稀有細(xì)胞富集裝置和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞分離、檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種從細(xì)胞懸液中高回收率篩選收集稀有細(xì)胞的裝置和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]為了醫(yī)學(xué)診療等目的，會需要從人或動物的血液、組織液或淋巴液，尤其是血液中篩選、分離出游離其中的特定目標(biāo)細(xì)胞，主要是病變的細(xì)胞或從病變組織、器官上脫落的細(xì)胞。經(jīng)常地，目標(biāo)細(xì)胞在在上述體液中的含量非常稀少。
[0003]例如，循環(huán)上皮細(xì)胞是存在于血液中的一種稀有細(xì)胞，從病變的上皮組織脫落，其中從良性病變組織脫落的為良性上皮細(xì)胞，從惡性病變組織(癌癥)脫落的為腫瘤細(xì)胞，其數(shù)目極其稀少，每10ml血液可能僅含幾個到幾十個循環(huán)腫瘤細(xì)胞，卻有多達(dá)約1億個白細(xì)胞和 500 億個紅細(xì)胞(Zhe XN, Cher ML, Bonfil RD, Am.J.Cancer Res.2011，1，740-751)，對其檢測猶如大海撈針。除了血液之外，一些組織液中也含有從病變組織脫落的具有診療價值的細(xì)胞，如腹水、胸腔積液、腦脊液等中的腫瘤細(xì)胞。此外，孕婦外周血中也可檢測到來自胎兒的有核紅細(xì)胞，收集這些胎兒的稀有細(xì)胞能夠獲得胎兒完整的基因組，從而為產(chǎn)前診斷遺傳病提供有力的工具。
[0004]下面以血液中循環(huán)上皮細(xì)胞為例概述目前一些稀有細(xì)胞富集方法。從血液中富集循環(huán)上皮細(xì)胞的方法按照富集方式可分為正選或負(fù)選，按照富集原理可分為基于細(xì)胞表面標(biāo)志物或基于細(xì)胞的物理性質(zhì)。
[0005](1)正選+細(xì)胞表面標(biāo)志物:這一方法主要通過針對上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物(如EpCAM, EGFR, HER2等)的抗體來富集血液中的上皮來源細(xì)胞，抗體可修飾于免疫磁球表面或微流控芯片通道表面，其中最具代表性的是已被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于檢測轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的Cell Search?系統(tǒng)(CristofanilliM, Budd T, Ellis MJ, et al.N.Engl.J.Med.2004, 351, 781-791 ；Riethdorf S, FritscheH, Muller V, et al.Clin.Cancer Res.2007, 13, 920-928 ；Cohen SJ, Punt CJA, IannottiN, et al.J.Clin.0ncol.2008, 26，3213-3221)，該系統(tǒng)運(yùn)用標(biāo)記有EpCAM抗體的磁性微球進(jìn)行血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集，但這一方法難以捕獲不表達(dá)或低表達(dá)EpCAM的上皮細(xì)胞，即使使用若干種針對不同抗原的抗體進(jìn)行聯(lián)合捕獲也依然存在上述問題。
[0006](2)正選+細(xì)胞物理性質(zhì):這一方法主要是利用腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞尺寸上的差異進(jìn)行富集。紅細(xì)胞明顯小于上皮來源的細(xì)胞，而白細(xì)胞雖然平均尺寸小于上皮細(xì)胞，但是數(shù)量巨大的白細(xì)胞其尺寸分布很寬，且上皮細(xì)胞尤其是腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性較大，因此部分白細(xì)胞與循環(huán)上皮細(xì)胞的尺寸存在重疊。通過這一方法分離的循環(huán)上皮細(xì)胞中往往混入大量白細(xì)胞，獲得樣本的純度很低，難以進(jìn)行后續(xù)的分子分析。同時，由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，存在著一些尺寸較小的腫瘤細(xì)胞容易被漏選從而造成損失。
[0007](3)負(fù)選:這一方法主要是為解決正選難以富集到血液中全體游離的循環(huán)上皮細(xì)胞而采用的，其富集策略是將血液中已知的血細(xì)胞分步去除，從而剩下的細(xì)胞懸液中包含了我們所需要的循環(huán)上皮細(xì)胞。基本的方法是首先通過密度梯度離心去除血液中的紅細(xì)胞及部分白細(xì)胞，取單個核細(xì)胞層與修飾了 CD45抗體的免疫磁球孵育(CD45是白細(xì)胞表面共同抗原)，然后通過施加磁場截留表面結(jié)合了 CD45磁球的白細(xì)胞，同時收集剩余的細(xì)胞懸液，其中包含了所需要的循環(huán)上皮細(xì)胞，最后通過離心濃縮這一稀有細(xì)胞懸液并進(jìn)行后續(xù)分析。但之前的研究證實(shí)這一方法的對上皮細(xì)胞的回收率很低，因此一直不是主流的稀有細(xì)胞富集方法。
