XCELLERATE IITM方法時(shí)，第3天的IFN-γ濃度高約2、3、4、有時(shí)5倍(數(shù)據(jù)略)。另外，與XCELLERATE ITM相比，直到刺激后第5天，TNF-α的水平仍明顯較高(高出1.5-3倍)(數(shù)據(jù)略)。
實(shí)施例VIII
再刺激后的細(xì)胞表型分析
為分析再刺激，終止日從培養(yǎng)物中取約5×106細(xì)胞。在幾個實(shí)施例中，培養(yǎng)第8天是終止日。把細(xì)胞放入5mL含血清以及含或不含IL-2的上述X-vivo 15培養(yǎng)基中，置于六孔板的一個孔。向含細(xì)胞孔中加入約5×106 Dynabeads M-450 CD3/CD28 T小珠，將細(xì)胞和小珠置于37℃、5％CO2保溫箱。兩天后取樣品，測試存活力，F(xiàn)ACS分析測定細(xì)胞大小和細(xì)胞標(biāo)志和/或細(xì)胞因子表達(dá)水平，例如CD25表達(dá)水平、CD154表達(dá)水平。下表6顯示了使用XCELLERATE ITM和XCELLERATE IITM方法的五個病人標(biāo)本的結(jié)果。表6利用XCELLERATE ITM和XCELLERATE IITM方法產(chǎn)生的XCELLERATED T
細(xì)胞的再刺激分析結(jié)果
實(shí)施例IX
另外的細(xì)胞收集和培養(yǎng)規(guī)程
XCELLERATETM
將從人血液分離的細(xì)胞在X-vivo培養(yǎng)基(Biowhittaker Inc.，Walkersville，MD)中生長，根據(jù)用途補(bǔ)加或不補(bǔ)加20U/mlIL-2(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，并補(bǔ)加5％人血清(Biowhittaker)、2mM谷氨酰胺(Life Technologies，Rockville，MD)和20mM HEPES(Life Technology)。Jurkat E6-1細(xì)胞(ATCC，Manassas，VA)生長在RPMI 1640(Life Technologies)中，其中補(bǔ)加10％FBS(Biowhittaker)、2mM谷氨酰胺(Life Technologies)、2mM青霉素(Life Technologies)和2mM鏈霉素(Life Technologies)。
從健康志愿者供體獲得暗黃色層(美國紅十字會，Portland，OR)。按照廠家說明書，利用淋巴細(xì)胞分離液(ICN Pharmaceuticals，CostaMesa，CA)獲得外周血單核細(xì)胞(PBMC)。
通過在培養(yǎng)瓶中(Costar，Pittsburgh，PA)與未包被的Dynabeads(Dynal，Oslo，Norway)，108細(xì)胞/ml，2小珠/細(xì)胞，37℃溫育2小時(shí)，從PBMC成分獲得外周血淋巴細(xì)胞(PBL)。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞因附著到培養(yǎng)瓶上而去除。或者，按照廠家說明書(Dynal)，使細(xì)胞吞噬順磁小珠，然后利用磁細(xì)胞分離法而除去這些細(xì)胞。通過與10μg/ml的抗CD8(克隆G10-1)、CD20(克隆IF5)、CD14(克隆F13)和CD16(Coulter)單克隆抗體，108細(xì)胞/ml，4℃溫育20分鐘，從PBL成分純化CD4+細(xì)胞。細(xì)胞洗滌后，利用綿羊抗小鼠Ig偶聯(lián)的Dynabeads(106細(xì)胞/ml，6小珠/細(xì)胞，4℃20分鐘)處理細(xì)胞，然后經(jīng)由磁細(xì)胞分離法兩次而去除。流式細(xì)胞術(shù)測量的CD4+細(xì)胞純度通常為91-95％。
通過108細(xì)胞/毫升，37℃2小時(shí)(無Dynabeads)，首先將PBMC粘附到培養(yǎng)瓶(Costar)上而產(chǎn)生樹突狀細(xì)胞。徹底洗滌后，在包含500U/mlGM-CSF(Boehringer Mannheim)和12.5U/ml IL-4(BoehringerMannheim)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)貼壁細(xì)胞7天。產(chǎn)生的細(xì)胞群體貼壁較弱，表達(dá)樹突狀細(xì)胞特征性的表面標(biāo)志(例如表達(dá)HLA-DR、CD86、CD83、CD11c并缺少CD4的表達(dá))。(全部抗體來自Becton Dickinson，SanJose，CA)。
在組織培養(yǎng)皿和/或組織培養(yǎng)瓶(Baxter袋)、或者其它常見的培養(yǎng)容器的培養(yǎng)基中(含有RPMI、X-Vivo 15、或者其它的一些T細(xì)胞培養(yǎng)基)中培養(yǎng)的包含T細(xì)胞的人外周血淋巴細(xì)胞，能夠?yàn)槠渌夹g(shù)所利用。盡管在T細(xì)胞的活化和生長中不需要谷氨酰胺和HEPES，但仍在培養(yǎng)基中加入。培養(yǎng)基中加入胎牛血清(10％終濃度)、人A/B血清(5％)、或者自體人血清(5％)。血清的百分比可以改變，而對T細(xì)胞生物學(xué)或者培養(yǎng)結(jié)果沒有太大影響。在有些情況下，培養(yǎng)物中加入重組人IL-2。某些情況下，利用下文所述磁性去除方法，去除CD14+吞噬細(xì)胞及其他吞噬細(xì)胞。以3∶1的小珠/細(xì)胞比率，加入表面上共固定抗CD3和抗CD28的小珠(3x28小珠)。在37℃、5-7％CO2條件下維持培養(yǎng)物。14天期間，在幾個時(shí)間點(diǎn)上取出細(xì)胞，以測定細(xì)胞密度(細(xì)胞數(shù)量)、細(xì)胞大小，并利用流式細(xì)胞術(shù)分析多種表面抗原，以測定細(xì)胞表面表型。從培養(yǎng)物中收集上清液，測定分泌細(xì)胞因子的概況，包括但不限于IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α。隨著活化細(xì)胞的生長和分裂，培養(yǎng)物維持在0.2-2×106CD3+T細(xì)胞/ml。T細(xì)胞密度大致超過1.5×106/毫升時(shí)，分開培養(yǎng)物，供給新鮮培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度在0.2-1.4×106/ml范圍內(nèi)。開始刺激后大約2小時(shí)-14天，當(dāng)活化T細(xì)胞顯示進(jìn)入更靜止的時(shí)期(例如CD25水平降低、前向散射測定的細(xì)胞大小變小、細(xì)胞分裂速率降低)時(shí)，可將細(xì)胞或者輸入給受實(shí)驗(yàn)者，或者用下列刺激物之一進(jìn)行再刺激
