專利名稱：2型糖尿病蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷和預(yù)測糖尿病相關(guān)疾病易感性的方法以及用于治療這些疾病的藥物組合物。
背景技術(shù)：
臨床上糖尿病分為胰島素依賴型和胰島素非依賴型糖尿病[分別為IDDM(1型)和NIDDM(2型)]。這兩類疾病具有許多不同的特征。
1型糖尿患者有很嚴(yán)重的胰島素缺陷，以至于不能維持很低水平的胰島素以正常防止脂肪分解和細(xì)胞生成。因此1型糖尿患者一般顯示出高水平的葡萄糖和低水平的胰島素。隨著該疾病的發(fā)展，胰島受損或被破壞，而胰島素生成越來越少。
2型糖尿病是一種常見并復(fù)雜的病癥，其源于胰島素分泌缺陷以及在周圍組織，例如骨骼肌肉(1)中胰島素敏感性受損(胰島素抗性)的聯(lián)合作用。2型糖尿病表現(xiàn)為在空腹和飽食后的高血糖癥，不同程度的高血胰島素癥和肥胖癥。盡管在過去的十年中對胰島素信號傳導(dǎo)通路上的蛋白質(zhì)進(jìn)行了徹底的研究，但是原代細(xì)胞的原因仍然不明。最近的研究報告顯示2型糖尿患者肌肉具有降低的氧化酶活性(2)，線粒體DNA的突變通過損傷氧化磷酸化導(dǎo)致2型糖尿病(3，4)，加劇了該疾病在分子水平上的復(fù)雜性。
現(xiàn)行的治療方法包括食物控制、服用磺酰脲以提高胰島素分泌、服用胰島素本身以及服用縮二胍以降低胰島素抗性。由于縮二胍有毒、而磺酰脲對那些胰島功能嚴(yán)重受損的患者沒有效果，而且治療十年后50％的患者產(chǎn)生抗性，因此，有必要研制一種新型的抗糖尿病藥物。
為了確定糖尿病的易感性，已經(jīng)采用許多策略。在專利WO 00/66762中(在此引為參考文獻(xiàn))，其中糖尿病可能涉及線粒體ATP合酶基因8/6序列中的特異性突變。另外，專利WO 00/66782和WO 98/17862描述了一種通過在ATP合酶基因序列中尋找突變來診斷糖尿病的方法。
盡管已有人提出了幾種策略來確定糖尿病的易感性，但是沒有一種被證明是成功的。本發(fā)明旨在提供一種方法來確定糖尿病的易感性。
發(fā)明概述本發(fā)明發(fā)明了一種通過測量樣品中蛋白質(zhì)的水平來診斷和確定至少一種與糖尿病相關(guān)的疾病的方法。本發(fā)明基于這樣的意外的實(shí)驗(yàn)事實(shí)在2型糖尿病中有15種蛋白質(zhì)被上調(diào)或下調(diào)。這些蛋白質(zhì)中(作為2型糖尿病的標(biāo)記)有11種已被質(zhì)譜鑒定。在這11種蛋白質(zhì)的表達(dá)中所觀察到的變化與在胰島素抗性個體中出現(xiàn)的細(xì)胞壓力和骨骼肌線粒體的代謝中干擾的增長是一致的(2)。被鑒定的大部分蛋白質(zhì)是磷蛋白或涉及細(xì)胞中磷酸代謝的蛋白質(zhì)。最有趣的是，本發(fā)明人表明ATP合酶的β亞基是磷酸化的，并且發(fā)現(xiàn)β亞基的磷酸化同工型的表達(dá)量減少并同空腹糖尿患者肌肉血漿中的葡萄糖水平負(fù)相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明ATP合酶的β亞基的磷酸化在調(diào)節(jié)ATP的合成中起作用，該蛋白質(zhì)以及細(xì)胞壓力蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)的變化可能有助于2型糖尿病的發(fā)病。
關(guān)于治療糖尿病的方法，單個蛋白質(zhì)或一組蛋白質(zhì)均可作為治療的靶點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明可以改變作為靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平(如上升或下降)或干涉這些蛋白質(zhì)本身而防止或延遲人的糖尿病相關(guān)疾病的發(fā)作。這可通過施用如，蛋白質(zhì)標(biāo)記物、編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)的核酸序列(或互補(bǔ)序列或其部分)、標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體、能與蛋白質(zhì)標(biāo)記物結(jié)合的核酸片段，和/或能與標(biāo)記蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物而得以實(shí)現(xiàn)。影響標(biāo)記物轉(zhuǎn)錄或影響標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄后修飾的化合物，尤其是影響標(biāo)記物活性(磷酸化狀態(tài))的化合物應(yīng)該也是明顯的藥物備選物。
本發(fā)明的詳細(xì)公開本發(fā)明涉及基本純的多肽，其包含至少一種選自下列的氨基酸序列(a)ATP合酶β亞基或磷酸化的ATP合酶β亞基的同工型；(b)磷酸葡萄糖變位酶1；(c)熱休克蛋白90β；(d)肌酸激酶β亞基；(e)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2；(f)膠原蛋白α1(VI)鏈；(g)78KDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白；(h)由表3所公布的特性定義的標(biāo)記蛋白質(zhì)(匹配號199，303，391，或511)；(i)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中的任何一種多肽或其部分有優(yōu)選至少70％同源性(如至少80％、至少90％、至少95％)的類似物；和(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)中的氨基酸序列的衍生物、前體、類似物或修飾物。
ATP合酶β亞基是核編碼蛋白質(zhì)，該亞基位于ATP合酶的催化部分(在F1部分內(nèi))，與ATP合酶的6/8亞基相反，后者為線粒體編碼蛋白質(zhì)，位于ATP合酶無催化活性的跨膜部分(在F0部分內(nèi))。
這些多肽(包括它們的磷酸化同工型)可用作藥物治療如至少一種糖尿病相關(guān)疾病，優(yōu)選2型糖尿病。
本發(fā)明還涉及用于治療至少一種糖尿病相關(guān)疾病(優(yōu)選為2型糖尿病)的藥物組合物，其含有至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽或其模擬物(mimetic)或抗模擬物(antimimetic)。根據(jù)本發(fā)明，其它的藥物組合物含有(a)至少一種物質(zhì)，其能夠調(diào)節(jié)編碼至少部分根據(jù)本發(fā)明的多肽的核酸片段的表達(dá)；和/或(b)至少一種所述多肽；和/或(c)所述多肽或其修飾產(chǎn)物的至少一種抗體；和/或(d)至少一種核酸序列，能雜交編碼所述多肽的核苷酸序列(包括其調(diào)節(jié)元件)或其互補(bǔ)鏈；和/或(e)至少一種化合物，如，核酸片段，能與所述多肽結(jié)合的；和/或(f)至少一種化合物，能修飾與該疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)的形式而使得其相對表達(dá)、活性和/或濃度向健康人的方向改變；和/或(g)至少一種能夠標(biāo)記至少一種所述蛋白質(zhì)的化合物，這些蛋白質(zhì)在該疾病中對于更快的更新或降解表達(dá)量相對太高；和/或(h)至少一種能夠標(biāo)記至少一種所述蛋白質(zhì)的化合物，這些蛋白質(zhì)在該疾病中相對表達(dá)量太低使得它們更新或降解得更慢。
(i)一種適體(aptamer)，能與所述蛋白質(zhì)或其結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合；和/或(j)一種適體，能夠優(yōu)先與所述蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)或活性位點(diǎn)結(jié)合。
該藥物組合物至少含有一種活性化合物，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多的不同的化合物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療糖尿病相關(guān)疾病的方法，防止所述疾病和/或延遲其在人體中的發(fā)作，該方法包含施用至少一種化合物，其選自(a)根據(jù)本發(fā)明的多肽；(b)編碼(a)中多肽的核苷酸序列；
(c)能與(a)中多肽結(jié)合的抗體；(d)能與編碼至少部分(a)中多肽的核酸或其互補(bǔ)鏈(包括其調(diào)節(jié)元件)雜交的核酸片段；(e)能與(a)中多肽結(jié)合的化合物；(f)能上調(diào)、下調(diào)根據(jù)本發(fā)明的至少一種多肽的表達(dá)、活性和/或濃度的化合物；(g)一種能修飾與該疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)的形式的化合物，使得其相對表達(dá)、活性和/或濃度向健康人中可見的方向改變；(h)至少一種能夠標(biāo)記(如用泛醌)至少一種所述蛋白質(zhì)的化合物，這些蛋白質(zhì)在該疾病中對于更快的更新或降解其表達(dá)量相對太高；(i)至少一種能夠標(biāo)記至少一種所述蛋白質(zhì)的化合物，這些蛋白質(zhì)在該疾病中對于更慢的更新或降解其表達(dá)量相對太低；對于所述人群，該治療應(yīng)優(yōu)選具有將標(biāo)記蛋白質(zhì)的水平恢復(fù)到在健康人群中可見的水平的效果。
在目前優(yōu)選的方案中，ATP合酶β亞基的磷酸化可調(diào)，如上調(diào)，因?yàn)槿藗兿嘈臕TP合酶β亞基的磷酸化可改變該酶的此種功能。這種磷酸化也可通過調(diào)節(jié)該激酶或調(diào)節(jié)使ATP合酶β亞基磷酸化或去磷酸化的磷酸酶而得以調(diào)節(jié)。
