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非特異性富集細菌細胞的方法

文檔序號:410600閱讀:840來源:國知局
專利名稱:非特異性富集細菌細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種利用陽離子或陰離子聚合物和磁性載體非特異性富集(enrichment)細菌細胞的方法。
幾乎每一種細胞成分的處理、分析或分離的起始點都是細胞的富集,即“細胞收獲(cell harvest)”。后者通常是以離心來實施。因為除了將離心機整合到相應(yīng)的自動設(shè)備所用的高技術(shù)之外,在離心程序的起始與停止位置都需要極端高的精確度,所以此離心步驟成為在方法完全自動化(例如質(zhì)粒純化)中的主要問題。所以,在細胞化合物的處理、分析或分離中之自動化方法通常是用已經(jīng)在自動設(shè)備以外富集、離心或沉積過的細胞起始的。但是,實現(xiàn)相關(guān)方法的盡可能的完全自動化對于例如完整基因組、蛋白質(zhì)組(proteomes)的快速分析,以及對于高通量方法中結(jié)構(gòu)和功能的迅速解析等都是必要的。不過,部份步驟的自動化程度,例如在基因組分析方面,已經(jīng)非常先進。例如,細菌培養(yǎng)和質(zhì)粒分離都可以自動地實施。然而,現(xiàn)在仍缺乏一種行之有效的包括細胞收獲在內(nèi)的簡單、低成本且完全自動化的方法。
標準的細胞收獲方法為細菌培養(yǎng)物的離心。對此而言,需要用到微滴定板離心機(micro-titre-plate centrifuge),特別是要設(shè)計用于較高通量的方法之中者。
另一種方法系利用過濾膜將培養(yǎng)的細胞富集(例如WO 01/51206,3M Innovative Properties Co(US)與US 5,464,541,Diagen Institut f.Molekularbiologie)。不過,此種方法在使用高度富集的細胞懸液且因此溶液具有高粘度的情況中,顯然會非常易于出現(xiàn)堵塞等意外事件。類似地,對于采用離子交換裝置(例如結(jié)合到一多孔型基質(zhì)并過濾)和真空技術(shù)的情況也是如此(WO 92/07863,Qiagen)。此種情形會產(chǎn)生許多問題,尤其是對于自動化方法。
利用以磁性顆粒為基底的方法進行微生物的富集在原則上適合于自動化。到目前為止已經(jīng)有三種細菌富集所用方法被述及,不過其在菌株特異性方面以及生產(chǎn)成本方面都明顯地顯示存在缺點。
EP1 118676 A2,Chemagen AG和WO 01/53525 A2,Genpoint AS述及一種以固相富集微生物的方法,其使用一經(jīng)共價鍵或非共價鍵方式固定化在此固相的非特異性配體。就此方法而言,所用固相為聚乙烯醇珠,其可為磁性或非磁性。于此方法的要旨中,將可以作為微生物所用的養(yǎng)分的分子視為配體。此方法的缺點在于某些配體必須固定化到一支持物上,此可能導(dǎo)致生產(chǎn)費用之顯著增加。另一項缺點在于對于不同的菌株可能需要固定化不同的配體,此意味著該磁珠和該方法將缺乏通用性。
于另一專利申請中,亦即WO 98/51693,Genpoint述及使用含有鹽類、醇類和聚乙二醇或可與聚乙二醇相比的聚合物的混合物在磁性顆粒上面富集細菌。于WO 98/51693中所述的方法需要花5-20分鐘及添加2-50%(w/v)的聚合物。此種高濃度的鹽類和聚合物會在細菌的后續(xù)處理中產(chǎn)生問題,這是因為,例如30%的聚乙二醇非常粘稠,或高濃度的鹽會干擾SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
WO 00/29562,Merck Patent GmbH述及一種從微生物分離出質(zhì)粒DNA的方法,包括a)將微生物培養(yǎng)物酸化,并與固體表面材料(solidface material)(二氧化硅-磁性顆粒)溫育與混合,及b)隨后將質(zhì)粒純化。不過,此種方法并非對于所有大腸桿菌(E.coli)菌株而言都是可行的,因為其可能導(dǎo)致一定程度的產(chǎn)率上的損失。此種方法的另一項缺點在于所需的珠之量,因為珠的費用會構(gòu)成細菌富集費用的主要中心,而特別是二氧化硅珠相當(dāng)昂貴。由于二氧化硅珠可能主要結(jié)合到DNA,因此用該二氧化硅珠來分離質(zhì)粒的過程中,也會觀察到產(chǎn)率的減損。