1)無刺激物
2)植物凝集素(PHA)2μg/ml
3)(3x28小珠)小珠/細(xì)胞比率為1∶1
重新隨時(shí)間分析細(xì)胞表型以及活化/功能狀態(tài)。重新收集上清液，分析所分泌的細(xì)胞因子。
用三種不同方法刺激細(xì)胞1)共價(jià)偶聯(lián)抗CD3(OKT-3)和抗CD28(9.3)抗體的Dynabeads(M-450)(3x28小珠)，按照廠家說明書(Dynal)，為3個小珠/細(xì)胞，2)離子霉素(Calbiochem，La Jolla，CA)(100ng/ml)和12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(PMA)(Calbiochem)(10ng/ml)，3)同種異體樹突狀細(xì)胞(25,000樹突狀細(xì)胞/200,000 CD4細(xì)胞)。在106細(xì)胞/ml的濃度下刺激所有細(xì)胞。在96孔平底培養(yǎng)板，進(jìn)行一式四份增殖分析。在106細(xì)胞/ml、200μl終體積條件下刺激細(xì)胞。在第3天(刺激方法1和2)或者第6天(刺激方法3)，用MTT分析法測量增殖(MTT分析試劑盒，Chemicon International Inc.，Temecula，CA)，結(jié)果以四次重復(fù)的平均值表示。利用3x28小珠、離子霉素/PMA、或者同種異體的樹突狀細(xì)胞，刺激PBL培養(yǎng)物或者純化的CD4+細(xì)胞培養(yǎng)物。
如圖8A-8B所證明，利用PHA、附著綿羊抗小鼠(SAM)的3x28小珠(小珠上共固定抗CD3和抗CD28)、抗體共價(jià)附著其上的3x28小珠、或者單個或者雙重固定在平板上的抗體刺激以后，細(xì)胞數(shù)量(Coulter計(jì)數(shù)器)顯著增加。圖9還表明，利用共價(jià)固定抗CD3和抗CD28的小珠+/-去除單核細(xì)胞以及+/-20U IL-2刺激以后，細(xì)胞數(shù)量增加。
實(shí)施例X
利用磁性去除方法去除單核細(xì)胞
利用多種″無關(guān)的″(即，無抗體包被或無靶抗體包被)Dynal小珠，通過磁性去除，從T細(xì)胞制劑中除去單核細(xì)胞(CD14+吞噬細(xì)胞)。將ficoll分離的全血、或者單采血液成分的外周血，與Dynal綿羊抗小鼠M-450小珠、或Dynal人血清白蛋白包被的小珠(M-450)、或者用Dynal環(huán)氧樹脂(M-450)小珠，按小珠細(xì)胞比率大致2∶1，預(yù)先22-37℃溫育1-2小時(shí)，隨后磁性去除附著于小珠或吞噬小珠的細(xì)胞，進(jìn)行了去除。把剩余細(xì)胞與未處理細(xì)胞一起培養(yǎng)。利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定去除前后的細(xì)胞表型。圖9證明無單核細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞增殖增強(qiáng)。
實(shí)施例XI
活化前后時(shí)程動力學(xué)研究
在多種條件下培養(yǎng)分離自全血或者單采血液成分的外周血的人T細(xì)胞，進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)。這些培養(yǎng)條件包括
1)無刺激
2)用2μg/ml植物凝集素(PHA)刺激。
3)用3x28 Dynabeads(其上偶聯(lián)有抗CD3和抗C28的小珠)刺激，小珠與T細(xì)胞比率為3∶1或1∶1。
4)在有或沒有外加10U/ml(5ng/ml)重組人IL-2情況下，刺激或培養(yǎng)。
5)存在單核細(xì)胞(CD14+吞噬細(xì)胞)情況下培養(yǎng)，或者利用多種″無關(guān)的″Dynabeads通過磁性去除除去前述細(xì)胞后培養(yǎng)。如實(shí)施例2所示進(jìn)行去除。
用流式細(xì)胞術(shù)分析下列細(xì)胞表面標(biāo)志，測定細(xì)胞表型和活化狀態(tài)CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD20、CD25、CD45RA、CD45RO、CD54、CD62L、CDw137(41BB)、CD154。也利用流式細(xì)胞術(shù)經(jīng)前向散射分布圖測定細(xì)胞大小。
標(biāo)志，例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD20、CD45RA、和CD45RO用于測定T、B、和單核細(xì)胞譜系以及亞群，而前向散射CD25、CD62L、CD54、CD137、CD154用于測定細(xì)胞的激活狀態(tài)和功能特性。
如實(shí)施例IX所述制備包含T細(xì)胞的人外周血淋巴細(xì)胞。隨時(shí)間分析細(xì)胞表型以及活化/功能狀態(tài)。收集上清液，分析分泌的細(xì)胞因子。圖8和9表明了利用3x28小珠+/-10u/ml重組人IL-2以及+/-單核細(xì)胞去除活化以后的人T細(xì)胞的一般生長特征。在Baxter Lifecell瓶(300ml)中培養(yǎng)全部細(xì)胞。圖上標(biāo)的″按比例放大″，是指300ml玻瓶培養(yǎng)(無IL-2/去除單核細(xì)胞)擴(kuò)增到Baxter Lifecell 3L培養(yǎng)瓶中。該圖表明在各種條件下，人T細(xì)胞擴(kuò)增約2-4對數(shù)倍。