ATP合酶β亞基的表達(dá)由稱作PPARγ共活化物-1(PGC-1)的轉(zhuǎn)錄功能的“PPARγ的共活化因子”所調(diào)節(jié)。該活化因子因此可用作一種手段來上調(diào)ATP合酶β亞基。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，來診斷或確定人的至少一種糖尿病相關(guān)疾病(優(yōu)選2型糖尿病)的易感性，該方法包括確定取自于該人的生物學(xué)樣品中至少一種標(biāo)記蛋白質(zhì)的存在、活性、濃度和/或表達(dá)水平，而該標(biāo)記蛋白質(zhì)選自(a)ATP合酶β亞基或磷酸化的ATP合酶β亞基的同工型；(b)磷酸葡萄糖變位酶1；(c)熱休克蛋白90β；(d)肌酸激酶β亞基；
(e)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2；(f)膠原蛋白α1(VI)鏈；(g)78KDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白；(h)由表3公布的特性定義的一種標(biāo)記蛋白質(zhì)(匹配號199，303，391，或511)；(i)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任何一種多肽或其部分優(yōu)選有至少70％同源性的類似物；和(j)(a)到(i)中氨基酸序列的衍生物、前體、類似物或修飾物。
隨意地將所述蛋白質(zhì)的存在、活性、濃度和/或表達(dá)水平同取自于至少一位正常人(也就是不患有所討論的該疾病)生物學(xué)樣品的所述蛋白質(zhì)的存在、活性、濃度和/或表達(dá)水平進(jìn)行比較。
該方法優(yōu)選地包含(A)確定取自該人的生物學(xué)樣品中至少一種標(biāo)記蛋白質(zhì)增高的表達(dá)、修飾、活性和/或濃度，該標(biāo)記蛋白質(zhì)選自(a)磷酸葡萄糖變位酶1；(b)熱休克蛋白90β；(c)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2上調(diào)同工型；(d)膠原蛋白α1(VI)鏈；(e)78KDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白；(f)由表3公布特性定義的一種標(biāo)記蛋白質(zhì)(匹配號303或511)；(g)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中任何一種多肽或其部分優(yōu)選有至少70％同源性的類似物；和(h)(a)到(f)中氨基酸序列的衍生物、類似物或修飾物；和/或(B)確定取自該人的一種生物學(xué)樣品中至少一種標(biāo)記蛋白質(zhì)(一種下調(diào)的標(biāo)記蛋白質(zhì))降低的表達(dá)、修飾、活性和/或濃度，該標(biāo)記蛋白質(zhì)選自(a)ATP合酶β亞基或其磷酸化同工型；
(b)肌酸激酶β亞基；(c)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2下調(diào)同工型；(d)由表3公布特性定義的一種標(biāo)記蛋白質(zhì)(匹配號199或391)；(e)與(a)、(b)、(c)或(d)中任何一種多肽或其部分優(yōu)選有至少70％同源性的類似物；(f)(a)、(b)、(c)或(d)中氨基酸序列的衍生物、類似物或修飾物。
增高或降低的表達(dá)、修飾、活性和/或濃度相對于取自于正常人的生物學(xué)樣品可得值。該生物學(xué)樣品選自尿、血液、淋巴液、唾液和組織，優(yōu)選肌肉組織，如股外側(cè)肌。由于確定一種蛋白質(zhì)是上調(diào)或下調(diào)是糖尿病相關(guān)疾病易感性的有效標(biāo)記，本發(fā)明也涉及一種方法用于診斷或確定人的至少一種糖尿病相關(guān)疾病(優(yōu)選2型糖尿病)的易感性，該方法包含確定患有糖尿病相關(guān)疾病個體的樣品中至少一種標(biāo)記蛋白質(zhì)(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)的存在、活性、修飾、濃度和/或表達(dá)水平，其以比正常人更低或更高的量存在。可以理解為這樣的標(biāo)記蛋白質(zhì)可選自，由其肽段和/或凝膠位置(亦即，無特異基因與其相關(guān)聯(lián)的位置，可能由于該基因還未被鑒定)鑒定出的標(biāo)記蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用實(shí)施例公開的方法能鑒定出其它的標(biāo)記蛋白質(zhì)。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，確定試劑在治療糖尿病相關(guān)疾病中具有治療功效的可能性，其包含確定將測試模型暴露于所述試劑之前和之后根據(jù)本發(fā)明的一種或更多多肽的表達(dá)水平以及比較所述水平。
另外，本發(fā)明涉及一種方法以確定化合物在治療糖尿病相關(guān)疾病中的作用，其中包含確定根據(jù)本發(fā)明的一種或更多多肽(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)的表達(dá)水平。特別是，這種方法可用來評價化合物在治療糖尿病相關(guān)疾病中的作用，其中包括確定將測試模型暴露于所述試劑接之前和之后，一種或更多標(biāo)記蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
一種目前優(yōu)選的用于確定物質(zhì)在治療糖尿病相關(guān)疾病中的作用的方法，包括使用經(jīng)確定(例如通過使用根據(jù)本發(fā)明的方法)對患該病有很大(如遺傳學(xué)上的)可能性或易感性的哺乳動物或該動物的一部分，該方法包括對所述哺乳動物或其部分施用該物質(zhì)并確定該物質(zhì)的作用，優(yōu)先通過確定對所述哺乳動物或其部分施用該物質(zhì)前后，根據(jù)本發(fā)明的一種或更多標(biāo)記蛋白質(zhì)的水平。
本發(fā)明還涉及一種方法來確定患有或易于患有所述疾病的人的糖尿病相關(guān)疾病的性質(zhì)或原因，其中包括確定根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記蛋白質(zhì)關(guān)于某種模型的表達(dá)水平。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種核酸片段，其中包括(A)編碼一種多肽的核酸序列或其調(diào)節(jié)元件，該多肽包含至少一種氨基酸序列，其選自(a)ATP合酶β亞基或磷酸化的ATP合酶β亞基的同工型；(b)磷酸葡萄糖變位酶1；(c)熱休克蛋白90β；(d)肌酸激酶β亞基；(e)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2；(f)膠原蛋白α1(VI)鏈；(g)78KDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白；(h)由表3公布特性定義的一種標(biāo)記蛋白質(zhì)(匹配號199，303，391，或511)；(i)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任何一種多肽或其部分優(yōu)選有至少70％同源性的類似物；和(j)(a)到(i)中氨基酸序列的衍生物、前體、類似物或修飾物；或(B)能與(A)中核酸序列、該核酸序列的調(diào)節(jié)元件或其互補(bǔ)鏈雜交的核酸片段。
這樣的一種核酸片段可用來檢測糖尿病相關(guān)疾病相關(guān)的標(biāo)記蛋白質(zhì)的存在或水平；用于檢測編碼所述標(biāo)記蛋白質(zhì)的核酸序列，例如作為一種探針或PCR的引物，或作為調(diào)節(jié)標(biāo)記蛋白質(zhì)表達(dá)或水平的藥物，例如在反義治療或基因治療。并且，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可將這樣一種序列整合到載體中并用于產(chǎn)生該多肽。當(dāng)然，這些蛋白質(zhì)可由其它方法生產(chǎn)，例如利用固相合成或從自然資源如組織中純化獲得。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及能與根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記蛋白質(zhì)(或它的修飾產(chǎn)物)結(jié)合的抗體。該抗體可為多克隆或單克隆。獲得這樣抗體的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。一種根據(jù)本發(fā)明的抗體可用于檢測與糖尿病相關(guān)疾病相關(guān)的標(biāo)記蛋白質(zhì)的存在或水平，它也可作為一種治療手段。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于在哺乳動物中診斷糖尿病相關(guān)疾病或其對所述疾病(例如在遺傳學(xué)上)的易感性的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括(A)至少一種結(jié)合手段，其特異性地結(jié)合至少一種根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記蛋白質(zhì)，例如i)所述標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體；ii)能與所述標(biāo)記蛋白質(zhì)結(jié)合的核酸片段；和/或iii)能與所述標(biāo)記蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物(如抗模擬物)；(B)至少一種用于檢測所述手段與至少一種標(biāo)記蛋白質(zhì)結(jié)合，如果有的話，或結(jié)合水平；并且，如果必要的話，(C)至少一種將與所述結(jié)合手段的結(jié)合或結(jié)合水平(若有的話)是否標(biāo)記個體哺乳動物具有患該病的高度可能性或(遺傳學(xué)上)易感性相關(guān)聯(lián)的手段。