WO 91/12079,Amersham述及一種在可非特異性地結(jié)合到聚合物(細胞)的磁珠上沉淀細胞的方法。于此方法中,必須強制地遵守所需藥劑(醇和鹽類)與磁珠的添加順序。在使用之前將藥劑及/或藥劑與珠混合是不可能的,如此一來就不能省卻吸移步驟,而省卻吸移步驟對于自動設(shè)備的最優(yōu)利用的自動化是必要的。另外,其可使用的磁性顆粒僅局限于纖維素/氧化亞鐵顆粒。
US 6,284,470 B1,Promega述及完整細胞與磁性顆粒形成復(fù)合體。就可應(yīng)用的磁珠而言,此方法僅局限于二氧化硅顆粒。由于此種方法指定需要將一體積的醇加到一體積的細胞懸液,因此該方法顯然不能在產(chǎn)率沒有任何明顯減損之下應(yīng)用深孔板(deep-well-plates)進行細胞收獲。再者,高濃度的醇可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。
有許多研究顯示陽離子聚合物可能與細菌交互作用。例如,實驗顯示出陽離子聚合物例如脫乙酰殼多糖(chitosan)(脫乙酰殼多糖為一種經(jīng)去乙?;臍ざ嗵?chitin))非常適合用于單細胞實驗中對活的微生物細胞進行包囊化(encapsulation)或“封裝(sealing)”(參閱例如MethodsEnzymol.1987,vol.135,259-268,或US 5,489,401)。脫乙酰殼多糖也可用來對珠聚合物之內(nèi)活性生物材料進行包囊化處理(US 4,647,536和WO 01/46266)。脫乙酰殼多糖也可用來——視情況也以其改質(zhì)形式——包被免疫檢測所用的對象或?qū)嶒炘噭┖?US 5,208,166)。
不過,有關(guān)陽離子聚合物對于微生物細胞壁所具疏水性的影響的文章業(yè)已證明,在pH值高于3時,疏水性表面的粘著力會顯著地增加,但在pH值低于3時會減低到幾乎為0%(參考資料Goldberg,S.,Doyle,R.J.和Rosenberg,M.,1990,J.Bacteriol.vol.172,5650-5654)。
使用以磁性顆粒支持的方法可具有進一步的優(yōu)點,因為如此一來便有可能分別進行單個孔(例如在深孔板中)的收獲,而不需要收獲整個板。如此一來,例如在表達研究(expression Study)的范圍之內(nèi),可以依時間相關(guān)方式進行收獲。
總之,可以確定的是,在目前還沒有一種不需離心步驟即可完成且可同時用于多種不同細菌的簡單方法可以用來有效率、快速、低成本地富集細菌細胞。所以,本發(fā)明的任務(wù)為提供一種不需離心步驟即可完成非特異性地富集細菌細胞的方法。
此問題由后附權(quán)利要求書所界定的主題予以解決。


本發(fā)明要用下列圖式予以更詳細地示范說明。
圖1顯示出使用不同的磁性顆粒進行大腸桿菌(E.coli)LE392(淺色條)和TG2(黑色條)細胞收獲所得產(chǎn)率之結(jié)果。數(shù)值指示的是以上清液的濁度與所用細胞懸液的光密度的比值測定得到的產(chǎn)率%??s寫代表Silica(二氧化硅)MagPrep Silica Beads(Fa.MERCK,Darmstadt,Germany);NH2氨基聚苯乙烯珠(Fa.Estapor,MERCK-Eurolab);COOH羧基聚苯乙烯珠(Fa.Estapor,MERCK-Eurolab);PS聚苯乙烯珠(Spherotech,Illinois,USA);PVA聚乙烯醇珠(Chemagen,Baesweiler,Germany)。
圖2顯示出使用二氧化硅珠(黑色條)和脫乙酰殼多糖/氨基聚苯乙烯珠(淺色條)在酸性pH值下進行細胞收獲所得產(chǎn)率之結(jié)果。于圖2中將根據(jù)本發(fā)明的方法所得細胞收獲產(chǎn)率(淺色條)與使用得自WO 00/29562的方法所得細胞收獲產(chǎn)率(黑色條)相比較。將根據(jù)本發(fā)明的方法所得細胞產(chǎn)率定為100%,且相對于此定出根據(jù)WO 00/29562所得產(chǎn)率。所有值都是得自數(shù)個實驗的平均值附上標準偏差。根據(jù)本發(fā)明的方法的細胞收獲系按照實施例5中所述實施的。對于WO 00/29562/MERCK,則是采用制造商的實驗程序。
圖3以圖解方式顯示出使用經(jīng)溶解的脫乙酰殼多糖(淺色條)和經(jīng)固定化在珠上的脫乙酰殼多糖(脫乙酰殼多糖珠,F(xiàn)a.Chemicell,Berlin,Germany)(黑色條)進行大腸桿菌(E.coli)DH5α和HB101細胞收獲所得產(chǎn)率之結(jié)果。數(shù)值指示的是以上清液與所用細胞懸液的光密度的比值測定得到的產(chǎn)率%。