[0008]由于稀有細(xì)胞難以高收率的篩選和富集，導(dǎo)致對其檢測分析困難。因此需發(fā)展高效、快速的將稀有細(xì)胞從例如血液這類極為復(fù)雜的生物樣本中富集出來的工具與方法，達(dá)到回收率收集稀有細(xì)胞的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的正是稀有細(xì)胞負(fù)選回收率低的問題。
[0010]本發(fā)明的第一方面是一種稀有細(xì)胞富集裝置，其包括:細(xì)胞篩選部分，其包含形成在兩個相對表面之間的細(xì)胞篩選通道，兩個相對表面中的至少一個表面為磁性吸附表面，其中所述細(xì)胞篩選通道的厚度設(shè)置為，當(dāng)細(xì)胞懸液流經(jīng)時形成為使得細(xì)胞基本上以單層分布的薄液層，從而結(jié)合了免疫磁球的多數(shù)細(xì)胞在所述細(xì)胞篩選通道內(nèi)被吸附到所述磁性吸附表面時避免裹挾稀有細(xì)胞。所述裝置還包括:細(xì)胞收集部分，其包含過濾單元，其可拆卸地設(shè)置于所述細(xì)胞篩選部分的下游，以截留未被磁性吸附的稀有細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明的第二方面是一種富集稀有細(xì)胞的方法，包括:制備包含多數(shù)細(xì)胞和稀有細(xì)胞的細(xì)胞懸液，其中所述多數(shù)細(xì)胞結(jié)合有免疫磁球；使所述細(xì)胞懸液以細(xì)胞基本上呈單層分布的薄液層形式流過磁性吸附表面，其中結(jié)合了免疫磁球的多數(shù)細(xì)胞被吸附到所述磁性吸附表面；及用微濾膜截留細(xì)胞懸液中未被吸附的稀有細(xì)胞，以收集未被吸附的稀有細(xì)胞。
[0012]當(dāng)含有目標(biāo)稀有細(xì)胞以及結(jié)合有免疫磁球的多數(shù)細(xì)胞懸液從流經(jīng)細(xì)胞篩選通道時，由于流過通道的適當(dāng)稀釋細(xì)胞懸液的液層很薄，細(xì)胞基本上以單層形式存在，表面結(jié)合磁球的細(xì)胞被吸引到磁性表面的時候不會裹挾稀有的循環(huán)上皮細(xì)胞。另外，用微濾膜截留未被吸附的稀有細(xì)胞可以提高稀有細(xì)胞回收率，克服離心濃縮稀有細(xì)胞懸液帶來的回收率低的問題。本發(fā)明解決了通過負(fù)選富集稀有細(xì)胞時容易導(dǎo)致稀有細(xì)胞丟失這兩個關(guān)鍵問題，因此能獲得較高的稀有細(xì)胞回收率，這也正是本發(fā)明的創(chuàng)新之處。
【附圖說明】
[0013]圖1是根據(jù)本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的稀有細(xì)胞富集裝置的原理圖；
[0014]圖2是根據(jù)本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的稀有細(xì)胞富集裝置的三維圖；
[0015]圖3是用于本發(fā)明稀有細(xì)胞富集裝置的用于收集稀有細(xì)胞的雙層濾膜示意圖；及
[0016]圖4是圖3所述濾膜截留了細(xì)胞的照片。
[0017]附圖標(biāo)記的說明:1.稀有細(xì)胞富集裝置；2.磁性部；2A.內(nèi)管；2B.磁體；3.外管；4.進(jìn)樣口 ；5.出樣口 ；6.濾膜；7.集液瓶；8.抽氣口 ；9.填充物 '及C.細(xì)胞篩選通道。
【具體實(shí)施方式】
[0018]參見圖1和圖2，它們示出了本發(fā)明一【具體實(shí)施方式】的稀有細(xì)胞富集裝置的原理圖和三維圖。本發(fā)明的稀有細(xì)胞富集裝置1具有主體部分或細(xì)胞篩選部分，其包括磁性部2和套在磁性部2外的外管3。磁性部2可包括內(nèi)管2A和容納其中的磁體2B。磁性部2的外壁與外管3的內(nèi)壁，也即內(nèi)管2A的外表面與外管3的內(nèi)表面，共同界定細(xì)胞篩選通道C。主體部分的上、下兩端分別形成有與細(xì)胞篩選通道C液體聯(lián)通的進(jìn)樣口 4和出樣口 5。因此，本發(fā)明的這一實(shí)施方式中，富集裝置的篩選部分大體形成為內(nèi)含磁體的雙層套管結(jié)構(gòu)。
[0019]例如，內(nèi)管2A和外管3分別采用的材料為聚苯乙烯或親水凝膠包被的聚苯乙烯或其他對細(xì)胞不吸附或超低吸附的材料。磁體2B可以是由一個或多個永磁體組合成的圓柱狀的磁體。但本發(fā)明不限于此。
[0020]內(nèi)管2與外管3的管壁間距(即沿管壁縱向延伸的通道C的寬度)設(shè)置為，當(dāng)細(xì)胞懸液流過通道C時形成的液層很薄，使得懸浮細(xì)胞基本上以單層分布。為了使懸浮細(xì)胞在通道C中以單層分布，可根據(jù)懸浮液中細(xì)胞尺寸和懸浮細(xì)胞密度來確定通道C的寬度為0.1mm - 5mm，優(yōu)選為0.lmm-lmm。在本發(fā)明實(shí)施例2中，對于從作為多數(shù)細(xì)胞的白細(xì)胞中篩選出作為稀有細(xì)胞的循環(huán)上皮細(xì)胞時實(shí)際使用的富集裝置中，通道C