同時，本發(fā)明涉及用于確定物質(zhì)在治療糖尿病相關(guān)疾病中的作用的方法，該方法包含使用經(jīng)確定很大可能性患該病或有(如遺傳學(xué)上的)易感性的哺乳動物或該動物的一部分(例如使用權(quán)利要求1中的方法)，該方法還包括對所述哺乳動物或其部分施用該物質(zhì)并確定該物質(zhì)的作用，優(yōu)先通過確定對所述哺乳動物或其部分施用該物質(zhì)前后，根據(jù)本發(fā)明的一種或更多標(biāo)記蛋白質(zhì)(例如1、2、3、4、5、6或更多)的水平。
值得注意的是，確定不止一種標(biāo)記物的任何組合將使得這種分析結(jié)果成為糖尿病相關(guān)疾病的更可信的指標(biāo)。因此，一種用于診斷或確定至少一種糖尿病相關(guān)疾病易感性的方法包括優(yōu)選確定兩種標(biāo)記物組合的存在、活性、修飾、濃度和/或表達(dá)水平，而更優(yōu)選確定三種或更多標(biāo)記物(例如4、5、6或更多標(biāo)記物)。與此類似，我們建議采用多于一種的根據(jù)本發(fā)明的化合物(2、3、4、5、6或更多化合物)進(jìn)行治療(例如，超過一種化合物選自根據(jù)本發(fā)明的多肽、核酸片段或抗體)，所述組合的化合物能夠超過一種標(biāo)記蛋白質(zhì)水平而將對于該疾病的治療更為有效。
術(shù)語“糖尿病相關(guān)疾病”被理解成最廣義范圍內(nèi)的任何與糖尿病相關(guān)的疾病，包括糖尿病并發(fā)癥以及該代謝性綜合病癥(在糖尿病發(fā)作前)。與2型糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥病例為視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病、腎病、大血管病變、胰島素抗性、高脂血、高血壓以及肥胖癥。這種代謝性綜合病癥的病例包括肥胖癥、dyslipidemia、葡萄糖不耐受高血壓以及其它心血管性疾病。
術(shù)語“多肽”在本發(fā)明中有其通常的含義。那就是任何長度的一條氨基酸鏈，包括全長蛋白質(zhì)、寡肽、短肽及其片段，其中這些氨基酸殘基由共價肽鍵連接在一起。術(shù)語“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”以及“蛋白質(zhì)”可交替使用。
該多肽可通過磷酸化、硫酸化、糖基化或任何其它形式的修飾，或通過添加任意形式的脂類或脂肪酸、泛素或任何其它的大型側(cè)鏈基團(tuán)或通過含有額外的氨基酸如一種信號肽來進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)修飾。并且，該多肽可被切割(如通過處理其N末端或C末端或者剪切以除去其內(nèi)部序列)。
每個多肽因此可被特異性氨基酸序列所表征并被特異性核酸序列所編碼。應(yīng)當(dāng)理解，這樣的序列包括由重組或合成方法所生產(chǎn)的類似物和突變體，其中這樣的多肽序列通過取代、插入、添加或刪除一種或更多重組多肽中的氨基酸殘基而被修飾并且這些多肽在本文描述的任何生物測定中仍具有免疫原性。取代物優(yōu)選為保守的。保守取代物為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。優(yōu)選，屬于同種類型[非極性氨基酸(G、A、P、I、L和V)，極性不帶電荷氨基酸(C、S、T、M、N和Q)，極性帶電荷氨基酸(D、E、K和R)和芳香族氨基酸(H、F、W和Y)。在每一類型中，氨基酸可互相替代，但是其它取代當(dāng)然是可能的。
每個多肽被特定的核酸序列所編碼。應(yīng)當(dāng)理解，這樣的序列包括其類似物及突變體，其中這樣的核酸序列通過取代、插入、添加或刪除一種或更多核酸殘基[包括插入一種或更多內(nèi)含子(小的或大的)]而得到修飾。取代物優(yōu)選為編碼子使用中的沉默取代物，其不會導(dǎo)致氨基酸序列的任何改變，但可被引入以提高該蛋白質(zhì)的表達(dá)。
在本文中，術(shù)語“基本純的多肽片段”指的是一種質(zhì)量上至多含有5％其它與其天然相關(guān)的多肽物質(zhì)的多肽制劑(優(yōu)選其它多肽的低百分含量，例如至多4％，至多3％，至多2％，至多1％，至多0.5％)。優(yōu)選至少96％純度的基本純的多肽，也就是說，該多肽至少占制劑中總蛋白質(zhì)的96％，并且優(yōu)選該多肽的高百分含量，如至少97％，至少98％，至少99％，至少99.25％，至少99.5％，至少99.75％。尤其優(yōu)選“基本純”的多肽片段，也就是該多肽片段基本上不含有其它任何與其天然相關(guān)的蛋白質(zhì)，即不含有來自一種哺乳動物的任何其它蛋白質(zhì)。本發(fā)明多肽的制備可以借助本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的在宿主細(xì)胞中重組的方法得以實(shí)現(xiàn)，或者通過眾所周知的固相或液相多肽合成法合成，例如通過Merrifield描述的方法(Merrifield，R.B.Fed.Proc.am.Soc.Ex.Biol.21412，確良1962和J.Am.Chem.Soc.852149，1963)或者其衍生方法或從電泳凝膠中回收。
本發(fā)明也包含所述多肽的同工型、衍生物、前體、截短物(如成熟型)、類似物以及模擬物。優(yōu)選的這樣同工型、衍生物、前體、類似物以及模擬物具有相同的活性，例如與其前體多肽相同的酶活性。這種同工型、衍生物、前體、類似物或模擬物可能比其前體多肽具有較低水平活性、相同水平或優(yōu)選具有更高水平的活性。
術(shù)語“同工型”指相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)的家族(亦即同種蛋白質(zhì)的多種形式)，這些蛋白質(zhì)在氨基酸序列上略有不同。它們能由不同基因產(chǎn)生或由相同基因RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)不同剪切所產(chǎn)生。因此，術(shù)語“同工型”包含由可變序列間隔的同源的氨基酸殘基序列。另外，術(shù)語“同工型”包含一種經(jīng)翻譯后修飾處理的蛋白質(zhì)形式，如磷酸化(磷酸-同工型)。
“多肽模擬物”是一種能夠模擬多肽生物活性的分子但其在化學(xué)本質(zhì)上不再是肽。嚴(yán)格的定義是多肽模擬物是不含有任何肽鍵(即氨基酸殘基之間的酰胺鍵)的分子。然而，術(shù)語“多肽模擬物”有時也被用于描述在本質(zhì)上不完全是肽的分子，如假肽，半肽和肽類似物。無論是完全或部分非多肽分子，本發(fā)明的多肽模擬物提供了有反應(yīng)活性的空間排列，其同多肽的活性基團(tuán)的三維排列極其相似(多肽模擬物構(gòu)建的基礎(chǔ))。由于具有這種相似的活性位點(diǎn)立體結(jié)構(gòu)，多肽模擬物對生物系統(tǒng)的作用同多肽的生物活性很相似。
本發(fā)明包括多肽模擬物成分——具有同本發(fā)明多肽類似的有生物活性的類似物，即多肽模擬物可被用于治療糖尿病相關(guān)疾病。本發(fā)明優(yōu)選的多肽模擬物本質(zhì)上同多肽在三維結(jié)構(gòu)和生物活性上相似，或同上文提及的活性位點(diǎn)相似。
或者，多肽模擬物也可以是“抗模擬物”，換句話說，它適合并能夠封阻蛋白質(zhì)的活性，或者與結(jié)合位點(diǎn)或同其它生物分子相互作用的位點(diǎn)結(jié)合并以此來干擾該蛋白的功能。當(dāng)前大多數(shù)的藥物都屬于這種類型。本發(fā)明包括這種能夠與本發(fā)明的多肽相互作用的抗模擬物。
“適體”是一種在體外被選擇用于優(yōu)先與另外一種化合物(這種情況下指的是被識別的蛋白質(zhì))結(jié)合的化合物。經(jīng)常，適體是核酸或肽，因?yàn)閺暮怂峄虬被嶂?包括天然存在或合成的)可立即產(chǎn)生很大數(shù)量的隨機(jī)序列，當(dāng)然并不限于此。
使用給定肽的模擬物而非該肽本身具有很明顯的優(yōu)勢，因?yàn)殡耐ǔ３尸F(xiàn)出兩種不符合要求的特點(diǎn)(1)生物利用度很低；并且(2)作用持續(xù)時間短。肽模擬物提供一種明顯的繞過這兩種主要缺陷的路徑，因?yàn)檫@些相關(guān)分子足夠小以至于既有口服活性又有很長的持續(xù)作用時間。這種做法還能夠節(jié)約開支并改善患者對肽模擬物的順應(yīng)性，因?yàn)樗鼈兡軌蚩诜皇悄c胃外或跨粘膜給藥。另外，生產(chǎn)肽模擬物要比肽便宜得多。最后，與肽相關(guān)的穩(wěn)定性、貯存及免疫反應(yīng)方面的問題在肽模擬物中尚未見到。
因此，所述肽可以用來研制具有相似生物活性并因此具有相似治療功效的所述小化合物。這些研制肽模擬物的技術(shù)是傳統(tǒng)技術(shù)。因此，肽鍵可被非肽鍵所取代進(jìn)而使得肽模擬物具有一種與原初肽相似的結(jié)構(gòu)并因此具有其生物活性。另外，也可以通過用其它具有相似結(jié)構(gòu)的化學(xué)基團(tuán)來取代氨基酸的化學(xué)基團(tuán)對其進(jìn)行修飾。通過NMR波譜學(xué)、結(jié)晶學(xué)和/或計(jì)算機(jī)輔助分子建模方法確定原初肽的三維結(jié)構(gòu)可以幫助研制肽模擬物。這些新技術(shù)幫助研制比原初肽更高效和/或更高生物利用度和/或更穩(wěn)定的新成分[Dean(1994)，BioEssays，16683-687；Cohenand Shatzmiller(1993)，J.Mol.Graph.11166-173；Wiley and Rich(1993)，Med.Res.Rev.，13327-384；Moore(1994)，TrendsPharmacol.Sci.，15124-129；Hruby(1993)，Biopolymers，331073-1082；Bugg et al.(1993)，Sci.Am.，26992-98，在此均被引為參考文獻(xiàn)]。一旦一種潛在的肽模擬化合物鑒定出來，即可將其合成并使用本文所描述的診斷分析法或適合的抑制劑分析法來評定其活性[見Finlay et al.(1983)，Cell，571083-1093 and Fujiwara etal.(1993)，Cancer Res.，534129-4133，在此均被引為參考文獻(xiàn)]。