圖4顯示出利用15種大腸桿菌克隆菌珠進行細胞收獲(如實施例5所述實施)的生產(chǎn)效率的結(jié)果。產(chǎn)率系以上清液的光密度與細胞懸液光密度的比值測定得到的%繪出(得自數(shù)個實驗的平均值,n=27)。
圖5顯示出不同細菌菌種的收獲結(jié)果。圖5顯示出根據(jù)本發(fā)明的細胞收獲系統(tǒng)可以廣泛用于多種菌群(革蘭氏陽性和革蘭氏陰性兩者)。于每一種情況中標繪出細胞收獲的產(chǎn)率。細胞以類似于實施例7所述的方式收獲。E.faecalis糞腸球菌(Enterococcus faecalis);B.vallismortisBacillus vallismortis;P.mirabilis奇異變形桿菌(Proteus mirabilis),M.luteus藤黃微球菌(Micrococcus luteus);S.haemolyticus溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus);C.freundii弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)。
圖6以圖解方式顯示出使用含有聚賴氨酸的0.5M HCl與不含聚賴氨酸的0.5M HCl進行大腸桿菌菌株JM83的細胞收獲所得產(chǎn)率之結(jié)果。數(shù)值指示出通過上清液光密度與細胞懸液光密度的比值測定得到的產(chǎn)率%。PL/HCl含有聚賴氨酸的0.5M HCl;HCl只有0.5M HCl(不含聚賴氨酸的對照樣品)。
圖7顯示出大腸桿菌細胞,脫乙酰殼多糖和磁珠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成。此網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成是經(jīng)由將溶解在0.5M甲酸中的游離脫乙酰殼多糖加入到大腸桿菌(菌株HB 101)懸液中(C和D)而促成的。于沒有脫乙酰殼多糖的對照樣品中(只有0.5M甲酸),沒有產(chǎn)生網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(A和B)。細菌仍然呈現(xiàn)為單個細胞之形式。A和C亮視野圖,于A中可以看到單個細胞與磁性顏料,而在C中可看到聚集體。B和D于使用碘化丙啶/Syto9(Propidiumiodide/Syto9)(BacLightTMViability Kit,Molecular Probes,Eugene,Oregon,USA)染色大腸桿菌細胞之后的熒光圖象。于B中可以看到具有熒光的單個細胞;D顯示出經(jīng)包埋在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的細胞的熒光。
圖8以顯示出在根據(jù)本發(fā)明的方法進行細胞收獲之后與經(jīng)由離心收獲之后分別所得的大腸桿菌的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的酶活性。酶活性的值以相對于包括300微升收獲細胞的用于分析的細胞成分相對單位表示(%)??招牧庑问境鼋?jīng)離心收集的細胞的值。三角形和方形示出以本發(fā)明方法收獲的細菌的值。三角形于添加30微升的125微克/毫升脫乙酰殼多糖/0.5M甲酸溶液之后,將細胞溫育3分鐘并用磁性分離程序予以分離3分鐘。方形將細菌溫育5分鐘并于添加所述溶液之后在磁場中分離5分鐘。
圖9顯示出在將異源性表達性大腸桿菌菌株BL21(DE3)以根據(jù)本發(fā)明的方法予以收獲,然后使用Strep-Tactin珠(IBA GmbH,Gttingen,Germany)富集N-Strep-T4-p12蛋白質(zhì)所得的結(jié)果。A未經(jīng)誘導(dǎo)的細胞;B經(jīng)誘導(dǎo)的細胞;1粗制細胞裂解物;2結(jié)合N-Strep-T4-p12之后的strep-tactin珠;3洗脫出的天然的、三聚體形式的N-Strep-T4-p12蛋白質(zhì);4洗脫出的單體形式的N-Strep-T4-p12蛋白質(zhì)(在95℃下煮沸之后);5洗脫之后的strep-tactin珠;6標準品(經(jīng)純化的N-Strep-T4-p12蛋白質(zhì))。