圖10表示利用前向散射流式細(xì)胞術(shù)-時(shí)間曲線測定細(xì)胞大小進(jìn)行的動力學(xué)分析?？梢园l(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞的大小在活化之后不久增大，隨后減小，在第14天顯示的前向散射分布更小，表明處于更靜止的狀態(tài)。
圖11表示在3x28小珠刺激以后，IL-2受體(CD25)隨時(shí)間的表達(dá)情況。CD4+和CD8+T細(xì)胞都顯示出受體水平早期增加。到第14天，大多數(shù)T細(xì)胞的CD25表達(dá)水平大大降低，表明處于更靜止的狀態(tài)。
當(dāng)3x28刺激的T細(xì)胞變得更靜止時(shí)(CD25低，前向散射低)，如下所示再刺激
1)無刺激
2)2ug/mlPHA
3)3x28(Xcellerate)小珠，按1小珠/CD3+T細(xì)胞刺激
然后進(jìn)行細(xì)胞大小(前向散射)、表面表型、活化標(biāo)志表達(dá)、和細(xì)胞因子分泌的動力學(xué)分析。圖12顯示初級和次級刺激以后前向散射(細(xì)胞大小)的動力學(xué)。圖13表示初級和次級刺激以后CD25(IL-2受體)的表達(dá)動力學(xué)。圖16顯示次級刺激以后，CD4+T細(xì)胞(A)和CD8+T細(xì)胞(B)上CD54(I-CAM)的表達(dá)情況，其中初級刺激是PHA或CD3xCD28小珠，再刺激是無刺激、PHA、或3x28小珠。CD4和CD8陽性細(xì)胞的標(biāo)志也用于測定3x28抗體小珠活化期間兩者的相對比例(圖19和22)。
實(shí)施例XII
共刺激T細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)模式的分析
已經(jīng)廣泛地研究了多種細(xì)胞因子有關(guān)T細(xì)胞維持、擴(kuò)增和分化的作用，其中包括IL-2、IFN-γ、TNF-、和IL-4。值得注意的是，已經(jīng)表明IL-2支持T細(xì)胞的維持和擴(kuò)增。已經(jīng)應(yīng)用IFN-γ促使T細(xì)胞分化為TH1型免疫效應(yīng)器，應(yīng)用IL-4促使T細(xì)胞發(fā)生TH2型反應(yīng)。通過按實(shí)施例IX方法刺激T細(xì)胞，分析用PHA或者CD3xCD28小珠活化的取代T細(xì)胞細(xì)胞因子釋放水平，包括初級刺激反應(yīng)和再刺激反應(yīng)的動力學(xué)研究。圖18A-C和圖23-24所示數(shù)據(jù)表明CD3xCD28小珠刺激的獨(dú)特特點(diǎn)。開始刺激后的第2天和第4天之間(第1天沒有測定)，觀察到IL-2和IFN-γ的水平都非常高。觀察到與PHA刺激的細(xì)胞相比，3x28小珠刺激的T細(xì)胞，其分泌IL-2的絕對水平提高了幾乎5倍。還觀察到3x28刺激的T細(xì)胞，比較相應(yīng)PHA，其IFN-γ水平增加約7倍。至于IL-4，初級刺激后提高不顯著。令人感興趣并可能意義重大的是，細(xì)胞經(jīng)初級刺激變靜止(不再分裂或分泌上述3種細(xì)胞因子)以后，用CD3xCD28小珠、PHA再刺激，或者不刺激。通過CD3xCD28小珠接受初始活化/擴(kuò)增信號的T細(xì)胞，分泌的IFN-γ水平甚至比初級刺激后觀察到的更高。相反，經(jīng)PHA起始刺激的細(xì)胞，分泌的IFN-γ水平比相應(yīng)3x28觀察到的更低許多。也注意到IL-4水平有類似差異。
這些數(shù)據(jù)提示，經(jīng)過CD3xCD28小珠介導(dǎo)的活化/擴(kuò)增所獲得的細(xì)胞，功能上不同于其它擴(kuò)增方法獲得的細(xì)胞，例如PHA方法。獲得的細(xì)胞似乎具有改變了的細(xì)胞因子分泌反應(yīng)，即使TH1和TH2細(xì)胞因子水平大大提高，并可能傾向于TH1型模式(IFN-γ)。細(xì)胞培養(yǎng)物中分泌如此高水平的細(xì)胞因子具有許多效果，包括促使T細(xì)胞進(jìn)入TH1分化途徑，這有利于抗腫瘤和抗病毒反應(yīng)；以及改變所得T細(xì)胞的基本功能(例如降低活化和抑制細(xì)胞程序性死亡途徑的閾值)。
實(shí)施例XIII
共刺激T細(xì)胞的CD54表達(dá)的分析
圖16顯示次級刺激以后，CD4+T細(xì)胞(A)和CD8+T細(xì)胞(B)上CD54(I-CAM)的表達(dá)情況，其中初級刺激是PHA或CD3xCD28小珠，再刺激是無、PHA、或3x28小珠。
實(shí)施例XIV
短期活化標(biāo)志分析
如實(shí)施例IX所述，通過多個時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測標(biāo)志的表達(dá)情況。在這方面，使用抗人CD4(Immunotech，F(xiàn)ullerton，CA)、FITC偶聯(lián)的抗人CD11a(Pharmingen)、FITC偶聯(lián)的抗人CD26(Pharmingen)、FITC偶聯(lián)的抗人CD49d(Coulter)、FITC偶聯(lián)的抗人CD54(Pharmingen和BectonDickinson)、FITC偶聯(lián)的抗人CD95(Pharmingen)、FITC偶聯(lián)的抗人CD134(Pharmingen)、FITC偶聯(lián)的抗人CD25抗體(Becton Dickinson，F(xiàn)ullerton，CA)、FITC偶聯(lián)的抗人CD69抗體(Becton Dickinson)、FITC或PE偶聯(lián)的抗人CD154抗體(Becton Dickinson)、或者FITC或PE偶聯(lián)的IgG1同型對照抗體標(biāo)記細(xì)胞。每種抗體2μl，在終體積30μl中，將2×105細(xì)胞于4℃標(biāo)記20分鐘，細(xì)胞洗滌并重懸于1％低聚甲醛(Sigma，St.Louis，MO)。參見圖21-22和26A-26L，這些圖形表明隨活化時(shí)間以及在CD4+和CD8+細(xì)胞之間呈現(xiàn)顯著差別。