因此，利用上述方法，本發(fā)明提供了比上述多肽治療活性更高的化合物。本發(fā)明包括利用上述方法獲得的肽模擬化合物，其具有上述指定肽的生物活性及其相似的三維結(jié)構(gòu)。以下事實(shí)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知肽模擬物可以產(chǎn)自前述修飾過的任何一種肽或者產(chǎn)自具有超過一種修飾位點(diǎn)的肽。除了其治療功效外，本發(fā)明的肽模擬物還可用來研制更有效的非肽化合物。
術(shù)語“核酸片段”和“核酸序列”指的是包括DNA、RNA、LNA(鎖定的核酸分子)、PNA、dsRNA和RNA-DNA雜合子的任何核酸分子。另外還包括含有非天然核苷的核酸分子。該術(shù)語包括任意長度的核酸分子(根據(jù)用途不同，長度為10-10000核苷酸)。當(dāng)該核酸分子用作藥物如DNA治療或用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的多肽的方法中時，優(yōu)選使用一種編碼至少該多肽部分的分子(長度約為18-1000核苷酸)，該分子可選地插入一種載體中。當(dāng)所述核酸分子作為一種探針、引物或在反義治療中使用時，優(yōu)選使用一種長度為10-100個核苷酸的分子。根據(jù)本發(fā)明，其它長度的分子也可以使用，例如一種具有至少12、15、21、25、27、30、33、36、39、42、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或1000核苷酸(或核苷酸衍生物)的分子，或一種至多具有10000、5000、4000、3000、2000、1000、700、500、400、300、200、100、50、40、30或20核苷酸(或核苷酸衍生物)的分子。應(yīng)該清楚，這些數(shù)字可以任意組合以產(chǎn)生范圍。
作為本領(lǐng)域的定義，術(shù)語“嚴(yán)緊”與雜交條件聯(lián)合使用，也就是雜交是在不超過核酸片段熔點(diǎn)(Tm)以下15-20℃進(jìn)行的，參照Samrooket al Molecular Cloning；A Laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratories，NY，1989，pages 11.45-11.49.優(yōu)選條件為高度嚴(yán)緊的，也就是核酸片段熔點(diǎn)(Tm)以下5-10℃。
在該說明書中除非另外要求，術(shù)語“包含”或它的時態(tài)、語態(tài)變指是包括所述元件或整體或者是一組元件或整體但并不排除任何其它元件或整體或者元件組或整體組。
術(shù)語“序列同一性”意指相同長度的兩個氨基酸序列或者核酸序列之間同源程度的定量測量。如果要比較的兩個序列長度不同，它們一定以帶有缺口的插入或者切斷蛋白質(zhì)序列末端的方式排列成最可能的匹配。序列同一性可用公式----計(jì)算，其中Ndif為兩個序列比對時其中非同一殘基的總數(shù)，而Nref為其中一種序列的殘基數(shù)。因此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC之間有著75％的序列同一性(Ndif＝2，而Nref＝8)。缺口被當(dāng)作特異性序列中的非同一殘基，也就是DNA序列AGTGTC與序列AGTCAGTC之間有著75％的序列同一性(Ndif＝2，而Nref＝8)。序列同一性也可利用BLAST程序如BLASTP程序(Person W.R和D.J.Lipman(1988)PNAS USA 852444-2448)(www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)進(jìn)行計(jì)算。本發(fā)明的一方面，可用帶有設(shè)定參數(shù)的序列比對方法ClustalW進(jìn)行比對，參見Thompson J.，等人Necleic Acids Res 1994 224673-4680，http//www2.ebi.ac.uk/Clustalw。
優(yōu)選序列同一性的最小百分率是至少70％，如是至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％。
本發(fā)明也涉及使用本發(fā)明的多肽或核酸作為治療疫苗，參見文獻(xiàn)Lowry，D.B.等人1999，Nature 400269-71。
在免疫效價評定中能夠同本發(fā)明的一種多肽特異性相互作用的單克隆或多克隆抗體，或者所述抗體的特異性結(jié)合片段也是本發(fā)明的一部分。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法來生產(chǎn)抗體。例如，多克隆抗體可以在哺乳動物中制備，通過注射一次或多次根據(jù)本發(fā)明的一種多肽，并且如果需要，還應(yīng)注射佐劑。根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體可以利用Kohler和Milstein在Nature，256495(1975)首次描述的雜交瘤方法或美國專利NO.4,816,567中描述的重組DNA方法生產(chǎn)。例如，利用McCafferty等人在Nature，348552-554(1990)中描述的技術(shù)也可以從噬菌體文庫中分離出單克隆抗體。文獻(xiàn)中描述了生產(chǎn)抗體的方法，例如美國專利6136958。
在診斷學(xué)上，抗體、核酸片段和/或本發(fā)明的多肽可單獨(dú)使用，亦可作為組合物中的成分。這樣的組合物為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，并且其組分中抗體、核酸片段或本發(fā)明的多肽能與至少一種其它的分子如一種標(biāo)記物(例如放射性或熒光標(biāo)記)或一種載體分子結(jié)合，優(yōu)選共價連接。
本發(fā)明還提供方法來利用所述化合物治療和/或預(yù)防患有糖尿病相關(guān)疾病的患者。
本發(fā)明的方法包括下列步驟a)在適合的藥物載體中整合一種或更多本發(fā)明的化合物；b)以治療有效量或預(yù)防有效量對患者施用該化合物或整合進(jìn)載體的該化合物。
術(shù)語“適合的藥物載體”指的是為制藥領(lǐng)域所熟知、用于將化合物給患者施用的任意載體。根據(jù)本發(fā)明，只要不產(chǎn)生相容性問題，任何適合的藥物載體都可使用。
可通過胃腸外注射施用有效劑量給患者，例如靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、肌肉內(nèi)或動脈內(nèi)注射。這些化合物也可口服或皮下給藥，或者利用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何其它手段如借助于吸入器或鼻腔噴霧器?？诜钱?dāng)前優(yōu)選的給藥方式。
就像這里所使用的一樣，術(shù)語“治療有效量”指的是治療患者所需的一種或更多本發(fā)明中化合物的數(shù)量。這樣的治療適于被診斷為患有糖尿病相關(guān)疾病的患者。同樣地，術(shù)語“預(yù)防有效量”指的是預(yù)防性處理患者所需的一種或更多本發(fā)明中化合物的數(shù)量。例如，這樣的治療適于還沒有被確診具有糖尿病相關(guān)疾病任何臨床癥狀的對象。早日確定受試者有患上糖尿病相關(guān)疾病的危險可能有利于盡快開始預(yù)防治療，例如，通過改變標(biāo)記物的水平來確定糖尿病易感性。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會了解，一種給定化合物的劑量，給藥路徑及治療持續(xù)時間不僅依賴于化合物類型及其在治療該疾病中的效果，還依賴于被治療個體的情況，患者體重、用于治療患者的其它治療方法和患者的情況、臨床反應(yīng)和耐受力等這些因素都要考慮進(jìn)去。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過評定這些和其它相關(guān)因素可確定治療劑量、給藥以及持續(xù)時間。
確定肌肉組織切片樣品(取自易患遺傳性2型糖尿病的受試者)中2型糖尿病基本標(biāo)記物的水平可用于確定是否需要干涉，以通過醫(yī)學(xué)治療、節(jié)食指導(dǎo)、身體鍛煉等形式來防止2型糖尿病或治療前糖尿病狀態(tài)。如果所述ATP合酶β亞基磷酸化同工型下調(diào)的水平低于二維電泳圖(pH范圍4-7的IPG膠，其制備如上所述)上蛋白質(zhì)相關(guān)的IOD總量的0.5％，則患2型糖尿病或前糖尿病狀態(tài)的可能性高于85％。與此類似，如果肌酸激酶β亞基的水平低于二維電泳圖上0.25％IOD，則患2型糖尿病或前糖尿病狀態(tài)的可能性高于80％。而如果2型糖尿病的標(biāo)記物表達(dá)水平均低于這些水平，則患2型糖尿病或前糖尿病狀態(tài)的可能性甚至更高。
能夠調(diào)節(jié)ATP合酶β亞基磷酸化和/或表達(dá)的物質(zhì)(激素、激酶、磷酸酶、小分子等)正在調(diào)查研究中。能夠以提高2型糖尿病相關(guān)生理參數(shù)如胰島素敏感性、葡萄糖吸收和血糖的方式調(diào)節(jié)ATP合酶β亞基磷酸化和/或表達(dá)的物質(zhì)可直接使用，然而具有相反效果的物質(zhì)可用于研制其抑制劑。我們的研究表明，磷酸化ATP合酶的激酶的治療性活化將改善ATP的合成，隨后改善胰島素敏感性、葡萄糖吸收和血糖水平。
圖表圖例