圖10顯示出從使用根據(jù)本發(fā)明的方法(如實施例4中所述)收獲所得的大腸桿菌XL1Blue分離質(zhì)粒DNA所得的結(jié)果。1使用根據(jù)本發(fā)明的方法收獲細菌;2以離心法收獲細菌;a用PstI消化過的質(zhì)粒pUC19;b未經(jīng)消化的質(zhì)粒;MDNA標準品(Lambda-DNAEcoRI/HindIII)。
本文中所使用的術(shù)語“純化”或“富集”是指將細菌細胞或細胞成分從水溶液(即其中含有細菌細胞或細胞成分的培養(yǎng)基)中分離出來。該純化或富集是使用磁性顆粒進行的。
本文中所使用的術(shù)語“非特異性富集”是指在所選條件下進行的富集與細菌的種、株、屬等無關(guān)。
本發(fā)明的一方面涉及提供一種非特異性地純化細菌細胞的方法,包括下列步驟a)將含有細菌細胞的樣品與陽離子聚合物在酸性pH值下或與陰離子聚合物在堿性pH值下接觸;b)添加一磁性載體;c)從樣品分離出其上面結(jié)合著細菌細胞的該磁性載體。
具體地,該方法的特征在于下列步驟將細菌培養(yǎng)物與陽離子或陰離子聚合物混合,特別是無支鏈的(unbranched)陽離子聚合物,優(yōu)選地為脫乙酰殼多糖(例如FLUKAProd.No.22741,22742 or 22743,Sigma C-3646或Roth 5375.1)或聚賴氨酸(例如Sigma P2636)。優(yōu)選的陰離子聚合物為硫酸葡聚糖(dextransulfate)、硫酸軟骨素(chondroitinsulfate)、聚谷氨酸(polyglutamate)、聚蘋果酸(polymalate)、聚半乳糖醛酸(polygalacturonicacid)、聚磷酸鹽(polyphosphate)和硫酸化寡糖(sulfated oligosaccharides)。
細菌培養(yǎng)物與聚合物形成的混合物必須根據(jù)所使用的聚合物配合相應(yīng)的緩沖液而具有某一pH值。該pH值于陽離子聚合物的情況中優(yōu)選地要低于或等于3或4,且于陰離子聚合物的情況中優(yōu)選地要高于或等于8。在添加聚合物之前可以利用緩沖液溶液的添加或直接添加酸或堿調(diào)整細菌培養(yǎng)物而將pH值調(diào)整到合意的pH值。此外,也可以將聚合物溶解在個別的緩沖液溶液內(nèi)或直接溶解在酸或堿之中而調(diào)整該pH值。再者,可以在添加聚合物之后,利用緩沖液溶液的添加或直接添加酸或堿調(diào)整細菌培養(yǎng)物和聚合物的混合物而調(diào)整pH值。該陽離子聚合物可經(jīng)溶解在酸性緩沖液之中或直接溶解在酸之中。該溶液的調(diào)整方式為使得細菌培養(yǎng)物和該陽離子聚合物的混合物得到根據(jù)本發(fā)明的合意pH值。對于根據(jù)本發(fā)明的方法而言,優(yōu)選地,該細菌培養(yǎng)物和聚合物的混合物具有一酸性pH值。該pH值可以用任何緩沖液或酸予以調(diào)整,優(yōu)選地使用0.5M HCl/25%醋酸、0.5M HCl或0.5M甲酸。使用何種緩沖液系分別取決于細菌的后續(xù)處理方式與后續(xù)的方法。若要使用根據(jù)本發(fā)明的方法來純化質(zhì)粒之時,緩沖液HCl/HAc的pH值優(yōu)選地在約2至約3的范圍之間,因為DNA在低于1.8的pH值下會水解。若要使用根據(jù)本發(fā)明的方法來純化蛋白質(zhì)之時,優(yōu)選地是使用pH值在大約4的范圍之內(nèi)的甲酸作為緩沖液,因為對于功能性蛋白質(zhì)的分離而言,pH值應(yīng)該在大約4至大約9的范圍內(nèi)。
陽離子聚合物的濃度范圍要確保細菌的充分純化。用于進行沉淀的聚賴氨酸的濃度范圍在12.5微克/毫升培養(yǎng)物至150微克/毫升培養(yǎng)物之間,優(yōu)選地在25微克/毫升培養(yǎng)物至150微克/毫升培養(yǎng)物的范圍之間,特別優(yōu)選地在40微克/毫升培養(yǎng)物至75微克/毫升培養(yǎng)物的范圍之間,更優(yōu)選地為50微克/毫升。最適濃度于此分別取決于細菌菌種和細菌菌株,不過也取決于所使用的聚賴氨酸的供應(yīng)來源或分子量。
用于進行沉淀的脫乙酰殼多糖的濃度范圍在0.05微克/毫升培養(yǎng)物至100微克/毫升培養(yǎng)物的范圍之間,優(yōu)選地在0.25微克/毫升培養(yǎng)物至50微克/毫升培養(yǎng)物的范圍之間,特別優(yōu)選地在0.5微克/毫升培養(yǎng)物至50微克/毫升的范圍之間,更特別優(yōu)選地在1微克/毫升培養(yǎng)物至50微克/毫升的范圍之間,更加優(yōu)選地為2.5-50微克/毫升??蓮南卤碇兴械木彌_液決定其它優(yōu)選的濃度。最適濃度于此系分別取決于細菌菌種和細菌菌株,不過也取決于所使用的脫乙酰殼多糖的供應(yīng)來源或分子量以及脫乙酰殼多糖的脫乙?;潭取C撘阴ざ嗵堑膬?yōu)選的濃度總覽于下表。