從上文所述可以理解，盡管為說明起見，此處描述了本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下，可以對其做各種修改。
因此，除所附權(quán)利要求之外，本發(fā)明不受限制。以上引用的所有參考文獻(xiàn)、專利、專利申請、等等，此處全文引入。此外，此處所述所有數(shù)值范圍明確地包括該范圍內(nèi)的全部整數(shù)值。
權(quán)利要求
1.利用同步T細(xì)胞富集和細(xì)胞表面成分連接刺激T細(xì)胞群體的一種方法，包括
(a)提供細(xì)胞群體，其中至少其一部分包含T細(xì)胞；
(b)將所述細(xì)胞群體與表面接觸，其中所述表面上附著一種或多種因子，所述因子可連接至少一部分所述T細(xì)胞的細(xì)胞表面成分，并刺激至少所述部分的T細(xì)胞；
(c)施加主要驅(qū)使T細(xì)胞富集以及T細(xì)胞表面成分連接的作用力，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞刺激。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述表面上附著第一因子，其可連接T細(xì)胞的第一細(xì)胞表面成分；并且同一或第二表面上附著第二因子，其可連接所述T細(xì)胞的第二成分，其中所述通過第一和第二因子的連接可誘導(dǎo)所述T細(xì)胞增殖。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述表面是生物相容性的。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述表面是天然的或者合成的。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述表面包含聚合物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述表面選自膠原、純化的蛋白質(zhì)、純化的肽、多糖、糖胺聚糖、以及細(xì)胞外基質(zhì)成分。
7.權(quán)利要求6的方法，其中該多糖選自脫乙酰殼多糖、藻酸鹽、葡聚糖、透明質(zhì)酸、以及纖維素。
8.權(quán)利要求5的方法，其中聚合物選自聚苯乙烯、聚酯、聚醚、聚酐、聚烷基腈基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、聚乙酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、以及聚氨基甲酸乙酯。
9.權(quán)利要求8的方法，其中聚合物包括乳酸。
10.權(quán)利要求5的方法，其中聚合物是共聚物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中共聚物包括乳酸和羥基乙酸(PLGA)。
12.權(quán)利要求3的方法，其中生物相容性表面是可生物降解的。
13.權(quán)利要求3的方法，其中生物相容性表面是不可生物降解的。
14.權(quán)利要求13的方法，其中不可生物降解的物質(zhì)包含選自聚(二甲基硅氧烷)和聚(乙烯-乙酸乙烯酯)的聚合物。
15.權(quán)利要求3的方法，其中生物相容性表面選自膠原、金屬、羥基磷灰石、玻璃、鋁酸鹽、生物陶瓷材料、透明質(zhì)酸聚合物、藻酸鹽、丙烯酸酯聚合物、乳酸聚合物、羥基乙酸聚合物、乳酸/羥基乙酸聚合物、純化的蛋白質(zhì)、純化的肽、和/或細(xì)胞外基質(zhì)成分。
16.權(quán)利要求3的方法，其中生物相容性表面與一種可植入裝置有關(guān)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中裝置選自支架、導(dǎo)管、纖維、中空纖維、小片、和縫線。
18.權(quán)利要求4的方法，其中所述表面選自玻璃、二氧化硅、硅、膠原、羥基磷灰石、水凝膠、PTFE、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍和聚丙烯酰胺。
19.權(quán)利要求4的方法，其中所述表面選自脂類、平板、碟、袋、桿、丸、纖維和網(wǎng)。
20.權(quán)利要求4的方法，其中所述表面是顆粒。
21.權(quán)利要求20的方法，其中顆粒選自小珠、微球、納米微粒、和膠體粒子。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述小珠直徑約為5納米-約500微米。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述因子獨(dú)立地選自蛋白質(zhì)配基、天然的配基和合成配基。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述因子獨(dú)立地選自抗體、抗體片段、肽、多肽、糖肽、受體、類固醇、激素、有絲分裂原、抗原、超抗原、生長因子、細(xì)胞因子、凝集素、病毒蛋白質(zhì)、粘附分子和趨化因子。
25.權(quán)利要求24的方法，其中至少一個因子是抗體或抗體片段。
26.權(quán)利要求24的方法，其中第一因子是抗體及其片段，并且第二因子是抗體或者其片段。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述第一和所述第二因子是不同的抗體。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述第一因子是抗-CD3抗體、抗-CD2抗體、或者抗CD3抗體或抗CD2抗體的抗體片段。
29.權(quán)利要求24或者27的方法，其中所述第二因子是抗CD28抗體或其抗體片段。