圖12型糖尿病骨骼肌中的標(biāo)記蛋白質(zhì)糖尿病人典型的骨骼肌二維電泳圖。利用IPG膠在一維分離蛋白質(zhì)斑點(diǎn)(pI4-7)并用銀染法顯色。其數(shù)量與2型糖尿病人肌肉中顯著上調(diào)(下面劃線的)或下調(diào)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)相符。這15個蛋白質(zhì)中有7個用MALDI-MS鑒定(表2)。
圖2人骨骼肌中ATP合酶β亞基(ATPsyn-β)的磷酸化。
圖2A骨骼肌二維電泳(銀染)和人骨骼肌細(xì)胞(成肌細(xì)胞)[32P]標(biāo)記的二維電泳的放大區(qū)比較顯示出全部4個同工型均為ATPsyn-β的磷酸化同工型。
圖2B在銀染膠上定位于ATPsyn-β(斑點(diǎn)180)右側(cè)的大斑點(diǎn)也被MALDI-TOF質(zhì)譜分析鑒定為ATPsyn-β的一種同工型。該ATPsyn-β同工型的MALDI肽質(zhì)譜圖顯示出了具有最可能的磷酸化位點(diǎn)在該肽的N末端為蘇氨酸的磷酸化肽的存在(具有80Da分子量差異的兩個峰)。
圖2C這個豐度更高的ATPsyn-β同工型序列覆蓋率為59％，并且在被測的45個肽中有29個與該蛋白質(zhì)(粗體字)相匹配。這個磷酸化肽的潛在磷酸化位點(diǎn)(用框標(biāo)記)是核苷酸結(jié)合區(qū)域內(nèi)的Thr213(下面劃線的)。
圖3所觀察到的2型糖尿病標(biāo)記蛋白質(zhì)在骨骼肌代謝中的潛在作用圖3A-3BATP合酶β亞基(ATPsyn-β)同工型表達(dá)的下調(diào)和DM2受試者空腹血糖水平的相關(guān)性(r＝-0.75；P＝0.020)，以及同對照受試者的空腹血漿FFA水平之間的相關(guān)性(r＝-0.81；P＝0.049)。
圖3C-3DDM2患者中肌酸激酶β的表達(dá)和空腹血糖水平(r＝-0.82；P＝0.007)以及下調(diào)的ATP合酶β亞基(ATPsyn-β)同工型的表達(dá)(r＝-0.71；P＝0.033)之間的相關(guān)性。
圖3E研究2型糖尿病標(biāo)記蛋白質(zhì)(灰色標(biāo)記)在骨骼肌代謝中推定的作用的建議方案。ATP合酶的F1部分含有3個催化功能的β亞基，并且呼吸鏈上的復(fù)合物IV等同于細(xì)胞色素C氧化酶。ROS，活性氧類；PKB，蛋白激酶B；eNOS，內(nèi)皮硝酸氧化物合酶；AMPK，AMP-活化的蛋白激酶；TCA循環(huán)，三羧酸循環(huán)；mtCK，線粒體肌酸激酶；GLUT4，葡萄糖轉(zhuǎn)輸?shù)鞍?；GS，糖原合酶；IR，胰島素受體；G-6-P，葡萄糖-6-磷酸和G-1-P，葡萄糖-1-磷酸。余下的縮寫在下文中解釋。
圖4在糖尿病患者肌肉中差異表達(dá)的2種不同的MRLC2同工型在DM2患者中斑點(diǎn)A是下調(diào)的，而斑點(diǎn)I是上調(diào)的。斑點(diǎn)A、B和C均被MALDI-MS鑒定為MRLC2的心室/心肌同工型(數(shù)據(jù)庫登錄號P10916)并可能代表不同的磷酸-同工型。斑點(diǎn)I、II和III均被鑒定為另一種MRLC2同工型(數(shù)據(jù)庫登錄號AAK52797)，并且它們可能也代表不同的磷酸-同工型。在這2種不同的MRLC2同工型之間只有72％同源性。
實(shí)驗(yàn)蛋白組(proteome)分析為研究成千上萬種蛋白質(zhì)以及它們的翻譯后修飾物提供了可能性，是2型糖尿病系統(tǒng)疾病研究中一種很有前途的技術(shù)(5)，高分辨率的蛋白組技術(shù)能夠有效地分離并能夠高成功率的鑒定蛋白質(zhì)。同mRNA表達(dá)分析相比，蛋白組分析為蛋白質(zhì)表達(dá)改變的量化以及翻譯后蛋白質(zhì)修飾(如磷酸化、甲基化和切割)的鑒定和定量提供了可能性。翻譯后修飾為蛋白質(zhì)的功能活化所必需，因此它可能具有致病研究方面的重要性。
本發(fā)明利用蛋白組分析選擇并鑒定糖尿病相關(guān)蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)就其本身而言，無論上調(diào)還是下調(diào)都是患有糖尿病的標(biāo)記。這些蛋白質(zhì)的調(diào)控方式也是糖尿病的標(biāo)記。這些蛋白質(zhì)可作為治療糖尿病的靶點(diǎn)或者用于治療該疾病。
因此，確定一種蛋白質(zhì)是否上調(diào)或下調(diào)是糖尿病易感性的有效指標(biāo)。上調(diào)及下調(diào)模式也是一種指標(biāo)。也就是說確定超過一種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，并且將一組蛋白質(zhì)的表達(dá)方式作為一種指標(biāo)。很明顯，鑒定的可信度隨著這組蛋白質(zhì)的數(shù)量增加而上升。
肌肉樣品肌肉樣品取自10個2型糖尿患者(糖尿病組)及10個健康受試者(對照組)。2型糖尿病患者(空腹C-肽600pmol/l，同時GAD65抗體陰性)僅僅通過飲食治療或聯(lián)合使用口服抗糖尿病藥物，這些措施在研究前2周停用。研究前要求受試者在48小時內(nèi)不進(jìn)行過度的體育鍛煉并空腹10個小時(過夜)。確定非糖尿患者的正常葡萄糖耐受，并利用所述方法確定血糖、FFA、血清胰島素及C-肽的濃度(26)。股外側(cè)肌的皮下針活組織檢查用一種活組織檢查槍來進(jìn)行，而肌肉樣品(～25mg)被立即吸去血液、脂肪和結(jié)締組織，并凍存于液氮中。該研究流程依照Helsinki說明進(jìn)行。
樣品制備凍存肌肉樣品在100μl冰冷的DNase/RNase緩沖液(含有20mmol/l Tris-HCl緩沖液pH7.5，含30mmol/lNaCl，5mmol/lCaCl2，5mmol/l MgCl2和25μg/ml RNaseA/DNase I(Worthington，F(xiàn)reehold，NJ))中勻漿化25min。勻漿后，樣品凍干過夜，然后不斷振蕩使之溶解在120μl裂解緩沖液(7M尿素(ICNBiomedicals)，2M硫脲(Fluka)，2％CHAPS，0.4％DTT(Sigma)，0.5％pharmalyte 3-10和0.5％pharmalyte 6-11(Amersham PharmaciaBiotech，Sweden))中。
蛋白質(zhì)和CPM確定樣品中的蛋白質(zhì)濃度通過Bradford方法確定，用上述裂解緩沖液將其調(diào)至適用。
二維電泳一維電泳在IPG4-7梯度膠(Amersham Pharmacia Biotech)中進(jìn)行。IPG4-7膠條的再水化緩沖液與用于樣品制備的裂解緩沖液成分相同，并且用帶膠(in-gel)再水化物上樣。每塊膠上樣400μg。在20℃，線性增加的壓力/時間條件下(0V-600V進(jìn)行215h；600V-3500V進(jìn)行1h；3500V進(jìn)行1330h)，于Multiphor II上進(jìn)行等電聚焦電泳，聚焦后，將膠條置于平衡緩沖液(6M尿素，2％SDS，30％甘油，50mMTris-HCl pH8.8，1％DTT)平衡2次15分鐘，在平衡步驟之間，將膠于-80℃凍存。使用Protean II Multi Cell 2-D電泳系統(tǒng)(Bio-Rad公司)以及實(shí)驗(yàn)室制備的單百分比膠(12.5％丙烯酰胺；丙烯酰胺N，N’-乙烯-雙丙烯酰胺＝200∶1)進(jìn)行第二維的SDS PAGE。于20℃，恒流電泳過夜。循環(huán)緩沖液以保持pH、溫度和鹽濃度恒定。
蛋白質(zhì)顯色和計(jì)算機(jī)分析二維電泳后，使用所述銀染法進(jìn)行蛋白質(zhì)顯色(29)。所有的凝膠圖象由同一人使用Bio Image computer program(version 6.1，B.I.System Corporation)進(jìn)行分析。測量每個蛋白質(zhì)的表達(dá)水平并表達(dá)為其整合的光密度百分比(％IOD)(目前正在討論的斑點(diǎn)范圍內(nèi)所有像素灰度水平值的總和占所有被檢測斑點(diǎn)范圍內(nèi)該值的百分比)。為了比較，本發(fā)明人使用對照組的6塊膠和糖尿病患者組的9塊膠(余下的膠顯示出蛋白質(zhì)在樣品制備過程中發(fā)生降解，因此不能使用)。每組圖象都被匹配和對比。計(jì)算每組中每個蛋白質(zhì)的斑點(diǎn)％IOD平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差并利用Student t-test進(jìn)行比較。以95％的顯著差異水平表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)被選擇用于進(jìn)一步分析。
蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定將目標(biāo)蛋白質(zhì)從膠中切下，帶膠消化后，用MALDI質(zhì)譜儀進(jìn)行分析(27，28，29)。使用胰蛋白酶自身溶解肽對質(zhì)譜進(jìn)行內(nèi)源性校準(zhǔn)，然后將質(zhì)量值輸入NCBI數(shù)據(jù)庫中利用Profound程序進(jìn)行搜索并使用FindPept和FindMod程序進(jìn)行進(jìn)一步分析(http//www.proteometrics.com)。用對每個程序所需少量修飾的下列屬性進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索所有種屬、不設(shè)分子量和蛋白質(zhì)等電點(diǎn)限制、胰蛋白酶消化、允許一次丟失的切割(one missed cleavage allowed)、丙烯酰胺修飾的半胱氨酸、和可能的甲硫氨酸氧化以及質(zhì)量誤差范圍(0.1-0.5Da)。當(dāng)至少5個肽與蛋白質(zhì)相匹配并且無序列重疊時，認(rèn)為該鑒定是陽性的。標(biāo)記的人成肌細(xì)胞按照前述方法培養(yǎng)人骨骼肌細(xì)胞(Hemmer等人，30)。在12孔平板上培養(yǎng)成肌細(xì)胞，在標(biāo)記實(shí)驗(yàn)前一天將細(xì)胞培養(yǎng)液換成含有5mM葡萄糖和補(bǔ)充有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。標(biāo)記前，將細(xì)胞置于含有0.2％牛血清白蛋白(BSA)的無血清DMEM培養(yǎng)液中孵育2.5h。人成肌細(xì)胞蛋白質(zhì)中的磷酸基團(tuán)的生物合成標(biāo)記通過在300μl補(bǔ)充有2mM L-谷氨酸(Life Technologies，Paisley，Scotland)、2％BSA以及300μCi[32P]-正磷酸鹽(Amersham Biosciences)的無血清、無磷酸DMEM培養(yǎng)基(ICN，Ohio)中孵育2.5h而完成。然后立即除去標(biāo)記培養(yǎng)液，在400μl上述裂解緩沖液中裂解細(xì)胞。使用所述TCA(三氯乙酸)沉淀法確定成肌細(xì)胞蛋白質(zhì)中[32P]-正磷酸鹽的摻入量(29)。按照所述方法進(jìn)行二維電泳，在膠上細(xì)胞裂解液的上樣體積相應(yīng)于4×105cpm。[32p]-標(biāo)記的成肌細(xì)胞的蛋白由將干膠對磷成像板暴光而顯像(AGFA)。