于添加聚合物之后,應(yīng)該將細菌培養(yǎng)物與聚合物的溶液混合,優(yōu)選地為經(jīng)由吸液管吸上和放下或經(jīng)由搖蕩。經(jīng)混合,可以更快速且直接地使所有涉及的成分彼此接觸。
酸化的或堿性的聚合物與細菌的混合物可以立即處理。不過,也可以將該混合物溫育一段短時間,優(yōu)選地6-10分鐘,特別優(yōu)選地5分鐘。溫育溫度可為室溫至40℃,優(yōu)選地為37℃,特別優(yōu)選地為室溫。
于該酸化的或堿性的聚合物與細菌的混合物中加入磁性載體。優(yōu)選地,該磁性載體為磁性顆粒(于下文中也稱為磁珠),例如聚苯乙烯珠或磁性顏料。于根據(jù)本發(fā)明的方法之范圍內(nèi),可以使用其表面經(jīng)過化學(xué)官能化過的聚苯乙烯珠,特別是具有NH2-、COOH-或OH-表面者,其中優(yōu)選地為具有NH2-表面者。有關(guān)經(jīng)官能化過的顆粒,優(yōu)選地為使用商業(yè)上可取得的珠例如Estapor公司的氨基珠(EM2 100/40,直徑1.43微米)或羧基珠(EM1 100/40,(23710)直徑1.3微米)。有關(guān)磁性顏料,可以使用商業(yè)上可以取得的珠例如Bayferrox 318M、Bayoxid E 8706或BayoxidE8713H(Bayer AG)。珠的優(yōu)選的直徑在0.5微米到2微米的范圍之內(nèi),優(yōu)選地該直徑在1微米到5微米的范圍之內(nèi),特別優(yōu)選地為約1微米。
根據(jù)本發(fā)明的方法包括形成細菌與聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),其中有摻入不論何種類型的磁性顆粒,例如聚苯乙烯珠或顏料。由此可以經(jīng)由施加磁場通過包含在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的磁性顆粒而分離出細菌。
根據(jù)本發(fā)明的方法于此不限于特別類型的經(jīng)表面官能化的磁性顆粒,而是任何類型的磁性顆粒,此意味著可以使用例如具有各種表面的珠或顏料。于表A或B中列出具有不同的表面的常見類型磁鐵之概述。如果在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用磁性顏料,可以將此顏料溶解在醇類中,也可以溶解在水性緩沖液之內(nèi)。
表A列出至今已經(jīng)測試過且在根據(jù)本發(fā)明的方法中有功能的所有磁性顆粒。表A以制造商為索引的磁性顏料。表B以制造商為索引的具有不同的官能團的不同基礎(chǔ)基質(zhì)的磁珠。PS聚苯乙烯;Silica二氧化硅基質(zhì);PVA聚乙烯醇。


磁性顆粒的濃度范圍要確保細菌的充分純化,不過該純化的費用要在合理的范圍之內(nèi)。優(yōu)選地,該聚苯乙烯珠以1%的聚苯乙烯珠溶液的形式,按照細菌培養(yǎng)物體積的約1/10至1/70的濃度添加。特別優(yōu)選的濃度為約1/20至1/50,特別是1/20或1/50的濃度。于此,該濃度取決于細菌培養(yǎng)物的體積大小。若細菌培養(yǎng)物的體積為例如0.2或1或1.5毫升時,優(yōu)選地為1/20的1%該聚苯乙烯珠溶液的濃度,且若細菌培養(yǎng)物的體積為例如10毫升之時,優(yōu)選地為1/50的1%該聚苯乙烯珠溶液的濃度。細菌培養(yǎng)物的體積愈大,該聚苯乙烯珠的濃度可以愈低。磁性顏料優(yōu)選地用5%溶液的形式,按照細菌培養(yǎng)物的1/10體積的濃度使用。
于添加磁性顆粒之后,應(yīng)該將細菌培養(yǎng)物、聚合物和磁性顆粒的溶液混合,優(yōu)選地經(jīng)由用吸液管抽吸與放下、搖蕩或使用磁攪拌棒。經(jīng)混合,可以使所有涉及的成分更快速且直接地彼此接觸。
該混合物可以立即處理。不過,也可以將該混合物溫育一段短時間,優(yōu)選地3-10分鐘,特別優(yōu)選地5分鐘。溫育溫度可為室溫至40℃,優(yōu)選地為37℃,特別優(yōu)選地為室溫。
隨后,可以將經(jīng)結(jié)合到磁性載體的細菌從樣品分離出來。于此將細菌培養(yǎng)物、聚合物和磁性顆粒的混合物置于一磁場中,且使復(fù)合物沉淀出來。