30.權(quán)利要求24或者27的方法，其中所述第二因子是CD28的天然配基。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述天然配基包括B7-1或B7-2。
32.權(quán)利要求1的方法，其中所述作用力選自大于重力的一種作用力、液壓力、跨膜壓產(chǎn)生的滲透力、離心力以及磁力。
33.權(quán)利要求32的方法，其中磁力是利用磁鐵產(chǎn)生的，在磁鐵表面的磁場強(qiáng)度介于大約200-約12,000高斯。
34.權(quán)利要求1的方法，其中所述表面是順磁顆粒的表面。
35.權(quán)利要求1的方法，其中所述因子對表面的附著是共價(jià)的、非共價(jià)的、靜電的、或疏水性的。
36.權(quán)利要求1的方法，其中連接的T細(xì)胞與未連接的T細(xì)胞分開。
37.權(quán)利要求1的方法，其中所述T細(xì)胞改善免疫應(yīng)答功能障礙。
38.一種利用同步細(xì)胞表面成分連接和T細(xì)胞聚集而刺激T細(xì)胞的方法，包括
(a)提供包括T細(xì)胞的細(xì)胞群體；
(b)使所述細(xì)胞群體與表面接觸，其中所述表面上附著一種或多種特異性針對細(xì)胞表面成分的配基；
(c)施加驅(qū)動T細(xì)胞和表面富集的作用力；以及
(d)溫育所述細(xì)胞一段時(shí)間，使足以獲得所要求的刺激。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述足以獲得所要求刺激的時(shí)間為從1分鐘到8天。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述足以獲得所要求刺激的時(shí)間為從1天到5天。
41.權(quán)利要求38的方法，其中所述表面是生物相容性的。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述表面是天然的或者合成的。
43.權(quán)利要求42的方法，其中表面選自玻璃、二氧化硅、硅、膠原、羥基磷灰石、水凝膠、PTFE、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍、葡聚糖和聚丙烯酰胺。
44.權(quán)利要求38的方法，其中所述表面選自平板、碟、袋、桿、丸、纖維和網(wǎng)。
45.權(quán)利要求38的方法，其中所述表面是顆粒。
46.權(quán)利要求45的方法，其中顆粒選自小珠、微球、納米微粒、和膠體粒子。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述小珠直徑約為5納米-約500微米。
48.權(quán)利要求38的方法，其中所述因子選自蛋白質(zhì)、天然配基和合成配基。
49.權(quán)利要求38的方法，其中所述配基選自抗體、抗體片段、肽、多肽、糖肽、可溶性受體、類固醇、激素、有絲分裂原、抗原、配基、超抗原、生長因子、細(xì)胞因子、凝集素和趨化因子。
50.權(quán)利要求49的方法，其中至少一個配基是抗體或其片段。
51.權(quán)利要求49的方法，其中至少兩個配基是抗體或其片段。
52.權(quán)利要求49的方法，其中存在至少兩個配基，并且是不同的抗體或其片段。
53.權(quán)利要求49的方法，其中至少一個配基是抗-CD3抗體、抗-CD2抗體、或者抗-CD3抗體或抗-CD2抗體的抗體片段。
54.權(quán)利要求49或者53的方法，其中至少一個配基是抗CD28抗體或其抗體片段。
55.權(quán)利要求49或者53的方法，其中至少一個配基是CD28的天然配基。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述天然配基包括B7-1或B7-2。
57.權(quán)利要求38的方法，其中所述作用力選自大于重力的作用力、液壓力、跨膜壓產(chǎn)生的滲透力、離心力以及磁力。
58.權(quán)利要求57的方法，其中磁力是利用磁鐵產(chǎn)生的，在磁鐵表面的磁場強(qiáng)度介于大約200-約12,000高斯。
59.權(quán)利要求38的方法，其中所述表面是順磁顆粒的表面。
60.權(quán)利要求38的方法，其中所述配基對表面的附著是共價(jià)的、非共價(jià)的、靜電的、或疏水性的。
61.權(quán)利要求38的方法，進(jìn)一步包括在步驟(d)之前或同時(shí)，將用表面富集的T細(xì)胞與未富集的細(xì)胞分開。
62.一種適于體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞激活的方法，包括給予動物以順磁顆粒，所述顆粒上附著可誘導(dǎo)T細(xì)胞活化的、特異性針對T細(xì)胞表面成分的配基；施加磁場到動物的分散區(qū)域；并從而誘導(dǎo)在所述分散區(qū)域與所述顆粒結(jié)合的T細(xì)胞定位和活化。
63.一種利用同步靶細(xì)胞富集和靶細(xì)胞表面成分連接刺而激靶細(xì)胞群體的方法，包括
(a)提供細(xì)胞群體，其中至少其一部分包含靶細(xì)胞；
(b)使所述細(xì)胞群體與表面接觸，其中所述表面上附著一種或多種因子，該因子可連接至少一部分所述靶細(xì)胞的細(xì)胞表面成分，并刺激至少所述部分的靶細(xì)胞；和
(c)施加主要驅(qū)使靶細(xì)胞富集以及靶細(xì)胞表面成分連接的作用力，從而誘導(dǎo)靶細(xì)胞刺激。
64.權(quán)利要求63的方法，其中所述表面上附著第一因子，其連接靶細(xì)胞的第一細(xì)胞表面成分；以及同一或第二表面附著第二因子，其連接所述靶細(xì)胞的第二成分，其中所述第一和第二因子的連接可誘導(dǎo)所述靶細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