結(jié)果本發(fā)明者收集了分別取自于年齡、性別相匹配的對照組和2型糖尿病受試者(DM2)組的股外側(cè)肌組織切片，通過蛋白組分析比較吸收完畢(postabsorptive)狀態(tài)下靜止骨骼肌中體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)圖。
發(fā)明者通過二維凝膠電泳來分離肌肉中的蛋白質(zhì)并采用銀染法進(jìn)行染色觀察。發(fā)明者使用計(jì)算機(jī)成像分析法匹配并定量確定了每個凝膠圖像中的489個斑點(diǎn)。在兩組中共有15個統(tǒng)計(jì)學(xué)上表達(dá)水平不同的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)(圖1)。將這些2型糖尿病相關(guān)的標(biāo)記蛋白質(zhì)從二維凝膠中切割下來，隨后進(jìn)行凝膠胰蛋白酶消化，再利用基質(zhì)輔助激光解吸/離子化-飛行時間質(zhì)譜分析并進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索鑒定。其中11個點(diǎn)已經(jīng)被鑒定了；3種為代謝酶、兩種為伴侶蛋白、以及兩種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的同工型(表2)。
2型糖尿病受試者中磷酸葡萄糖變位酶1(PGM-1)顯著上調(diào)。磷酸葡萄糖變位酶(PGM1)是一種糖分解酶，在糖原代謝中有著非常重要的地位。
發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病受試者肌肉中的熱休克蛋白90β(HSP90β)表達(dá)水平也顯著上調(diào)(表2)。糖尿病患者肌肉中HSP90β表達(dá)上升這種類型的壓力目前仍是未知的。
2型糖尿病受試者肌肉中的肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2(MRLC2)的一種同工型顯著下調(diào)，而其另一種同工型卻顯著上調(diào)(表2)。目前肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2(MRLC2)在骨骼肌中的功能還只是部分被了解。因此，MRLC2同工型表達(dá)上的這些變化所具有的潛在含義目前還不清楚。
下調(diào)的MRLC2同工型已經(jīng)被鑒定為MRLC2的心室/心肌中的同工型(數(shù)據(jù)庫登錄號為P10916)，而上調(diào)的MRLC2同工型已經(jīng)被鑒定為另一種同工型，其數(shù)據(jù)庫登錄號為AAK52797。這兩個同工型之間的同源性僅為72％。
肌酸激酶B(CK-B)在2型糖尿病受試者中顯著下調(diào)(表2)。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)糖尿患者肌肉中的血糖水平和肌酸激酶B(CK-B)的水平呈負(fù)相關(guān)(圖3C)，這暗示著后者在高血糖癥患者的糖酵解中發(fā)揮作用。另外，發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)在2型糖尿患者肌肉中肌酸激酶B(CK-B)和下調(diào)的ATPsyn-β磷酸化同工型(圖3D)之間存在著正相關(guān)的關(guān)系。
在2型糖尿患者中，被鑒定為ATP合酶β亞基(ATPsyn-β)的斑點(diǎn)顯著下調(diào)(表2)，并且分子量相同但是等電點(diǎn)不同的四個斑點(diǎn)同時出現(xiàn)下調(diào)，這表明該蛋白質(zhì)具有不同電荷的突變體(圖2A)。為了進(jìn)一步鑒定ATP合酶β亞基的修飾產(chǎn)物，我們對[32P]標(biāo)記的人骨骼肌細(xì)胞(成肌細(xì)胞)進(jìn)行了二維電泳分析。二維電泳圖顯示事實(shí)上所有四種ATPsyn-β的同工型都是磷酸化同工型(圖2A)，并且假定的非修飾突變體在銀染檢測限之下。對ATPsyn-β三種最基本磷酸化同工型經(jīng)胰蛋白酶消化后所生成的磷酸化肽(包括下調(diào)的ATPsyn-β斑點(diǎn)第180號)進(jìn)行MALDI-MS分析以及數(shù)據(jù)庫搜索，結(jié)果清晰地表明磷酸化的殘基最可能位于ATPsyn-β核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域上Thr213位置處(圖2B-C)。酪氨酸的硫酸化可以產(chǎn)生與磷酸化相同的二維電泳圖像并引起相同的多肽質(zhì)量增加(80Da)。然而，使用酪氨酸上硫酸化位點(diǎn)(31，32)的一致特征，這樣的位點(diǎn)并不包括在ATPsynβ序列中。標(biāo)記的所有4種ATPsyn-β同工型和質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明ATPsyn-β是受多位點(diǎn)磷酸化調(diào)控的，當(dāng)前數(shù)據(jù)顯示人F1-ATP合酶的催化性β亞基在骨骼肌中受磷酸化調(diào)節(jié)，但是在2型糖尿患者中這種調(diào)節(jié)方式可能改變了。
而且，分子量為78kDA的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(GRP78)在2型糖尿患者肌肉組織中的表達(dá)水平也顯著上調(diào)。我們觀察到2型糖尿病受試者體內(nèi)GRP78表達(dá)水平顯著上升，并且在三種已鑒定的同工型中只有最基本(非磷酸化)和最具活性的同工型顯著上調(diào)。
四個斑點(diǎn)，均被假定為IV型膠原蛋白α-1鏈[α1(IV)膠原蛋白]的同工型，表明這個蛋白質(zhì)及其同工型在2型糖尿患者中均顯著上調(diào)。
在對照受試者中本發(fā)明者觀察到了在ATPsyn-β磷酸化的同工型表達(dá)水平的下調(diào)和空腹血漿FFA之間的負(fù)相關(guān)(圖3B)，然而在2型糖尿患者中該磷酸化同工型的表達(dá)和FFA之間并無關(guān)聯(lián)而是反過來同空腹血糖具有逆相關(guān)性(圖3A)。這一點(diǎn)很有趣，因?yàn)榧∪庵薪馀悸?lián)蛋白3的mRNA水平同非糖尿病受試者空腹?fàn)顟B(tài)下的FFA循環(huán)水平呈現(xiàn)出正相關(guān)(23)，但是在2型糖尿患者中并沒有觀察到這種相關(guān)性(24)，而是觀察到了高血糖癥與ATPsyn-β的磷酸化同工型表達(dá)下調(diào)之間的關(guān)系。
總之，采用蛋白組分析，本發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)在2型糖尿患者受試者肌肉中有15個蛋白質(zhì)被上調(diào)或下調(diào)。這些蛋白質(zhì)中有11個已經(jīng)通過質(zhì)譜鑒定出來了。在吸收完畢狀態(tài)這些蛋白質(zhì)可用作2型糖尿病骨骼肌中的標(biāo)記蛋白質(zhì)。IV型膠原蛋白同工型還沒有作為在糖尿患者骨骼肌組織中上調(diào)的蛋白質(zhì)被公開，而11種蛋白質(zhì)中的剩余部分以前并未同DM2直接相關(guān)。
最令人吃驚的是，本發(fā)明者證明F1-ATP合酶的催化性β-亞基被磷酸化了。另外，本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，糖尿患者肌肉中一種β-亞基磷酸化同工型的表達(dá)顯著降低了，并且其表達(dá)水平同血糖的水平呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系。這些資料表明ATP合酶β-亞基的磷酸化在ATP合成中的作用，并表明該蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的改變貢獻(xiàn)于2型糖尿病的形成。
表1 臨床特征
2型糖尿病(DM2)組和對照組受試者的臨床特征。數(shù)據(jù)代表平均數(shù)±S.E.M，P值由Student t實(shí)驗(yàn)給出。Ns代表不顯著。男性/女性比率由CHI-平方測試給出。
表2 MALDI TOF MS分析鑒定的2型糖尿病標(biāo)記蛋白質(zhì)
2型糖尿病骨骼肌中的蛋白質(zhì)標(biāo)記物同它們的數(shù)據(jù)庫登陸號、理論分子量(mW)及等電點(diǎn)(pI)。
這些標(biāo)記蛋白質(zhì)的表達(dá)水平用它們的整合光密度百分含量(％IOD)的平均數(shù)±SEM表示。
*p＜0.05相對于對照**p＜0.01相對于對照表3 質(zhì)譜沒有鑒定的2型糖尿病標(biāo)記蛋白質(zhì)
表達(dá)水平用它們的整合光密度百分含量(％IOD)表示，平均值±SD。
§，從二維凝膠的位置預(yù)計(jì)的近似值。
*p＜0.05相對于對照**p＜0.01相對于對照表達(dá)水平％IOD是使用pH值4-7的IPG膠條確定的。如果使用的凝膠系統(tǒng)同在此所用系統(tǒng)不同，其實(shí)際結(jié)果也可以不同。