已經(jīng)在本方法前面步驟中結(jié)合到細菌的磁性顆??梢愿鶕?jù)后續(xù)處理的類別——例如質(zhì)粒制備、RNA或基因組DNA制備——而通過搖蕩從細菌分離下來并丟棄,或者也可以將其與細菌一起用于后續(xù)的處理步驟之中。若要將細菌從磁性顆粒分離開時,可以將細菌、聚合物和磁性顆粒的混合物于從樣品中分離出來之后再懸浮于相應(yīng)的緩沖液內(nèi),且予以取出及例如轉(zhuǎn)移到一新的反應(yīng)管之內(nèi),同時使用磁鐵保留住磁性顆粒。要將細菌從細菌、聚合物和磁性顆粒的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)脫離出來之時,優(yōu)選地為使用Tris緩沖液(200mM,pH8-9.5)。要脫離時,優(yōu)選地為以高速度,例如以1200rpm(Eppendorf旋轉(zhuǎn)搖蕩器)實施搖蕩步驟。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以在所有常用的反應(yīng)管內(nèi)進行,優(yōu)選地為在所有類別的Eppendorf反應(yīng)管內(nèi)或在微滴定板之內(nèi)進行。
可以使用根據(jù)本發(fā)明的方法予以富集的細菌可為所有類型的細菌,優(yōu)選地為真細菌(eubacteria)和原始細菌(archaebacteria),特別者為大腸桿菌,尤其是大腸桿菌BL21、JM109、大腸桿菌B、DH1、LE392、大腸桿菌K12、DH5α、NM522、大腸桿菌C、DH10b、Sure、GM2163、TG2、HB101、Top10、InvaF’、XL1Blue、JM83、以及微球菌(Micrococcus spec.),尤其是藤黃微球菌(Micrococcus luteus),變形菌(Proteus spec.),尤其是奇異變形桿菌(Proteus mirabilis),腸球菌(Enterococcus spec.),尤其是糞腸球菌(Enterococcus faecalis),檸檬酸桿菌(Citrobacter spec.),尤其是弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii),芽孢桿菌(Bacillus spec.),尤其是Bacillus.vallismortis,葡萄球菌(Staphylococcus spec.),尤其是溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以用來替代離心且因而有助于對細菌細胞進行自動化純化。使用所述方法,可以在約5-10分鐘之內(nèi)將細菌從培養(yǎng)物內(nèi)非特異地富集。由于所使用的陽離子聚合物的濃度非常低,在1%以下,因此能夠以與根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的程序相比顯著低成本的程序來實施富集。再者,在根據(jù)本發(fā)明的方法之中,可以使用相當(dāng)少量的珠,即每個細菌1-15個珠,而不是在例如WO 00/29562中所述的每個細菌30-50個珠。
下面的實施例用來說明而不是用來在任何方面限制本發(fā)明的范圍。
實施例1.脫乙酰殼多糖溶液的制備秤取脫乙酰殼多糖,再懸浮于0.5N HCl/25%HAc中并加熱該溶液(約80-90℃)一直到脫乙酰殼多糖完全溶解為止。隨后將該溶液稀釋并在0.5N HCl/25%HAc中稀釋且調(diào)整到25微克/毫升(=工作溶液H),或在0.5N甲酸中稀釋且調(diào)整到125微克/毫升(=工作溶液A)。該工作溶液(25微克/毫升)在室溫之下保持穩(wěn)定的溶液并以該方式貯存。
2.聚賴氨酸溶液的制備秤取聚賴氨酸,再懸浮于0.5N HCl之中且在0.5N HCl中調(diào)整到0.5毫克/毫升(=工作溶液)。將該工作溶液貯存在-20℃直到使用為止。
3.以0.2毫升培養(yǎng)物的規(guī)模收獲細菌網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成在0.5毫升96-孔聚丙乙烯微滴定板中,使用每孔0.2毫升培養(yǎng)物,將大腸桿菌HB101培養(yǎng)過夜。分別加入20微升脫乙酰殼多糖工作溶液A和20微升0.5M甲酸,于對照樣品中沒有脫乙酰殼多糖,且于培養(yǎng)物中加入20微升5%磁性顏料Bayoxid E8706(溶于PBS溶液),且經(jīng)由吸液管吸上與放下予以混合。于在室溫之下溫育5分鐘后,以顯微鏡檢查網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成(圖7)。