65.權(quán)利要求63的方法，其中所述表面是生物相容性的。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述表面是天然的或者合成的。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述表面包含聚合物。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述表面選自膠原、純化的蛋白質(zhì)、純化的肽、多糖、糖胺聚糖、以及細(xì)胞外基質(zhì)成分。
69.權(quán)利要求68的方法，其中多糖選自脫乙酰殼多糖、藻酸鹽、葡聚糖、透明質(zhì)酸、以及纖維素。
70.權(quán)利要求67的方法，其中聚合物選自聚酯、聚醚、聚酐、聚烷基腈基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、聚乙酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、以及聚氨基甲酸乙酯。
71.權(quán)利要求70的方法，其中聚合物包括乳酸。
72..權(quán)利要求67的方法，其中聚合物是共聚物。
73.權(quán)利要求72的方法，其中共聚物包括乳酸和羥基乙酸(PLGA)。
74.權(quán)利要求65的方法，其中的生物相容性表面是可生物降解的。
75.權(quán)利要求65的方法，其中的生物相容性表面是不可生物降解的。
76.權(quán)利要求75的方法，其中不可生物降解的物質(zhì)包括選自聚(二甲基硅氧烷)和聚(乙烯-乙酸乙烯酯)的聚合物。
77.權(quán)利要求65的方法，其中生物相容性表面選自膠原、金屬、羥基磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽、生物陶瓷材料、透明質(zhì)酸聚合物、藻酸鹽、丙烯酸酯聚合物、乳酸聚合物、羥基乙酸聚合物、乳酸/羥基乙酸聚合物、純化的蛋白質(zhì)、純化的肽、和/或細(xì)胞外基質(zhì)成分。
78.權(quán)利要求65的方法，其中生物相容性表面與一種可植入裝置有關(guān)。
79.權(quán)利要求78的方法，其中裝置選自支架、導(dǎo)管、纖維、中空纖維、小片、和縫線。
80.權(quán)利要求66的方法，其中所述表面選自玻璃、二氧化硅、硅、膠原、羥基磷灰石、水凝膠、PTFE、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍和聚丙烯酰胺。
81.權(quán)利要求66的方法，其中所述表面選自脂類、平板、碟、袋、桿、丸、纖維和網(wǎng)。
82.權(quán)利要求66的方法，其中所述表面是顆粒。
83.權(quán)利要求82的方法，其中顆粒選自小珠、微球、納米微粒、和膠體粒子。
84.權(quán)利要求83的方法，其中所述小珠直徑約為5納米-約500微米。
85.權(quán)利要求63的方法，其中所述因子獨(dú)立地選自蛋白質(zhì)配基、天然配基和合成配基。
86.權(quán)利要求85的方法，其中所述因子獨(dú)立地選自抗體、抗體片段、肽、多肽、糖肽、受體、類固醇、激素、有絲分裂原、抗原、超抗原、生長因子、細(xì)胞因子、凝集素、病毒蛋白質(zhì)、粘附分子和趨化因子。
87.權(quán)利要求86的方法，其中至少一個因子是抗體或抗體片段。
88.權(quán)利要求86的方法，其中第一因子是抗體或其片段，并且第二因子是抗體或其片段。
89.權(quán)利要求86的方法，其中所述第一和所述第二因子是不同的抗體或其片段。
90.權(quán)利要求63的方法，其中所述作用力選自大于重力的作用力、液壓力、離心力、跨膜壓產(chǎn)生的滲透力、以及磁力。
91.權(quán)利要求32的方法，其中磁力是利用磁鐵產(chǎn)生的，在磁鐵表面的磁場強(qiáng)度介于大約200-約12,000高斯。
92.權(quán)利要求63的方法，其中所述表面是順磁顆粒的表面。
93.權(quán)利要求63的方法，其中所述因子對表面的附著是共價(jià)的、非共價(jià)的、靜電的、或疏水性的。
94.一種利用細(xì)胞表面成分連接和靶細(xì)胞富集而刺激靶細(xì)胞的方法，包括
(a)提供包括靶細(xì)胞的細(xì)胞群體；
(b)使所述細(xì)胞群體與表面接觸，其中所述表面附著一種或多種特異性針對細(xì)胞表面成分的配基；
(c)施加可驅(qū)動靶細(xì)胞富集以及所述細(xì)胞在所述表面富集的作用力；并且
(d)溫育所述細(xì)胞足夠長的一段時(shí)間，以達(dá)到所要求的刺激。
95.權(quán)利要求94的方法，其中所述足以獲得所要求刺激的時(shí)間從大約1分鐘到大約30天。
96.權(quán)利要求95的方法，其中所述足以獲得所要求刺激的時(shí)間是從大約1天到大約5天。
97.權(quán)利要求94的方法，其中所述表面是生物相容性的。
98.權(quán)利要求97的方法，其中所述表面是天然的或者合成的。
99.權(quán)利要求98的方法，其中所述表面選自玻璃、二氧化硅、硅、膠原、羥基磷灰石、水凝膠、PTFE、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍、葡聚糖和聚丙烯酰胺。
100.權(quán)利要求94的方法，其中所述表面選自平板、袋、碟、桿、丸、纖維和網(wǎng)。
101.權(quán)利要求94的方法，其中所述表面是顆粒。
102.權(quán)利要求101的方法，其中顆粒選自小珠、微球、納米微粒、和膠體粒子。
103.權(quán)利要求102的方法，其中所述小珠直徑約為5納米-約500微米。
104.權(quán)利要求94的方法，其中所述配基選自蛋白質(zhì)、天然配基和合成配基。
105.權(quán)利要求94的方法，其中所述配基選自抗體、抗體片段、肽、多肽、糖肽、受體、類固醇、激素、有絲分裂原、抗原、配基、超抗原、生長因子、細(xì)胞因子、凝集素和趨化因子。
106.權(quán)利要求105的方法，其中至少一個配基是抗體或其片段。
107.權(quán)利要求105的方法，其中至少兩個配基是抗體或其片段。
108.權(quán)利要求105的方法，其中至少兩個配基存在，并且是不同的抗體或其片段。