蛋白質(zhì)上調(diào)或下調(diào)的測試自股外側(cè)肌上取下一小塊皮下針活組織切片，將其置入低滲溶液中(裂解細(xì)胞和線粒體)。該溶液含有蛋白水解酶、激酶及磷酸化酶抑制劑。振蕩15分鐘，釋放蛋白質(zhì)，然后取100μl該溶液加到已制備好的ELISA微孔平板合適的孔中。
微孔平板已經(jīng)用抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)包被好，每行用一種抗體包被(不包括標(biāo)準(zhǔn)品—肌動蛋白和核酮糖二磷酸羥化酶)，它們可以特異性識別ATP合酶、磷酸化ATP合酶以及表2中已鑒定的部分或所有其它蛋白質(zhì)。其它蛋白質(zhì)(如糖原合酶)的抗體也在其中。另外還設(shè)了一種陽性對照(如肌動蛋白)和一種陰性對照(即一種不能被識別的蛋白質(zhì)，如植物蛋白質(zhì)核酮糖二磷酸羥化酶)以確保免疫反應(yīng)正常進(jìn)行。含有當(dāng)前討論的幾種蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的平板在下面圖解中給出。這些標(biāo)準(zhǔn)曲線可通過重組蛋白質(zhì)、修飾或適當(dāng)裂解蛋白質(zhì)繪出。
然后將微平板在4℃放置1小時，清洗、顯色，并在ELISA平板讀數(shù)器上讀取數(shù)據(jù)。某些讀數(shù)器能夠參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出未知樣品中特異蛋白質(zhì)的數(shù)量。如果肌動蛋白不顯色或核酮糖二磷酸羥化酶顯色，則該平板被排除。
眾所周知，每一種蛋白質(zhì)都有平均值以及最大最小容限(相當(dāng)于健康個體的通常范圍)。當(dāng)某人體內(nèi)的某個蛋白質(zhì)超出這些極限，即可認(rèn)為他患上了一種2型糖尿病相關(guān)疾病。兩種或更多診斷標(biāo)記蛋白質(zhì)呈陽性比僅一種呈陽性更有意義。例如觀察到最近患局部缺血的患者體內(nèi)肌酸激酶高度表達(dá)，因此，這個標(biāo)記物就其本身而言，對于鑒定2型糖尿病仍然不夠充分。
當(dāng)然，還有許多本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法也可以得出本質(zhì)上相同的診斷結(jié)論。此處所得數(shù)據(jù)可同其它糖尿病的相關(guān)數(shù)據(jù)如血糖或游離脂肪酸的水平結(jié)合起來，從而提高預(yù)測或診斷的特異性的可靠性。
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權(quán)利要求
1.診斷或確定人對至少一種糖尿病相關(guān)疾病，優(yōu)選2型糖尿病，的易感性的方法，該方法包括確定取自于該人生物學(xué)樣品中至少一種標(biāo)記蛋白質(zhì)的存在、活性、濃度和/或表達(dá)水平，而該標(biāo)記蛋白質(zhì)選自(a)ATP合酶β亞基或磷酸化的ATP合酶β亞基的同工型；(b)磷酸葡萄糖變位酶1；(c)熱休克蛋白90β；(d)肌酸激酶β亞基；(e)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2；(f)膠原蛋白α1(VI)鏈；(g)78KDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白；(h)由表3所公布的特性定義的標(biāo)記蛋白質(zhì)(匹配號199，303，391，或511)；(i)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一多肽或其部分優(yōu)選有至少70％同源性的類似物；和(j)(a)到(i)中任一多肽的衍生物、前體、類似物或修飾物；并且可選將所述蛋白質(zhì)的存在、活性、濃度和/或表達(dá)水平同取自至少一個正常人的生物學(xué)樣品中所述蛋白質(zhì)的存在、活性、濃度和/或表達(dá)水平進(jìn)行比較。
2.權(quán)利要求1的方法，該方法包括(A)確定取自該人的生物學(xué)樣品中至少一種標(biāo)記蛋白質(zhì)的增加的表達(dá)、修飾、活性和/或濃度，該標(biāo)記蛋白質(zhì)選自(a)磷酸葡萄糖變位酶1；(b)熱休克蛋白90β；(c)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2上調(diào)同工型；(d)膠原蛋白α1(VI)鏈；(e)78KDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白；(f)由表3所公布的特性定義的標(biāo)記蛋白質(zhì)(匹配號303或511)；(g)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中任一多肽或其部分優(yōu)選有至少70％同源性的類似物；和(h)(a)到(f)中任一多肽的衍生物、類似物或修飾物；和/或(B)確定取自該人的生物學(xué)樣品中至少一種標(biāo)記蛋白質(zhì)(下調(diào)的標(biāo)記蛋白質(zhì))降低的表達(dá)、修飾、活性和/或濃度，該標(biāo)記蛋白質(zhì)選自(a)ATP合酶β亞基或其磷酸化的同工型；(b)肌酸激酶β亞基；(c)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2下調(diào)同工型；(d)由表3公布特性定義的標(biāo)記蛋白質(zhì)(匹配號199或391)；(e)與(a)、(b)、(c)或(d)中任一多肽或其部分優(yōu)選有至少70％同源性的類似物；(f)(a)到(d)中任一多肽的衍生物、類似物或修飾物；其中增高或降低的表達(dá)、修飾、活性和/或濃度相對于取自正常人的生物學(xué)樣品的所得值。
3.權(quán)利要求1-2中任何一項(xiàng)的方法，其中生物學(xué)樣品選自尿、血液、淋巴液、唾液和組織。
4.權(quán)利要求3的方法，其中組織是肌肉組織，如股外側(cè)肌。
5.基本純的多肽，其包含至少一種選自下列的氨基酸序列(a)ATP合酶β亞基或磷酸化的ATP合酶β亞基的同工型；(b)磷酸葡萄糖變位酶1；(c)熱休克蛋白90β；(d)肌酸激酶β亞基；(e)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2；(f)膠原蛋白α1(VI)鏈；(g)78KDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白；(h)由表3所公布的特性定義的標(biāo)記蛋白質(zhì)(匹配號199，303，391，或511)；(i)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一氨基酸序列或其部分優(yōu)選有至少70％同源性的類似物；和(j)(a)到(i)中任一氨基酸序列的衍生物、前體、類似物或修飾物；用作藥物，如用于治療至少一種糖尿病相關(guān)疾病，優(yōu)選2型糖尿病。
6.基本純的多肽，其包含至少一種選自下列的氨基酸序列(a)ATP合酶β亞基或磷酸化的ATP合酶β亞基的同工型；(b)磷酸葡萄糖變位酶1；(c)熱休克蛋白90β；(d)肌酸激酶β亞基；(e)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2；(f)膠原蛋白α1(VI)鏈；(g)78KDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白；(h)由表3所公布的特性定義的標(biāo)記蛋白質(zhì)(匹配號199，303，391，或511)；(i)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一氨基酸序列或其部分優(yōu)選有至少70％同源性的類似物；和(j)(a)到(i)中任一氨基酸序列的衍生物、前體、類似物或修飾物；條件是排出(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)中的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求5或6的基本純的多肽，其中該氨基酸序列類似物與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一序列有至少80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％的序列同一性。
8.用于治療至少一種糖尿病相關(guān)疾病，優(yōu)選2型糖尿病，的藥物組合物，其含有至少一種權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的多肽或其模擬物、抗模擬物或適體。
9.藥物組合物，其含有(a)至少一種物質(zhì)，其能夠調(diào)節(jié)如權(quán)利要求5、6或7的肽的至少部分的編碼核酸片段的表達(dá)；和/或(b)至少一種所述多肽；和/或(c)所述多肽或其修飾產(chǎn)物的至少一種抗體；和/或(d)至少一種核酸片段，其能與編碼所述多肽的、包括其調(diào)節(jié)元件的核酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交；和/或(e)至少一種化合物，如核酸片段，其能與所述多肽結(jié)合；和/或(f)至少一種化合物，其能修飾該疾病的相關(guān)的蛋白質(zhì)的形式而使其相對的表達(dá)、活性和/或濃度向健康人的方向改變；和/或(g)至少一種能夠標(biāo)記至少(如用泛醌)一種所述蛋白質(zhì)的化合物，這些蛋白質(zhì)在該疾病中對于更快的更新或降解其表達(dá)量相對太高；和/或(h)至少一種能夠標(biāo)記至少一種所述蛋白質(zhì)的化合物，這些蛋白質(zhì)對于更慢的更新或降解其表達(dá)量相對太低。