4.1.5毫升培養(yǎng)物規(guī)模的細菌收獲DNA-分離在96-DWP中使用1.25毫升培養(yǎng)物體積每孔在有100微克/毫升氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中實施經(jīng)質(zhì)粒pUC19轉(zhuǎn)染過的大腸桿菌XL1Blue之過夜培養(yǎng)。于該過夜培養(yǎng)物中加入125微升脫乙酰殼多糖工作溶液H與125微升的5%顏料珠溶液(Bayferrox 318M在異丙醇內(nèi)),并經(jīng)由以吸液管吸上與放下予以充分混合。于在室溫下5分鐘的溫育期之后,在一磁分離器(Bilatc AG,Mannheim,Germany)上分離出該細菌/珠復(fù)合物。將上清液完全取出并使用DNA分離試劑盒Wizard MagneSilTM質(zhì)粒純化系統(tǒng)(Promega,Madison,USA),根據(jù)制造商的實驗程序從細胞沉積物中分離出質(zhì)粒DNA(圖10)。
5.10毫升培養(yǎng)物規(guī)模的細菌收獲在一聚丙烯管中以10毫升培養(yǎng)物體積實施大腸桿菌JM83的過夜培養(yǎng)。于該過夜培養(yǎng)物中加入1毫升(1/10體積)的脫乙酰殼多糖工作溶液H并經(jīng)由以吸液管吸上與放下兩次予以混合。其后,加入0.2毫升的1%氨基聚苯乙烯珠溶液。隨后經(jīng)由吸液管吸上與放下(兩次)混合該溶液。之后在室溫下溫育5分鐘。將該管置于一永久磁鐵(Bilatec AG,Mannheim,Germany)的磁場中10分鐘,以沉積該細菌/珠-復(fù)合物。丟棄其上清液并直接處理細菌細胞。
6.大腸桿菌培養(yǎng)物之培養(yǎng)在標準培養(yǎng)基例如LB、2x YT、SOB或SOC中過夜培養(yǎng)大腸桿菌培養(yǎng)物(Maniatis,1987),于200微升過夜培養(yǎng)物中加入20微升脫乙酰殼多糖工作溶液H和與20微升的氨基聚苯乙烯珠并充分混合。于溫育5分鐘之后,于一磁性分離器(Bilatc AG,Mannheim,Germany)上進行該細菌/珠復(fù)合物的分離。若使用上面所述的培養(yǎng)基時,可能需要調(diào)整該工作溶液和珠的濃度。
7.0.2毫升培養(yǎng)物規(guī)模的細菌收獲在一96微孔板中于37℃下實施0.2毫升糞腸球菌、奇異變形桿菌、溶血葡萄球菌培養(yǎng)物的過夜培養(yǎng)。在一96微孔板中于30℃下實施0.2毫升Bacillus vallismortis、奇異變形桿菌、藤黃微球菌、弗氏檸檬酸桿菌培養(yǎng)物的過夜培養(yǎng)。于該過夜培養(yǎng)物中加入20微升(1/10體積)脫乙酰殼多糖工作溶液H。其后加入10微升的1%氨基聚苯乙烯珠溶液。隨后經(jīng)由吸液管吸上與放下(1或2次)充分地混合該溶液。接著在室溫下溫育5分鐘。將該微滴定板管置于磁性分離器(Bilatec AG,Mannheim,Germany)上溫育5分鐘以沉積該細菌/珠復(fù)合物。丟棄其上清液并直接處理細菌細胞。
8.活細菌之收獲在0.5毫升的96孔PP微滴定板中,在300微升的大腸桿菌BL21(DE3)過夜培養(yǎng)物中加入30微升的脫乙酰殼多糖工作溶液A和30微升的5%顏料珠溶液(Bayferrox 318M于PBS中),并經(jīng)由吸液管吸上與放下予以充分混合。其后在室溫下分別實施3和5分鐘的溫育步驟。隨后在一適當(dāng)?shù)拇判苑蛛x器(Bilatec AG,Mannheim,Germany)上溫育該細菌/珠復(fù)合物,以使之分別沉積3和5分鐘。丟棄其上清液并將細菌/珠沉丸再懸浮于200微升的200mM Tris pH8.0之中。對于對照組,將300微升的該過夜培養(yǎng)物離心,并也將其沉淀再懸浮于200微升的200mMTris pH8.0之中。經(jīng)由在瓊脂板上將稀釋系列平板培養(yǎng)且在過夜培養(yǎng)之后計數(shù)菌落以查驗細胞的生命力。有關(guān)細胞的活性和生命力之進一步檢定,系測量細胞本身的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的酶活性(Apte et al.,1995,Wat.Res.29,1803-1806)(圖8)。