109.權(quán)利要求63或94的方法，其中所述靶細(xì)胞選自T細(xì)胞、B細(xì)胞、或者干細(xì)胞。
110.權(quán)利要求94的方法，其中所述作用力選自大于重力的作用力、液壓力、跨膜壓產(chǎn)生的滲透力、離心力、以及磁力。
111.權(quán)利要求110的方法，其中磁力是利用磁鐵產(chǎn)生的，在磁鐵表面的磁場強(qiáng)度介于大約200-大約12,000高斯。
112.權(quán)利要求94的方法，其中所述表面是順磁顆粒的表面。
113.權(quán)利要求94的方法，其中所述配基對表面的附著是共價(jià)的、非共價(jià)的、靜電的、或疏水性的。
114.權(quán)利要求94的方法，進(jìn)一步包括在步驟(d)之前或同時(shí)，將富集的靶細(xì)胞與未富集細(xì)胞分開。
115.一種體內(nèi)誘導(dǎo)靶細(xì)胞刺激的方法，包括給予動物以順磁顆粒，所述顆粒上附著可誘導(dǎo)靶細(xì)胞刺激的、特異性針對靶細(xì)胞表面成分的配基；施加磁場到動物的分散區(qū)域；并從而誘導(dǎo)在所述分散區(qū)域與所述顆粒結(jié)合的靶細(xì)胞定位和刺激。
116.一種誘導(dǎo)攜帶受體的細(xì)胞中發(fā)生受體極化的方法，
包括
a)提供細(xì)胞群體；
b)將所述細(xì)胞群體與固相表面接觸，其中所述固相表面上附著存在于至少一部分所述細(xì)胞群體上、特異性針對細(xì)胞表面受體的一種或多種配基；并且
c)施加可驅(qū)動細(xì)胞富集和細(xì)胞表面受體連接的作用力。
117.一種誘導(dǎo)細(xì)胞表面分子聚集的方法，包括
a)提供具有靶細(xì)胞表面分子的細(xì)胞群體；
b)使所述細(xì)胞群體與固相表面接觸，其中所述固相表面上附著了針對至少一種靶細(xì)胞表面分子的配基；和
(c)施加可驅(qū)動靶細(xì)胞表面分子聚集的作用力。
118.權(quán)利要求117的方法，其中所述細(xì)胞群體包括淋巴細(xì)胞。
119.權(quán)利要求116或者117的方法，其中所述固相表面選自平板、袋、碟、桿、丸、纖維、微球和小珠。
120.權(quán)利要求116或者117的方法，其中所述配基選自抗體、天然配基和合成配基。
121.權(quán)利要求120的方法，其中所述配基包括抗體、肽、多肽、生長因子、細(xì)胞因子、或趨化因子。
122.權(quán)利要求116或者117的方法，其中所述作用力選自大于重力的作用力、液壓力、跨膜壓產(chǎn)生的作用力、離心力、以及磁力。
123.權(quán)利要求122的方法，其中磁力是利用磁鐵產(chǎn)生的，在磁鐵表面的磁場強(qiáng)度介于大約200-大約12,000高斯。
124.權(quán)利要求116或者117的方法，其中所述固相表面是順磁性的。
125.權(quán)利要求116或者117的方法，其中所述受體結(jié)合引起細(xì)胞事件的下調(diào)或抑制。
126.權(quán)利要求116或者117的方法，其中所述受體結(jié)合引起細(xì)胞事件的上調(diào)或活化。
127.權(quán)利要求116的方法，其中所述細(xì)胞事件是受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
128.權(quán)利要求94的方法，其中所述作用力驅(qū)動細(xì)胞表面成分的富集或定位。
129.一種誘導(dǎo)T細(xì)胞群體增殖的方法，包括使T細(xì)胞與固相表面接觸介于大約2小時(shí)-9天之間的一段時(shí)間，所述固相表面上固定了第一因子和第二因子，其中所述第一因子向所述T細(xì)胞提供活化信號，并且所述第二因子提供共刺激信號。
130.權(quán)利要求129的方法，其中所述一段時(shí)間介于大約2-大約48小時(shí)之間。
131.權(quán)利要求130的方法，其中所述一段時(shí)間介于大約2-大約12小時(shí)之間。
132.權(quán)利要求129的方法，其中所述一段時(shí)間介于大約2-大約8天之間。
133.權(quán)利要求129的方法，其中所述一段時(shí)間介于大約3-大約6天之間。
134.權(quán)利要求129的方法，其中所述第一和第二因子固定于相同的固相表面。
135.權(quán)利要求134的方法，其中所述固相表面選自平面、不規(guī)則表面、球面。
136.權(quán)利要求129的方法，其中所述固相表面是小珠。
137.權(quán)利要求135的方法，其中所述不規(guī)則表面是塑料表面。
138.權(quán)利要求129的方法，其中所述第一因子包括結(jié)合CD3的抗體或其片段，并且所述第二因子包括結(jié)合CD28的抗體或其片段。
139.根據(jù)129-138的任一方法生產(chǎn)的T細(xì)胞群體。
140.一種組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求139的T細(xì)胞群體以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。
141.一種誘導(dǎo)T細(xì)胞群體增殖的方法，包括
a.通過將所述T細(xì)胞與小珠上固定的第一因子接觸，以活化T細(xì)胞群體，其中所述小珠直徑介于約20微米-約1毫米；以及
b.利用可結(jié)合輔助分子的第二因子刺激所述T細(xì)胞表面上的輔助分子，其中所述第二因子固定在小珠上，并從而誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖。
142.權(quán)利要求141的方法，其中所述小珠直徑介于約80微米和約500微米之間。
143.權(quán)利要求142的方法，其中所述小珠直徑介于約100微米和約400微米之間。
144.權(quán)利要求143的方法，其中所述小珠直徑介于約250微米和300微米之間。
145.權(quán)利要求141-144任一項(xiàng)的方法，其中所述小珠是順磁小珠。