10.用于治療人的糖尿病相關(guān)疾病的方法，包括改變至少一種標(biāo)記蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾、活性和/或濃度，而該標(biāo)記蛋白質(zhì)選自(a)ATP合酶β亞基或磷酸化的ATP合酶β亞基的同工型；(b)磷酸葡萄糖變位酶1；(c)熱休克蛋白90β；(d)肌酸激酶β亞基；(e)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2；(f)膠原蛋白α1(VI)鏈；(g)78KDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白；(h)由表3公布特性定義的標(biāo)記蛋白質(zhì)(匹配號199，303，391，或511)；(i)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一多肽或其部分優(yōu)選有至少70％同源性的類似物；和(j)(a)到(i)中任一多肽的衍生物、前體、類似物或修飾物。
11.用于治療人的糖尿病相關(guān)疾病、防止所述疾病和/或延遲所述疾病在人體內(nèi)發(fā)作的方法，該方法包括向所述人施用至少一種選自下列的化合物(a)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的多肽；(b)編碼(a)中多肽的核苷酸序列；(c)能結(jié)合(a)中多肽的抗體；(d)核酸片段，其能與至少部分(a)中多肽的編碼核酸序列或能與所述核酸的互補(bǔ)鏈雜交，包括其調(diào)節(jié)元件；和/或(e)能與(a)中多肽結(jié)合的化合物；(f)能夠上調(diào)或下調(diào)至少一種(a)中多肽的表達(dá)、活性和/或濃度的化合物；(g)能修飾與該疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)的形式的化合物，使得該蛋白質(zhì)的相對表達(dá)、活性和/或濃度向健康的人方向改變；(h)能夠標(biāo)記(如用泛醌)至少一種所述蛋白質(zhì)的化合物，這些蛋白質(zhì)在該疾病中對于更快的更新或降解其表達(dá)量相對太高；和(i)能夠標(biāo)記至少一種所述蛋白質(zhì)的化合物，這些蛋白質(zhì)對于更慢的更新或降解其表達(dá)量相對太低。
12.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的多肽的用途，用于生產(chǎn)藥物，如治療糖尿病相關(guān)疾病的藥物，優(yōu)選2型糖尿病。
13.確定藥劑在治療糖尿病相關(guān)疾病中是否可能具有治療功效的方法，其包含在將測試模型暴露于所述試劑之前和之后確定一種或更多多肽的表達(dá)水平，并比較所述水平，這些多肽選自于(a)ATP合酶β亞基或磷酸化的ATP合酶β亞基的同工型；(b)磷酸葡萄糖變位酶1；(c)熱休克蛋白90β；(d)肌酸激酶β亞基；(e)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2；(f)膠原蛋白α1(VI)鏈；(g)78KDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白；(h)由表3公布特性定義的標(biāo)記蛋白質(zhì)(匹配號199，303，391，或511)；(i)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一多肽或其部分優(yōu)選有至少70％同源性的類似物；和(j)(a)到(i)中任一多肽的衍生物、前體、類似物或修飾物。
14.確定化合物在治療糖尿病相關(guān)疾病中的效果的方法，其包含確定一種或更多(如1、2、3、4、5、6或更多)如權(quán)利要求13所述的多肽的表達(dá)水平。
15.確定用于治療糖尿病相關(guān)疾病的化合物的效果水平的方法，其包括在將測試模型暴露于所述試劑之前和之后確定一種或更多(如1、2、3、4、5、6或更多)如權(quán)利要求13所述的多肽的表達(dá)水平。
16.確定患有或易于患糖尿病相關(guān)疾病的人的所述疾病的特點(diǎn)或原因的方法，其包括相對某種模型確定一種或更多(如1、2、3、4、5、6或更多)如權(quán)利要求13中所述的多肽的表達(dá)水平。
17.核酸片段，其包括(A)編碼多肽或其調(diào)節(jié)元件的核苷酸序列，該多肽包含至少一種選自下列的氨基酸序列(a)ATP合酶β亞基或磷酸化的ATP合酶β亞基的同工型；(b)磷酸葡萄糖變位酶1；(c)熱休克蛋白90β；(d)肌酸激酶β亞基；(e)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2；(f)膠原蛋白α1(VI)鏈；(g)78KDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白；(h)由表3公布特性定義的標(biāo)記蛋白質(zhì)(匹配號199，303，391，或511)；(i)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中氨基酸序列或其部分中優(yōu)選有至少70％同源性的類似物；和(j)(a)到(i)中氨基酸序列的衍生物、前體、類似物或修飾物；或(B)核苷酸序列，其與(A)中核苷酸序列、與該核苷酸序列的調(diào)節(jié)序列或與該核酸序列的互補(bǔ)鏈雜交。
18.權(quán)利要求17的核酸片段的用途，用于檢測糖尿病相關(guān)的標(biāo)記蛋白質(zhì)的存在或水平或者編碼所述標(biāo)記蛋白質(zhì)的核酸序列的存在或水平。
19.能與標(biāo)記蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體，該標(biāo)記蛋白質(zhì)選自于(a)ATP合酶β亞基或磷酸化的ATP合酶β亞基的同工型；(b)磷酸葡萄糖變位酶1；(c)熱休克蛋白90β；(d)肌酸激酶β亞基；(e)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2；(f)膠原蛋白α1(VI)鏈；(g)78KDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白；(h)由表3公布特性定義的標(biāo)記蛋白質(zhì)(匹配號199，303，391，或511)；(i)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一多肽或其部分優(yōu)選有至少70％同源性的類似物；和(j)(a)到(i)中任一多肽的衍生物、前體、類似物或修飾物。
20.權(quán)利要求19的抗體，其為多克隆抗體。
21.權(quán)利要求19的抗體，其為單克隆抗體。
22.權(quán)利要求19-21任一項(xiàng)中抗體的用途，用于檢測糖尿病相關(guān)疾病相關(guān)的標(biāo)記蛋白質(zhì)的存在或水平。
23.用于在哺乳動物中診斷糖尿病相關(guān)疾病或其對所述病例如遺傳學(xué)上的易感性的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括(A)至少一種特異性結(jié)合至少一種選自下列的標(biāo)記蛋白的結(jié)合手段(a)ATP合酶β亞基或磷酸化的ATP合酶β亞基的同工型；(b)磷酸葡萄糖變位酶1；(c)熱休克蛋白90β；(d)肌酸激酶β亞基；(e)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2；(f)膠原蛋白α1(VI)鏈；(g)78KDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白；(h)由表3公布特性定義的標(biāo)記蛋白質(zhì)(匹配號199，303，391，或511)；(i)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)中任一的多肽或其部分優(yōu)選有至少70％同源性的類似物；和(j)(a)到(i)中任一多肽的衍生物、前體、類似物或修飾物；例如i)所述標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體；ii)能與所述標(biāo)記蛋白質(zhì)結(jié)合的核酸片段；和/或iii)能與所述標(biāo)記蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物(如抗模擬物)；(B)至少一種用于檢測結(jié)合手段與至少一種所述標(biāo)記蛋白質(zhì)的結(jié)合(若有的話)或結(jié)合水平的手段；并且，如必要，(C)至少一種將同所述結(jié)合手段的結(jié)合(若有的話)或該結(jié)合水平是否標(biāo)記個體哺乳動物有患該疾病的高度可能性或(遺傳學(xué)上)易感性相關(guān)聯(lián)的手段。
24.用于確定物質(zhì)在治療糖尿病相關(guān)疾病中的效果的方法，該方法包含使用經(jīng)確定具有高度可能性患所述疾病或具有對該疾病的(如遺傳學(xué)上)易感性的哺乳動物或該動物的一部分，例如通過使用權(quán)利要求1中的方法，所述方法包括對所述哺乳動物或其部分施用該物質(zhì)并確定其效果，優(yōu)選確定在對所述哺乳動物或其部分施用該物質(zhì)前后，根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的一種或多種(例如1、2、3、4、5、6或更多)多肽的水平。
全文摘要
本發(fā)明涉及天然存在的化合物及其衍生物作為糖尿病相關(guān)疾病易感性的標(biāo)記物的應(yīng)用。本發(fā)明也涉及用于糖尿病相關(guān)疾病治療的一種藥物組合物。
文檔編號C12Q1/68GK1571848SQ02819808
公開日2005年1月26日 申請日期2002年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月5日
發(fā)明者K·霍吉倫德, S·J·菲, P·M·拉森, H·貝克-尼爾森, K·沃澤辛斯基 申請人:普賴德普羅特奧米克斯公司