9.蛋白質(zhì)分離要從已經(jīng)通過本發(fā)明的方法收獲的細胞中進行蛋白質(zhì)所分離,使用了Strep-tag系統(tǒng)。使用分子生物學(xué)標準方法將p12(Selivanov,N.A.,etal.,1988,Nucleotide and deduced amino acid sequence of bacteriophage T4gene 12,Nucleic Acids Rs.;16(5)2334)融合到N-端Strep-tag(US 5,506,121),且按照Burda,M.R.& Miller S.(Europ.J.Biochem,1999,265771-778)所述予以表達。在一96深孔板中使用1.25毫升培養(yǎng)物每孔實施可表達N-Strep-T4-p12的大腸桿菌菌珠BL21(DE3)pNS-T4-p12p57的培養(yǎng)。于OD600約為0.5的細胞密度時,使用1mM IPTG培養(yǎng)3小時。隨后。于每一孔中分別加入125微升的脫乙酰殼多糖工作溶液A與125微升的5%顏料珠溶液(Bayoxid E8706 in PBS),經(jīng)由吸液管吸上與放下予以充分混合,并且在室溫下溫育5分鐘。其后在一適當(dāng)?shù)拇判苑蛛x器(Bilatec AG,Mannheim,Germany)上溫育,使該細菌/珠復(fù)合物沉積5分鐘。將其上清液完全取出,并將沉淀再懸浮于150微升的緩沖液A(200mM Tris pH8.0,200mM NaCl,10mM EDTA,0.05%Tween20)之中。隨后經(jīng)由一搖蕩步驟(以1200rpm進行5分鐘,德國Eppendorf公司的搖蕩器)使細菌從細菌/珠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)脫離開。經(jīng)由重復(fù)地在磁性分離器上溫育將珠與細胞分離開,分離的珠現(xiàn)存在于上清液中,將上清液轉(zhuǎn)移到0.5毫升96孔PP微滴定板的一新孔之內(nèi)。之后經(jīng)由添加溶菌素(lysozyme)(1.6毫克/毫升),以750rpm搖蕩2分鐘及在室溫下溫育15分鐘將細胞溶裂,并經(jīng)由添加5微克/毫升的DNAse將DNA消化。經(jīng)由添加10微升的5%-StrepTactin珠(Company IBA,Gttingen,Germany)且在平穩(wěn)搖蕩之下溫育20分鐘使異源表達的N-Strep-T4-p12結(jié)合到StrepTactin珠并且從裂解液中富集。經(jīng)添加5mM生物素(biotin)從珠上洗脫出該N-Strep-T4-p12(圖9)。
權(quán)利要求
1.一種非特異性純化細菌的方法,其包括下列步驟a)將含有細菌細胞的樣品與一種陽離子聚合物在酸性pH值下接觸,b)添加一種磁性載體,c)從所述的樣品中分離出其上面結(jié)合了細菌細胞的該磁性載體。
2.權(quán)利要求1的方法,其中在步驟a)及/或步驟b)之后插入一溫育步驟。
3.前述權(quán)利要求中任一項的方法,其中所述的陽離子聚合物為脫乙酰殼多糖或聚賴氨酸。
4.前述權(quán)利要求中任一項的方法,其中該脫乙酰殼多糖的添加濃度在0.05至100微克/毫升培養(yǎng)物的范圍內(nèi),而聚賴氨酸的添加濃度在12.5至150微克/毫升培養(yǎng)物的范圍內(nèi)。
5.前述權(quán)利要求中任一項的方法,其中該pH值通過使用HCl/HAc調(diào)整到低于或等于3,或通過使用甲酸調(diào)整到低于或等于4。
6.前述權(quán)利要求中任一項的方法,其中該磁性載體為磁性顏料或磁性聚苯乙烯珠,特別是具有NH2-、COOH-或OH-表面的磁性聚苯乙烯珠。
7.前述權(quán)利要求中任一項的方法,其中該被純化的細菌為大腸桿菌(E.coli)、芽孢桿菌(Bacillus spec)、變形菌(Proteus spec)、微球菌(Micrococcus spec)、葡萄球菌(Staphylococcus spec)或檸檬酸桿菌(Citrobacter spec)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用陽離子或陰離子聚合物和磁性載體非特異性富集細菌細胞的方法。
文檔編號C12N1/20GK1568367SQ02819980
公開日2005年1月19日 申請日期2002年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月9日
發(fā)明者沙賓·迪樂, 雷瑞特·格拉貝爾, 史特方·米勒, 英格麗·羅伯, 邁可·修斯, 湯瑪斯·詹德 申請人:普羅佛斯公司
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