146.權(quán)利要求141的方法，其中第一因子包括抗CD3抗體，并且第二因子包括抗CD28抗體。
147.權(quán)利要求146的方法，其中T細(xì)胞群體包括輔助T細(xì)胞。
148.權(quán)利要求141-144任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括利用過濾將小珠和T細(xì)胞分開。
149.權(quán)利要求148的方法，其中第一因子包括抗CD3抗體，并且第二因子包括抗CD28抗體。
150.權(quán)利要求149的方法，其中T細(xì)胞群體包括輔助T細(xì)胞。
151.活化的T細(xì)胞群體，其中至少一個細(xì)胞亞群具有這樣的表型，即刺激后約1-約4天之間CD154水平達(dá)到峰值。
152.活化的T細(xì)胞群體，其中所述群體包括超過約60％的CD4+T細(xì)胞。
153.活化的T細(xì)胞群體，其中所述群體包括至少約70％的CD4+T細(xì)胞。
154.活化的T細(xì)胞群體，其通過與抗CD3和抗CD28抗體或其片段接觸大約2小時(shí)-大約9天時(shí)間而預(yù)先刺激，從而增殖。
155.權(quán)利要求154的群體，其中所述接觸時(shí)間為大約4小時(shí)-約8天。
156.權(quán)利要求154的群體，其中所述接觸時(shí)間為大約4小時(shí)-8天。
157.活化的T細(xì)胞群體，其中所述T細(xì)胞已通過與固定的第一因子和第二因子接觸介于大約2小時(shí)-約9天之間的一段時(shí)間而預(yù)先誘導(dǎo)發(fā)生增殖，其中所述第一因子向所述T細(xì)胞提供活化信號，并且所述第二因子提供共刺激信號。
158.權(quán)利要求157的群體，其中所述T細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-4水平，于初級和次級信號活化后約2-約7天之間達(dá)到峰值。
159.權(quán)利要求157的群體，其中所述T細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-2水平，于初級和次級信號活化后約2-約7天之間達(dá)到峰值。
160.權(quán)利要求157的群體，其中所述T細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子-α或干擾素-γ水平，于初級和次級信號活化后約2-約7天之間達(dá)到峰值。
161.一種組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求151-160中任何一項(xiàng)的T細(xì)胞以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。
162.從包含T細(xì)胞和單核細(xì)胞的懸浮液中去除單核細(xì)胞的方法，包括使懸浮液與順磁小珠接觸，其中所述小珠直徑為約2.8μm-約10μm，并隨后利用磁力吸引從懸浮液中分離單核細(xì)胞。
163.權(quán)利要求162的方法，其中懸浮液是全血細(xì)胞懸液。
164.權(quán)利要求162和163中任何一項(xiàng)的方法，其中的小珠上附著至少一種抗體。
165.權(quán)利要求164的方法，其中抗體是一種非特異性抗體。
166.一種治療病人腫瘤的方法，包括給予該病人以權(quán)利要求161的藥物組合物。
167.權(quán)利要求166的方法，其中病人在給藥之前去除內(nèi)源的淋巴細(xì)胞。
168.權(quán)利要求166的方法，其中T細(xì)胞取自活化前的病人。
169.權(quán)利要求166的方法，其中T細(xì)胞群體已經(jīng)去除了單核細(xì)胞。
170.刺激的T細(xì)胞群體，其CD154表達(dá)水平，較之用抗CD3和抗CD28抗體刺激而沒有同步富集和刺激的T細(xì)胞，高出至少10％，其中所述水平是在T細(xì)胞刺激后1-4天內(nèi)通過流式細(xì)胞術(shù)測定的。
171.刺激的T細(xì)胞群體，其CD25表達(dá)水平，較之用抗CD3和抗CD28抗體刺激而沒有同步富集和刺激的T細(xì)胞，高出至少10％，其中所述水平是在T細(xì)胞刺激后1-4天內(nèi)通過流式細(xì)胞術(shù)測定的。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及刺激細(xì)胞的方法，尤其涉及富集和刺激細(xì)胞以使該細(xì)胞最大程度刺激和/或增殖的新方法。在多種實(shí)施方案中，利用可增強(qiáng)增殖、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或細(xì)胞表面成分聚集的表面來刺激和富集細(xì)胞。在某些方面，通過將該細(xì)胞群體與表面相接觸提供了用于通過同步富集以及細(xì)胞表面成分連接來刺激細(xì)胞群體(例如T細(xì)胞)的方法，該表面另外附著有可連接細(xì)胞表面成分的一種或多種因子，并施加可顯著驅(qū)使細(xì)胞富集以及細(xì)胞表面成分連接的作用力，從而誘導(dǎo)細(xì)胞刺激、細(xì)胞表面成分聚集和/或受體信號增強(qiáng)。還提供了用于產(chǎn)生包括T細(xì)胞在內(nèi)的表型定制細(xì)胞的方法，用于診斷、藥物發(fā)現(xiàn)以及治療各種適應(yīng)癥，包括癌癥、病毒感染以及免疫相關(guān)病癥。此外，還提供了利用這些方法產(chǎn)生的、具有特定表型特性的細(xì)胞組合物。
文檔編號A61K35/14GK1419597SQ01807319
公開日2003年5月21日 申請日期2001年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月24日
發(fā)明者R·貝倫森, C·勞, M·邦尼哈迪, N·桑德, S·克雷格, D·卡拉瑪茨, A·哈德威克, D·麥克米倫 申請人:?？怂刮魈刂委煿?br>